專(zhuān)利名稱(chēng)：：用于傳染病檢測(cè)和診斷的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本申請(qǐng)涉及用于檢測(cè)和診斷傳染病的方法和組合物。確切地說(shuō)，本發(fā)明涉及包含分枝桿菌抗原的透皮釋放系統(tǒng)或裝置，其中該系統(tǒng)或裝置的用藥刺激產(chǎn)生免疫應(yīng)答，后者對(duì)活性分枝桿菌感染的檢測(cè)和診斷來(lái)說(shuō)是足夠的。
背景技術(shù)：
：傳染病的檢測(cè)通常是利用監(jiān)測(cè)免疫應(yīng)答的試驗(yàn)來(lái)完成的。不過(guò)在很多情況下，這些試驗(yàn)是麻煩的，經(jīng)常得出不一致的結(jié)果。另外，對(duì)生活在不發(fā)達(dá)地區(qū)的個(gè)人來(lái)說(shuō)，缺少高級(jí)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備，通常降低了試驗(yàn)的有效性，不相稱(chēng)的是在這些地區(qū)傳染病的發(fā)病率可能較高。傳染病的準(zhǔn)確診斷和檢測(cè)不僅對(duì)于治療、而且對(duì)于預(yù)防發(fā)病和疾病傳播來(lái)說(shuō)也是重要的。對(duì)于靈敏和準(zhǔn)確的檢測(cè)方法的需求目前已經(jīng)變得特別明確，尤其根據(jù)由分枝桿菌等引起的感染不斷增加來(lái)說(shuō)更是如此。分枝桿菌感染通常表現(xiàn)為結(jié)核等疾病。由分枝桿菌引起的人感染自古已經(jīng)廣為傳播，結(jié)核在今天仍是一個(gè)引起死亡的原因。盡管至少自從十九世紀(jì)中葉以來(lái)發(fā)病率隨著生活水平的提高而下降，不過(guò)分枝桿菌感染仍然構(gòu)成醫(yī)學(xué)資源有限的國(guó)家一個(gè)引起發(fā)病和死亡的原因，可導(dǎo)致無(wú)免疫應(yīng)答患者壓倒多數(shù)的廣為傳播的疾病。盡管世界上多數(shù)衛(wèi)生組織都作出了努力，也從沒(méi)有實(shí)現(xiàn)分枝桿菌疾病的根除，或者接近根除。世界人口幾乎三分之一被結(jié)核分枝桿菌復(fù)合物感染，普遍稱(chēng)之為結(jié)核(TB)，每年新增大約八百萬(wàn)患者，并且每年有三百萬(wàn)患者死于TB。經(jīng)過(guò)幾十年的下降，TB又在上升。在美國(guó)，多達(dá)一千萬(wàn)人據(jù)信被感染。據(jù)報(bào)道1990年新增近28000例，比1989年增長(zhǎng)9.4%0從1985年到1990年增長(zhǎng)了16%。生活狀況和分享空間過(guò)于擁擠更有助于TB的傳播，例如在美國(guó)觀察到在監(jiān)獄囚犯和大城市的無(wú)家可歸者當(dāng)中發(fā)病增加。所有獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)患者的大約一半將會(huì)感染分枝桿菌，其中TB是尤其具有毀滅性的并發(fā)癥。AIDS患者臨床發(fā)展為T(mén)B的風(fēng)險(xiǎn)更高，并且抗TB治療似乎沒(méi)有對(duì)非AIDS患者那么有效。因此，感染通常發(fā)展為致命的廣為傳播的疾病。在折磨AIDS患者的機(jī)會(huì)感染中逐漸發(fā)現(xiàn)了除結(jié)核分枝桿菌以外的分枝桿菌。來(lái)自胞內(nèi)鳥(niǎo)分枝桿菌復(fù)合物(MAC)的生物體、尤其是第四和第八血清型，占來(lái)自AIDS患者的分枝桿菌隔離種群的68%。發(fā)現(xiàn)了龐大數(shù)量的MAC(多達(dá)IOki個(gè)耐酸桿菌每克組織)，因此，感染的AIDS患者預(yù)后不良。世界衛(wèi)生組織(WHO)繼續(xù)支持對(duì)抗TB的戰(zhàn)斗，推薦了主動(dòng)預(yù)防措施，例如“致免疫法的擴(kuò)展程序”(EPI)，和主動(dòng)治療應(yīng)變性措施，例如“直接觀察的短期治療”(DOTS)。對(duì)TB的根除來(lái)說(shuō)，診斷、治療和預(yù)防是同等重要的?；顒?dòng)期TB患者的快速檢測(cè)有利于早期治療，而通過(guò)早期治療，治愈率預(yù)期為90%。因此，早期診斷對(duì)于對(duì)抗TB的戰(zhàn)斗來(lái)說(shuō)是關(guān)鍵的。另外，治療應(yīng)變性不僅確保消除感染，而且減少耐藥菌株的出現(xiàn)。耐藥性結(jié)核分枝桿菌的出現(xiàn)是極為令人不安的現(xiàn)象。新增TB病例證實(shí)耐受至少一種標(biāo)準(zhǔn)藥物的速度從二十世紀(jì)八十年代的10%增加到1991年的23%。因此，治療方案的應(yīng)變性在為消除TB和防止耐藥菌株的出現(xiàn)所作的努力中也起決定性作用。盡管已經(jīng)鑒別出37種以上的分枝桿菌，不過(guò)所有人感染的95%以上都是由六種分枝桿菌引起的結(jié)核分枝桿菌、胞內(nèi)鳥(niǎo)分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、龜分枝桿菌和麻風(fēng)分枝桿菌。最普遍的人分枝桿菌疾病是結(jié)核(TB)，引起結(jié)核的分枝桿菌菌種包括結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌或非洲分枝桿菌(MerckManual1992)。感染通常開(kāi)始于吸入傳染性粒子，它能夠到達(dá)肺內(nèi)末端路徑。在被肺泡巨噬細(xì)胞吞噬后，桿菌能夠自由地復(fù)制，最后破壞吞噬細(xì)胞。繼而發(fā)生級(jí)聯(lián)效應(yīng)，其中，吞噬細(xì)胞被破壞，導(dǎo)致另外的巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞移行到感染部位，在這里它們也最終被消除了。在最初階段，疾病通過(guò)被感染的巨噬細(xì)胞進(jìn)一步傳播，因?yàn)楸桓腥镜木奘杉?xì)胞游走到局部淋巴結(jié)，以及進(jìn)入血流和其他組織，例如骨髓、脾、腎、骨和中樞神經(jīng)系統(tǒng)(參見(jiàn)Murray等《醫(yī)學(xué)微生物學(xué)》TheC.V.MosbyCompany219-230(1990))。對(duì)引起分枝桿菌毒性的因素尚不清楚。很多研究暗示，細(xì)胞壁脂質(zhì)和細(xì)菌表面是引起菌落形態(tài)和毒性的因素。有證據(jù)表明，在某些分枝桿菌細(xì)胞表面上的C-分枝菌糖苷脂具有重要的促進(jìn)巨噬細(xì)胞內(nèi)生物體存活的作用。對(duì)于其他分枝桿菌，暗示為海藻糖-6，6’_二分枝菌酸酯，它是一種索狀因子。菌落形態(tài)與毒性的相互關(guān)系在鳥(niǎo)分枝桿菌中特別明顯。鳥(niǎo)分枝桿菌以幾種顯著的菌落形式存在。在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基上長(zhǎng)成透明或粗糙菌落的桿菌能夠在組織培養(yǎng)物中的巨噬細(xì)胞內(nèi)繁殖，在被注射到易感小鼠體內(nèi)后是有毒性的，對(duì)抗生素是耐受的。保持在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基上的粗糙或透明桿菌通常自發(fā)地呈現(xiàn)不透明的菌落形態(tài)，此時(shí)它們不能在巨噬細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)，對(duì)小鼠是無(wú)毒的，對(duì)抗生素是高度易感的。透明、粗糙和不透明的鳥(niǎo)分枝桿菌菌株之間的菌落形態(tài)差異幾乎肯定是由一種糖脂的存在而引起的，該糖脂包被在透明和粗糙生物體的表面上，起到保護(hù)莢膜的作用。這種莢膜或包被主要是由C-分枝菌糖苷脂組成的，它顯然保護(hù)了毒性鳥(niǎo)分枝桿菌生物體不受溶菌酶和抗生素的作用。相形之下，鳥(niǎo)分枝桿菌的無(wú)毒的不透明形式在其表面幾乎不含有C-分枝菌糖苷脂。對(duì)抗生素的耐受性和對(duì)被巨噬細(xì)胞殺死的耐受性都已被認(rèn)為是鳥(niǎo)分枝桿菌表面上的糖脂屏障。分枝桿菌感染的診斷是通過(guò)病原體的分離和鑒別而得以確認(rèn)的，不過(guò)常規(guī)診斷是基于唾液涂片、胸部X-射線(xiàn)檢查(CXR)和臨床癥狀的。培養(yǎng)基上分枝桿菌的分離需要長(zhǎng)達(dá)四至八周的時(shí)間。菌種鑒別進(jìn)一步需要兩周。另有其他若干用于檢測(cè)分枝桿菌的技術(shù)，例如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、結(jié)核分枝桿菌直接試驗(yàn)或放大的結(jié)核分枝桿菌直接試驗(yàn)(MTD)，以及利用放射性標(biāo)記物的測(cè)定法。一種廣泛用于檢測(cè)由結(jié)核分枝桿菌引起的感染的診斷試驗(yàn)是結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)。盡管可以得到多種版本的皮膚試驗(yàn)，不過(guò)通常使用這兩種結(jié)核菌素抗原制劑之一舊結(jié)核菌素(OT)或純化蛋白衍生物(PPD)。將抗原制劑皮內(nèi)注射到皮膚內(nèi)，或者局部用藥，然后利用一種多叉接種器侵入性地轉(zhuǎn)運(yùn)到皮膚內(nèi)(Tine試驗(yàn))。皮膚試驗(yàn)診斷方法存在幾個(gè)問(wèn)題。例如，Tine試驗(yàn)一般是不被推薦的，因?yàn)樽⑸涞狡?nèi)層的抗原量不能精確地加以控制(參見(jiàn)Murray等《醫(yī)學(xué)微生物學(xué)》TheC.V.MosbyCompany219-230(1990))。盡管結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)是廣泛使用的，不過(guò)它們通常需要2-3天才能產(chǎn)生結(jié)果，很多時(shí)候結(jié)果是不準(zhǔn)確的，因?yàn)橐呀?jīng)接觸分枝桿菌但仍健康的受試者有時(shí)見(jiàn)到假陽(yáng)性。另夕卜，經(jīng)常發(fā)生誤診，這是由于不僅活動(dòng)期TB患者觀察到陽(yáng)性結(jié)果，而且BCG-疫苗接種過(guò)的人員和已經(jīng)被分枝桿菌感染但還沒(méi)有發(fā)展為疾病的人員也觀察到陽(yáng)性結(jié)果。因此，通過(guò)結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)難以區(qū)分活動(dòng)期TB患者和其他人，例如家庭TB接觸人。此外，結(jié)核菌素試驗(yàn)通常引起被除結(jié)核分枝桿菌以外的其他分枝桿菌(MOTT)感染的個(gè)體的交叉反應(yīng)。目前可得到的利用皮膚試驗(yàn)所進(jìn)行的診斷經(jīng)常引起誤差和錯(cuò)誤。需要有效的試驗(yàn)，用于檢測(cè)分枝桿菌感染的存在。特別是不需要侵入受試者皮膚表面的試驗(yàn)，將減少對(duì)受試者體液進(jìn)行試驗(yàn)的保健人員的接觸，減少被可能存在于受試者中的其他傳染劑傳染的風(fēng)險(xiǎn)。另外，易于進(jìn)行并且具有易于測(cè)定的陽(yáng)性或陰性結(jié)果的試驗(yàn)在監(jiān)測(cè)結(jié)核等高傳染性疾病治療方案的應(yīng)變性時(shí)是必要的，特別是針對(duì)無(wú)家可歸者、監(jiān)獄囚犯、學(xué)童和高齡公民等個(gè)體。還需要廉價(jià)和準(zhǔn)確的方法，用于區(qū)分處于疾病活動(dòng)期的人員和僅在免疫學(xué)上接觸過(guò)傳染劑但不處于活動(dòng)期的人員(例如事先被分枝桿菌感染的人員)，或者已經(jīng)用BCG進(jìn)行過(guò)疫苗接種的人員。此外，沒(méi)有已知方法用于監(jiān)測(cè)被分枝桿菌感染的人員中的藥物治療效果，例如能夠區(qū)分活動(dòng)期結(jié)核和治愈或接觸前的其他階段的試驗(yàn)。而且，還需要能夠易于對(duì)兒童進(jìn)行的試驗(yàn)，兒童對(duì)目前所用的涉及針頭或刺入皮膚的皮膚試驗(yàn)尤其感到害怕。這樣的試驗(yàn)對(duì)監(jiān)測(cè)AIDS患者來(lái)說(shuō)是特別需要的，他們對(duì)分枝桿菌感染是高度易感的。另外，易于進(jìn)行并且具有易于測(cè)定的陽(yáng)性或陰性結(jié)果的試驗(yàn)在監(jiān)測(cè)無(wú)家可歸者或監(jiān)獄囚犯的結(jié)核等疾病時(shí)是必要的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明包含用于傳染病檢測(cè)的方法和組合物。按照本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，提供了透皮釋放系統(tǒng)或裝置，例如含有分枝桿菌抗原組合物的藥貼。將該藥貼貼在皮膚上，在預(yù)定時(shí)間后揭去。然后檢查皮膚對(duì)藥貼內(nèi)存在的抗原所產(chǎn)生的免疫原性應(yīng)答。與現(xiàn)有技術(shù)方法不同，本文提供的診斷方法和組合物是高度靈敏的和特異性的。最重要的是，本發(fā)明的診斷方法和組合物尤其有效地檢測(cè)活動(dòng)期結(jié)核患者的結(jié)核分枝桿菌感染，從而消除誤診已經(jīng)接種疫苗或者已經(jīng)接觸該生物體而又沒(méi)有疾病表現(xiàn)的個(gè)體的可能性。本文所述診斷方法包括局部施用包含分枝桿菌抗原的組合物，用于透皮釋放和隨后的免疫原性應(yīng)答檢測(cè)，其中分枝桿菌抗原包含但不限于MPB44、MPB45、MPB51、MPB59、MPB64、MPB70、MPB80或MPB83?？乖梢詥为?dú)使用，也可以組合使用。特別優(yōu)選的是局部施用包含MPB64的抗原組合物。本發(fā)明針對(duì)任何具有MPB64特征的抗原，其特征在于在活動(dòng)期結(jié)核疾病的情況下，存在對(duì)抗原的遲發(fā)型超敏反應(yīng)，而對(duì)沒(méi)有接觸分枝桿菌者、或者通過(guò)疫苗接觸或其他非活動(dòng)期結(jié)核狀態(tài)則沒(méi)有反應(yīng)。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供用于傳染病檢測(cè)的方法和組合物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于活動(dòng)期結(jié)核檢測(cè)的方法和組合物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于活動(dòng)期結(jié)核檢測(cè)的方法和組合物，將用于透皮釋放的抗原組合物局部用藥。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于分枝桿菌感染檢測(cè)的方法和組合物。本發(fā)明還有另一個(gè)目的是提供用于由分枝桿菌菌種引起的活動(dòng)期疾病檢測(cè)的方法和組合物，其中分枝桿菌菌種包括結(jié)核分枝桿菌復(fù)合物、胞內(nèi)鳥(niǎo)分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、龜分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌、非洲分枝桿菌和田鼠分枝桿菌。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于由結(jié)核分枝桿菌引起的活動(dòng)期疾病檢測(cè)的方法和組合物。本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供用于由牛分枝桿菌引起的活動(dòng)期疾病檢測(cè)的方法和組合物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于分枝桿菌感染的免疫檢測(cè)的方法和組合物，利用局部用藥而無(wú)需侵入操作。本發(fā)明還有另一個(gè)目的是提供用于由分枝桿菌引起的活動(dòng)期疾病檢測(cè)的靈敏的診斷方法和組合物，其中抗原組合物被局部施用和透皮釋放，隨后檢查皮膚的免疫原性應(yīng)答。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于由分枝桿菌引起的活動(dòng)期疾病檢測(cè)的方法和組合物，其中局部用藥的分枝桿菌抗原組合物包含]^^44、]\0^45、]\0^51、]\0^59、]\0^64、]\0^70、MPB80或MPB83。本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供用于由分枝桿菌引起的活動(dòng)期疾病檢測(cè)的方法和組合物，其中局部用藥的分枝桿菌抗原組合物包含]^^44、]\0^45、]\0^51、]\0^59、]\0^64、]\0^70、MPB80或MPB83，其中該抗原是單獨(dú)或與另一種分枝桿菌抗原組合用藥的。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于由分枝桿菌引起的活動(dòng)期疾病檢測(cè)的方法和組合物，其中局部用藥的分枝桿菌抗原組合物包含MPB64。本發(fā)明還有另一個(gè)目的是提供易于進(jìn)行的用于傳染病診斷的方法和組合物。本發(fā)明另外一個(gè)目的是提供用于活動(dòng)期結(jié)核檢測(cè)的方法和組合物，用于監(jiān)測(cè)治療功效。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于由分枝桿菌引起的活動(dòng)期疾病診斷和檢測(cè)的試劑盒。本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供用于家庭TB或分枝桿菌疾病接觸人由分枝桿菌弓I起的活動(dòng)期疾病檢測(cè)的方法和組合物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于分枝桿菌感染患者在化療后的臨床狀態(tài)監(jiān)測(cè)的方法和組合物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于活動(dòng)期結(jié)核兒童的靈敏的診斷方法和組合物。本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供用于由分枝桿菌引起的活動(dòng)期疾病檢測(cè)的靈敏的方法和組合物，其中該方法涉及皮膚藥貼的使用。本發(fā)明的這些和其他目的、特征與優(yōu)點(diǎn)在回顧下列對(duì)所公開(kāi)的實(shí)施方式和所附加的權(quán)利要求書(shū)的詳細(xì)說(shuō)明之后將變得顯而易見(jiàn)。附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明圖1顯示不同量MPB64抗原通過(guò)豚鼠皮膚反應(yīng)所產(chǎn)生的劑量效應(yīng)圖。圖2是顯示接種BCG后的豚鼠對(duì)MPB64抗原藥貼的遲發(fā)型超敏反應(yīng)的時(shí)間過(guò)程的圖形。詳細(xì)說(shuō)明參照下列本文所包括的具體實(shí)施方式的詳細(xì)說(shuō)明可以更易于理解本發(fā)明。盡管本發(fā)明已經(jīng)參照某些實(shí)施方式的具體細(xì)節(jié)加以描述，這些細(xì)節(jié)也不應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明范圍的限制。本文提到的參考文獻(xiàn)全文引用在此作為參照，包括1998年2月6日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/073911和1998年8月11日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/096140。引起結(jié)核等的分枝桿菌感染一旦被認(rèn)為發(fā)病率下降，又有反彈并再次對(duì)健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。人員擁擠在一起或者居住環(huán)境在標(biāo)準(zhǔn)以下的地區(qū)逐漸發(fā)現(xiàn)感染了分枝桿菌的人員。無(wú)免疫應(yīng)答的人員有被分枝桿菌感染并死于該感染的巨大風(fēng)險(xiǎn)。另外，分枝桿菌耐藥菌株的出現(xiàn)也增加了感染人員的治療難度。很多被分枝桿菌感染的人是貧窮的，或者生活在保健設(shè)施不完備的地區(qū)。這些人不易于進(jìn)行分枝桿菌感染的試驗(yàn)，他們需要廉價(jià)和非侵入型感染檢測(cè)方法。此外，監(jiān)獄里的人員或無(wú)家可歸者一般不具有充分的保健條件，身體狀況較差，通常也得不到充分或成功的保健介入。本發(fā)明提供了包含抗原組合物的局部用藥的方法和組合物，該組合物用于抗原、特別是分枝桿菌抗原的透皮釋放。更確切地說(shuō)，本發(fā)明提供了方法和組合物，用于檢測(cè)活動(dòng)期結(jié)核等疾病，用于區(qū)分活動(dòng)期疾病人員和僅在免疫學(xué)上接觸過(guò)分枝桿菌等傳染劑的人員。本發(fā)明的方法和組合物可用于試驗(yàn)人以及其他動(dòng)物中分枝桿菌感染的存在。例如，本發(fā)明特別可以用于被牛分枝桿菌感染的母牛的疾病檢測(cè)。醫(yī)學(xué)上“活動(dòng)期結(jié)核”是通過(guò)胸部X—射線(xiàn)(CXR)、唾液試驗(yàn)或其他癥狀等熟知的醫(yī)學(xué)操作進(jìn)行診斷的。因?yàn)榉种U菌傳染劑的存在的精確鑒別是昂貴的，并且需要較長(zhǎng)時(shí)間，所以活動(dòng)期疾病的診斷不必包括分枝桿菌存在的鑒別。因此，結(jié)核等活動(dòng)期疾病的診斷可以依靠檢測(cè)分枝桿菌感染的其他方面，例如特定免疫應(yīng)答的產(chǎn)生或某些癥狀的表現(xiàn)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“結(jié)核”包括通常與感染有關(guān)的疾病狀態(tài)，該感染是由包括結(jié)核分枝桿菌復(fù)合物在內(nèi)的分枝桿菌菌種引起的。由除結(jié)核分枝桿菌以外的分枝桿菌(MOTT)引起的分枝桿菌感染通常是由包括胞內(nèi)鳥(niǎo)分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、偶發(fā)分技桿菌、龜分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌、非洲分枝桿菌和田鼠分枝桿菌在內(nèi)的分枝桿菌菌種引起的。本發(fā)明包括用于局部用藥的方法和組合物，局部用藥能夠?qū)崿F(xiàn)抗原的透皮釋放，抗原引起由分枝桿菌感染引起的結(jié)核等活動(dòng)期疾病人員產(chǎn)生免疫應(yīng)答，例如遲發(fā)型超敏反應(yīng)。該抗原來(lái)源于分枝桿菌，或者與分枝桿菌蛋白質(zhì)或碳水化合物部分具有交叉反應(yīng)性。優(yōu)選的抗原包括但不限于來(lái)源于分枝桿菌的]^^44、]\0^45、]\0^51、]\0^59、]\0^64、]\0^70、]\0^80或MPB83。特別優(yōu)選的是抗原MPB64(參見(jiàn)Kawajiri等日本專(zhuān)利申請(qǐng)公報(bào)09206092，其全文引用在此作為參考文獻(xiàn))。另一種優(yōu)選的抗原組合包括MPB64與MPB59的組合使用。例如，MPB59與MPB64的組合可以指示非典型分枝桿菌的感染，因?yàn)楸徊环置贛PB64的其他種類(lèi)分枝桿菌感染的受試者將對(duì)MPB59顯示陽(yáng)性應(yīng)答。MPB64是一種經(jīng)常與結(jié)核分枝桿菌復(fù)合物有關(guān)的分枝桿菌抗原。Harboe等首先描述其為MPT64(《傳染與免疫性》1986；52:293_902，全文引用在此)，此后已經(jīng)進(jìn)行了充分的特征化鑒定，并用在各種實(shí)驗(yàn)室中(例如參見(jiàn)Yamaguchi等《傳染與免疫性》1989；57283-288，全文也引用在此)。“MPB64”和“MPT64”指同一種抗原MPT64是從結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)物濾液中分離到的，因此命名為結(jié)核分枝桿菌蛋白，MPB64是后來(lái)從牛分枝桿菌(或BCG)的培養(yǎng)物濾液中分離到的，因此命名為牛分枝桿菌蛋白。隨后發(fā)現(xiàn)這兩種蛋白質(zhì)是相同的。MPB64和MPT64指選自分枝桿菌菌種的抗原，所選擇的分枝桿菌菌種包括但不限于結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌和牛分枝桿菌BCG的某些菌株?？乖窃诩?xì)菌生長(zhǎng)過(guò)程中分泌出來(lái)的，并且是免疫原性的，引起豚鼠和人產(chǎn)生遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)。重組抗原也可以用在本發(fā)明所預(yù)期的診斷方法和組合物中。例如參見(jiàn)Haga等《白細(xì)胞生物學(xué)雜志》1995；57-.221-225；Roche等《臨床與實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)》1996；103(2)226-232；Roche等《傳染病雜志》1994；107(5)1326-30，各自全文引用在此。本發(fā)明抗原通常用于透皮釋放到供試者皮膚內(nèi)?？乖氖褂梅椒ㄊ潜３职乖慕M合物與皮膚緊密接觸。組合物中抗原的濃度在大約1至150微克/所用劑量的范圍內(nèi)，更確切為10至100微克/所用劑量，最確切為30至75微克/所用劑量?？乖M合物可以包含一種生理學(xué)上有效的溶液，溶液中含有表面活性劑、緩沖劑和溶劑，能夠?qū)崿F(xiàn)抗原組合物的透皮釋放。優(yōu)選使用這樣的表面活性劑、緩沖劑和溶劑，它們?cè)黾涌乖臐B透和轉(zhuǎn)運(yùn)，本身不引發(fā)反應(yīng)或者干擾抗原的免疫原性。優(yōu)選用于抗原組合物的表面活性劑包括吐溫20、吐溫40、吐溫60和吐溫80；各自在磷酸鹽緩沖鹽水中的使用濃度可以是0.001-10%,0.001-1%，優(yōu)選為0.005%。一種優(yōu)選用于用藥的實(shí)施方式在100微升磷酸鹽緩沖鹽水中包含30至75微克抗原，進(jìn)一步包含優(yōu)選的表面活性劑吐溫80。最優(yōu)選用于用藥的實(shí)施方式是在100微升磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中含有75微克抗原和0.005%吐溫80。所制備的抗原組合物可以根據(jù)需要量分批或分等份貯藏在適當(dāng)?shù)臒o(wú)菌玻璃或塑料容器內(nèi)。本發(fā)明特別涉及抗原組合物到皮膚細(xì)胞的透皮釋放方法，用于活動(dòng)期疾病的檢測(cè)。照此包括所有所預(yù)期的能夠?qū)崿F(xiàn)傳染劑抗原到皮膚細(xì)胞的釋放從而進(jìn)行活動(dòng)期疾病檢測(cè)的溶劑和抗原組合物。本文所用的術(shù)語(yǔ)“透皮釋放”指組合物到皮膚各層的釋放，包括但不限于表皮(角質(zhì)層、透明層、顆粒層、生發(fā)層、基底層)、真皮和皮下層。本文所用的術(shù)語(yǔ)“局部用藥”指組合物施用或放置在皮膚上，而不用針頭等刺穿或侵入性地進(jìn)入皮膚。本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式包括透皮釋放系統(tǒng)或裝置，用于使上述組合物與人皮膚保持密切接觸。非常優(yōu)選的實(shí)施方式包括藥貼帶，例如皮膚藥貼帶，用于使組合物與皮膚保持密切接觸。適合用在用于釋放本發(fā)明抗原組合物的藥貼中的材料包括TORII藥貼繃帶“Toriiban”(從ToriiandCo.，Ltd.，Tokyo得到)、Finn-chamber禾口Perme-aidS.(Nitto-DenkouCo.Japan)。另外，也可以使用醫(yī)用橡皮膏或膠帶等材料，其中一部分硬膏或膠帶包括一部分浸潤(rùn)了抗原組合物的材料，并使該材料固定，使其直接與皮膚接觸。適合的醫(yī)用橡皮膏、膠帶和織物由多家廠商制造，例如Nichiban(Japan)、Kimberly-Clark(Neenah，Wisconsin)和3M(St.Paul,Minnesota)。該裝置可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各種固定方法固定。例如，可以利用細(xì)繩將裝置系在受試者手臂上，或者可以利用橡皮膏將裝置貼上。優(yōu)選地，用于固定裝置的橡皮膏等材料應(yīng)當(dāng)是透氣的和防水的，使其不會(huì)由于出汗或沐浴而受潮脫落。本發(fā)明一個(gè)特別有利的方面涉及本發(fā)明使用和實(shí)施容易。例如，抗原組合物整體可以通過(guò)在適當(dāng)溫度條件下將組合物裝運(yùn)或保持在無(wú)菌容器內(nèi)進(jìn)行保存。抗原組合物可以分所需量的等份貯藏，例如100或200μ1，然后用于紗布、硬膏或膠帶等，這對(duì)試驗(yàn)患者來(lái)說(shuō)是必要的。進(jìn)而，組合物的各必要組分和本發(fā)明的方法可以一起提供在試劑盒中，有助于使用。除了藥貼型實(shí)施方式以外，本發(fā)明也可以采取本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他透皮藥物釋放載體的形式，包括但不限于凝膠、霜?jiǎng)?、液體噴霧劑等。本發(fā)明所預(yù)期的優(yōu)選方法包括包含分枝桿菌抗原的組合物的局部給藥，用于人的透皮釋放。例如，將含有抗原組合物的藥貼施用在人的前臂上，并保持與皮膚的密切接觸。藥貼留置預(yù)定時(shí)間，使抗原能夠充分地透皮釋放。這樣一種時(shí)間范圍可以是1至7天，優(yōu)選為2至5天，最優(yōu)選為3天。經(jīng)過(guò)指定時(shí)間后，揭去藥貼，檢查皮膚的免疫原性應(yīng)答。本領(lǐng)域已知，響應(yīng)于某些抗原的存在，在皮膚上觀察到遲發(fā)型超敏反應(yīng)。通常，這種反應(yīng)是在抗原組合物的侵入之后觀察到的，這種反應(yīng)的特征是發(fā)紅、紅斑、硬結(jié)(皮膚增厚)、紅色水泡的出現(xiàn)或潰瘍。在本發(fā)明方法中所要尋找的應(yīng)答類(lèi)似于用分枝桿菌抗原皮內(nèi)注射所見(jiàn)到的應(yīng)答。本發(fā)明人已經(jīng)驚奇地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明抗原通過(guò)局部用藥的透皮釋放導(dǎo)致患有結(jié)核等活動(dòng)期分枝桿菌疾病的人員產(chǎn)生免疫原性應(yīng)答(具體來(lái)說(shuō)是遲發(fā)型超敏(DTH)反應(yīng))。如本文實(shí)施例所示，TB感染的豚鼠對(duì)抗原ΜΡΒ64表現(xiàn)出遲發(fā)型超敏皮膚反應(yīng)，只要該細(xì)菌繼續(xù)生長(zhǎng)；相形之下，用BCG-Tokyo致免疫的豚鼠在疫苗接種后一定時(shí)間喪失對(duì)ΜΡΒ64的遲發(fā)型超敏性。正如發(fā)明人所公開(kāi)的，包含分枝桿菌抗原、特別是ΜΡΒ64的本發(fā)明方法和組合物可用于活動(dòng)期分枝桿菌疾病的診斷，例如活動(dòng)期ΤΒ。令人驚奇的是，被結(jié)核分枝桿菌感染但是還沒(méi)有發(fā)展為結(jié)核的個(gè)體和預(yù)先已經(jīng)接受過(guò)BCG疫苗接種的個(gè)體不顯示響應(yīng)于ΜΡΒ64的陽(yáng)性皮膚反應(yīng)?？乖?、特別是ΜΡΒ64通過(guò)局部用藥的透皮釋放用于診斷結(jié)核等活動(dòng)期分枝桿菌疾病，這一新發(fā)現(xiàn)尤其是令人期望的，因?yàn)椴恍枰秩胄圆僮鳌Ｊ聦?shí)上，ΜΡΒ64的皮內(nèi)釋放最近已經(jīng)顯示在區(qū)分TB患者與健康對(duì)照者上是不成功的(wilcke等《結(jié)核與肺疾病》(1996)77250-256)。分枝桿菌抗原通過(guò)局部用藥的有效透皮釋放迄今是未知的，利用本發(fā)明的方法和組合物，本發(fā)明人已經(jīng)成功地研究出診斷操作，用于區(qū)分活動(dòng)期TB患者與健康PPD-陽(yáng)性對(duì)照者?？乖钠?nèi)注射可能不如透皮用藥那么有效的一個(gè)原因被認(rèn)為涉及抗原的溶解度和/或抗原呈遞的機(jī)會(huì)不當(dāng)，不過(guò)并不希望受到該理論的局限。例如，借助皮內(nèi)注射，抗原可能快速溶解在體液中，免疫系統(tǒng)沒(méi)有充分的時(shí)間識(shí)別和/或響應(yīng)它。相形之下，本發(fā)明的新方法能夠使抗原逐漸引入到受試者的免疫系統(tǒng)內(nèi)，由于抗原緩慢地通過(guò)皮孔和汗腺滲透到皮內(nèi)的局部，免疫系統(tǒng)有足夠時(shí)間封固應(yīng)答，通常是以遲發(fā)型超敏反應(yīng)的形式?？乖钠?nèi)和透皮引入也可能引起顯著的免疫應(yīng)答。超敏反應(yīng)(已知也叫IV型或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng))被認(rèn)為大部分是由T細(xì)胞介導(dǎo)的，并繼之以單核細(xì)胞的參與，不過(guò)并不希望受到該理論的局限。該反應(yīng)通常具有在經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后才觀察到的應(yīng)答，即18-24小時(shí)，因此稱(chēng)之為遲發(fā)型超敏性?？乖蔬f細(xì)胞被認(rèn)為向T細(xì)胞呈遞抗原，在激活后T細(xì)胞釋放淋巴因子，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和非免疫淋巴細(xì)胞的蓄積和激活。本發(fā)明也可用于檢測(cè)以前感染的TB患者的家庭接觸人的活動(dòng)期結(jié)核。這可以監(jiān)測(cè)疾病傳播到與最初感染人員有密切接觸的其他人。因?yàn)楣娍赡芑加薪Y(jié)核，并通過(guò)咳嗽傳播，因此本發(fā)明可用于監(jiān)測(cè)為公眾工作的人員接觸，例如飛機(jī)乘務(wù)員或保健人員。為無(wú)家可歸者或監(jiān)獄人群工作的人員也易于監(jiān)測(cè)活動(dòng)期結(jié)核的存在。本發(fā)明的一個(gè)尤為可取的用途是監(jiān)測(cè)對(duì)患有分枝桿菌感染的人員的治療功效。例如，隨著耐藥性分枝桿菌的增加，非常需要檢測(cè)活動(dòng)期結(jié)核患者不再具有活動(dòng)期TB、即治療有效的能力。一種優(yōu)選的方法包括在治療前將本發(fā)明的抗原對(duì)具有活動(dòng)期TB的人員局部用藥，經(jīng)過(guò)充分的時(shí)間后，觀察皮膚反應(yīng)。在治療方案的后面的步驟中，將抗原再次用藥，觀察皮膚反應(yīng)。沒(méi)有皮膚反應(yīng)說(shuō)明治療已經(jīng)有效地改變了活動(dòng)期結(jié)核狀態(tài)。皮膚的連續(xù)反應(yīng)說(shuō)明治療是無(wú)效的，或者還沒(méi)有足夠的時(shí)間使治療生效，人員仍具有活動(dòng)期TB。此時(shí)，可以改變治療，可以測(cè)定感染的分枝桿菌的藥物敏感性，或者可以繼續(xù)相同的治療較長(zhǎng)時(shí)間。本發(fā)明的一個(gè)用途將用于人群的快速篩選，例如調(diào)查相鄰地區(qū)或貧民區(qū)的感染率，用于試驗(yàn)入獄人員、收容所或街頭的無(wú)家可歸者。例如，入獄人員在剛?cè)氇z時(shí)即發(fā)給他們含有本發(fā)明抗原的藥貼。佩帶藥貼一定時(shí)間后，檢查囚犯的皮膚反應(yīng)。陽(yáng)性反應(yīng)者將被單獨(dú)安置。因?yàn)楸景l(fā)明檢測(cè)活動(dòng)期TB，所以可以將這些囚犯與其他囚犯隔離，并立即開(kāi)始治療。其他TB試驗(yàn)?zāi)軌驒z測(cè)在其生命中的某時(shí)接觸過(guò)TB和也許不能將TB傳染給其他人的囚犯。不能將TB傳染給其他人的囚犯不需要隔離和治療。在世界上的很多地區(qū)，人們接種了抗TB疫苗。在這些人身上極難檢測(cè)活動(dòng)期TB，因?yàn)樵跇?biāo)準(zhǔn)TB皮膚試驗(yàn)的條件下，所有接觸過(guò)分枝桿菌的人都呈陽(yáng)性，而無(wú)論存在活動(dòng)期TB還是疫苗接種的結(jié)果。本發(fā)明在這種情況下用于檢測(cè)個(gè)體中活動(dòng)期TB的存在，將他們與預(yù)先接種過(guò)疫苗的人員區(qū)分開(kāi)來(lái)。給藥的簡(jiǎn)易性是本發(fā)明的一個(gè)特別有利的方面。例如，兒童對(duì)藥貼等局部裝置用藥不感到害怕，不加遲疑地佩帶這樣的裝置一定時(shí)間，足以產(chǎn)生皮膚反應(yīng)。藥貼等局部裝置易于貯藏和運(yùn)輸?shù)介]塞的地方，那里可能缺乏冷藏條件和凈水。本發(fā)明可以從廉價(jià)材料制成，生產(chǎn)成本低，可以被世界范圍內(nèi)的保健組織使用。本發(fā)明通過(guò)下列實(shí)施例加以進(jìn)一步闡述，實(shí)施例無(wú)論如何不被解釋為對(duì)發(fā)明范圍的限制。相反，本領(lǐng)域技術(shù)人員在不背離本發(fā)明精神的前提下，在閱讀說(shuō)明書(shū)之后可以訴諸其他各種實(shí)施方式、改進(jìn)和等價(jià)方式。實(shí)施例1為了試驗(yàn)新穎、簡(jiǎn)便和快速的活動(dòng)期結(jié)核診斷方法，試驗(yàn)受試者對(duì)MPB64的皮膚反應(yīng)，利用可揭去的藥貼進(jìn)行抗原組合物的局部用藥，然后進(jìn)行透皮釋放。皮膚貼劑盡管MPB59、MPB70、MPB44、MPB45、MPB51或MPB64等抗原都可以用在本發(fā)明的藥貼試驗(yàn)中，不過(guò)在下例中所用抗原是MPB64，濃度大約為75μg每貼。預(yù)期使用大約50至100μg抗原每貼是成功的。優(yōu)選的抗原溶液包含大約750μg抗原每ml磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，其中的PBS由0.005%吐溫80組成。將藥貼施用到受試者皮膚上，留置三天，揭去藥貼后觀察用藥部位。存在免疫應(yīng)答指示陽(yáng)性結(jié)果，例如遲發(fā)型超敏(DTH)反應(yīng)(發(fā)紅、硬結(jié)或小紅泡)，也就是存在活動(dòng)期結(jié)核。用藥部位沒(méi)有變化表示陰性反應(yīng)。受試者試驗(yàn)了53名活動(dòng)期結(jié)核患者和43名健康的純化蛋白衍生物(PPD)陽(yáng)性對(duì)照，以測(cè)定對(duì)MPB64的反應(yīng)是否僅在活動(dòng)期結(jié)核患者中是陽(yáng)性。檢查了來(lái)自菲律賓馬尼拉附近的四個(gè)診所OurLadyofGraceParish、Sto.NinodeTondoParish、CanossaHealthandSocialCenter禾口HealthCareDevelopmentCenter的結(jié)核患者。53名活動(dòng)期結(jié)核患者中，52名顯示對(duì)MPB64的陽(yáng)性反應(yīng)，而43名PPD-陽(yáng)性對(duì)照中沒(méi)有一名具有對(duì)MPB64的陽(yáng)性反應(yīng)。MPB64對(duì)活動(dòng)期結(jié)核的特異性為100%，靈敏度為98.1%。試驗(yàn)的效力為98.9%。MPB64藥貼試驗(yàn)是有效和準(zhǔn)確的用于活動(dòng)期結(jié)核診斷的方法，區(qū)分患者與BCG-疫苗接種過(guò)的個(gè)體和自然感染但沒(méi)有發(fā)展為結(jié)核的個(gè)體。用于該發(fā)現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)詳見(jiàn)實(shí)施例2所述。實(shí)施例2為了測(cè)定MPB64作為皮膚藥貼法診斷活動(dòng)期TB的特異性抗原的可靠性，在下列三組不同個(gè)體間進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)(1)活動(dòng)期TB患者；(2)健康的結(jié)核菌素_陽(yáng)性人員；(3)家庭TB接觸人。觀察了人對(duì)MPB64的皮膚反應(yīng)與TB的臨床狀態(tài)之間的相互關(guān)系。因?yàn)楸卷?xiàng)研究的目的是測(cè)定MPB64作為用于活動(dòng)期TB的特異性診斷抗原的可靠性，所以活動(dòng)期TB患者的選擇是最重要的。檢查門(mén)診患者的臨床記錄。將唾液涂片陽(yáng)性、CXR異常和具有活動(dòng)期TB臨床癥狀的患者分為活動(dòng)期TB患者第1組。培養(yǎng)結(jié)果在多數(shù)情況下是不可得到的。不久前剛開(kāi)始化療的患者是優(yōu)選的，因?yàn)殚L(zhǎng)期化療對(duì)MPB64皮膚反應(yīng)的影響是未知的。不過(guò)，第1組中也有一些患者已經(jīng)治療了6個(gè)月。根據(jù)在最近的檢查中涂片呈陽(yáng)性以及癥狀表現(xiàn)，他們被認(rèn)為是活動(dòng)期TB患者。患者生活在診所附近，那里的社會(huì)經(jīng)濟(jì)條件非常差。他們居住的地理位置是重要的，因?yàn)樗麄儽话才?天后返回診所以讀取結(jié)果。105名試驗(yàn)患者中只有12名沒(méi)有返回。在返回的患者中，53名可用于最后的分析。分析結(jié)果如表1所示。其余患者排除在外，因?yàn)樗麄兊乃庂N在讀取結(jié)果當(dāng)天之前已經(jīng)揭去或脫落了。根據(jù)臨床記錄篩選患者，僅選擇涂片陽(yáng)性、CXR異常和具有咳嗽、發(fā)燒或體重降低等指示TB的其他癥狀的患者作為活動(dòng)期TB患者。培養(yǎng)物陽(yáng)性的患者是優(yōu)選的，但是培養(yǎng)物的結(jié)果僅有七例可以利用。多數(shù)活動(dòng)期TB患者已經(jīng)化療1-4個(gè)月。有一些在進(jìn)行研究時(shí)已經(jīng)治療了6個(gè)月。健康的結(jié)核菌素陽(yáng)性志愿者是不顯示任何TB指征的菲律賓人和日本人。在進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，一些家庭成員陪TB患者也來(lái)到診所。他們作為“家庭TB接觸人”進(jìn)行試驗(yàn)。所有受試者都被告知研究的大致情況，并同意進(jìn)行試驗(yàn)。三組供試者數(shù)量如下第1組活動(dòng)期TB患者，53；第2組健康對(duì)照，43；第3組家庭TB接觸人，41。從東京牛分枝桿菌BCG(從日本東京的日本BCG實(shí)驗(yàn)室得到)的8天培養(yǎng)物濾液中分離到MPB64。將純化蛋白懸浮在PBS中，貯藏在-20°C下。用Lowry法測(cè)量蛋白質(zhì)的量。將從牛分枝桿菌BCG的8天培養(yǎng)物濾液中用硫酸銨沉淀出來(lái)的全蛋白命名為PPD-eT，以區(qū)分純化蛋白衍生物結(jié)核菌素(PPD)，用作藥貼試驗(yàn)的對(duì)照。從結(jié)核分枝桿菌AoyamaB制備的PPD是從日本BCG實(shí)驗(yàn)室(日本東京)得到的。將五個(gè)結(jié)核菌素單位(TU)的懸浮在0.Iml重建緩沖液中的PPD用于芒圖氏皮內(nèi)注射試驗(yàn)。藥貼試驗(yàn)材料使用15mm紗布大小的TORII藥貼繃帶“Toriiban”從ToriiandCo.，Ltd.，Tokyo得到)。將抗原溶液(75μg抗原的100μ1PBS溶液，含有0.005%吐溫80)倒在紗布上，將藥貼貼在受試者前臂上，前臂上藥貼用藥的皮膚區(qū)域已經(jīng)用酒精清潔過(guò)。藥貼放置在受試者皮膚上，使浸潤(rùn)有抗原溶液的紗布直接與皮膚接觸。藥貼留置72小時(shí)。藥貼試驗(yàn)安排試驗(yàn)活動(dòng)期TB患者和結(jié)核菌素陽(yáng)性健康對(duì)照對(duì)左臂上的ΜΡΒ64藥貼和右臂上的PPD-eT藥貼的皮膚反應(yīng)。每種藥貼含有75μg抗原。將PPD皮內(nèi)注射(5TU/100μ1)到右前臂上不同于藥貼的位置。PPD-eT藥貼用于確認(rèn)蛋白質(zhì)抗原沒(méi)有透皮進(jìn)入到體內(nèi)。如果PPD試驗(yàn)陽(yáng)性而PPD-eT藥貼試驗(yàn)陰性，那么透皮給藥是不完全的。這種情況排除在試驗(yàn)結(jié)果之外。3天(72小時(shí))后揭去藥貼，將反應(yīng)結(jié)果判斷為陽(yáng)性或陰性。用藥部位皮膚沒(méi)有變化為“陰性”，而用藥部位出現(xiàn)紅斑、硬結(jié)或若干小紅泡則記錄為對(duì)抗原呈“陽(yáng)性”應(yīng)答。我們比較了藥貼在前臂和上臂的用藥。在讀取結(jié)果當(dāng)天以前，藥貼從上臂脫落(41.2%)比從前臂脫落(17.6%)更為容易。因此，前臂是成人試驗(yàn)所推薦的。統(tǒng)計(jì)學(xué)二乘二偶然性試驗(yàn)用于評(píng)價(jià)人MPB64藥貼試驗(yàn)結(jié)果?；顒?dòng)期TB患者和結(jié)核菌素陽(yáng)性健康對(duì)照表1顯示第1組和第2組中對(duì)MPB64反應(yīng)陽(yáng)性或陰性的實(shí)際數(shù)目。所有受試者都對(duì)PPD芒圖氏試驗(yàn)和PPD-eT藥貼試驗(yàn)呈陽(yáng)性。由這些結(jié)果計(jì)算下列數(shù)值靈敏度98.；特異性100%；假陽(yáng)性率0%；假陰性率1.9%；陽(yáng)性預(yù)期值100%；陰性預(yù)期值97.7%；試驗(yàn)效力98.9%。結(jié)果說(shuō)明，MPB64藥貼試驗(yàn)是有效區(qū)分活動(dòng)期TB與健康結(jié)核菌素陽(yáng)性人員的方法。表1MPB64藥貼試驗(yàn)第1組與第2組之間的二乘二偶然性試驗(yàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>家庭TB接觸人家庭TB接觸人(第3組)的數(shù)量是41，包括12名男性和29名女性。藥貼試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。有26名受試者顯示對(duì)PPD-eT和MPB64藥貼的陽(yáng)性反應(yīng)(63.4%)，九名受試者對(duì)PPD-eT陽(yáng)性而對(duì)MPB64陰性(22.0%)六人(14.6%)對(duì)PPD-eT和MPB64陰性。在這些雙陰性人員中，三名對(duì)PPD芒圖氏試驗(yàn)陰性。第3組受試者在臨床上不被記錄為T(mén)B患者。各人的臨床狀態(tài)是未知的，盡管觀察到了某些提示為T(mén)B的癥狀。表2家庭TB接觸人的MPB64和PPD_eT藥貼試驗(yàn)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>本項(xiàng)研究強(qiáng)烈地提示，MPB64藥貼試驗(yàn)是有希望用于活動(dòng)期TB的快速診斷的工具。它能夠區(qū)分活動(dòng)期TB患者與接種過(guò)BCG疫苗的個(gè)體或被TB感染但還沒(méi)有發(fā)展為疾病的個(gè)體，靈敏度為98.1%，特異性為100%。該藥貼試驗(yàn)還具有優(yōu)于皮內(nèi)注射的優(yōu)點(diǎn)，即技術(shù)簡(jiǎn)易和用藥安全。該藥貼試驗(yàn)據(jù)認(rèn)為能夠?yàn)榛颊弋a(chǎn)生應(yīng)答而連續(xù)地供應(yīng)抗原，不過(guò)并不希望受任何理論的局限。實(shí)施例3為了測(cè)定MPB64作為利用皮膚藥貼法用于活動(dòng)期TB的特異性診斷抗原的可靠性，在豚鼠上進(jìn)行了對(duì)比試驗(yàn)。從JapanLaboratoryAnimals,Inc.，Tokyo購(gòu)買(mǎi)雌性白化體Hartley豚鼠，在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)重300至400g。動(dòng)物在日本BCG實(shí)驗(yàn)室保持在無(wú)特異性病原體的條件下?？乖凑諏?shí)施例2所述方法和材料制備抗原。豚鼠的致免疫按照廠商說(shuō)明書(shū)重建活體BCG疫苗(日本BCG實(shí)驗(yàn)室，日本東京)，無(wú)佐劑方式皮下注射給豚鼠，劑量為0.5mg每只動(dòng)物。在BCG注射后的4與25周之間對(duì)動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)。藥貼試驗(yàn)材料使用7mm紗布大小的TORII藥貼繃帶(從ToriiandCo.，Ltd.，Tokyo,Japan得到)。將抗原溶液(75μg抗原的15μ1PBS溶液，含有0.005%吐溫80)倒在紗布上，將藥貼貼在每只豚鼠的去毛部位上。將ΜΡΒ64用在藥貼上，劑量如圖1所示，將藥貼貼在BCG-致免疫的豚鼠右側(cè)與左側(cè)脅腹上，其上的毛已被除去。藥貼試驗(yàn)安排24小時(shí)后揭去藥貼，立即讀取反應(yīng)結(jié)果。用藥部位皮膚沒(méi)有變化為“陰性”，而用藥部位出現(xiàn)紅斑、硬結(jié)或若干小紅泡則記錄為對(duì)抗原呈“陽(yáng)性”應(yīng)答。BCG-致免疫的豚鼠藥貼試驗(yàn)中對(duì)MPB64的劑量應(yīng)答預(yù)先用BCGTokyo致免疫4周的豚鼠用于MPB64藥貼試驗(yàn)，抗原劑量各不相同。藥貼試驗(yàn)的最高劑量為75μg/貼。用含有2.3至75μg/貼不等的MPB64的藥貼對(duì)動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)。24小時(shí)后揭去藥貼，讀取反應(yīng)結(jié)果為陽(yáng)性或陰性。為了確使動(dòng)物對(duì)BCG敏感，皮內(nèi)注射0.05μgPPD的0.Iml緩沖溶液，在24小時(shí)后測(cè)量皮膚反應(yīng)。圖1顯示劑量-應(yīng)答實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在4.7μg/貼的劑量或更高濃度下，對(duì)MPB64的應(yīng)答為陽(yáng)性。在2.3ygMPB64每貼的劑量下沒(méi)有觀察到陽(yáng)性反應(yīng)。陰性對(duì)照藥貼僅含有PBS，PBS含有0.005%吐溫80，在BCG-致免疫的豚鼠中沒(méi)有引起任何皮膚反應(yīng)。未致免疫的豚鼠未顯示出對(duì)PPD或MPB64的任何應(yīng)答。BCG-致免疫的豚鼠對(duì)MPB64的皮膚反應(yīng)的時(shí)間過(guò)程已知在用MPB64的皮內(nèi)注射進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，BCG-致免疫的豚鼠在BCG致免疫后15周喪失對(duì)MPB64的皮膚反應(yīng)。為了確認(rèn)這一點(diǎn)在藥貼試驗(yàn)中是否也是如此，將豚鼠用BCGTokyo致免疫，在BCG注射后的不同時(shí)間用MPB64藥貼進(jìn)行試驗(yàn)。各動(dòng)物僅試驗(yàn)一次，以避免加強(qiáng)效應(yīng)。作為對(duì)照，同時(shí)對(duì)每只動(dòng)物施用PPD-eT藥貼試驗(yàn)。結(jié)果如圖2所示。DTH以3+、2+等表示，因?yàn)榉磻?yīng)直徑是通過(guò)藥貼大小來(lái)調(diào)節(jié)的，而不是通過(guò)抗原劑量。所有動(dòng)物對(duì)MPB64藥貼試驗(yàn)的皮膚反應(yīng)直到BCG注射后13周還都是陽(yáng)性。后來(lái)變得幾乎不可檢測(cè)，在23周后完全為陰性。相形之下，對(duì)PPD-eT藥貼試驗(yàn)的反應(yīng)直到BCG注射后25周實(shí)驗(yàn)結(jié)束仍然保持陽(yáng)性。在BCG注射后不同時(shí)間檢查對(duì)MPB64和PPD_eT的遲發(fā)型超敏性(DTH)。圖2各點(diǎn)代表3只豚鼠的遲發(fā)型超敏性，表示如下3+紅斑和硬結(jié)；2+紅斑；1+小泡；+/-顏色模糊(可疑反應(yīng))；沒(méi)有反應(yīng)。豚鼠藥貼試驗(yàn)確認(rèn)，用于人的抗原劑量的1/16引起陽(yáng)性反應(yīng)。當(dāng)然，不言而喻的是，前述內(nèi)容僅涉及本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，在不背離本發(fā)明精神和范圍的前提下可以作出大量改進(jìn)或變更。權(quán)利要求用于診斷傳染病的透皮釋放裝置，包括一種組合物的局部用藥，該組合物包含抗原和生理學(xué)上有效的溶液。2.權(quán)利要求1的裝置，其中的裝置包括一種選自由醫(yī)用膠帶、醫(yī)用橡皮膏、紗布、TORII繃帶、Finn-chamber和Perm-aideS.組成的組中的材料。3.權(quán)利要求2的裝置，其中的抗原是來(lái)源于分枝桿菌菌種的，包括結(jié)核分枝桿菌復(fù)合物、胞內(nèi)鳥(niǎo)分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、龜分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌、非洲分枝桿菌和田鼠分枝桿菌。4.權(quán)利要求3的裝置，其中的抗原包含MPB44、MPB45、MPB51、MPB59、MPB64、MPB70、MPB80或MPB83。5.權(quán)利要求1的裝置，其中的生理學(xué)上有效的溶液包含表面活性劑、緩沖劑或溶劑。6.權(quán)利要求5的裝置，其中的生理學(xué)上有效的溶液包含磷酸鹽緩沖溶液，其中包含吐溫20、吐溫40、吐溫60或吐溫80。7.權(quán)利要求2的裝置，其中的抗原包含MPB64，生理學(xué)上有效的溶液包含磷酸鹽緩沖溶液和吐溫80。8.權(quán)利要求7的裝置，其中的傳染病包括結(jié)核。9.檢測(cè)活動(dòng)期疾病的方法，包括通常將透皮釋放裝置施用到皮膚上，其中所述的裝置包含一種抗原組合物；在預(yù)定時(shí)間階段后除去所述的透皮釋放裝置；觀察皮膚的免疫應(yīng)答；和使免疫應(yīng)答的存在與活動(dòng)期疾病發(fā)生相互關(guān)聯(lián)。10.權(quán)利要求9的方法，其中的透皮釋放裝置包括一種選自由醫(yī)用膠帶、醫(yī)用橡皮膏、紗布、TORII繃帶、Finn-chamber和PermiadeS.組成的組中的材料。11.權(quán)利要求9的方法，其中的抗原組合物包含生理學(xué)上有效的溶液，還進(jìn)一步包含來(lái)源于下列分枝桿菌菌種的抗原結(jié)核分枝桿菌復(fù)合物、胞內(nèi)鳥(niǎo)分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、龜分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌、非洲分枝桿菌和田鼠分枝桿菌。12.權(quán)利要求11的方法，其中的抗原包含MPB44、MPB45、MPB51、MPB59、MPB64、MPB70、MPB80或MPB83。13.權(quán)利要求11的方法，其中的生理學(xué)上有效的溶液包含表面活性劑、緩沖劑和溶劑。14.權(quán)利要求13的方法，其中的生理學(xué)上有效的溶液包含磷酸鹽緩沖溶液，其中包含吐溫20、吐溫40、吐溫60或吐溫80。15.權(quán)利要求11的方法，其中的抗原組合物包含MPB64，磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)一步包含吐溫80。16.權(quán)利要求15的方法，其中的活動(dòng)期疾病包括結(jié)核。17.用于檢測(cè)傳染病的組合物，包含一種抗原，和一種在局部用藥后用于透皮釋放的生理學(xué)上有效的溶液。18.權(quán)利要求17的組合物，其中的抗原來(lái)源于分枝桿菌。19.權(quán)利要求18的組合物，其中的抗原包含]\0^44、]\0^45、]\0^51、]\0^59、]\0^64、]\0^70、MPB80或MPB83。20.權(quán)利要求19的組合物，其中的用于透皮釋放的生理學(xué)上有效的溶液包含表面活性齊U、緩沖劑和溶劑。全文摘要提供了用于傳染病檢測(cè)和診斷的方法和組合物。特別是提供了用于活動(dòng)期分枝桿菌疾病檢測(cè)的有效和靈敏的方法和組合物，用于區(qū)分患有活動(dòng)期疾病的個(gè)體與已經(jīng)在免疫學(xué)上接觸過(guò)的個(gè)體，例如被分枝桿菌感染過(guò)但沒(méi)有活動(dòng)期疾病的個(gè)體或已經(jīng)進(jìn)行過(guò)BCG疫苗接種的個(gè)體。該方法包括將用于透皮釋放的抗原組合物局部用藥。文檔編號(hào)A61B10/00GK101804213SQ20091025414公開(kāi)日2010年8月18日申請(qǐng)日期1999年2月4日優(yōu)先權(quán)日1998年2月6日發(fā)明者中村玲子申請(qǐng)人:日本Bcg制造株式會(huì)社;中村玲子