專利名稱：牛型結(jié)核菌素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及牛型結(jié)核菌素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及其制備方法，屬于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)和獸用生物
制品技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
牛結(jié)核病是由牛分枝桿菌引起的對動物和人的一種慢性細菌性疾病，該病呈世界性分布，也是我國牛的主要傳染病，能夠傳播給人類，使人患結(jié)核病，對人類的健康威脅較大。由于我國對牛結(jié)核病陽性牛實行淘汰制度，牛結(jié)核診斷技術(shù)尤為重要，牛結(jié)核菌素診斷技術(shù)是世界動物衛(wèi)生組織(OIE)推薦的唯一診斷方法。提純牛型結(jié)核菌素產(chǎn)品的效價標(biāo)定，是用豚鼠的皮膚變態(tài)反應(yīng)方法，用標(biāo)準(zhǔn)品作為對照，通過皮膚反應(yīng)面積的比對，用統(tǒng)計學(xué)方法確定牛結(jié)核菌素產(chǎn)品的國際單位(IU)含量。由世界動物衛(wèi)生組織(OIE)指定的參考實驗室提供國際標(biāo)準(zhǔn)品，也稱之為基準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品，各國實驗室用國際標(biāo)準(zhǔn)品溯源制備各自國家的國家標(biāo)準(zhǔn)品，用于結(jié)核菌素產(chǎn)品的標(biāo)定。然而，標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量要求高，制備方法和檢驗或標(biāo)定方法嚴(yán)格，有關(guān)制備程序和標(biāo)定方法至今未見有關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立一種利用由我國分離的牛分支桿菌來制備牛型結(jié)核菌素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的方法以制備出合格的牛型結(jié)核菌素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。 本發(fā)明是通過一下技術(shù)路線來實現(xiàn)的，即是通過利用由我國分離的牛分支桿菌經(jīng)
過培養(yǎng)、滅活、過濾、純化及凍干工藝過程制備牛型結(jié)核菌素，并通過對其中的蛋白、核酸及
多糖含量的測定及結(jié)合豚鼠和牛的皮膚敏感試驗測定而制備出牛型結(jié)核菌素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。 本發(fā)明的詳細描述 —、牛型結(jié)核菌素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備 1.培養(yǎng)基 蘇通合成培養(yǎng)基(農(nóng)業(yè)部獸用生物制品規(guī)程委員會.中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程，2000年版，化學(xué)工業(yè)出版社，2000)成分包括如下，天門冬素、檸檬酸、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、檸檬酸鐵銨、甘油等，每種成分均為分析純。
2.菌種本發(fā)明所用的牛分枝桿菌C68001和C68002株由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。
(1)菌種特性 1)菌種形態(tài)在光學(xué)顯微鏡下觀察，菌體為細長、直或稍彎的桿菌，長約1. 5 4微米，寬0. 2 0. 6微米，革蘭氏陽性，抗酸染色陽性。 2)培養(yǎng)特性在配氏(Petragnani)固體培養(yǎng)基培養(yǎng)20天以上，生長的單個菌落為淡黃色顆粒狀，較為干燥。在蘇通培養(yǎng)基中生長良好，培養(yǎng)20天培養(yǎng)基表層應(yīng)出現(xiàn)較豐富的菌膜，液體應(yīng)清亮，生長純粹，培養(yǎng)時間視生長情況一般2 3個月。
3)毒力對家兔耳靜脈注射活菌6 10mg，可致死家兔。
3
(2)生產(chǎn)用種子制備 1) —級種子制備將凍干菌種開封后，接種小川培養(yǎng)基(見附錄1)置37t:溫室中培養(yǎng)約兩周左右，發(fā)育生長呈黃色顆粒狀菌落或菌苔，為一級種子。 2) 二級種子制備用鉑金鏟鉤取一級種子菌苔或菌落，均勻涂布于數(shù)支小川培養(yǎng)基斜面上，置37t:溫室中培養(yǎng)IO天左右，用鉑金鏟從小川培養(yǎng)基斜面上鉤取菌苔，在蘇通合成培養(yǎng)基(見附錄2)試管內(nèi)壁充分研細，然后傾斜試管，用培養(yǎng)基輕輕接觸菌體，使其浮在培養(yǎng)基液面上，緩慢移至37t:溫室中培養(yǎng)7 15日，則在培養(yǎng)基表面形成薄的菌膜。用鉑金環(huán)挑出一塊菌膜移植到蘇通合成培養(yǎng)基瓶中，在37t:溫室中培養(yǎng)7 15日，即可在培養(yǎng)瓶液體表面形成具有彈性的菌膜，再菌膜移植到蘇通合成培養(yǎng)基瓶中，在37t:溫室中培養(yǎng)7 15日，在球瓶液體表面上形成微有皺褶、彈性較強的菌膜，此菌膜即可作為大量生產(chǎn)的種子，經(jīng)肉眼觀察，液體必須清亮，菌膜純粹、薄白、無雜菌污染作為二級種子。
3.牛型結(jié)核菌素的制備 (1)接種挑取菌膜徐徐放入瓶的液面上，持瓶者塞好瓶塞，輕輕放回原處。 接種完畢后，應(yīng)對已接種的培養(yǎng)基瓶逐瓶進行檢查，發(fā)現(xiàn)有種子下沉或散開者應(yīng)
進行再接種。接種結(jié)束后，小心移入溫室中，輕放于培養(yǎng)架上。 (2)培養(yǎng)于室溫下培養(yǎng)2 3個月菌膜應(yīng)生長較厚，應(yīng)停止培養(yǎng)。 (3)滅活培養(yǎng)結(jié)束，培養(yǎng)物經(jīng)121°C 30min滅活處理。 (4)混合粗濾首先各取兩個菌株對應(yīng)批號、相同瓶數(shù)的培養(yǎng)物混合后用雙層紗布加一層銅紗濾過除去菌膜。 (5)細濾在蔡氏濾器(型號2000ml生產(chǎn)廠商北京中北國泰生物技術(shù)有限公司)中加入8塊濾板(型號甲III，生產(chǎn)商大連源順過濾器材有限公司)，打開空氣壓縮機電源使純化水完全通過濾器后將混合菌液吸入儲料罐，再使之完全通過濾器，即為牛型結(jié)核菌素濾液。 (6)提純將1倍體積的40%三氯醋酸溶液(見附錄)徐徐加入到9倍體積的結(jié)核菌素濾液中，邊加邊攪拌，混勻后，在2 『C靜置14 24h，使蛋白沉淀。然后小心將上清吸出，收集沉淀。用1%三氯醋酸溶液(見附錄)將沉淀物重新懸浮混勻，再離心沉淀(4000r/min，2 8°C，30min)去上清，如此重復(fù)3次。最后一次離心結(jié)束后，棄上清稱取濕蛋白凈重。 (7)重溶過濾將沉淀物先加少量lmol/L氫氧化鈉溶液(見附錄)，使之溶解。根據(jù)濕蛋白凈重和適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)計算出稀釋后菌素總體積和需要pH 7.4磷酸鹽緩沖液(見附錄)的體積。稀釋后，調(diào)PH到7.4，用滅菌賽氏濾器過濾即為牛型結(jié)核菌素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的候選物。4.附錄培養(yǎng)基及試劑的配制(1)小川培養(yǎng)基1)成分見表1表l小川培養(yǎng)基的成分新鮮雞蛋4個2%孔雀石綠水溶液6ml鹽溶液100ml
注鹽溶液配方、制法 味精(含麩氨酸鈉80%) lg 磷酸二氫鉀(酸性) lg 甘油 6ml 預(yù)冷注射用水 94ml 將以上組分水浴加溫溶解后過濾分裝，12rC滅菌30分鐘，備用。
2)制法 將鮮雞蛋用肥皂洗刷，用自來水沖洗干凈，將洗凈雞蛋浸入75 %酒精中數(shù)分鐘。用無菌紗布將雞蛋表面酒精擦干。用無菌鑷子除去雞蛋一端外殼，將此端朝下，并在上端打一小孔，使蛋液流入帶有玻璃珠的大口瓶中，搖晃使蛋清蛋黃混合均勻。將鹽溶液及2%孔雀石綠6ml傾入蛋液中搖勻，通過兩層紗布滅菌漏斗過濾分裝試管。將試管在血清凝固器中擺成斜面，85-9(TC滅菌1小時，第二天可重復(fù)一次，取出經(jīng)無檢合格即放2-8t:冰箱保存?zhèn)溆谩?(2)蘇通合成培養(yǎng)基 1)成分見表2 表2蘇通合成培養(yǎng)基的成分 天門冬素 4g 檸檬酸 2g 含水硫酸鎂 0. 5g 磷酸氫二鉀 0. 5g 擰檬酸鐵銨 0. 05g 甘油 60ml 預(yù)冷注射用水 940ml 2)制法 將配方中的固體成分加入少量預(yù)冷注射用水中。徐徐加熱，使全部材料溶解。入余水和甘油。用氫氧化鈉溶液調(diào)整pH至7.0。加熱煮沸，濾過后分裝。以116t:滅菌40分鐘或12rC滅菌30分鐘。
(3)三氯醋酸溶液(40%和1% ) 40%三氯醋酸溶液將400g三氯醋酸溶于1000ml預(yù)冷注射用水中即可； 1 %三氯醋酸溶液將1份40%三氯醋酸溶液和9份預(yù)冷注射用水混合均勻即可。 (4) lmol/L氫氧化鈉溶液 將40g氫氧化鈉(分析純)加預(yù)冷注射用水至1000ml即可。
(5) lmol/L鹽酸溶液將83. 3ml濃鹽酸(質(zhì)量百分濃度36-38%;摩爾濃度約12mol/L)和917. 7ml預(yù)
冷注射用水混合均勻即可。 (6) pH7. 4磷酸鹽緩沖液 甲液l/30mol/L十二水磷酸氫二鈉，取11. 9g十二水磷酸氫二鈉溶于1000ml預(yù)冷注射用水中即可； 乙液l/30mol/L磷酸二氫鉀，取4. 5g磷酸二氫鉀溶于1000ml預(yù)冷注射用水中即
5可。 將81份甲液和19份乙液混合均勻，調(diào)pH至7. 4， 12rC滅菌30分鐘。 二、牛型結(jié)核菌素(候選物)的鑒定 1.無菌檢驗 按《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》(2000年版)規(guī)定方法進行。 2.蛋白含量測定 取少量無菌檢驗合格的提純牛型結(jié)核菌素半成品，采用凱氏定氮法，具體操作步 驟參見附《牛型提純結(jié)核菌素國家標(biāo)準(zhǔn)品蛋白質(zhì)含量測定標(biāo)準(zhǔn)操作方法》根據(jù)蛋白含量測
定結(jié)果， 用pH 7. 4磷酸鹽緩沖液(苯酚含量為0. 5% (W/V))將提純牛型結(jié)核菌素半成品 稀釋成每lml含1.8mg蛋白質(zhì)。 3. 純 度 測 定 (Physicochemical and Biological Studies on Various Preparations ofTuberculin Purified Protein Derivative APPLIED MICROBIOLOGY, March,1965， Copyright 1965 American Society for Microbiology, Vol. 13， No. 2 ;中 華人民共和國藥典2005年三部《卡介苗純蛋白衍生物》)。 [OO72] (1)核酸含量測定 取本品2 3ml，采用紫外-可見分光光度法，于波長260nm處測定吸光度，按 Elcm1%= 200計算核酸含量。 [OO 4] (2)多糖含量測定 以生理鹽水溶液稀釋無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，制備0 100 g/ml，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液， 將硫酸225ml加入到75ml生理氯化鈉溶液中，另稱取蒽酮0. 6g，加入到10ml乙醇中，將上 述溶液混合，配置成蒽酮混合液。分別精確量取1. 0ml，不同濃度標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，以及本 品，加入4. 0ml蒽酮混合液，混均，置沸水浴20min后與波長620nm處測定吸光度，計算多糖 (3)判定標(biāo)準(zhǔn) 每lmg蛋白質(zhì)含多糖與核酸總量應(yīng)不高于0. lmg。 (4)候選物選擇選擇蛋白質(zhì)含量適宜，核酸和多糖總量末超出標(biāo)準(zhǔn)的候選物(每 lmg蛋白質(zhì)含多糖與核酸總量應(yīng)不高于O. lmg)用于定量分裝、冷凍真空干燥，用誤差《1% 的分裝儀器定量分裝，按適宜凍干曲線冷凍干燥。
三、牛型結(jié)核菌素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的檢驗 1.均勻性試驗取樣品15支，用凱氏定氮法測定每支安瓿的結(jié)核菌素蛋白質(zhì)含量， 平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、變異系數(shù)，標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)應(yīng)《5%。 2.穩(wěn)定性試驗用熱加速穩(wěn)定性試驗測定，檢查在高溫條件下，樣品放置的時間。并 以此數(shù)據(jù)作為依據(jù)，為下一批穩(wěn)定性試驗作基礎(chǔ)。 [OO82] 3.效價測定(初次) [OO83] (1)預(yù)備試驗 1)豚鼠致敏選體重400g左右的白色豚鼠10 12只，分別在大腿內(nèi)側(cè)深部肌肉 注射牛型結(jié)核桿菌致敏原(先將牛型結(jié)核桿菌培養(yǎng)物刮下、稱重、磨碎，加適量生理鹽水稀 釋，12rC滅活30分鐘，再用弗氏不完全佐劑制成油乳劑，使每lml含牛型結(jié)核桿菌8 10mg，分裝后8(TC水浴滅菌2小時。無菌檢驗合格后置2 8t:備用)0. 5ml。 2)豚鼠測敏致敏5周后，將每只致敏豚鼠臀部拔去一小塊被毛(約3cm2，避開注
射致敏原一側(cè))，第2日將牛型提純結(jié)核菌素國際標(biāo)準(zhǔn)品或國家標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成每lml含結(jié)核
菌素32. 5IU，于拔毛處皮內(nèi)注射0. lml，注射后48小時觀察，注射部位皮膚紅腫面積達lcm2
以上者，方可用于效價測定。 (2)正式測定 將待測樣品稀釋成每lml含結(jié)核菌素蛋白(按lmg相當(dāng)于32， 500IU計算)25、50、100和200IU的4種不同濃度；將國際標(biāo)準(zhǔn)品(英國國家生物標(biāo)準(zhǔn)檢定所，下同)也作同樣稀釋。挑選8只致敏合格豚鼠，于注射的前一日將胸腹部二側(cè)被毛拔去(約3X9cm2)，采用輪回換點方式在每只豚鼠拔毛處依次注射此8種菌素稀釋液，每點皮內(nèi)注射0. lml，注射后24小時用游標(biāo)卡尺測量每個注射點皮膚紅腫面積，計算待測樣品各梯度和國際標(biāo)準(zhǔn)品各稀釋度在8只豚鼠身上引起皮膚紅腫面積(以24小時判定為主，如有必要42小時可作第二次判定)。(世界動物衛(wèi)生組織著，農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)局/中國世界動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心譯.陸生動物診斷試驗和疫苗手冊[S]. 2007 :399-410.)
4.安全檢驗 用生理鹽水將提純牛型結(jié)核菌素稀釋成每lml 32500IU。用體重350 450g的豚鼠2只，每只腹腔注射結(jié)核菌素lml，觀察10日。
5.特異性檢驗
(1)用牛檢驗 用健康易感牛20頭，分為兩組，每組10頭。 第一組頸左側(cè)皮內(nèi)注射被檢結(jié)核菌素，右側(cè)注射國際標(biāo)準(zhǔn)品。 第二組頸左側(cè)皮內(nèi)注射國際標(biāo)準(zhǔn)品，右側(cè)注射被檢結(jié)核菌素。 各皮內(nèi)注射每lml含32500IU的菌素0. lml，注射后72小時判定，個別牛反應(yīng)不一
致時，可在不同部位即刻作第二次注射。觀察被檢結(jié)核菌素與國際標(biāo)準(zhǔn)品對牛有無非特異
性炎性反應(yīng)。 (2)用豚鼠檢驗 用體重350 450g的豚鼠進行特異性檢驗，其方法與"效價測定(第一次)"基本相同，但菌素不作稀釋，每lml含32500IU，皮內(nèi)注射0. lml。注射后48小時判定，觀察有無任何炎性反應(yīng)。 6.定值(協(xié)作標(biāo)定)國家標(biāo)準(zhǔn)品效價單位的確定一般用各協(xié)作單位結(jié)果的統(tǒng)計值表示，一般需經(jīng)幾個有經(jīng)驗的實驗室協(xié)作進行。參加單位應(yīng)采用統(tǒng)一的設(shè)計方案、統(tǒng)一的方法和統(tǒng)一的記錄格式，標(biāo)定結(jié)果須經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理(標(biāo)定結(jié)果至少需取得5次獨立的有效結(jié)果)。 (1)數(shù)據(jù)統(tǒng)計通過協(xié)作標(biāo)定所測定的數(shù)據(jù)，采用中華人民共和國獸藥典一部(2005年版)，生物檢定統(tǒng)計法中的量反應(yīng)平行線測定法。(中華人民共和國國家計量技術(shù)規(guī)范JJG1006-94《一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)》國家技術(shù)監(jiān)督局；中華人民共和國獸藥典二OO五年版一部) (2)國際單位確定通過協(xié)作標(biāo)定結(jié)果數(shù)據(jù)統(tǒng)計后計算出lmg結(jié)核菌素的國際單位含量，以此作為國家標(biāo)準(zhǔn)品的確定值。
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本發(fā)明的積極意義 本發(fā)明涉及一種牛型結(jié)核菌素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及其制備方法。本發(fā)明所涉及的牛型結(jié)核菌素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是通過利用由我國分離的牛分支桿菌經(jīng)過培養(yǎng)、滅活、過濾、純化等工藝過程制備牛型結(jié)核菌素，并通過對其中的蛋白、核酸及多糖含量的測定及結(jié)合生物學(xué)試驗測定而制備出牛型結(jié)核菌素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。本發(fā)明的方法使標(biāo)準(zhǔn)品制備更加科學(xué)、嚴(yán)謹、完善，按照標(biāo)準(zhǔn)品制備程序使每一個步驟科學(xué)嚴(yán)謹，經(jīng)過協(xié)作標(biāo)定，數(shù)據(jù)統(tǒng)計，保證效價定值準(zhǔn)確。
實施例1牛型提純結(jié)核菌素國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備
1.培養(yǎng)基 蘇通合成培養(yǎng)基(農(nóng)業(yè)部獸用生物制品規(guī)程委員會.中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程，2000年版，化學(xué)工業(yè)出版社，2000)成分包括如下，天門冬素4g、檸檬酸2g、硫酸鎂0. 5g、磷酸氫二鉀0. 5g、檸檬酸鐵銨0. 05g、甘油60ml，每種成分均為分析純。加蒸餾水940ml，共制備50000ml。
2.菌種 牛分枝桿菌C68001和C68002株(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供)。
(1)生產(chǎn)用種子制備[O109] 1) —級種子制備 接種將凍干菌種開封后，接種小川培養(yǎng)基置37t:溫室中培養(yǎng)約兩周左右，發(fā)育生
長呈黃色顆粒狀菌落或菌苔，為一級種子。
2) 二級種子制備 用鉑金鏟鉤取一級種子菌苔或菌落，均勻涂布于數(shù)支小川培養(yǎng)基斜面上，置37t:溫室中培養(yǎng)10天左右，即可發(fā)育良好。此培養(yǎng)物用作液體馴化。 為使生長在固體培養(yǎng)基上的結(jié)核菌種能在液體培養(yǎng)基中生長繁殖，以適應(yīng)結(jié)核菌素生產(chǎn)的需要，應(yīng)于生長前期將菌種接種于液體培養(yǎng)基上，進行種子馴化工作。用鉑金鏟從小川培養(yǎng)基斜面上鉤取菌苔，在蘇通合成培養(yǎng)基試管內(nèi)壁充分研細，然后傾斜試管，用培養(yǎng)基輕輕接觸菌體，使其浮在培養(yǎng)基液面上，緩慢移至37t:溫室中培養(yǎng)7 15日，則在培養(yǎng)基表面形成薄的菌膜。用鉑金環(huán)挑出一塊菌膜移植到蘇通合成培養(yǎng)基瓶中，在37t:溫室中培養(yǎng)7 15日，即可在培養(yǎng)瓶液體表面形成具有彈性的菌膜，再菌膜移植到蘇通合成培養(yǎng)基瓶中，在37t:溫室中培養(yǎng)7 15日，在球瓶液體表面上形成微有皺褶、彈性較強的菌膜，此菌膜即可作為大量生產(chǎn)的種子，為二級種子。
3) 二級種子鑒定 肉眼觀察，液體必須清亮，菌膜純粹、薄白、無雜菌污染。對于液體不清亮的培養(yǎng)物棄去。 3.菌素制造 1)接種挑取菌膜徐徐放入瓶的液面上，持瓶者塞好瓶塞，輕輕放回原處。 接種完畢后，應(yīng)對已接種的培養(yǎng)基瓶逐瓶進行檢查，發(fā)現(xiàn)有種子下沉或散開者進
行再接種。接種結(jié)束后，小心移入溫室中，輕放于培養(yǎng)架上。 2)培養(yǎng)培養(yǎng)期間須定期檢查溫度、濕度和有無雜菌生長。污染者及時高壓滅菌棄去。 3)滅活培養(yǎng)2 3個月，菌膜生長較厚，停止培養(yǎng)，培養(yǎng)物置12rC滅活30min。
4)混合粗濾首先用雙層紗布加一層銅紗將兩個菌株同一批號相同瓶數(shù)的培養(yǎng)瓶培養(yǎng)物混合濾過除去菌膜。 5)細濾在濾器中加入8塊甲3濾板，打開空氣壓縮機電源使純化水完全通過濾器。將混合菌液吸入儲料罐，再使之完全通過濾器，即為結(jié)核菌素濾液。大約40000ml。
6)提純將1倍體積的40%三氯醋酸溶液(見附錄)徐徐加入到9倍體積的結(jié)核菌素濾液中，邊加邊攪拌，混勻后，在2 『C靜置14-24小時，使蛋白沉淀。然后小心將上清吸出，收集沉淀。用1%三氯醋酸溶液(見附錄)將沉淀物重新懸浮混勻，再離心沉淀(4000r/min，2 8°C，30min)去上清，如此3次。最后一次離心結(jié)束后，棄上清稱重，并減去離心管重量得到濕蛋白凈重，大約70g左右。 重溶過濾。將沉淀物先加少量(約7ml) lmol/L氫氧化鈉溶液(見附錄)，使之溶解。根據(jù)濕蛋白凈重和適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)計算出稀釋后菌素總體積和需要PH7.4磷酸鹽緩沖液(見附錄)的體積。先量取少量pH7.4磷酸鹽緩沖液將離心管內(nèi)菌素濃縮液進行稀釋，并用量筒轉(zhuǎn)移至3000ml瓶，再用剩余體積的pH 7. 4磷酸鹽緩沖液對離心管和量筒進行2次洗滌并先后轉(zhuǎn)移至3000ml瓶，此即為單批的提純牛型結(jié)核菌素原液。將提純牛型結(jié)核菌素原液進行適當(dāng)稀釋，調(diào)pH到7.4，用滅菌賽氏濾器過濾即為候選物。
4候選物檢定
(1)無菌檢驗 按《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》(2000年版)附錄448頁進行。
(2)蛋白含量測定 取少量無菌檢驗合格的提純牛型結(jié)核菌素半成品，采用凱氏定氮法(《中華人民共和國獸藥典》2000年版一部附錄44頁)測定每lml總氮量，計算蛋白含量。具體操作步驟參見，附《牛型提純結(jié)核菌素國家標(biāo)準(zhǔn)品蛋白質(zhì)含量測定標(biāo)準(zhǔn)操作方法》根據(jù)蛋白含量測定結(jié)果，用pH7. 4磷酸鹽緩沖液(苯酚含量為0. 5% (W/V))將提純牛型結(jié)核菌素半成品稀釋成每lml含58，500IU/1. 8mg。 (3)純度測定每lmg蛋白質(zhì)含多糖與核酸總量應(yīng)不高于0. lmg。
1)核酸含量測定 取本品2 3ml，采用紫外-可見分光光度法，于波長260!1111處測定吸光度，按Elcm1%= 200計算核酸含量，測定結(jié)果為0. 002mg/mg蛋白質(zhì)。
2)多糖含量測定 以生理氯化鈉稀釋無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，制備0 100ug/ml，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，將硫酸225ml加入到75ml生理氯化鈉溶液中，另稱取蒽酮0. 6g，加入到10ml乙醇中，將上述溶液混合，配置成蒽酮混合液。分別精確量取1. Oml，不同濃度標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，以及本品，加入4. Oml蒽酮混合液，混均，置沸水浴20分鐘后與波長620nm處測定吸光度，計算多糖含量為O. 072mg/lmg/mg蛋白質(zhì)。 5.候選物選擇選擇蛋白質(zhì)含量適宜，核酸和多糖總量未超出標(biāo)準(zhǔn)的候選物凍干(每lmg蛋白質(zhì)含多糖與核酸總量應(yīng)不高于0. lmg)。核酸和多糖含量共計0. 072mg/lmg蛋白質(zhì)。 6.定量分裝、冷凍真空干燥，用誤差《1%的分裝儀器定量分裝，按適宜凍干曲線冷凍干燥。1200ml結(jié)核菌素分裝1163支安瓿，每支分裝量lml，剩余30ml左右。
實施例2牛型提純結(jié)核菌素國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的成品檢驗 1.均勻性試驗取樣品15支，用凱氏定氮法測定每支安瓿結(jié)核菌素蛋白質(zhì)含量結(jié)果見表3。 表3牛型提純結(jié)核菌素凍干后均勻性測定結(jié)果
樣品號氮含量實際蛋白質(zhì)含量理論蛋白質(zhì)含量實際蛋白質(zhì)含量與
ng/ml_ )(mg/mL)ng/mL)理論蛋白質(zhì)含量的比率
10.15340. 95880-9000106- 527 0%
20.13860. 86630.900096.250 0%
30. 13600. 85000.900096.444 4%
40.14390. 89940.900099.930 6%
50.13930, 87060.900096— 736 1%
6015150. 94690.9000105. 208 3%
0.14130. 88310.900098. 125 0%
80.14450. 90310.9000跳347 2%
90.14980. 93630.9000104. 027 8%
100.13830. 86440.900096.047 1%
110.13530. 84560.900093. 958 3%
120.14820. 926309000102 916 7%
13013700. 85630.■095. 138 9%
140.15410. 96310.■0107.013 9%
150.15340. 95880■0106. 537 8%
0.14430. 90190.9000100. 213 0%
標(biāo)準(zhǔn)乾s000690. 043104, 785 5%
變異系數(shù)cv4. 8%4. 8%04. 8% 15支安瓿平均值X為100. 2130%，標(biāo)準(zhǔn)差S為4. 7855%，變異系數(shù)CV為4. 8%。
2.穩(wěn)定性試驗國際標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)定保存期為8年，我們用熱加速耐老化試驗檢查結(jié)核菌素蛋白5(TC條件下保存效果，將樣品放置5(TC 7U4、21、和28天通過效力測定保存至21天能夠達到合格判定標(biāo)準(zhǔn)，第28天比值為0. 1109，判定不合格(合格判定標(biāo)準(zhǔn)為0. 9-1. 1)，見表4。
類別
對照組
5crc存放時間
天
14且——217. 50—0. 71
21天
28天
217. 750. 695
208. 251. 109
效價初步效
反應(yīng)面積(mm2)平均值7 234.38 215.50效價下降程度平均值7 0 0.8 3.溈
(1)豚k^ 選體重400g左右的白色豚鼠10-12只，分別在大腿內(nèi)側(cè)深部肌肉注射牛型結(jié)核桿
菌致敏原(先將牛型結(jié)核桿菌培養(yǎng)物刮下、稱重、磨碎，加適量生理鹽水稀釋，i2rc滅活30
分鐘，再用弗氏不完全佐劑制成油乳劑，使每lml含牛型結(jié)核桿菌8 10mg，分裝后8(TC水
10浴滅菌2小時。無菌檢驗合格后置2 8t:備用)0. 5ml。
(2)豚鼠測敏 致敏5周后，將每只致敏豚鼠臀部拔去一小塊被毛(約3cm2，避開注射致敏原一側(cè))，第2日將牛型提純結(jié)核菌素國際標(biāo)準(zhǔn)品或國家標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成每lml含結(jié)核菌素32. 5IU，于拔毛處皮內(nèi)注射0. lml，注射后48小時觀察，注射部位皮膚紅腫面積達lcm2以上者，方可用于效價測定，每只豚鼠均達到lcm2以上。 將待測樣品稀釋成每lml含結(jié)核菌素蛋白(按lmg相當(dāng)于32，500IU計算)25、50、100和200IU的4種不同濃度；將國際標(biāo)準(zhǔn)品也作同樣稀釋。挑選8只致敏合格豚鼠，于注射的前一日將胸腹部二側(cè)被毛拔去(約3X9cm2)，采用輪回換點方式在每只豚鼠拔毛處依次注射此8種菌素稀釋液，每點皮內(nèi)注射0. lml，注射后24小時用游標(biāo)卡尺測量每個注射點皮膚紅腫面積，計算待測樣品各梯度和國際標(biāo)準(zhǔn)品各稀釋度在8只豚鼠身上引起皮膚紅腫面積。通過計算待測各樣品的稀釋度平均反應(yīng)面積和國際標(biāo)準(zhǔn)品平均反應(yīng)面積比值為25IU比值0. 07 50IU比值0. 068 100IU比值0. 064和200IU比值0. 0114。
4.安全檢驗用生理鹽水將提純牛型結(jié)核菌素稀釋成每lml 32500IU。用體重350-450g的豚鼠2只，每只腹腔注射結(jié)核菌素lml，觀察10日。結(jié)果均健活。
5.特異性檢驗
(1)用牛檢驗 用健康易感牛20頭，分為兩組，每組10頭。 第一組頸左側(cè)皮內(nèi)注射被檢結(jié)核菌素，右側(cè)注射國際標(biāo)準(zhǔn)品。 第二組頸左側(cè)皮內(nèi)注射國際標(biāo)準(zhǔn)品，右側(cè)注射被檢結(jié)核菌素。各皮內(nèi)注射每lml含32500IU的菌素0. lml，注射后72小時判定。測定結(jié)果均無
過敏反應(yīng)。 (2)用豚鼠檢驗 用體重350-450g的豚鼠進行特異性檢驗，每lml含32500IU菌素，皮內(nèi)注射0. lml。注射后48小時判定，結(jié)果均無任何炎性反應(yīng)。 6、定值(協(xié)作標(biāo)定)用效價測定方法，國家標(biāo)準(zhǔn)品效價單位的確定一般用各協(xié)作單位結(jié)果的統(tǒng)計值表示，一般需經(jīng)幾個有經(jīng)驗的實驗室協(xié)作進行。參加單位應(yīng)采用統(tǒng)一的設(shè)計方案、統(tǒng)一的方法和統(tǒng)一的記錄格式，標(biāo)定結(jié)果須經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理(標(biāo)定結(jié)果至少需取得5次獨立的有效結(jié)果)。我們首先制定方案，由黑龍江生物藥廠、吉林生物藥廠、成都生物藥廠、中監(jiān)所等單位進行標(biāo)定，每單位進行2次獨立試驗。 (1)數(shù)據(jù)統(tǒng)計通過協(xié)作標(biāo)定所測定的數(shù)據(jù)，采用生物檢定統(tǒng)計法中的量反應(yīng)平行線測定法(中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典一部2005年版.中國農(nóng)業(yè)出版社，2006) (2)國際單位確定數(shù)據(jù)統(tǒng)計后計算出lmg結(jié)核菌素的國際單位含量為32322IU，以此作為國家標(biāo)準(zhǔn)品的確定值。
權(quán)利要求
一種牛型結(jié)核菌素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其特征在于本發(fā)明所涉及的牛型結(jié)核菌素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為每1mg蛋白質(zhì)中含多糖與核酸總量應(yīng)不高于0.1mg的牛分枝桿菌C68001和C68002株的牛型結(jié)核菌素。
2. —種牛型結(jié)核菌素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法，其特征在于是通過利用由我國分離的牛分 支桿菌經(jīng)過培養(yǎng)、滅活、過濾、純化及凍干工藝過程制備牛型結(jié)核菌素，并通過對其中的蛋 白、核酸及多糖含量的測定及結(jié)合豚鼠和牛的皮膚敏感試驗測定而制備出牛型結(jié)核菌素標(biāo) 準(zhǔn)物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種牛型結(jié)核菌素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及其制備方法。本發(fā)明所涉及的牛型結(jié)核菌素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是通過利用由我國分離的牛分支桿菌經(jīng)過培養(yǎng)、滅活、過濾、純化等工藝過程制備牛型結(jié)核菌素，并通過對其中的蛋白、核酸及多糖含量的測定及結(jié)合生物學(xué)試驗測定而制備出牛型結(jié)核菌素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。
文檔編號A61K49/00GK101732732SQ200910259889
公開日2010年6月16日 申請日期2009年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月17日
發(fā)明者關(guān)孚時, 張秀英, 戴志紅, 李翠, 林朝洪, 王在時, 申詠紅, 肖朝云, 蔣卉, 陸連壽 申請人:中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所