專利名稱：人源化抗-C5aR抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與人C5a受體結(jié)合的人源化抗體及其作為治療和診斷藥劑的用途。本 研究中進(jìn)一步涉及編碼所述人源化抗體的核酸序列，及其在重組宿主細(xì)胞中的表達(dá)。特別 地，本發(fā)明涉及來(lái)源于與人C5a受體特異性結(jié)合的小鼠抗體7F3的人源化抗體。
背景技術(shù)：
每種補(bǔ)體蛋白C3-C5的蛋白水解都會(huì)產(chǎn)生稱為過(guò)敏毒素的含有信號(hào)分子的氨基 末端陽(yáng)離子片段。這些片段中最有效的片段C5a引發(fā)了最廣泛的反應(yīng)。認(rèn)為炎癥反應(yīng)的 組成部分是白細(xì)胞邊集(margination)和浸潤(rùn)、顆粒結(jié)合型蛋白水解酶(granule-bound proteolytic enzyme)的釋放、活性氧和氮源自由基的產(chǎn)生、血流和毛細(xì)血管滲透性改變以 及具有收縮平滑肌的能力，C5a分子是“完全的”促炎性介質(zhì)。C5a分子在次納摩爾到納摩 爾水平上引發(fā)的所有髓系細(xì)胞(中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和 單核細(xì)胞)的化學(xué)趨化作用，并引起血管通透，前列腺素和循環(huán)白細(xì)胞顯著地增強(qiáng)了血管 通透性。較高的納摩爾濃度可以引發(fā)NADPH氧化酶的脫粒和活化。這種生物活性的廣度與 其他炎性介質(zhì)形成鮮明對(duì)比。C5a參與包括風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、敗血癥、再灌注損傷和 成年呼吸窘迫綜合癥在內(nèi)的各種疾病的發(fā)病機(jī)制(Gerard and Gerard, 1994 ；Murdoch and Finn,2000)。C5a通過(guò)與其受體(C5aR)的結(jié)合介導(dǎo)C5a的活性。C5aR屬于七次跨膜的G-蛋白 偶聯(lián)受體家族。C5aR是對(duì)C5a具有高親和力的受體，其中Kd為 InM，其位于包括白細(xì)胞 在內(nèi)的一些不同細(xì)胞類型上。每個(gè)細(xì)胞的受體數(shù)量都非常高，每個(gè)白細(xì)胞可高達(dá)200，000 個(gè)位點(diǎn)。受體的生物活化發(fā)生在使結(jié)合飽和的范圍內(nèi)。C5aR結(jié)構(gòu)符合七次跨膜受體家族，緊接于細(xì)胞外N-末端之后的是七個(gè)跨膜螺旋， 七個(gè)跨膜螺旋通過(guò)螺旋間結(jié)構(gòu)域連接，螺旋間結(jié)構(gòu)域交互地作為細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外環(huán)，以細(xì) 胞內(nèi)C-末端結(jié)構(gòu)域?yàn)榻K點(diǎn)。C5aR含有延伸的N-末端細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。這種大型的N-末端 結(jié)構(gòu)域是典型的結(jié)合包括IL-8和fMet-Leu-Phe (FMLP)受體家族的肽的G-蛋白偶聯(lián)受體。用C5aR拮抗劑抑制C5a反應(yīng)可減少由C5a介導(dǎo)的急性炎性反應(yīng)，而不影響其他 補(bǔ)體成分。為了這個(gè)目的，先前已經(jīng)描述了 C5aR肽拮抗劑和抗_C5a受體抗體(Watanabe 等人，1995 ；Pellas 等人，1998 ；Konteatis 等人，1994 ；Kaneko 等人，1995 ；Morgan 等人， 1993)。例如，WO 95/00164描述了針對(duì)C5aR的N-末端肽(殘基9_29)的抗體。WO 03/062278也描述了針對(duì)C5aR的抗體。這些小鼠抗體中的三個(gè)稱為7F3、6C12 和12D4。這些抗體顯示出優(yōu)異的性質(zhì)，例如可非常有效地阻斷C5a結(jié)合到它的受體，中止體 外中性粒細(xì)胞的C5a-定向遷移，并阻止動(dòng)物模型中的炎癥。為了控制慢性疾病，有必要在 數(shù)月或數(shù)年內(nèi)連續(xù)幾次給予小鼠抗體。然而，給予小鼠抗體的一個(gè)缺點(diǎn)是人免疫系統(tǒng)可產(chǎn) 生針對(duì)小鼠抗體(HAMA反應(yīng))其自身的抗體。HAMA反應(yīng)通過(guò)從血液迅速清除小鼠抗體使它 們無(wú)效，從而阻止小鼠抗體與它的靶結(jié)合。為了避免形成HAMA反應(yīng)，已采取的一個(gè)方法是通過(guò)用人序列取代非表位結(jié)合區(qū)中的許多“外來(lái)”殘基而“人源化”小鼠抗體。然而，這個(gè)過(guò)程通常導(dǎo)致抗原性的喪失。而 且，人源化抗體領(lǐng)域的研究人員一直在努力確定能可靠生產(chǎn)具有人治療中使用的所有必需 要求的人源化抗體的合適方法。人源化步驟的主要問(wèn)題在于對(duì)抗原的親和力的喪失(Jones等人，1986)，在一些 情況下，損失到十分之一或更少，尤其當(dāng)抗原是蛋白質(zhì)時(shí)(Verhoeyen等人，1988)。當(dāng)然，任 何親和力的喪失都是及其不愿意看到的。至少，它意味著必需將更多人源化抗體以更高代 價(jià)和更大副作用的風(fēng)險(xiǎn)注射到病人中。更嚴(yán)重地，親和力減小的抗體的生物功能如補(bǔ)體裂 解 、抗體依賴的細(xì)胞毒性或病毒中和作用較差。因而，對(duì)基于人源化的治療或診斷應(yīng)用有用 的任何最后抗體的結(jié)構(gòu)都是當(dāng)前不可預(yù)知的，通常需要數(shù)個(gè)技術(shù)的多次重復(fù)和應(yīng)用從而獲 得有用的人源化抗體。需要可用于診斷和/或治療方法中的可替換的和/或改進(jìn)的C5aR拮抗劑。特別 地，需要開發(fā)用于所述人的診斷和/或治療方法的適宜的人源化抗_C5aR抗體。

發(fā)明內(nèi)容
已生產(chǎn)了大量結(jié)合C5aR的人源化抗體，但具有結(jié)合特異性差和/或其他不期望的 特性。然而，本發(fā)明的發(fā)明人生產(chǎn)了幾種相關(guān)的人源化抗體，其具有用于人的診斷和/或治 療方法的合適活性。第一方面，本發(fā)明提供了基本上純化的和/或重組的人源化抗體，其包含i)包含可變區(qū)的免疫球蛋白輕鏈，該可變區(qū)包含與SEQ ID N0:31、SEQ ID NO :32、 SEQ ID NO 33和SEQ ID NO 48中的一個(gè)或多個(gè)序列至少93%相同的氨基酸序列，和/或ii)包含可變區(qū)的免疫球蛋白重鏈，該可變區(qū)包含與SEQ ID N0:34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID N0:36和SEQ ID NO :39中的一個(gè)或多個(gè)序列至少90%相同的氨基酸序列，其中該抗體結(jié)合人C5aR。在優(yōu)選的實(shí)施例中，免疫球蛋白重鏈包含可變區(qū)，該可變區(qū)包含選自由SEQ ID NO :34、SEQ ID NO 35和SEQ ID NO 36組成的組的氨基酸序列。更優(yōu)選地，免疫球蛋白重 鏈包含可變區(qū)，該可變區(qū)包含由SEQ ID NO :36提供的氨基酸序列。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，免疫球蛋白輕鏈包含可變區(qū)，該可變區(qū)包含選自由SEQ ID NO :3USEQ ID N0:32和SEQ ID NO :33組成的組的氨基酸序列。更優(yōu)選地，免疫球蛋白 輕鏈包含可變區(qū)，該可變區(qū)包含由SEQ ID NO :31提供的氨基酸序列。在特別優(yōu)選的實(shí)施例中，免疫球蛋白輕鏈包含可變區(qū)，該可變區(qū)包含由SEQ ID NO :31提供的氨基酸序列，而免疫球蛋白重鏈包含可變區(qū)，該可變區(qū)包含由SEQ ID NO 36 提供的氨基酸序列。優(yōu)選地，免疫球蛋白輕鏈包含恒定區(qū)，該恒定區(qū)包含由SEQ ID N0:41 提供的氨基酸序列，而免疫球蛋白重鏈包含恒定區(qū)，該恒定區(qū)包含由SEQ ID NO 42, SEQ ID NO 43, SEQ ID NO 44或SEQ ID NO :45提供的氨基酸序列。更優(yōu)選地，免疫球蛋白輕鏈包 含恒定區(qū)，該恒定區(qū)包含由SEQ ID NO :41提供的氨基酸序列，而免疫球蛋白重鏈包含恒定 區(qū)，該恒定區(qū)包含由SEQ ID N0:43或SEQ ID NO :45提供的氨基酸序列，更優(yōu)選SEQ ID N0: 45。在一個(gè)實(shí)施例中，免疫球蛋白輕鏈包含可變區(qū)，該可變區(qū)包含由SEQ ID N0:31提 供的氨基酸序列，而免疫球蛋白重鏈包含可變區(qū)，該可變區(qū)包含由SEQ ID N0:34提供的氨基酸序列。優(yōu)選地，免疫球蛋白輕鏈包含恒定區(qū)，該恒定區(qū)包含由SEQ ID N0:41提供的氨 基酸序列，而免疫球蛋白重鏈包含恒定區(qū)，該恒定區(qū)包含由SEQ ID N0:42或SEQ ID NO 43 提供的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施例中，免疫球蛋白輕鏈包含可變區(qū)，該可變區(qū)包含由SEQ ID N0:32 提供的氨基酸序列，而免疫球蛋白重鏈包含可變區(qū)，該可變區(qū)包含由SEQ ID N0:34提供的 氨基酸序列。優(yōu)選地，免疫球蛋白輕鏈包含恒定區(qū)，該恒定區(qū)包含由SEQ ID N0:41提供的 氨基酸序列，而免疫球蛋白重鏈包含恒定區(qū)，該恒定區(qū)包含由SEQ ID N0:42或SEQ ID NO 43提供的氨基酸序列。
在進(jìn)一步的實(shí)施例中，免疫球蛋白輕鏈包含可變區(qū)，該可變區(qū)包含由SEQ ID NO: 33提供的氨基酸序列，而免疫球蛋白重鏈包含可變區(qū)，該可變區(qū)包含由SEQ ID N0:34提供 的氨基酸序列。優(yōu)選地，免疫球蛋白輕鏈包含恒定區(qū)，該恒定區(qū)包含由SEQ ID N0:41提供 的氨基酸序列，而免疫球蛋白重鏈包含恒定區(qū)，該恒定區(qū)包含由SEQ ID N0:42、SEQ ID NO: 43或SEQ ID NO :44提供的氨基酸序列。在又一個(gè)實(shí)施例中，免疫球蛋白輕鏈包含可變區(qū)，該可變區(qū)包含由SEQ ID N0:31 提供的氨基酸序列，而免疫球蛋白重鏈包含可變區(qū)，該可變區(qū)包含由SEQ ID N0:35提供的 氨基酸序列。優(yōu)選地，免疫球蛋白輕鏈包含恒定區(qū)，該恒定區(qū)包含由SEQ ID N0:41提供的氨 基酸序列，而免疫球蛋白重鏈包含恒定區(qū)，該恒定區(qū)包含由SEQ ID N0:42、SEQ ID NO :43、 SEQ ID N0:44或SEQ ID NO :45提供的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施例中，免疫球蛋白輕鏈包含可變區(qū)，該可變區(qū)包含由SEQ ID NO 32 提供的氨基酸序列，而免疫球蛋白重鏈包含可變區(qū)，該可變區(qū)包含由SEQ ID N0:35提供的 氨基酸序列。優(yōu)選地，免疫球蛋白輕鏈包含恒定區(qū)，該恒定區(qū)包含由SEQ ID N0:41提供的 氨基酸序列，而免疫球蛋白重鏈包含恒定區(qū)，該恒定區(qū)包含由SEQ ID N0:43提供的氨基酸 序列。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，免疫球蛋白輕鏈包含可變區(qū)，該可變區(qū)包含由SEQ ID NO: 33提供的氨基酸序列，而免疫球蛋白重鏈包含可變區(qū)，該可變區(qū)包含由SEQ ID N0:35提供 的氨基酸序列。優(yōu)選地，免疫球蛋白輕鏈包含恒定區(qū)，該恒定區(qū)包含由SEQ ID N0:41提供 的氨基酸序列，而免疫球蛋白重鏈包含恒定區(qū)，該恒定區(qū)包含由SEQ ID N0:43提供的氨基 酸序列。在另一個(gè)的實(shí)施例中，免疫球蛋白輕鏈包含可變區(qū)，該可變區(qū)包含由SEQ ID NO: 32提供的氨基酸序列，而免疫球蛋白重鏈包含可變區(qū)，該可變區(qū)包含由SEQ ID N0:36提供 的氨基酸序列。優(yōu)選地，免疫球蛋白輕鏈包含恒定區(qū)，該恒定區(qū)包含由SEQ ID N0:41提供 的氨基酸序列，而免疫球蛋白重鏈包含恒定區(qū)，該恒定區(qū)包含由SEQ ID N0:43提供的氨基 酸序列。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，免疫球蛋白輕鏈包含可變區(qū)，該可變區(qū)包含由SEQ ID N0: 33提供的氨基酸序列，而免疫球蛋白重鏈包含可變區(qū)，該可變區(qū)包含由SEQ ID N0:36提供 的氨基酸序列。優(yōu)選地，免疫球蛋白輕鏈包含恒定區(qū)，該恒定區(qū)包含由SEQ ID N0:41提供 的氨基酸序列，而免疫球蛋白重鏈包含恒定區(qū)，該恒定區(qū)包含由SEQ ID N0:43提供的氨基 酸序列。在優(yōu)選的實(shí)施例中，該抗體可在人C5aR的第二細(xì)胞外環(huán)上結(jié)合抗原表位EEYFPP (SEQ ID NO 38)。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，該抗體沒(méi)有在人C5aR的N-末端上可檢測(cè) 地結(jié)合抗原表位 PDYGHYDDKDTLDLNTPVDKT (SEQ ID NO :59)。在優(yōu)選的實(shí)施例中，抗體結(jié)合人C5aR，該抗體的親和力至少在7F3的8倍以內(nèi)，更 優(yōu)選至少在7F3的4倍以內(nèi)，甚至更優(yōu)選在7F3的3倍以內(nèi)。在優(yōu)選的實(shí)施例中，對(duì)于表達(dá)人C5aR的人中性粒細(xì)胞而言，本發(fā)明抗體的EC5tl小 于4. 5nM。在可替換的實(shí)施例中，本發(fā)明抗體的EC5tl小于3nM，小于2nM，或小于I nM。用于 表達(dá)C5aR的人中性粒細(xì)胞抗體的EC5tl可按實(shí)施例3中描述的方法確定。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明抗體能夠使人中性粒細(xì)胞遷移降低至少40%，更優(yōu)選 至少50 %，更優(yōu)選至少60 %，更優(yōu)選至少70 %，以及甚至更優(yōu)選80 %。在進(jìn)一步的實(shí)施例 中，本發(fā)明抗體阻斷C5aR誘導(dǎo)的人中性粒細(xì)胞遷移的能力比7F3強(qiáng)，至少?gòu)?qiáng)2倍，甚至更優(yōu) 選強(qiáng)5倍。人中性粒細(xì)胞遷移的降低可按實(shí)施例5中描述的方法確定。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，本發(fā)明抗體沒(méi)有可檢測(cè)地活化人中性粒細(xì)胞。中性粒細(xì)胞 活化可通過(guò)分析⑶62L和⑶lib表達(dá)，和/或超氧化物產(chǎn)生確定，如實(shí)施例7中所述。在又一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明抗體沒(méi)有可檢測(cè)地消耗(deplete)回體法中來(lái)自血液 的中性粒細(xì)胞或單核細(xì)胞?；伢w法中(ex vivo)中性粒細(xì)胞或單核細(xì)胞的消耗可按實(shí)施例 8和9中描述的方法確定。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，本發(fā)明抗體能夠阻斷C5a誘導(dǎo)的Ca2+向人中性粒細(xì)胞的 流入，抗體的濃度小于30 μ g/mL,更優(yōu)選小于10 μ g/mL,更優(yōu)選小于5 μ g/mL,更優(yōu)選小于 1 μ g/mL。阻斷C5a誘導(dǎo)的Ca2+流入人中性粒細(xì)胞可按實(shí)施例6中描述的方法確定。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明抗體是非消耗性(non-d印leting)和非活化性 (non-activating)的。此處描述的此種抗體的實(shí)施例是hAb_Q。在可替換的實(shí)施例中，本 發(fā)明的抗體是消耗性的和非活化性的。此處描述的此種抗體的實(shí)施例是hAb-N。在優(yōu)選的實(shí)施例中，i)免疫球蛋白輕鏈包含恒定區(qū)，該恒定區(qū)包含與SEQ ID NO 40和SEQ ID NO 41 中的一個(gè)或多個(gè)序列至少90%相同的氨基酸序列，和ii)免疫球蛋白重鏈包含恒定區(qū)，該恒定區(qū)包含與SEQ ID NO 42、SEQ ID NO :43、 SEQ ID N0:44和SEQ ID NO :45中的一個(gè)或多個(gè)序列至少90%相同的氨基酸序列，更優(yōu)選 地，i)免疫球蛋白輕鏈包含恒定區(qū)，該恒定區(qū)包含與SEQ ID :41至少90%相同的氨基 酸序列，和ii)免疫球蛋白重鏈包含恒定區(qū)，該恒定區(qū)包含與SEQ ID NO :45至少90%相同的
氨基酸序列。人源化抗體可以是本領(lǐng)域中已知的任何適宜的結(jié)構(gòu)。實(shí)施例包括，但不限于， 由兩條重鏈和兩條輕鏈組成的四多肽鏈結(jié)構(gòu)、單鏈抗體、雙鏈抗體(diabody)、三鏈抗體 (triabody)或四鏈抗體(tetrabody)，以及抗體片段，例如，但不限于Fab片段或單域抗體。另一方面，本發(fā)明提供了包含可變區(qū)的基本上純化的和/或重組的免疫球蛋白輕 鏈，該可變區(qū)包含與 SEQ ID N0:31、SEQ ID NO 32、SEQ ID N0:33 禾口 SEQ ID N0:48 中的一 個(gè)或多個(gè)序列至少93%相同的氨基酸序列。在優(yōu)選的實(shí)施例中，免疫球蛋白輕鏈包含可變區(qū)，該可變區(qū)包含與SEQ ID N0:31至少93%相同的氨基酸序列。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，本發(fā)明提供了包含可變區(qū)的基本上純化的和/或重組的免 疫球蛋白重鏈，該可變區(qū)包含與SEQ ID N0:34、SEQ ID NO 35、SEQ ID NO 36和SEQ ID NO 39中一個(gè)或多個(gè)序列至少90%相同的氨基酸序列。
在優(yōu)選的實(shí)施例中，免疫球蛋白重鏈包含可變區(qū)，該可變區(qū)包含與SEQ ID NO 36 至少90%相同的氨基酸序列。另一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明免疫球蛋白輕鏈和/或本發(fā)明免疫球蛋白重 鏈的基本上純化的和/或重組的抗體，其中該抗體可結(jié)合人C5aR。也提供了包含本發(fā)明抗體和直接或間接結(jié)合到抗體的治療劑的結(jié)合物。治療劑的 實(shí)施例包括，但不限于，細(xì)胞毒素、放射性同位素(例如，碘-131、釔-90或銦-111)、免疫調(diào) 節(jié)藥劑、抗血管新生(angiogenic)藥劑、抗-新血管形成和/或其他血管形成藥劑、毒素、 抗-增殖藥劑、促凋亡(Pro-apoptotic)藥劑、化療劑，和治療核酸。在一個(gè)實(shí)施例中，毒素是假單胞桿菌(綠膿桿菌，Pseudomonas)外毒素或其衍生 物。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，治療劑經(jīng)由接頭(linker)間接結(jié)合到抗體。實(shí)施例包 括，但不限于4-(4'乙?；窖趸?丁酸(AcBut)、3_乙?；交嵝运?AcPac)、4-巰 基-4-甲基-戊酸(酰胺)和其衍生物。另一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明抗體和直接或間接結(jié)合到抗體的可檢測(cè)標(biāo)簽 的結(jié)合物。適宜的標(biāo)簽的實(shí)施例包括，但不限于，放射性標(biāo)簽、熒光標(biāo)簽、酶標(biāo)簽和顯像劑 (成像劑)。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明抗體或其鏈、本發(fā)明的免疫球蛋白輕 鏈、本發(fā)明的免疫球蛋白重鏈和/或本發(fā)明的結(jié)合物的分離的和/或外源的多核苷酸。優(yōu)選地，該多核苷酸包含由SEQ ID NO 52 57中任一個(gè)提供的序列。另一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明多核苷酸的載體。優(yōu)選地，該載體是表達(dá)載 體。更優(yōu)選地，該多核苷酸可操作地連接到啟動(dòng)子。另一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明多核苷酸和/或本發(fā)明載體的宿主細(xì)胞。該 宿主細(xì)胞可以是任何細(xì)胞類型，例如細(xì)菌、酵母、植物或動(dòng)物細(xì)胞。也提供了包含本發(fā)明細(xì)胞的非人轉(zhuǎn)基因生物。也提供了組合物，該組合物包含本發(fā)明抗體、本發(fā)明免疫球蛋白輕鏈、本發(fā)明的免 疫球蛋白重鏈、本發(fā)明結(jié)合物、本發(fā)明多核苷酸、本發(fā)明載體和/或本發(fā)明宿主細(xì)胞，以及 藥用載體(carrier)。另一方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)抗體的方法，該方法包含培養(yǎng)本發(fā)明宿主細(xì)胞以表 達(dá)多核苷酸和生產(chǎn)該抗體，其中宿主細(xì)胞包含至少一種本發(fā)明的多核苷酸。在一個(gè)實(shí)施例中，免疫球蛋白輕鏈和免疫球蛋白重鏈被一個(gè)連續(xù)多核苷酸上的兩 個(gè)分開的開放閱讀框編碼。優(yōu)選地，該方法進(jìn)一步包含從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中回收(recover)抗體。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了抑制人C5aR與其配體相互作用的方法，該方法包 含使該細(xì)胞暴露到本發(fā)明抗體或本發(fā)明結(jié)合物中。優(yōu)選地，該配體是人C5a。
優(yōu)選地，該抗體或結(jié)合物可阻止至少一些配體結(jié)合到該細(xì)胞。另一方面，本發(fā)明提供了抑制細(xì)胞中人C5aR活性的方法，該方法包含使細(xì)胞暴露 到本發(fā)明抗體或本發(fā)明結(jié)合物中。關(guān)于前述兩個(gè)方面，該方法可在體外或體內(nèi)執(zhí)行。另一方面，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防對(duì)象中病癥的方法，該方法包含給予所述對(duì) 象本發(fā)明的抗體、本發(fā)明的結(jié)合物、本發(fā)明的多核苷酸、本發(fā)明的載體、本發(fā)明的宿主細(xì)胞 和/或本發(fā)明的組合物。在一個(gè)實(shí)施例中，該病癥是免疫病態(tài)病癥，例如自身免疫疾病。在另一個(gè)實(shí)施例中，該病癥是炎性疾病，例如急性炎癥或慢性炎 癥。在另一個(gè)實(shí)施例中，免疫病態(tài)病癥或炎性疾病涉及白細(xì)胞遷移和/或白細(xì)胞活 化。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，免疫病態(tài)病癥或炎性疾病涉及補(bǔ)體活化?？杀恢委熁蝾A(yù)防的病癥實(shí)例包括，但不限于，過(guò)敏性鼻炎、肺過(guò)敏、超敏感性肺炎、 間質(zhì)性肺病、過(guò)敏性反應(yīng)、超敏感性反應(yīng)、藥物過(guò)敏、昆蟲叮咬過(guò)敏、炎性腸病、脊柱關(guān)節(jié)病、 硬皮病、牛皮癬、皮炎、濕疹、特應(yīng)性皮炎、變應(yīng)性接觸性皮炎、風(fēng)疹、血管炎、關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性 硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、重癥肌無(wú)力、青少年型糖尿病、腎炎、自身免疫性甲狀腺炎、白塞氏 病(Behcet' s disease)、移植排斥、動(dòng)脈硬化癥、具有皮膚或器官的白細(xì)胞浸潤(rùn)的癌癥、、 再灌注損傷、中風(fēng)、成人型呼吸窘迫綜合征、惡性血液病、細(xì)胞因子誘導(dǎo)毒性、多肌炎、皮肌 炎、類天皰瘡、阿爾茨海默氏病(Alzheimers diseas)、肉芽腫性疾病、血友病滑膜炎、痛風(fēng)、 與感染有關(guān)的不良炎性反應(yīng)、SAR、敗血癥、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、抗 磷脂綜合征、年齡相關(guān)性黃斑變性、膜性增生性腎小球腎炎和致密沉積物病。本發(fā)明的方法可與其他已知治療聯(lián)合進(jìn)行。因而，在實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括 給予至少一種其他化合物，用以治療或預(yù)防病癥。此種其他治療可同時(shí)提供或相繼提供。技術(shù)人員(addressee)應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)給予對(duì)象本發(fā)明的多核苷酸、本發(fā)明的載體 和/或宿主細(xì)胞時(shí)，將在適當(dāng)條件下，使得抗體或結(jié)合物在體內(nèi)被表達(dá)。優(yōu)選地，該抗體、結(jié)合物、多核苷酸、載體和/或宿主細(xì)胞以本發(fā)明的組合物的形 式給予。另一方面，本發(fā)明提供了遞送治療劑到對(duì)象的炎癥部位的方法，該方法包括給予 所述對(duì)象本發(fā)明的結(jié)合物，或?yàn)榇司幋a的多核苷酸。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了將遺傳物質(zhì)引入到呈遞(present)C5aR細(xì)胞中的 方法，該方法包含使該細(xì)胞與根據(jù)本發(fā)明的抗體或本發(fā)明的結(jié)合物接觸，其中該抗體或結(jié) 合物結(jié)合到遺傳物質(zhì)或與遺傳物質(zhì)聯(lián)合。遺傳物質(zhì)的實(shí)例包括DNA、RNA或其組合。在優(yōu)選的實(shí)施例中，遺傳物質(zhì)是至少部 分雙鏈的DNA或至少部分雙鏈的RNA。在優(yōu)選的實(shí)施例中，呈遞C5aR的細(xì)胞選自由下列細(xì)胞組成的組白細(xì)胞，例如粒 細(xì)胞(例如，中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞)、單核細(xì)胞、肥大細(xì)胞和漿細(xì)胞 樣樹突狀細(xì)胞，以及組織中的免疫細(xì)胞，例如巨噬細(xì)胞(例如，小膠質(zhì)細(xì)胞、肝庫(kù)普弗細(xì)胞 (hepatic_Kupffer_cell)、腎小球系膜細(xì)胞)、B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、心 肌細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、滑膜細(xì)胞、關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞(artiCular_chrondocytes)、刺激肝細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞及胸腺細(xì)胞。在特別優(yōu)選的實(shí) 施例中，呈遞C5aR的細(xì)胞選自由下列細(xì)胞組成的組，即白細(xì)胞，例如粒細(xì)胞(例如，中性粒 細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞)、單核細(xì)胞、肥大細(xì)胞和漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞，及組織 中的免疫細(xì)胞，例如巨噬細(xì)胞(例如，小膠質(zhì)細(xì)胞、肝庫(kù)普弗細(xì)胞、腎小球系膜細(xì)胞)。又一方面，本發(fā)明提供了檢測(cè)樣品中人C5aR存在與否的方法，該方法包含使樣品 與本發(fā)明的抗體，和/或本發(fā)明的結(jié)合物接觸，并分析樣品中人C5aR與抗體或結(jié)合物的結(jié)
I=I ο 可被測(cè)試的適宜樣品的實(shí)例包括，但不一定局限于，血液、血清、血漿，及細(xì)胞或組 織活檢(tissue biopsy)。另一方面，本發(fā)明提供了診斷對(duì)象的病癥的方法，該方法包含使對(duì)象，或從其獲得 的樣品與本發(fā)明的抗體，或本發(fā)明的結(jié)合物接觸，并分析對(duì)象或樣品中人C5aR與抗體或結(jié) 合物的結(jié)合。因而，該方法可在體外或體內(nèi)進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施例中，使用組織學(xué)標(biāo)本或從對(duì)象獲得的組織或流體的亞組分在體外執(zhí) 行該方法。在另一個(gè)實(shí)施例中，該方法包含在可使抗體與對(duì)象中呈遞C5aR的細(xì)胞之間形成 復(fù)合物的條件下給予對(duì)象用顯像劑標(biāo)記的本發(fā)明抗體，并使該復(fù)合物顯像。優(yōu)選地，該病癥是免疫病態(tài)病癥。也提供了本發(fā)明的抗體、本發(fā)明的結(jié)合物、本發(fā)明的多核苷酸、本發(fā)明的載體、本 發(fā)明的宿主細(xì)胞和/或本發(fā)明的組合物在制備用于治療或預(yù)防對(duì)象中的病癥的藥物方面 的用途。也提供了本發(fā)明的結(jié)合物或?yàn)榇司幋a的多核苷酸在制備用于將治療劑遞送到對(duì) 象的炎癥部位的藥物方面的用途。也提供了本發(fā)明的抗體、本發(fā)明的結(jié)合物、本發(fā)明的多核苷酸、本發(fā)明的載體、本 發(fā)明的宿主細(xì)胞和/或本發(fā)明的組合物作為治療或預(yù)防對(duì)象中的病癥的藥物的用途。也提供了本發(fā)明的結(jié)合物或?yàn)榇司幋a的多核苷酸作為將治療劑遞送到對(duì)象的炎 癥部位的藥物的用途。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了試劑盒，該試劑盒包含本發(fā)明的抗體、本發(fā)明的結(jié) 合物、本發(fā)明的多核苷酸、本發(fā)明的載體、本發(fā)明的宿主細(xì)胞和/或本發(fā)明的組合物。顯而易見(jiàn)地，本發(fā)明一方面的優(yōu)選特征和特性也適用于本發(fā)明的許多其他方面。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在本發(fā)明的許多方面，優(yōu)選定義的分子(抗體或免疫球蛋白 等)基本上由，或與包含所述序列相比，更優(yōu)選由指定的SEQ ID NO序列組成。下文通過(guò)下面非限制性實(shí)施例并參考附圖描述本發(fā)明。


圖1.與小鼠7F3輕鏈Vk區(qū)的同源性最高的人Ig輕鏈序列的ClustalW比對(duì)?？?出了 7F3定義的CDR。示出了共有框架序列(consensus framework序列)，hVkFW Cons。圖2.與小鼠7F3重鏈Vh序列同源性最高的人Ig重鏈V區(qū)序列㈧和J區(qū)序列 (B)的ClustalW比對(duì)。框出了定義為7F3的⑶R。示出的V區(qū)的共有框架序列(hVhvFWCons)和J區(qū)的共有框架序列(hVhjFW Cons)相連，從而創(chuàng)建共有序列(hVhFW Cons)，用于 移植7F3⑶R(注意D區(qū)包含在⑶R-H3內(nèi))。圖3.圖1中的共有人Vk框架序列與小鼠7F3Vk序列的比對(duì)用于創(chuàng)建人源化7F3Vk 輕鏈序列，h7Vk。小鼠7F3⑶R(框出的)被移植到hVkFW共有框架序列中。星號(hào)標(biāo)記的三 個(gè)氨基酸回復(fù)突變?yōu)樾∈?F3框架序列。圖4.人RN0K203VL序列與小鼠7F3Vk序列的比對(duì)用于創(chuàng)建人源化的7F3Vk輕鏈 序列，h7aVk。小鼠7F3CDR (框出的)被移植到RN0K203VL框架序列中。圖5. KV2F-人源的VLCD18-Q序列與小鼠7F3Vk序列的比對(duì)用于創(chuàng)建人源化的 7F3Vk輕鏈序列，h7bVk。小鼠7F3⑶R (框出的)被移植到VIXD18-Q框架序列中。 圖6.人源化7F3Vk序列與小鼠7F3Vk序列的比對(duì)。共有序列h7F3VkCons是三個(gè) 人源化序列的共有序列?？虺隽?CDR。人源化7F3Vk序列之間的差異由黑色背景上的白色 字體表示。圖7.圖2A和2B中共有的人Vh框架序列與小鼠7F3Vh序列的比對(duì)用于創(chuàng)建人源 化7F3Vh重鏈序列，h7Vh。小鼠7F3⑶R (框出的)被移植到hVhFW共有的框架序列中。星 號(hào)(*)標(biāo)記的氨基酸回復(fù)突變?yōu)樾∈?F3框架序列。用#標(biāo)記的氨基酸突變成替代殘基 (alternate residue),如文中討論的。圖8.人SGI-VH序列與小鼠7F3Vh序列的比對(duì)用于創(chuàng)建人源化7F3Vh重鏈序列， h7aVh。小鼠7F3⑶R(框出的)被移植到SGI-VH框架序列中。星號(hào)(*)標(biāo)記的氨基酸回復(fù) 突變?yōu)樾∈?F3框架序列。圖9.人HG3序列與小鼠7F3Vh序列的比對(duì)用于創(chuàng)建人源化的7F3Vh重鏈序列， h7bVh。小鼠7F3⑶R(框出的)被移植到HG3框架序列中。星號(hào)(*)標(biāo)記的氨基酸回復(fù)突 變?yōu)樾∈?F3框架序列。圖10.人源化7F3Vh序列與小鼠7F3Vh序列的比對(duì)。共有序列h7F3VhCons是三 個(gè)人源化序列的共有序列?？虺隽?CDR。人源化7F3Vh序列之間的差異由黑色背景上的白 色字體表示。圖11.競(jìng)爭(zhēng)性配體結(jié)合試驗(yàn)，該試驗(yàn)比較了人源化7F3抗體和小鼠7F3從人中性 粒細(xì)胞上hC5aR中取代125I_C5a的能力。圖12.競(jìng)爭(zhēng)性配體結(jié)合試驗(yàn)，該試驗(yàn)比較了人源化7F3抗體和小鼠7F3從Li. 2/ hC5aR轉(zhuǎn)染子上hC5aR中取代125I_C5a的能力。圖13.在4°C下抗_C5aR抗體對(duì)人中性粒細(xì)胞的飽和結(jié)合，用Iogltl (上方圖(top panel))和線性(下方圖(bottom panel))比例對(duì)χ-軸作圖。圖14.肽ELISA 人源化抗_C5aR抗體hAb_J(圖A)和hAb_Q(圖B)對(duì)一系列重 疊肽(no. 1-22)的結(jié)合，該重疊肽包含來(lái)自人C5aR的第二個(gè)細(xì)胞外環(huán)的12mer序列(每個(gè) 被一個(gè)偏移)，和包含來(lái)自SEQ ID NO :37(no. 23)的殘基173-205的33mer。hAb_J(圖C) 和hAb-Q(圖D)與來(lái)自人C5aR(n0.Al)的第二個(gè)細(xì)胞外環(huán)的12mer序列的結(jié)合，一系列突 變肽(no.A2-A13)包含帶有單個(gè)Ala突變和雜亂(scrambled)肽(no. A14)的12mer。圖15.在不同稀釋度下，人源化抗_C5aR mAb hAb_J和Q或抗_C5aR mAb S5/l(在 5 μ g/ml)與包被在ELISA板上的肽PEPl (SEQID NO 37的殘基9-29)的結(jié)合。圖16.化學(xué)趨化試驗(yàn)在5 μ g/ml 7F3和各種人源化7F3抗體的存在下人中性粒細(xì)胞向InM C5a的遷移。圖17.抗_C5aR抗體hAb_Q(閉合菱形，closed diamond)和7F3 (開放方形)對(duì) C5a誘導(dǎo)的人中性粒細(xì)胞的化學(xué)趨化的抑制。4個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的平均(士sem)結(jié)果表示為無(wú) 抗體對(duì)照樣本(上圖)的最大遷移的百分比，或表示為遷移細(xì)胞(下圖)的平均數(shù)目。X軸 上的單位是Iog10U g/ml的Ab濃度，。圖18.親本小鼠抗體7F3和人源化抗體J和Q對(duì)C5a定向的hC5aR/Ll. 2轉(zhuǎn)染子 細(xì)胞遷移的抑制。圖19.在與高濃度的人源化抗_C5aR抗體hAb-Q—起孵育之后C5a誘導(dǎo)的人中性 粒細(xì)胞的化學(xué)趨化被抑制。圖20.在C5a誘導(dǎo)的與各種濃度的人源化抗_C5aR抗體hAb-Q預(yù)孵育細(xì)胞的化學(xué) 趨化之前和之后，在游離C5aR和人中性粒細(xì)胞上結(jié)合的抗_C5aR抗體hAb-Q水平之間觀測(cè) 到的反比關(guān)系。圖21.人中性粒細(xì)胞上結(jié)合的抗_C5aR抗體hAb_Q水平(C5a誘導(dǎo)的化學(xué)趨 化之 前和之后)與各種濃度的人源化抗_C5aR抗體hAb-Q預(yù)孵育的細(xì)胞遷移的抑制之間觀測(cè)到 的關(guān)系。圖22. C5a誘導(dǎo)的⑶lib在與各種濃度的人源化抗_C5aR抗體hAb_Q預(yù)孵育的人 中性粒細(xì)胞上的表達(dá)的抑制。圖23. C5a誘導(dǎo)的⑶62L在與各種濃度的人源化抗_C5aR抗體hAb_Q預(yù)孵育的人 中性粒細(xì)胞上的下調(diào)的抑制。圖24.在人全血與人源化抗_C5aR抗體hAb_Q和hAb_J、PBS或粒細(xì)胞活化劑fMLP 一起孵育1小時(shí)之后，中性粒細(xì)胞上⑶llb(圖A)和⑶62L(圖B)的表達(dá)。圖25.在人全血與人源化抗_C5aR抗體hAb_G或hAb_J或C5a —起孵育20分鐘 之后，相對(duì)PBS對(duì)照，中性粒細(xì)胞上⑶lib (圖A)和⑶62L(圖B)的表達(dá)。圖26.在與hAb-Q、單獨(dú)的hlgG同種型對(duì)照抗體，或hlgG抗體加IOOnM人C5a — 起孵育的人全血中，以相對(duì)CDllb表達(dá)(圖A)和CD62L表達(dá)(圖B)中的變化表示的中性 粒細(xì)胞的活化。圖27.1^13-0(稱為抗義5池ab)自身沒(méi)有刺激結(jié)合在固體載體上的人中性粒細(xì)胞 從而生產(chǎn)超氧化物，但可阻礙C5a引起的生產(chǎn)。圖28.與人源化抗_C5aR抗體hAb-Q或?qū)φ?利妥昔，不相關(guān)的人IgG4，PBS)回體 法中孵育4小時(shí)之后，每毫升人血液中B細(xì)胞、單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的平均數(shù)目(士sd)。圖29.與人源化抗_C5aR抗體hAb_Q或?qū)φ?利妥昔，不相關(guān)的人IgG4)回體法 中孵育4小時(shí)之后，相對(duì)每毫升人血液中B細(xì)胞、單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的PBS對(duì)照的平均 消耗(士sd)百分?jǐn)?shù)。圖30.在存在1 %兔補(bǔ)體的情況下，與100 μ g/ml hAb-Q,利妥昔和hIgG4或 20 μ g/ml多克隆抗_C5aR抗體孵育之后，特異性CDC(% ToPro3+ve (Iysed) Ramos E2細(xì) 胞)。圖31.在存在10%人血清的情況下，與1-100 μ g/ml hAb_Q、利妥昔和hIgG4孵育 之后，特異性CDC(不可存活的Ramos E2細(xì)胞％ )。與10%熱滅活的牛血清的每個(gè)樣品的 非特異性裂解已被扣除。
圖32.特異性ADCC(在扣除‘僅有介質(zhì)’和‘僅有靶’背景之后，‘靶+效應(yīng)子’樣 品中的靶細(xì)胞裂解％ )與人PBMC效應(yīng)細(xì)胞及100 μ g/ml抗體在帶有10%熱滅活的胎牛血 清的介質(zhì)中孵育之后，不可存活的(TP3+ve) Ramos E2靶細(xì)胞％。
圖33.特異性ADCC(在扣除‘僅有介質(zhì)’和‘僅有靶’背景之后，‘靶+效應(yīng)子’樣 品中的靶細(xì)胞裂解％ )與人供體PBMC效應(yīng)細(xì)胞及1-100 μ g/ml抗體在帶有10%人供體血 清的介質(zhì)中孵育之后，不可存活的(TP3+ve) Ramos E2靶細(xì)胞％。圖34.在炎性關(guān)節(jié)炎模型中的疾病進(jìn)展。在腹腔給藥10mg/kg抗_hC5aR抗體G、M 和N之后第5天，組中平均臨床得分的變化表明K/BxN血清誘導(dǎo)的hC5aR敲入(knock-in) 小鼠(每組η = 6)中炎癥逆轉(zhuǎn)。圖35.在炎性關(guān)節(jié)炎模型中的疾病進(jìn)展。在腹腔給藥l-10mg/kg抗_hC5aR抗體C 和J之后第5天，組中平均臨床得分的變化表明K/BxN血清誘導(dǎo)的hC5aR敲入小鼠(每組 η = 4-5)中炎癥逆轉(zhuǎn)。圖36.在炎性關(guān)節(jié)炎模型中的疾病進(jìn)展。在腹腔給藥l-10mg/kg hAb-Q之后第5 天，組中爪尺寸平均變化(A)和平均臨床得分(B)的平均變化表明K/BxN血清誘導(dǎo)的hC5aR 敲入小鼠(每組η = 10+)中炎癥逆轉(zhuǎn)。圖37.體內(nèi)給予各種劑量的人源化抗_C5aR抗體、對(duì)照抗體或PBS之后，隨著時(shí)間 的推移占位(occupied)的C5aR的水平。圖38.體內(nèi)給予各種劑量的人源化抗_C5aR抗體、對(duì)照抗體或PBS之后，隨著時(shí)間 的推移游離的C5aR水平。圖39.在治療性地給予帶有關(guān)節(jié)炎癥的小鼠后第5天，hAb-Q隨時(shí)間推移的血清 濃度。圖40.臨床得分(爪和關(guān)節(jié)炎癥水平)、在第0和2天用K/BxN血清注射，和在第 5天用10mg/kg人源化抗_C5aR抗體注射的小鼠中占位的C5a受體水平和hAb-Q的血清濃 度之間的關(guān)系。圖41.臨床得分(爪和關(guān)節(jié)炎癥水平)、在第0和2天用K/BxN血清注射，和在第 5天用3mg/kg人源化抗_C5aR抗體注射的小鼠中占位的C5a受體水平和hAb-Q的血清濃度 之間的關(guān)系。圖42.臨床得分(爪和關(guān)節(jié)炎癥水平)、在第0和2天用K/BxN血清注射，和在第 5天用lmg/kg人源化抗_C5aR抗體注射的小鼠中占位的C5a受體水平和hAb-Q的血清濃度 之間的關(guān)系。圖43.在轉(zhuǎn)基因小鼠的毒理研究和藥理研究中，hAb-Q的整合PK/PD模型的圖解表不。圖44.在毒理研究(圖中以Tox表示)和藥理研究(圖中以KRN表示)中，對(duì)于 hAb-Q(稱為抗_C5aR ab)的各種靜脈給藥、皮下給藥，和腹腔給藥劑量，相對(duì)時(shí)間預(yù)測(cè)的和 觀測(cè)到的濃度(左)和占位(右)。對(duì)于毒理研究，在第1天給藥之后和在第43天給藥之 后取PK樣品。第43天的數(shù)據(jù)假定處于平穩(wěn)狀態(tài)，并持續(xù)到第六次之后。平均組值菱形， 單個(gè)小鼠開放圓圈，通過(guò)靶隔室(target compartment)的模型擬合粗線。圖45.在藥理研究中，用于hAb-Q對(duì)實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的抑制效果的PK/PD模型 的圖解表示。這個(gè)模型并入了圖43中示出的PK/PD模型中計(jì)算的占位率。
圖46.在轉(zhuǎn)基因小鼠中在第0天發(fā)炎，在第5天以不同的劑量hAb-Q腹腔給藥之 后，相對(duì)時(shí)間，占位率(左)和爪尺寸變化(右)。平均組測(cè)量彩色的實(shí)線菱形，單個(gè)小鼠 值彩色的開放圓圈。每組中的模型擬合彩線。圖47.應(yīng)用于人預(yù)測(cè)的PK/PD模型的圖解表示。該模型由利用用靶介導(dǎo)的處理擴(kuò) 大的典型IgG參數(shù)的兩區(qū)室模型組成。Vl=中間體積。V2=周邊體積。CL=清除率。Q =分配清除率。kof/kon=締合/解離的速率常數(shù)。逆轉(zhuǎn)(turnover)=更新靶和除去結(jié)合 抗體所需的時(shí)間。兩個(gè)靶區(qū)室用于反映被認(rèn)為在血液內(nèi)部分配和在血液外部分配的靶。圖48.在抗_C5aR(hAb-Q)的靜脈給藥之后，用于藥物動(dòng)力學(xué)(左)和占位率(右) 的模型預(yù)測(cè)。最低量化限由水平線表示。圖49.在抗_C5aR(hAb-Q)的皮下給藥之后，用于藥物動(dòng)力學(xué)(左)和占位率(右) 的模型預(yù)測(cè)。最低量化限由水平線表示。序列表說(shuō)明 SEQ ID NO :1_7F3可變輕鏈蛋白序列。SEQ ID NO :2_7F3可變重鏈蛋白序列。SEQ ID NO :3_7F3可變輕鏈編碼序列。SEQ ID NO :4_7F3可變重鏈編碼序列。SEQ ID NO :5_KV2F_人的人輕鏈可變區(qū)。SEQ ID NO :6_KV2E_人的人輕鏈可變區(qū)。SEQ ID NO :7_KV2D_人的人輕鏈可變區(qū)。SEQ ID NO :8_KV2B_人的人輕鏈可變區(qū)。SEQ ID NO :9_KV2A_人的人輕鏈可變區(qū)。SEQ ID N0:10-X12691 的人輕鏈可變區(qū)。SEQ ID NO :11-U41645 的人輕鏈可變區(qū)。SEQ ID NO :12_U41644 的人輕鏈可變區(qū)。SEQ ID NO :13_M31952 的人輕鏈可變區(qū)。SEQ ID NO 14-人輕鏈可變序列的hVkFW Cons共有序列，如圖1中提供的。SEQ ID NO :15_HvlAv_人的人重鏈可變區(qū)。SEQ ID NO :16_HvlBv_人的人重鏈可變區(qū)。SEQ ID NO :17_HvlCv_人的人重鏈可變區(qū)。SEQ ID NO :18_HvlGv_人的人重鏈可變區(qū)。SEQ ID NO :19_M99641. aa 的人重鏈可變區(qū)。SEQ ID NO :20-M99642. aa 的人重鏈可變區(qū)。SEQ ID NO :21-X62109. aa 的人重鏈可變區(qū)。SEQ ID NO :22_X92343. aa 的人重鏈可變區(qū)。SEQ ID NO :23_Z12305. aa 的人重鏈可變區(qū)。SEQ ID NO 24~人重鏈可變(V)區(qū)序列的hVhvFW Cons共有序列，如圖2A中提供 的。SEQ ID NO :25_Hvl Cj_人的人重鏈連接區(qū)。SEQ ID NO :26_Hv2I j_人的人重鏈連接區(qū)。
SEQ ID NO :27_Hv3Hj_人的人重鏈連接區(qū)。SEQ ID NO :28_Hv3Kj_人的人重鏈連接區(qū)。SEQ ID NO :29_Hv3Tj_人的人重鏈連接區(qū)。SEQ ID NO :30_人重鏈連接(J)區(qū)序列的hVhjFW Cons共有序列，如圖2B中提供 的。SEQ ID NO :31_人源化7F3 V區(qū)輕鏈h7Vk氨基酸序列。
SEQ ID NO :32_人源化7F3 V區(qū)輕鏈h7aVk氨基酸序列。SEQ ID NO :33_人源化7F3 V區(qū)輕鏈h7bVk氨基酸序列。SEQ ID NO :34_人源化7F3 V區(qū)重鏈h7Vh氨基酸序列。SEQ ID NO :35_人源化7F3 V區(qū)重鏈h7aVh氨基酸序列。SEQ ID NO :36_人源化7F3 V區(qū)重鏈h7bVh氨基酸序列。SEQ ID N0:37_ 人 C5aR。SEQ ID NO :38_人C5aR的第二細(xì)胞外環(huán)上的抗原表位。SEQ ID NO :39_本發(fā)明人源化7F3重鏈可變區(qū)的h7F3VhCons共有序列，如圖10所 提供的。SEQ ID NO :40_ 人輕鏈恒定區(qū) hC κ -R0SEQ ID Ν0:41-人輕鏈恒定區(qū) hCK。SEQ ID NO 42~ 人重鏈恒定區(qū) hC γ 4。SEQ ID NO :43_ 人重鏈恒定區(qū) hC γ 4ΡΕ。SEQ ID NO 44~ 人重鏈恒定區(qū) hCy I0SEQ ID NO :45_ 人重鏈恒定區(qū) hC γ 4p。SEQ ID NO :46_ 人源化 RN0K203VL 序列。SEQ ID NO :47_KV2F-人源的 VLCDl8-Q 序列。SEQ ID NO :48_本發(fā)明人源化7F3輕鏈可變區(qū)的h7F3VkCons共有序列，如圖6中 所提供的。SEQ ID NO :49-hVhFff Cons共有的人重鏈VJ框架序列SEQ ID NO 50-人 SGI-VH 序列。SEQ ID NO :51_ 人種系(germline) HG3 序列。SEQ ID NO :52_編碼人源化7F3V區(qū)輕鏈h7Vk氨基酸序列的多核苷酸序列。SEQ ID NO :53_編碼人源化7F3V區(qū)輕鏈h7aVk氨基酸序列的多核苷酸序列。SEQ ID NO :54_編碼人源化7F3V區(qū)輕鏈h7bVk氨基酸序列的多核苷酸序列。SEQ ID NO :55_編碼人源化7F3V區(qū)重鏈h7Vh氨基酸序列的多核苷酸序列。SEQ ID NO :56_編碼人源化7F3V區(qū)重鏈h7aVh氨基酸序列的多核苷酸序列。SEQ ID NO 57~編碼人源化7F3V區(qū)重鏈h7bVh氨基酸序列的多核苷酸序列。SEQ ID NO :58_人C5aR的第二細(xì)胞外環(huán)的片段。SEQ ID NO :59_人C5aR的N-末端細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的片段。
具體實(shí)施例方式一般技術(shù)
除非另外具體限定，在本文中使用的所有科技術(shù)語(yǔ)應(yīng)當(dāng)理解為與本領(lǐng)域中(即細(xì) 胞培養(yǎng)技術(shù)，分子遺傳學(xué)、抗體技術(shù)、免疫學(xué)、免疫組織化學(xué)、蛋白質(zhì)化學(xué)和生物化學(xué)中)普 通技術(shù)人員通常理解的含義相同。除非另外指明，本發(fā)明中采用的重組蛋白、細(xì)胞培養(yǎng)和免疫技術(shù)均是標(biāo)準(zhǔn)操 作，是本領(lǐng)域中技術(shù)人員眾所周知的。此種技術(shù)描述和解釋在下面來(lái)源的文獻(xiàn)中，這 些來(lái)源為，例如，J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons(1984), J. Sambrook 等人’ Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T. A. Brown (editor), Essential Molecular Biology :A Practical Approach, volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D. M. Glover and B. D. Hames(editor),DNA Cloning :A Practical Approach,volumes 1-4, IRL Press (1995 禾口 1996), and F. M. Ausubel 等人· (editor), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988,包括至今的所有更新)， Ed Harlow and David Lane (editor)Antibodies :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988)，以及 J. E. Coligan 等人· (editor)Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (包括至今的所有更新)。詵擇的定義如本文中使用的，“C5a受體”、“C5aR”、“C5aRl”或“人C5aR”和其變化形式 是指人 補(bǔ)體成分5受體1，其在本領(lǐng)域中也叫做C5a過(guò)敏毒素受體和⑶88抗原。C5aR屬于七次跨 膜G-蛋白-偶聯(lián)受體家族，并結(jié)合C5a(Gerard和Gerard，1991)。人C5a氨基酸序列的實(shí) 例提供在SEQ ID NO :37中，然而，技術(shù)人員將意識(shí)到還存在這些分子的天然存在的等位基 因變體，這些變體也包括在術(shù)語(yǔ)“C5aR”中。人C5aR的各種結(jié)構(gòu)域定義如下氨基酸 1-37 細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域-N-末端氨基酸 38-61 跨膜結(jié)構(gòu)域氨基酸 62-71 細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域氨基酸 72-94 跨膜結(jié)構(gòu)域氨基酸 95-110細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域-細(xì)胞外環(huán)1氨基酸 111-132跨膜結(jié)構(gòu)域氨基酸 133-149細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域氨基酸 150-174跨膜結(jié)構(gòu)域氨基酸 175-206細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域-細(xì)胞外環(huán)2氨基酸 207-227跨膜結(jié)構(gòu)域氨基酸 228-242細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域氨基酸 243-264跨膜結(jié)構(gòu)域氨基酸 265-283細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域-細(xì)胞外環(huán)3氨基酸 284-307跨膜結(jié)構(gòu)域氨基酸 308-350細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域_C_末端術(shù)語(yǔ)“對(duì)象”，如在本文中使用的，是指任何動(dòng)物，特別是哺乳動(dòng)物，例如人、馬、牛、 貓和狗，并在適當(dāng)時(shí)，可以與術(shù)語(yǔ)“病人”交換使用。優(yōu)選地，對(duì)象是人。如在本文中使用的術(shù)語(yǔ)“治療”及其變化形式包括給予治療有效量的本發(fā)明抗體，該有效量足以減輕或消除病癥的至少一個(gè)癥狀。如在本文中使用的術(shù)語(yǔ)“預(yù)防”或其變化形式是指保護(hù)對(duì)象不患疾病的至少一個(gè) 癥狀，或減輕病癥癥狀的嚴(yán)重性。如在本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“ 暴露細(xì)胞”是指提供抗體，以便能夠接觸/結(jié)合人C5aR， 條件是C5aR存在于細(xì)胞上。術(shù)語(yǔ)“有效濃度50%”(縮寫為"EC5tl”)表示抗體靶向的分子特定效果(例如，抑 制/取代(displace)人C5a與人C5aR的結(jié)合)的50%所需的本發(fā)明抗體濃度。本領(lǐng)域人 員應(yīng)當(dāng)理解較低的EC5tl值相當(dāng)于更有效的抗體。如這里使用的，術(shù)語(yǔ)“抑制”是指降低，和可能徹底破壞確定的活性。優(yōu)選地，確定 的活性被降低至少50 %，更優(yōu)選至少75 %，甚至更優(yōu)選至少90 %。如在本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“約”是指具體值的+/-5%的范圍。整個(gè)本說(shuō)明書中，術(shù)語(yǔ)“包含”，或其變化形式應(yīng)當(dāng)理解為包括陳述的成分、整體或 步驟，或成分、整體或步驟的組，但不包括任何其他成分、整體或步驟，或成分、整體或步驟 的組。在一個(gè)實(shí)施例中，分子“基本上由”定義的序列“組成”。在其它實(shí)施例中，分子“由” 定義的序列“組成”。人源化抗_C5aR抗體術(shù)語(yǔ)免疫球蛋白是指一類結(jié)構(gòu)上相關(guān)的糖蛋白，該糖蛋白由兩對(duì)多肽鏈組成，一 對(duì)低分子量的輕(L)鏈和一對(duì)重(H)鏈，所有四條鏈通過(guò)二硫鍵互相連接。免疫球蛋白的 結(jié)構(gòu)已定性清楚，參見(jiàn)例如 Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W. , ed. ,2nd ed. Raven Press,N. Y. (1989))。簡(jiǎn)言之，每條重鏈典型地由重鏈可變區(qū)(在本文中縮寫為Vh)和重鏈 恒定區(qū)(在本文中縮寫為Ch)組成。每條輕鏈典型地由輕鏈可變區(qū)(在本文中縮寫為^ 和輕鏈恒定區(qū)(在本文中縮寫為CJ組成。輕鏈恒定區(qū)典型地由一個(gè)結(jié)構(gòu)域Q組成。Vh* Vl區(qū)可進(jìn)一步細(xì)分成高變的區(qū)(或序列上高變的高變區(qū)和/或結(jié)構(gòu)確定的環(huán)的形式)，也 稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，中間穿插著較其保守的區(qū)，稱為框架區(qū)(FR)。在優(yōu)選的實(shí)施例中， 本發(fā)明抗體至少包含\結(jié)構(gòu)域和Vh結(jié)構(gòu)域。每個(gè)Vh和\典型地由三個(gè)⑶R和四個(gè)FR組成，從氨基末端到羧基末端按下面順 序排布，F(xiàn)Rl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4(也參見(jiàn) Chothia 和 Lesk，1987)。典型地，在 SE^MSSI^SWIle^· nTiSil Kabat ^A, Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed,Public Health Service, National Institutes of Health,Bethesda, MD. (1991)(短語(yǔ)可變結(jié)構(gòu)域殘基編號(hào)，如Kabat中或根據(jù)Kabat，在本文中指用于重鏈可變 結(jié)構(gòu)域或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的這種編號(hào)系統(tǒng))中描述的方法執(zhí)行。使用這個(gè)編號(hào)系統(tǒng)，肽的 實(shí)際線性氨基酸序列可含有較少或另外的氨基酸，對(duì)應(yīng)于可變結(jié)構(gòu)域FR或CDR的縮短，或 插入可變結(jié)構(gòu)域FR或⑶R。術(shù)語(yǔ)“人源化抗體”，如在本文中使用的，在本文中指來(lái)源于非人抗體，典型地鼠科 動(dòng)物的抗體，該抗體保留或基本保留親本抗體(parent antibody)的抗原結(jié)合的性質(zhì)但它 在人中的免疫性低。由于本發(fā)明抗體由結(jié)構(gòu)和功能特征限定，因此術(shù)語(yǔ)“人源化抗體”可與 “抗體”交換使用。術(shù)語(yǔ)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，如在本文中使用的，是指多種氨基酸序列，該多種氨基酸 序列共同限定免疫球蛋白結(jié)合位點(diǎn)的可變片段(Fv)區(qū)的結(jié)合親和力和特異性。
術(shù)語(yǔ)框架區(qū)(FR)，如在本文中使用的，是指插入在CDR之間的氨基酸序列。抗體的 這些部分用來(lái)將CDR保持在適當(dāng)?shù)奈恢?允許CDR結(jié)合抗原)?？勺儏^(qū)，輕的或重的，均包 含框架區(qū)和典型地三個(gè)⑶R。術(shù)語(yǔ)恒定區(qū)(CR)，如在本文中使用的，是指賦予效應(yīng)子功能的抗體分子的部分。題 述人源化抗體的恒定區(qū)來(lái)源于人免疫球蛋白。重鏈恒定區(qū)可選自五種同種型α、δ、ε、 Y或μ。進(jìn)一步地，各種亞類的重鏈(例如，重鏈的IgG亞類)可引起不同效應(yīng)子功能， 并因而，通過(guò)選擇期望的重鏈恒定區(qū)，可生產(chǎn)具有期望的效應(yīng)子功能的抗體。優(yōu)選的重鏈 恒定區(qū)是 Yl (IgGl)、y2(IgG2), y3(IgG3)和 Y4(IgG4)，更優(yōu)選 y4(IgG4)0 更優(yōu)選的 是Y4(IgG4)同種型的可結(jié)晶片段(Fe)區(qū)，帶有突變Ser228Pro (稱為“P”突變)和/或 Leu235Glu(稱為“E”突變)。特別優(yōu)選的重鏈恒定區(qū)序列由SEQ ID NO 42 45提供。輕 鏈恒定區(qū)可以是κ或λ型，優(yōu)選為κ型。特別優(yōu)選的輕鏈恒定區(qū)序列由SEQ ID NO 40 和41提供。在優(yōu)選的實(shí)施例中，在本文 中描述的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)直接連接到在本文中 描述的免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)。類似地，在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施例中，在本文中描述的免疫球 蛋白重鏈可變區(qū)直接連接到在本文中描述的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)。因而，在優(yōu)選的實(shí)施 例中，由SEQ ID NO :31提供的氨基酸序列的C-末端直接連接到由SEQ ID Ν0:41提供的氨 基酸序列N-末端，由SEQ ID NO 36提供的氨基酸序列的C-末端直接連接到SEQ ID NO 45的氨基酸序列N-末端。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解免疫球蛋白重鏈或輕鏈的可變區(qū)或恒定區(qū)可按照描述的通過(guò) 使用標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)連接，從而創(chuàng)建可在適宜的宿主中被表達(dá)(從而產(chǎn)生所述免疫球 蛋白鏈(一種或多種))的多核苷酸，或可通過(guò)使用肽化學(xué)合成連接的可變區(qū)和恒定區(qū)。本發(fā)明的人源化抗體保存了親本抗體的結(jié)合性質(zhì)的重要部分，即單克隆抗體，該 親本抗體也就是稱為7F3的單克隆抗體，由雜交瘤產(chǎn)生，該雜交瘤于2000年11月6日保藏 在ECACC，編號(hào)為00110609。特別地，本發(fā)明的人源化抗體保留了特異性結(jié)合親本抗體識(shí)別 抗原的能力，該親本抗體用于生產(chǎn)此種人源化抗體。優(yōu)選地，人源化抗體展現(xiàn)出與親本抗體 相同或基本相同的抗體結(jié)合親和力(affinity)和親合力(avidity)。理想地，抗體的親和 力(Kd)將不大于親本抗體親和力的10倍，更優(yōu)選不大于5倍，更優(yōu)選不大于親本抗體親和 力的3倍。分析抗原結(jié)合親和力的方法是本領(lǐng)域中眾所周知的，并包括半最大結(jié)合試驗(yàn)、競(jìng) 爭(zhēng)試驗(yàn)和Scatchard分析。適宜的抗原結(jié)合試驗(yàn)描述在本申請(qǐng)中(參見(jiàn)，例如，實(shí)施例3)。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，“親合力(avidity)”是指兩個(gè)分子之間，例如抗體和抗原之 間相互作用的總強(qiáng)度。親合力取決于相互作用的親和力和價(jià)態(tài)。而且，“親和力”是指分子 (例如，抗體)的單個(gè)結(jié)合位點(diǎn)與配體(例如，抗原)之間結(jié)合的強(qiáng)度。分子X(jué)對(duì)配體Y的 親和力可由解離常數(shù)(Kd)表示，解離常數(shù)是占據(jù)溶液中存在的一半的X分子的結(jié)合部位所 需的Y濃度。更小的Kd表示更強(qiáng)或更高的親和力相互作用，和需要更低的配體濃度來(lái)占據(jù) 該部位。術(shù)語(yǔ)“人源化抗體”或“抗體”，如本發(fā)明中使用的，包括完整分子以及能與表位決 定簇結(jié)合的它們的片段，例如Fab、F(ab' )2和Fv。這些抗體片段保留了選擇性結(jié)合到人 C5aR的一些能力，這些片段的實(shí)施例包括，但不限于下面(l)Fab，含有抗體分子的單價(jià)抗原結(jié)合片段的片段，該片段可通過(guò)酶木瓜蛋白酶將全抗體(whole antibody)降解生成完整的輕鏈和一個(gè)重鏈的一部分；(2)Fab’，可通過(guò)以下方式獲得抗體分子片段，用胃蛋白酶處理全抗體，接著還原， 從而生成完整的輕鏈和重鏈的一部分；每個(gè)抗體分子可得到兩個(gè)Fab’片段；(3) (Fab’)2，可通過(guò)用酶胃蛋白酶處理但沒(méi)有隨后還原以獲得抗體片段；(Fab) 2 是通過(guò)兩個(gè)二硫鍵結(jié)合在一起的兩個(gè)Fab’片段的二聚體；(4) Fv，定義為含有表示為兩條鏈的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的基因工程片段；(5)單鏈抗體(“SCA”)，定義為基因工程分子，其含有通過(guò)適宜的多肽接頭連接成 基因融合的單鏈分子的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，此種單鏈抗體可以是多聚體形式，例如， 雙鏈抗體、三鏈抗體，和四鏈抗體等，這些抗體可以是或不可以是多特異性的(參見(jiàn)，例如， WO 94/07921和 WO 98/44001)和(6)單鏈結(jié)構(gòu)域抗體，典型地?zé)o輕鏈的可變重鏈結(jié)構(gòu)域。人源化抗體片段包括獨(dú)立的重鏈、輕鏈、Fab、Fab，、F(ab，)2、Fe、無(wú)任何重鏈的可 變輕結(jié)構(gòu)域、無(wú)輕鏈的可變重結(jié)構(gòu)域和Fv。多種片段可通過(guò)重組DNA技術(shù)，或通過(guò)完整的免 疫球蛋白的酶分離或化學(xué)分離生產(chǎn)?！叭嗽椿贵w”或本發(fā)明抗體也可以是異源結(jié)合抗體(heteroconjugate antibody) 0異源結(jié)合抗體由兩個(gè)共價(jià)連接的抗體組成。已提出，例如，此種抗體可使得免 疫系統(tǒng)細(xì)胞靶向不需要的細(xì)胞(US 4，676，980)，和用于治療HIV感染(W0 91/00360、WO 92/200373、EP 586505)?？紤]了，該抗體可通過(guò)使用合成蛋白質(zhì)化學(xué)中包括涉及交聯(lián)劑的 那些方法在內(nèi)的已知方法在體外制備。關(guān)于效應(yīng)子功能，理想的是修飾本發(fā)明抗體，以便增強(qiáng)，例如，該抗體治療在本文 中描述的病癥，例如關(guān)節(jié)炎的效力。例如，可將半胱氨酸殘基(一種或多種)引入Fc區(qū)中， 從而允許這個(gè)區(qū)中鏈間二硫鍵的形成。因而產(chǎn)生的同種型二聚體人源化抗體可改進(jìn)內(nèi)化能 力和/或增大補(bǔ)體_介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷和抗體_依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC) (Caron等人， 1992 ；Shopes, 1992).活性增強(qiáng)的同種型二聚體抗體也可使用異型雙功能交聯(lián)劑制備，如 Wolff等人(1993)描述的?？商鎿Q地，可改造具有雙Fc區(qū)的抗體并可從而增強(qiáng)補(bǔ)體裂解和 ADCC 能力(Stevenson 等人，1989)。如在本文中使用的，“非消耗性抗體”是指可結(jié)合到其靶，但不募集(recruit)影 響靶細(xì)胞裂解的免疫系統(tǒng)效應(yīng)子功能的抗體。免疫系統(tǒng)效應(yīng)子功能依賴于Fc-結(jié)構(gòu)域與 Clq-補(bǔ)體級(jí)聯(lián)的第一成分，和/或受體(FcR)的相互作用。補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性(CDC)可 被與Clq相互作用的多Fc-結(jié)構(gòu)域啟動(dòng)，該多Fc-結(jié)構(gòu)域可最終導(dǎo)致靶細(xì)胞通過(guò)形成膜攻 擊復(fù)合物(MAC)裂解。另外，免疫系統(tǒng)細(xì)胞，例如粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞，可通過(guò)FcR與 結(jié)合到靶細(xì)胞的mAb相互作用。靶細(xì)胞的裂解可通過(guò)抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC) 或吞噬作用引發(fā)。非消耗性抗體包括無(wú)Fc結(jié)構(gòu)域的抗體片段，該抗體片段包括例如，單價(jià) (例如，F(xiàn)ab、scFv、納米抗體和dAbs)、二價(jià)(例如，F(xiàn)(ab' )2和雙鏈抗體)和多價(jià)(例如， 三鏈抗體和五鏈抗體)形式。另外，非消耗性抗體包括被修飾從而除去效應(yīng)子功能而不影 響藥物動(dòng)力學(xué)(pharmokinetic)的抗體，例如，可修飾在與Clq和FcR的相互作用中發(fā)揮著 主導(dǎo)作用的Fc-結(jié)構(gòu)域中的氨基酸殘基，或可除去CH2結(jié)構(gòu)域中的N-連接的糖基化位點(diǎn)。 技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解，改造非消耗性抗體的可能性與用于生產(chǎn)抗體的恒定區(qū)相聯(lián)系。IgG3恒 定區(qū)比IgGl恒定區(qū)更有可能生產(chǎn)消耗性抗體，IgGl恒定區(qū)又比IgG2恒定區(qū)更有可能生產(chǎn)消耗性抗體，而IgG4恒定區(qū)一般表示抗體是非消耗性的。技術(shù)人員也應(yīng)當(dāng)理解對(duì)恒定區(qū)的 修飾可使消耗性抗體轉(zhuǎn)化成非消耗性抗體，反之亦然。如在本文中使用的，“非活化抗體”是指結(jié)合細(xì)胞表面受體，和否定(negate)或阻 斷內(nèi)源配體作用的抗體。本發(fā)明人源化抗體可通過(guò)人的介入生產(chǎn)。因而，并不期望它們是天然存在的。但 是，在優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明抗體或免疫球蛋白鏈?zhǔn)恰盎旧霞兓摹被颉凹兓摹?。“基?上純化的”或“純化的”，表示從在天然狀態(tài)上與其關(guān)聯(lián)的一種或多種脂質(zhì)、核酸、其他多肽， 或其他污染分子分離的抗體。優(yōu)選基本上純化的多肽的至少60%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu) 選至少90%不包含與其天然關(guān)聯(lián)的其他成分。在另一個(gè)實(shí)施例中，“基本上純化的”或“純 化的”表示在組合物中為優(yōu)勢(shì)種類(predominant species)的分子，其中，它所屬于的該類 分子即在該種組合物中發(fā)現(xiàn)(即，它構(gòu)成組合物中該類分子的至少約50%，典型地構(gòu)成組 合物中該種類的分子，例如肽的至少約70%，至少約80%，至少約85%，至少約90%，至少 約95%，或更多)。在抗體或免疫球蛋白鏈上下文中的術(shù)語(yǔ)“重組”是指細(xì)胞或在無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中 生產(chǎn)的，與天然狀態(tài)相比，量或比率改變的抗體或免疫球蛋白鏈。在一個(gè)實(shí)施例中，該細(xì)胞 是不能天然生產(chǎn)抗體或免疫球蛋白鏈的細(xì)胞。然而，該細(xì)胞可以是包含非內(nèi)源基因的細(xì)胞， 該非內(nèi)源基因可改變，優(yōu)選增大待生產(chǎn)的多肽量。本發(fā)明的重組抗體或免疫球蛋白鏈包括 未與生產(chǎn)它的轉(zhuǎn)基因(重組)細(xì)胞，或無(wú)細(xì)胞表達(dá)的其他成分系統(tǒng)分離的多肽，和在本文中 細(xì)胞或無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中生產(chǎn)，隨后從至少其他一些成分中純化出來(lái)的抗體或免疫球蛋白鏈。多肽(免疫球蛋白鏈)的同一性％可通過(guò)GAP(Needleman和Wunsch，1970)分析 (GCG程序)確定，其中缺口生成罰分(gap creation penalty) = 5，而缺口延伸罰分(gap extension penalty) =0.3。查詢序列為至少50個(gè)氨基酸長(zhǎng)度，GAP分析在至少50個(gè)氨 基酸的區(qū)上排列該兩個(gè)序列。甚至更優(yōu)選地，查詢序列為至少100個(gè)氨基酸長(zhǎng)度，GAP分析 在至少100個(gè)氨基酸的區(qū)中排列該兩個(gè)序列。更優(yōu)選地，將該兩個(gè)序列在它們的全長(zhǎng)上排 列。關(guān)于定義的免疫球蛋白鏈，應(yīng)當(dāng)理解，高于上面提供的那些的同一性％數(shù)字將包 括優(yōu)選的實(shí)施例。因而，適當(dāng)時(shí)，根據(jù)最小的同一性％數(shù)字，優(yōu)選免疫球蛋白鏈包含這種氨 基酸序列，即，與指定的有關(guān)序列SEQ ID NO至少94%，更優(yōu)選至少95%，更優(yōu)選至少96%， 更優(yōu)選至少97%，更優(yōu)選至少98%，更優(yōu)選至少99%，更優(yōu)選至少99. 1%，更優(yōu)選至少 99.2%,更優(yōu)選至少99. 3%，更優(yōu)選至少99. 4%，更優(yōu)選至少99. 5%，更優(yōu)選至少99. 6%， 更優(yōu)選至少99. 7%，更優(yōu)選至少99. 8%，和甚至更優(yōu)選至少99. 9%的同一性的氨基酸序 列。在另一個(gè)實(shí)施例中，指定的SEQ ID NO中添加了一個(gè)殘基，指定的SEQ ID NO中刪 除了一個(gè)殘基，與指定的SEQ ID NO相比，添加了一個(gè)殘基并刪除了一個(gè)殘基，指定的SEQ ID NO中添加了二個(gè)殘基，指定的SEQ ID NO中刪除了二個(gè)殘基，指定的SEQ ID NO中改變 了一個(gè)殘基，指定的SEQ ID NO中改變了兩個(gè)殘基，指定的SEQ ID NO中一個(gè)殘基改變且刪 除了一個(gè)殘基，或者指定的SEQ IDNO中改變了一個(gè)殘基且添加了一個(gè)殘基，或者其任何組
I=I O在優(yōu)選的實(shí)施例中，該序列比對(duì)中沒(méi)有缺口。更具體地，該算法不需在氨基酸的毗鄰延伸(contiguous stretch)中創(chuàng)建缺口，從而獲得理想的(最高的同一性％ )序列比對(duì)。本發(fā)明的抗體和/或免疫球蛋白鏈的氨基酸序列突變可通過(guò)引入適當(dāng)?shù)暮塑账?改變到本發(fā)明核酸中制備，或通過(guò)體外合成期望的多肽制備。此種突變包括，例如，氨基序 列內(nèi)殘基的缺失、插入或置換?？山M合使用缺失、插入和置換，從而到達(dá)最后的構(gòu)建體，條件 是最后的多肽產(chǎn)物具有期望的特性。突變的(改變的)多肽可使用本領(lǐng)域中已知的任何技術(shù)制備。例如，本發(fā)明多核 苷酸可經(jīng)體外誘變。此種體外誘變技術(shù)包括將多核苷酸子克隆成適宜的載體，將載體轉(zhuǎn)換 成“增變”菌株，例如E. coli XL-I red(Stratagene)，并繁殖該轉(zhuǎn)化的細(xì)菌，以獲得合適數(shù) 目的代數(shù)。可使用在本文中描述的技術(shù)快捷地(readily)篩選從突變/改變DNA獲得的產(chǎn) 物，從而確定它們是否具有受體結(jié)合和/或受體抑制活性。在設(shè)計(jì)氨基酸序列突變時(shí)，突變位點(diǎn)的位置和突變的性質(zhì)取決于待修飾的特性 (一種或多種)。用于突變的位點(diǎn)可單獨(dú)修飾或成批地(in series)修飾，例如，通過(guò)(1)首 先用保守氨基酸選擇物置換，然后根據(jù)獲得的結(jié)果用更激進(jìn)的選擇置換，(2)刪除靶殘基， 或(3)插入與定位位點(diǎn)(located site)相鄰的其他殘基。氨基酸序列缺失范圍一般為約1 15個(gè)殘基，更優(yōu)選為約1 10個(gè)殘基，以及典 型地為約1 5個(gè)連續(xù)的殘基。置換突變(substitution mutants)去除了抗體和/或免疫球蛋白鏈分子中的至 少一個(gè)氨基酸殘基，并在該位置插入了不同的殘基。對(duì)于置換突變，最感興趣的位點(diǎn)包括被 鑒定為對(duì)抗原結(jié)合重要的位點(diǎn)。這些位點(diǎn)，尤其是屬于人抗體和/或免疫球蛋白鏈中至少 三個(gè)其他相同的保守位點(diǎn)的序列的那些位點(diǎn)，優(yōu)選以相對(duì)保守的方式被置換。此種保守置 換在標(biāo)題為“示例性置換”的表1中給出。置換的具體實(shí)施例提供在圖6和10中，其中在 給定位點(diǎn)處的氨基酸可被存于其他人源化鏈中相同位點(diǎn)處的另外的氨基酸置換。表1.示例性置換
權(quán)利要求
一種基本上純化的和/或重組的人源化抗體，包括i)包括了包含與SEQ ID NO31、SEQ ID NO32、SEQ ID NO33和SEQ ID NO48中的一個(gè)或多個(gè)序列至少93％相同的氨基酸序列的可變區(qū)的免疫球蛋白輕鏈，和/或ii)包括了包含與SEQ ID NO34、SEQ ID NO35、SEQ ID NO36和SEQ ID NO39中的一個(gè)或多個(gè)序列至少90％相同的氨基酸序列的可變區(qū)的免疫球蛋白重鏈，其中所述抗體結(jié)合人C5aR。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人源化抗體，其中所述免疫球蛋白重鏈包括了包含選自由 SEQ ID NO :34、SEQ ID NO 35和SEQ ID NO 36組成的組中的氨基酸序列的可變區(qū)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的人源化抗體，其中所述免疫球蛋白輕鏈包括了包含選自 由SEQ ID NO :31、SEQ ID NO 32和SEQ ID NO 33組成的組中的氨基酸序列的可變區(qū)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的人源化抗體，其中所述免疫球蛋白輕鏈包括了 包含由SEQ ID NO :31提供的氨基酸序列的可變區(qū)，免疫球蛋白重鏈包括了包含由SEQ ID NO 36提供的氨基酸序列的可變區(qū)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的人源化抗體，其中所述免疫球蛋白輕鏈包括了 包含由SEQ ID NO :31提供的氨基酸序列的可變區(qū)，免疫球蛋白重鏈包括了包含由SEQ ID NO 34提供的氨基酸序列的可變區(qū)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的人源化抗體，其中所述免疫球蛋白輕鏈包括了 包含由SEQ ID NO :32提供的氨基酸序列的可變區(qū)，免疫球蛋白重鏈包括了包含由SEQ ID NO 34提供的氨基酸序列的可變區(qū)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的人源化抗體，其中所述免疫球蛋白輕鏈包括了 包含由SEQ ID NO :33提供的氨基酸序列的可變區(qū)，免疫球蛋白重鏈包括了包含由SEQ ID NO 34提供的氨基酸序列的可變區(qū)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的人源化抗體，其中所述免疫球蛋白輕鏈包括了 包含由SEQ ID NO :31提供的氨基酸序列的可變區(qū)，免疫球蛋白重鏈包括了包含由SEQ ID NO 35提供的氨基酸序列的可變區(qū)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的人源化抗體，其中所述免疫球蛋白輕鏈包括了 包含由SEQ ID NO :32提供的氨基酸序列的可變區(qū)，免疫球蛋白重鏈包括了包含由SEQ ID NO 35提供的氨基酸序列的可變區(qū)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的人源化抗體，其中所述免疫球蛋白輕鏈包括了 包含由SEQ ID NO :33提供的氨基酸序列的可變區(qū)，免疫球蛋白重鏈包括了包含由SEQ ID NO 35提供的氨基酸序列的可變區(qū)。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的人源化抗體，其中所述免疫球蛋白輕鏈包括了 包含由SEQ ID NO :32提供的氨基酸序列的可變區(qū)，免疫球蛋白重鏈包括了包含由SEQ ID NO 36提供的氨基酸序列的可變區(qū)。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的人源化抗體，其中所述免疫球蛋白輕鏈包括了 包含由SEQ ID NO :33提供的氨基酸序列的可變區(qū)，免疫球蛋白重鏈包括了包含由SEQ ID NO 36提供的氨基酸序列的可變區(qū)。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的人源化抗體，其中i)所述免疫球蛋白輕鏈包括了包含與SEQ ID NO 40和SEQ ID NO 41中的一個(gè)或多個(gè)至少90%相同的氨基酸序列的恒定區(qū)，和ii)所述免疫球蛋白重鏈包括了包含與SEQ ID N0:42、SEQ ID NO 43、SEQ ID NO 44 和SEQ ID NO :45中的一個(gè)或多個(gè)至少90%相同的氨基酸序列的恒定區(qū)。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的人源化抗體，所述人源化抗體為由兩條重鏈 和兩條輕鏈組成的四多肽鏈結(jié)構(gòu)、單鏈抗體、雙鏈抗體、三鏈抗體或四鏈抗體。
15.根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的人源化抗體，所述人源化抗體為結(jié)合人C5aR 的抗體片段。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的人源化抗體，其中所述片段為Fab片段或單域抗體。
17.一種基本上純化的和/或重組的免疫球蛋白輕鏈，包括了包含與SEQ ID N0:3U SEQ ID NO 32,SEQ ID N0:33和SEQ ID NO :48中的一個(gè)或多個(gè)至少93%相同的氨基酸序 列的可變區(qū)。
18.一種基本上純化的和/或重組的免疫球蛋白重鏈，包括了包含與SEQ ID N0:34、 SEQ ID NO 35,SEQ ID NO 36禾口 SEQ ID NO :39中的一個(gè)或多個(gè)至少90%相同的氨基酸序 列。
19.一種基本上純化的和/或重組的抗體，包含權(quán)利要求17所述的免疫球蛋白輕鏈和 /或權(quán)利要求18所述的免疫球蛋白重鏈，其中所述抗體結(jié)合人C5aR。
20.一種結(jié)合物，包含根據(jù)權(quán)利要求1至16或19中任一項(xiàng)所述的抗體和直接或間接結(jié) 合到所述抗體的治療劑。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的結(jié)合物，其中所述治療劑選自由下列物質(zhì)組成的組細(xì)胞 毒素、放射性同位素、免疫調(diào)節(jié)藥劑、抗血管新生藥劑、毒素、抗增殖藥劑、促凋亡藥劑、化療 劑、和治療核酸。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的結(jié)合物，其中所述毒素是假單胞桿菌(Pseudomonas)外毒 素或其衍生物。
23.根據(jù)權(quán)利要求20至22中任一項(xiàng)所述的結(jié)合物，其中所述治療劑通過(guò)接頭間接結(jié)合 到所述抗體。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的結(jié)合物，其中所述接頭選自由下列物質(zhì)組成的組4-(4'乙酰基苯氧基)丁酸(AcBut)、3_乙?；交嵝运?AcPac)、 4-巰基-4-甲基-戊酸(酰胺)、及其衍生物。
25.—種結(jié)合物，包含根據(jù)權(quán)利要求1至16或19中任一項(xiàng)所述的抗體和直接或間接結(jié) 合到所述抗體的可檢測(cè)標(biāo)簽。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的結(jié)合物，其中所述標(biāo)簽選自由下列物質(zhì)組成的組放射性 標(biāo)簽、熒光標(biāo)簽、酶標(biāo)簽和顯像劑。
27.一種分離的和/或外源的多核苷酸，其編碼權(quán)利要求1至16或19中任一項(xiàng)所述的 抗體或其鏈、權(quán)利要求17所述的免疫球蛋白輕鏈、權(quán)利要求18所述的免疫球蛋白重鏈和/ 或權(quán)利要求20至23、25或26中任一項(xiàng)所述的結(jié)合物。
28.一種包含權(quán)利要求27所述的多核苷酸的載體。
29.一種包含權(quán)利要求27所述的多核苷酸和/或權(quán)利要求28所述的載體的宿主細(xì)胞。
30.一種包含根據(jù)權(quán)利要求29所述的細(xì)胞的非人轉(zhuǎn)基因生物。
31.一種組合物，包含根據(jù)權(quán)利要求1至16或19中任一項(xiàng)所述的抗體、權(quán)利要求17所述的免疫球蛋白輕鏈、權(quán)利要求18所述的免疫球蛋白重鏈、權(quán)利要求20至26中任一項(xiàng)所 述的結(jié)合物、權(quán)利要求27所述的多核苷酸、權(quán)利要求28所述的載體和/或權(quán)利要求29所 述的宿主細(xì)胞，以及藥用載體。
32.—種生產(chǎn)抗體的方法，所述方法包含培養(yǎng)權(quán)利要求29所述的宿主細(xì)胞，以表達(dá)所 述多核苷酸并生產(chǎn)所述抗體，其中所述宿主細(xì)胞包含至少一種權(quán)利要求27所述的多核苷 酸。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述免疫球蛋白輕鏈和所述免疫球蛋白重鏈被 一個(gè)連續(xù)多核苷酸上的兩個(gè)分開的開放閱讀框編碼。
34.根據(jù)權(quán)利要求32或權(quán)利要求33所述的方法，進(jìn)一步包含從所述宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中 回收所述抗體。
35.一種抑制人C5aR與其配體相互作用的方法，所述方法包括使細(xì)胞暴露于根據(jù)權(quán)利 要求1至16或19中任一項(xiàng)所述的抗體或根據(jù)權(quán)利要求20至26中任一項(xiàng)所述的結(jié)合物。
36.一種抑制細(xì)胞中人C5aR活性的方法，所述方法包含使細(xì)胞暴露于根據(jù)權(quán)利要求1 至16或19中任一項(xiàng)所述的抗體或根據(jù)權(quán)利要求20至26中任一項(xiàng)所述的結(jié)合物。
37.一種治療或預(yù)防對(duì)象中的病癥的方法，所述方法包含給予所述對(duì)象根據(jù)權(quán)利要求 1至16或19中任一項(xiàng)所述的抗體、根據(jù)權(quán)利要求20至26中任一項(xiàng)所述的結(jié)合物、權(quán)利要 求27所述的多核苷酸、權(quán)利要求28所述的載體、權(quán)利要求29所述的宿主細(xì)胞和/或權(quán)利 要求31所述的組合物。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中所述病癥是免疫病態(tài)病癥。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述免疫病態(tài)病癥是自身免疫疾病。
40.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中所述病癥是炎性疾病。
41.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述炎性疾病是急性炎癥或慢性炎癥。
42.根據(jù)權(quán)利要求39至41中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述免疫病態(tài)病癥或炎性疾病涉 及白細(xì)胞遷移和/或白細(xì)胞活化。
43.一種根據(jù)權(quán)利要求39至41中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述免疫病態(tài)病癥或炎性疾 病涉及補(bǔ)體活化。
44.一種用于遞送治療劑到對(duì)象的炎癥部位的方法，所述方法包含給予所述對(duì)象根據(jù) 權(quán)利要求20至24中任一項(xiàng)所述的結(jié)合物、或編碼其的多核苷酸。
45.一種用于將遺傳物質(zhì)引入到呈遞C5aR的細(xì)胞中的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞 與根據(jù)權(quán)利要求1至16或19中任一項(xiàng)所述的抗體、或根據(jù)權(quán)利要求20至26中任一項(xiàng)所 述的結(jié)合物接觸，其中所述抗體或結(jié)合物結(jié)合于遺傳物質(zhì)或與遺傳物質(zhì)聯(lián)合。
46.一種用于檢測(cè)樣品中人C5aR存在與否的方法，所述方法包括使所述樣品與根據(jù)權(quán) 利要求1至16或19中任一項(xiàng)所述的抗體、和/或根據(jù)權(quán)利要求20至26中任一項(xiàng)所述的 結(jié)合物接觸，并分析所述樣品中人C5aR與所述抗體或結(jié)合物之間的結(jié)合。
47.一種用于診斷對(duì)象的病癥的方法，所述方法包括使對(duì)象、或從其獲得的樣品與根據(jù) 權(quán)利要求1至16或19中任一項(xiàng)所述的抗體、或根據(jù)權(quán)利要求20至26中任一項(xiàng)所述的結(jié) 合物接觸，并分析所述對(duì)象或樣品中人C5aR與所述抗體或結(jié)合物之間的結(jié)合。
48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中所述方法在體外使用組織學(xué)標(biāo)本或從所述對(duì)象 獲得的組織或流體的亞組分進(jìn)行。
49.根據(jù)權(quán)利要求47或權(quán)利要求48所述的方法，其中所述病癥是免疫病態(tài)病癥。
50.根據(jù)權(quán)利要求1至16或19中任一項(xiàng)所述的抗體、根據(jù)權(quán)利要求20至26中任一項(xiàng) 所述的結(jié)合物、權(quán)利要求27所述的多核苷酸、權(quán)利要求28所述的載體、權(quán)利要求29所述的 宿主細(xì)胞和/或權(quán)利要求31所述的組合物作為藥物在治療或預(yù)防對(duì)象中的病癥方面的用 途。
51.根據(jù)權(quán)利要求20至24中任一項(xiàng)所述的結(jié)合物或編碼其的多核苷酸在制備用于將 治療劑遞送到對(duì)象的炎癥部位的藥物方面的用途。
52.根據(jù)權(quán)利要求1至16或19中任一項(xiàng)所述的抗體、根據(jù)權(quán)利要求20至26中任一項(xiàng) 所述的結(jié)合物、權(quán)利要求27所述的多核苷酸、權(quán)利要求28所述的載體、權(quán)利要求29所述的 宿主細(xì)胞和/或權(quán)利要求31所述的組合物作為藥物在治療或預(yù)防對(duì)象中的病癥方面的用 途。
53.根據(jù)權(quán)利要求20至24中任一項(xiàng)所述的結(jié)合物或編碼其的多核苷酸作為藥物在將 治療劑遞送到對(duì)象的炎癥部位的用途。
54.一種試劑盒，包含根據(jù)權(quán)利要求1至16或19中任一項(xiàng)所述的抗體、根據(jù)權(quán)利要求 20至26中任一項(xiàng)所述的結(jié)合物、權(quán)利要求27所述的多核苷酸、權(quán)利要求28所述的載體、權(quán) 利要求29所述的宿主細(xì)胞和/或權(quán)利要求31所述的組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及與人C5a受體結(jié)合的人源化抗體及其作為治療和診斷藥劑的用途。本發(fā)明進(jìn)一步涉及編碼所述人源化抗體的核酸序列，及其在重組宿主細(xì)胞中的表達(dá)。特別地，本發(fā)明涉及來(lái)源于與人C5a受體特異性結(jié)合的小鼠抗體7F3的人源化抗體。
文檔編號(hào)A61K39/395GK101970494SQ200980105691
公開日2011年2月9日 申請(qǐng)日期2009年2月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月20日
發(fā)明者彼得·惠特菲爾德, 戴維·扎赫拉, 查爾斯·麥凱 申請(qǐng)人:G2炎癥私人有限公司