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      綴合的因子Ⅷ分子的制作方法

      文檔序號(hào):1175858閱讀:345來(lái)源:國(guó)知局
      專(zhuān)利名稱(chēng):綴合的因子Ⅷ分子的制作方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明涉及綴合的凝固因子VIII分子。具體地,本發(fā)明涉及具有改變的循環(huán)半衰 期的綴合的因子VIII分子。
      背景技術(shù)
      A型血友病是由凝固因子VIII (FVIII)活性的缺乏或功能障礙造成的一種遺傳性 出血障礙。臨床表現(xiàn)不是在初級(jí)止血一正常形成血凝塊一而是由于缺乏次級(jí)凝血酶形成所 導(dǎo)致的凝塊不穩(wěn)定。通過(guò)靜脈內(nèi)注射從血液分離的或重組生產(chǎn)的凝固因子FVIII,治療該疾 病。流行的治療推薦正在從傳統(tǒng)的在要求時(shí)(on-demand)治療轉(zhuǎn)向預(yù)防。內(nèi)源的 FVIII的循環(huán)半衰期是12-14小時(shí),因而每周需要進(jìn)行幾次預(yù)防性治療,以使患者得到實(shí)際 上無(wú)癥狀的生活。對(duì)于許多人,尤其是兒童和年輕人,靜脈內(nèi)施用伴有顯著的不便和/或疼 痛。因而本領(lǐng)域需要新穎的具有因子VIII活性的因子VIII產(chǎn)品,它們優(yōu)選地在結(jié)構(gòu)上是 同質(zhì)的,優(yōu)選地是安全的,且優(yōu)選地具有顯著延長(zhǎng)的循環(huán)半衰期,以減少每周施用因子VIII 的次數(shù)。此外,本領(lǐng)域需要相對(duì)簡(jiǎn)單的得到和生產(chǎn)這種分子的方法。本領(lǐng)域已知,為了延長(zhǎng)循環(huán)半衰期,向因子VIII加入聚乙二醇(PEGylation)。但 是,這是得到具有同質(zhì)結(jié)構(gòu)以及顯著提高的循環(huán)半衰期的安全產(chǎn)品的障礙??傻玫降纳a(chǎn) 綴合的因子VIII分子的方法經(jīng)常是費(fèi)力的,和/或傾向于導(dǎo)致低得率和/或在結(jié)構(gòu)上不同 質(zhì)的產(chǎn)品。在W02008011633中已經(jīng)暗示了人工改造的0-聯(lián)糖基化位點(diǎn)用于得到治療蛋 白的應(yīng)用,所述治療蛋白具有延長(zhǎng)的治療蛋白循環(huán)半衰期,但是,其中沒(méi)有公開(kāi)綴合的因子 VIII分子。發(fā)明概述在第一個(gè)方面,本發(fā)明涉及具有改變的循環(huán)半衰期的B結(jié)構(gòu)域截短的因子VIII分 子,所述分子在截短的B結(jié)構(gòu)域中通過(guò)0-聯(lián)寡糖與親水聚合物共價(jià)綴合,其中因子VIII激 活導(dǎo)致共價(jià)綴合的側(cè)基的去除。在其它方面,本發(fā)明另外涉及用于得到這種分子的方法,這種分子的用途和包含 這種分子的藥物組合物。因而,提供了具有改變的循環(huán)半衰期的綴合的因子VIII分子,其中綴合的側(cè)基 (例如親水聚合物)在激活后去除。根據(jù)本發(fā)明的分子優(yōu)選地在結(jié)構(gòu)上一至少在親水聚合 物在截短的B結(jié)構(gòu)域中的位置這方面一是同質(zhì)的,且優(yōu)選地具有有利的安全概況。同樣, 本文另外提供了相對(duì)簡(jiǎn)單的用于得到這種分子的方法。優(yōu)選地,根據(jù)本發(fā)明的激活的因子 VIII分子類(lèi)似于內(nèi)源激活的因子VIII。發(fā)明詳述定義因子VIII分子FVIII/因子VIII是一種主要由肝細(xì)胞產(chǎn)生的大的、復(fù)雜的糖 蛋白。FVIII由2351個(gè)氨基酸組成,包括信號(hào)肽,且含有幾個(gè)根據(jù)同源性定義的不同結(jié)構(gòu) 域。存在3個(gè)A-結(jié)構(gòu)域,1個(gè)獨(dú)特的B-結(jié)構(gòu)域和2個(gè)C-結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)域次序可以列成NH2-A1-A2-B-A3-C1-C2-C00H。FVIII在血漿中作為在B-A3邊界處分開(kāi)的兩條鏈進(jìn)行循環(huán)。 鏈通過(guò)二價(jià)金屬離子結(jié)合進(jìn)行連接。A1-A2-B鏈稱(chēng)作重鏈(HC),而A3-C1-C2稱(chēng)作輕鏈(LC)。內(nèi)源的因子VIII分子作為一群具有各種大小的B結(jié)構(gòu)域的分子在體內(nèi)循環(huán)。在 體內(nèi)可能發(fā)生的是,B結(jié)構(gòu)域的逐漸酶促去除,從而產(chǎn)生一群具有各種大小的B結(jié)構(gòu)域的分 子。一般認(rèn)為,隨同凝血酶激活發(fā)生在位置740處的切割,由此去除B-結(jié)構(gòu)域的最后一部 分。但是,不能排除的是,其中例如在位置740的切割位點(diǎn)已經(jīng)受損的因子VIII變體可能 是有活性的。本文使用的“因子VIII”或“FVIII”是指一種人血漿糖蛋白,它是內(nèi)在的凝固途徑 的一個(gè)成員,且是血液凝固所必需的。“天然的FVIII”是在SEQ ID NO. 1 (氨基酸1-2332) 中所示的全長(zhǎng)人FVIII分子。B-結(jié)構(gòu)域跨SEQ ID NO 1中的氨基酸741-1648。SEQ ID NO 1 ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWM GLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGP MASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAA SARAffPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYffHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLL MDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKK HPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLY GEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTR YYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEF QASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENP GLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNSRHPSTRQKQFNATTIP ENDIEKTDPWFAHRTPMPKIQNVSSSDLLMLLRQSPTPHGLSLSDLQEAKYETFSDDPSPGAIDSNNSLSEMTHFRP QLHHSGDMVFTPESGLQLRLNEKLGTTAATELKKLDFKVSSTSNNLISTIPSDNLAAGTDNTSSLGPPSMPVHYDSQ LDTTLFGKKSSPLTESGGPLSLSEENNDSKLLESGLMNSQESSWGKNVSSTESGRLFKGKRAHGPALLTKDNALFKV SISLLKTNKTSNNSATNRKTHIDGPSLLIENSPSVWQNILESDTEFKKVTPLIHDRMLMDKNATALRLNHMSNKTTS SKNMEMVQQKKEGPIPPDAQNPDMSFFKMLFLPESARWIQRTHGKNSLNSGQGPSPKQLVSLGPEKSVEGQNFLSEK NKVVVGKGEFTKDVGLKEMVFPSSRNLFLTNLDNLHENNTHNQEKKIQEEIEKKETLIQENVVLPQIHTVTGTKNFM KNLFLLSTRQNVEGSYDGAYAPVLQDFRSLNDSTNRTKKHTAHFSKKGEEENLEGLGNQTKQIVEKYACTTRISPNT SQQNFVTQRSKRALKQFRLPLEETELEKRIIVDDTSTQWSKNMKHLTPSTLTQIDYNEKEKGAITQSPLSDCLTRSH SIPQANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLTRVLFQDNSSHLPAASYRKKDSGVQESSHFLQGAKKNNLSLAILTLEMTCD QREVGSLGTSATNSVTYKKVENTVLPKPDLPKTSGKVELLPKVHIYQKDLFPTETSNGSPGHLDLVEGSLLQGTEGA IKWNEANRPGKVPFLRVATESSAKTPSKLLDPLAWDNHYGTQIPKEEWKSQEKSPEKTAFKKKDTILSLNACESNHA IAAINEGQNKPEIEVTffAKQGRTERLCSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQ SPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYI RAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSD VDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYR FHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAG IWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSffl KVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARY
      4IRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNN PKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLL TRYLRlHPQSffVHQIALRMEVLGCEAQDLY根據(jù)本發(fā)明的因子VIII分子是B結(jié)構(gòu)域截短的因子FVIII分子,其中剩余的結(jié)構(gòu) 域?qū)?yīng)著SEQ ID NO. 1中氨基酸編號(hào)1-740和1649-2332所述的序列。因而斷定根據(jù)本發(fā) 明的分子是在轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞(優(yōu)選哺乳動(dòng)物起源)中生產(chǎn)的重組分子。但是,剩余的結(jié) 構(gòu)域(即3個(gè)A-結(jié)構(gòu)域和2個(gè)C-結(jié)構(gòu)域)可以稍微(例如約1%、2%、3%、4%或5% ) 不同于在SEQ ID NO 1中所述的氨基酸序列(氨基酸1-740和1649-2332)。具體地,可取 的是將氨基酸修飾(取代、缺失等)引入剩余的結(jié)構(gòu)域,例如以修飾因子VIII與各種其它 組分(例如vW因子、LPR、各種受體、其它凝固因子、細(xì)胞表面等)的結(jié)合能力。此外,似乎 可取的是根據(jù)本發(fā)明的因子VIII分子在例如截短的B-結(jié)構(gòu)域中和/或在分子的一個(gè)或多 個(gè)其它結(jié)構(gòu)域中包含其它翻譯后修飾。這些其它的翻譯后修飾可以是與根據(jù)本發(fā)明的因子 VIII分子綴合的各種分子的形式,例如聚合物、肽化合物、脂肪酸衍生的化合物等。無(wú)論根據(jù)本發(fā)明的因子VIII分子是否在B結(jié)構(gòu)域之外被修飾、是否具有其它翻譯 后修飾,它們都具有因子VIII活性,即以在功能上類(lèi)似于或等同于FVIII的方式在凝固級(jí) 聯(lián)中起作用,通過(guò)與激活的血小板上的FIXa之間的相互作用誘導(dǎo)FXa的形成,及支持血凝 塊的形成的能力。通過(guò)本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù),例如凝塊分析、內(nèi)源凝血酶潛力分析等,可 以在體外評(píng)估活性。根據(jù)本發(fā)明的因子VIII分子具有的FVIII活性是天然人FVIII的至 少約10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至 少90%和100%或甚至超過(guò)100%。B結(jié)構(gòu)域因子VIII中的B-結(jié)構(gòu)域跨SEQ ID NO 1中的氨基酸741-1648。B-結(jié)構(gòu) 域在幾個(gè)不同的位點(diǎn)切割,從而產(chǎn)生循環(huán)血漿FVIII分子的大異質(zhì)性。重度糖基化的B-結(jié) 構(gòu)域的確切功能是未知的。已知的是,該結(jié)構(gòu)域?qū)τ谀碳?jí)聯(lián)中的FVIII活性而言是可有 可無(wú)的。這種明顯的功能缺失得到下述事實(shí)的支持,即B結(jié)構(gòu)域缺失的/截短的FVIII似 乎具有與全長(zhǎng)天然FVIII相同的體內(nèi)性質(zhì)。也就是說(shuō),有跡象表明,B-結(jié)構(gòu)域可以減少與 細(xì)胞膜的結(jié)合,至少在無(wú)血清的條件下。B結(jié)構(gòu)域截短的/缺失的因子VIII分子內(nèi)源的全長(zhǎng)FVIII作為單鏈前體分子來(lái) 合成。在分泌之前,前體被切割成重鏈和輕鏈??梢詮?種不同的策略生產(chǎn)重組的B結(jié)構(gòu) 域缺失的FVIII。單獨(dú)地合成沒(méi)有B-結(jié)構(gòu)域的重鏈和輕鏈,作為2條不同的多肽鏈(雙鏈 策略),或者合成B-結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII,作為單條前體多肽鏈(單鏈策略),其以與全長(zhǎng) FVIII前體相同的方式切割成重鏈和輕鏈。在B結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII前體多肽中,重鏈和輕鏈部分正常被接頭分開(kāi)。為了使在 B結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII中引入免疫原性的表位的風(fēng)險(xiǎn)最小化,接頭的序列優(yōu)選地源自FVIII B-結(jié)構(gòu)域。所述接頭必須包含蛋白酶的識(shí)別位點(diǎn),其將B結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII前體多肽分 開(kāi)成重鏈和輕鏈。在全長(zhǎng)FVIII的B結(jié)構(gòu)域中,氨基酸1644-1648構(gòu)成該識(shí)別位點(diǎn)。在B 結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII激活后導(dǎo)致接頭去除的凝血酶位點(diǎn)位于重鏈中。因而,接頭的大小和 氨基酸序列不太可能影響由凝血酶激活將它從剩余的FVIII分子去除。B結(jié)構(gòu)域的缺失對(duì) 于FVIII的生產(chǎn)是有利的。盡管如此,在接頭中可以包含B結(jié)構(gòu)域部分,而不降低生產(chǎn)力。 B結(jié)構(gòu)域?qū)ιa(chǎn)力的消極作用尚未歸因于B結(jié)構(gòu)域的任意特定大小或序列。
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      截短的B-結(jié)構(gòu)域可以含有幾個(gè)0-糖基化位點(diǎn)。但是,根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案,該分 子在截短的B-結(jié)構(gòu)域中包含僅1個(gè)、或2個(gè)、3個(gè)或4個(gè)0-聯(lián)寡糖。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案,截短的B結(jié)構(gòu)域包含僅1個(gè)潛在的0-糖基化位點(diǎn),且親水 聚合物共價(jià)地綴合至該0-糖基化位點(diǎn)。根據(jù)本發(fā)明的B-結(jié)構(gòu)域截短的分子中的0-聯(lián)寡糖可以附著至0-糖基化位點(diǎn), 后者通過(guò)重組方式和/或通過(guò)截短B-結(jié)構(gòu)域來(lái)暴露“隱藏的” 0-糖基化位點(diǎn)而人工生成。 在兩種情況下,可以如下制備這種分子設(shè)計(jì)B-結(jié)構(gòu)域截短的因子VIII氨基酸序列,且隨 后對(duì)該氨基酸序列進(jìn)行預(yù)測(cè)截短的B-結(jié)構(gòu)域中出現(xiàn)0-糖基化位點(diǎn)的概率的計(jì)算機(jī)分析。 可以在合適的宿主細(xì)胞中合成具有相對(duì)較高的具備這種糖基化位點(diǎn)的概率的分子,隨后分 析糖基化模式,再選擇在截短的B-結(jié)構(gòu)域中具有0-聯(lián)糖基化的分子。適用于生產(chǎn)重組因 子VIII蛋白的宿主細(xì)胞優(yōu)選地具有哺乳動(dòng)物起源,以確保該分子被糖基化。在實(shí)踐本發(fā)明 時(shí),細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞,更優(yōu)選確立的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系,包括、但不限于,CH0(例如,ATCC CCL 61)、C0S-1(例如,ATCC CRL 1650)、幼倉(cāng)鼠腎(BHK)和 HEK293 (例如,ATCC CRL 1573 ; Graham 等人,J. Gen. Virol. 36 :59-72,1977)細(xì)胞系。優(yōu)選的 BHK 細(xì)胞系是 tk_tsl3 BHK 細(xì) 胞系(Waechter 和 Baserga,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 1106-1110,1982),在下文中稱(chēng) 作BHK 570細(xì)胞。BHK 570細(xì)胞系可以從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr.,Rockville, MD 20852)在 ATCC 登記號(hào) CRL 10314 下得 到。tk-tsl3 BHK細(xì)胞系也可以從ATCC在登記號(hào)CRL 1632下得到。優(yōu)選的CHO細(xì)胞系是 可從ATCC在登記號(hào)CC161下得到的CHO Kl細(xì)胞系以及細(xì)胞系CH0-DXB11和CH0-DG44。其它合適的細(xì)胞系包括、但不限于,大鼠H印1(大鼠肝癌;ATCC CRL 1600)、大 鼠 H印 II (大鼠肝癌;ATCC CRL 1548)、TCMK(ATCC CCL 139)、人肺(ATCC HB 8065)、NCTC 1469 (ATCC CCL 9. 1)、DUKX 細(xì)胞(CH0 細(xì)胞系)(Urlaub 和 Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 4216-4220,1980) (DUKX 細(xì)胞也稱(chēng)作 DXBll 細(xì)胞)和 DG44(CH0 細(xì)胞系)(Cell, 33 405,1983,和 Somatic Cell and Molecular Genetics 12:555,1986)。也有用的是 3T3 細(xì) 胞、Namalwa細(xì)胞、骨髓瘤和骨髓瘤與其它細(xì)胞的融合體。在有些實(shí)施方案中,細(xì)胞可以是突 變的或重組的細(xì)胞,例如,與它們的來(lái)源細(xì)胞類(lèi)型相比,表達(dá)在質(zhì)量上或在數(shù)量上不同的酶 譜的細(xì)胞,所述酶催化蛋白的翻譯后修飾(例如,糖基化酶例如糖基轉(zhuǎn)移酶和/或糖苷酶, 或加工酶例如前肽)。DUKX細(xì)胞(CH0細(xì)胞系)是特尤其優(yōu)選的。目前優(yōu)選的細(xì)胞是HEK293、COS、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、幼倉(cāng)鼠腎(BHK)和骨 髓瘤細(xì)胞,尤其是中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。因而,本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)表明,通過(guò)截短B-結(jié)構(gòu)域,可能激活因子VIII B-結(jié)構(gòu) 域中“隱藏的” 0-糖基化位點(diǎn)。雖然不希望受任何理論約束,但該現(xiàn)象可以歸因于截短的 B-結(jié)構(gòu)域中的分子的三級(jí)結(jié)構(gòu)被改變?!半[藏的” 0-糖基化位點(diǎn)因而“被迫可進(jìn)行”截短 的B-結(jié)構(gòu)域中的糖基化。該方案的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是,提供就例如變應(yīng)原性而論具有有利的安全 性的重組分子。另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是,它可以代表更簡(jiǎn)單的獲取在B-結(jié)構(gòu)域中具有0-聯(lián)寡糖的 B-結(jié)構(gòu)域截短的變體的方案,這是由于B-結(jié)構(gòu)域中糖基化位點(diǎn)的固有豐度,因?yàn)橐郧耙呀?jīng) 證實(shí)難以在重組蛋白中工程改造人工的0-糖基化位點(diǎn)。野生型FVIII分子中B結(jié)構(gòu)域的長(zhǎng)度是約907個(gè)氨基酸。根據(jù)本發(fā)明的分子中的 截短的B結(jié)構(gòu)域的長(zhǎng)度可以是約10個(gè)氨基酸至約700個(gè)氨基酸,例如約12-500個(gè)氨基酸、12-400個(gè)氨基酸、12-300個(gè)氨基酸、12-200個(gè)氨基酸、15-100個(gè)氨基酸、15-75個(gè)氨基酸、 15-50個(gè)氨基酸、15-45個(gè)氨基酸、20-45個(gè)氨基酸、20-40個(gè)氨基酸或20-30個(gè)氨基酸。截 短的B-結(jié)構(gòu)域可以包含重鏈和/或輕鏈的片段和/或在野生型FVIII分子中不存在的人 工引入的序列。術(shù)語(yǔ)“B-結(jié)構(gòu)域截短的”和“B-結(jié)構(gòu)域缺失的”可以在本文中互換使用。改變的循環(huán)半衰期根據(jù)本發(fā)明的分子具有與野牛型因子VIII分子相比改變的 循環(huán)半衰期,優(yōu)選增加的循環(huán)半衰期。循環(huán)半衰期優(yōu)選地增加了至少10%、優(yōu)選至少15%、 優(yōu)選至少20%、優(yōu)選至少25%、優(yōu)選至少30%、優(yōu)選至少35%、優(yōu)選至少40%、優(yōu)選至少 45%、優(yōu)選至少50%、優(yōu)選至少55%、優(yōu)選至少60%、優(yōu)選至少65%、優(yōu)選至少70%、優(yōu)選 至少75 %、優(yōu)選至少80 %、優(yōu)選至少85 %、優(yōu)選至少90 %、優(yōu)選至少95 %、優(yōu)選至少100 %、 更優(yōu)選至少125%、更優(yōu)選至少150%、更優(yōu)選至少175%、更優(yōu)選至少200%和最優(yōu)選至少 250%或300%。甚至更優(yōu)選地,這種分子具有與野生型FVIII的循環(huán)半衰期相比增加了至 少400%、500%、600%或甚至700%的循環(huán)半衰期。親水聚合物根據(jù)本發(fā)明的修飾某閉/親水聚合物優(yōu)選地是非天然存在的。在一 個(gè)實(shí)例中,“非天然存在的修飾基團(tuán)”是聚合的修飾基團(tuán),其中至少一個(gè)聚合部分是非天然 存在的。在另一個(gè)實(shí)例中,非天然存在的修飾基團(tuán)是修飾的碳水化合物。選擇由修飾基團(tuán)官 能化的部位,從而使它不會(huì)阻止“修飾的糖”酶促地添加到多肽上?!靶揎椀奶恰币仓溉我獾?糖基模仿部分,其被修飾基團(tuán)官能化,且是天然的或修飾的酶(例如糖基轉(zhuǎn)移酶)的底物。添加到多肽上的聚合的修飾基團(tuán)可以改變這種多肽的性質(zhì),例如,它的生物利用 率、生物活性或它在體內(nèi)的半衰期。根據(jù)本發(fā)明的示例性的聚合物包括線性的或分支的水 溶性的聚合物,且可以包括一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立地選擇的聚合部分,例如聚(亞烷基二醇)和其 衍生物。根據(jù)本發(fā)明的聚合的修飾基團(tuán)可以包括水溶性的聚合物,例如聚(乙二醇)和其 衍生物(PEG,m-PEG)、聚(丙二醇)和其衍生物(PPG, m-PPG)等。術(shù)語(yǔ)“水溶性的”是指在水中具有一些可檢測(cè)程度的溶解度的部分。檢測(cè)和/或 定量水溶性的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。根據(jù)本發(fā)明的示例性的水溶性的聚合物包括肽、 糖、聚(醚)、聚(胺)、聚(羧酸)等。肽可以具有混合的序列,且由單個(gè)氨基酸組成,例如, 聚(賴氨酸)。示例性的多糖是聚(唾液酸)。示例性的聚(醚)是聚(乙二醇),例如, m-PEG。聚(乙烯亞胺)是示例性的聚胺,聚(丙烯酸)是代表性的聚(羧酸)。根據(jù)本發(fā)明的水溶性的聚合物的聚合物主鏈可以是聚(乙二醇)(即PEG)。與本 發(fā)明有關(guān)的術(shù)語(yǔ)PEG包括任意形式的聚(乙二醇),包括烷氧基PEG、雙功能的PEG、多臂的 PEG、叉狀的(forked)PEG、分支的PEG、懸垂的(pendent)PEG(即具有一個(gè)或多個(gè)從聚合物 主鏈懸垂的官能團(tuán)的PEG或有關(guān)的聚合物)或具有可降解的鍵的PEG。聚合物主鏈可以是線性的或分支的。分支的聚合物主鏈?zhǔn)潜绢I(lǐng)域普遍已知的。一 般地,分支的聚合物具有中心分支核心部分和連接到該中心分支核心的許多線性的聚合物 鏈。PEG通常以分支形式使用,其可以通過(guò)將環(huán)氧乙烷添加到各種多元醇(例如丙三醇、季 戊四醇和山梨糖醇)上來(lái)制備。中心分支部分也可以源自幾個(gè)氨基酸,例如賴氨酸或半胱 氨酸。在一個(gè)實(shí)例中,分支的聚(乙二醇)可以表示為通式R(_PEG-0H)m,其中R代表核心 部分,例如丙三醇或季戊四醇,且m代表臂的數(shù)目。多臂的PEG分子,例如在本文中整體并 入作為參考的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,932,462中所述的那些,也可以用作聚合物主鏈,圖8顯示了在本發(fā)明的實(shí)施方案中使用的代表性分支的PEG聚合物,在本文中稱(chēng)
      7作“SA-丙三醇-PEG”。圖8A顯示了 CMP-SA-丙三醇-PEG或與聚糖或多肽氨基酸連接的 SA-丙三醇-PEG的示例性的SA-丙三醇-PEG組分。圖8B顯示了通過(guò)Gal殘基連接至聚 糖或多肽上的SA-丙三醇-PEG部分。圖8C顯示了通過(guò)Gal-GalNAc殘基連接至聚糖或多 肽上的SA-丙三醇-PEG部分。圖8D顯示了通過(guò)Gal-GalNAc部分連接至多肽氨基酸上的 SA-丙三醇-PEG部分。在各種實(shí)施方案中,AA是蘇氨酸或絲氨酸。在示例性的實(shí)施方案中, 通過(guò)缺失FVIII多肽的B-結(jié)構(gòu)域,將AA轉(zhuǎn)變成O-聯(lián)糖基化位點(diǎn)。下文W032]段落中關(guān)于 聚合物分子量的討論,通常也適用于在圖8中所示的分支的PEG。在圖8中,下標(biāo)“η”代表 任意整數(shù),其提供具有在下面W032]段落中討論的所需分子量的線性的(和因而分支的) m-PEG。在各種實(shí)施方案中,選擇“n”,從而使得線性的m_PEG部分是約20KDa至約40KDa, 例如,約20KDa、約30KDa或約40KDa。與這些m_PEG分子量對(duì)應(yīng)的整數(shù)等于約400 (例如約 455)至約900 (例如約910)。因此,選擇“n”,以提供約40KDa至約80KDa、例如約40KDa、約 50KDa、約 60KDa、約 70KDa 或約 80KDa 的分支的 PEG。許多其它的聚合物也適用于本發(fā)明。非肽的和水溶性的聚合物主鏈在本發(fā)明 中特別有用。合適的聚合物的實(shí)例包括、但不限于,其它聚(亞烷基二醇)例如聚(丙 二醇)(〃 PPG")、乙二醇和丙二醇的共聚物等,聚(氧乙基化的多元醇),聚(烯醇), 聚(乙烯吡咯烷酮),聚(羥丙基甲基丙烯酰胺),聚(α-羥酸),聚(乙烯醇),聚磷腈 (polyphosphazene),聚”惡唑啉,聚(N-丙烯酰嗎啉),例如在本文中整體并入作為參考的美 國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,629,384中所述的那些,以及它們的共聚物、三元共聚物和混合物。
      盡管聚合物主鏈的每條鏈的分子量可以變化,但它通常是在從約IOODa至 約160,OOODa、例如從約5,OOODa至約100,OOODa的范圍內(nèi)。更具體地,根據(jù)本發(fā)明的每個(gè)綴 合的親水聚合物的大小可以從約500Da至約80,OOODa變化,例如約IOOODa至約80,OOODa ; 約 2000Da 至約 70,OOODa ;約 5000 至約 70,OOODa ;約 5000 至約 60,OOODa ;約 10,000 至約 70,OOODa ;約 20,000 至約 60,OOODa ;約 30,000 至約 60,OOODa ;約 30,000 至約 50,OOODa ; 或約30,000至約40,OOODa。應(yīng)當(dāng)理解,這些大小代表估計(jì)值,而不是精確測(cè)量值。根據(jù) 優(yōu)選的實(shí)施方案,根據(jù)本發(fā)明的分子綴合親水聚合物的異質(zhì)群體,例如大小為例如10,000、 40,000 或 80,OOODa士 約 5000、約 4000、約 3000、約 2000 或約 IOOODa 的 PEG。0-聯(lián)寡糖通過(guò)生產(chǎn)蛋白的細(xì)胞,使N-聚糖和0-聚糖附著到蛋白上。隨著新生 的蛋白從核糖體轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng),細(xì)胞的N-糖基化機(jī)構(gòu)識(shí)別和糖基化氨基酸鏈中的N-糖基 化信號(hào)(N-X-S/T 基序)(Kiely 等人 1976 ;Glabe 等人 1980)。同樣地,0-聚糖附著氨基酸鏈中的特定0-糖基化位點(diǎn),但是觸發(fā)0-糖基化的基 序比N-糖基化信號(hào)的異質(zhì)性高得多,我們?nèi)匀徊荒茴A(yù)測(cè)氨基酸序列中的0-糖基化位點(diǎn) (Julenius等人2004)。人工的0-糖基化位點(diǎn)的構(gòu)建因而伴有一些不確定性。一般的假設(shè) 是,天然FVIII分子不含有任何0-糖基化位點(diǎn),且技術(shù)人員因此預(yù)期,在實(shí)踐本發(fā)明方面, 必須構(gòu)建至少一個(gè)人工的0-糖基化位點(diǎn),并插入B結(jié)構(gòu)域。截短的因子VIII B結(jié)構(gòu)域中的0-聯(lián)寡糖因而可以共價(jià)地連接天然存在的0-聯(lián) 糖基化序列或已經(jīng)通過(guò)重組技術(shù)人工構(gòu)建的0-聯(lián)糖基化序列。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案,0-聯(lián)寡糖連接至天然存在的0-聯(lián)糖基化序列, 后者在野生型因子VIII分子中不暴露于糖基化,但是作為B結(jié)構(gòu)域截短的結(jié)果,變得可進(jìn) 行0-糖基化。其實(shí)例顯示在實(shí)施例和SEQ ID NO 2中(截短的B-結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)著氨基酸742-763)。即使B-結(jié)構(gòu)域在稍微不同的位置被截短,S卩如果截短的B結(jié)構(gòu)域與SEQ ID NO 2 相比稍微更短(例如比SEQ ID NO 2短1、2、3、4或5個(gè)氨基酸)或更長(zhǎng)(例如長(zhǎng)1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45 或 50 個(gè)氨基酸),SEQ ID NO 2 中的“隱藏的”0-糖 基化位點(diǎn)似乎也變成糖基化的。該通過(guò)截短B-結(jié)構(gòu)域來(lái)激活“隱藏的” 0-糖基化位點(diǎn)、而 不是生成人工0-糖基化位點(diǎn)的方案,具有生成具有有利的安全概況(即減少的變應(yīng)原性 等)的分子的優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)以不同方式截短分子,同樣可以激活因子VIII B-結(jié)構(gòu)域中的其 它0-糖基化位點(diǎn)。
      0-聯(lián)寡糖的糖-PEG化(Glyco-PEGylation)通過(guò)在牛物合成的相對(duì)早期,添加唾 液酸殘基,可以修飾和終止0-聚糖的生物合成。某些唾液酸轉(zhuǎn)移酶在核心1 GalT作用后能 作用于GalNAc α -Ser/Thr或早期0_聚糖核心亞型。術(shù)語(yǔ)T抗原與Gal β l_3GalNAc α -Ser/ Thr 二糖的存在有關(guān)。這些結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生涉及糖基轉(zhuǎn)移酶之間競(jìng)爭(zhēng)相同的底物,且因而高爾基 體內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)水平和亞細(xì)胞分布決定了 0-聚糖生物合成的結(jié)構(gòu)結(jié)果和多樣化。 如

      圖1所示,僅Gal β l-3GalNAc α -Ser/Thr 二糖順從糖PEG化。但是,通過(guò)用唾液酸酶或核心1 GalT或它們的組合處理蛋白,可以極大地增強(qiáng)該 結(jié)構(gòu)的可利用量。作為糖PEG化過(guò)程的結(jié)果,通過(guò)與靶蛋白的Gal β l-3GalNAc α -Ser/Thr 二糖的α 3鍵,唾液酸PEG添加到天然結(jié)構(gòu)上(圖1)。其它親水聚合物也可以附著到0-聯(lián)寡糖上。通過(guò)0-聚糖將其它親水聚合物酶 促地綴合到FVIII上的基本要求是,如在W003031464中公開(kāi)的通過(guò)游離氨基使它們與甘 氨酰基_唾液酸衍生物偶聯(lián)的能力。這可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多種偶聯(lián)化學(xué) 來(lái)實(shí)現(xiàn)。激活的生物相容的聚合物的實(shí)例包括聚環(huán)氧烷,例如、但不限于,聚乙二醇(PEG)、 2-(甲基丙烯?;?乙基磷酸膽堿(mPC)聚合物(如W003062290所述)、葡聚糖、多聚乙 酰神經(jīng)氨酸或其它基于碳水化合物的聚合物、氨基酸或特定肽序列的聚合物、生物素衍生 物、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、乙烯-馬來(lái)酐共聚物、苯乙烯_蘋(píng)果酸酐 共聚物、聚v惡唑啉、聚丙烯酰嗎啉、肝素、清蛋白、纖維素、殼聚糖的水解產(chǎn)物、淀粉例如羥乙 基_淀粉和羥丙基_淀粉、糖原、瓊脂糖和其衍生物、瓜耳膠、支鏈淀粉、菊粉、黃原膠、角叉 菜聚糖、果膠、藻酸水解產(chǎn)物、其它生物聚合物和它們的任意等價(jià)物。藥物組合物藥物組合物在本文中優(yōu)選地意在包括適合腸胃外施用的包含根據(jù)本 發(fā)明的因子villi分子的組合物,例如即可使用的無(wú)菌含水組合物或可以在例如水或含水 緩沖液中重構(gòu)的干燥的無(wú)菌組合物。根據(jù)本發(fā)明的組合物可以包含各種藥學(xué)上可接受的賦 形劑、穩(wěn)定劑等。這種組合物中的其它成分可以包括潤(rùn)濕劑、乳化劑、抗氧化劑、填充劑、張力調(diào)節(jié) 齊U、螯合劑、金屬離子、油性載體、蛋白(例如,人血清清蛋白、明膠或蛋白)和兩性離子(例 如,氨基酸,例如甜菜堿、?;撬?、精氨酸、甘氨酸、賴氨酸和組氨酸)。這種其它成分當(dāng)然不 應(yīng)不利地影響本發(fā)明的藥物制劑的總穩(wěn)定性。借助于注射器,任選筆樣注射器,通過(guò)皮下 的、肌內(nèi)的、腹膜內(nèi)的或靜脈內(nèi)的注射,可以進(jìn)行腸胃外施用?;蛘撸柚谳斪⒈?,可以進(jìn) 行腸胃外施用。另一個(gè)選擇是鼻或肺噴霧劑形式的組合物,其可以是用于施用FVIII化合 物的溶液或懸浮液。作為另一個(gè)選擇,含有本發(fā)明的FVIII化合物的藥物組合物也可以適 合于經(jīng)皮施用(例如通過(guò)無(wú)針注射或來(lái)自貼劑,任選離子電滲療法貼劑)或跨粘膜的(例 如口腔含化的)施用。
      在第一個(gè)方面,本發(fā)明因而涉及具有改變的循環(huán)半衰期的B-結(jié)構(gòu)域截短的因子 VIII分子,所述分子在截短的B結(jié)構(gòu)域中通過(guò)0-聯(lián)寡糖與親水聚合物共價(jià)綴合,其中因子 VIII激活(分子的激活)導(dǎo)致共價(jià)綴合的親水聚合物的去除。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案,親水聚合物是PEG。PEG聚合物的大小可以是約10,000至 約 160,OOODa,例如 10,000 至 80,OOODa,例如約 10,000、15,000,20, 000,25, 000,30, 000、 35,000,40, 000,45, 000,50, 000,55, 000,60, 000,65, 000,70, 000,75, 000 或 80,OOODa0 優(yōu) 選地,0-聯(lián)寡糖附著到通過(guò)截短B-結(jié)構(gòu)域、而不是通過(guò)插入在野生型FVIII分子中不存在 的人工0-糖基化位點(diǎn)產(chǎn)生的0-糖基化位點(diǎn)上。
      根據(jù)特別優(yōu)選的實(shí)施方案,根據(jù)本發(fā)明的分子包含如SEQ ID NO 2所述的氨基酸 序列。這種分子具有獨(dú)特的特征,因?yàn)榧せ畹腇VIII分子與天然的活性FVIII分子相同。該 特征似乎在安全性評(píng)判方面具有有利的性質(zhì)。本發(fā)明也涉及包含根據(jù)本發(fā)明的分子的藥物組合物。本發(fā)明此外涉及得到根據(jù)本發(fā)明的分子的方法,其中所述方法包含,通過(guò)截短的B 結(jié)構(gòu)域中的0-聯(lián)寡糖,給B-結(jié)構(gòu)域截短的因子VIII分子綴合親水聚合物,例如PEG基團(tuán)。 因而斷定,本發(fā)明也涉及通過(guò)這種方法得到的或可以得到的分子。在另一個(gè)方面,本發(fā)明涉及治療血友病的方法,其包含給需要治療的患者施用治 療有效量的根據(jù)本發(fā)明的分子。本文使用的術(shù)語(yǔ)“治療”是指需要治療的任意人或其它動(dòng)物受試者的醫(yī)學(xué)療法。 預(yù)期所述受試者已經(jīng)經(jīng)歷醫(yī)學(xué)從業(yè)人員的體檢,所述人員已經(jīng)給出推測(cè)的或確定的診斷, 其可指示所述特定治療的應(yīng)用對(duì)所述人或其它動(dòng)物受試者的健康是有益的。根據(jù)受試者的 健康現(xiàn)狀,所述治療的時(shí)間選擇和目的可以隨個(gè)體不同而異。因而,所述治療可以是預(yù)防性 的、治標(biāo)的、針對(duì)癥狀的和/或治愈的。在另一個(gè)方面,本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的分子作為藥物的用途,以及根據(jù)本發(fā)明 的分子用于生產(chǎn)治療血友病的藥物的用途。在最后的方面,本發(fā)明涉及工程改造根據(jù)本發(fā)明的B-結(jié)構(gòu)域截短的因子VIII分 子的方法,所述方法包含,(i)截短B-結(jié)構(gòu)域,和任選地對(duì)該截短的因子VIII分子的氨基 酸序列進(jìn)行鑒定潛在的0-聯(lián)糖基化位點(diǎn)的分析,(ii)在合適的宿主細(xì)胞中生產(chǎn)該分子,和 (iii)選擇在截短的B-結(jié)構(gòu)域中具有0-聯(lián)聚糖的分子。附圖簡(jiǎn)述在附圖中,綴合基團(tuán)的大小有時(shí)稱(chēng)作“K”,它在本文中意在等同于KDa(千道爾 頓)。圖1 :0_聯(lián)寡糖的糖PEG化過(guò)程的示意圖。該圖不代表取得在實(shí)施例中得到的產(chǎn) 物的可行方式的窮盡列表。圖2 反應(yīng)混合物在Source 15Q上的離子交換層析(A)。收集的級(jí)分的SDS-PAGE, 含有分子標(biāo)記(左邊)(B)。圖3 加帽的產(chǎn)物在superdex 200大小排阻層析上的純化。圖4 使用各種aPTT試劑,0_糖PEG化的rFVIII的凝固活性。㈧顯示了凝固活 性和生色活性之間的比。(B)顯示了比凝固活性。圖5 :40K-PEG-
      -N8在FVIII KO小鼠中的體內(nèi)作用(閉塞時(shí)間)。
      圖6:顯示生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的糖PEG化的因子FVIII所包含的過(guò)程步驟的流程圖。圖7 在實(shí) 施例中生產(chǎn)的根據(jù)本發(fā)明的因子VIII分子的示意圖。
      實(shí)施例實(shí)施例1重組的B結(jié)構(gòu)域截短的0-糖基化的因子VIII的生產(chǎn)在SEQ ID NO 2中給出了 B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII分子的氨基酸序列的實(shí)例。該 多肽也可以稱(chēng)作“N8”。該分子包含21個(gè)氨基酸殘基的接頭序列(SFSQNSRHPSQNPPVLKRHQR, 加有下劃線的S是在實(shí)施例2的含有加入聚乙二醇的0-聚糖的絲氨酸殘基)。根據(jù)本發(fā)明的因子VIII分子在實(shí)施例中可以以各種方式提及,但是所有提及的 “因子VIII分子”都表示根據(jù)本發(fā)明的因子VIII分子,或者在轉(zhuǎn)變成根據(jù)本發(fā)明的因子 VIII分子的過(guò)程中的因子VIII分子。SEQ ID NO 2 ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWM GLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGP MASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAA SARAffPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYffHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLL MDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKK HPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLY GEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKffTVTVEDGPTKSDPRCLTR YYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEF QASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENP GLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTCDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNSRHPSQNPPVLKRHQRE ITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGS VPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPR KNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFF TIFDETKSWYFTE匪ERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIH FSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRD FQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAffSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKK WQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDA QITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSS QDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY細(xì)胞系和培養(yǎng)過(guò)程使用因子VIII cDNA,構(gòu)建哺乳動(dòng)物表達(dá)質(zhì)粒,其編碼具有SEQ IDNO 2所述氨基酸 序列的B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII。該質(zhì)粒編碼包含全長(zhǎng)人因子VIII的氨基酸1-740的因 子VIII重鏈和包含全長(zhǎng)人因子VIII的氨基酸1649-2332的因子VIII輕鏈。重鏈和輕鏈 序列通過(guò)具有全長(zhǎng)人因子VIII的氨基酸741-750和1638-1648的序列的21氨基酸接頭相 連。用編碼BDD因子VIII的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞,并用二氫葉酸還原酶系統(tǒng) 選擇,最終產(chǎn)生在無(wú)動(dòng)物組分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的無(wú)性系懸浮生產(chǎn)細(xì)胞。
      該過(guò)程的第一步是,將來(lái)自工作細(xì)胞庫(kù)小瓶的細(xì)胞小瓶接種進(jìn)化學(xué)成分確知的且無(wú)動(dòng)物組分的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。最初,解凍后,在τ-瓶中溫育細(xì)胞。解凍后1或2天,將細(xì)胞 轉(zhuǎn)移至搖瓶,并通過(guò)連續(xù)稀釋擴(kuò)大培養(yǎng)體積,以便使細(xì)胞密度維持在0. 2-3. OxlO6細(xì)胞/ml。 下一步是,將搖瓶培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移進(jìn)種子生物反應(yīng)器。在這里進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)體積,然后最終轉(zhuǎn) 移至生產(chǎn)生物反應(yīng)器。相同的化學(xué)成分確知的且無(wú)動(dòng)物組分的培養(yǎng)基用于所有接種物增殖 步驟。轉(zhuǎn)移至生產(chǎn)生物反應(yīng)器后,給培養(yǎng)基補(bǔ)充增加產(chǎn)物濃度的組分。在生產(chǎn)生物反應(yīng)器 中,以3天的循環(huán)時(shí)間,以重復(fù)的分批方法培養(yǎng)細(xì)胞。在收獲時(shí),將80-90%的培養(yǎng)體積轉(zhuǎn)移 至收獲罐。然后用新鮮的培養(yǎng)基稀釋剩余的培養(yǎng)液,以得到最初的細(xì)胞密度,且然后開(kāi)始新 的生長(zhǎng)期。通過(guò)離心和過(guò)濾,澄清收獲批,并轉(zhuǎn)移至貯藏罐,然后開(kāi)始純化過(guò)程。將緩沖液加 入貯藏罐中的無(wú)細(xì)胞的收獲物,以穩(wěn)定化pH。在生產(chǎn)運(yùn)行結(jié)束前,收集細(xì)胞,并冷凍,以造成生產(chǎn)細(xì)胞庫(kù)的結(jié)束。測(cè)試該細(xì)胞庫(kù) 的支原體、無(wú)菌性和病毒污染。純化為了從細(xì)胞培養(yǎng)基分離B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII,使用4步純化程序,包括在 Capto MMC柱上的濃縮步驟、免疫吸附(immunoabsorbent)層析步驟、陰離子交換層析和最 終的凝膠過(guò)濾步驟。通常,使用下述程序以15ml/分鐘的流速,用泵將11升無(wú)菌過(guò)濾的 培養(yǎng)基泵到Capto MMC (GE Healthcare,瑞典)的柱(1.6x12cm)上,后者在緩沖液A中平 衡20mM 咪唑,IOmM CaCl2, 50mM NaCl,0. 02 % 吐溫 80,pH = 7. 5。用 75ml 緩沖液 A 洗滌 柱,然后用含有1.5M NaCl的75ml緩沖液A洗滌。以Iml/分鐘的流速,用20mM咪唑、IOmM CaCl2、0. 02%吐溫80、2. 5M NaCl、8M乙二醇、pH = 7. 5洗脫蛋白。收集8ml級(jí)分,且測(cè)定因 子VIII活性(CoA-實(shí)驗(yàn))。合并含有因子VIII的級(jí)分,且正常得到約50ml的合并體積。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了抗因子VIII的單克隆抗體(Kjalke Eur J Biochem 234773)。通過(guò) 對(duì)該抗體進(jìn)行表位繪圖(結(jié)果未顯示),發(fā)現(xiàn)F25識(shí)別從氨基酸殘基725至740的重鏈遠(yuǎn) C-末端序列?;旧先缟a(chǎn)商所述,以2. 4mg/ml凝膠的密度,將F25抗體偶聯(lián)至NHS-激活 的 S印harose 4FF (GE Healthcare, Bio-Sciences AB,Uppsala,瑞典)。用 20mM 咪唑、IOmM CaCl2、0. 02%吐溫80、pH = 7. 3,將來(lái)自前述步驟的庫(kù)稀釋10倍,并以0. 5ml/分鐘的流速, 應(yīng)用于 F25 S印harose 柱(1.6x9. 5cm),后者用 20mM 咪唑、IOmM CaCl2、150mM NaCl.O. 02% 吐溫80、IM丙三醇、pH = 7. 3平衡過(guò)。用平衡緩沖液洗滌柱,直到紫外信號(hào)恒定,且然后用 20mM咪唑、IOmM CaCl2、0. 65M NaCUpH = 7. 3洗滌,直到紫外信號(hào)再次恒定。以Iml/分鐘 的流速,用 20mM 咪唑、IOmM CaCl2、0. 02%吐溫 80、2. 5M NaCl、50% 乙二醇、pH = 7. 3 洗脫 因子VIII。收集Iml級(jí)分,且測(cè)定因子VIII活性(CoA-實(shí)驗(yàn))。合并含有因子VIII的級(jí) 分,且正常得到約25ml的合并體積。為離子交換步驟制備緩沖液A :20mM咪唑、IOmM CaCl2、0. 02%吐溫80、IM丙三醇、 PH = 7. 3和緩沖液B :20mM咪唑、IOmM CaCl2、0. 02%吐溫80、1M丙三醇、IM NaCUpH = 7. 3。 以2ml/分鐘的流速,用85%緩沖液A/15%緩沖液B平衡Macro-Pr印25Q Support (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)的柱(IxlOcm)。用緩沖液A將來(lái)自前述步驟的庫(kù)稀釋 10倍,且以2ml/分鐘的流速泵到柱上。以2ml/分鐘的流速,用85%緩沖液A/15%緩沖液 B洗滌柱,且以2ml/分鐘的流速,以從15%緩沖液B至70%緩沖液B的線性梯度,在120ml范圍內(nèi)洗脫因子VIII。收集2ml級(jí)分,且測(cè)定因子VIII活性(CoA-實(shí)驗(yàn))。合并含有因子 VIII的級(jí)分,且正常得到約36ml的合并體積 將來(lái)自前述步驟的庫(kù)應(yīng)用到Superdex 200制備級(jí)(GE Healthcare,Bio-Sciences AB,Uppsala,瑞典)柱(2. 6x60cm),后者用 20mM 咪唑、IOmM CaCl2、0. 02% 吐溫 80、1M 丙三 醇、150mM NaCl、pH = 7. 3平衡過(guò),并用其在lml/分鐘洗脫。收集3ml級(jí)分,且測(cè)定因子VIII 活性(CoA-實(shí)驗(yàn))。合并含有因子VIII的級(jí)分,且正常得到約57ml的合并體積。在_80°C 儲(chǔ)存含有因子VIII的庫(kù)。 利用上述的4步純化程序,得到約15 %的總得率,如通過(guò)CoA活性和ELISA測(cè)量來(lái) 判斷的。用于生產(chǎn)N8的細(xì)胞系是用在PTSV7中的表達(dá)質(zhì)粒#814 F8-500穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的重組 的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系,所述在pTSV7中的表達(dá)質(zhì)粒#814 F8-500由含有插入片段 的pTSV7表達(dá)載體組成,所述插入片段含有編碼F8-500蛋白的cDNA。“N8”在本文中意在對(duì) 應(yīng)于具有SEQ ID NO 2所列出的氨基酸序列的蛋白。從N-末端開(kāi)始,F(xiàn)8-500蛋白(N8)由 FVIII信號(hào)肽(氨基酸-19至-1)、然后是沒(méi)有B結(jié)構(gòu)域的FVIII重鏈(氨基酸1_740)、21氨 基酸接頭(SFSQNSRHPSQNPPVLKRHQR)和FVIII輕鏈(野生型人FVIII的氨基酸1649-2332) 組成。21氨基酸接頭的序列源自FVIII B結(jié)構(gòu)域,且由全長(zhǎng)FVIII的氨基酸741-750和 1638-1648 組成。用在pTSV7中的814 F8-500轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞,并用二氫葉酸還原酶系統(tǒng)選擇,最終 產(chǎn)生在無(wú)動(dòng)物組分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的無(wú)性系懸浮生產(chǎn)細(xì)胞。如下開(kāi)始生產(chǎn)運(yùn)行解凍工作 細(xì)胞庫(kù)小瓶,并增殖細(xì)胞,直到轉(zhuǎn)移至生產(chǎn)生物反應(yīng)器。相同的化學(xué)成分確知的且無(wú)動(dòng)物組 分的培養(yǎng)基用于所有接種物增殖步驟。轉(zhuǎn)移至生產(chǎn)生物反應(yīng)器后,給培養(yǎng)基補(bǔ)充增加產(chǎn)物 濃度的組分。在生產(chǎn)生物反應(yīng)器中,以3天的循環(huán)時(shí)間,以重復(fù)的分批方法培養(yǎng)細(xì)胞。在收 獲時(shí),將80-90%的培養(yǎng)體積轉(zhuǎn)移至收獲罐。然后用新鮮的培養(yǎng)基稀釋剩余的培養(yǎng)液,以得 到最初的細(xì)胞密度,且然后開(kāi)始新的生長(zhǎng)期。通過(guò)離心和過(guò)濾,澄清收獲批,并轉(zhuǎn)移至貯藏 罐,然后開(kāi)始純化過(guò)程。將緩沖液加入貯藏罐中的無(wú)細(xì)胞的收獲物,以穩(wěn)定化PH。實(shí)施例2重組的B結(jié)構(gòu)域截短的且0-糖基化的因子VIII的加入聚乙二醇使用下述程序,用聚乙二醇(PEG)綴合在實(shí)施例1中得到的重組因子VIII分子為了有效地進(jìn)行在實(shí)施例1中得到的重組因子VIII分子的糖PEG化,> 5mg/ml 的FVIII濃度是優(yōu)選的。由于FVIII在該濃度正常是不溶的,所述篩選選擇的緩沖液組合 物(參見(jiàn)表1中的一些結(jié)果)?;谶@些考慮,發(fā)現(xiàn)含有50mM MES、50mM CaC12、150mM NaCl、20%丙三醇、pH 6.0 的緩沖液是合適的反應(yīng)緩沖液。表1反應(yīng)條件對(duì)FVIII溶解度和聚集的影響的評(píng)價(jià)
      權(quán)利要求
      具有改變的循環(huán)半衰期的B 結(jié)構(gòu)域截短的因子VIII分子,所述分子在截短的B結(jié)構(gòu)域中通過(guò)O 聯(lián)寡糖與親水聚合物共價(jià)綴合,其中因子VIII激活導(dǎo)致共價(jià)綴合的親水聚合物的去除。
      2.根據(jù)權(quán)利要求1的分子,其中所述0-聯(lián)寡糖附著到通過(guò)截短B-結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生的0-糖 基化位點(diǎn)上。
      3.根據(jù)權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)的分子,其中所述親水聚合物是PEG。
      4.根據(jù)權(quán)利要求3的分子,其中所述PEG的大小是約10,000至約160,OOODa0
      5.根據(jù)權(quán)利要求4的分子,其中所述PEG的大小是約40,OOODa0
      6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的分子,其包含如SEQID NO 2所述的氨基酸序列。
      7.藥物組合物,其包含根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的分子。
      8.制備根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的分子的方法,其中所述方法包含,通過(guò)截短的B結(jié) 構(gòu)域中的0-聯(lián)寡糖,給B-結(jié)構(gòu)域截短的因子VIII分子綴合親水聚合物。
      9.通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求8的方法可得到的分子。
      10.治療血友病的方法,其包含,給需要治療的患者施用治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求 1-6中任一項(xiàng)的分子。
      11.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的分子作為藥物的用途。
      12.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的分子用于生產(chǎn)治療血友病的藥物的用途。
      13.工程改造根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的B-結(jié)構(gòu)域截短的因子VIII分子的方法,所 述方法包含,(i)截短B-結(jié)構(gòu)域,和任選地對(duì)該截短的因子VIII分子的氨基酸序列進(jìn)行鑒 定潛在的0-聯(lián)糖基化位點(diǎn)的分析,(ii)在合適的宿主細(xì)胞中生產(chǎn)該分子,和(iii)選擇在 截短的B-結(jié)構(gòu)域中具有0-聯(lián)聚糖的分子。
      全文摘要
      本發(fā)明涉及具有改變的循環(huán)半衰期的B-結(jié)構(gòu)域截短的因子VIII分子,所述分子與親水聚合物共價(jià)綴合。本發(fā)明此外涉及用于得到這種分子的方法以及這種分子的用途。
      文檔編號(hào)A61P7/04GK101965200SQ200980106738
      公開(kāi)日2011年2月2日 申請(qǐng)日期2009年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月27日
      發(fā)明者B·B·S·范達(dá)爾, G·博爾特, H·R·斯特尼克, L·蒂姆, S·德弗里斯, T·D·斯蒂恩斯特魯普 申請(qǐng)人:諾沃-諾迪斯克有限公司
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