專利名稱：乙酰水楊酸鹽用于治療病毒感染的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含O-乙酰水楊酸和堿性氨基酸的鹽的組合物用于制備藥物組合物的 新型用途。現(xiàn)有技術(shù)和
背景技術(shù)：
流行性感冒(influenza)仍然屬于具有大流行潛力的大病疫類型。僅存在少數(shù)藥 物對(duì)抗該誘發(fā)性病原體，也即流行性感冒A病毒，它們?nèi)际侵苯訉?duì)抗該病毒。問(wèn)題是會(huì)相 對(duì)快地產(chǎn)生抗性。此外，存在禽類中流行性發(fā)生的由H5流行性感冒A病毒感染引起的禽流 感(avian influenza)還傳播到人類的風(fēng)險(xiǎn)。特別是與被感染的禽類接觸的人員因此處于 高風(fēng)險(xiǎn)。特別地，必須注意的是，越來(lái)越密集地報(bào)道出H5W病毒對(duì)抗少數(shù)經(jīng)證實(shí)有效的藥 物(例如奧塞米韋(oseltamivir))。因此迫切需要新的和有效的用于預(yù)防和治療病毒感染 的抗流行性感冒藥物，并且如果可能的話，該藥物應(yīng)當(dāng)不觸發(fā)任何抗性。由文件W02004/060360A1已知，乙酰水楊酸能夠抑制宿主細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄因子 NF-K B，和在該NF-K B信號(hào)通路的抑制過(guò)程中，必需的病毒成分將保留在細(xì)胞核中和不再 能整合到病毒顆粒中。從該文件中還已知的是，產(chǎn)氣式地(aerogenic)給藥乙酰水楊酸以 預(yù)防或治療病毒感染。例如，從文件DE 10202019A1已知乙酰水楊酸和堿性氨基酸的鹽，由此獲得的制 劑被專用于口服給藥。從該文獻(xiàn)中，還獲知了這種鹽用于治療下列疾病的用途風(fēng)濕病、關(guān) 節(jié)炎、神經(jīng)痛、肌痛、偏頭痛、缺血性心臟病、卒中、心絞痛、心肌梗死、旁路手術(shù)、PTCA、支架 植入、用于刺激HIV患者的免疫系統(tǒng)、用于腫瘤預(yù)防、用于減緩因癡呆綜合征引發(fā)的認(rèn)知衰 退、用于抑制膽結(jié)石形成和/或治療糖尿病。迄今已知的鹽還已經(jīng)以商品名Aspisol 用作 藥物用于治療哮喘、花粉病、鼻粘膜腫脹或慢性呼吸道感染，和除了口服給藥之外，該已知 的鹽還用于注射。所有這些疾病都不與由流行性感冒病毒引起的病毒感染直接關(guān)聯(lián)。在動(dòng)物模型中，純乙酰水楊酸(其作為氣溶膠吸入式給藥到呼吸道或肺中)作為 抗病毒劑的用途原則上在動(dòng)物模型中已經(jīng)證實(shí)其自身是非常有利的。然而，對(duì)于人類，吸入 純乙酰水楊酸會(huì)導(dǎo)致呼吸道的嚴(yán)重刺激。此外，在個(gè)別情況下，已經(jīng)表明吸入乙酰水楊酸可 能導(dǎo)致某些敏感患者的哮喘發(fā)作。因此，在任何情況下，產(chǎn)氣式地給藥乙酰水楊酸作為抗流 行性感冒藥物對(duì)于哮喘患者或具有哮喘風(fēng)險(xiǎn)的人員將是禁忌的。發(fā)明的技術(shù)目標(biāo)因此，本發(fā)明的目標(biāo)在于提供一種含有乙酰水楊酸的用于治療病毒感染的配制 劑，其是特別好耐受的和特別是可靠地避免了引起哮喘發(fā)作的風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明的基礎(chǔ)和優(yōu)選的實(shí)施方案為了實(shí)現(xiàn)該技術(shù)目標(biāo)，本發(fā)明教導(dǎo)了包含生理學(xué)有效劑量的O-乙酰水楊酸和天 然或非天然堿性氨基酸的鹽的組合物用于制備藥物組合物的用途，所述藥物組合物用于預(yù) 防或治療人類或動(dòng)物(特別是哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類)的病毒感染。出于本發(fā)明的目的，特別是 被自然發(fā)生的野生型病毒感染，而不是被基因改性的病毒感染，被稱為病毒感染。在鳥(niǎo)類，特別是禽類，例如雞、鵝、鴨、肉用母雞、火雞、鵪鶉或鴿子，還有鳴禽被涉
3及用來(lái)預(yù)防或治療。通過(guò)使用這樣的鹽，特別是在產(chǎn)氣式地給藥時(shí)，由于在給藥的配制劑中活性物質(zhì) 不是酸，避免了組織(例如呼吸道粘膜)的刺激。由此，可靠地防止了患者中由哮喘引起的 哮喘發(fā)作或者具有此風(fēng)險(xiǎn)的人員，并且在實(shí)踐中對(duì)于作為治療劑和預(yù)防劑廣泛施加沒(méi)有障 礙，其原因是不存在副作用風(fēng)險(xiǎn)，更多地是因?yàn)樵撆渲苿┥踔烈呀?jīng)用作抗哮喘藥物。此外， 正如本發(fā)明已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，抑制病毒復(fù)制沒(méi)有因乙酰水楊酸的衍生化而受到影響，這是沒(méi)有預(yù) 料到的；出乎意料的是，其甚至有時(shí)還略微增加了。優(yōu)選的是，如果所述堿性氨基酸選自包括下列的組“賴氨酸、精氨酸、鳥(niǎo)氨酸、二 氨基丁酸和所述酸的混合物”，所述乙酰水楊酸鹽優(yōu)選是單乙酰水楊酸鹽。氨基酸是α-氨 基羧酸，和在α-原子上，氫或任意殘基可以作為側(cè)鏈鍵合。堿性氨基酸可以在側(cè)鏈包括一 個(gè)或者多個(gè)堿性基團(tuán)，特別是氨基。所述堿性氨基酸可以特別為D-賴氨酸、L-賴氨酸或者 D-賴氨酸和L-賴氨酸的混合物。所述制劑可以另外包括ο-乙酰水楊酸與天然或非天然的帶非堿性側(cè)鏈的氨基酸 的鹽，特別是與甘氨酸的鹽。在組合物中賴氨酸對(duì)甘氨酸的重量比可以為100 1-1 1， 特別是100 1-10 1。優(yōu)選的是氨基酸賴氨酸和甘氨酸的鹽的混合物。特別優(yōu)選的是鹽
或鹽的混合物，例如以商品名Aspisol 市售的組合物，比如以水溶液的形式。出于本發(fā)明目的，還可以使用這樣的藥物組合物，其包含在服用或給藥后經(jīng)由生 物體自然代謝成根據(jù)本發(fā)明所用的活性物質(zhì)的前藥。根據(jù)本發(fā)明，所用的組合物可以用于預(yù)防或治療多種病毒感染。所述組合物特別 適合用于預(yù)防或治療帶負(fù)鏈RNA病毒的感染，例如流行性感冒病毒，優(yōu)選流行性感冒A病 毒，特別是H5或H7型病毒。但是，還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明所用的物質(zhì)抑制病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞因子的過(guò)表達(dá)(“細(xì) 胞因子風(fēng)暴(cytokine storm)”)，其以NF-K B依賴性的方式調(diào)節(jié)。因此，借助根據(jù)本發(fā)明 的物質(zhì)，許多病毒的致病性(pathogenity)通常會(huì)降低，其致病潛力尤其與細(xì)胞因子的過(guò) 度表達(dá)相關(guān)。因此，根據(jù)本發(fā)明所用的組合物還適合于治療和預(yù)防由冠狀病毒(SARS)、呼吸 道合胞體病毒(Respiratory Syncytial Virus) (RSV)、纖絲病毒例如馬爾堡病毒(Marburg virus)或埃博拉病毒(Ebola virus)、沙狀病毒(arena virus)例如拉沙病毒(Lassa virus)、阿根廷、玻利維亞或委內(nèi)瑞拉出血熱病毒，漢坦病毒、黃病毒例如登革熱病毒或者 黃熱病病毒，克里米亞_剛果出血熱病毒，裂谷熱病毒，副流行性感冒病毒(1、2和3型)、鼻 病毒、人類偏肺病毒(hMPV)和愛(ài)潑斯坦-巴爾病毒(Epstein Barr virus)引起的病毒感
染ο根據(jù)本發(fā)明使用的藥物組合物的蓋侖制劑(galenic pr印aration)可以以本技術(shù) 領(lǐng)域中常規(guī)的方式制備，并且原則上可以以任意給藥類型實(shí)施，例如口服、注射或者產(chǎn)氣式 地用于吸入給藥。合適的固體或液體蓋侖制劑形式例如是顆粒、粉末、錠劑、片劑、(微)膠 囊、栓劑、糖漿、果汁、懸浮液、乳液、滴劑或者可注射的溶液(i. v.，i. p.，i. m. , s. c.)或者 微細(xì)分散體(氣溶膠)、經(jīng)皮體系和延遲釋放活性物質(zhì)的制劑，為了制備它們使用了常規(guī)手 段，例如載體物質(zhì)、爆炸劑(explosive)、粘合劑、包衣、溶脹劑、滑動(dòng)劑或潤(rùn)滑劑、增味劑、甜 味劑和增溶劑(solution mediator)。作為輔助物質(zhì)在此提到碳酸鎂、二氧化鈦、乳糖、甘露 醇和其它糖類、滑石、乳蛋白、明膠、淀粉、纖維素及其衍生物、動(dòng)物和植物油例如鱈魚(yú)肝油、葵花籽油、花生油或芝麻油，聚乙二醇和溶劑例如滅菌水和一元或多元醇，例如甘油或這些 溶劑的混合物。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可以通過(guò)如下方式制備將至少一種根據(jù)本發(fā)明 的鹽以界定劑量與藥學(xué)上合適的和生理學(xué)上良好耐受的載體以及可能的額外的合適的活 性物質(zhì)、添加物質(zhì)或輔助物質(zhì)混合，并以所需的給藥形式準(zhǔn)備。口服給藥的制劑實(shí)例例如參 見(jiàn)于文件DE 10202019A1和其中所引述的文件中。但是，優(yōu)選地，用于產(chǎn)氣式地、鼻腔給藥的蓋侖制劑作為液體的含水組合物(溶 液)，或者作為粉末，如果可能的話在推進(jìn)劑(propellant)中的懸浮液中，例如將在室溫下 液化的推進(jìn)劑，例如CFCs，氫氟代烷烴，例如1，1，1，2-四氟乙烷或者1，1，1，2，3，3，3-七氟 丙烷、丙烷、丁烷、異丁烷或者其它在醫(yī)用氣溶膠配制劑領(lǐng)域中常用的推進(jìn)劑。作為所提到 的推進(jìn)劑的補(bǔ)充或者替代，還可以使用空氣、氧氣、氮?dú)?、二氧化碳或者一氧化二氮。所述組 合物可以包括醫(yī)用氣溶膠配制劑的常見(jiàn)添加物質(zhì)和輔助物質(zhì)，例如比如生理學(xué)上良好耐受 的表面活性物質(zhì)和/或常規(guī)的分散劑。此外，所述含水組合物優(yōu)選是所述鹽或者所述鹽的混合物的0. OlmM-3. 0M、優(yōu)選 0. 5-3. 0M,或者0. Ol-IOOmM,特別是0. I-IOmM的含水溶液。優(yōu)選的是，所述氣溶膠的顆粒尺寸(如果其為溶液，如果其為固體材料形式的鹽 或者其為懸浮液形式的鹽)具有小于10微米，優(yōu)選小于5微米的MMAD值(質(zhì)量中值氣體 動(dòng)力學(xué)直徑(mass median aerodynamic diameter))。為了測(cè)定氣體動(dòng)力學(xué)顆粒尺寸分布 FPD(微細(xì)顆粒劑量)或者FPF(微細(xì)顆粒級(jí)分)，沖擊器(impactor)是合適的，例如比如 5_段式的多段式液體碰撞取樣器(MSLI)或者8段式的Andersen級(jí)聯(lián)沖擊器(ACI)，其記載 在美國(guó)藥典(USP)的第601章或者歐洲藥典(Ph. Eur.)的Inhalanda Monograph中。基于 氣體動(dòng)力學(xué)顆粒分布，氣溶膠制劑的MMAD值可以通過(guò)“l(fā)og-概率點(diǎn)”進(jìn)行計(jì)算。通過(guò)優(yōu)選 的MMAD值，獲得了可呼吸性的氣溶膠顆粒，其達(dá)到肺的深處(de印part)，使得在常規(guī)的給 藥期間在整個(gè)肺部獲得足夠的濃度。為了防止小顆粒被再次呼出，可以為MMAD值設(shè)定0. 1 微米，優(yōu)選0. 5微米，非常優(yōu)選1微米的下限。根據(jù)本發(fā)明使用的鹽可以被減小成小片或者以常規(guī)方式微粉化以獲得合意 的MMAD值，例如通過(guò)圓錐磨機(jī)(pinned disk mill)、球磨機(jī)或者空氣射流磨機(jī)(air separation mill)。根據(jù)本發(fā)明的氣溶膠的給藥可以借助所有帶氣溶膠產(chǎn)生器(例如蒸發(fā)器或噴 霧器)的吸入裝置進(jìn)行，正如在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中常用的那些。實(shí)例是粉末氣溶膠蒸發(fā)器或者 DPI (干粉吸入器)、噴嘴、超聲或者振動(dòng)膜噴霧器。此外，可以使用利用電流體動(dòng)力學(xué)原理 的氣溶膠產(chǎn)生器或者來(lái)自液體配制劑的凝聚式氣溶膠。合適的吸入裝置的實(shí)例記載在文件 EP1741460A, EP 1700614A, EP 1258264A 和 EP 1163921A 中。就所用的氣溶膠產(chǎn)生器的通過(guò)率而言，組合物中的鹽濃度經(jīng)選擇使得至少10毫 克、優(yōu)選至少50毫克，非常優(yōu)選至少100毫克的鹽轉(zhuǎn)變成氣溶膠并在低于5分鐘、優(yōu)選2分 鐘，非常優(yōu)選1分鐘的時(shí)間內(nèi)給藥至患者。此外，有用于最優(yōu)化肺部淀積的是，呼吸流或者呼吸體積經(jīng)檢查和調(diào)節(jié)。在吸氣 流太快的情況下，氣溶膠顆粒會(huì)已經(jīng)沖擊到喉嚨后壁(pharyngeal background)或者在聲 門處分離。如果呼吸過(guò)于平緩，氣溶膠顆粒會(huì)僅僅接觸到上呼吸道而不是肺的深處(deep part)。因此，所用的吸入系統(tǒng)應(yīng)當(dāng)保證患者深入、緩慢的吸入。對(duì)于兒童，吸入體積應(yīng)當(dāng)
5為至少200毫升，優(yōu)選至少500毫升。對(duì)于成人，吸入體積應(yīng)當(dāng)為至少300毫升，優(yōu)選至少 500毫升。合適地，這種氣溶膠體積的吸入應(yīng)當(dāng)在至少Is、更好地至少3s、優(yōu)選地至少5s 的時(shí)間內(nèi)完成。吸氣流應(yīng)當(dāng)有利地調(diào)節(jié)為低于1000ml/S，特別是低于500ml/s，特別是低于 300ml/s，和將呼吸體積調(diào)節(jié)為相對(duì)于患者的吸氣量的至少20%、特別是至少30%，優(yōu)選至 少50%，至多95%。后者確保了患者一方面緩慢而另一方面深入的吸入。對(duì)于本發(fā)明目的，可以使用吸入體系，其利用傳感器測(cè)量上述參數(shù)并借助電學(xué)、聲 學(xué)和/或光學(xué)信號(hào)提供關(guān)于適當(dāng)或不適當(dāng)?shù)奈氲男畔?。就以此方式工作的吸入裝置而 言，參見(jiàn)上述文件。在簡(jiǎn)單吸入體系的情況下，還可以設(shè)想將帶有上述測(cè)量的患者信息表添 加到藥物組合物中。因此，本發(fā)明還涉及這樣的氣溶膠配制劑，其包括O-乙酰水楊酸與天然或非天 然的堿性氨基酸的鹽、推進(jìn)劑和任選的輔助物質(zhì)和/或載體物質(zhì)。所述鹽的含量可以為 0. 001-50重量％。0. 001-10重量％，特別是0. 1-10重量％或者10-50重量％，特別是30-50 重量％的量，相對(duì)于整個(gè)配制劑而言。如果所述鹽以顆粒形式存在，那么其可以具有低于10 微米、特別是低于5微米的MMAD值。特別是在使用上述的高濃度的情況下，出人意料的是，由這樣的溶液產(chǎn)生的氣溶 膠顆粒能夠以上述小顆粒尺寸制備。此外，本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的氣溶膠配制劑用于預(yù)防或治療人類或動(dòng)物的病 毒感染的用途，其中向處于病毒感染風(fēng)險(xiǎn)或者被病毒感染的人類或者這樣的動(dòng)物產(chǎn)氣式地 給藥生理學(xué)有效量的氣溶膠配制劑，以經(jīng)鼻或口吸入。最后，本發(fā)明涉及具有供料罐(supply tank)和連接到該供料罐的氣溶膠產(chǎn)生器 的吸入裝置，其中所述供料罐含有根據(jù)本發(fā)明的氣溶膠配制劑。在氣溶膠發(fā)生器的出口處 通常連接有噴口(mouthpiece)。此外，可以配備有空氣泵，藉此在控制裝置的控制下，吸氣 流和/或吸入體積受到控制。可以配備用于控制和/或調(diào)節(jié)吸氣流和呼吸體積的控制和/ 或調(diào)節(jié)機(jī)構(gòu)，且所述控制和/或調(diào)節(jié)機(jī)構(gòu)優(yōu)選經(jīng)調(diào)節(jié)為上述值。針對(duì)本發(fā)明的藥物組合物的上述闡述也以類比的方式適用于根據(jù)本發(fā)明的氣溶 膠配制劑，其用途和吸入裝置。在下面，本發(fā)明將參照實(shí)施例進(jìn)行更詳細(xì)地解釋。實(shí)施例1 抗性現(xiàn)象的研究因?yàn)樘貏e是將要討論乙酰水楊酸作為細(xì)胞因子的抗病毒作用抑制劑的抗性問(wèn)題， 將形成抗性變種的趨勢(shì)與直接作用于病毒的藥物金剛烷胺和奧塞米韋進(jìn)行比較。A549肺部 上皮細(xì)胞由高致病性禽流感A病毒隔離群(isolate) A/FPV/Bratislava/79(H7N7) (FPV，禽 瘟病毒(fowl plague virus))感染，其MOI = 0. 01 (感染復(fù)制數(shù))，并在存在或不存在乙酰 水楊酸(5mM)、金剛烷胺(5μΜ)和奧塞米韋(2μΜ)的情況下再孵育24小時(shí)。在分開(kāi)的批 次中，Α549肺部上皮細(xì)胞由A/FPV/Bratislava/79(H7N7)感染，其MOI = 0.001，并在存在 或不存在賴氨酸_甘氨酸_乙酰水楊酸鹽(5mM)和奧塞米韋(2 μ Μ)的情況下再孵育24小 時(shí)。然后，針對(duì)兩個(gè)批次收集每個(gè)樣品的細(xì)胞上清液，并在MDCK細(xì)胞上測(cè)定噬菌斑測(cè)定中 的病毒滴度。所述上清液隨后經(jīng)規(guī)格化和再次用于在相同的條件下用各自相同數(shù)量的病毒 感染第二個(gè)經(jīng)處理或者未經(jīng)處理的細(xì)胞通過(guò)。這種工序重復(fù)總共至多到第五次或第八次通 過(guò)。
在圖IA中，用乙酰水楊酸或金剛烷胺或奧塞米韋處理過(guò)的細(xì)胞的病毒滴度與未 經(jīng)處理的細(xì)胞的上清液的滴度進(jìn)行比較。在第三次通過(guò)中已經(jīng)可以看出，經(jīng)金剛烷胺處理 的細(xì)胞的病毒滴度再次顯著增加，這是因?yàn)樾纬闪丝剐缘淖兎N。出人意料地，在此處選擇的 實(shí)驗(yàn)條件下，還發(fā)現(xiàn)奧塞米韋處于可比較的程度。與此明確不同的是，發(fā)現(xiàn)乙酰水楊酸甚 至在第5次通過(guò)中仍然具有與第一次通過(guò)中不變的相同抗病毒活性。在圖IB中，用賴氨 酸_甘氨酸_乙酰水楊酸鹽或者奧賽米韋進(jìn)行處理的細(xì)胞的病毒滴度與未經(jīng)處理的細(xì)胞的 上清液的滴度進(jìn)行比較。對(duì)于賴氨酸-甘氨酸-乙酰水楊酸鹽，同樣獲得了在圖IA中所述 的結(jié)果，并且在用賴氨酸_甘氨酸乙酰水楊酸鹽處理后甚至在8次通過(guò)后仍然不能檢測(cè)到 病毒抗性形成。所得的結(jié)果充分地適合于說(shuō)明，乙酰水楊酸和賴氨酸_甘氨酸_乙酰水楊 酸鹽完全不具有在細(xì)胞培養(yǎng)中形成抗性變種的趨勢(shì)。實(shí)施例2 :賴氨酸_甘氨酸_乙酰水楊酸鹽配制劑的抗高致病性流行性感冒A病 毒的抗病毒活性研究。所研究的組合物是lys-gly-乙酰水楊酸鹽(在下文中也被稱為L(zhǎng)G-乙酰水楊酸 鹽)，其對(duì)應(yīng)于產(chǎn)品Aspisol (可由Bayer AG獲得)的分子組成。該配制劑經(jīng)受抗流行性感冒病毒的抗病毒活性的研究。A549肺部上皮細(xì)胞經(jīng)由 A/FPV/Brat is lava/79 (H7N7) (MOI = 0. 01)感染并在存在或不存在乙酰水楊酸(5mM)或 LG-乙酰水楊酸鹽(5mM)的情況下孵育8小時(shí)、24小時(shí)和36小時(shí)。隨后收集各樣品的細(xì)胞 上清液，并由此在MDCK細(xì)胞上測(cè)定噬菌斑測(cè)定中的病毒滴度。圖2顯示出病毒滴度對(duì)時(shí)間 的圖。結(jié)果為L(zhǎng)G-乙酰水楊酸鹽和乙酰水楊酸一樣等同有效地抑制高致病性鳥(niǎo)類H7N7隔 離群的病毒增殖。在用H5W亞種的高致病性隔離群進(jìn)行感染后，同樣是這種情形，正如圖3所示。 A549肺部上皮細(xì)胞經(jīng)由人類H5m隔離群A/Thai land/KAN-1/2004 (MOI = 0.001)感染，并 在存在或不存在上述濃度的乙酰水楊酸或LG乙酰水楊酸的情況下孵育。研究所述細(xì)胞上 清液，以測(cè)定在MDCK細(xì)胞上的噬菌斑測(cè)定中的病毒滴度。圖3A示出了 20小時(shí)的時(shí)間值， 在圖3B中以生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)圖示出了病毒滴度。在兩種情況下，都可以看出H5W菌株的病毒 滴度的有效抑制，抑制程度為十的幾次冪(several decimal power) 0因?yàn)樵隗w外的高抗病毒潛力，可以假定LG-乙酰水楊酸鹽配制劑適合作為可吸入 給藥用的抗流行性感冒活性物質(zhì)。實(shí)施例3 在細(xì)胞培養(yǎng)體系中，LG-乙酰水楊酸鹽對(duì)高致病性禽流感病毒的影響。MDCKII 細(xì)胞在 MEM-介質(zhì)(MEM ；Gibco (Invitrogen)德國(guó) 21430-079，批次 32034) 中通過(guò)添加10%的熱滅活的胎牛血清(FCS，PAA Laboratories/A04305-0346)，盤尼西林 (Grunenthal/616G03)和鏈霉素(Sanavita/03056440111)進(jìn)行培養(yǎng)。為了進(jìn)行感染，將 所述細(xì)胞播灑在24孔板(8xl04細(xì)胞/孔；Greiner，德國(guó)，No. 662160，批次05210151)中 和在37°C孵育過(guò)夜。在感染之前，所述細(xì)胞用PBS洗滌，將相應(yīng)的病毒(FPV，SNl, MBl) 在 PBS/BA(補(bǔ)充有 0. 6% BA 的 PBS(MP Biomedicals), ImM MgCl2,0. 9mM CaCl2，盤尼西林 (Grunenthal/616G03)和鏈霉素)稀釋，并在細(xì)胞菌苔(cell lawn)上用0. 001的MOI滴 定。在于37°C孵育30分鐘后，去除病毒接種物，向所述細(xì)胞添加Iml MEM介質(zhì)或者含有5mM LG-乙酰水楊酸鹽的MEM介質(zhì)。在感染8、24、32和48小時(shí)后，取出各個(gè)上清液。在“噬菌 斑測(cè)定”中驗(yàn)證到感染病毒顆粒的存在。
對(duì)于“噬菌斑測(cè)定”而言，將MDCKII細(xì)胞播撒到96孔板中，使得細(xì)胞菌苔在第 二天融合。所述細(xì)胞用PBS洗滌并用上清液的稀釋液感染(于37°C將所述上清液的稀 釋液布置在PBS/ΒΑ中達(dá)60分鐘)。在孵育后，所述細(xì)胞用Avicel介質(zhì)混合物(Avicel RC-581 (FMC/B624C))涂覆。為此，將2. 5 %的Avicel溶液與相同量的2x MEM-介質(zhì)混 合。在20小時(shí)的孵育時(shí)間后，去除Avicel介質(zhì)混合物，所述細(xì)胞用在PBS中的4%Roti -Histofix (Roth/32789170)溶液在4°C固定30分鐘，隨后用PBS進(jìn)行洗滌。對(duì)于染色所必 需的后續(xù)加工步驟在室溫實(shí)施。通過(guò)用在PBS中的0. 3% Triton-X-100 (Serva/30043)進(jìn) 行孵育，對(duì)所述細(xì)胞進(jìn)行透化。病毒感染的細(xì)胞用免疫組織學(xué)方法染色。為此，將細(xì)胞用單 克隆抗體(Serotec/250107)(其為針對(duì)流行性感冒A病毒核蛋白特異性的)孵育1小時(shí)。 經(jīng)感染的細(xì)胞的檢測(cè)通過(guò)用過(guò)氧化物酶結(jié)合的抗小鼠抗體(DIAN0VA/75790)的另一次孵 育(30分鐘)和添加True Blue 過(guò)氧化物酶底物(KPL/070490)進(jìn)行。所述抗體的稀釋在 含10% FCS和0. 1% Tween-20(Serva/16211)的PBS中實(shí)施。在用第一和第二抗體孵育后， 所述細(xì)胞用PBS/0. 1% Tween-20洗滌5分鐘達(dá)三次。為了終止反應(yīng)，所述板用自來(lái)水洗滌 并經(jīng)干燥。經(jīng)干燥的板經(jīng)掃描并借助Corel DRAW 9. 0軟件評(píng)估。為了測(cè)定上清液的病毒 滴度，經(jīng)感染的細(xì)胞(病灶)在96孔板的每個(gè)孔中的累積經(jīng)計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)的病灶的數(shù)目與各 自的稀釋因子相乘。從所計(jì)算出的值，測(cè)定對(duì)于每個(gè)樣品的平均值。病毒滴度作為平均值 的IoglO值記錄。所述結(jié)果在圖4中示出?？梢钥闯?，在用LG-乙酰水楊酸鹽處理后，H7W病毒 (FPV)和H5m病毒(MBl)的復(fù)制在細(xì)胞培養(yǎng)體系中有時(shí)降低了超過(guò)99%。實(shí)施例4 =LG-乙酰水楊酸鹽的抗病毒活性所基于的分子作用機(jī)制研究。此外，研究了 LG-乙酰水楊酸鹽的分子作用曲線是否能和純乙酰水楊酸物質(zhì)相比 較。LG-乙酰水楊酸鹽應(yīng)當(dāng)充當(dāng)NF-κ B抑制劑和相應(yīng)地不具有任何在其它病毒誘導(dǎo)信號(hào) 通路上的副作用。重要的信號(hào)介體類型(其在流行性感冒病毒感染后也被活化)是人們所 說(shuō)的絲裂原(mitogen)激活的蛋白質(zhì)激酶(MAPK)。其包括激酶JNK、p38和ERK。對(duì)于純物 質(zhì)乙酰水楊酸而言，已經(jīng)示出這些激酶的病毒誘導(dǎo)活化不受乙酰水楊酸的抑制。如圖5所 示，在LG-乙酰水楊酸鹽的情況下也是如此JNK、p38和ERK(圖5，徑跡5)的病毒誘導(dǎo)活 性(其可以借助磷光體特異性抗體對(duì)抗這些激酶在免疫印跡(Western blot)中的活性形 式進(jìn)行檢測(cè))沒(méi)有通過(guò)添加5mM(徑跡7)或者7mM乙酰水楊酸(徑跡9)而阻斷。乙酰水 楊酸以通過(guò)抑制促凋亡因子表達(dá)的抗病毒方式起作用，其最終將導(dǎo)致在細(xì)胞中降低的半胱 天冬酶活性。基于免疫印跡，圖6針對(duì)LG-乙酰水楊酸鹽也顯示了這一點(diǎn)，通過(guò)半胱天冬酶 底物聚-ADP-核糖聚合酶(PARP)的裂解顯示了半胱天冬酶活性。在30小時(shí)后清楚可見(jiàn)的 裂解PARP帶(徑跡6)在用LG-乙酰水楊酸鹽處理的樣品(徑跡7)中有效降低。在病毒復(fù)制中NF- κ B依賴性的步驟是病毒核糖核蛋白絡(luò)合物(RNP)的半胱天冬 酶依賴性輸出到細(xì)胞質(zhì)中，其可以隨后在細(xì)胞膜中在新的病毒顆粒中形成。乙酰水楊酸 特異性地阻斷這一步驟，而不對(duì)增殖周期更早的階段中的病毒蛋白質(zhì)積累起作用。對(duì)于 LG-乙酰水楊酸鹽而言，相同的作用機(jī)制適用圖7在免疫印跡中示出了病毒蛋白質(zhì)M1、NP、 NSl和PBl的積累沒(méi)有受LG-乙酰水楊酸鹽的抑制。但是，與在前文中針對(duì)純物質(zhì)乙酰水楊 酸已經(jīng)描述的相同，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)病毒RNP絡(luò)合物的有效保留，正如將在圖8中由免疫熒光分析 中變得清楚的那樣。
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由此能夠得出結(jié)論LG_乙酰水楊酸具有和乙酰水楊酸一樣的抗病毒潛力，并以 在病毒增殖上的抑制方式中相同的分子機(jī)制起作用。實(shí)施例5 在LG-乙酰水楊酸鹽處理之后，IPlO和干擾素-Y m-RNA表達(dá)水平的降 低。已知過(guò)度的細(xì)胞因子產(chǎn)生(所謂的細(xì)胞因子風(fēng)暴)是H5m流行性感冒病毒感染 的重要致病性因素。因?yàn)檫@些細(xì)胞因子中的大部分以NF-K B依賴性的方式調(diào)節(jié)，證實(shí)了 LG-ASA是否能夠抑制病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞因子的表達(dá)和因此是否能夠額外間接影響這些病毒 的致病性。從我們的準(zhǔn)備工作中，已知在小鼠肺部被H5m (MBl)感染后，IPlO和IFN-Y被 調(diào)節(jié)為高。這些趨化因子或者細(xì)胞因子的表達(dá)由轉(zhuǎn)錄因子NF-κ B誘導(dǎo)?；诟绲陌l(fā)現(xiàn)， 能夠表明阿司匹林充當(dāng)NF-K B抑制劑。本實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)在于發(fā)現(xiàn)LG-乙酰水楊酸鹽是否在H5W感染后在小鼠肺部中充 當(dāng)NF-K B抑制劑。為此，研究了在MBI感染之前或者期間用LG-乙酰水楊酸鹽處理小鼠 是否在兩種趨化因子或細(xì)胞因子的表達(dá)率上有影響。對(duì)于該實(shí)驗(yàn)，在感染(感染劑量 lxl03pfu/50y l)i. v. (100 μ 1)和 i. p. (200 μ 1))前一小時(shí)，五只 Balb/c 小鼠均用 50mM LG-乙酰水楊酸鹽處理。進(jìn)一步的處理在感染后17、24和42小時(shí)實(shí)施。在48小時(shí)p. i.后， 取出肺部并分離出RNA。將用LG-乙酰水楊酸鹽處理的小鼠的小鼠肺部中的IPlO和IFN- γ 表達(dá)與對(duì)比動(dòng)物的比較借助定量的RT-PCR驗(yàn)證。數(shù)據(jù)示出在圖9中。未處理小鼠的IPlO和IFN-Y的表達(dá)被設(shè)定為100%，以能夠更清楚地進(jìn)行比較。 在經(jīng)靜脈和腹膜內(nèi)處理途徑用LG-乙酰水楊酸鹽處理4次后，對(duì)于趨化因子和細(xì)胞因子 兩者均能檢測(cè)到m-RNA表達(dá)的下降。靜脈內(nèi)處理途徑顯示出62%的IPlO下降和68%的 IFN-Y下降，其效果高于腹膜內(nèi)處理途徑中26%的IPlO下降和50%的IFN-γ下降。所述結(jié)果表明H5W病毒誘導(dǎo)的NF- κ B依賴性基因表達(dá)在用LG-乙酰水楊酸鹽處 理的感染小鼠肺部中強(qiáng)烈下降。這是重要的，因?yàn)樵贖5m病毒感染后觀察到細(xì)胞因子的過(guò) 度產(chǎn)生(“細(xì)胞因子風(fēng)暴”)，該細(xì)胞因子在很大程度上以NF-K B依賴性的方式調(diào)節(jié)，非常 有助于這些病毒的致病性。因此，LG-ASA不僅能直接影響病毒復(fù)制，而且還能通過(guò)降低過(guò) 度的細(xì)胞因子產(chǎn)生以積極方式間接影響疾病過(guò)程。實(shí)施例6 相容性研究。在下面實(shí)驗(yàn)中，測(cè)試了在氣溶膠處理小鼠后LG-乙酰水楊酸鹽的相容性。為了盡 可能精確地監(jiān)測(cè)處理的影響，所述實(shí)驗(yàn)借助小鼠監(jiān)測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行。這允許實(shí)時(shí)測(cè)量溫度。每 5分鐘測(cè)定和繪制一個(gè)溫度值(

圖10A-F)。此外，所述動(dòng)物每天稱重。在處理結(jié)束后，殺死 小鼠，并測(cè)定肝臟和脾臟的器官重量。在肝毒性的第一跡象中，已經(jīng)導(dǎo)致肝臟的尺寸增大。 另一方面，脾臟的尺寸增大是發(fā)炎過(guò)程的跡象。對(duì)于相容性研究，在處理前3天，將小鼠監(jiān)測(cè)發(fā)射機(jī)植入總共12只雌性Balb/c 小鼠中。在3天內(nèi)監(jiān)測(cè)到成功的介入。然后，6只小鼠各通過(guò)Pari噴霧器每天用2ml的 50mM LG-乙酰水楊酸鹽溶液處理三次。6只小鼠充當(dāng)對(duì)照，其用2ml PBS處理。所述溶液 在1. 5bar的壓力下霧化，使得所述處理花了大約10分鐘。所述處理每天于9:00點(diǎn)；12:00 點(diǎn)和15:00點(diǎn)實(shí)施，持續(xù)5天。LG-乙酰水楊酸鹽在重量變化上的影響經(jīng)調(diào)查。從被處理的那一天起并在第一次 治療前(9:00點(diǎn))，對(duì)所有小鼠進(jìn)行稱重。治療第一天的重量被設(shè)定為100%，在隨后的日子中測(cè)得的體重以此為參照。兩組處理的對(duì)比導(dǎo)致在圖11中示出的圖?？梢园l(fā)現(xiàn)在LG-乙 酰水楊酸鹽組和PBS處理組之間沒(méi)有顯著的體重變化區(qū)別。此外，研究了 LG-乙酰水楊酸鹽對(duì)體溫的影響。正如已經(jīng)提到的，小鼠監(jiān)測(cè)體系 允許實(shí)時(shí)測(cè)定小鼠的體溫。因?yàn)樾∈缶哂懈叩男玛惔x，健康的極小變化已經(jīng)導(dǎo)致體溫的 變化。在圖10中，示出了從處理前1天開(kāi)始(圖10A)到處理結(jié)束(第4天(day+4))(圖 10F)的溫度曲線?？梢钥闯?，當(dāng)與對(duì)照動(dòng)物進(jìn)行比較時(shí)，LG-乙酰水楊酸鹽處理的小鼠就體 溫而言沒(méi)有區(qū)別。最后，研究了 LG-乙酰水楊酸鹽對(duì)肝臟和脾臟重量的影響。在最后一次處理15分 鐘后，殺死所有動(dòng)物，并進(jìn)行尸體解剖。在經(jīng)腔靜脈完全放血后，檢查內(nèi)臟器官。肺部首先 以未塌縮的狀態(tài)經(jīng)隔膜檢查。肝臟和脾臟經(jīng)稱重。結(jié)果在圖13中示出。因?yàn)樾∈蟮捏w重 在處理期間沒(méi)有顯著變化，器官重量的規(guī)格化可以省去。對(duì)于脾臟(圖12A)和肝臟(圖 12B)，在經(jīng)LG-乙酰水楊酸鹽處理的動(dòng)物和對(duì)照動(dòng)物的器官重量上未能發(fā)現(xiàn)顯著變化。因 此，在小鼠的吸入性處理后，沒(méi)有觀察到肝臟毒性(其通常伴有器官腫脹)的跡象。此外， 沒(méi)有觀察到系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)，通常伴隨著脾臟尺寸的增大。從上下文研究總結(jié)得出，在5天的時(shí)間內(nèi)吸入性給藥2ml濃度為50mM的LG-乙酰 水楊酸鹽對(duì)于小鼠是良好相容的。實(shí)施例7:患者試驗(yàn)。在治療嘗試中，向4位支氣管感染的患者給藥溶液，該溶液含有至多2M的 LG-ASA(50 50)并被蒸發(fā)到小于5微米的顆粒尺寸。LG-ASA的總量為至多350毫克。將 吸氣流調(diào)節(jié)為低于500ml/s，在大多數(shù)情況下低于300ml/s。呼吸體積為患者吸氣量的至少 30%，在大多數(shù)情況下為至少50%。對(duì)于這些患者中的三位，在給藥后的第一天已經(jīng)檢測(cè)到癥狀的顯著改善。對(duì)于所 有其它患者，在給藥后的第3天發(fā)生了癥狀的改善。這些在溶液中的高濃度的主觀感知相 容性是優(yōu)異的。沒(méi)有患者報(bào)道有味道刺激。此外，沒(méi)有檢測(cè)到極端的咳嗽沖動(dòng)。
權(quán)利要求
含有o 乙酰水楊酸與天然或非天然堿性氨基酸的鹽的組合物用于制備用以預(yù)防或治療人類或動(dòng)物的病毒感染的藥物組合物的用途。
2.權(quán)利要求1的用途，其中所述堿性氨基酸選自由下列組成的組“賴氨酸、精氨酸、鳥(niǎo) 氨酸、二氨基丁酸和這些氨基酸的混合物”，優(yōu)選單-乙酰水楊酸鹽，且其中任選地可以含有 額外的ο-乙酰水楊酸與帶非堿性側(cè)鏈的天然或非天然氨基酸的鹽，特別是與甘氨酸的鹽。
3.權(quán)利要求2的用途，其中所述堿性氨基酸是D-賴氨酸、L-賴氨酸或D-賴氨酸和 L-賴氨酸的混合物。
4.權(quán)利要求1-3之一的用途，用于預(yù)防或治療負(fù)鏈RNA病毒，優(yōu)選流行性感冒A病毒、 特別是H5或H7型病毒的感染。
5.權(quán)利要求1-4之一的用途，在作為液體、含水的組合物的蓋侖制劑中，特別是用于產(chǎn) 氣式地給藥，例如經(jīng)鼻給藥。
6.權(quán)利要求5的用途，其中所述含水組合物是所述鹽的0.1-5M，特別地0. 1-3M，優(yōu)選 1-3M的含水溶液。
7.權(quán)利要求5的用途，其中所述含水組合物是所述鹽的0.Ol-lOOmM，特別是0. I-IOmM 的含水溶液。
8.權(quán)利要求1-7之一的用途，其中所述組合物設(shè)置在帶有蒸發(fā)器或噴霧器的藥學(xué)相容 的罐中。
9.權(quán)利要求8的用途，其中所述罐經(jīng)制備以將吸氣流調(diào)節(jié)為低于1000ml/S，優(yōu)選低于 500ml/s，特別是低于300ml/s，并將呼吸體積調(diào)節(jié)為相對(duì)于患者的吸氣量至少10%，特別 是至少30%，優(yōu)選至少50%，至多95%。
10.含有ο-乙酰水楊酸與天然或非天然的堿性氨基酸的鹽、推進(jìn)劑和任選的輔助物質(zhì) 和/或載體物質(zhì)的氣溶膠配制劑。
11.權(quán)利要求10的氣溶膠配制劑，其中所述鹽的含量為0.001-50重量％，0. 001-10重 量％，特別是0. 1-10重量％，或者特別是10-50重量％，相對(duì)于總的配制劑計(jì)。
12.權(quán)利要求10或11的氣溶膠配制劑，其中含有顆粒形式或者溶液形式的MMAD值低 于10微米、特別是低于5微米的鹽。
13.權(quán)利要求10-12之一的氣溶膠配制劑用于預(yù)防或治療人類或者動(dòng)物的病毒感染的 用途，其中向處于病毒感染風(fēng)險(xiǎn)或者被病毒感染的人類或者這樣的動(dòng)物產(chǎn)氣式地給藥生理 學(xué)有效量的氣溶膠配制劑，以經(jīng)鼻或口吸入。
14.權(quán)利要求13的用途，其中產(chǎn)氣式地給藥至少10毫克、優(yōu)選至少50毫克、非常優(yōu)選 至少100毫克，直至超過(guò)200毫克的氣溶膠配制劑，并優(yōu)選在低于5分鐘、優(yōu)選低于2分鐘、 非常優(yōu)選低于1分鐘的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行。
15.權(quán)利要求13或14的用途，其中將所述吸氣流調(diào)節(jié)為低于1000ml/S，特別是低 于500ml/s，特別是低于300ml/s，且其中將呼吸體積調(diào)節(jié)為相對(duì)于患者的吸氣量的至少 20%，特別是至少30%，優(yōu)選至少50%，至多95%。
16.帶有供料罐和連接到該供料罐的氣溶膠產(chǎn)生器的吸入裝置，其中所述供料罐含有 根據(jù)權(quán)利要求10-12之一的氣溶膠配制劑。
17.權(quán)利要求16的吸入裝置，帶有用于控制和/或調(diào)節(jié)吸氣流和呼吸體積的控制和/ 或調(diào)節(jié)機(jī)構(gòu)，其中所述控制和/或調(diào)節(jié)機(jī)構(gòu)優(yōu)選經(jīng)調(diào)節(jié)到根據(jù)權(quán)利要求13的值。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有o-乙酰水楊酸與堿性氨基酸的鹽的組合物用于制備用以預(yù)防或治療人類或動(dòng)物(特別是哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類)的病毒感染的藥物組合物的用途。
文檔編號(hào)A61P31/16GK101909650SQ200980102181
公開(kāi)日2010年12月8日 申請(qǐng)日期2009年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月14日
發(fā)明者G·朔伊希, O·普蘭茲, S·路德維希 申請(qǐng)人:艾克蒂維羅有限責(zé)任公司