專利名稱：治療慢性疲勞綜合征的b細(xì)胞耗竭劑,如抗-cd20抗體或其片段的制作方法
治療慢性疲勞綜合征的B細(xì)胞耗竭劑，如抗-CD20抗體或其
片段本發(fā)明第一方面涉及治療慢性疲勞綜合征和肌痛性腦脊髓炎的耗竭B細(xì)胞的 抗-CD20抗體或者其結(jié)合CD20的抗體片段。特別地，本發(fā)明涉及優(yōu)選人源化的抗-CD20單 克隆抗體或者其片段在治療受累于慢性疲勞綜合征/肌痛性腦脊髓炎的對(duì)象中所述疾病 的應(yīng)用。另一方面，本發(fā)明涉及一般用于治療受累于慢性疲勞綜合征和肌痛性腦脊髓炎的 對(duì)象中所述疾病的B細(xì)胞耗竭劑(cbpleting agents)。
背景技術(shù)：
慢性疲勞綜合征慢性疲勞綜合征(CFS)特征在于無(wú)法解釋的嚴(yán)重疲勞，持續(xù)至少連續(xù)六個(gè)月，伴 有職業(yè)、社會(huì)或者個(gè)人活動(dòng)的先前水平明顯降低?；颊咭餐ǔ＝?jīng)歷持久或者復(fù)發(fā)的如短期 記憶力或者注意力受損、肌肉疼痛、無(wú)關(guān)節(jié)炎跡象的關(guān)節(jié)疼痛、頭痛、睡眠異常以及運(yùn)動(dòng)后 精疲力竭等癥狀(Fukuda K，et al. , 1994,Ann Intern Med 121 :953_9et al 1994)。許多 研究已經(jīng)示出血液測(cè)試或者放射研究中的微細(xì)改變，但是還沒(méi)有生物標(biāo)記或者診斷測(cè)試。全世界CFS的流行程度被認(rèn)為是至少0.5%，且女性男性比率為3 Kffyller VB. 2007，Acta Neurol Scand Suppl 187 :7_14)。CFS的病原學(xué)還未明確。各種假說(shuō)包括免疫學(xué)、病毒學(xué)、神經(jīng)內(nèi)分泌學(xué)以及心理學(xué) 機(jī)制。推測(cè)CFS的發(fā)病機(jī)制是多因素的，且包括主體(host)和環(huán)境因素(Devanur & Kerr 2006)。在2007年11月的新近綜述中，描述了當(dāng)前CFS的優(yōu)先研究領(lǐng)域中迫切需要闡述 CFS 的發(fā)病機(jī)制(Kerr JR et al.，2007，J Clin Pathol 60 113-6)。許多患有CFS的患者在發(fā)生疲勞之前具有急性病毒感染史。盡管研究數(shù)據(jù)指出免 疫系統(tǒng)激活證據(jù)，但是疾病機(jī)制仍未知。在2001年成立合作研究小組，以闡明CFS的分子 機(jī)制，旨在開(kāi)發(fā)診斷測(cè)試及指導(dǎo)開(kāi)發(fā)更特異性的治療(Devanur LD, Kerr JR. 2006，J Clin Virol 37:139-50)。在CFS中已經(jīng)進(jìn)行了一些基因表達(dá)研究，根據(jù)免疫應(yīng)答和防御機(jī)制中的功能失調(diào) 表明存在特異性但復(fù)雜的基因變異。一項(xiàng)微陣列研究揭示CFS中16個(gè)基因的差異表達(dá)，提 示T細(xì)胞激活及神經(jīng)元和線粒體功能紊亂(Kaushik N, et. Al.，2005，J Clin Pathol 58 826-32)。另一項(xiàng)微陣列研究使用來(lái)自在埃巴病毒(EBV)感染之后發(fā)生CFS的患者以及感 染EBV但是未發(fā)生疲勞的對(duì)象的外周血單個(gè)核細(xì)胞總RNA的系列樣品，推斷出影響線粒體 功能和細(xì)胞周期的一些基因失調(diào)(Vernon SD, et. Al.，2006，BMC Infect Dis 6:15)。在 CFS中進(jìn)行的另一項(xiàng)基因表達(dá)研究提示運(yùn)動(dòng)應(yīng)答基因包括參與膜轉(zhuǎn)運(yùn)和離子通道的一些基 因的失調(diào)(Whistler Τ, et. al. ,2005, BMC Physiol 5:5)。近年來(lái)，在CFS中進(jìn)行的基因 網(wǎng)絡(luò)分析表明在臨床表現(xiàn)和嚴(yán)重性方面不同的七個(gè)不同的基因組亞型(Kerr J，et. al., 2007，J Clin Pathol)。一些其它研究致力于CFS中全局基因表達(dá)(Fang H，et. al.，2006，Pharmacogenomics 7 429-40 ；Whistler Τ, et al. ，2003，J Transl Med 1 :10)。基因表達(dá)數(shù)據(jù)不是結(jié)論性的，但是提示在CFS中存在代表多種細(xì)胞功能的基因表 達(dá)失調(diào)，且可以表明所述疾病具有異源發(fā)病機(jī)制。CFS研究的主要論題是持續(xù)免疫失調(diào)，隨后是急性外源刺激如病毒感染。據(jù)報(bào)道與 CFS相關(guān)的微生物病原體是埃巴病毒(Lemer AM, et al. ,2004, In Vivo 18 101-6)、腸道病 毒(Chia JK, Chia AY. 2007, J Clin Pathol)、細(xì)小病毒B19 (Matano S，et al. ,2003, Intern Med 42 :903-5)、巨細(xì)胞病毒(Lerner AM, et al.，2002，In Vivo 16 :153_9)、人皰疹病毒 類型 6 (Chapenko S, et al.，2006，JClin Virol 37Suppl 1 :S47_51 ；Komaroff AL. 2006， J Clin Virol 37Suppll :S39_46)、肺炎衣原體(Nicolson GL, et al.，2003，Apmis 111 557-66)。然而，數(shù)據(jù)不一致(Soto NE, Straus SE.，2000，Herpes 7 :46_50)。近來(lái)對(duì)于感染后疲勞綜合征的研究發(fā)現(xiàn)與在感染后立即康復(fù)的對(duì)照組相比，在 超過(guò)12個(gè)月的時(shí)期在離體(ex vivo)細(xì)胞因子產(chǎn)生方面并無(wú)不同(Vollmer-Corma U， et al.，2007，Clin Infect Dis 45:732-5)。其它研究主張盡管通過(guò)激活的T細(xì)胞數(shù)目 增加以及細(xì)胞因子水平提高表明免疫激活證據(jù)，但是CFS患者可能具有降低的免疫細(xì)胞功 能，伴有低NK細(xì)胞細(xì)胞毒性和免疫球蛋白缺陷(Patarca R. 2001，Ann N YAcad Sci 933 185-200)。其它研究報(bào)道了與對(duì)照組相比，CFS患者中大量循環(huán)B淋巴細(xì)胞，改變的NK細(xì)胞 亞系，也具有增加的粘附分子表達(dá)(Tirelli U，et al.，1994，ScandJ Immunol 40:601-8)， 而其它研究示出在CFS患者中減少的⑶56+NK-細(xì)胞和減少的⑶4+和⑶8+T-淋巴細(xì)胞 (Racciatti D，et al.，2004，Int Jlmmunopathol Pharmacol 17:57-62)。也發(fā)現(xiàn)來(lái)自 CFS 患者的T細(xì)胞和NK細(xì)胞表達(dá)較低水平的細(xì)胞內(nèi)顆粒蛋白-穿孔蛋白，表明介導(dǎo)細(xì)胞毒性的 能力降低。一項(xiàng)研究示出在CFS患者中與免疫功能相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室標(biāo)記中的一些異常(Klimas NG, et al. ,1990, J Clin Microbiol 28:1403-10)。最一致的結(jié)果是低 NK 細(xì)胞細(xì)胞毒性， 但是也有⑶8+T-細(xì)胞增加、⑶20+B-細(xì)胞數(shù)目增加以及共表達(dá)⑶20和⑶5的B細(xì)胞亞系 增加(Klimas et al 1990)。這些資料在一定程度上由一項(xiàng)研究支持，該研究報(bào)道在CFS患 者中激活的⑶8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞擴(kuò)增以及NK細(xì)胞活性明顯降低(Barker Ε, et al.， 1994. ClinInfect Dis 18 Suppl 1 :S136_41)。近來(lái)一項(xiàng)對(duì)比CFS患者與對(duì)照組的研究報(bào)道在體外促有絲分裂刺激之后T細(xì) 胞和NK細(xì)胞上的⑶69表達(dá)降低，表明由這些細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫性的早期激活失調(diào) (Mihaylova I，et al. ,2007, Neuro Endocrinol Lett28 :477_83)。然而，CFS中免疫失調(diào)數(shù)據(jù)不一致，一項(xiàng)對(duì)比CFS患者與抑郁癥患者、多發(fā)性硬化 癥患者以及健康對(duì)照組的淋巴細(xì)胞亞系的研究發(fā)現(xiàn)τ細(xì)胞、B細(xì)胞或者NK細(xì)胞亞系無(wú)差異 (Robertson MJ, et al. ,2005, Clin Exp Immunol 141 :326_32)。相似地，對(duì)于 CFS 免疫學(xué)的 綜述推斷在研究領(lǐng)域進(jìn)行的研究具有不同性質(zhì)，不能鑒別出免疫學(xué)異常的一致模式(Lyal 1 M, et al.，2003，JPsychosom Res 55 :79_90)。連同CFS中免疫失調(diào)的假說(shuō)一起，已經(jīng)提出對(duì)于內(nèi)源血管活性神經(jīng)肽的自身免疫 性是該疾病的發(fā)病機(jī)制(Staines DR. ,2005,Med Hypotheses64 :539_42)，然而無(wú)科學(xué)數(shù)據(jù) 支持。該作者也提示在纖維肌痛、多發(fā)性硬化、肌萎縮側(cè)索硬化、帕金森氏癥和嬰兒猝死綜
4合征病原學(xué)中的相似機(jī)制，推測(cè)對(duì)于發(fā)揮激素、神經(jīng)遞質(zhì)、免疫調(diào)節(jié)劑和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子作用 的血管活性神經(jīng)肽的自身免疫性可以解釋這些疾病的復(fù)雜臨床表現(xiàn)。然而，未證明在CFS 中具有這些神經(jīng)肽的自身抗體。一項(xiàng)研究調(diào)查了 CFS患者和對(duì)照組中循環(huán)抗肌肉和抗CNS抗體的存在情況，未檢 測(cè)到病原性抗體。關(guān)于CFS中抗核自身抗體的另一報(bào)道推斷不存在關(guān)聯(lián)性(Skowera A,et al. ,2002, Clin Exp Immunol 129 :354_8)，而關(guān)于神經(jīng)元特異性抗原的共有自身抗體和抗 體另一項(xiàng)研究示出在CFS中較高比率的微管相關(guān)蛋白2和ssDNA抗體(Vernon SD, Reeves WC. 2005，JAutoimmune Dis 2 5)。一項(xiàng)研究表明與對(duì)照組相比，CFS患者亞系中存在毒蕈 堿膽堿能受體的自身抗體(Tanaka S，et al. ,2003, Int J MoI Medl2 :225_30)，以及在CFS 中較高水平的不溶的細(xì)胞抗原自身抗體(yonMikeecz Α.，et al.，1997，Arthritis Rheum 40 295-305)。然而，沒(méi)有一致的數(shù)據(jù)直接表明存在病原性自身抗體或者T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的自身 免疫性。沒(méi)有通過(guò)在動(dòng)物模型中用類似于(推定的)人自身抗原的抗原免疫接種再現(xiàn)CFS 疾病的間接證據(jù)。目前未將CFS定義為自身免疫疾病，近來(lái)關(guān)于CFS的藥物治療方案的Cochrane 綜述指出其病原學(xué)還未知(Rawson KM, et al.，2007. Pharmacological treatments for chronic fatigue syndrome in adults. (Protocol)Cochrane Database of Systematic Reviews, Issue 4. Art. No. :CD006813.)。 關(guān)于CFS發(fā)病機(jī)制的的其它假說(shuō)是血小板功能失調(diào)(Kennedy G，et al., 2006，Blood Coagul Fibrinolysis 17 :89_92)、神經(jīng)學(xué)(Natelson BH let al. ,2005, Clin Diagn Lab Immunol 12 :52_5)、神經(jīng)內(nèi)分泌學(xué)(Van Den Eede F, et al. ,2007, Neuropsychobiology 55 :112_20)、代謝或者自主神經(jīng)紊亂、離子通道功能失調(diào)(Chaudhuri A, et al.，2000，Med Hypotheses 54 :59_63)、鋅缺乏(Maes Μ, etal.，2006，J Affect Disord 90 141-7)、毒素暴露或者先前的接種(Appel S, et al.，2007，Autoimmunity 40 48-53)。其它假說(shuō)集中在對(duì)于運(yùn)動(dòng)的異常應(yīng)答，細(xì)胞內(nèi)免疫失常是一種可能的CFS發(fā)病機(jī) 制(Nijs J, et al.，2004，Med Hypotheses62 :759_65)。也已經(jīng)提出合成 n_3 和 n_6 長(zhǎng)鏈 多不飽和脂肪酸的能力在感染后損害在CFS的病理生理學(xué)中是重要的(Puri BK. 2007，J Clin Pathol60 122-4)。因此，近來(lái)在頗具聲望的期刊中對(duì)于CFS的綜述指出目前對(duì)于該疾病的原因還未 知(Hampton Τ.2006，Jama 296 2915 ；Hooper Μ. 2007，J ClinPathol 60 466-71 ；Prins JB, et al. ,2006, Lancet 367:346-55)。因此，對(duì)于CFS的病原學(xué)和發(fā)病機(jī)制呈現(xiàn)出無(wú)一 致描述。目前CFS的治療由于缺乏對(duì)于準(zhǔn)確發(fā)病機(jī)制的了解以及無(wú)已知的因果機(jī)制，因此目前對(duì)于CFS沒(méi) 有標(biāo)準(zhǔn)的特異性治療方案。一項(xiàng)系統(tǒng)綜述推斷CFS應(yīng)與“生物心理社會(huì)模型”相關(guān)，強(qiáng)調(diào) 進(jìn)行性肌肉康復(fù)，組合行為和認(rèn)知治療(Maquet etal, 2006, Ann Readapt Med Phys 49: 337-47,418-27)。CFS的病因?qū)W未知可能是極少進(jìn)行基于生物學(xué)假說(shuō)評(píng)價(jià)治療的研究的原因。由于大多數(shù)證據(jù)提示免疫系統(tǒng)失調(diào)，可能由于外來(lái)刺激所致，因此進(jìn)行了兩項(xiàng)研究評(píng)定靜脈內(nèi)使用丙種球蛋白治療CFS。一項(xiàng)研究是在急性細(xì)小病毒B19感染后發(fā)生CFS 的三個(gè)患者中報(bào)道的病例，通過(guò)靜脈內(nèi)使用免疫球蛋白治療5天，臨床癥狀改善以及細(xì)胞 因子失調(diào)得以解決(Kerr et al，2003·，Clin Infect Dis 36 :el00_6)。在對(duì)患有 CFS 的 71名青少年進(jìn)行的雙盲的安慰劑對(duì)照的隨機(jī)研究中，一個(gè)月內(nèi)相隔一段時(shí)間輸注三次丙種 球蛋白，在6個(gè)月丙種球蛋白治療組的功能得以改善，繼續(xù)進(jìn)行平均18個(gè)月。在實(shí)驗(yàn)的頭 6個(gè)月中，安慰劑組和丙種球蛋白治療組均報(bào)道有改善(Rowe 1997，JPsychiatr Res 31: 133-47)。在以摘要形式報(bào)道的先導(dǎo)研究中(Lamprecht 2001，Meeting of theAmerican association of chronic fatigue syndrome (AACFS). Seattle),給予 6 名 CFS 患者 etanerc印t(Enbrel，即人腫瘤壞死因子受體p75Fc融合蛋白，其是可溶的競(jìng)爭(zhēng)性TNF-受 體，抑制TNF-介導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答)，報(bào)道臨床受益。在其它治療策略中，使用valganciclovir治療長(zhǎng)期存在疲勞及對(duì)于埃巴病毒或 者人皰疹病毒_6具有升高的抗體效價(jià)的12名患者，其中9名患者癥狀改善，然而不確定該 作用是由于抗病毒作用還是由于免疫調(diào)節(jié)作用所致(Kogelnik AM, . 2006.，J Clin Virol 37Suppl 1 :S33-8)。用具有免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)的抗生素阿奇霉素治療，99名CFS患者的59%得 以改善(Vermeulen & Scholte2006, J Transl Med 4 34)。在近來(lái)對(duì)于CFS的優(yōu)先研究的綜述中(Kerr et al 2007，J Clin Pathol60 113-6)，鼓勵(lì)進(jìn)行針對(duì)理解該疾病的分子發(fā)病機(jī)制的新研究，測(cè)試有效的分子標(biāo)記，以及幫 助開(kāi)發(fā)特異性治療方法。許多分子技術(shù)可利用，且已經(jīng)用于此目的，包括使用微陣列進(jìn)行全 局基因表達(dá)分析。RITUXIMAB在B細(xì)胞淋巴瘤和自身免疫中作為耗竭B細(xì)胞的抗體的實(shí)例 Rituximab (Mabthera, RITUXAN )是針對(duì)跨膜分子CD20的胞外部分中的表位的單克隆 抗體。該抗體是嵌合人-小鼠抗體，其中抗原結(jié)合片段(Fab)部分是小鼠的及Fc-部分是 人的。⑶20蛋白在B淋巴細(xì)胞上表達(dá)，但是在干細(xì)胞或者成熟的漿細(xì)胞上不表達(dá)。⑶20也 在大多數(shù)B細(xì)胞淋巴瘤上表達(dá)。CD20參與調(diào)節(jié)跨膜鈣傳導(dǎo)和細(xì)胞周期行進(jìn)，但是確切功能 未知(Janas etal 2005,Biochem Soc Symp :165_75)。基于 Rituximab 與 CD20 的結(jié)合，通 過(guò)補(bǔ)體與Fc部分的結(jié)合激活補(bǔ)體級(jí)聯(lián)以及通過(guò)活化抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)介導(dǎo)免疫 細(xì)胞殺傷(Glennie et al 2007，MoI Immunol 44:3823-37)。在Rituximab結(jié)合后，分子不內(nèi)在化或者流出(shed from)漿膜，這使得單克隆抗 體保持在細(xì)胞表面以擴(kuò)大免疫攻擊。Rituximab在治療B細(xì)胞淋巴瘤中的作用已經(jīng)迅速顯現(xiàn)，在惰性淋巴瘤中使用 Rituximab組合化療或者單一 Rituximab治療的免疫化療方法目前是通用的標(biāo)準(zhǔn)治療，在 老年(Coiffier et al 2002,N Engl J Med 346 :235_42)和年紀(jì)較小患者(Pfreundschuh et al 2006, Lancet Oncol 7 :379_91)的大多數(shù)一般類型的侵襲性B細(xì)胞淋巴瘤(彌漫 性大B細(xì)胞淋巴瘤)中均改善總體生存力，以及在大多數(shù)常見(jiàn)的惰性淋巴瘤(濾泡型淋巴 瘤)中也如此(Marcus et al 2005,Blood 105 :1417_23)。在選擇的濾泡型淋巴瘤患者中， Rituximab也用作在誘導(dǎo)治療之后的維持治療，在兩年內(nèi)每第三個(gè)月輸注一次，示出改善的 總體生存力(van Oers et al 2006，Blood 108 :3295_301)。近年來(lái)，證實(shí)Rituximab在自身免疫疾病中也是有效的治療方法，其中B細(xì)胞耗竭通常與臨床癥狀改善相關(guān)，例如在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中(Dass et al2006, Expert Opin Pharmacother 7 2559-70)。其中Rituximab具有治療作用的不同自身免疫疾病的列表逐 漸增多(Sanz et al 2007,Front Bioscil2 :2546_67)。對(duì)于未來(lái)的B細(xì)胞靶向和耗竭，重 要的是產(chǎn)生特異性B細(xì)胞亞系的抗體(Domer & Lipsky 2007,Expert Opin Biol Ther 7 1287-99)。 Rituximab抗體是針對(duì)CD20抗原的遺傳工程化的嵌合鼠/人單克隆抗體。 Rituximab是在美國(guó)專利No. 5，736，137中被稱作“C2B8”的抗體。RITUXAN 指定 用于治療復(fù)發(fā)或者難以控制的低度或者濾泡型CD20陽(yáng)性B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤。體 外作用機(jī)制研究已經(jīng)證實(shí)RITUXAN 結(jié)合人補(bǔ)體并且通過(guò)補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性 (CDC)裂解 B 淋巴細(xì)胞系(Reff et al. Blood83 (2) :435_445 (1994))。此外，其在抗 體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)測(cè)定中具有顯著活性。最近揭示了RITUXAN 在氚標(biāo)記 的胸苷摻入測(cè)定中具有抗增殖作用以及直接誘導(dǎo)凋亡，而其它抗CD19和CD20抗體則 否(Maloney et alBlood 88 (10) :637a(1996))。已經(jīng)通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀測(cè)到 RITUXAN 與化療和毒素之間的協(xié)同作用。特別地，RITUXAN 使得藥物抗性人B細(xì)胞淋巴瘤 細(xì)胞系對(duì)于阿霉素、CDDP, VP-16、白喉毒素和蓖麻毒素的細(xì)胞毒性作用敏感(Demidem et al Cancer Chemotherapy&Radiopharmaceuticals 12(3) 177-186(1997))。 體 內(nèi) 臨床前研究表明RITUXAN 耗竭獼猴來(lái)自外周血、淋巴結(jié)和骨髓的B細(xì)胞，可能是 通過(guò)補(bǔ)體和細(xì)胞-介導(dǎo)的過(guò)程實(shí)現(xiàn)(Reff et al.Blood83(2) :435-445(1994))。關(guān) 于CD20抗體的專利和專利出版物包括美國(guó)專利No. 5，776，456、5，736，137、5，843，439、 6，399，061 和 6，682，734 以及美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?US 2002/0197255A1、US 2003/0021781A1、 US 2003/0082172AU US 2003/0095963AU US 2003/0147885A1 (Anderson et al)；美國(guó) 專利 No. 6, 455, 043B1 和 W000/09160(Grillo-Lopez，Α.) ；W000/27428(GriIlo-Lopezand White) ；W000/27433(Grillo-Lopez and Leonard) ；W000/44788(Braslawsky et al)； W001/10462(Rastetter, W) ；W001/10461(Rastetter andffhite) ；W001/10460(White and Grillo-Lopez) ；US2001/0018041A1, US2003/0180292A1, W001/34194(Hanna and Hariharan)；美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?US2002/0006404 和 W002/04021 (Hanna and Hariharan)； 美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)朥S2002/0012665A1和WOO1/74388 (Hanna, N.)；美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?US2002/0058029 Al (Hanna, N.)；美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?US 2003/0103971A1 (Hariharan and Hanna)；美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?US2002/0009444A1 和 WOO1/80884 (GriIlo-Lopez，A)； W001/97858 (White, C)；美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?US2002/0128488A1 和 W002/34790 (Reff, M.)； W002/060955(Braslawsky eta/.) ；W02/096948(Braslawsky et al. ) ；W002/079255(Reff and Davies)；美國(guó)專利 No. 6，171，586B1 和 W098/56418 (Lam et al) ；W098/58964 (Raju, S.) ；W099/22764(Raju, S.) ；W099/51642,美國(guó)專利 No. 6，194，551B1，美國(guó)專利 No. 6,242，195B1，美國(guó)專利 No. 6，528，624B1 和美國(guó)專利 No. 6，538，124 (Idusogie et al)； W000/42072(Presta, L. ) ；W000/67796(Curd et al. ) ；W001/03734(Grillo-Lopez et al.)；美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?US 2002/0004587A1 和 W001/77342 (Miller and Presta)；美國(guó) 專利申請(qǐng)?zhí)?US2002/0197256(Grewal，L)；美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?US 2003/0157108A1 (Presta, L.)；美國(guó)專利 No. 6，565，827B1、6, 090，365B1、6, 287，537B1、6, 015，542、5，843，398 和 5，595，721(Kaminski et al)；美國(guó)專利 No. 5，500，362、5，677，180、5，721，108、6, 120, 767,6, 652, 852B1 (Robinson et al)；美國(guó)專利 No. 6，410，391B1 (Raubitschek et al)；美國(guó)專利 No. 6，224，866Bl 和 W000/20864(Barbera-Guillem，Ε.) ；W001/13945(B arbera-Guillem, Ε.) ；W000/67795 (Goldenberg)；美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?US2003/0133930A1 和 W000/74718(Goldenberg and Hansen) ；W000/76542(Golay et a/·) ；W001/72333(ffolin and Rosenblatt)；美國(guó)專利 No. 6，368，596Bl(Ghetie et al)；美國(guó)專利 No. 6，306，393 和美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)朥S2002/0041847A1，(Goldenberg, D.)；美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?US2003/0026801A1(ffeiner andHartmann) ；W002/102312(Engleman, E.)；美國(guó)專利 申請(qǐng) No.2003/0068664 (Albitar et al) ；W003/002607 (Leung, S.) ；WO 03/049694、 US2002/0009427A1 禾口 US 2003/0185796A1(ffolin et al) ；W003/061694 (Sing and Siegall) ；US2003/0219818A1 (Bohen et al) ；US 2003/0219433A1 和WO 03/068821 (Hansen et a/.) ；US2003/0219818AI (Bohen et al) ；US2002/0136719A1 (Shenoyet al)； W02004/032828 (ffahl et al)，所述專利在此援引加入。也見(jiàn)美國(guó)專利No. 5，849，898和 歐洲專利申請(qǐng) no. 330，191 (Seed et al)；美國(guó)專利 No. 4，861，579 和 EP332, 865A2 (Meyer and Weiss) ；USP 4, 861, 579 (Meyer et al) ；W095/03770 (Bhat et al) ；US 2003/0219433A1 (Hansen et al)所述。RITUXIMAB 的安全性譜(SAFETY PROFILE)Rituximab在治療B細(xì)胞淋巴瘤中的安全性譜已熟知且基于370，000名患者的數(shù) 據(jù)庫(kù)經(jīng)驗(yàn)(Kavanaugh 2006，J Rheumatol Suppl 77:18-23)。在淋巴瘤治療中，在第一次 輸注期間的輕度至中度反應(yīng)是最常見(jiàn)的副作用，主要由于高初始腫瘤負(fù)擔(dān)的患者中細(xì)胞因 子釋放導(dǎo)致(Solal-Celigny 2006,LeukRes 30Suppl 1 :S16_21)。在輸注期間也可以見(jiàn)到 過(guò)敏反應(yīng)，由于Rituximab分子的蛋白質(zhì)性質(zhì)導(dǎo)致。對(duì)于所有B細(xì)胞定向治療的考慮是對(duì)于體液免疫性的預(yù)期作用。通過(guò)長(zhǎng)期治療， 特別是維持治療，即在兩年的時(shí)間內(nèi)(在可能每三周輸注6-8次Rituximab的誘導(dǎo)治療之 后)每三個(gè)月輸注一次，更顯著耗竭B細(xì)胞，大多數(shù)患者呈現(xiàn)出低丙種球蛋白血癥。然而， 低水平的免疫球蛋白和B細(xì)胞耗竭似乎對(duì)感染的臨床危險(xiǎn)無(wú)主要影響。使用Rituximab的一種潛在的嚴(yán)重副作用是發(fā)生間質(zhì)性肺病。這是潛在的危及生 命的并發(fā)癥，但是在文獻(xiàn)中僅報(bào)道16例，非常罕見(jiàn)(Wagner et al2007,Am J Hematol 82: 916-9)。關(guān)于Rituximab在慢性自身免疫疾病治療中的安全問(wèn)題在臨床研究中被研究 (Edwards et al 2006,Best Pract Res Clin Rheumatol 20 :915_28)，目前跟蹤時(shí)間較短。 因此長(zhǎng)期安全性待闡明，特別是當(dāng)每年給予一或兩次Rituximab持續(xù)多年的情況。對(duì)于自 身免疫疾病患者通常輸注Rituximab兩次(間隔幾周)，6_12個(gè)月后可重復(fù)進(jìn)行，即明顯低 于在淋巴瘤患者中的劑量(短期)。目前能耗竭B細(xì)胞的下一代抗CD20抗體被用于臨床實(shí)驗(yàn)中，推測(cè)在幾年內(nèi)將用 于臨床實(shí)踐中。例如，目前Glaxo-Smith-Kline的完全人源化抗⑶20抗體Ofatumomab在 進(jìn)行B細(xì)胞淋巴瘤復(fù)發(fā)臨床實(shí)驗(yàn)。推測(cè)下一代的完全人源化抗CD-20抗體導(dǎo)致更有效的B 細(xì)胞耗竭，因此在治療B細(xì)胞淋巴瘤中應(yīng)比Rituximab更有效。此外，推測(cè)其將顯示低于 Rituximab 白勺胃(site effects)。已經(jīng)提出治療慢性疲勞綜合征的各種方案。例如在US 2007/025375中提供了一
8種復(fù)合治療方案用于治療患有慢性疲勞綜合征的患者。所述方案包括給予milna Cipran0鑒于CFS/ME的未知病因?qū)W，仍然需要可用于有效治療CFS的化合物。發(fā)明概述本發(fā)明旨在提供可用于治療慢性疲勞綜合征的新化合物。特別地，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn) B細(xì)胞耗竭劑如抗-CD20抗體可用于治療慢性疲勞綜合征。優(yōu)選地，所述抗-CD20抗體或者其結(jié)合CD-20的抗體片段是單克隆抗體。特別優(yōu) 選地，當(dāng)給予人對(duì)象時(shí)，所述單克隆抗體是人源化抗體。本發(fā)明還涵蓋所述抗體以抗體片段 存在，所述片段例如可以通過(guò)遺傳工程重組產(chǎn)生。另一方面，本發(fā)明涉及治療慢性疲勞綜合征/肌痛性腦脊髓炎的方法，所述方 法包括給予患有所述疾病或失調(diào)的對(duì)象治療有效量的B細(xì)胞耗竭劑例如耗竭B細(xì)胞的 抗-⑶20抗體或者結(jié)合⑶20的抗體片段。附圖簡(jiǎn)述

圖1示出在不同干預(yù)下三個(gè)患者在一年時(shí)期內(nèi)CFS癥狀的發(fā)展，所述干預(yù)即 Rituximab 或者M(jìn)ethotrexat (M)。CFS癥狀的癥狀得分在0_10范圍內(nèi)，其中0是指無(wú)癥 狀，而10是指非常嚴(yán)重的CFS癥狀。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及治療慢性疲勞綜合征/肌痛性腦脊髓炎的B細(xì)胞耗竭劑或耗竭B細(xì)胞 的生物學(xué)實(shí)體，如抗-CD20抗體或者其結(jié)合CD20的抗體片段或者化學(xué)實(shí)體，如具有耗竭B 細(xì)胞活性的小分子。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“慢性疲勞綜合征(CFS) ”與“肌痛性腦脊髓炎(ME)，，同義使用。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“B細(xì)胞耗竭”或者“B細(xì)胞耗竭活性”是指實(shí)體如化學(xué)或者生物 學(xué)實(shí)體如抗體降低對(duì)象循環(huán)B細(xì)胞水平的能力。B細(xì)胞耗竭可以通過(guò)例如誘導(dǎo)細(xì)胞死亡或 者降低增殖而實(shí)現(xiàn)?！阿?0”抗原或者“⑶20”是在人外周血或者淋巴器官的90%以上的B細(xì)胞表面上 發(fā)現(xiàn)的大約35-kDa的非糖基化磷蛋白。⑶20存在于正常B細(xì)胞以及惡性B細(xì)胞上，但是在 干細(xì)胞上不表達(dá)。文獻(xiàn)中⑶20的其它名稱包括“B-淋巴細(xì)胞限制抗原”和“Bp35”。例如， CD20 抗原在 Clark et al. Proc. Natl. Acad. Sd. (USA) 82 1766 (1985)中描述。術(shù)語(yǔ) CD20 包 括除人之外其它物種的等價(jià)分子。近年來(lái)已經(jīng)報(bào)道了⑶20在T細(xì)胞和NK細(xì)胞亞系上的低 水平表達(dá)?！癇細(xì)胞”是在骨髓內(nèi)成熟的淋巴細(xì)胞，包括幼稚B細(xì)胞、記憶B細(xì)胞或者效應(yīng)B細(xì) 胞(漿細(xì)胞)。廣義而言，本發(fā)明不僅涉及抗體或者其片段在治療CFS中的應(yīng)用，而且還涉及一 般具有B細(xì)胞耗竭活性的CD20分子的拮抗劑在治療CFS中的應(yīng)用。在本文可互換使用的“拮抗劑”或者“B細(xì)胞耗竭劑”是這樣的分子，當(dāng)其結(jié)合B細(xì) 胞表面標(biāo)記如B細(xì)胞上的CD20時(shí)破壞或者耗竭哺乳動(dòng)物中的B細(xì)胞和/或干擾一或多種 B細(xì)胞功能，例如通過(guò)降低或者阻止由B細(xì)胞激發(fā)的體液應(yīng)答進(jìn)行。本發(fā)明的拮抗劑或者B 細(xì)胞耗竭劑能耗竭用其治療的哺乳動(dòng)物中的B細(xì)胞(即降低循環(huán)B細(xì)胞水平)。這種耗竭 可以通過(guò)各種機(jī)制實(shí)現(xiàn)，如抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)和/或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞 毒性(CDC)、抑制B細(xì)胞增殖和/或誘導(dǎo)B細(xì)胞死亡(例如通過(guò)凋亡)。本發(fā)明范圍內(nèi)的拮
9抗劑包括結(jié)合B細(xì)胞表面標(biāo)記的抗體，合成或者天然序列肽以及小分子拮抗劑，任選與細(xì) 胞毒性劑綴合或者融合。優(yōu)選的拮抗劑是CD20抗體或者結(jié)合CD20的抗體片段。此外，優(yōu) 選小分子拮抗劑，如已知的B細(xì)胞耗竭劑Methotrexat。目前除了 B細(xì)胞之外其它細(xì)胞表達(dá)⑶20抗原如T細(xì)胞和NK細(xì)胞亞系，這些細(xì)胞 也被通過(guò)CD20起作用的B細(xì)胞耗竭劑耗竭?！罢T導(dǎo)凋亡”的拮抗劑是誘導(dǎo)例如B細(xì)胞程序化細(xì)胞死亡的那些物質(zhì)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)凋 亡測(cè)定確定，如armexin V的結(jié)合、DNA片段化、細(xì)胞皺縮、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹、細(xì)胞破碎，和/或膜 小泡形成(稱作凋亡體)。術(shù)語(yǔ)“抗體”在本文以其廣義使用，特別包括單克隆抗體、多克隆抗體、至少兩個(gè)完 整抗體形成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)以及抗體片段，只要其呈現(xiàn)所需的生物 學(xué)活性即可。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可用于治療CFS的抗體是耗竭B細(xì)胞的結(jié)合CD20的抗體片 段?！敖Y(jié)合⑶20的抗體片段”包含完整抗體的一部分，其包含完整抗體的抗原結(jié)合區(qū) 域。舉例的抗體片段包括Fab、Fab'、F(ab' ) 2和Fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體 分子；以及由抗體片段形成的多特異性抗體。對(duì)于本發(fā)明的目的，“完整抗體”是包含重鏈 和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域以及Fc區(qū)域的抗體?！疤烊豢贵w”通常是大約150，000道爾頓的異源四聚體糖蛋白，由兩個(gè)相同的輕 (L)鏈和兩個(gè)相同的重(H)鏈組成。每個(gè)輕鏈通過(guò)一個(gè)共價(jià)二硫鍵與重鏈連接，而二硫鍵 的數(shù)目在不同的免疫球蛋白同種型的重鏈之中有所不同。每個(gè)重鏈和輕鏈也可以具有規(guī)則 間隔的鏈內(nèi)二硫鍵。每個(gè)重鏈在一個(gè)末端具有可變結(jié)構(gòu)域(VII)，隨后是多個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域。 每個(gè)輕鏈在一個(gè)末端具有可變結(jié)構(gòu)域(VI)，在其另一末端具有恒定結(jié)構(gòu)域；輕鏈的恒定結(jié) 構(gòu)域與重鏈的第一個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域排列在一起，輕鏈可變結(jié)構(gòu)域與重鏈的可變結(jié)構(gòu)域排列在 一起。據(jù)信特定的氨基酸殘基形成輕鏈與重鏈可變結(jié)構(gòu)域之間的界面。術(shù)語(yǔ)“可變”是指在抗體序列中可變結(jié)構(gòu)域的某些部分十分不同，用于每個(gè)特定抗 體與其特定抗原的結(jié)合和特異性。然而，可變性不是均勻分布于抗體的可變結(jié)構(gòu)域中。其 集中于在輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的稱作高變區(qū)的三個(gè)節(jié)段?？勺兘Y(jié)構(gòu)域的更高度保守的 部分被稱作構(gòu)架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域均包含四個(gè)FR，主要采用β-折疊 構(gòu)型，通過(guò)三個(gè)高變區(qū)連接，形成環(huán)連接的β-折疊結(jié)構(gòu)及在一些情況中形成部分β-折疊 結(jié)構(gòu)。每個(gè)鏈中的高變區(qū)通過(guò)FR與其它鏈的高變區(qū)緊密連接在一起，使得抗體的抗原結(jié) 合位點(diǎn)形成(JAL Kabat et ah, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes ofHealth,Bethesda, MD. (1991))。 ’g 定結(jié)構(gòu)域不直接參與抗體與抗原結(jié)合，但呈現(xiàn)出各種效應(yīng)物功能，如在抗體依賴性細(xì)胞毒 性(ADCC)中抗體的參與?！癋v”是最小抗體片段，其含有完整的抗原識(shí)別和抗原結(jié)合位點(diǎn)。這個(gè)區(qū)域由緊密 非共價(jià)連接的一個(gè)重鏈和一個(gè)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的二聚體組成。在這個(gè)構(gòu)型中，每個(gè)可變結(jié) 構(gòu)域的三個(gè)高變區(qū)相互作用，限定VH-VL 二聚體表面上抗原結(jié)合位點(diǎn)。六個(gè)高變區(qū)共同賦 予抗體的抗原結(jié)合特異性。然而，即使一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域(或者包含僅三個(gè)特異于抗原的高 變區(qū)的Fv的一半)也具有識(shí)別和結(jié)合抗原的能力，但是比全部結(jié)合位點(diǎn)的親和性低。Fab片段也含有輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域以及重鏈的第一個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域(CHl)。Fab’片段與Fab片 段不同，在重鏈CHl結(jié)構(gòu)域的羧基末端添加幾個(gè)殘基，包括來(lái)自抗體鉸鏈區(qū)的一或多個(gè)半 胱氨酸。Fab' -SH在本文是Fab’的名稱，其中恒定結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸殘基具有至少一個(gè) 游離硫醇基團(tuán)。F(ab' ) 2抗體片段最初作為成對(duì)的Fab’片段產(chǎn)生，在其之間具有鉸鏈半 胱氨酸。也已知抗體片段的其它化學(xué)偶聯(lián)。基于其恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，任何脊椎動(dòng) 物物種的抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”均可以被指定為兩個(gè)明顯不同的類型之一，稱作 kappa(K)和lambdaU)。根據(jù)其重鏈恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，抗體可以被指定為不同 類別。有五個(gè)主要類別的完整抗體IgA5、IgD、IgE、IgG和IgM，以及一些類別可進(jìn)一步分 成亞類(同種型)，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。相應(yīng)于不同類別抗體的重鏈 恒定結(jié)構(gòu)域分別被稱作α、δ、e、Y和μ。本領(lǐng)域熟知不同類別免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和 三維構(gòu)型?！皢捂淔v”或者“scFv”抗體片段包含抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域 存在于一個(gè)多肽鏈中。優(yōu)選地，F(xiàn)v多肽進(jìn)一步包含VH與VL結(jié)構(gòu)域之間的多肽接頭，其使得 scFv形成為抗原結(jié)合所需的結(jié)構(gòu)。關(guān)于scFv的綜述見(jiàn)Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. ,Springer-Verlag,New York, pp.269-315(1994)。術(shù)語(yǔ)“雙抗體”是指具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的小抗體片段，該片段包含在同一多肽 鏈(VH-Vl)中與輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(Vl)連接的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VII)。通過(guò)使用接頭(所述 接頭很小，不能使在同一鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間配對(duì))，使所述結(jié)構(gòu)域與另一鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu) 域配對(duì)，產(chǎn)生兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。雙抗體在例如EP 404097,WO 93/11161和Hollinger et al, Proc. Natl. Acad. Sd. USA, 90 :6444_6448 (1993)中更充分描述。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”是指得自一群基本同質(zhì)抗體的抗體，即該群包含 的各個(gè)抗體是相同的和/或結(jié)合相同表位，除了在單克隆抗體產(chǎn)生期間可以產(chǎn)生的可能變 體，如通常以少量存在的變體。與典型包括針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆 抗體制品相反，每個(gè)單克隆抗體針對(duì)抗原上單一決定簇。除了其特異性之外，單克隆抗體的 優(yōu)勢(shì)是其不被其它免疫球蛋白污染。修飾語(yǔ)“單克隆”表示抗體的特性，其得自基本同質(zhì)的 抗體群，且不需要通過(guò)任何特定方法產(chǎn)生抗體。例如，本發(fā)明使用的單克隆抗體可以通過(guò) 首先由Kohler et al, Nature, 256 =495(1975)描述的雜交瘤方法產(chǎn)生，或者可以通過(guò)重組 DNA方法產(chǎn)生(見(jiàn)例如美國(guó)專利No. 4，816，567所述)?！皢慰寺】贵w”也可以分離自噬菌 體抗體文庫(kù)，例如使用 Clackson etal,Nature, 352 624-628 (1991)和 Marks et al,J. MoI Biol,222 581-597(1991)所述技術(shù)分離。在本文中，單克隆抗體特別包括“嵌合”抗體(免 疫球蛋白)，其中一部分重鏈和/或輕鏈與衍生自特定物種或者屬于特定抗體類別或者亞 類的抗體中相應(yīng)序列相同或同源，而剩余的鏈與衍生自另一物種或者屬于另一抗體類別或 者亞類的抗體中相應(yīng)序列相同或者同源，以及包括這種抗體的片段，只要其呈現(xiàn)出希望的 生物學(xué)活性即可(美國(guó)專利 No. 4，816，567 ；Morrison et al,Proc. Natl. Acad. Sd. USA,81 6851-6855(1984))。感興趣的嵌合抗體包括“靈長(zhǎng)類動(dòng)物源化(primatized) ”抗體，其包 含衍生自非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物(例如舊大陸猴，如狒狒、恒河猴或者獼猴)的可變結(jié)構(gòu)域抗原 結(jié)合序列以及人恒定區(qū)序列(美國(guó)專利No. 5，693，780)?！叭嗽椿毙问降姆侨?例如鼠) 抗體是嵌合抗體，其含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列。大部分人源化抗體是人免疫 球蛋白(受體抗體)，其中來(lái)自受體的高變區(qū)的殘基由來(lái)自非人物種(供體抗體)如小鼠、
11大鼠、兔或者非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的高變區(qū)的具有希望的特異性、親和性和能力的殘基置換。在 一些情況中，人免疫球蛋白的構(gòu)架區(qū)(FR)殘基由相應(yīng)非人殘基置換。此外，人源化抗體可 包含在受體抗體或者供體抗體中未發(fā)現(xiàn)的殘基。進(jìn)行這些修飾以進(jìn)一步優(yōu)化抗體性能。通 常，人源化抗體包含基本上所有的至少一個(gè)、典型兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，其中所有或者基本上所 有高變環(huán)相應(yīng)于非人免疫球蛋白的那些，以及所有或者基本上所有FR均是人免疫球蛋白 序列的那些，除了上述FR取代之外。人源化抗體任選也包含至少一部分免疫球蛋白典型人 免疫球蛋白的恒定區(qū)。進(jìn)一步的詳細(xì)描述見(jiàn)Jones et al，Nature 321:522-525(1986); Riechmannet al, Nature 332:323—329(1988);禾口 Presta，Curr. Op. Struct. Biol. 2 593-596(1992)所述。本文所用術(shù)語(yǔ)“高變區(qū)”是指負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的抗體的氨基酸殘基。所 述高變區(qū)包含來(lái)自“互補(bǔ)決定區(qū)”或者“CDR”的氨基酸殘基(例如輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的殘 基 24-34 (Li)、50-56 (L2)和 89-97 (L3)以及重鏈可變結(jié)構(gòu)域中殘基 31-35 (Hl)、50-65 (H2) 禾口 95-102(H3) ；Kabat et al, Sequencesof Proteins of Immunological Interest,5th Ed. Public Health Service, NationalInstitutes ofHealth, Bethesda, MD. (1991))禾口 /或來(lái)自“高變環(huán)”的那些殘基(例如輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中殘基26-32(Ll)、50-52(L2)和 91-96 (L3)以及重鏈可變結(jié)構(gòu)域中殘基 26-32(Η1)、53-55(H2)和 96_101(H3) ； Chothia and Lesk J. MoI. Biol. 196 :901_917 (1987))。“構(gòu)架”或者 “FR” 殘基是除了本文所述高 變區(qū)殘基之外的那些可變結(jié)構(gòu)域殘基。“裸抗體”(在本文定義)是未與異源分子如細(xì) 胞毒性部分或者放射性標(biāo)記綴合的抗體。舉例的結(jié)合CD20抗原的抗體包括C2B8，其目 前被稱作Rituximab (RITUXAN )(美國(guó)專利No. 5，736，137，在此援引加入本文)； 釔-[90]-標(biāo)記的 2B8 鼠抗體，稱作 Y2B8 或 “ IbritumomabTiuxetan” ZEVALIN (美國(guó) 專利No. 5，736，137，在此援引加入本文)；鼠IgG2a “Bi”，也稱作“Tositumomab”，任選用 131I 標(biāo)記以產(chǎn)生“131I-B1” 抗體(碘 1131 tositumomab, BEXXAR )(美國(guó)專利 No. 5，595，721， 在此援引加入本文)；鼠單克隆抗體“1F5”(Press et al. Blood 69(2) :584_591 (1987)及 其包括 “framework patched” 或者人源化 1F5 的變體(W003/002607，Leung, S. ；ATCC 保 藏HB-96450)；鼠2H7和嵌合2H7抗體(美國(guó)專利No. 5，677，180，在此援引加入本文)； 人源化2H7 ；Ofatumumab,針對(duì)CD20huMax_CD20上新表位的完全人源化的IgGl (Genmab， Denmark ；W02004/035607) ；AME-133 (Applied Molecular Evolution) ；A20 抗體或者其變 體如嵌合或者人源化A20抗體(分別為cA20和hA20) (US 2003/0219433, lmmunomedics)； 以及可得自 International Leukocyte Typing Workshop (Valentine et ah, In :Leukocyte Typing 111 (McMichae 1, Ed. , p. 440, Oxford University Press (1987))的單克隆抗體 L27、 G28-2、93_1B3、B-Cl或者NU-B2。此外，合適的抗體是例如Ocrelizumab，這是得自Biogen Idec/Genentech/Roche的完全人源化抗-CD20抗體；抗體GAlOl，這是得自Biogen Idec/ Genentech/Roche的第三代人源化抗-⑶20-抗體。此外，合適的抗體可以是得自Biolex Therapeutics的具有優(yōu)化糖基化的BLX-301人源化抗CD20或者均是人源化抗-CD20抗體 的 自 lmmunomedics ^ Veltuzumab (hA20)自 Inexus Biotechnology 的 DXL625。此外，推測(cè)其它B細(xì)胞耗竭劑、特別是抗⑶22抗體如Epratuzumab或者抗⑶19人 源化抗體如MDX-1342可用于治療CFS。在本文術(shù)語(yǔ)“rituximab”或者“RITUXAN ”或者“mabthera”是指針對(duì)CD20抗 原的遺傳工程化的嵌合鼠/人單克隆抗體，在美國(guó)專利No. 5，736，137 (援引加入本文)中
12稱作“C2B8”，包括其保留結(jié)合CD20能力的片段。純粹為了本發(fā)明之目的及除非特別指出， “人源化2H7”是指結(jié)合人CD20的人源化抗體，或者其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體在體內(nèi) 有效地耗竭靈長(zhǎng)類動(dòng)物B細(xì)胞。B細(xì)胞耗竭劑或者拮抗劑、特別是抗CD20抗體或者其結(jié)合CD20的抗體片段的“有 效量”是指有效治療CFS的B細(xì)胞耗竭劑或者拮抗劑的量。例如，治療慢性疲勞綜合征/肌 痛性腦脊髓炎的抗-CD20抗體的施用量在10mg-5000mg每劑范圍內(nèi)。例如，所述劑量可以 在100-1000mg/m2范圍內(nèi)，特別是Rituximab的一次輸注為500mg/m2。典型地，氨甲蝶呤的 劑量在5mg-30mg每周的范圍內(nèi)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述B細(xì)胞耗竭劑是化學(xué)實(shí)體，例如小分子。本領(lǐng)域已 知許多B細(xì)胞耗竭劑，例如已知的B細(xì)胞耗竭劑是BAFF-拮抗劑。此外，已知的B細(xì)胞耗竭 劑包括BR3的拮抗劑、α -4-整聯(lián)蛋白的激動(dòng)劑等。例如，氨甲蝶呤是顯示B細(xì)胞耗竭活性 的葉酸類似物。其它可用的B細(xì)胞耗竭劑是針對(duì)CD20的小模塊免疫藥物(SMIP)。例如，具 有 B 細(xì)胞耗竭劑作用的 SMIP 是 Trubion Pharmaceuticals 的 TRU-015 或者 SBI-087。SMIP 也可以是具有強(qiáng)B細(xì)胞耗竭活性的比抗體小的單鏈多肽。 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，代表B細(xì)胞耗竭劑的生物學(xué)實(shí)體的抗CD20抗體與代表B細(xì) 胞耗竭劑的化學(xué)實(shí)體的氨甲蝶呤的組合用于治療慢性疲勞綜合征或者肌痛性腦脊髓炎。可 以同時(shí)、單獨(dú)或者相繼施用這些實(shí)體。例如，在第一個(gè)方案中，給對(duì)象施用所述抗體或者氨 甲蝶呤；在第二個(gè)方案中，給對(duì)象施用其它制劑。包含B細(xì)胞耗竭劑、拮抗劑、特別是抗⑶20抗體或者其結(jié)合⑶20的抗體片段的組 合物，可以以符合良好醫(yī)學(xué)實(shí)踐的形式配制、確定劑量和施用。在這方面需要考慮的因素包 括待治療的特定疾病或者失調(diào)的階段、待治療的特定哺乳動(dòng)物、各個(gè)對(duì)象的臨床狀況、輸送 所述藥劑的部位、施用方法、施用時(shí)間安排以及為醫(yī)學(xué)從業(yè)人員已知的其它因素。根據(jù)這 些需考慮的因素決定施用的B細(xì)胞耗竭劑如抗體或者抗體片段的有效量。一般而言，經(jīng)胃 腸外施用的每劑拮抗劑的有效量在大約20mg/m2-10，000mg/m2對(duì)象機(jī)體的范圍內(nèi)，給予一 或多劑。舉例的完整抗體給藥方案包括375mg/m2每周X 4 ； IOOOmgX 2 (例如在第1和15 天)；或者lgX3。以所述抗體的單個(gè)治療有效劑量給對(duì)象施用的抗體為50-2000mg/m2或 者施用多個(gè)所述抗體或者其結(jié)合CD20的抗體片段的治療有效劑量50-2000mg/m2。然而， 如上所述，這些建議的抗體量要進(jìn)行大量治療性判斷。選擇合適劑量和時(shí)間安排的關(guān)鍵因 素是獲得的結(jié)果，如上所述。B細(xì)胞耗竭劑拮抗劑如抗體通過(guò)任何合適方式施用，包括胃腸 外、局部、皮下、腹膜內(nèi)、肺內(nèi)、鼻內(nèi)和/或病灶內(nèi)(intralesional)施用。胃腸外輸注包括 肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或者皮下施用。本發(fā)明也涵蓋鞘內(nèi)施用。此外，B細(xì)胞耗竭劑 拮抗劑如抗體可適當(dāng)?shù)赝ㄟ^(guò)脈沖輸注施用，例如使用漸減劑量的拮抗劑。優(yōu)選通過(guò)靜脈內(nèi) 注射給予。本文描述了產(chǎn)生這種耗竭B細(xì)胞的拮抗劑的方法。用于產(chǎn)生或者篩選拮抗劑的抗 原可以是例如含有希望表位的可溶形式的CD20或者其一部分?；蛘呋蛄硗猓谄浼?xì)胞表面 表達(dá)CD20的細(xì)胞可用于產(chǎn)生或者篩選拮抗劑?？捎糜诋a(chǎn)生拮抗劑的其它形式的CD20對(duì)于 本領(lǐng)域技術(shù)人員是明顯的。雖然優(yōu)選的拮抗劑是抗體，但是本發(fā)明也涵蓋除抗體之外的拮抗劑。例如，拮抗劑 可包含小分子拮抗劑?？梢葬槍?duì)CD20篩選小分子文庫(kù)以鑒別結(jié)合抗原的小分子?；蛘?，可以通過(guò)已知技術(shù)基于其B細(xì)胞耗竭活性篩選小分子?？梢愿鶕?jù)其拮抗性質(zhì)進(jìn)一步篩選所述 小分子。拮抗劑也可以是通過(guò)合理設(shè)計(jì)或者通過(guò)噬菌體展示產(chǎn)生的肽(見(jiàn)例如1998年8 月13日公開(kāi)的W098/35036所述)。在一個(gè)實(shí)施方案中，選擇的分子可以是基于抗體CDR設(shè) 計(jì)的“CDR模擬物”或者抗體類似物。雖然這種肽可以是自身拮抗的，但是可任選將所述肽 與細(xì)胞毒性劑融合以添加或者增強(qiáng)所述肽的拮抗性質(zhì)。下文描述了生產(chǎn)本發(fā)明使用的抗體 拮抗劑的示例技術(shù)。(i)多克隆抗體多克隆抗體優(yōu)選在動(dòng)物中通過(guò)多次皮下(sc)或者腹膜內(nèi)(ip)注射相關(guān)抗原和佐 劑而產(chǎn)生?？梢允褂秒p功能或者衍生化物質(zhì)使相關(guān)抗原與被免疫的物種中免疫原性蛋白質(zhì) 如匙孔血藍(lán)蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或者大豆胰蛋白酶抑制劑綴合，所述雙功能 或者衍生化物質(zhì)例如是馬來(lái)酰亞胺芐磺基琥珀酰亞胺酯(通過(guò)半胱氨酸殘基綴合)、N-羥 基琥珀酰亞胺(通過(guò)賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酐、S0C12或者RlN = C = NR，其中R和Rl 是不同的烷基基團(tuán)。通過(guò)組合例如IOOyg或者5yg蛋白質(zhì)或者綴合物(分別針對(duì)兔或者小鼠)與 3體積的弗氏完全佐劑并且在多個(gè)部位皮內(nèi)注射所述溶液，針對(duì)所述抗原、免疫綴合物 或者衍生物對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫接種。一個(gè)月后，通過(guò)在多個(gè)部位皮下注射在完全佐劑中的 1/5-1/10原始量的肽或者綴合物對(duì)動(dòng)物進(jìn)行加強(qiáng)免疫。7-14天之后，取該動(dòng)物血樣，測(cè)定 血清抗體效價(jià)。對(duì)動(dòng)物進(jìn)行加強(qiáng)免疫直至效價(jià)平穩(wěn)期。優(yōu)選地，使用與不同蛋白質(zhì)和/或 通過(guò)不同交聯(lián)劑綴合的相同抗原的綴合物對(duì)動(dòng)物進(jìn)行加強(qiáng)免疫。綴合物也可以在重組細(xì)胞 培養(yǎng)物中作為蛋白質(zhì)融合體產(chǎn)生。也可以適當(dāng)?shù)厥褂镁奂瘎┤缑鞯\以增強(qiáng)免疫應(yīng)答。(ii)單克隆抗體單克隆抗體得自一群基本同質(zhì)的抗體，即除了在單克隆抗體產(chǎn)生期間產(chǎn)生的可能 變體之外，該群的各個(gè)抗體是相同的和/或結(jié)合相同表位，這種變體通常以少量存在。因 此，修飾語(yǔ)“單克隆”是指抗體的特性，其不是分立的或者多克隆抗體的混合物。例如，單克 隆抗體可以通過(guò)使用最初由Kohler et al，Nature，256 :495 (1975)描述的雜交瘤方法產(chǎn) 生，或者通過(guò)重組DNA方法(美國(guó)專利No. 4，816，567)產(chǎn)生。使用常規(guī)方法可易于分離和測(cè)序編碼單克隆抗體的DNA(例如通過(guò)使用能特異性 結(jié)合編碼鼠抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)。雜交瘤細(xì)胞作為這種DNA的優(yōu)選 來(lái)源。分離后，可以將DNA置于表達(dá)載體中，然后將其轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞如不另外產(chǎn)生免疫球 蛋白的大腸桿菌(E. coli)細(xì)胞、猿COS細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或者骨髓瘤細(xì)胞以 在該重組宿主細(xì)胞中合成單克隆抗體。對(duì)于編碼抗體的DNA在細(xì)菌中的重組表達(dá)的綜述 文章包括 Skerra et ah, Curr. Opinion in Immunol.，5 :256_262 (1993)禾口 Pluckthun， Immunol. Revs. , 130 151-188 (1992)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體或者抗體片段可以分離 自使用在McCafferty et ah, Nature, 348 =552-554(1990)中描述的技術(shù)產(chǎn)生的抗體噬菌 體文庫(kù)。Clackson et al, Nature, 352 624-628 (1991)禾 P Marks et al, J. MoI. Biol., 222:581-597(1991)分別描述了使用噬菌體文庫(kù)分離鼠和人抗體。隨后的出版物描述了通 過(guò)鏈改組(chain shuffling)方法產(chǎn)生高親和性(nM范圍)人抗體(Marks et ah, Bio/ Technology, 10 :779_783 (1992))，以及作為構(gòu)建非常大的噬菌體文庫(kù)的策略的組合感染 和體內(nèi)重組(Waterhouseet al, Nuc. Acids. Res. ,21 :2265_2266 (1993))。因此，可以選擇
14這些技術(shù)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的單克隆抗體雜交瘤技術(shù)以分離單克隆抗體。DNA也可以被修飾，例如 通過(guò)用人重鏈和輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域的編碼序列代替同源鼠序列(美國(guó)專利No. 4，816，567 ； Morrison, et ah, Proc. Natl Acad. ScL USA，81 :6851 (1984))，或者通過(guò)將非免疫球蛋白多 肽編碼序列的全部或部分與免疫球蛋白編碼序列共價(jià)結(jié)合。典型地，這種非免疫球蛋白多 肽由抗體的恒定結(jié)構(gòu)域取代，或者由抗體的一個(gè)抗原組合位點(diǎn)的可變結(jié)構(gòu)域取代，產(chǎn)生嵌 合二價(jià)抗體，其包含對(duì)于抗原具有特異性的一個(gè)抗原組合位點(diǎn)以及對(duì)于不同抗原具有特異 性的另一個(gè)抗原組合位點(diǎn)。(iii)人源化抗體本領(lǐng)域已經(jīng)描述了人源化非人抗體的方法。優(yōu)選地，人源化抗體具有導(dǎo)入其中的 來(lái)自非人來(lái)源的一或多個(gè)氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基通常稱作“輸入(import)”殘 基，其典型來(lái)自“輸入”可變結(jié)構(gòu)域。人源化可以基本根據(jù)Winter及其同事(Jones et al, Nature, 321 :522_525 (1986)、Riechmann et al, Nature, 332 :323_327 (1988)、Verhoeyen et al.，Science, 239 =1534-1536 (1988))所述方法進(jìn)行，用高變區(qū)序列取代人抗體的相應(yīng) 序列。因此，這種“人源化”抗體是嵌合抗體(美國(guó)專利No. 4，816，567)，其中完整人可變 結(jié)構(gòu)域的很少一部分由非人物種的相應(yīng)序列取代，實(shí)踐中，人源化抗體典型是人抗體，其中 一些高變區(qū)殘基以及可能一些FR殘基由嚙齒動(dòng)物抗體中類似位點(diǎn)的殘基取代。用于產(chǎn) 生人源化抗體的人可變結(jié)構(gòu)域輕鏈和重鏈的選擇對(duì)于降低抗原性非常重要。根據(jù)所謂的 “best-fit”方法，針對(duì)已知人可變結(jié)構(gòu)域序列的完整文庫(kù)篩選嚙齒動(dòng)物抗體的可變結(jié)構(gòu)域 序列。然后將與嚙齒動(dòng)物最密切的人序列作為人源化抗體的人構(gòu)架區(qū)(FR) (Sims etal, J. Immunol，151 :2296 (1993) ；Chothia et al, J. MoI. Biol, 196 901 (1987)) 另一方法使 用衍生自輕鏈或重鏈可變區(qū)的特定亞群的所有人抗體的共有序列的特定構(gòu)架區(qū)。相同構(gòu)架 可用于一些不同的人源化抗體(Carter et al,Proc. Natl Acad. ScL USA,89 4285(1992)； Presta et al，J. Immunol, 151 :2623 (1993))。重要的是被人源化的抗體保持對(duì)于抗原的高 親和性及其它有利的生物學(xué)性質(zhì)。為了實(shí)現(xiàn)這個(gè)目標(biāo)，根據(jù)優(yōu)選的方法，通過(guò)使用親代和人 源化序列的三維模型分析親代序列及各種概念上的人源化產(chǎn)物的方法制備人源化抗體?？?通常利用三維免疫球蛋白模型，該模型為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知?？梢岳糜?jì)算機(jī)程序，其 示出并展示選擇的候選免疫球蛋白序列的可能的三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)。測(cè)試這些表現(xiàn)使得可以分 析所述殘基在候選免疫球蛋白序列發(fā)揮功能中的可能作用，即分析影響候選免疫球蛋白結(jié) 合其抗原的能力的殘基。以這種方法，可以選擇和組合來(lái)自受體的FR殘基和輸入序列，由 此獲得希望的抗體特性，如增加的與靶抗原的親和性。一般高變區(qū)殘基直接且最主要參與 影響抗原結(jié)合。(iv)人抗體代替人源化，可以產(chǎn)生人抗體。例如，可以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如小鼠)，其在免 疫基礎(chǔ)上能產(chǎn)生人抗體的所有組成部分，不存在內(nèi)源免疫球蛋白產(chǎn)生。例如，已經(jīng)描述了在 嵌合和種系(germ-line)突變小鼠中抗體重鏈結(jié)合區(qū)(Jll)基因的純合缺失導(dǎo)致完全抑 制內(nèi)源抗體產(chǎn)生。這種種系突變小鼠中人種系免疫球蛋白基因陣列的轉(zhuǎn)移導(dǎo)致在抗原攻 擊時(shí)產(chǎn)生人抗體。見(jiàn)例如 Jakobovits et al, Proc. Natl. Acad. ScL USA,90 2551 (1993)； Jakobovits et al, Nature, 362 :255_258(1993) ；Bruggermann et al, Year in Immuno., 7 33(1993)；和美國(guó)專利 Nos. 5，591，669,5, 589，369 和 5，545，807 所述?；蛘撸删w展
15示技術(shù)(McCafferty et al, Nature 348 :552_553 (1990))可用于在體外從未免疫的供體 的免疫球蛋白可變(V)結(jié)構(gòu)域基因所有組成部分中產(chǎn)生人抗體和抗體片段。根據(jù)這種技 術(shù)，將抗體V結(jié)構(gòu)域符合讀框地克隆進(jìn)絲狀噬菌體如M13或者fd的主要或者次要外殼蛋 白基因中，并且在噬菌體顆粒表面上展示為功能性抗體片段。由于絲狀顆粒含有噬菌體基 因組的單鏈DNA拷貝，基于抗體的功能性質(zhì)加以選擇也導(dǎo)致可以選擇編碼呈現(xiàn)這些性質(zhì)的 抗體的基因。因此，所述噬菌體模擬B細(xì)胞的一些性質(zhì)。噬菌體展示可以各種形式進(jìn)行， 綜述見(jiàn)例如 Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J. , Current Opinion inStructural Biology 3 =564-571 (1993)所述。V基因節(jié)段的一些來(lái)源可用于噬菌體展示。Clackson et al，Nature，352 624-628 (1991)從衍生自免疫的小鼠脾的V基因的小的隨機(jī)組合文庫(kù)中分 離不同的抗噁唑酮抗體陣列。基本根據(jù)Marks et al.，J. MoI. Biol. 222 :581_597 (1991)或 者Griffith et al，EMB0J. 12 :725-734(1993)所述技術(shù)可以從未免疫的人供體中構(gòu)建V基 因的所有組成部分以及可以分離不同抗原陣列(包括自體抗原)的抗體。也見(jiàn)例如美國(guó)專 利Nos. 5，565，332和5，573，905所述。人抗體也可以通過(guò)體外激活的B細(xì)胞產(chǎn)生(見(jiàn)美國(guó) 專利 5，567，610 和 5，229，275 所述)。(ν)抗體片段已經(jīng)開(kāi)發(fā)了許多技術(shù)用以產(chǎn)生抗體片段。傳統(tǒng)地，這些片段是通過(guò)對(duì)完整抗體進(jìn) 行蛋白醇解而衍生的(見(jiàn)例如Morimoto et adjournal ofBiochemical and Biophysical Methods 24:107—117(1992)和 Brennan et al, Science，229 :81 (1985)所述)。然而，現(xiàn) 在可以通過(guò)重組宿主細(xì)胞直接產(chǎn)生這些片段。例如，抗體片段可以分離自上述抗體噬菌體 文庫(kù)?；蛘?，F(xiàn)ab' -SH片段可以直接從大腸桿菌回收以及化學(xué)偶聯(lián)形成F(ab' )2片段 (Carter et al, Bio/Technology 10:163-167(1992))。根據(jù)另一方法，F(xiàn)(ab' )2 片段可 以直接分離自重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知產(chǎn)生抗體片段的其它技術(shù)。在其 它實(shí)施方案中，選擇的抗體是單鏈Fv片段(scFv) 0見(jiàn)WO 93/16185、美國(guó)專利No. 5，571， 894和美國(guó)專利No. 5，587，458。抗體片段也可以是“線性抗體”，例如美國(guó)專利5，641，870 所述。這種線性抗體片段可以是單特異性或者雙特異性的。藥物配制物以凍干配制物或者水溶液形式制備本發(fā)明中使用的B細(xì)胞耗竭劑如抗體或者其 它拮抗劑的治療性配制物并貯存，通過(guò)將具有希望純度的抗體或者其片段與任選藥物可 接受載體、賦形劑或者穩(wěn)定劑混合制備(Remington' sPharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A. Ed. (1980))?？山邮茌d體、賦形劑或者穩(wěn)定劑在所用劑量和濃度對(duì)于受體 無(wú)毒性，包括緩沖液如磷酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液及其它有機(jī)酸緩沖液；抗氧化劑包括 抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(如十八烷基二甲基芐基氯化銨；氯化六甲雙銨；苯扎氯銨， 芐索氯銨；苯酚，丁醇或苯甲醇；烷基對(duì)羥苯甲酸酯如甲基或者丙基對(duì)羥苯甲酸酯；鄰苯二 酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；以及m-甲酚)；低分子量(少于大約10個(gè)殘基)多肽；蛋白 質(zhì)如血清白蛋白、明膠或者免疫球蛋白；親水性聚合物如聚乙烯比咯烷酮；氨基酸如甘氨 酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或者賴氨酸；單糖、二糖及其它碳水化合物，包括葡 萄糖、甘露糖或者糊精；螯合劑如EDTA ；糖如蔗糖、甘露醇、海藻糖或者山梨醇；形成鹽的平 衡離子如鈉；金屬?gòu)?fù)合物(例如Zn-蛋白質(zhì)復(fù)合物)；和/或非離子表面活性劑如TWEEN 、 PLUR0NICS 或者聚乙二醇(PEG)。
舉例的抗-⑶20抗體配制物在W098/56418中描述，所述文獻(xiàn)援引加入本文。這 個(gè)出版物描述了液體多劑量配制物，包含40mg/mL rituximab、25mM乙酸鹽、150mM海藻糖、 0.9%苯甲醇、0.02%聚山梨醇酯20，pH 5.0，在2-8°C最小保質(zhì)期為兩年。另一感興趣的 抗-CD20配制物包含lOmg/mLrituximab于9. Omg/mL氯化鈉、7. 35mg/mL檸檬酸鈉二水合 物、0.7mg/mL聚山梨醇酯80和無(wú)菌注射用水中，pH 6.5。適合皮下施用的凍干配制物在美 國(guó)專利No. 6，267，958 (Andya et al)中描述。這種凍干的配制物可以用合適的稀釋劑重建 至高蛋白質(zhì)濃度，所述重建配制物可以皮下施用給待治療的哺乳動(dòng)物。本發(fā)明也涵蓋晶體 形式的抗體或者拮抗劑。見(jiàn)例如US2002/0136719A1所述。也可以在膠體藥物輸送系統(tǒng)(例如脂質(zhì)體、白蛋白微球體、微乳液 (microemulsions)、納米顆粒和納米膠囊)或者粗乳液(macroemulsions)中將活性成分 包含于例如通過(guò)凝聚技術(shù)或者通過(guò)界面聚合制備的微囊中，例如分別為羥甲基纖維素或者 凝膠-微囊和聚_(甲基丙烯酸酯)微囊。這種技術(shù)在Remington' s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)中揭示?？梢灾苽涑掷m(xù)釋放制備物。合適的 持續(xù)釋放制備物的例子包括含有拮抗劑的固體疏水性聚合物的半透性基質(zhì)，所述基質(zhì)是成 形物品形式，例如膜或者微囊。舉例的持續(xù)釋放基質(zhì)包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙 基-甲基丙烯酸酯)，或者聚(乙烯醇))、聚交酯(美國(guó)專利No. 3，773，919)，L-谷氨酸 與？乙基-L-谷氨酸的共聚物，不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯，可降解的乳酸_乙醇酸共聚 物如LUPRON DEPOT (由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林組成的可注射微球體)，以及 聚-D-(-)-3-羥丁酸。用于在體內(nèi)施用的配制物必須是無(wú)菌的。這可以通過(guò)滅菌濾膜過(guò)濾 實(shí)現(xiàn)。
實(shí)施例在 Department of Oncology and Medical Physics, Hauke land 此^61^^7!10印^￡11，一名具有穩(wěn)定0 5(在埃巴病毒感染后于1997年初次顯現(xiàn))的43歲 女性患者在細(xì)胞毒性化療后觀測(cè)到癥狀顯著改善。她在2003年出現(xiàn)霍奇金病，使用化療和 放療方法治療。她在2004年復(fù)發(fā)淋巴瘤，使用化療方法治療。與預(yù)期相反(CFS患者通常 耐受所有類型藥物以及應(yīng)激不佳)，該患者在這次化療期間和之后CFS癥狀明顯減輕。所述 改變未被解釋為與淋巴瘤活性相關(guān)，在化療開(kāi)始后作用持續(xù)大約5個(gè)月，然后CFS樣癥狀逐 步復(fù)發(fā)。除了細(xì)胞毒性作用之外，化療藥物也具有免疫調(diào)節(jié)作用。推測(cè)對(duì)CFS癥狀的作用 主要通過(guò)在化療期間施用的藥物氨甲蝶呤介導(dǎo)。當(dāng)試圖理解這個(gè)患者在癌癥化療期間和之后的經(jīng)歷而回顧關(guān)于CFS的文獻(xiàn)時(shí)，結(jié) 論是免疫系統(tǒng)的修飾似乎是患者經(jīng)歷明顯但短暫的癥狀改善的最可能解釋。在CFS患者中 見(jiàn)到的長(zhǎng)期B細(xì)胞激活對(duì)于所述癥狀以及報(bào)道的生理學(xué)改變是重要的，所述生理學(xué)改變例 如中樞神經(jīng)血液循環(huán)改變，以及腦組織、脊神經(jīng)根或者心肌中淋巴細(xì)胞侵潤(rùn)的報(bào)道。B細(xì)胞耗竭的可能的作用模式可以在幾個(gè)部位，如與T細(xì)胞系統(tǒng)相互作用，因此修 飾炎癥過(guò)程，以及在免疫穩(wěn)態(tài)中影響重要的多效性參與者(pleiotropic players)如血管 活性神經(jīng)肽的水平。這些在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有廣泛活性。綜合現(xiàn)有資料與在免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞毒性治療之后CFS患者的疲勞和疼痛得以未 曾預(yù)料的改善，推測(cè)B細(xì)胞耗竭在概念上可以治療CFS。
17
目前實(shí)現(xiàn)B細(xì)胞耗竭最容易的方法是使用單克隆抗-⑶20抗體Rituximab。然而， 推測(cè)新一代抗-⑶20抗體由于推測(cè)實(shí)現(xiàn)更有效的B細(xì)胞耗竭而對(duì)于CFS癥狀也具有至少類 似作用。先導(dǎo)(pilot)患者1 作為第一個(gè)先導(dǎo)患者，在告知有關(guān)方法的實(shí)驗(yàn)性質(zhì)和風(fēng)險(xiǎn)之后，上文提及的婦女 接受一次Rituximab 500mg/m2輸注。在治療前，她具有伴有明顯疲勞的穩(wěn)定CFS，不能離家 工作或者做家務(wù)。她使用電動(dòng)輪椅在室外活動(dòng)。在輸注之后5-6周之間開(kāi)始，她經(jīng)歷明顯 的癥狀改善，疲勞明顯減輕、肌痛明顯減輕、皮膚灼痛減輕以及頭痛減輕，伴隨阿片類鎮(zhèn)痛 藥物的需要量逐漸減少。由于疲勞減輕，她可以長(zhǎng)距離步行，重新開(kāi)始其愛(ài)好且能做家務(wù)及 照顧孩子。她還報(bào)道認(rèn)知功能顯著改善，保持集中注意力的能力，且再次能閱讀以及例如使 用計(jì)算機(jī)工作。第一次輸注Rituximab之后的作用持續(xù)直至14周，然后逐漸消退，但是CFS 癥狀未完全復(fù)發(fā)。在第一次輸注Rituximab之后5個(gè)月，她再次出現(xiàn)穩(wěn)定及失去工作能力的CFS癥 狀。她接受新一次相同劑量的Rituximab輸注。6周后，她再次經(jīng)歷所有CFS癥狀(疲勞、疼 痛、認(rèn)知癥狀)逐步消退及大部分痊愈，對(duì)于生活質(zhì)量具有較大作用。在第二次輸注后(也 是輸注一次低劑量500mg/m2)，治療作用持續(xù)直至16周，然后出現(xiàn)癥狀緩慢和逐步惡化。然后決定從第二次輸注Rituximab之后，從18周開(kāi)始每周口服低劑量氨甲蝶呤， 開(kāi)始時(shí)每周7. 5mg，在接下來(lái)兩個(gè)月期間增加劑量至每周12. 5mg。從每周氨甲蝶呤之后12 周開(kāi)始，她再次經(jīng)歷逐步和中等程度CFS癥狀痊愈。她現(xiàn)在使用氨甲蝶呤22周，癥狀中等 至顯著改善，但是目前不如在Rituximab治療后明顯和快速。然而她仍經(jīng)歷其狀況逐步改 善。CFS癥狀的發(fā)展在圖1示出。先導(dǎo)患者2 他是42歲男性，在8年前感染埃巴病毒之后發(fā)生CFS。自從感染病毒后他具有明 顯的疲勞及不能做任何工作。大多數(shù)時(shí)間被迫坐在椅子中。在輕度運(yùn)動(dòng)后，即出現(xiàn)疲憊、肌 痛和頭痛增強(qiáng)等顯著問(wèn)題。他也具有發(fā)熱感覺(jué)、出汗和腹瀉。他具有嚴(yán)重的認(rèn)知障礙。盡 管先前是電腦工程師，但是現(xiàn)在他不能使用計(jì)算機(jī)或者連續(xù)閱讀1-2頁(yè)書籍。給予他輸注一次Rituximab 500mg/m2。第一個(gè)改善的癥狀(在輸注3周后)是長(zhǎng) 期腹瀉。從輸注后6周開(kāi)始，他經(jīng)歷疲勞、疼痛、認(rèn)知和自主功能癥狀顯著改善。然后他能進(jìn) 行手工勞動(dòng)以及享受計(jì)算機(jī)游戲和閱讀的樂(lè)趣。在相對(duì)低劑量(一次輸注IOOOmg)之后， 作用直至12周最明顯，之后逐步降低。他和家人描述臨床癥狀顯著改善，對(duì)全家的生活質(zhì) 量具有顯著影響。在第一次輸注Rituximab之后5個(gè)月，間隔兩周輸注兩次IOOOmg的Rituximab進(jìn) 行再次治療。與在第一次治療之后一樣，他首先痊愈的是腹瀉(3周后)。然后在6周后，認(rèn) 知癥狀減輕，之后幾天疲勞癥狀開(kāi)始改善。輸注兩次Rituximab在輸注后16周明顯的CFS癥狀改善最顯著。之后，他經(jīng)歷非 常緩慢和逐步的癥狀加重。然而，在輸注5個(gè)月后，他仍具有臨床反應(yīng)(仍好于治療前)(圖 1)。目前他開(kāi)始每周口服低劑量氨甲蝶呤進(jìn)行治療。先導(dǎo)患者3 她是22歲學(xué)生，7年前在單核細(xì)胞增多癥之后出現(xiàn)CFS。最初她出現(xiàn)全部臨床癥
18狀，明顯疲勞、疼痛包括頭痛、認(rèn)知障礙以及自主癥狀。然而在后四年期間，她經(jīng)歷一些癥狀 改善，但是仍出現(xiàn)明顯疲勞，嗜睡以及腹瀉。她具有中等認(rèn)知障礙和中等肌痛。給予她輸注一次500mg/m2的Rituximab。這個(gè)患者在輸注后3周也經(jīng)歷腹瀉癥狀 改善。輸注6周后，她注意到肌痛有一些改善。在前5個(gè)月，她還具有疲勞癥狀略微改善， 但是較其它患者短暫及持續(xù)時(shí)間短。然而，在輸注6個(gè)月之后，她經(jīng)歷所有CFS癥狀的明顯臨床反應(yīng)，直至在最后7 年中未經(jīng)歷的高水平功能性。她開(kāi)始全天學(xué)習(xí)，可以無(wú)困難閱讀，以及其短期記憶明顯改 善。這種顯著的改善持續(xù)4個(gè)半月。隨后幾周她經(jīng)歷CFS癥狀逐步復(fù)發(fā)。目前她接受新的 Rituximab輸射(間隔兩周輸注兩次500mg/m2)。氨甲蝶呤(Methotrexat，Mtx)是具有已知(但未充分了解的)免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)的治 療劑。對(duì)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療方案是每周口服一次，藥物作用之一是中等B細(xì)胞耗竭， 機(jī)制與 Rituximab 作用相似但不如其明顯(Edwards etal. NEJM, 2004. Efficacy of B-CeII Targeting Therapy with Rituximab inPatients with Rheumatoid Arthritis)。對(duì)于三 個(gè)先導(dǎo)患者之一(患者1)，每周用氨甲蝶呤治療一次，持續(xù)22周，從最初Mtx治療之后10 周開(kāi)始，CFS癥狀也具有顯著和中等的臨床反應(yīng)?？偠灾^測(cè)到在三個(gè)先導(dǎo)患者中在Rituximab治療之后三個(gè)均出現(xiàn)明顯臨床 反應(yīng)，其中兩個(gè)患者在第二次Rituximab治療后也出現(xiàn)重復(fù)的臨床反應(yīng)。第三個(gè)患者在輸注Rituximab之后6周CFS癥狀有限改善。然而，從輸注后第6至 10個(gè)半月，她具有所有CFS相關(guān)癥狀的顯著臨床反應(yīng)，持續(xù)至今(輸注后10個(gè)半月)。然 后她的癥狀逐步復(fù)發(fā)，現(xiàn)在她接受新的Rituximab治療(在第一次Rituximab治療之后在 第47和49周進(jìn)行兩次輸注)。對(duì)這三個(gè)患者的所有五次治療均導(dǎo)致顯著至中等程度的主要癥狀改善。對(duì)于這 三個(gè)患者，癥狀改善的動(dòng)力學(xué)非常相似，但是在第三個(gè)患者中額外具有較晚和長(zhǎng)期反應(yīng)，如 圖1所示。間隔時(shí)間與已知的可以由B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的某些蛋白質(zhì)的降解和半衰期一致。 在Rituximab治療后癥狀的再現(xiàn)與在CD20抗原指導(dǎo)的B細(xì)胞裂解之后前漿細(xì)胞B-淋巴 細(xì)胞從干細(xì)胞成熟一致，這是通過(guò)補(bǔ)體指導(dǎo)的細(xì)胞毒性(CDC)及通過(guò)抗體依賴性細(xì)胞毒性 (ADCC)介導(dǎo)的。這些不成熟的B細(xì)胞示出能產(chǎn)生蛋白質(zhì)，在其中能產(chǎn)生抗體。
權(quán)利要求
B細(xì)胞耗竭劑，用于治療慢性疲勞綜合征和肌痛性腦脊髓炎。
2.權(quán)利要求1的B細(xì)胞耗竭劑，其是耗竭B細(xì)胞的抗-CD20抗體或者其結(jié)合CD-20的 抗體片段。
3.權(quán)利要求2的耗竭B細(xì)胞的抗-CD20抗體或者結(jié)合CD20的抗體片段，其是單克隆抗 體或者其結(jié)合CD20的抗體片段。
4.權(quán)利要求2的B細(xì)胞耗竭劑，其是人源化抗-CD20抗體或者其結(jié)合CD20的抗體片段。
5.權(quán)利要求2的B細(xì)胞耗竭劑，其是結(jié)合CD20的耗竭B細(xì)胞的CD20抗體片段，優(yōu)選選 自由F(ab' )2、F(ab' )、Fab、Fv和sFv組成的組中的抗原結(jié)合片段。
6.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的B細(xì)胞耗竭劑，其選自人源化抗體Rituximab.Ofatumumab, Ocre 1 izumab、GAlO 1、BCX-301、VeItuzumab 或者 DXL 625。
7.權(quán)利要求1的B細(xì)胞耗竭劑，其是MethotrexatTRU-015或者SBI-087。
8.用于治療慢性疲勞綜合征/肌痛性腦脊髓炎的權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的B細(xì)胞耗竭 劑，其中耗竭B細(xì)胞的抗⑶20抗體的量在10mg-5000mg每劑的范圍內(nèi)。
9.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的B細(xì)胞耗竭劑，其中所述B細(xì)胞耗竭劑是耗竭B細(xì)胞的 抗CD20抗體或者其結(jié)合CD20的抗體片段，用于給對(duì)象施用所述抗體的單個(gè)治療有效量 50-2000mg/m2或者施用多個(gè)所述抗CD20抗體或者其結(jié)合抗CD20的抗體片段的治療有效量 50-2000mg/m2。
10.治療慢性疲勞綜合征和肌痛性腦脊髓炎的方法，包括給患有此疾病的對(duì)象施用權(quán) 利要求1-9任一項(xiàng)定義的B細(xì)胞耗竭劑的步驟。
11.治療慢性疲勞綜合征和肌痛性腦脊髓炎的方法，包括在兩周內(nèi)兩次施用一或兩次 輸注權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)定義的B細(xì)胞耗竭劑的步驟。
12.權(quán)利要求10或11的治療慢性疲勞綜合征和肌痛性腦脊髓炎的方法，其中同時(shí)、單 獨(dú)或者相繼給患有慢性疲勞綜合征或者肌痛性腦脊髓炎的對(duì)象施用耗竭B細(xì)胞的抗CD20 抗體或者其結(jié)合CD20的抗體片段與Methotrexat的組合。
13.權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的B細(xì)胞耗竭劑在治療慢性疲勞綜合征或者肌痛性腦脊髓炎 中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明第一方面涉及耗竭B細(xì)胞的抗-CD20抗體或者其結(jié)合CD20的抗體片段，用于治療慢性疲勞綜合征以及肌痛性腦脊髓炎。本發(fā)明特別涉及優(yōu)選人源化的抗-CD20單克隆抗體或者其片段在治療慢性疲勞綜合征/肌痛性腦脊髓炎對(duì)象中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K39/395GK101910201SQ200980101646
公開(kāi)日2010年12月8日 申請(qǐng)日期2009年1月2日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月2日
發(fā)明者O·弗呂格, O·梅拉 申請(qǐng)人:卑爾根技術(shù)轉(zhuǎn)移公司