專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種治療腦卒中的藥物組合物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種治療腦卒中的藥物組合物，屬于藥物領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：腦血管疾病是當(dāng)今世界嚴(yán)重危害人類(lèi)生命健康的主要疾病之一，是我國(guó)的常見(jiàn)病、多發(fā)病。腦卒中是多種腦血管疾病的嚴(yán)重表現(xiàn)形式，具有極高的致殘率和較高的致死率，腦卒中一直是中國(guó)人群死亡的主要原因。2574歲年齡組人群急性腦卒中事件的平均年齡標(biāo)化發(fā)病率男性為270/10萬(wàn)，女性為161/10萬(wàn)，平均年齡標(biāo)化死亡率男性為89/10萬(wàn)，女性為61/10萬(wàn)，平均年齡標(biāo)化病死率男性為33%，女性為38%。它不僅嚴(yán)重威脅病人的生命，影響其生活質(zhì)量，還給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。目前腦血管疾病的致死率仍然很高，有大約75%的卒中患者會(huì)留下神經(jīng)功能或認(rèn)知功能異常的后遺癥。在腦血管病中，急性缺血性腦血管病約占75%-85%。因此，進(jìn)一步探索急性腦血管病特別是缺血性腦血管病的有效防治方法十分必要。人們很早就發(fā)現(xiàn)腦梗死伴發(fā)炎性反應(yīng)。早在20世紀(jì)50年代，人們就發(fā)現(xiàn)動(dòng)物的缺血損傷區(qū)域內(nèi)有不復(fù)流(nore-flow)現(xiàn)象，這種現(xiàn)象的出現(xiàn)與血管內(nèi)皮細(xì)胞水腫和白細(xì)胞粘附、浸潤(rùn)密切相關(guān)。近年來(lái)，隨著對(duì)腦梗死的深入研究，研究人員提出了腦缺血損傷的病理生理機(jī)制新理論——損傷級(jí)聯(lián)反應(yīng)，即腦缺血后組織損傷的興奮性毒性、梗死周?chē)O化、炎癥、程序性細(xì)胞死亡等機(jī)制。根據(jù)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的機(jī)制有時(shí)間選擇地采取干預(yù)措施，使半暗帶向正常組織轉(zhuǎn)化或穩(wěn)定半暗帶，以便贏得進(jìn)一步治療時(shí)間，這對(duì)腦梗死的治療非常重要。近年來(lái)大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究均支持炎性反應(yīng)參與缺血性腦損傷。不少學(xué)者認(rèn)為，減少炎性細(xì)胞在缺血區(qū)浸潤(rùn)、聚集，可減輕腦缺血后的炎性反應(yīng)，進(jìn)而減少梗死體積和神經(jīng)的功能缺損。在我國(guó)，中醫(yī)治療中風(fēng)有悠久的歷史，活血化瘀治療已被公認(rèn)治療缺血性腦卒中有效，然而其作用機(jī)理尚不十分清楚。黃芪為豆禾斗(Leguminosae)植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fish.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao禾口膜莢黃芪A.membranaceus(Fisch.)Bunge的木艮，產(chǎn)于內(nèi)蒙古、山西、甘肅、黑龍江等地。黃芪甘、微溫。歸脾、肺經(jīng)。功效補(bǔ)氣升陽(yáng)，益衛(wèi)固表，利水消腫，托瘡生肌。黃芪中主要含有甙類(lèi)、多糖、氨基酸及微量元素等；具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、利尿、抗衰老、保肝、降壓作用；能消除實(shí)驗(yàn)性腎炎尿蛋白，增強(qiáng)心肌收縮力，還有促雌激素樣作用和較廣泛的抗菌作用。其中膜莢黃芪皂甙甲具有降壓、穩(wěn)定紅細(xì)胞膜、提高血漿組織內(nèi)c-AMP的含量、增強(qiáng)免疫功能、促進(jìn)再生肝DNA合成等多種作用。黃芪多糖具有提高小鼠應(yīng)激能力、增強(qiáng)免疫功能、調(diào)節(jié)血糖含量、保護(hù)心血管系統(tǒng)、加速遭受放射線損傷機(jī)體的修復(fù)等作用。丹參為唇形科(Labiatae)植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根及根莖，主產(chǎn)四川、山東、河南、山西等地?？啵⒑w心、肝經(jīng)；具有活血調(diào)經(jīng)，祛瘀止痛，涼血消癰，清心除煩，養(yǎng)血安神。主治月經(jīng)不調(diào)，經(jīng)閉痛經(jīng)，癥瘕積聚，胸腹剌痛，熱痹疼痛，瘡瘍腫痛，心煩不眠；肝脾腫大，心絞痛。具體的藥理作用有(一)心血管系統(tǒng)的作用①?gòu)?qiáng)3心加強(qiáng)心肌收縮力、改善心臟功能，不增加心肌耗氧量；②對(duì)血管作用擴(kuò)張冠脈，增加心肌血流量；擴(kuò)張外周血管，血流增加；腦血流量下降；③抗血栓形成提高纖溶酶活性；延長(zhǎng)出、凝血時(shí)間；抑制血小板聚集(提高血小板內(nèi)cAMP水平抑制TXA2合成)；改善血液流變學(xué)特性(血粘度降低、紅細(xì)胞電泳時(shí)間縮短)；④改善微循環(huán)。(二)促進(jìn)組織的修復(fù)與再生作用①促進(jìn)組織的修復(fù)與再生，治療壞死心肌清除快；纖維母細(xì)胞分化、膠原纖維形成較明顯；肉芽形成比較成熟。局部瘀血減輕、血液循環(huán)改善，愈合時(shí)間縮短。②抑制過(guò)度增生對(duì)過(guò)度增生的纖維母細(xì)胞有抑制作用。(三)保肝、改善肝微循環(huán)。(四)抗菌丹參中含有隱丹參酮、二氫丹參酮，對(duì)體外的葡萄球菌、大腸桿菌、變性桿菌有抑制作用。川尊為傘形科(Umbel1iferae)植物川尊LigusticumchuanxiongHort.的干燥根莖，主產(chǎn)四川。辛，溫。歸肝、膽、心包經(jīng)。功能與主治活血行氣，祛風(fēng)止痛。用于安撫神經(jīng)，正頭風(fēng)頭痛，癥瘕腹痛，胸脅剌痛，跌撲腫痛，頭痛，風(fēng)濕痹痛。其化學(xué)成分為含揮發(fā)油、阿魏酸(ferulicacid)，以及4-羥基-3-丁基釅內(nèi)酯(4-hydroxy-3-butylphthalide)、川尊1T內(nèi)酉旨(senkyimolide)、蔓本內(nèi)酉旨(Ligustilide)、川尊嚷(tetramethylpyrazine)、川尊酚(chimnxiongol)、瑟丹酸(sedanicacid)等。目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道將黃芪、丹參、川芎的有效部位配合使用治療腦卒中。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的技術(shù)方案是提供了一種治療腦卒中的藥物組合物，本發(fā)明的另一技術(shù)方案是提供了該藥物組合物的制備方法和用途。本發(fā)明提供了一種治療腦卒中的藥物組合物，它是由黃芪總皂苷、丹參醇提取物、川芎油為活性組份，配伍制備而成的藥劑，其重量配比為黃芪總皂苷1-50份、丹參醇提物1-50份、川芎油0.5-30份。進(jìn)一步優(yōu)選地，黃芪總皂苷、丹參醇提取物、川芎油的重量配比為黃芪總皂苷6-12份、丹參醇提物2.5-5份、川芎油1-3份。更進(jìn)一步優(yōu)選地，黃芪總皂苷、丹參醇提取物、川芎油的重量配比為黃芪總皂苷6份、丹參醇提物2.5份、川芎油3份。所述的黃芪總皂苷中總皂苷的重量百分含量，以黃芪甲苷計(jì)為4055%;所述的丹參醇提物中含有丹參總酚酸和丹參總酮，其中，丹參總酚酸中酚酸類(lèi)成分的重量百分含量，以丹參酚酸B計(jì)為5580%;丹參總酮中含丹參酮IIA的重量百分含量為4080%;所述的川芎油中藁本內(nèi)酯的重量百分含量為4055%。所述的藥劑是片劑、膠囊劑、顆粒劑、丸劑、口服液或滴丸。本發(fā)明還提供了一種制備所述的藥物組合物的方法，它包括如下步驟a、黃芪飲片用3060%乙醇提取，濾液過(guò)大孔樹(shù)脂柱，3070%乙醇洗脫，回收乙醇，得黃芪總皂苷；b、丹參醇提物的制備丹參飲片用815倍水加熱提取，提取液過(guò)大孔樹(shù)脂柱，5090%乙醇洗脫，回收乙醇，得丹參總酚酸；藥渣用95%100%乙醇回收提取，回收乙醇，得丹參總酮提取物，將丹參總酚酸和丹參總酮提取物混合，得丹參醇提物；"川芎飲片用80%100%乙醇溶劑浸提，回收溶劑得川芎油；d、將a、b、c步驟的黃芪總皂苷、丹參醇提取物、川芎油按下述重量配比，加入藥學(xué)4上可接受的輔料或輔助性成分制備成藥學(xué)上常用的藥劑黃芪總皂苷1-50份、丹參醇提物1-50份、川芎油0.5-30份。本發(fā)明還提供了該藥物組合物在制備治療腦卒中的藥物中的用途。其中，所述的藥物是治療缺血性腦卒中的藥物。其中，所述的藥物是治療腦梗死的藥物。本發(fā)明還提供了所述的藥物組合物在制備具有縮小腦梗死體積、保護(hù)神經(jīng)元、對(duì)腦缺血損傷保護(hù)作用；下調(diào)TNF-amRNA的表達(dá)；降低外周血粘附分子CDlla/CD18、CDllb/CD18的表達(dá)、下調(diào)ICAM-lmRNA的表達(dá)；抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-kB的轉(zhuǎn)錄活性；抑制caspase3的激活與表達(dá)的藥物中的用途。本發(fā)明藥物采用局灶性腦缺血標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物模型(MCA0模型)，運(yùn)用現(xiàn)代組織病理技術(shù)、流式細(xì)胞技術(shù)和分子生物學(xué)的方法，觀察本發(fā)明藥物減少腦梗死體積、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、抑制腦缺血后細(xì)胞凋亡及阻斷梗死缺血區(qū)炎性反應(yīng)的作用。試驗(yàn)證明，本發(fā)明藥物中三味原料配伍使用，發(fā)揮了明顯協(xié)同增效的作用，藥效明確，且質(zhì)量可控，為臨床提供了一種治療腦卒中藥物的新選擇。顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明的上述基本技術(shù)思想前提下，還可以作出其它多種形式的修改、替換和變更。以下通過(guò)實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。但不應(yīng)該將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1本發(fā)明藥物的制備a、黃芪飲片用30%乙醇提取，濾液過(guò)大孔樹(shù)脂柱，30%乙醇洗脫，回收乙醇，得黃芪總皂苷；b、丹參醇提物的制備丹參飲片用8倍水加熱提取，提取液過(guò)大孔樹(shù)脂柱(D皿)，50%乙醇洗脫，回收乙醇，得丹參總酚酸；藥渣用95%乙醇回收提取，回收乙醇，得丹參總酮提取物，將丹參總酚酸和丹參總酮提取物混合，得丹參醇提物；c、川芎飲片用80%乙醇溶劑浸提，回收溶劑得川芎油；d、將a、b、c步驟的黃芪總皂苷、丹參醇提取物、川芎油按下述重量配比，加入藥學(xué)上可接受的輔料或輔助性成分制備成藥學(xué)上常用的藥劑黃芪總皂苷l(shuí)kg、丹參醇提物lkg、川芎油0.5kg，黃芪總皂苷和丹參提取物加適當(dāng)?shù)矸?、糊精等相關(guān)輔料混勻后，制粒，干燥；川芎油用環(huán)糊精包埋后，干燥；將上述二者混勻，可制成片劑、膠囊劑、顆粒劑、丸劑。實(shí)施例2本發(fā)明藥物的制備a、黃芪飲片用60%乙醇提取，濾液過(guò)大孔樹(shù)脂柱，70%乙醇洗脫，回收乙醇，得黃芪總皂苷；b、丹參醇提物的制備丹參飲片用15倍水加熱提取，提取液過(guò)大孔樹(shù)脂柱，90%乙醇洗脫，回收乙醇，得丹參總酚酸；藥渣用無(wú)水乙醇回收提取，回收乙醇，得丹參總酮提取物，將丹參總酚酸和丹參總酮提取物混合，得丹參醇提物；c、川芎飲片用無(wú)水乙醇溶劑浸提，回收溶劑得川芎油；d、將a、b、c步驟的黃芪總皂苷、丹參醇提取物、川芎油按下述重量配比，加入藥學(xué)上可接受的輔料或輔助性成分制備成藥學(xué)上常用的藥劑黃芪總皂苷50kg、丹參醇提物50kg、川芎油30kg，將川芎油、黃芪總皂苷和丹參提取物混溶后，加相關(guān)輔料制成滴丸。也可適當(dāng)?shù)闹軇⒋ㄜ河汀ⅫS芪總皂苷和丹參提取物混溶后制成口服液。實(shí)施例3本發(fā)明藥物的制備取實(shí)施例1制備的黃芪總皂苷6kg、丹參醇提物2.5kg、川芎油3kg，混合，按實(shí)施例1的方法制備成片劑。實(shí)施例4本發(fā)明藥物滴丸的制備取聚乙二醇4000和聚乙二醇6000(比例為1:l)，水浴熔融后加入干燥藥粉(黃芪總皂苷干粉30g、丹參醇提物干粉25g、川芎油13-環(huán)糊精包埋無(wú)干粉15g，混合；藥物與基質(zhì)的配比為l:2)，攪勻，熔融，迅速移至預(yù)熱至恒溫(85°C)的滴丸機(jī)儲(chǔ)料灌中，以甲基硅油為冷卻劑制備滴丸，滴頭口徑為2.5/5.Omm，冷卻溫度為1015。C，滴速為每分鐘30滴，滴制，滴完后洗滌，干燥，包裝成成品。實(shí)施例5本發(fā)明藥物的質(zhì)量控制方法將實(shí)施例1、2制備的黃芪總皂苷、丹參醇提物、川芎油進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，結(jié)果如下黃芪總皂苷中總皂苷的含量4055%(以黃芪甲苷計(jì))，丹參提取物中丹參總酚酸中酚酸類(lèi)成分的含量5580%(以丹參酚酸B計(jì))、丹參總酮中丹參總酮的含量5080X(丹參酮IIA計(jì))，川芎油中藁本內(nèi)酯的含量4060%。制備的顆粒劑的藥物質(zhì)量要求本品每lg含黃芪甲苷(C41H68014)不得少于5mg，丹參酮IIA((^H^3)不得少于15mg，丹參酚酸B(C3eH3。0j不得少于200mg，藁本內(nèi)酯(C12H1402)不得少于100mg。以下通過(guò)藥效學(xué)試驗(yàn)證明本發(fā)明的有益效果。試驗(yàn)例1本發(fā)明藥物原料各有效部位配伍篩選試驗(yàn)采用DPS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行3因素4水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案(見(jiàn)表4)，分別將各提取物混勻后給大鼠給藥，參照文獻(xiàn)制作MCAO模型。以24h腦梗死體積的為指標(biāo)對(duì)提取物的配伍比例進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果見(jiàn)下表4:表4組方配伍比例的三因素5水平<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表5正交設(shè)計(jì)方差分析表(完全隨機(jī)模型)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表6極差分析結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>由方差分析表，模型誤差顯著水平=0.0233<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。FA=122.3666、PA=0.0001<0.01，F(xiàn)B=64.6656、PB=0.0001<0.01，F(xiàn)c=30.0080、PB=0.0001<0.01。由極差分析，A取水平2，B取水平2，C取水平3，故最優(yōu)試驗(yàn)方案為A2B2C3。因此，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的黃芪總皂苷、丹參醇提取物、川芎油的重量配比為黃芪總皂苷6份、丹參醇提物2.5份、川芎油3份。試驗(yàn)例2本發(fā)明藥物對(duì)MCA0模型大鼠神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)1、研究對(duì)象SD雄性健康大鼠，6-8月齡，247只(133只用于腦梗死體積的檢測(cè)，114只用于其余指標(biāo)檢測(cè))，體重300士20g，均為清潔級(jí)動(dòng)物，檢疫合格，由成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(批號(hào)川動(dòng)管8)。2、試劑戊巴比妥鈉，中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司，批號(hào)F20020915。2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2，3，5-triphenyltetrazoliumchloride,TTC)，北京生化制藥廠，批號(hào)20020352。3、儀器及材料高速渦輪牙鉆機(jī)YK-4北京醫(yī)療器械廠雙極電凝器成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院自制Mias-2000圖形分析系統(tǒng)四川大學(xué)圖像圖形研究所奧林巴斯BX50光學(xué)顯微鏡日本數(shù)碼相機(jī)(Kodak,DC240USA)美國(guó)4、實(shí)驗(yàn)藥物及給藥方法本發(fā)明藥物(按實(shí)施例3制備)，由成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院制備。配制成每ml含生藥2克的藥液備用。環(huán)磷酰胺，上海華聯(lián)制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)20030124。治療組造模前8天開(kāi)始灌胃，每天一次，中藥組每次按臨床劑量(lg/Kg)20倍(高劑量組)、10倍(中劑量組)、5倍(低劑量組)灌胃；環(huán)磷酰胺組15mg/Kg(給藥劑量以體表面積按最小劑量計(jì)算，200g大鼠的系數(shù)為0.018)灌胃，造模后繼續(xù)灌胃直至處死動(dòng)物。模型對(duì)照組予生理鹽水灌胃。5、實(shí)驗(yàn)方法5.l動(dòng)物分組5.1.1腦梗死體積檢測(cè)動(dòng)物分組將133只大鼠隨機(jī)分為正常組7只；假手術(shù)組21只；模型對(duì)照組21只；本發(fā)明藥物高劑量組(20倍)21只；本發(fā)明藥物中劑量組(10倍)21只；本發(fā)明藥物低劑量組(5倍)21只；環(huán)磷酰胺組21只。5.1.2相關(guān)病理檢測(cè)動(dòng)物分組將114只大鼠隨機(jī)分為正常組6只；假手術(shù)組18只；模型組18只；本發(fā)明藥物高劑量組(20倍)18只；本發(fā)明藥物中劑量組(10倍)18只；本發(fā)明藥物低劑量組(5倍)18只；環(huán)磷酰胺組18只5.2MCA0動(dòng)物造模制作電凝法閉塞大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈制成MCAO模型。灌胃8天后造模。參照王世忠等電凝法制作MCAO模型(王世忠，劉舒潔，梁玉，等.大鼠局灶性腦缺血模型制作技術(shù)的探討.天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，5(4):72-73.)。方法SD大鼠經(jīng)2X戊巴比妥鈉(35mg/kg)腹腔注射麻醉，大鼠頭部右側(cè)臥位固定于鼠板。局部剪毛，常規(guī)消毒，于右眼外眥和右耳的中點(diǎn)縱形切開(kāi)皮膚約1.5cm，沿顳骨緣解開(kāi)顳肌筋膜，鈍性分離顳肌，直至完全暴露顳骨的顳鱗和蝶骨大翼，在顴弓上方顳鱗與蝶骨大翼交界處進(jìn)行鉆孔，隨后用血管鉗向下方咬骨將孔擴(kuò)大，做3-5mm2骨窗，以手術(shù)刀切開(kāi)硬膜，暴露大腦中動(dòng)脈，用微小雙極電凝器電凝大腦中動(dòng)脈(電流4毫安，時(shí)間2分鐘)使之閉塞?？p合顳肌及皮膚，局部涂抹氧氟沙星。放回籠中飼養(yǎng)，大鼠蘇醒后觀察神經(jīng)癥狀和體征。血管閉塞大鼠蘇醒后表現(xiàn)為(l)提尾時(shí)左前肢內(nèi)收屈曲；(2)爬行時(shí)向左側(cè)劃圈。凡具有上述2項(xiàng)體征者提示模型成功。腦梗死體積檢測(cè)造模過(guò)程中，共有3只大鼠死亡。模型組一只麻醉過(guò)量死亡，中劑量和環(huán)磷酰胺組各有一只血管破裂出血死亡。造模后至72小時(shí)無(wú)大鼠死亡。5.3觀察指標(biāo)5.3.1腦梗死體積5.3.1.1組織標(biāo)本的采集分別于造模后24、48、72小時(shí)分三批處死大鼠。在處死大鼠時(shí)，24小時(shí)模型組、本發(fā)明藥物中劑量組、環(huán)磷酰胺組各處死6只，本發(fā)明藥物高劑量組、低劑量組各處死7只。48、72小時(shí)各組均處死大鼠7只。動(dòng)物用戊巴比妥鈉深度麻醉后處死，迅速取出鼠腦，置于-22t:冰箱快速冷凍15min。5.3.1.2標(biāo)本的處理取冠狀面均勻切成2mm厚腦片，迅速放入2%紅四氮唑(TTC)溶液(37°C)中染色30min，然后用4X甲醛固定。24h后用數(shù)碼相機(jī)(Kodak,DC240USA)拍照，輸入計(jì)算機(jī)，用圖像處理軟件(Adobe,Photoshop7.0)計(jì)算梗死面積(粉紅色區(qū)為正常腦組織，白色區(qū)為梗死區(qū))，各腦片梗死體積(梗死面積乘以厚度2mm)之和為總的梗死體積。5.3.2相關(guān)病理檢測(cè)5.3.2.1標(biāo)本的采集分別于造模后24、48、72小時(shí)各處死6只大鼠。開(kāi)顱取大腦右側(cè)半球，稱(chēng)取80毫克額、頂部腦組織，放入經(jīng)焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonat，DEPC)水處理過(guò)的1.5ml印pendorf管，置于-7(TC低溫保存?zhèn)溆?，將其余腦組織入4^多聚甲醛液內(nèi)固定2小時(shí)，脫水、浸蠟、包埋切片。5.3.2.2組織病理學(xué)檢查常規(guī)石蠟制片，HE染色。5.3.2.3尼氏體檢測(cè)5.3.2.3.1甲苯胺藍(lán)染色方法顯示尼氏體(1)切片15-20ym，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫苯至蒸餾水洗。(2)放入經(jīng)預(yù)熱至5(TC的1%甲苯胺籃(toluidneblue)水溶液中，并在56"溫箱中染20min。(3)蒸餾水洗。(4)70%酒精約lmin。(5)95%酒精分化，鏡下控制。以尼氏體顯示清晰為度。(6)無(wú)水酒精迅速脫水，二甲苯透明，中性塑膠封固。5.3.2.3.2圖像分析采用Mias-2000高清晰度彩色病理圖文報(bào)告系統(tǒng)對(duì)尼氏體染色結(jié)果進(jìn)行半定量分析，放大倍數(shù)為200，檢測(cè)正常組、偽手術(shù)組、模型組、本發(fā)明藥物不同劑量組、環(huán)磷酰胺組在單位視野中尼氏體染色的積分光密度。以每例標(biāo)本5個(gè)表達(dá)最強(qiáng)視野(X200)的積分光密度值作為該例的測(cè)量值。5.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)以Mean士SD表示，采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件，用One-WayANOVA方差分析。結(jié)果1.組織病理學(xué)檢查正常組、假手術(shù)大腦神經(jīng)元細(xì)胞層次較多，排列緊密，細(xì)胞形態(tài)完整。模型組可見(jiàn)大腦皮層大小不等的液化性壞死區(qū)，表現(xiàn)為壞死區(qū)內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞消失，部分梗死區(qū)邊緣可見(jiàn)鬼影細(xì)胞。梗死區(qū)內(nèi)有程度不等的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。2.本發(fā)明藥物對(duì)模型大鼠腦梗死體積的影響表7各時(shí)間點(diǎn)各組腦梗死體積變化組別24H體禾只mm3■體禾只mm372H體禾只mm3正常組假手術(shù)組模型組中劑量組低劑量組環(huán)磷酰胺組70706104.37±4.28775.45±3.25;683.53土2.55'785.39土2.32:677.38±2.4170707113.18±3.11AA783.45士2.27闊7卯.45±3.18#$厶'792.63±2.09#$Ai786.13士2.87#77119.54±6.83AA790.30±2.96#$"795.53±1.93#$AA799.56±11.42#$AJ791.12±1.84#*AA10#，與模型組相比，P<0.05j，與高劑量組相比P<0.05;參，與中劑量組相比P<0.05;令，與低劑量組相比P〈0.05;A，與24H相比，P〈0.05。A與48H相比，P〈0.05。由表7可見(jiàn)，本發(fā)明藥物高、中、低劑量組及環(huán)磷酰胺組與模型組比較，24、48、72小時(shí)各時(shí)點(diǎn)梗死體積明顯縮小，P<0.05，48h、72h腦梗死體積較24h增加，P均〈0.05。本發(fā)明藥物三個(gè)劑量組均能減小腦梗死體積，三組之間有量效關(guān)系，P均〈0.05。環(huán)磷酰胺組與本發(fā)明藥物高劑量組療效相近，p>0.05。3.本發(fā)明藥物對(duì)模型大鼠尼氏體的影響3.l尼氏體光鏡結(jié)果顯示正常組、假手術(shù)組大腦神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)細(xì)胞層次較多，排列緊密，細(xì)胞形態(tài)完整；可見(jiàn)深藍(lán)色染色的塊狀或顆粒狀尼氏體；模型組大腦神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)尼氏體部分或全部溶解或消失，隨著時(shí)間的推移病理?yè)p害逐漸加重；本發(fā)明藥物高劑量、中劑量、低劑量組神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)尼氏體部分溶解或消失。高劑量組、環(huán)磷酰胺組神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)尼氏體數(shù)目較中、低劑量組明顯增多，呈顆粒狀或塊狀，染色較均勻；大腦皮層外顆粒層和外錐體細(xì)胞層神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)染成深藍(lán)色分布均勻呈塊狀或顆粒狀的尼氏體，與模型組比較，尼氏體結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常。3.2本發(fā)明藥物對(duì)尼氏體積分光密度的影響表8尼氏體積分光密度變化組別n24H(X106)48H(X106)72H(X106)正常組69.93±0.589.93±0.589.93±0.58假手術(shù)組69.75±0.329.67±0.519.90±0.50模型組62.66±0.61*2.13±0.27*A1.62±0.27*A高劑量組64.64±0.45*#3,82±0.30*#$A3,52±0.29*#$A中劑量組64.30±0.39*#3.60±0.33*#A3,18±0.73*#A低劑量組63.55±0.67,3,23±0.19*#A2.49±0.26**"環(huán)磷酰胺組64.43土0.50一3.73±0.22*歸3.46±1.69*#*A承與正常組、假手術(shù)組相比P<0.05;#，與模型組相比，P<0.05;$，與高劑量組相比P〈0.05;參，與中劑量組相比P<0.05;令，與低劑量組相比P〈0.05;A，與24H相比，P〈0.05。A與48H相比，P<0.05。由表8可見(jiàn)，正常組、假手術(shù)組尼氏體積分光密度比較，PX).05;模型組尼氏體積分光密度顯著降低，與正常組、假手術(shù)組比較，P<0.05。隨著梗死時(shí)間的延長(zhǎng)，尼氏體的積分光密度逐漸降低，48小時(shí)、72小時(shí)與24小時(shí)相比較，P<0.05。本發(fā)明藥物高、中、低劑量組、環(huán)磷酰胺組與正常組、假手術(shù)組比較，尼氏體的積分光密度明顯降低，P<0.05，本發(fā)明藥物三個(gè)劑量組均能增加尼氏體的表達(dá)，三組之間有量效關(guān)系，P均〈0.05。環(huán)磷酰胺組與本發(fā)明藥物高劑量組療效相近，p>0.05。試驗(yàn)例2本發(fā)明藥物對(duì)MCAO模型大鼠炎性細(xì)胞因子的影響l研究對(duì)象同試驗(yàn)例12試劑TrizolKReagent美國(guó)Invitrogen公司(Lot3111)11氯仿(分析純)成都化學(xué)試劑廠(批號(hào)20020612)異丙醇(分析純)成都化學(xué)試劑廠(批號(hào)20021025)乙醇(分析純)成都化學(xué)試劑廠(批號(hào)20021206)乙二胺四乙酸鈉成都化學(xué)試劑廠(批號(hào):20030107)冰醋酸成都化學(xué)試劑廠(批號(hào):20030217)DEPCSigma公司(Lot2101)瓊脂糖寶生物(大連)有限公司(Lot0763)TitanTM—步法RT-PCR試劑盒TaKaRa公司(LotBK2201)TNF-a、ICAM-1、GAPDH寡核上海捷倍思基因技術(shù)有限公司合成苷酸引物EBSigma(Lot3107)Tris堿成都云鴻科技發(fā)展有限公司(LotBB0605)3儀器及材料SW-CJ-IFO型超凈工作臺(tái)中國(guó)蘇凈集團(tuán)泰安公司3K18型高速冷凍離心機(jī)美國(guó)Sigma公司AE240型電子天平美國(guó)MilliporeDU-7500紫外分光光度計(jì)美國(guó)Beckman凝膠成像分析系統(tǒng)意大利BIORAD電泳系統(tǒng)GE-100美國(guó)梯度PCR儀ThermoHybaidPX24實(shí)驗(yàn)藥物及給藥方法同試驗(yàn)例2。5實(shí)驗(yàn)方法5.1動(dòng)物分組同試驗(yàn)例15.1.2。5.2MCA0動(dòng)物造模制作同試驗(yàn)例15.2。5.3RT-PCR檢測(cè)TNF-amRNA的表達(dá)5.3.1總RNA提取(1)取6080mg腦組織置于1.5mlEP管中，加入Trizol試劑1ml，超聲勻漿，室溫靜置5min。(2)加入氯仿200iU，劇烈振蕩混勻，靜置lOmin。(3)4°C，12000rpm離心lOmin。(4)水相移入另一1.5mlEP管中，加入異丙醇500ia，振蕩混勻，室溫靜置10min。(5)4°C，12000rpm離心10min。(6)棄上清，加入75%乙醇lml，振蕩混勻。(7)4°C，9800rpm離心5min。(8)棄上清，超靜工作臺(tái)上靜置晾干(9)加入50iil無(wú)RNase純水56。C水浴10min，置-70。C保存。實(shí)驗(yàn)所用器材、溶液等均經(jīng)0.1%DEPC處理。5.3.2RNA質(zhì)量鑒定5.3.2.l紫外鑒定取提取RNA溶液5iU，稀釋100倍后加入Beckman比色杯中，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA樣品的A26。與A28。值，每個(gè)樣品測(cè)3次，以平均0D值計(jì)算樣品RNA的濃度和純度。所測(cè)樣品A26。/A28。比值在1.72.0之間，表示RNA較純，RNA(iig/iU)=A26。X40X稀釋倍數(shù)/1000。5.3.2.2RNA瓊脂糖凝膠電泳鑒定(1)凝膠制備稱(chēng)取0.4g瓊脂糖，溶于20ml無(wú)RNase的1XTAE緩沖液中，微波爐加熱溶解，待冷卻至50°C時(shí)倒入制膠器，厚度0.5cm，室溫放置30min以上，膠凝固后輕輕取出梳子。(2)電泳取未稀釋RNA溶液5iil及6X加樣緩沖液1yl，混勻后加樣，1XTAE作為電泳緩沖液，80V電泳40min，EB染液中染色30min，將凝膠置于紫外燈下觀察，若見(jiàn)18S及28S兩條清晰條帶，28S約為18S的兩倍，則表明RNA未降解。5.3.3RT-PCR(—步法)5.3.3.1PCR引物的設(shè)計(jì)與合成分別合成TNF-a及GAPDH(內(nèi)參照)引物TNF-a上游引物:5，-CCACCACGCTCTTCTGTCTACT-3'TNF-a下游引物:5，-GGGCTACGGGCTTGTCACT-3'GAPDH上游引物:5，-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3'GAPDH下游引物5，-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3，5.3.3.2RT-PCR試劑容積終濃度(或加入的容積)10Xonest印RNAPCRBuffer5ii1IX25mMMgCl210ii15mM10mMdNTP5ii1lmMRNaseinhibitor(40unitsii1)1ii10.8皿it/u1AMVRTaseXL(5unitii1)1ii10.limit/ii1AMV_0ptimizedTaq(5units/li1)1ii10.15皿its/ii1SpecificdownstreamPCRprimer(10uM)2ii10.4iiMSpecificupstreamPCRprimer(10uM)2ii10.4iiM13<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>取總RNA1g(根據(jù)樣品RNA濃度計(jì)算加樣量)，反應(yīng)體系50。加樣完畢后混勻，再加入25iU礦物油封蓋，進(jìn)行RT-PCR。反應(yīng)條件cDNA合成和預(yù)變性50。C逆轉(zhuǎn)錄30min，94。C2min進(jìn)行一次循環(huán)。PCR擴(kuò)增94。C變性30s，59。C退火30s，72。C延伸30s，共29個(gè)循環(huán)；最后以72。C延伸10min。TNF-a可擴(kuò)增出長(zhǎng)度為151bp的cDNA片斷，GAPDH可擴(kuò)增出長(zhǎng)度為306bp的cDNA片斷。5.3.2.3瓊脂糖凝膠電泳如前所述制膠，取PCR產(chǎn)物5iU，6X加樣緩沖液lyl，混勻后加入凝膠加樣孔中，1XTAE作電泳緩沖液，80V電泳40min，EB染色液中染色30min，將凝膠置于紫外燈下觀察。5.3.2.4掃描分析測(cè)定表達(dá)量凝膠成像分析系統(tǒng)對(duì)DNA含量進(jìn)行密度掃描，并用對(duì)應(yīng)的GAPDH掃描曲線下面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，以其比值表示TNF-a表達(dá)量。結(jié)果各組各時(shí)點(diǎn)TNF-amRNA表達(dá)變化見(jiàn)表9。表9MCA0模型大鼠TNF-amRNA表達(dá)(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>承與正常組、偽手術(shù)組相比P<0.05;#，與模型組相比，P<0.05;$，與高劑量組相比P<0.05;參，與中劑量組相比P<0.05;令，與低劑量組相比P<0.05。由表9可見(jiàn)，正常組、假手術(shù)組的TNF-amRNA表達(dá)很弱，正常組與假手術(shù)組之間比較P>0.05。模型組TNF-amRNA的表達(dá)顯著升高，24小時(shí)達(dá)到峰值，48、72小時(shí)逐漸下降，三個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間比較P>0.05。本發(fā)明藥物高、中、低三個(gè)劑量組與環(huán)磷酰胺組造模后24、48、72小時(shí)三個(gè)不同時(shí)點(diǎn)的TNF-amRNA的表達(dá)明顯下調(diào)，與相應(yīng)時(shí)點(diǎn)模型組比較，P<0.05。三個(gè)時(shí)點(diǎn)之間比較，TNF-amRNA的表達(dá)有逐步下降的趨勢(shì)，但未出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；本發(fā)明藥物三個(gè)劑量組均能降低TNF-amRNA的表達(dá)，有量效關(guān)系，P<0.05。環(huán)磷酰胺組與本發(fā)明藥物高劑量組比較，p>0.05，其作用強(qiáng)于本發(fā)明藥物低、中劑量組，P<0.05。試驗(yàn)例3本發(fā)明藥物對(duì)模型大鼠粘附分子的影響細(xì)胞粘附分子(celladhesionmolecule,CAM)是一類(lèi)調(diào)節(jié)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)間相互結(jié)合、起粘附作用的膜表面糖蛋白。根據(jù)其編碼基因結(jié)構(gòu)同源性及產(chǎn)物的功能特點(diǎn)，可將其歸納為6個(gè)家族整合素家族(integrinfamily)、選擇素家方矣(selectinfamily)、免疫球蛋白超家方矣(immunoglobulinsuper-family,IGSF)、牽丐粘附素家族(cadherinfamily)、血管附著素家族(vascularaddressinfamily)及CD44等粘附分子所屬的尚未分類(lèi)的家族。本部分實(shí)驗(yàn)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MCAO模型大鼠外周血CDU/CD18、RT-PCR檢測(cè)ICAM-lmRNA的變化，以進(jìn)一步研究本發(fā)明藥物對(duì)外周血粘附分子和細(xì)胞間粘附分子的影響。l研究對(duì)象同試驗(yàn)例2。2試劑小鼠抗大鼠CDlla/CD18、CDllb/CD18單克隆抗體由法國(guó)Immunotech公司提供(LotC0201、C0206)，紅細(xì)胞破解液由美國(guó)B-D公司提供(LotB2012)，其余主要試劑同試驗(yàn)例2。3儀器及材料同試驗(yàn)例2。4實(shí)驗(yàn)藥物及給藥方法同試驗(yàn)例2。5實(shí)驗(yàn)方法5.1動(dòng)物分組同試驗(yàn)例2。5.2MCA0動(dòng)物造模制作同試驗(yàn)例2。5.3觀察指標(biāo)5.3.1流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CDn/分別取肝素抗凝全血100i！l，各加1::100稀釋的小鼠抗大鼠CDlla/CD18、CDCD18單克隆抗體20，搖勻后靜置40分鐘，加紅細(xì)胞破解液2ml，靜置10分鐘，離心6分鐘(1500r/min)，棄上清液，PBS洗2次，加l:IOO稀釋的二抗(羊抗鼠IgG-FITC標(biāo)記)20yl，搖勻后避光放置30分鐘，PBS洗2次，加1001%多聚甲醛固定后，樣品上流式細(xì)胞儀，于中性粒細(xì)胞段開(kāi)窗，用帶有熒光標(biāo)記的多型核粒細(xì)胞(polymorphonuclearcells,PMNs)占整個(gè)PMNs的百分?jǐn)?shù)代表PMNCDlla/CD18、CDllb/CD18的表達(dá)水平。數(shù)據(jù)以Mean士SD表示，用SPSS11.5軟件，采用方差分析(AN0VA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。5.3.2RT-PCR檢測(cè)ICAM-lmRNA的表達(dá)5.3.2.1總RNA提取同試驗(yàn)例25.3.1。5.3.2.2RNA質(zhì)量鑒定同試驗(yàn)例25.3.2。5.3.2.3RT-PCR(一步法)5.3.2.3.1PCR引物的設(shè)計(jì)與合成分別合成ICAM-1及GAPDH(內(nèi)參照)引物ICAM-1上游引物5'_GGGTTGGAGACTAACTGGATGA_3，ICAM-l下游引物5'-GGATCGAGCTCCACTCGCTC-3'GAPDH上游引物5'-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3'GAPDH下游引物5'-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3'5.3.2.3.2RT-PCR<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>取總RNA1g(根據(jù)樣品RNA濃度計(jì)算加樣量)，反應(yīng)體系50。加樣完畢后混勻，再加入25ii1礦物油封蓋，進(jìn)行RT-PCR。反應(yīng)條件cDNA合成和預(yù)變性50。C逆轉(zhuǎn)錄30min，94°C2min進(jìn)行一次循環(huán)。PCR擴(kuò)增94。C變性45s，56.5。C退火lmin，72。C延伸lmin，共34個(gè)循環(huán)；最后以72。C延伸10min。ICAM-1可擴(kuò)增出長(zhǎng)度為181bp的cDNA片斷，GAPDH可擴(kuò)增出長(zhǎng)度為306bp的cDNA片斷。5.3.2.3.3瓊脂糖凝膠電泳如前所述制膠，取PCR產(chǎn)物5iU，6X加樣緩沖液1y1，混勻后加入凝膠加樣孔中，1XTAE作電泳緩沖液，80V電泳40min，EB染色液中染色30min，將凝膠置紫外燈下觀察。5.3.2.4掃描分析測(cè)定表達(dá)量凝膠成像分析系統(tǒng)對(duì)DNA含量進(jìn)行密度掃描，并用對(duì)應(yīng)的GAPDH掃描曲線下面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，以其比值表示ICAM-lmRNA表達(dá)量。結(jié)果1.本發(fā)明藥物對(duì)模型大鼠CDlla/CD18表達(dá)的影響本發(fā)明藥物對(duì)模型大鼠CDlla/CD18表達(dá)的影響見(jiàn)表10。表10多形核粒細(xì)胞CDlla/CD18的表達(dá)(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>承與正常組、假手術(shù)組相比P<0.05;#，與模型組相比，P<0.05;$，與高劑量組相比P〈0.05;參，與中劑量組相比P<0.05;令，與低劑量組相比P〈0.05;A，與24H相比，P<0.05。由表10可見(jiàn)，正常組、假手術(shù)組CDn乂CDw的表達(dá)很弱，正常組與假手術(shù)組之間比較P>0.05。模型組24小時(shí)CDlla/CD18的表達(dá)顯著升高，48小時(shí)達(dá)到峰值，72小時(shí)開(kāi)始下降，各時(shí)點(diǎn)與正常組、假手術(shù)組比較，P<0.05，不同劑量的本發(fā)明藥物及環(huán)磷酰胺可顯著降低CDlla/CD18的表達(dá)，P<0.05，本發(fā)明藥物各劑量組對(duì)CDn乂CD^表達(dá)的影響存在量效關(guān)系，P<0.05。高劑量組與環(huán)磷酰胺組比較，P>0.05。2.本發(fā)明藥物對(duì)MCAO模型大鼠CDllb/CD18表達(dá)的影響本發(fā)明藥物對(duì)模型大鼠CDllb/CD18表達(dá)的影響見(jiàn)表11。表11多形核粒細(xì)胞CDllb/CD18的表達(dá)(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>承與正常組、假手術(shù)組相比P<0.05;#，與模型組相比，P<0.05;$，與高劑量組相比P〈0.05;參，與中劑量組相比P<0.05;令，與低劑量組相比P〈0.05;A，與24H相比，P〈0.05。A與48H相比，P<0.05。由表11可見(jiàn)，正常組、假手術(shù)組CDnb/CDw的表達(dá)很弱，正常組與假手術(shù)組之間比較P>0.05。模型組24小時(shí)CDllb/CD18的表達(dá)顯著升高，48小時(shí)達(dá)到峰值，72小時(shí)開(kāi)始下降，各時(shí)點(diǎn)與正常組、假手術(shù)組比較，P<0.05。不同劑量的本發(fā)明藥物及環(huán)磷酰胺可顯著降低CDllb/CD18的表達(dá)，P<0.05。本發(fā)明藥物各劑量組對(duì)CDllb/CD18表達(dá)的影響存在量效關(guān)系，P<0.05。高劑量組與環(huán)磷酰胺組比較，P>0.05。3.本發(fā)明藥物對(duì)MCAO模型大鼠ICAM-lmRNA表達(dá)的影響本發(fā)明藥物對(duì)MCAO模型大鼠ICAM-lmRNA表達(dá)的影響見(jiàn)表12。表12MCA0模型大鼠ICAM-lmRNA表達(dá)(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>承與正常組、假手術(shù)組相比P<0.05;#，與模型組相比，P<0.05;$，與高劑量組相比P<0.05;參，與中劑量組相比P<0.05;令，與低劑量組相比P<0.05。由表12可見(jiàn)，正常組、假手術(shù)組的ICAM-lmRNA表達(dá)很弱，正常組與假手術(shù)組之間比較P>0.05。模型組24小時(shí)ICAM-lmRNA的表達(dá)顯著升高并達(dá)到峰值，48、72小時(shí)逐漸下降，各時(shí)點(diǎn)與正常組、假手術(shù)組比較，差異有顯著性，P<0.05。不同劑量的本發(fā)明藥物及環(huán)磷酰胺可顯著降低ICAM-lmRNA的表達(dá)，P<0.05。本發(fā)明藥物各劑量組對(duì)ICAM-lmRNA表達(dá)的影響存在量效關(guān)系，P<0.05。高劑量組與環(huán)磷酰胺組比較，P>0.05。試驗(yàn)例4本發(fā)明藥物對(duì)MCA0模型大鼠炎性反應(yīng)信號(hào)傳導(dǎo)的影響核因子kB(NF-kB)是從B淋巴細(xì)胞核抽提物中發(fā)現(xiàn)的一種能與免疫球蛋白k輕鏈基因增強(qiáng)子KB序列特異性結(jié)合的核蛋白因子，廣泛存在于真核細(xì)胞中，參與許多基因表達(dá)的調(diào)控。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，NF-KB還存在于腦血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞中，與腦缺血及再灌注損傷時(shí)的炎癥機(jī)制密切相關(guān)。本部分研究通過(guò)NF-kB的變化進(jìn)一步探討本發(fā)明藥物對(duì)腦缺血炎性反應(yīng)信號(hào)傳導(dǎo)的影響。材料與方法1、研究對(duì)象同試驗(yàn)例22、試劑NF-kBP65(Lot，C-20)rabbitpolyclonalIgGSantaCruz公司.二抗及試劑盒購(gòu)至北京中山生物技術(shù)有限公司。其余試劑同試驗(yàn)例12。3、儀器及材料同試驗(yàn)例2。4.實(shí)驗(yàn)藥物及給藥方法同試驗(yàn)例2。5實(shí)驗(yàn)方法5.1動(dòng)物分組同試驗(yàn)例2。5.2動(dòng)物造模制作同試驗(yàn)例2。5.3免疫組織化學(xué)術(shù)5.3.l采用SP法(采用生物素標(biāo)記的第二抗體與鏈霉菌抗生物素蛋白連接的過(guò)氧化物酶染色及基質(zhì)素混合液來(lái)測(cè)定細(xì)胞和組織中的抗原)。(1)石蠟(3i！m)切片脫蠟至水(2)染色過(guò)程3%H202室溫下避光孵育lOminI蒸餾水水平搖床洗5minX2次IPBS水平搖床洗5minX2次I取出容器，室溫冷卻1520minIPBS水平搖床洗5minX3次I10%正常山羊血清(1:20PBS稀釋)封片，37t:濕盒中孵育20minI濾紙吸去封閉齊U，加兔抗大鼠NF-KB多克隆抗體(1:100)50illI37。C孵育60minIPBS水平搖床洗5minX3次I滴加二抗生物素標(biāo)記的兔抗羊IgGI37。C濕盒中孵育30minIPBS水平搖床洗5minX3次I加第二代辣根酶標(biāo)記的鏈親和素I37。C濕盒中孵育30minIPBS水平搖床洗5minX3次I顯微鏡下DAB顯色適時(shí)終止I自來(lái)水充分沖洗30minIMayer's蘇木精輕微復(fù)染，顯色完成后流水終止反應(yīng)I1%鹽酸酒精10秒分色I(xiàn)19自來(lái)水沖洗5minX2次I氨水溶液3060秒I自來(lái)水沖洗35min。(3)脫水、透明、封片70%、80%、90%、95%、100%酒精依次脫水各3minI二甲苯1、二甲苯II透明各5minI中性樹(shù)脂膠封片。每批染色均設(shè)立陰性空白對(duì)照(以PBS代替一抗)。胞核染色棕黃色者為NF-KB陽(yáng)性細(xì)胞。5.3.2圖像分析采用Mias-2000高清晰度彩色病理圖文報(bào)告系統(tǒng)對(duì)NF-kB染色結(jié)果進(jìn)行定量檢測(cè)，放大倍數(shù)為400，檢測(cè)正常組、偽手術(shù)組、模型組、本發(fā)明藥物不同劑量組、環(huán)磷酰胺組在單位視野中NF-kB陽(yáng)性的炎性細(xì)胞數(shù)及積分光密度。以每例標(biāo)本5個(gè)表達(dá)最強(qiáng)的視野(X400)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和積分光密度值作為該例的測(cè)量值。結(jié)果1.NF-kB陽(yáng)性的炎性細(xì)胞數(shù)變化NF-kB陽(yáng)性的炎性細(xì)胞數(shù)變化見(jiàn)表13。表13NF-kB陽(yáng)性的炎性細(xì)胞數(shù)變化組別n24H48H72H正常組6000假手術(shù)組6000模型組618.17±1.4719.16±1.4722.0±2.28AA高劑量組610.50±1.87#12.0±1.41#14.33±1.63#AA中劑量組612.17±1.47#13,83±1.47#16.16±1.47#"低劑量組615.16±lf16.17士1.47拳17.50±1.05#$A環(huán)磷酰胺組611.17±1.47#*13.50士1.04歸15.00±15.00,#，與模型組相比，P<0.05j，與高劑量組相比P<0.05;參，與中劑量組相比P<0.05;令，與低劑量組相比P〈0.05;A，與24H相比，P〈0.05。A與48H相比，P〈0.05。由表13可見(jiàn)正常組、假手術(shù)組腦組織中未見(jiàn)核轉(zhuǎn)位炎性細(xì)胞。阻斷大腦中動(dòng)脈后，NF-kB被激活。模型組24小時(shí)梗死區(qū)可見(jiàn)較多核轉(zhuǎn)位炎性細(xì)胞，48、72小時(shí)逐漸升高，72小時(shí)與24小時(shí)比較，P<0.05。使用藥物干預(yù)后，NF-kB陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著減少，與各時(shí)點(diǎn)模型組比較，差異有顯著性(P<0.05)。2.炎性細(xì)胞NFKB積分光密度變化表14NF-kB積分光密度變化20組別N24H(X105)48H(X10S)72H(X105)正常組61.06±0.551.06±0.551.06±0.55假手術(shù)組6U2±0.151.16±0.451.26±0.55模型組627.80±1.45*31.31±8.80*A34.97±8.54*"高劑量組614.00±1.73'#15.71±3.42*#16.36±2.32*#中劑量組616.61±2.32*#$16.58±4.75*#16.97±4.53*#低劑量組618.54±1.08*#$23.19±6.32*#$"24.81±1.04*#$*AA環(huán)磷酰胺組615.03±1.55，15.38±3.71*#*16.15±3.12*"承與正常組、假手術(shù)組相比P<0.05;#，與模型組相比，P<0.05;$，與高劑量組相比P〈0.05;參，與中劑量組相比P<0.05;令，與低劑量組相比P〈0.05;A，與24H相比，P〈0.05。A與48H相比，P<0.05。由表14可見(jiàn)，正常組、假手術(shù)組NF-kB的表達(dá)都很弱，正常組與假手術(shù)組之間差異無(wú)顯著性，提示NF-kB以非活性形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。阻斷大腦中動(dòng)脈后，NF-kB被激活。模型組24小時(shí)炎性細(xì)胞NF-KB積分光密度顯著增高，48、72小時(shí)逐漸升高。本發(fā)明藥物低、中、高三個(gè)劑量組梗死后24、48、72小時(shí)三個(gè)不同時(shí)點(diǎn)炎性細(xì)胞的核轉(zhuǎn)位數(shù)顯著減少，NF-KB的表達(dá)明顯下調(diào)，與模型組比較差異有顯著性(P<0.05);高劑量組與低劑量之間差異有顯著性(P<0.05)。環(huán)磷酰胺也能抑制模型大鼠不同時(shí)點(diǎn)炎性細(xì)胞NF-kB的核轉(zhuǎn)位數(shù)與表達(dá)，其抑制作用強(qiáng)于本發(fā)明藥物低劑量組，與本發(fā)明藥物高、中劑量組比較，差異無(wú)顯著性。試驗(yàn)例5本發(fā)明藥物對(duì)MCAO模型大鼠細(xì)胞凋亡的影響細(xì)胞凋亡(即optosis)是一種由基因控制的細(xì)胞自主性死亡，是真核細(xì)胞在生理或病理?xiàng)l件下接受到某種信號(hào)的剌激，啟動(dòng)其自身的遺傳機(jī)制，通過(guò)內(nèi)源性DNA內(nèi)切酶的激動(dòng)而發(fā)生自動(dòng)化死亡的過(guò)程。1.研究對(duì)象同試驗(yàn)例2。2.試劑caspase3p20goatpolyclonalIgG批號(hào)L_18SantaCruz公司。二抗及試劑盒購(gòu)至北京中山生物技術(shù)有限公司。3儀器及材料同試驗(yàn)例2。4.實(shí)驗(yàn)藥物及給藥方法同試驗(yàn)例2。5實(shí)驗(yàn)方法5.1動(dòng)物分組同試驗(yàn)例2。5.2MCA0動(dòng)物造模制作同試驗(yàn)例2。5.3免疫組織化學(xué)術(shù)5.3.l采用SP法(采用生物素標(biāo)記的第二抗體與鏈霉菌抗生物素蛋白連接的過(guò)氧化物酶染色及基質(zhì)素混合液來(lái)測(cè)定細(xì)胞和組織中的抗原)。21(1)石蠟(3m)切片脫蠟至水(2)染色過(guò)程3%H202室溫下避光孵育lOminI蒸餾水水平搖床洗5minX2次IPBS水平搖床洗5minX2次I取出容器，室溫冷卻1520minIPBS水平搖床洗5minX3次I10%正常山羊血清(1:20PBS稀釋)封片，37。C濕盒中孵育20minI濾紙吸去封閉劑，加羊抗大鼠多克隆抗體(1:100)50iUI37。C孵育60minIPBS水平搖床洗5minX3次I滴加二抗生物素標(biāo)記的兔抗羊IgGI37。C濕盒中孵育30minIPBS水平搖床洗5minX3次I加第二代辣根酶標(biāo)記的鏈親和素I37。C濕盒中孵育30minIPBS水平搖床洗5minX3次I顯微鏡下DAB顯色適時(shí)終止I自來(lái)水充分沖洗30minIMayer's蘇木精輕微復(fù)染，顯色完成后流水終止反應(yīng)I1%鹽酸酒精10秒分色I(xiàn)自來(lái)水沖洗5minX2次I氨水溶液3060秒I自來(lái)水沖洗35min。[OS"](3)脫水、透明、封片70%、80%、90%、95%、100%酒精依次脫水各3minI二甲苯1、二甲苯II透明各5minI中性樹(shù)脂膠封片。每批染色均設(shè)立陰性空白對(duì)照(以PBS代替一抗)。胞漿染色棕黃色者為caspase3陽(yáng)性的神經(jīng)細(xì)胞。5.3.2圖像分析采用Mias-2000高清晰度彩色病理圖文報(bào)告系統(tǒng)對(duì)caspase3染色結(jié)果進(jìn)行半定量檢測(cè)，放大倍數(shù)為200，檢測(cè)正常組、假手術(shù)組、模型組、本發(fā)明藥物不同劑量組、環(huán)磷酰胺組在單位視野中caspase3積分光密度。每例標(biāo)本切片選取5個(gè)表達(dá)最強(qiáng)視野(X200)，測(cè)定每個(gè)視野下caspase3陽(yáng)性的神經(jīng)細(xì)胞積分光密度。以每例標(biāo)本5個(gè)視野的陽(yáng)性細(xì)胞積分光密度值作為該例的測(cè)量值。結(jié)果Caspase3陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞積分光密度變化見(jiàn)表15。表15caspase3的表達(dá)變化<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>承與正常組、假手術(shù)組相比P<0.05;#，與模型組相比，P<0.05;$，與高劑量組相比P〈0.05;參，與中劑量組相比P<0.05;令，與低劑量組相比P〈0.05;A，與24H相比，P〈0.05。A與48H相比，P<0.05。由表15可見(jiàn)正常組、假手術(shù)組caspase3的表達(dá)都很弱，正常組與假手術(shù)組之間差異無(wú)顯著性。阻斷大腦中動(dòng)脈后，caspase3被激活。模型組24小時(shí)神經(jīng)細(xì)胞caspase3積分光密度顯著增高，48、72小時(shí)逐漸升高，各時(shí)點(diǎn)間比較P〈0.05。使用藥物干預(yù)后，caspase3積分光密度顯著降低，藥物干預(yù)組與模型組比較P<0.05。本發(fā)明藥物高劑量組與環(huán)磷酰胺組比較P<0.05。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(1)本發(fā)明藥物能縮小腦梗死體積，保護(hù)神經(jīng)元，對(duì)腦缺血損傷具有保護(hù)作用；高劑量的本發(fā)明藥物的作用強(qiáng)度與環(huán)磷酰胺相似。(2)本發(fā)明藥物能顯著下調(diào)TNF-amRNA的表達(dá)，高劑量的本發(fā)明藥物的作用強(qiáng)度與環(huán)磷酰胺相似。(3)本發(fā)明藥物可顯著降低外周血粘附分子CDlla/CD18、CDllb/CD18的表達(dá)；同時(shí)還能顯著下調(diào)ICAM-lmRNA的表達(dá)；高劑量的本發(fā)明藥物的作用強(qiáng)度與環(huán)磷酰胺相似。(4)本發(fā)明藥物能抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-kB的轉(zhuǎn)錄活性；高劑量的本發(fā)明藥物的作用強(qiáng)度與環(huán)磷酰胺相似。(5)本發(fā)明藥物及環(huán)磷酰胺能顯著抑制caspase3的激活與表達(dá)；高劑量本發(fā)明藥物抑制caspase3表達(dá)的作用強(qiáng)于環(huán)磷酰胺。不同劑量的本發(fā)明藥物及一定劑量的環(huán)磷酰胺通過(guò)下調(diào)TNF-amRNA的表達(dá)，抑制NF-kB的激活與活性，降低ICAM-lmRNA和白細(xì)胞粘附分子CDU/CD18的表達(dá)，進(jìn)而抑制其ICAM-1與CDn/CD18的結(jié)合，抑制其介導(dǎo)的白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的粘附，減輕炎性細(xì)胞的聚集與浸潤(rùn)，減輕組織浸潤(rùn)，減輕缺血性腦損傷。另一方面，本發(fā)明藥物與環(huán)磷酰胺通過(guò)下調(diào)TNF-amRNA的表達(dá)，抑制了TNF_a誘導(dǎo)的腦缺血后細(xì)胞凋亡。同時(shí)還能直接抑制細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶caspase3，進(jìn)而抑制腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡。2權(quán)利要求一種治療腦卒中的藥物組合物，其特征在于它是由黃芪總皂苷、丹參醇提取物、川芎油為活性成份配伍制備而成的藥劑，其重量配比為黃芪總皂苷1-50份、丹參醇提物1-50份、川芎油0.5-30份。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于黃芪總皂苷、丹參醇提取物、川芎油的重量配比為黃芪總皂苷6-12份、丹參醇提物2.5-5份、川芎油1-3份。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的藥物組合物，其特征在于黃芪總皂苷、丹參醇提取物、川芎油的重量配比為黃芪總皂苷6份、丹參醇提物2.5份、川芎油3份。4.根據(jù)權(quán)利要求l-3任意一項(xiàng)所述的藥物組合物，其特征在于所述的黃芪總皂苷中總皂苷的重量百分含量，以黃芪甲苷計(jì)為4055%;所述的丹參醇提物中含有丹參總酚酸和丹參總酮，其中，丹參總酚酸中酚酸類(lèi)成分的重量百分含量，以丹參酚酸B計(jì)為5580%;丹參總酮中含丹參酮IIA的重量百分含量為4080%;所述的川芎油中藁本內(nèi)酯的重量百分含量為4055%。5.根據(jù)權(quán)利要求l-4任意一項(xiàng)所述的藥物組合物，其特征在于所述的藥劑是片劑、膠囊劑、顆粒劑、丸劑、口服液或滴丸。6.—種制備權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述的藥物組合物的方法，它包括如下步驟a、黃芪飲片用3060%乙醇提取，濾液過(guò)大孔樹(shù)脂柱，3070%乙醇洗脫，回收乙醇，得黃芪總皂苷；b、丹參醇提物的制備丹參飲片用815倍水加熱提取，提取液過(guò)大孔樹(shù)脂柱，5090%乙醇洗脫，回收乙醇，得丹參總酚酸；藥渣用95%100%乙醇回收提取，回收乙醇，得丹參總酮提取物，將丹參總酚酸和丹參總酮提取物混合，得丹參醇提物；c、川芎飲片用80%100%乙醇溶劑浸提，回收溶劑得川芎油；d、將a、b、c步驟的黃芪總皂苷、丹參醇提取物、川芎油按下述重量配比，加入藥學(xué)上可接受的輔料或輔助性成分制備成藥學(xué)上常用的藥劑黃芪總皂苷l(shuí)-50份、丹參醇提物1-50份、川芎油0.5-30份。7.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的藥物組合物在制備治療腦卒中的藥物中的用途。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于所述的藥物是治療缺血性腦卒中的藥物。9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于所述的藥物是治療腦梗死的藥物。10.權(quán)利要求l-5任一項(xiàng)所述的藥物組合物在制備具有縮小腦梗死體積、保護(hù)神經(jīng)元、對(duì)腦缺血損傷保護(hù)作用；下調(diào)TNF-amRNA的表達(dá)；降低外周血粘附分子CDlla/CD18、CDllb/CD18的表達(dá)、下調(diào)ICAM-1mRNA的表達(dá)；抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-kB的轉(zhuǎn)錄活性；抑制caspase3的激活與表達(dá)的藥物中的用途。全文摘要本發(fā)明提供了一種治療腦卒中的藥物組合物，它是由下述重量配比的原料藥制備而成黃芪總皂苷1-50份、丹參醇提物1-50份、川芎油0.5-30份。本發(fā)明還提供了由黃芪總皂苷、丹參醇提取物、川芎油為活性成份配伍制備而成的藥劑。本發(fā)明藥物采用局灶性腦缺血標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物模型(MCAO模型)，運(yùn)用現(xiàn)代組織病理技術(shù)、流式細(xì)胞技術(shù)和分子生物學(xué)的方法，觀察本發(fā)明藥物減少腦梗死體積、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、抑制腦缺血后細(xì)胞凋亡及阻斷梗死缺血區(qū)炎性反應(yīng)的作用。試驗(yàn)證明，本發(fā)明藥物中三味原料配伍使用，發(fā)揮了明顯協(xié)同增效的作用，藥效明確，且質(zhì)量可控，為臨床提供了一種治療腦卒中的藥物新選擇。文檔編號(hào)A61K36/537GK101766686SQ200910262688公開(kāi)日2010年7月7日申請(qǐng)日期2009年12月23日優(yōu)先權(quán)日2008年12月31日發(fā)明者嚴(yán)鑄云,余芳,冉寧晶,劉福友,祝彼得,謝文,金碩果,陳衛(wèi)銀申請(qǐng)人:成都中醫(yī)藥大學(xué)