專利名稱：一種納米仿生骨材料及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域，具體涉及一種納米仿生骨材料及其制備方法。
背景技術(shù)：
天然骨是一種多層次組裝結(jié)構(gòu)并且具有完美優(yōu)異性能的生物礦化復(fù)合物，其有機(jī)成分主
要是I型膠原蛋白(collagen),無(wú)機(jī)成分主要是納米羥基磷灰石(hydroxyapatite)。近年 來(lái)的研究表明，骨組織的形成主要包括纖維狀膠原的自組裝和納米羥基磷灰石的定向沉積的 兩個(gè)過(guò)程，并且這兩個(gè)過(guò)程同時(shí)進(jìn)行，相互作用。因此目前模板組裝方法是獲得高度仿生的 最佳策略。然而現(xiàn)有的研究幾乎都局限于單一模板對(duì)無(wú)機(jī)晶體納米羥基磷灰石成核的調(diào)節(jié)和 控制上，而我們天然骨的形成是一個(gè)多模板協(xié)同共組裝的結(jié)果，因此受到自然界的啟發(fā)，我 們首次提出了基于雙模板協(xié)同共組裝的來(lái)制備納米仿生骨的研究新策略。是對(duì)現(xiàn)有單一模板 機(jī)制研究的一個(gè)重要突破和巨大補(bǔ)充。
細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix)是由大分子構(gòu)成的錯(cuò)綜復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。細(xì)胞外 基質(zhì)的主要成分包括蛋白質(zhì)和多糖類。由于這些細(xì)胞外基質(zhì)的大分子物質(zhì)具有良好的生物相 容性和可降解性。利用這些細(xì)胞外基質(zhì)的有機(jī)大分子模板的組裝來(lái)調(diào)控和誘導(dǎo)無(wú)機(jī)晶體的定 向生長(zhǎng)是目前研究生物礦化骨材料的首選方案，有機(jī)大分子通過(guò)自組裝或協(xié)同共組裝形成一 個(gè)規(guī)則地有導(dǎo)向成核位點(diǎn)的空間框架，這個(gè)框架模板的形狀、尺寸以及排列方式都調(diào)控?zé)o機(jī) 晶體的成核和生長(zhǎng)。 一種分子模板只可能提供一種成核位點(diǎn)和一個(gè)活性中心，晶體在這樣的 分子模板上生長(zhǎng)導(dǎo)致方向單一，結(jié)構(gòu)層次也較為簡(jiǎn)單，無(wú)法獲得高度仿生的多層次優(yōu)異結(jié)構(gòu) 的材料。因此我們提出采用雙模板協(xié)同共組裝新策略來(lái)制備結(jié)構(gòu)和性能更加完善的仿生骨材 料。通過(guò)選擇結(jié)構(gòu)相配，功能互補(bǔ)的兩個(gè)分子模板來(lái)同時(shí)調(diào)控晶體的生長(zhǎng)，使晶體多矢量生 長(zhǎng)方向，結(jié)構(gòu)層次復(fù)雜且有規(guī)律性。這種基于雙模板協(xié)同共組裝獲得的仿生骨材料，不僅具 有良好的生物相容性，骨傳導(dǎo)性和骨誘導(dǎo)性，還具有可控的降解特性和優(yōu)異的機(jī)械性能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提出了一種納米仿生骨材料及其制備方法，它克服現(xiàn)有的單模板組裝的仿生骨材料的不足，它不僅在成分上模擬了天然骨的組成，更在結(jié)構(gòu)上對(duì)天然 骨進(jìn)行了高度仿生，該材料具有良好的生物相容性、骨傳導(dǎo)性和骨誘導(dǎo)性，可控降解性及優(yōu) 異的機(jī)械性能。
本發(fā)明中提出的一種納米仿生骨材料，其特征在于，它基于雙分子模板協(xié)同共組裝生成 ，該雙分子模板主要包括蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)分子模板、蛋白質(zhì)與多糖分子模板、多糖與多糖分 子模板、合成分子與合成分子模板及合成分子模板與天然分子模板。
優(yōu)選的，所述蛋白質(zhì)分子模板主要包括膠原蛋白、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、纖連蛋白、層連蛋 白、骨唾液酸蛋白、絲素蛋白、血清蛋白中的任何一種。
優(yōu)選的，多糖分子模板主要包括氨基聚糖、蛋白聚糖、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸、殼聚糖 中任何一種。
優(yōu)選的，所述天然分子模板為所述的蛋白質(zhì)和多糖分子以及對(duì)其進(jìn)行改性、接枝和交聯(lián) 中的任何一種。
優(yōu)選的，所述合成分子模板為所述蛋白質(zhì)分子模板和多糖分子模板的改性、接枝和交聯(lián) 、合成的兩性多肽分子、合成的兩性自組裝分子中的任何一種。
本發(fā)明中提出的上述納米仿生骨材料的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟 步驟l、分別準(zhǔn)備兩種一定量的分子模板材料；
步驟2、分別將兩種分子模板在特定的溶劑中溶解；當(dāng)分子模板選用膠原蛋白、纖連蛋 白、層連蛋白、氨基聚糖、蛋白聚糖、殼聚糖時(shí)，用稀酸作為溶劑；當(dāng)分子模板選用骨形態(tài) 發(fā)生蛋白、骨唾液酸蛋白、血清蛋白、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸、合成的兩性多肽分子、合成 的自組裝分子時(shí)，用去離子水作為溶劑；當(dāng)分子模板選用絲素蛋白時(shí)，用鈣醇三元溶液作為 溶劑；
步驟3、按照鈣磷摩爾比為5:3的要求，分別配制一定量的鈣離子溶液和磷酸根離子溶液 ，其中，鈣離子溶液的濃度為0.01-lmol/L水溶液，磷酸根離子溶液濃度為O. 006-0. 6mol/L
步驟4、將一種分子模板溶液與鈣離子溶液來(lái)混合，同時(shí)將另一種分子模板溶液與磷酸 根離子溶液混合，中速攪拌混合均勻后，靜置讓其進(jìn)行自組裝至穩(wěn)定狀態(tài)，保證雙模板協(xié)同 共組裝；
步驟5、將含有磷酸根離子的溶液逐滴加入到含有鈣離子的溶液中，使混合溶液中分子 模板:羥基磷灰石的質(zhì)量比為3:7 (理論值)，這與天然骨成分中有機(jī)無(wú)機(jī)成分的質(zhì)量比例相 一致。然后將混合溶液pH調(diào)至7. 4;再轉(zhuǎn)至37。C恒溫水浴24至36小時(shí)，得到的沉淀樣品。在本步驟中，仿生的羥基磷灰石在雙模板上原位合成，形成具有高度仿生組裝結(jié)構(gòu)的納米骨材 料。
進(jìn)一步的，本發(fā)明該方法包括以下步驟
步驟6、將所述步驟5中得到的沉淀樣品，除去上清，離心分離出沉淀，用三蒸水反復(fù)洗
滌至中性，將洗滌后的沉淀樣品放入凍干機(jī)內(nèi)冷凍至干燥狀態(tài)，待干燥后研磨成粉。用三蒸 水反復(fù)洗滌至中性是為了確保其中的鹽離子徹底洗凈，避免污染新合成的材料。
更進(jìn)一步的，本發(fā)明還包括以下步驟
步驟7、取所述步驟6中得到的一定量的粉體材料，置于靜等壓成型機(jī)進(jìn)行塑形，保存?zhèn)?br> 用。利用靜等壓將粉體材料進(jìn)行塑形，以便進(jìn)行后續(xù)的生物相容性和機(jī)械性能檢測(cè)，也有利 于長(zhǎng)期保存?zhèn)溆谩?br> 作為一種優(yōu)選的制備方法，所述鈣離子溶液包括四水硝酸鈣、 一水乙酸鈣、氯化鈣、氫
氧化鈣溶液中的任一種；所述的磷酸根離子溶液包括磷酸氫二銨(鈉、鉀)、磷酸二氫銨( 鈉、鉀)、磷酸溶液中的任一種。
本發(fā)明首次描述了一種基于雙模板協(xié)同共組裝的納米仿生骨材料及其制備方法，該發(fā)明 填補(bǔ)了目前利用模板組裝法制備仿生納米材料在雙模板領(lǐng)域里的空白。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雙模 板法制備的納米材料的最突出的優(yōu)點(diǎn)是結(jié)構(gòu)仿生，多層次的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生優(yōu)異的機(jī)械性能。雙模 板法導(dǎo)向合成的無(wú)機(jī)晶體形貌與天然骨中高度接近。


下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步具體說(shuō)明。 圖l實(shí)施例1在I型膠原蛋白和血清蛋白雙模板調(diào)控下得到的粉體材料靜壓成圓片圖。 圖2實(shí)施例2在絲素蛋白和II型膠原蛋白雙模板調(diào)控下生長(zhǎng)的納米羥基磷灰石TEM圖。 圖3實(shí)施例5在骨形態(tài)發(fā)生蛋白和兩性短肽雙模板調(diào)控下定向生長(zhǎng)排列的納米羥基磷灰 石HRTEM圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
1) 稱取I型膠原蛋白(collagen I， COL I) 0. 5g溶解在0. 5M乙酸溶液中，配制濃度為 5mg/ml的膠原溶液100ml，為了保持膠原蛋白的活性，整個(gè)反應(yīng)過(guò)程在4。C環(huán)境中進(jìn)行。
2) 稱取牛血清蛋白(bovine serum albumin, BSA) 0. 5g溶解在去離子水中，配制濃度為
65mg/ml的血清蛋白溶液100ml，血清蛋白的純度對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響很大，所以要選用純度高的血 清蛋白，本實(shí)施例中使用的是牛血清蛋白(細(xì)胞培養(yǎng)級(jí))。
3) 分別配制200ml的0. lmol/L硝酸鈣水溶液和0.06mol/L磷酸氫二銨，鈣磷摩爾比為 5:3，然后分別用O. 22um的濾膜過(guò)濾一次保存?zhèn)溆?。這是為了消除雜質(zhì)成分對(duì)模板組裝和晶 體生長(zhǎng)的影響。
4) 將膠原溶液與硝酸鈣溶液混合形成Ca-COL I，同時(shí)將配制的血清蛋白溶液與磷酸氫 二銨溶液混合形成P-BSA，輕輕攪拌l小時(shí)后；將P-BSA逐滴加入到Ca-COL I中，得到分子模 板:羥基磷灰石的質(zhì)量比=3:7的混合溶液；用氨水將混合溶液pH調(diào)至7. 4。
5) 將混合后中性溶液轉(zhuǎn)移至37i:恒溫水浴鍋中過(guò)夜反應(yīng)24小時(shí)，確保溶液部分全部浸 沒(méi)在液面以下，在正常的生理溫度和酸堿度下來(lái)模擬生物礦化的過(guò)程。
6) 反應(yīng)完成后的沉淀樣品，棄去上清，離心分離出沉淀，用去離子水反復(fù)洗至中性。
7) 洗滌后的沉淀放入凍干機(jī)內(nèi)冷凍干燥48小時(shí)，待干燥后研磨成粉，包裝保存。
8) 將凍干研磨后的部分粉體材料在10Mpa壓力下靜壓成直徑是8mm的圓片狀材料，保存 備用。
實(shí)施例2
1) 稱取絲素蛋白(silk fibroin, SF)凍干粉O. 5g溶解在氯化鈣、無(wú)水乙醇和去離子水
配制的三元溶劑中(氯化鈣乙醇水=1: 2: 8)，然后用截留分子量為12000的透析帶透
析絲素蛋白的鈣醇溶液，最后得到濃度為5mg/ml的純絲素蛋白溶液100ml。
2) 稱取II型膠原蛋白(collagen, COL II) 0. 5g溶解在0. 5M乙酸溶液中，配制濃度為 5mg/ml的膠原溶液100ml，為了保持II型膠原蛋白的活性，整個(gè)反應(yīng)過(guò)程在4。C環(huán)境中進(jìn)行。
3) 分別配制200ml的0. lmol/L—水乙酸鈣溶液和0.06mol/L磷酸氫二鈉，鈣磷摩爾比為 5:3，然后分別用O. 22um的濾膜過(guò)濾一次保存?zhèn)溆谩＿@是為了消除雜質(zhì)成分對(duì)模板組裝和晶 體生長(zhǎng)的影響。
4) 將膠原溶液與乙酸鈣溶液混合形成Ca-COL II，同時(shí)將配制的絲素蛋白溶液與磷酸 氫二鈉溶液混合形成P-SF，輕輕攪拌l小時(shí)后；將P-SF逐滴加入到Ca-COL II中，得到分子模 板:羥基磷灰石的質(zhì)量比=3:7的混合溶液；用O. 01M氫氧化鈉將混合溶液pH調(diào)至7. 4。
5) 將混合后中性溶液轉(zhuǎn)移至37i:恒溫水浴鍋中過(guò)夜反應(yīng)24小時(shí)，確保溶液部分全部浸 沒(méi)在液面以下，在正常的生理溫度和酸堿度下來(lái)模擬生物礦化的過(guò)程。
6) 反應(yīng)完成后的沉淀樣品，棄去上清，離心分離出沉淀，用去離子水反復(fù)洗至中性。7) 洗滌后的沉淀放入凍干機(jī)內(nèi)冷凍干燥48小時(shí)，待干燥后研磨成粉，包裝保存。
8) 將凍干研磨后的部分粉體材料在10Mpa壓力下靜壓成直徑是8mm的圓片狀材料，保存 備用。
實(shí)施例3
1) 稱取V型膠原蛋白(collagen V， COL I) 0. 5g溶解在0. 5M乙酸溶液中，配制濃度為 5mg/ml的膠原溶液100ml，為了保持膠原蛋白的活性，整個(gè)反應(yīng)過(guò)程在4。C環(huán)境中進(jìn)行。
2) 稱取透明質(zhì)酸(hyaluronic acid， HA，分子量是5KD) 0. 5g溶解在去離子水中，配制 濃度為5mg/ml的透明質(zhì)酸溶液100ml，透明質(zhì)酸的純度對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響很大，所以要選用純度 高的透明質(zhì)酸，本實(shí)施例中使用的是透明質(zhì)酸(細(xì)胞培養(yǎng)級(jí))。
3) 分別配制200ml的0. lmol/L硝酸鈣水溶液和0.06mol/L磷酸二氫銨，鈣磷摩爾比為 5:3，然后分別用O. 22um的濾膜過(guò)濾一次保存?zhèn)溆谩＿@是為了消除雜質(zhì)成分對(duì)模板組裝和晶 體生長(zhǎng)的影響。
4) 將膠原溶液與硝酸鈣溶液混合形成Ca-COL V，同時(shí)將配制的透明質(zhì)酸溶液與磷酸氫 二銨溶液混合形成P-HA，輕輕攪拌l小時(shí)后；將P-HA逐滴加入到Ca-COL V中，得到分子模板 :羥基磷灰石的質(zhì)量比=3:7的混合溶液；用氨水將混合溶液pH調(diào)至7. 4。
5) 將混合后中性溶液轉(zhuǎn)移至37i:恒溫水浴鍋中過(guò)夜反應(yīng)24小時(shí)，確保溶液部分全部浸 沒(méi)在液面以下，在正常的生理溫度和酸堿度下來(lái)模擬生物礦化的過(guò)程。
6) 反應(yīng)完成后的沉淀樣品，棄去上清，離心分離出沉淀，用去離子水反復(fù)洗至中性。
7) 洗滌后的沉淀放入凍干機(jī)內(nèi)冷凍干燥48小時(shí)，待干燥后研磨成粉，包裝保存。
8) 將凍干研磨后的部分粉體材料在10Mpa壓力下靜壓成直徑是8mm的圓片狀材料，保存 備用。
實(shí)施例4
1) 稱取硫酸軟骨素(chondroitin sulfate, CS) 0. 5g溶解在去離子水中，配制濃度為 5mg/ml的溶液100ml，硫酸軟骨素的純度對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響很大，所以要選用純度高的硫酸軟骨 素，本實(shí)施例中使用的是硫酸軟骨素(醫(yī)用級(jí))。
2) 稱取透明質(zhì)酸(hyaluronic acid， HA，分子量是5KD) 0. 5g溶解在去離子水中，配制 濃度為5mg/ml的透明質(zhì)酸溶液100ml，透明質(zhì)酸的純度對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響很大，所以要選用純度 高的透明質(zhì)酸，本實(shí)施例中使用的是透明質(zhì)酸(細(xì)胞培養(yǎng)級(jí))。3) 分別配制200ml的0. lmol/L氯化鈣水溶液和0.06mol/L磷酸二氫鉀，鈣磷摩爾比為5:3 ，然后分別用O. 22 y m的濾膜過(guò)濾一次保存?zhèn)溆?。這是為了消除雜質(zhì)成分對(duì)模板組裝和晶體 生長(zhǎng)的影響。
4) 將硫酸軟骨素溶液與氯化鈣溶液混合形成Ca-CS，同時(shí)將配制的透明質(zhì)酸溶液與磷酸 氫二銨溶液混合形成P-HA，輕輕攪拌l小時(shí)后；將P-HA逐滴加入到Ca-CS中，得到分子模板 羥基磷灰石的質(zhì)量比=3:7的混合溶液；用O. 01M的氫氧化鉀將混合溶液pH調(diào)至7. 4。
5) 將混合后中性溶液轉(zhuǎn)移至37i:恒溫水浴鍋中過(guò)夜反應(yīng)24小時(shí)，確保溶液部分全部浸 沒(méi)在液面以下，在正常的生理溫度和酸堿度下來(lái)模擬生物礦化的過(guò)程。
6) 反應(yīng)完成后的沉淀樣品，棄去上清，離心分離出沉淀，用去離子水反復(fù)洗至中性。
7) 洗滌后的沉淀放入凍干機(jī)內(nèi)冷凍干燥48小時(shí)，待干燥后研磨成粉，包裝保存。
8) 將凍干研磨后的部分粉體材料在10Mpa壓力下靜壓成直徑是8mm的圓片狀材料，保存 備用。
實(shí)施例5
1) 采用多肽固相合成法來(lái)合成兩性短肽分子(p印tide-amphiphiles， PA)，該短肽有 22個(gè)氨基酸組成， 一端高度疏水，另一端高度親水，并且包含細(xì)胞促粘附因子的RGD序列， 取該合成的多肽50mg溶于去離子水中，配制濃度為lmg/ml的兩性短肽分子溶液50ml。
2) 稱取骨開多態(tài)發(fā)生蛋白2 (bone morphogenetic protein-2， BMP-2) 50mg溶解在去離 子水中，配制濃度為lmg/ml的溶液50ml。
3) 分別配制200ml的0. 01mol/L硝酸鈣水溶液和0. 006mol/L磷酸二氫鉀，鈣磷摩爾比為 5:3，然后分別用O. 22um的濾膜過(guò)濾一次保存?zhèn)溆谩＿@是為了消除雜質(zhì)成分對(duì)模板組裝和晶 體生長(zhǎng)的影響。
4) 將兩性短肽分子溶液與硝酸鈣溶液混合形成Ca-PA，同時(shí)將配制的骨形態(tài)發(fā)生蛋白2 溶液與磷酸二氫鉀溶液混合形成P-BMP-2，輕輕攪拌l小時(shí)后；將P-BMP-2逐滴加入到Ca-PA中 ，得到分子模板:羥基磷灰石的質(zhì)量比=3:7的混合溶液；用O. OlM的氫氧化鉀將混合溶液pH調(diào) 至7.4。
5) 將混合后中性溶液轉(zhuǎn)移至37i:恒溫水浴鍋中過(guò)夜反應(yīng)24小時(shí)，確保溶液部分全部浸 沒(méi)在液面以下，在正常的生理溫度和酸堿度下來(lái)模擬生物礦化的過(guò)程。
6) 反應(yīng)完成后的沉淀樣品，棄去上清，離心分離出沉淀，用去離子水反復(fù)洗至中性。
7) 洗滌后的沉淀放入凍干機(jī)內(nèi)冷凍干燥48小時(shí)，待干燥后研磨成粉，包裝保存。8)將凍干研磨后的部分粉體材料在10Mpa壓力下靜壓成直徑是8mm的圓片狀材料，保存 備用。
實(shí)施例6
1) 采用多肽固相合成法來(lái)合成兩性短肽分子(p印tide-amphiphiles， PA)，該短肽有 22個(gè)氨基酸組成， 一端高度疏水，另一端高度親水，并且包含細(xì)胞促粘附因子的RGD序列， 取該合成的多肽50mg溶于去離子水中，配制濃度為lmg/ml的兩性短肽分子溶液50ml。
2) 稱取殼聚糖(chitosan， CTS，分子量是25KD，脫乙酰度為95%) 50mg溶解在0. 5M乙酸 溶液中，配制濃度為lmg/ml的溶液50ml。
3) 分別配制200ml的0. 01mol/L硝酸鈣水溶液和0. 006mol/L磷酸氫二鈉，鈣磷摩爾比為 5:3，然后分別用O. 22um的濾膜過(guò)濾一次保存?zhèn)溆?。這是為了消除雜質(zhì)成分對(duì)模板組裝和晶 體生長(zhǎng)的影響。
4) 將兩性短肽分子溶液與硝酸鈣溶液混合形成Ca-PA，同時(shí)將配制的殼聚糖溶液與磷酸 二氫鉀溶液混合形成P-CTS，輕輕攪拌l小時(shí)后；將P-CTS逐滴加入到Ca-PA中，得到分子模板 :羥基磷灰石的質(zhì)量比=3:7的混合溶液；用O. 01M的氫氧化鈉將混合溶液pH調(diào)至7. 4。
5) 將混合后中性溶液轉(zhuǎn)移至37i:恒溫水浴鍋中過(guò)夜反應(yīng)24小時(shí)，確保溶液部分全部浸 沒(méi)在液面以下，在正常的生理溫度和酸堿度下來(lái)模擬生物礦化的過(guò)程。
6) 反應(yīng)完成后的沉淀樣品，棄去上清，離心分離出沉淀，用去離子水反復(fù)洗至中性。
7) 洗滌后的沉淀放入凍干機(jī)內(nèi)冷凍干燥48小時(shí)，待干燥后研磨成粉，包裝保存。
8) 將凍干研磨后的部分粉體材料在10Mpa壓力下靜壓成直徑是8mm的圓片狀材料，保存 備用。
實(shí)施例7
1) 通過(guò)超分子自組裝合成了兩性水凝膠材料(gelatin-alphiphile， GA)，該水凝膠 材料是一種溫敏性控制的兩性材料。稱取該水凝膠材料O. 5g，配制濃度為1%的水凝膠溶液 50ml， 0. 22ym的濾膜過(guò)濾。
2) 稱取I型膠原蛋白0.5g溶解在0.5M乙酸溶液中，配制濃度為5mg/ml的膠原溶液 100ml，為了保持膠原蛋白的活性，整個(gè)反應(yīng)過(guò)程在4。C環(huán)境中進(jìn)行。
3) 分別配制200ml的0. lmol/L硝酸鈣水溶液和0.06mol/L磷酸氫二銨，鈣磷摩爾比為5:3 ，然后分別用O. 22 y m的濾膜過(guò)濾一次保存?zhèn)溆谩＿@是為了消除雜質(zhì)成分對(duì)模板組裝和晶體
10生長(zhǎng)的影響。
4) 將I型膠原蛋白溶液與硝酸鈣溶液混合形成Ca-COL，同時(shí)將配制的兩性水凝膠材料溶 液與磷酸二氫銨溶液混合形成P-GA，輕輕攪拌l小時(shí)后；將P-GA逐滴加入到Ca-C0L中，得到 分子模板:羥基磷灰石的質(zhì)量比=3:7的混合溶液；用O. 01M的氨水將混合溶液pH調(diào)至7. 4。
5) 將混合后中性溶液轉(zhuǎn)移至37i:恒溫水浴鍋中過(guò)夜反應(yīng)24小時(shí)，確保溶液部分全部浸 沒(méi)在液面以下，在正常的生理溫度和酸堿度下來(lái)模擬生物礦化的過(guò)程。
6) 反應(yīng)完成后的沉淀樣品，棄去上清，離心分離出沉淀，用去離子水反復(fù)洗至中性。
7) 洗滌后的沉淀放入凍干機(jī)內(nèi)冷凍干燥48小時(shí)，待干燥后研磨成粉，包裝保存。
8) 將凍干研磨后的部分粉體材料在10Mpa壓力下靜壓成直徑是8mm的圓片狀材料，保存 備用。
實(shí)施例8
1) 采用多肽固相合成法來(lái)合成兩性短肽分子(p印tide-amphiphiles， PA)，該短肽有 22個(gè)氨基酸組成， 一端高度疏水，另一端高度親水，并且包含細(xì)胞促粘附因子的RGD序列， 取該合成的多肽50mg溶于去離子水中，配制濃度為lmg/ml的兩性短肽分子溶液50ml。
2) 通過(guò)超分子自組裝合成了兩性水凝膠材料(gelatin-alphiphile， GA)，該水凝膠 材料是一種溫敏性控制的兩性材料。稱取該水凝膠材料50mg，配制濃度為lmg/ml的水凝膠溶 液50ml 。
3) 分別配制200ml的0. 01mol/L氯化鈣水溶液和0. 006mol/L磷酸二氫鈉，鈣磷摩爾比為 5:3，然后分別用O. 22um的濾膜過(guò)濾一次保存?zhèn)溆?。這是為了消除雜質(zhì)成分對(duì)模板組裝和晶 體生長(zhǎng)的影響。
4) 將兩性短肽分子溶液與氯化鈣溶液混合形成Ca-PA，同時(shí)將配制的兩性水凝膠材料溶 液與磷酸二氫銨溶液混合形成P-GA，輕輕攪拌l小時(shí)后；將P-GA逐滴加入到Ca-PA中，得到分 子模板:羥基磷灰石的質(zhì)量比=3:7的混合溶液；用O. 01M的氫氧化鈉將混合溶液pH調(diào)至7. 4。
5) 將混合后中性溶液轉(zhuǎn)移至37i:恒溫水浴鍋中過(guò)夜反應(yīng)24小時(shí)，確保溶液部分全部浸 沒(méi)在液面以下，在正常的生理溫度和酸堿度下來(lái)模擬生物礦化的過(guò)程。
6) 反應(yīng)完成后的沉淀樣品，棄去上清，離心分離出沉淀，用去離子水反復(fù)洗至中性。
7) 洗滌后的沉淀放入凍干機(jī)內(nèi)冷凍干燥48小時(shí)，待干燥后研磨成粉，包裝保存。
8) 將凍干研磨后的部分粉體材料在10Mpa壓力下靜壓成直徑是8mm的圓片狀材料，保存 備用。最后所應(yīng)說(shuō)明的是，以上具體實(shí)施方式
僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參 照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的 技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本 發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。
權(quán)利要求
1.一種納米仿生骨材料，其特征在于，它基于雙分子模板協(xié)同共組裝生成，該雙分子模板包括蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)分子模板、蛋白質(zhì)與多糖分子模板、多糖與多糖分子模板、合成分子與合成分子模板及合成分子模板與天然分子模板。
2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的納米仿生骨材料，其特征在于，所述蛋白質(zhì) 分子模板主要包括膠原蛋白、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、纖連蛋白、層連蛋白、骨唾液酸蛋白、絲素 蛋白、血清蛋白中的任何一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求l所述的納米仿生骨材料，其特征在于，所述多糖分 子模板主要包括氨基聚糖、蛋白聚糖、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸、殼聚糖中任何一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求l所述的納米仿生骨材料，其特征在于，所述合成分 子模板為所述的合成兩性肽分子和合成的兩性自組裝分子中任何一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求l所述的納米仿生骨材料，其特征在于，所述天然分 子模板為所述的蛋白質(zhì)和多糖分子以及對(duì)其進(jìn)行改性、接枝和交聯(lián)中的任何一種。
6. 一種制備如權(quán)利要求l所述的納米仿生骨材料的方法，其特征在于 ，該方法包括以下步驟步驟l、分別準(zhǔn)備兩種一定量的分子模板材料；步驟2、分別將兩種分子模板在特定的溶劑中溶解；當(dāng)分子模板選用膠原蛋白、纖連蛋 白、層連蛋白、氨基聚糖、蛋白聚糖、殼聚糖時(shí)，用稀酸作為溶劑；當(dāng)分子模板選用骨形態(tài) 發(fā)生蛋白、骨唾液酸蛋白、血清蛋白、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸、合成的兩性多肽分子、合成 的自組裝分子時(shí)，用去離子水作為溶劑；當(dāng)分子模板選用絲素蛋白時(shí)，用鈣醇三元溶液作為溶劑；步驟3、按照鈣磷摩爾比為5:3的要求，分別配制一定量的鈣離子溶液和磷酸根離子溶 液，其中，鈣離子溶液的濃度為0.01-lmol/L水溶液，磷酸根離子溶液濃度為 0.006-0.6mol/L;步驟4、將一種分子模板溶液與鈣離子溶液來(lái)混合，同時(shí)將另一種分子模板溶液與磷酸 根離子溶液混合，中速攪拌混合均勻后，靜置讓其進(jìn)行自組裝至穩(wěn)定狀態(tài)；步驟5、將含有磷酸根離子的溶液逐滴加入到含有鈣離子的溶液中，使混合溶液中分子 模板:羥基磷灰石的質(zhì)量比為3:7 (理論值)；將混合溶液pH調(diào)至7.4;然后轉(zhuǎn)至37 恒溫水浴 24至36小時(shí)，得到的沉淀樣品。
7.如權(quán)利要求6所述的納米仿生骨材料的制備方法，其特征在于，該 方法包括以下步驟步驟6、將所述步驟5中得到的沉淀樣品，除去上清，離心分離出沉淀，用三蒸水反復(fù) 洗滌至中性，將洗滌后的沉淀樣品放入凍干機(jī)內(nèi)冷凍干燥，待干燥后研磨成粉。
8.如權(quán)利要求7所述的納米仿生骨材料的制備方法，其特征在于，還 包括以下步驟步驟7、取所述步驟6中得到的一定量的粉體材料，置于靜等壓成型機(jī)進(jìn)行塑形，保存 備用。
9.根據(jù)權(quán)利要求6、 7、 8之一所述的納米仿生骨材料的制備方法，其 特征在于，所述鈣離子溶液包括四水硝酸鈣、 一水乙酸鈣、氯化鈣、氫氧化鈣溶液中的任一 種；所述的磷酸根離子溶液包括磷酸氫二銨(鈉、鉀)、磷酸二氫銨(鈉、鉀)、磷酸溶液 中的任一種。
全文摘要
本發(fā)明具體涉及納米仿生骨材料及其制備方法，該納米仿生骨材料基于雙分子模板協(xié)同共組裝生成，該雙分子模板包括蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)模板、蛋白質(zhì)與多糖模板、多糖與多糖分子模板、合成分子與合成分子模板以及合成分子模板與天然分子模板。其制備方法為將一種模板與含鈣離子的溶液混合，另一種模板與含磷酸根離子的溶液混合，待二者均攪拌均勻后，將含有磷酸根離子的溶液逐滴加入到含有鈣離子的溶液中，調(diào)節(jié)混合溶液的pH值為7.4后轉(zhuǎn)移至37℃恒溫水浴后得到沉淀物即納米仿生骨材料。本發(fā)明的仿生骨材料不僅具有良好的生物相容性和可降解性，還具有高度接近的天然骨的仿生多層組裝結(jié)構(gòu)，是一種真正意義上的仿生骨材料，在臨床骨修復(fù)中具有廣泛應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61L27/40GK101628130SQ200910305850
公開日2010年1月20日 申請(qǐng)日期2009年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月20日
發(fā)明者張勝民, 王江林 申請(qǐng)人:華中科技大學(xué)