專利名稱：腺病毒向性的調(diào)節(jié)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腺病毒，并且特別涉及降低腺病毒對肝細胞的向性的方法。
背景技術(shù)：
腺病毒是腫瘤學(xué)、心血管學(xué)、再生醫(yī)學(xué)中實驗上以及完成的和進行的臨床試驗 中用于基因遞送和作為疫苗載體使用的常見病原體(Schenk-Braat etal.，2007 ； Kawabata etal, 2006)。許多工作已經(jīng)在臨床前和臨床上證明了腺病毒介導(dǎo)的基因療法的潛在益處 和局限性，后者是通過1999年Jesse Gelsinger由于直接遞送入肝動脈的極高劑量的5型腺 病毒(Ad5)而導(dǎo)致的死亡而引起重視(Raper et al.，2003)。這顯著地突出了在載體可以 完全優(yōu)化用于臨床用途之前，充分理解界定了腺病毒的肝感染性以及體內(nèi)毒性的病毒學(xué)和生物學(xué)方的需要。
已經(jīng)廣泛研究了基于人血清型5的腺病毒，但是關(guān)于感染機制，特別是體內(nèi)感 染機制的根本問題仍待闡明。腺病毒主要由三種主要的衣殼蛋白組成六鄰體、五鄰體 和纖維。已經(jīng)解析了 Ad2和Ad5六鄰體的晶體結(jié)構(gòu)(Athappilly et al., 1995 ； Roberts et al., 1986 ； Rux andBurnett, 2000)，并且其揭示了復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。腺病毒中主要的抗原性 位點六鄰體(Pichla-Gollon，2007 ； Roberts et al., 2006 ； Sumida et al.，2005)是最豐富 的衣殼蛋白，并且位于病毒體的表面，排列成與相鄰的單體相互連接的240同源三聚體 結(jié)構(gòu)，因而提供了結(jié)構(gòu)支持。與衣殼表面的五鄰體基座銜接從病毒體突出的纖維(San Martin and Burnett, 2003)長度高度可變，并且被認(rèn)為是決定細胞感染性的主要位點[綜 述于(Nicklin et al., 2005)]。對于包括Ad5的亞群C腺病毒，位于三聚體纖維軸末端處 的球狀纖維結(jié)與柯薩奇病毒(coxsackie)和腺病毒受體結(jié)合，并且在小鼠和人中以解剖學(xué) 上相似的方式表達(Bergelson et al., 1997 ； Tomko et al., 1997)，而亞群B腺病毒則利用 普遍地在人中表達但局限于小鼠的睪丸中的CD46 (Gaggar et al., 2003 ； Segerman et al., 2003)，Ad5內(nèi)化是由整聯(lián)蛋白與五鄰體基座的銜接所介導(dǎo)(Wickham etal.，1993)。廣泛 的研究工作主要集中于用于不同基因療法應(yīng)用中細胞相互作用的分析的纖維蛋白。血管內(nèi)遞送后，其是許多臨床應(yīng)用中重要的給藥途徑，肝是具有大量肝細胞 轉(zhuǎn)導(dǎo)的Ad5隔絕(sequestration)的主要位點(Huard et al.，1995)。在嚙齒類和非人靈 長類中，經(jīng)誘變改造而缺乏CAR結(jié)合的Ad5載體在血管內(nèi)注射后表現(xiàn)出相同的肝轉(zhuǎn) 導(dǎo)(Alemany and Curiel，2001 ； Smith et al.，2003)，這表明了體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移的替代途 徑。利用離體灌注模型，包括凝血因子IX(FIX)與補體結(jié)合蛋白_4(C4BP)的許多 血漿蛋白被證明在肝中結(jié)合Ad纖維節(jié)并“橋接”病毒與替代受體，因而潛在地繞過 CAR(Shayakhmetov et al., 2005)。利用表面等離子體共振(SPR)，我們證實Ad5與維生 素K依賴性凝血因子X(FX)直接結(jié)合(Parker et al., 2006)。在用華法林預(yù)處理(去除 維生素K依賴性凝血因子的功能性水平)的小鼠中，對于CAR結(jié)合Ad5載體與CAR結(jié) 合突變體Ad5載體，肝感染都降低了幾個數(shù)量級(Parker etal.，2006 ； Waddington etal., 2007)，這表明了肝靶向中宿主因子的重要功能。在靜脈內(nèi)Ad5注射前，向華法林處理的 小鼠注射生理水平的FX完全恢復(fù)了肝基因轉(zhuǎn)移(Parker et al., 2006 ； Waddington et al.,2007)。FX還涉及脾的轉(zhuǎn)導(dǎo)(Waddington et al.，2007)，脾的轉(zhuǎn)導(dǎo)也可以促進腺病毒基因 遞送載體的毒性。發(fā)明概述本發(fā)明部分源自將六 鄰體，特別是六鄰體的高變區(qū)(HVR)鑒定為主要負(fù)責(zé)與因 子X(FX)相互作用的病毒部分，該因子X介導(dǎo)體內(nèi)肝細胞以及其他細胞類型的腺病毒感 染，所述其他細胞類型的轉(zhuǎn)導(dǎo)由FX介導(dǎo)，諸如脾細胞。本發(fā)明人還將FX的Gla結(jié)構(gòu)域 鑒定為參與該相互作用。這些發(fā)現(xiàn)使提供以下成為可能尤其是調(diào)節(jié)肝細胞和脾細胞的 腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法，例如，通過穩(wěn)定、增強、抑制或破壞FX與腺病毒之間的相互作用； 篩選能夠調(diào)節(jié)該相互作用的新試劑的方法；以及具有對肝細胞與脾細胞的改變的向性的 新腺病毒和產(chǎn)生及鑒定這些新病毒的方法。本發(fā)明提供了抑制FX介導(dǎo)的細胞的腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法，該方法包括使所述細胞 與所述腺病毒在能夠抑制FX與腺病毒六鄰體蛋白之間的相互作用的試劑的存在下接觸。因此，本發(fā)明提供了抑制肝細胞或脾細胞的腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法，該方法包括使 所述肝細胞或脾細胞與所述腺病毒在能夠抑制FX與腺病毒六鄰體蛋白之間的相互作用的 試劑的存在下接觸。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的方法發(fā)現(xiàn)了特定的體內(nèi)用途，特別是減少個體中肝細胞或 脾細胞的腺病毒感染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的用途，所述腺病毒是有意地向該個體給藥，例如用于治療 目的。因此，所述方法可以包括將所述試劑和所述腺病毒給予個體。在腺病毒給藥前，將個體用所述試劑預(yù)處理是可取的，特別是當(dāng)該試劑與FX 結(jié)合時。最優(yōu)的預(yù)處理時間可以根據(jù)諸如個體的個性和物種、試劑的個性等的因素來確 定。因此，例如，預(yù)處理可以在給藥的1小時內(nèi)進行，例如，給藥前30分鐘或更少?？?選地，預(yù)處理可以在所述給藥前至少1、2、3、4、5、6小時或更長?？蛇x地，將試劑與腺病毒預(yù)混合是可取的，特別是當(dāng)該試劑與腺病毒結(jié)合時。 混合可以在給藥的1小時內(nèi)進行，例如給藥前30分鐘或更少。可選地，預(yù)混合可以在所 述給藥前至少1、2、3、4、5、6小時或更長。本發(fā)明還涉及體外或離體實施的方法。這些方法在含有FX的環(huán)境中實施，通常 為培養(yǎng)基?？梢韵蚺囵B(yǎng)基中單獨地添加FX，或者FX可以為諸如血清(如，胎牛血清， FCS)的培養(yǎng)基的大量補充物的部分。對于體外實施的方法，腺病毒含有抑制腺病毒與柯薩奇病毒和腺病毒受體 (CAR)結(jié)合的突變是可取的。例如，這通過降低其它機制的細胞感染發(fā)生率，可以便于 FX與Gla之間的相互作用的研究?？蛇x地，使用不具有CAR表達或具有低CAR表達的細胞類型是優(yōu)選的，例如 SKOV3細胞。關(guān)于體外或體內(nèi)實施的方法，抑制劑可以與FX的Gla結(jié)構(gòu)域結(jié)合。例如，所述試劑可以是來自尖吻蝮(Deinagkistrodon acutus)的FX結(jié)合蛋白 (X-bp)、其類似物或以上任一的功能片段，所述功能片段能夠與FX結(jié)合并抑制與六鄰 體蛋白的相互作用的。與FX結(jié)合的抑制劑的另一實例是特異性針對FX的抗體，特別是特異性針對FX 的Gla結(jié)構(gòu)域的抗體。然而，應(yīng)當(dāng)理解，抗體與Gla結(jié)構(gòu)域直接結(jié)合以使其抑制Gla與六鄰體之間的相互作用不是必須的。例如，抗體可以與FX分子的另一表位結(jié)合，該表 位在折疊的分子中與Gla結(jié)構(gòu)域足夠接近從而該抗體在空間上干擾Gla與六鄰體的結(jié)合。 可選地，抗體可以間接地干擾相互作用，例如通過影響Gla分子的構(gòu)象或三維結(jié)構(gòu)。另一實例是包含能夠與FX Gla結(jié)合的腺病毒六鄰體蛋白片段的可溶分子。該分 子可以是全長六鄰體蛋白或者可以包含全長六鄰體蛋白?？蛇x地，抑制劑可以與腺病毒六鄰體蛋白結(jié)合。例如，抑制劑可以是特異性針對六鄰體蛋白的抗體，特別是特異性針 對六鄰體 蛋白的HVR的抗體。如上文關(guān)于Gla已經(jīng)解釋的，應(yīng)當(dāng)理解，抗體與HVR直接結(jié)合以 使其抑制Gla與六鄰體之間的相互作用不是必須的。例如，抗體可以與六鄰體分子的另一 表位結(jié)合，該表位在折疊的分子中與HVR結(jié)構(gòu)域足夠接近從而該抗體在空間上干擾Gla 與六鄰體的結(jié)合?？蛇x地，該抗體可以間接地干擾相互作用，例如通過影響六鄰體分子 的構(gòu)象或三維結(jié)構(gòu)。能夠與腺病毒六鄰體蛋白結(jié)合的抑制劑的另一實例是FX類似物，其包含足以與 六鄰體蛋白結(jié)合的Gla結(jié)構(gòu)域片段，但是包含SP結(jié)構(gòu)域的修飾，從而該類似物不能介導(dǎo) 腺病毒與肝細胞或脾細胞之間的相互作用。例如，該類似物可以包含SP結(jié)構(gòu)域的硫酸 類肝素蛋白多糖結(jié)合胞外區(qū)(exocyte)中的突變，該突變減少或去除與肝細胞或脾細胞的 結(jié)合?？蛇x地，F(xiàn)X類似物可以完全缺乏SP結(jié)構(gòu)域。FX類似物可以包含完整的FXGla 結(jié)構(gòu)域，但是缺乏一個或多個結(jié)構(gòu)域，包括SP結(jié)構(gòu)域，以及任選的EGF2結(jié)構(gòu)域和/或 EGFl結(jié)構(gòu)域。例如，F(xiàn)X類似物可以包含由Gla結(jié)構(gòu)域單獨組成、由Gla-EGFl組成或 由Gla-EGF1_EGF2組成的FX組分。FX類似物可以是融合蛋白，該融合蛋白包含F(xiàn)X組 分(例如單獨的Gla結(jié)構(gòu)域、Gla-EGFl或Gla-EGF 1-EGF2)和異源融合伴侶(即不源自 FX的蛋白或蛋白結(jié)構(gòu)域)。腺病毒或六鄰體蛋白可以是任何合適的血清型的。在某些實施方案中，其可以 是Ad2或Ad5六鄰體蛋白。本發(fā)明的方法特別適用于作為或意圖用作基因轉(zhuǎn)移載體的腺病毒。本發(fā)明還提供了能夠抑制FX與腺病毒六鄰體蛋白之間的相互作用的試劑在藥物 制備中的用途，目的是抑制由腺病毒造成的肝細胞或脾細胞的感染。本發(fā)明還提供了能夠抑制FX與腺病毒六鄰體蛋白之間的相互作用的試劑，目的 用于抑制由腺病毒造成的肝細胞或脾細胞的感染。本發(fā)明還提供了能夠抑制FX與腺病毒六鄰體蛋白之間的相互作用的試劑，目的 用于醫(yī)療方法。上文列出了本發(fā)明的這些方面的優(yōu)選特征?？梢詫⑷绫菊f明書中所述的抑制劑配制為藥物組合物和試劑盒。因此，本發(fā)明 提供了藥物制劑，其包含能夠抑制FX與腺病毒六鄰體蛋白之間相互作用的試劑和腺病 毒，每個都與制藥上可接受的載體組合?？梢詫⒁种苿┡c腺病毒配制為單獨給藥或共同給藥，以及配制在相同的或不同 的組合物中。本發(fā)明還提供了試劑盒，該試劑盒包含第一組合物，其包含能夠抑制FX與腺病 毒六鄰體蛋白之間相互作用的試劑和腺病毒，以及包含腺病毒的第二組合物。優(yōu)選地，每個組合物為包含各自的活性組分(抑制劑或腺病毒)以及制藥上可接受的載體的藥物組 合物?？梢詫⒔M合物提供在單獨的容器中，任選地帶有給藥說明書。六鄰體蛋白與FX的Gla結(jié)構(gòu)域之間的相互作用的知識還使將腺病毒靶向于所選 的組織或細胞類型的方法成為可能。因此，本發(fā)明提供了將基因遞送至靶細胞或靶組織 的方法，該方法包括使所述細胞或組織與腺病毒基因轉(zhuǎn)移載體以及靶向劑接觸，其中所 述靶向劑包含能夠與腺病毒基因轉(zhuǎn)移載體的六鄰體蛋白結(jié)合的FX Gla結(jié)構(gòu)域片段，所述 轉(zhuǎn)移載體與能夠與所述靶細胞或靶組織結(jié)合的結(jié)合劑相連接。靶向劑可以包含F(xiàn)X組分，該FX組分包含完整的FX Gla結(jié)構(gòu)域。所述FX組 分還可以包含F(xiàn)X的一個或多個其它結(jié)構(gòu)域，如EGFl和/或EGF2。因此，F(xiàn)X組分可 以包含 Gla-EGFl 或 Gla_EGFl_EGF2，或者由 Gla-EGFl 或 Gla_EGFl_EGF2 組成。通
常，F(xiàn)X組分不包含F(xiàn)X SP結(jié)構(gòu)域。如果存在SP結(jié)構(gòu)域，則其通常包含修飾，從而其不 能介導(dǎo)腺病毒與肝細胞或脾細胞之間的相互作用，例如SP結(jié)構(gòu)域的硫酸類肝素蛋白多糖 結(jié)合胞外區(qū)中的突變，其減少或去除與肝細胞或脾細胞的結(jié)合。結(jié)合劑與FX組分是異源的，即所述結(jié)合劑不包含源自FX的組分。所述結(jié)合劑 能夠與存在于靶細胞或靶組織上的或與靶細胞或靶組織相關(guān)聯(lián)的結(jié)合伴侶結(jié)合。例如， 所述結(jié)合劑可以包含表達于靶細胞或靶組織表面的分子的配體或受體，或其足以結(jié)合的 片段。例如，所述結(jié)合劑可以包含特異性針對表達于細胞或組織表面的任何分子的抗體 或適體、表達于細胞或組織表面的受體的配體、能夠與存在于細胞或組織表面的碳水化 合物結(jié)合的凝集素，或者任何其它合適的分子。因此，結(jié)合劑所結(jié)合的結(jié)合伴侶可以是由細胞或組織表達的并且位于細胞或組 織表面的分子。優(yōu)選地，結(jié)合伴侶對于靶細胞類型是特異性的，即專門地或優(yōu)先地表達 于靶細胞的表面。例如，當(dāng)靶細胞為轉(zhuǎn)化的細胞時(如癌細胞或腫瘤細胞)時，結(jié)合伴 侶可以為對于該轉(zhuǎn)化的細胞特異性的抗原。這些抗原通常稱為腫瘤特異性抗原，但該術(shù) 語不應(yīng)當(dāng)用來暗示靶細胞必須為實體瘤。靶細胞可以為任何類型的轉(zhuǎn)化的細胞。優(yōu)選地，結(jié)合劑共價連接到FX組分。在某些實施方案中，靶向劑為包含單一多 肽鏈的融合蛋白，所述多肽鏈包含結(jié)合劑與FX組分。肽連接(linker)可以存在于結(jié)合劑 與FX組分之間。在腺病毒給藥前，將個體用所述靶向劑預(yù)處理是可取的。最優(yōu)的預(yù)處理時間可 以根據(jù)諸如個體的個性和物種、靶向劑的個性等的因素來確定。因此，例如，預(yù)處理可 以在給藥的1小時內(nèi)進行，例如，給藥前30分鐘或更少?？蛇x地，預(yù)處理可以在給藥前 至少1、2、3、4、5、6小時或更長?？蛇x地，將靶向劑與腺病毒預(yù)混合是可取的?；旌峡梢栽诮o藥的1小時內(nèi)進 行，例如給藥前30分鐘或更少。可選地，預(yù)混合可以在給藥前至少1、2、3、4、5、6 小時或更長。靶細胞通常不是肝細胞或脾細胞，靶組織通常不是肝或脾。然而，通過使用合 適的結(jié)合劑，所述方法可以適用于增加基因轉(zhuǎn)移載體向肝細胞或脾細胞的靶向。本發(fā)明還提供上文所述的靶向劑在藥物制備中用于通過腺病毒向靶細胞或靶組織進行基因轉(zhuǎn)移的用途。本發(fā)明還提供了上文所述的靶向劑，目的用于通過腺病毒向靶細胞或靶組織進行基因轉(zhuǎn)移。本發(fā)明還提供了上文所述的靶向劑，目的用于醫(yī)療方法。還可以將上文所述的靶向劑配制為藥物組合物和試劑盒。因此本發(fā)明提供了藥 物制劑，其包含上文所述的靶向劑和腺病毒，每個都與藥學(xué)上可接受的載體組合?？梢詫邢騽┡c腺病毒配制為單獨給藥或共同給藥，以及配制在相同的或不同 的組合物中。本發(fā)明還提供了試劑盒，該試劑盒包含第一組合物，其包含上文所述的靶向 齊U，以及包含腺病毒的第二組合物。優(yōu)選地，每一組合物是包含各自的活性組分(靶向 劑或腺病毒)以及藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物?？梢詫⒔M合物提供在單獨的容器 中，任選地帶有給藥說明書。腺病毒六鄰體蛋白(特別是HVRs)和Gla結(jié)構(gòu)域已經(jīng)被鑒定為介導(dǎo)腺病毒與FX 之間的相互作用的重要因子。因此，這使篩選能夠調(diào)節(jié)該相互作用的試劑成為可能。例如，如上文所述，能夠抑制或破壞該相互作用的試劑會發(fā)現(xiàn)在減少肝細胞和其它細胞類 型的腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法中的用途，所述其它細胞類型的轉(zhuǎn)導(dǎo)由FX介導(dǎo)，例如脾細胞。相 反，能夠促進(例如穩(wěn)定或增強)該相互作用的試劑會發(fā)現(xiàn)在將腺病毒載體靶向于肝細胞 以用于向肝進行基因轉(zhuǎn)移，和諸如脾細胞的細胞類型，以用于向諸如脾的其它組織進行 基因轉(zhuǎn)移中的用途，例如，用于肝功能障礙或感染的治療。因此，本發(fā)明提供了篩選能夠調(diào)節(jié)例如肝細胞或脾細胞的FX介導(dǎo)的腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo) 的試劑的方法，該方法包括使測試劑與包含能夠與FX結(jié)合的腺病毒六鄰體蛋白片段的第 一物質(zhì)以及包含能夠與腺病毒六鄰體蛋白結(jié)合的FX Gla結(jié)構(gòu)域片段的第二物質(zhì)接觸，并 測定所述六鄰體片段與所述FX Gla片段之間的結(jié)合。第一物質(zhì)可以包含能夠與FX Gla結(jié)合的六鄰體蛋白的任何片段。例如，第一物 質(zhì)可以包含單一分離的HVR，或者任選地具有中間支架(scaffold)序列的兩個或更多(例 如2、3、4、5、6或7)HVRs，或者完整的六鄰體蛋白。第一物質(zhì)可以為來自諸如Ad2或Ad5的任何合適的血清型的野生型六鄰體蛋白 或其片段?？蛇x地，第一物質(zhì)相對于野生型六鄰體蛋白在支架或HVRs中可以含有一個 或多個突變或修飾。例如，第一物質(zhì)在HVRs中可以含有一個或多個點突變，所述點突 變相對于對應(yīng)的野生型HVR的調(diào)節(jié)與FX的結(jié)合。例如，第一物質(zhì)在對應(yīng)于Ad5六鄰體蛋白的Thr268、Thr269和/或Glu270[在 下文提供的登錄號為AAW65514.1 ； GI 58177707的序列中表示為Thr269、Thr270和 Glu271]的殘基處可以含有一個或多個突變(例如取代、缺失或添加)。這些位于HVR5 中。第一物質(zhì)在對應(yīng)于Ad5六鄰體蛋白的Ile420、Asn421、Thr422、Glu423、Thr424、 Leu425、Asp447或Lys448[在下文提供的登錄號為AAW65514.1 ; GI: 58177707的序列 中表示為 Ile421、Asn422, Thr423、Glu424、Thr425、Leu426、Asp448 和 Lys449]的殘 基處可以含有一個或多個突變。這些位于HVR7中。另外地或者可選地，第一物質(zhì)在對 應(yīng)于Ad5六鄰體蛋白的Glu450、Arg452和Val453[在下文提供的登錄號為AAW65514.1 ； GI: 58177707的序列中表示為Glu451、Arg453和Val454]的殘基處可以含有一個或多個 突變。這些位于HVR7側(cè)翼的支架序列中。另外地或者可選地，第一物質(zhì)在對應(yīng)于Ad5 六鄰體蛋白的 Glu212、Thr213、Glu214、Ile215、Asn216, Ser267、Met314、Asn421、Thr426、Ser446或Aot449[在下文提供的登錄號為AAW65514.1 ; GI: 58177707的序列中 表示為 Glu213、Thr214、Glu215、Ile216、Asn217、Ser268、Met315、Asn422, Thr427、 Ser447和Asn450]的殘基處可以包含一個或多個突變?？梢允褂谜{(diào)節(jié)，特別是降低與FX 的結(jié)合的任何突變。例如，母體或野生型殘基可以由存在于來自具有較低的FX親和力 或者較低的轉(zhuǎn)導(dǎo)肝細胞或脾細胞的能力的血清型的腺病毒的對應(yīng)位置的殘基所代替。例 如，可以使 Ad5 中的殘基與來自 Adl7、Ad20、Ad25、Ad26、Ad28、Ad29、Ad44 或 Ad48之一的殘基交換。第一物質(zhì)在對應(yīng)于Ad5的Thr269和Glu270[在登錄號為AAW65514.1 ； GI 58177707的序列中表示為Thr270和Glu271]之一或兩者的殘基處可以含有突變。在對 應(yīng)于Thr269的位置處引入Pro或Asp是可取的。在對應(yīng)于Glu270的位置處引入Gly或 Ser殘基是可取的。因此，例如，第一物質(zhì)可以含有對應(yīng)于Ad5中的Thr269Pro和/或 Glu270Gly 的取代。第一物質(zhì)在對應(yīng)于Ile420、Thr422、Glu423和Leu425[在登錄號為 AAW65514.1 ； GI 58177707 的序列中表示為 Ile421、Thr423、Glu424 和 Leu426]的 1 個、2個、3個或全部4個的殘基處可以含有突變。在對應(yīng)于Ile420的位置處引入Gly是 可取的。另外地或者可選地，在對應(yīng)于Thr422的位置處引入Aot是可取的。另外地或者 可選地，在對應(yīng)于Glu423的位置處引入Ser或Ala是可取的。另外地或者可選地，在對應(yīng) 于Leu425的位置處引入Tyr是可取的。例如，第一物質(zhì)可以含有對應(yīng)于取代Ile420Gly、 Thr422Asn> Glu423Ser和Leu425Tyr的1個、2個、3個或全部4個的取代。在對應(yīng)于 Ad5的Thr424的位置處引入Val或Ala也是可取的。引入突變的特別理想的位置可能是對應(yīng)于Ad5的Glu450的位置[在下文提供的 登錄號為AAW65514.1 ； GI 58177707的序列中表示為Glu451]。該位置位于蛋白的最 終支架區(qū)中，HVR7的下游6個殘基。在該位置處引入中性或帶正電殘基是可取的。特 別是，用另一殘基代替在這個位置天然存在的Glu殘基是可取的，所述另一殘基優(yōu)選為 中性或帶正電殘基，例如Gin、lie、Leu、VaL Arg或Lys，如Gln或Arg。第二物質(zhì)可以含有來自第一腺病毒血清型的支架和來自不同的腺病毒血清型的 一個或多個HVRs。當(dāng)存在兩個或更多個HVR時，每個HVR可以來自不同的血清型。 通常，第一物質(zhì)至少不包含腺病毒纖維蛋白和五鄰體蛋白之一。在一些實施方案中，第 一物質(zhì)既不包含腺病毒五鄰體蛋白或也不包含纖維蛋白。因此，第二物質(zhì)可以包含來自Ad2或Ad5的支架，以及來自Adl7、Ad20、 Ad25、Ad26、Ad28、Ad29、Ad44或Ad48中至少一個的一個或多個HVRs。在一些實 施方案中，至少 HVR5 和 / 或 HVR7 源自 Adl7、Ad20、Ad25、Ad26、Ad28、Ad29、 Ad44 或 Ad48，例如，源自 Ad26 或 Ad48。它們還可以源自另一組D血清型，例如Ad9、AdlO, Adl5, Adl9、Ad22、 Ad24、Ad27、Ad30、Ad32、Ad33、Ad36、Ad38、Ad39、Ad42、Ad43、Ad45、Ad47 或 Ad51。第二物質(zhì)可以包含任何合適的FX片段或由任何合 適的FX片段組成，該FX片 段包含Gla結(jié)構(gòu)域或其能夠與六鄰體蛋白結(jié)合的片段。因此，第二物質(zhì)可以包含F(xiàn)X Gla-EGF 1、Gla-EGF 1-EGF2 或 Gla-EGF 1-EGF2-SP,或者由 FX Gla-EGF 1、Gla-EGF1-EGF2或Gla-EGF 1-EGF2-SP組成。在一些實施方案中，第二物質(zhì)不是全長FX。第二物質(zhì)可以為含有FX組分和異源融合伴侶(即不源自FX的蛋白或蛋白結(jié)構(gòu)域)的融合蛋白。所述FX組分包含F(xiàn)X Gla結(jié)構(gòu)域，并且可以包含EGFl結(jié)構(gòu)域、 EGF2結(jié)構(gòu)域和SP結(jié)構(gòu)域中的一個或多個。例如，F(xiàn)X組分可以包含Gla-EGFl或 Gla-EGF 1-EGF2。為了便于分析，可以使第一物質(zhì)或第二物質(zhì)附著(如共價連接)至固體支持物。 因此，所述方法可以包括提供附著于固體支持物的第一物質(zhì)或第二物質(zhì)，使固體支持物 與分別含有第二物質(zhì)或第一物質(zhì)的樣品(通常為液體樣品)接觸，并測定與支持物關(guān)聯(lián)的 第二物質(zhì)或第一物質(zhì)的量。在接觸與測定步驟之間可以包括一個或多個洗滌步驟以減少或最小化與支持物 非特異性地關(guān)聯(lián)的第二物質(zhì)或第一物質(zhì)的量。第一物質(zhì)與第二物質(zhì)之間的結(jié)合可以直接 或間接測定。例如，可以標(biāo)記第二物質(zhì)，例如用放射性的或分光光度可檢測的探針(如 熒光探針)?？蛇x地，本方法可以包括使固體支持物與能夠檢測第一試劑與第二試劑之間 的復(fù)合物的其它結(jié)合劑接觸，例如特異性針對未附著于支持物的物質(zhì)的抗體。可以標(biāo)記 結(jié)合劑自身。因此，檢測到的結(jié)合量會取決于測試試劑破壞或防止結(jié)合的能力。技術(shù)人員會知道許多合適的技術(shù)和檢測方式，包括ELISA、表面等離子體共振等。所述方法可以包括在存在或不存在測試試劑的條件下，測定六鄰體片段與FX Gla片段之間的結(jié)合，并且如果結(jié)合在存在測試試劑的情況下與不存在測試試劑的情況下 不同(如較低或較高)，則選擇測試試劑。測試試劑可以為任何合適的分子，包括蛋白質(zhì)、碳水化合物、小分子(如分子 量小于500Da)等。例如，測試試劑可以為抗體、X-bp的類似物、分離的Gla結(jié)構(gòu)域或 其片段或衍生物、分離的六鄰體蛋白或其片段或衍生物等。所述方法可以包括測試許多測試試劑，所述測試試劑可以是或可以不是結(jié)構(gòu)上 彼此相關(guān)的。優(yōu)選地使用高通量方式。多種測試試劑可以為小分子文庫或許多蛋白分 子，例如諸如X-bp的已知蛋白的許多類似物或變體。所述方法還可以包括利用能夠調(diào)節(jié)HVR與Gla之間的相互作用的已知試劑作為 陽性對照。例如，在意圖鑒定能夠抑制或破壞相互作用的試劑的檢測中可以將X-bp用 作合適的對照。因此，可以將任何給定的測試試劑的效力與已知對照試劑的效力直接比較。鑒定或選擇了合適的測試劑后，證實其調(diào)節(jié)肝細胞或脾細胞的腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的能 力是可取的。因此，所述方法還可以包括以下步驟使測試試劑與肝細胞或脾細胞及腺 病毒接觸，并測定肝細胞或脾細胞的腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。通常，腺病毒會含有與上文所述的第 一物質(zhì)相同的六鄰體片段。所述方法可以包括在存在和不存在測試試劑的條件下，將肝細胞或脾細胞的腺 病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)進行比較。所述方法還可以包括利用諸如X-bp的能夠調(diào)節(jié)HVR與Gla之間的 相互作用的已知試劑作為陽性對照?？梢栽隗w內(nèi)或體外測試測試試劑在調(diào)節(jié)肝或脾的腺病毒感染中的效力。當(dāng)在體外進行時，腺病毒可以包含減少CAR結(jié)合的突變?？蛇x地，使用不具有CAR表達或具 有低CAR表達的細胞類型是優(yōu)選的，例如SK0V3細胞?？梢栽谌魏魏线m的模型上進行體內(nèi)測試，如嚙齒類或非人靈長類。體外或體內(nèi)證實測試中所用的腺病毒可以是攜帶基因(如標(biāo)記基因)的基因轉(zhuǎn) 移載體，在轉(zhuǎn)導(dǎo)的肝細胞或脾細胞中所述攜帶的基因的表達是可容易檢測到的。因此， 所述方法可以包括直接或間接檢測所述基因的表達產(chǎn)物的步驟，例如在肝細胞或脾細胞 中，在肝細胞或脾細胞的表面或者分泌自肝細胞或脾細胞。直接檢測可以包括檢測蛋白 或mRNA，例如利用能夠與表達產(chǎn)物結(jié)合的結(jié)合劑。間接檢測可以包括檢測僅在所述表 達產(chǎn)物存在時產(chǎn)生的產(chǎn)物的存在的步驟。合適的標(biāo)記基因包括編碼酶、熒光蛋白、細胞 表面受體等的基因。本說明書中所述的發(fā)現(xiàn)還使具有改變的對于FX的親和力的腺病毒六鄰體蛋白的 產(chǎn)生成為可能，所述腺病毒六鄰體蛋白隨后可以用于創(chuàng)造具有改變的轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞的能力的 腺病毒，如基因轉(zhuǎn)移載體，所述細胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)完全或部分地由FX介導(dǎo)，例如肝細胞或脾細 胞。具有降低的對于FX的親和力的那些可以用于提供這樣的載體，其顯示出對肝和可能 的脾以外的細胞和組織類型改進的靶向，以及具有改進的安全譜(profile)。具有增加的 對于FX的親和力的那些可以用于這樣的載體，其意圖向肝細胞或脾細胞進行基因轉(zhuǎn)移， 例如用于肝功能障礙或感染的治療。因此，本發(fā)明提供了篩選具有改變的對于FX的親和力的腺病毒六鄰體蛋白的方 法，該方法包括提供包含能夠與FX結(jié)合的腺病毒六鄰體蛋白片段的物質(zhì)；使所述物質(zhì)與能夠與腺病毒六鄰體結(jié)合的FX Gla結(jié)構(gòu)域片段接觸；以及測定所述六鄰體片段與FX Gla片段之間的結(jié)合。所述物質(zhì)可以包含能夠與FX Gla結(jié)合的六鄰體蛋白的任何片段，或者由能夠與 FX Gla結(jié)合的六鄰體蛋白的任何片段組成。例如，所述物質(zhì)可以包含單一分離的HVR， 任選地具有中間支架序列的兩個或更多個(如2個、3個、4個、5個、6個或7個) HVRs,或者完整的腺病毒六鄰體蛋白。通常，所述物質(zhì)至少不包含腺病毒纖維蛋白和五 鄰體蛋白之一。在一些實施方案中，所述物質(zhì)既不包含腺病毒五鄰體蛋白也不包含纖維 蛋白。通常，所述方法會包括將兩種或更多種這些物質(zhì)之間的結(jié)合進行比較，這些物 質(zhì)中每種都含有具有各不相同的序列的六鄰體片段。因此，所述方法可以包括以下步 驟提供至少第一物質(zhì)和第二物質(zhì)，每種物質(zhì)包含各自的第一腺病毒六鄰體片段和 第二腺病毒六鄰體片段；使每種所述物質(zhì)與能夠與六鄰體蛋白結(jié)合的FX Gla結(jié)構(gòu)域片段接觸；以及測定每種所述六鄰體片段與FX Gla片段之間的結(jié)合。因此，第一物質(zhì)可以包含具有 已知的Gla結(jié)合性質(zhì)(或FX結(jié)合性質(zhì))的參考六 鄰體序列，如一個或多個分離的HVRs或者全長六鄰體蛋白。第二物質(zhì)(和任何后續(xù)物 質(zhì))可以包含諸如分離的HVR或六鄰體蛋白的測試序列，所述測試序列的Gla或FX結(jié) 合性質(zhì)將與參考比較。
第一物質(zhì)和第二物質(zhì)除它們的HVR序列以外基本上相同是可取的，目的是增加 結(jié)合性質(zhì)中的任何差異都是由于HVRs之間的差異的機會。因此，第一六鄰體片段可以具有野生型序列。第二六鄰體片段可以具有未天然 發(fā)現(xiàn)的序列。例如，其氨基酸序列可以相對于第一序列包含一個或多個突變或者修飾， 例如在HVR中或者一個或多個支架氨基酸中。例如，第二六鄰體片段在HVRs3、5和7 的一個或多個中可以具有一個或多個突變或者修飾。例如，第二六鄰體片段在對應(yīng)于Ad5六鄰體 蛋白的Thr268、Thr269和/或 Glu270[在下文提供的登錄號為AAW65514.1 ； GI 58177707的序列中表示為Thr269、 Thr270和Glu271]的殘基處可以含有一個或多個突變(如取代、缺失或添加)。這些位 于HVR5中。第二六鄰體片段在對應(yīng)于Ad5六鄰體蛋白的Ile420、Asn42U Thr422、 Glu423, Thr424, Leu425, Asp447 或Lys448[在下文提供的登錄號為 AAW655Ill ; GI: 58177707 的序列中表示為 Ile421、Asn422, Thr423、Glu424、Thr425、Leu426、Asp448 和Lys449]的殘基處可以含有一個或多個突變。這些位于HVR7中。另外地或者可選 地，第二六鄰體片段在對應(yīng)于Ad5六鄰體蛋白的Glu450、Arg452和Val453[在下文提供 的登錄號為AAW65514.1 ； GI 58177707的序列中表示為Glu451、Arg453和Val454]的 殘基處可以含有一個或多個突變。這些位于HVR7側(cè)翼的支架序列中。另外地或者可 選地，第二六鄰體片段在對應(yīng)于Ad5六鄰體蛋白的Glu212、Thr213、Glu214、Ile215、 Asn216、Ser267、Met314、Asn42U Thr426、Ser446 或 Asn449[在下文提供的登錄號 為 AAW65514.1 ； GI 58177707 的序列中表示為 Glu213、Thr214、Glu215、Ile216、 Asn217、Ser268、Met315、Asn422、Thr427、Ser447 和 Asn450]的殘基處可以包含一個 或多個突變。這些殘基被認(rèn)為在六鄰體與FX的相互作用中特別重要。可以使用調(diào)節(jié)， 特別是減少與FX的結(jié)合的任何突變。例如，母體或野生型殘基可以由存在于腺病毒中 對應(yīng)位置的殘基代替，所述腺病毒來自具有較低的對于FX的親和力或者較低的轉(zhuǎn)導(dǎo)肝細 胞或脾細胞的能力的血清型。例如，可以使Ad5中的殘基與來自Adl7、Ad20、Ad25、 Ad26、Ad28、Ad29、Ad44 或 Ad48 之一的殘基交換。第二六鄰體片段在對應(yīng)于Ad5的Thr269和Glu270[在登錄號為AAW65514.1 ； GI: 58177707的序列中表示為Thr270和Glu271]之一或兩者的殘基處可以含有突變。在 對應(yīng)于Thr269的位置處引入Pro或Asp是可取的。在對應(yīng)于Glu270的位置處引入Gly或 Ser殘基是可取的。因此，例如，第二六鄰體片段可以含有對應(yīng)于Ad5中Thr269Pr0和/ 或Glu270Gly的取代。第二六鄰體片段在對應(yīng)于Ile420、Thr422、Glu423和Leu425[在登錄號為 AAW65514.1 ； GI 58177707 的序列中表示為 Ile421、Thr423、Glu424 和 Leu426]的 1 個、2個、3個或全部4個的殘基處可以含有突變。在對應(yīng)于Ile420的位置處引入Gly是 可取的。另外地或者可選地，在對應(yīng)于Thr422的位置處引入Aot是可取的。另外地或 者可選地，在對應(yīng)于Glu423的位置處引入Ser或Ala是可取的。另外地或者可選地，在 對應(yīng)于Leu425的位置處引入Tyr是可取的。例如，第二六鄰體片段可以含有對應(yīng)于取 代 Ile420Gly、Thr422Asn> Glu423Ser 和 Leu425Tyr 中的 1 個、2 個、3 個或全部 4 個的取 代。在對應(yīng)于Ad5的Thr424的位置處引入Val或Ala也是可取的。引入突變的特別理想的位置可能是對應(yīng)于Ad5的Glu450[在下文提供的登錄號為AAW65514.1 ； GI 58177707的序列中表示為Glu451]的位置。該位置位于蛋白的最終 支架區(qū)中，HVR7的下游6個殘基。在該位置處引入中性或帶正電殘基是可取的。特別 是，用另一殘基代替在這個位置天然存在的Glu殘基是可取的，所述另一殘基優(yōu)選為中 性或帶正電殘基，例如Gin、lie、Leu、VaL Arg或Lys，如Gln或Arg。當(dāng)兩種物質(zhì)包含六鄰體蛋白或由六鄰體蛋白組成時，參考六鄰體序列可以包含 野生型六鄰體蛋白。測試六鄰體序列可以包含嵌合六鄰體蛋白，其中支架和一個或多個 HVRs源自不同的野生型六鄰體蛋白。支架可以來自參考六鄰體蛋白。例如，HVRs3、
5和7中的一個或多個可以與支架源自不同的血清型。HVRs可以源自六鄰體蛋白，該六 鄰體蛋白來自比支架所源自的血清型具有更低的肝向性的血清型。參考六鄰體序列可以是血清型Ad2或Ad5的。測試六鄰體序列可以是血清型Adl7、Ad20、Ad25、Ad26、Ad28、Ad29、Ad44 或Ad48的。如果測試序列為嵌合序列，則其可以包含來自Ad2或Ad5的支架片段和至少 一個來自 Adl7、Ad20、Ad25、Ad26、Ad28、Ad29、Ad44 或 Ad48 中至少一個的 HVR 序列。HVR序列還可以源自另一組D血清型，例如Ad9、AdlO, Adl5, Adl9、Ad22、 Ad24、Ad27、Ad30、Ad32、Ad33、Ad36、Ad38、Ad39、Ad42、Ad43、Ad45、Ad47 或 Ad51。因此，測試序列可以包含來自Ad2或Ad5的支架區(qū)和一個或多個來自Adl7、 Ad20、Ad25、Ad26、Ad28、Ad29、Ad44 或 Ad48 中至少一個的 HVRs。在一些實施 方案中，HVR3、HVR5 和 / 或 HVR7 源自 Adl7、Ad20、Ad25、Ad26、Ad28、Ad29、 Ad44或Ad48，例如源自Ad26或Ad48。它們還可以源自另一組D血清型，例如Ad9、 AdlO, Adl5, Adl9、Ad22、Ad24、Ad27、Ad30、Ad32、Ad33、Ad36、Ad38、Ad39、 Ad42、Ad43、Ad45、Ad47 或 Ad51。因此，第二或測試片段可以為第一或參考片段的有意修飾的形式。這可以通過 改造編碼第一或參考片段的核酸而實現(xiàn)，從而產(chǎn)生第二或測試片段，例如包含一個或多 個不同的HVRs。優(yōu)選地，只修飾HVR序列(和/或一個或多個側(cè)翼氨基酸)。因此， 在這樣的情況下，所述方法可以包括提供編碼所述第一物質(zhì)的第一核酸序列，并修飾所 述第一核酸以產(chǎn)生編碼所述第二物質(zhì)的第二核酸序列。應(yīng)當(dāng)理解，可以產(chǎn)生測試片段的文庫。因此，所述方法還可以包括將所述第一 核酸序列突變以產(chǎn)生許多測試核酸序列(如至少5個、至少10個、至少50個、至少100 個、至少1000個、至少10000個、至少IO6個或者甚至更多的測試序列)，每個測試核酸 序列編碼測試片段，其中測試片段彼此不同?？梢栽谔貏e靶向的位置或隨機位置進行突變或修飾，例如，在HVR內(nèi)。在任何 情況下，它們可以包括引入隨機取代基或特定的氨基酸。例如，可以將一個或多個位置 處的編碼互不相同的HVR序列(任選地包含一個或多個側(cè)翼氨基酸)的許多核酸引入編 碼相同支架序列的核酸群體中，因而提供了用于篩選的不同HVR的文庫?？梢酝ㄟ^上文所述的測定方法，或者通過諸如噬菌體展示的高通量方法等進行 蹄選。鑒定出或選擇了具有所 需的Gla或FX結(jié)合特征的合適六鄰體片段后，測試肝細 胞或脾細胞的腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)是可取的，所述腺病毒包含含有該片段的六鄰體蛋白。因此，所述方法可以包括選擇含有具有所需的與Gla或FX結(jié)合特征的片段的物質(zhì)，產(chǎn)生含有包 含各自片段的六鄰體蛋白的腺病毒，使所述腺病毒與肝細胞或脾細胞接觸，并測定肝細 胞或脾細胞的腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。可以體內(nèi)或體外測試腺病毒的感染性。當(dāng)體外測試時，腺病毒可以包含降低 CAR結(jié)合的突變?？蛇x地，使用不具有CAR表達或具有低CAR表達的細胞類型可能是 優(yōu)選的，例如SKOV3細胞。體內(nèi)測試可以在任何合適的模型上進行，例如嚙齒類或非人靈長類。體外或體內(nèi)證實測試中所用的腺病毒可以為攜帶基因的基因轉(zhuǎn)移載體，在轉(zhuǎn)導(dǎo) 的肝細胞或脾細胞中所述攜帶的基因的表達是可容易檢測到的。所述方法可以包括檢測 所述基因的表達產(chǎn)物的步驟，例如在肝細胞或脾細胞中，在肝細胞或脾細胞的表面上或 者分泌自肝細胞或脾細胞。檢測可以為直接或間接的。無論使用哪種測試系統(tǒng)，將腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)肝細胞或脾細胞的能力與包含六鄰體蛋 白的腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)肝細胞或脾細胞的能力進行比較都是可取的，所述六鄰體蛋白含有第一 或參考六鄰體片段。在一些情況下，不測試特定的六鄰體蛋白其針對分離的Gla或FX的結(jié)合性質(zhì)， 而是簡單地測試具有特定的六鄰體序列的腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞的能力是可取的，所述細胞的 轉(zhuǎn)導(dǎo)由FX介導(dǎo)，諸如肝細胞或脾細胞。通常，這會與參考腺病毒進行比較，所述參考腺 病毒具有已知參考六鄰體序列并且其轉(zhuǎn)導(dǎo)性質(zhì)是已知的。因此，本發(fā)明提供了篩選具有改變的轉(zhuǎn)導(dǎo)肝細胞或脾細胞的能力的腺病毒的方 法，該方法包括提供包含第一六鄰體蛋白的第一腺病毒；提供包含第二六鄰體蛋白的第二腺病毒；以及比較所述第一腺病毒和所述第二腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)肝細胞或脾細胞的能力。第一六鄰體蛋白和第二六鄰體蛋白具有不同的序列。通常，第一六鄰體蛋白與 第二六鄰體蛋白的差別在于一個或多個HVR序列和/或支架序列中的一個或多個氨基 酸。除了所述一個或多個HVRs或者支架殘基以外，第一六鄰體蛋白與第二六鄰體蛋白 是基本相同的是可取的。第一腺病毒與第二腺病毒在所有其它方面是相同的也是可取 的，目的是增加結(jié)合或轉(zhuǎn)導(dǎo)性質(zhì)中的任何差異可以肯定地歸結(jié)于六鄰體蛋白之間的差異 的機會。例如，它們可以具有相同的五鄰體蛋白和纖維蛋白。因此，第一六鄰體蛋白可以包含具有已知的Gla結(jié)合性質(zhì)(或FX結(jié)合性質(zhì))的 參考HVR。第二六鄰體蛋白(和任何后續(xù)的六鄰體蛋白)可以包含測試HVR，所述測試 HVR的Gla或FX結(jié)合性質(zhì)將與參考比較。因此，參考HVR可以為野生型HVR。測試HVR可以具有未天然發(fā)現(xiàn)的序列。 例如，測試HVR的氨基酸序列可以包含相對于參考HVR的一個或多個突變或者修飾，例 如，在HVRs3、5和/或7的一個或多個中。例如，測試六鄰體蛋白在對應(yīng)于Ad5六鄰體蛋白的Thr268、Thr269和/或 Glu270[在下文提供的登錄號為AAW65514.1 ； GI 58177707的序列中表示為Thr269、 Thr270和Glu271]的殘基處可以含有一個或多個突變(如取代、缺失或添加)。這些位 于HVR5中。測試六鄰體蛋白在對應(yīng)于Ad5六鄰體蛋白的Ile420、Asn42U Thr422、Glu423, Thr424, Leu425, Asp447 或Lys448[在下文提供的登錄號為 AAW655Ill ； GI: 58177707 的序列中表示為 Ile421、Asn422, Thr423、Glu424、Thr425、Leu426、Asp448 和Lys449]的殘基處可以含有一個或多個突變。這些位于HVR7中。另外地或者可選 地，測試六鄰體蛋白在對應(yīng)于Ad5六鄰體蛋白的Glu450、Arg452和Val453[在下文提供 的登錄號為AAW65514.1 ； GI 58177707的序列中表示為Glu451、Arg453和Val454]的 殘基處可以含有一個或多個突變。這些位于HVR7側(cè)翼的支架序列中。另外地或者可 選地，測試六鄰體蛋白在對應(yīng)于Ad5六鄰體蛋白的Glu212、Thr213、Glu214、Ile215、 Asn216、Ser267、Met314、Asn421、Thr426、Ser446 或 Asn449[在下文提供的登錄號 為 AAW65514.1 ； GI 58177707 的序列中表示為 Glu213、Thr214、Glu215、Ile216、 Asn217、Ser268、Met315、Asn422、Thr427、Ser447 和 Asn450]的殘基處可以包含一個 或多個突變。例如，母體或野生型殘基可以由存在于腺病毒中對應(yīng)位置的殘基代替，所 述腺病毒來自具有較低的對于FX的親和力或者較低的轉(zhuǎn)導(dǎo)肝細胞或脾細胞的能力的血清 型。例如，可以使Ad5中的殘基與來自Adl7、Ad20、Ad25、Ad26、Ad28、Ad29、 Ad44或Ad48之一的殘基交換。測試六鄰體蛋白在對應(yīng)于Ad5的Thr269和Glu270[在登錄號為AAW65514.1 ； GI 58177707的序列中表示為Thr270和Glu271]之一或兩者的殘基處可以含有突變。在 對應(yīng)于Thr269的位置處引入Pro或Asp是可取的。在對應(yīng)于Glu270的位置處引入Gly 或Ser殘基是可取的。因此，例如，測試六鄰體蛋白可以含有對應(yīng)于Ad5中的Thr269Pro 和/或Glu270Gly的取代。測試六鄰體蛋白在對應(yīng)于Ile420、Thr422、Glu423和Leu425[在登錄號為 AAW65514.1 ； GI 58177707 的序列中表示為 Ile421、Thr423、Glu424 和 Leu426]中 1 個、2個、3個或全部4個的殘基處可以含有突變。在對應(yīng)于Ile420的位置處引入Gly是 可取的。另外地或者可選地，在對應(yīng)于Thr422的位置處引入Aot是可取的。另外地或 者可選地，在對應(yīng)于Glu423的位置處引入Ser或Ala是可取的。另外地或者可選地，在 對應(yīng)于Leu425的位置處引入Tyr是可取的。例如，測試六鄰體蛋白可以含有對應(yīng)于取代 Ile420Gly、Thr422Asn、Glu423Ser 和 Leu425Tyr 中 1 個、2 個、3 個或全部 4 個的取代。 在對應(yīng)于Ad5的Thr424的位置處引入Val或Ala也是可取的。引入突變的特別理想的位置可能是對應(yīng)于Ad5的Glu450的位置[在下文提供的 登錄號為AAW65514.1 ； GI 58177707的序列中表示為Glu451]。該位置位于蛋白的最 終支架區(qū)中，HVR7的下游6個殘基。在該位置處引入中性或帶正電殘基是可取的。特 別是，用另一殘基代替在這個位置天然存在的Glu殘基是可取的，所述另一殘基優(yōu)選為 中性或帶正電殘基，例如Gin、lie、Leu、VaL Arg或Lys，如Gln或Arg。參考六鄰體蛋白可以為野生型六鄰體蛋白。測試六鄰體蛋白可以為嵌合六鄰體 蛋白，其中支架和一個或多個HVRs源自不同野生型六鄰體蛋白。支架可以來自參考六 鄰體蛋白。例如，HVRs3、5和7的一個或多個可以源自不同于支架的血清型。HVRs可 以源自六鄰體蛋白，該六鄰體蛋白來自比支架所源自的血清型具有更低的肝向性的血清型。參考HVR或六鄰體蛋白可以是血清型Ad2或Ad5的。
測試HVR或六鄰體蛋白可以是血清型Adl7、Ad20、Ad25、Ad26、Ad28、 Ad29、Ad44或Ad48的。當(dāng)測試HVR或六鄰體蛋白為嵌合的時，支架可以來自Ad2或 Ad,并且一個或多個 HVRs 可以來自 Adl7、Ad20、Ad25、Ad26、Ad28、Ad29、Ad44 或Ad48。HVRs還可以源自另一組D血清型，例如Ad9、AdlO, Adl5, Adl9、Ad22、 Ad24、Ad27、Ad30、Ad32、Ad33、Ad36、Ad38、Ad39、Ad42、Ad43、Ad45、Ad47 或 Ad51。因此，測試六鄰體蛋白可以包含來自Ad2或Ad5的支架區(qū)，以及一個或多個來 自 Adl7、Ad20、Ad25、Ad26、Ad28、Ad29、Ad44 或 Ad48 中至少一個的 HVRs。在 一些實施方案中，HVR5 和 / 或 HVR7 源自 Adl7、Ad20、Ad25、Ad26、Ad28、Ad29、 Ad44或Ad48，例如源自Ad26或Ad48。它們還可以源自另一組D血清型，例如Ad9、 AdlO, Adl5, Adl9、Ad22、Ad24、Ad27、Ad30、Ad32、Ad33、Ad36、Ad38、Ad39、 Ad42、Ad43、Ad45、Ad47 或 Ad51。因此，第二或測試六鄰體蛋白可以為第一或參考六鄰體蛋白的有意修飾的形 式。這可以通過改造編碼第一或參考六鄰體蛋白的核酸序列而實現(xiàn)，從而產(chǎn)生具有不同 序列的第二或測試六鄰體蛋白。優(yōu)選地，只修飾一個或多個HVR區(qū)和/或側(cè)翼氨基酸。 因此，在這樣的情況下，所述方法可以包括提供編碼所述第一或參考六鄰體蛋白的第一 核酸序列，以及修飾所述第一核酸以產(chǎn)生編碼所述第二或測試六鄰體蛋白的第二核酸序 列。應(yīng)當(dāng)理解，可以生成測試蛋白的文庫。因此，所述方法還可以包括將所述第一 核酸序列突變以產(chǎn)生許多測試核酸序列(如至少5個、至少10個、至少50個、至少100 個、至少1000個、至少10000個、至少IO6個或者甚至更多的測試序列)，每個序列編碼 測試六鄰體蛋白，其中測試六鄰體蛋白彼此不同?？梢栽谔囟ò邢虻奈恢没螂S機位置進行突變或修飾，例如，在HVR內(nèi)和/或上 文列出的位置處。無論哪種情況下，它們可以包括引入隨機取代基或特定氨基酸。例 如，可以將編碼在一個或多個位置彼此不同的HVR序列(任選地包含一個或多個側(cè)翼氨 基酸)的許多核酸引入編碼相同支架序列的核酸群體中，從而提供了用于篩選的含有不 同HVRs的六鄰體蛋白文庫。所述方法可以包括使至少分別的第一肝細胞和第二肝細胞或者至少分別的第一 脾細胞和第二脾細胞與至少所述第一腺病毒和第二腺病毒于體外在FX的存在下接觸，并 測定由所述腺病毒造成的所述細胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)。在這樣的檢測中，腺病毒可以包含減少與CAR結(jié)合的突變?？蛇x地，使用具有 低CAR表達或者不具有CAR表達的細胞類型是優(yōu)選的，例如SKOV3細胞?？蛇x地，所述方法可以在體內(nèi)進行，并且因此可以包括向分別的第一個體和第 二(優(yōu)選非人)個體給予所述第一腺病毒和第二腺病毒，并且測定肝細胞或脾細胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)。合適的個體可以為嚙齒類或非人靈長類。所述方法可以包括選擇具有最顯著改變的(如增強或降低)轉(zhuǎn)導(dǎo)的腺病毒。所述方法可以用于鑒定特定六鄰體片段，如具有與FX特定結(jié)合的HVR序列或 者HVR序列和/或支架序列組(set)。然后，將這些序列引入不同腺病毒的六鄰體蛋白中是可取的，例如一個不同血清型的；或者簡單地將含有選擇的HVR序列的六鄰體蛋白 引入不同腺病毒。然后，如上文所述，可以測試所得的腺病毒在FX的存在下向肝細胞或 脾細胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)能力，任選地與合適的參考腺病毒比較。本文所述的發(fā)現(xiàn)還提供制備具有改變的對細胞類型的向性的新腺病毒的方法是 顯而易見的，所述細胞類型的轉(zhuǎn)導(dǎo)由FX介導(dǎo)，例如肝細胞或脾細胞。因此，本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)腺病毒的肝或脾感染性的方法，該方法包括提供母體腺病毒六鄰體蛋白；修飾所述母體六鄰體蛋白以產(chǎn)生具有改變的對于FX的親和力的修飾過的六鄰體 蛋白；以及產(chǎn)生包含所述修飾過的六鄰體蛋白的腺病毒；從而所述腺病毒與包含所述母體六鄰體蛋白的腺病毒相比，具有改變的轉(zhuǎn)導(dǎo)肝 細胞或脾細胞的能力。因此，包含修飾過的六鄰體蛋白的腺病毒與參考腺病毒相比具有 改變的(即增加的或降低的)轉(zhuǎn)導(dǎo)肝細胞或脾細胞的能力，所述參考腺病毒除了引入六鄰 體蛋白的修飾以外，在所有方面都是相同的。特別是，這兩種病毒會共享相同的五鄰體 蛋白和纖維蛋白。本發(fā)明還涉及這些方法的產(chǎn)物。因此，本發(fā)明提供了含有修飾過的六鄰體蛋白 的腺病毒，所述修飾過的六鄰體蛋白包含相對于母體六鄰體蛋白的突變，從而所述腺病 毒與包含所述母體六鄰體蛋白的腺病毒相比具有改變的轉(zhuǎn)導(dǎo)肝細胞或脾細胞的能力，但 條件是修飾過的六鄰體蛋白不是包含來自Ad48六鄰體蛋白的HVR的Ad5六鄰體蛋白。 特別是，如Reynolds etal.，2006所述，修飾過的六鄰體蛋白不是包含來自Ad48六鄰體蛋 白的HVRl和野生型Ad5HVR2-7的Ad5六鄰體蛋白，而且不是包含來自Ad48六鄰體蛋 白的HVRsl-7的Ad5六鄰體蛋白。突變可以在一個或多個HVRs或側(cè)翼氨基酸中。因此，修飾過的六鄰體蛋白和 母體六鄰體蛋白通常具有相同的支架序列，并且只在一個或多個HVR中有差別。然而， 應(yīng)當(dāng)理解，每個都可以具有相對于野生型六鄰體蛋白的突變。例如，修飾過的六鄰體蛋白可以具有HVRs3、5和7的一個或多個中的一個或多
個突變或者修飾。然而，母體六鄰體蛋白可以為野生型六鄰體蛋白，例如Ad2或Ad5血清型的。例如，修飾過的六鄰體蛋白在對應(yīng)于Ad5六鄰體蛋白的Thr268、Thr269和/或 Glu270[在下文提供的登錄號為AAW65514.1 ； GI 58177707的序列中表示為Thr269、 Thr270和Glu271]的殘基處可以含有相對于母體的一個或多個突變(如取代、缺失或添 加)。這些位于HVR5中。修飾過的六鄰體蛋白在對應(yīng)于Ad5六鄰體蛋白的Ile420、 Asn42U Thr422, Glu423, Thr424, Leu425, Asp447 或 Lys448[在下文提供的登錄號 為 AAW65514.1 ； GI 58177707 的序列中表示為 Ile421、Asn422, Thr423、Glu424、 Thr425、Leu426、Asp448和Lys449]的殘基處可以含有一個或多個突變。這些位于HVR7 中。另外地或者可選地，修飾過的六鄰體蛋白在對應(yīng)于Ad5六鄰體蛋白的Glu450、 Arg452和Val453[在下文提供的登錄號為AAW65514.1 ； GI: 58177707的序列中表示 為Glu451、Arg453和Val454]的殘基處可以含有一個或多個突變。這些位于HVR7側(cè) 翼的支架序列中。另外地或者可選地，修飾過的六鄰體蛋白在對應(yīng)于Ad5六鄰體蛋白的 Glu212、Thr213、Glu214、Ile215、Asn216、Ser267、Met314、Asn421、Thr426、 Ser446或Aot449[在下文提供的登錄號為AAW65514.1 ; GI: 58177707的序列中表示為 Glu213、Thr214、Glu215、Ile216、Asn217、Ser268、Met315、Asn422, Thr427、Ser447 和Asn450]的殘基處可以包含一個或多個突變?？梢允褂谜{(diào)節(jié)，特別是降低與FX的結(jié) 合的任何突變。例如，母體或野生型殘基可以由存在于腺病毒中對應(yīng)位置的殘基代替， 所述腺病毒來自具有較低的對于FX的親和力或者較低的轉(zhuǎn)導(dǎo)肝細胞或脾細胞的能力的血 清型。例如，可以使Ad5中的殘基與來自Adl7、Ad20、Ad25、Ad26、Ad28、Ad29、 Ad44或Ad48之一的殘基交換。修飾過的六鄰體蛋白在對應(yīng)于Ad5的Thr269和Glu270[在登錄號為 AAW65514.1 ； GI 58177707的序列中表示為Thr270和Glu271]之一或兩者的殘基處可 以含有突變。在對應(yīng)于Thr269的位置處引入Pro或Asp是可取的。在對應(yīng)于Glu270的 位置處引入Gly或Ser殘基是可取的。因此，例如，修飾過的六鄰體蛋白可以含有對應(yīng) 于Ad5中的Thr269Pro和/或Glu270Gly的取代。修飾過的六鄰體蛋白在對應(yīng)于Ile420、Thr422、Glu423和Leu425[在登錄號為 AAW65514.1 ； GI 58177707 的序列中表示為 Ile421、Thr423、Glu424 和 Leu426]的 1 個、2個、3個或全部4個的殘基處可以含有突變。在對應(yīng)于Ile420的位置處引入Gly是 可取的。另外地或者可選地，在對應(yīng)于Thr422的位置處引入Aot是可取的。另外地或 者可選地，在對應(yīng)于Glu423的位置處引入Ser或Ala是可取的。另外地或者可選地，在 對應(yīng)于Leu425的位置處引入Tyr是可取的。例如，修飾過的六鄰體蛋白可以含有對應(yīng)于 取代 Ile420Gly、Thr422Asn、Glu423Ser 和 Leu425Tyr 的 1 個、2 個、3 個或全部 4 個的取 代。在對應(yīng)于Ad5的Thr424的位置處引入Val或Ala也是可取的。引入突變的特別理想的位置可能是對應(yīng)于Ad5的Glu450的位置[在下文提供的 登錄號為AAW65514.1 ； GI 58177707的序列中表示為Glu451]。該位置位于蛋白的最 終支架區(qū)中，HVR7的下游6個殘基?？梢云谕卦谠撐恢锰幰胫行曰驇д姎埢?。 特別是，用另一殘基代替在這個位置天然存在的Glu殘基是可取的，所述另一殘基優(yōu)選 為中性或帶正電殘基，例如Gin、lie、Leu、VaL Arg或Lys，如Gln或Arg。修飾過的六鄰體蛋白可以具有未天然存在的HVR氨基酸序列?？蛇x地，修飾過的六鄰體蛋白可以為嵌合六鄰體蛋白，其包含來自第一野生型 六鄰體蛋白的支架以及至少一個來自第二野生型六鄰體蛋白的HVR。嵌合六鄰體蛋白可以具有來自第一腺病毒血清型的支架區(qū)以及至少一個來自第 二腺病毒血清型的HVR。例如，HVRs3、5和7的一個或多個可以源自不同于支架的血清型。HVRs可 以源自六鄰體蛋白，該六鄰體蛋白來自比支架所源自的血清型具有更低的肝向性的血清型。第一血清型/野生型可以為Ad2或Ad5。第二血清型/野生型可以為Adl7、 Ad20、Ad25、Ad26、Ad28、Ad29、Ad44 或 Ad48，或者另一組 D 血清型，例如 Ad9、 Adl0, Adl5, Adl9、Ad22、Ad24、Ad27、Ad30、Ad32、Ad33、Ad36、Ad38、Ad39、 Ad42、Ad43、Ad45、Ad47 或 Ad51。因此，修飾過的六鄰體蛋白可以包含來自Ad2或Ad5的支架區(qū)，以及一個或多個來自 Adl7、Ad20、Ad25、Ad26、Ad28、Ad29、Ad44 或 Ad48 中至少一個的 HVRs。 在一些實施方案中，HVR3、HVR5 和 / 或 HVR7 源自 Adl7、Ad20、Ad25、Ad26、 Ad28、Ad29、Ad44或Ad48，例如源自Ad26或Ad48。它們還可以源自另一組D血 清型，例如 Ad9、AdlO, Adl5, Adl9、Ad22、Ad24、Ad27、Ad30、Ad32、Ad33、 Ad36、Ad38、Ad39、Ad42、Ad43、Ad45、Ad47 或 Ad51。修飾過的腺病毒可以為基因遞送載體。本發(fā)明還提供用于醫(yī)療方法的如上文所述的修飾過的腺病毒。本發(fā)明還提供用于基因遞送的如上文所述的修飾過的腺病毒。本發(fā)明還提供如上文所述的修飾過的腺病毒在制備用于基因遞送或基因治療的 藥物中的用途。通過舉例而并非限制的方式，結(jié)合附圖和實施例，將更詳細地描述本發(fā)明。附圖描述

圖1.FX與Ad5結(jié)合的分析。(A)人FX的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)。球狀表示鈣離子。(B)凝血因子(FXa、EGF2-SP FXa)共價偶聯(lián)到SA生物傳感器芯片。描述的 是覆蓋的感應(yīng)譜(overlayed sensorgrams。箭頭表示試劑注射的開始和結(jié)束。RU =響應(yīng) 單位(responsive units)。(C)在Ad5注射前，在FX生物傳感器芯片上預(yù)先注射定向針對FX Gla-EGFl的 抗體HX-1。HX-I減少FX_Ad5結(jié)合(δ RU)。箭頭表示試劑注射的開始和結(jié)束。(D)在生理FX水平的存在下，將HepG2細胞暴露于AdKOl。FX與抗體HX-I
或IgG同種型匹配的對照預(yù)先孵育。在感染72h后定量細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)Γρ < 0.001與對照相 比)。誤差棒表示SEM。(E) Ad5與FX和缺乏FX Gla結(jié)構(gòu)域的FX-GD結(jié)合的SPR分析。顯示出扣除
的感應(yīng)譜(將FXI用作非特異性結(jié)合的對照)。箭頭表示試劑注射的開始和結(jié)束。(F)在病毒注射前30min，MF_1小鼠用對照花生油或華法林預(yù)處理，并且在有 或沒有FX或FX-GD預(yù)先注射的情況下，注射4X IO11VP/小鼠的Ad5。β -半乳糖苷酶 的定量ELISA顯示出肝、脾和肺中的水平Γρ = 0.03)。圖2.Ad5六鄰體與FX結(jié)合，而并非纖維與FX結(jié)合。(A)用于評價FX與Ad5結(jié)合的纖維突變體的圖示。Ad5_21R含有21個軸重 復(fù)，但是沒有結(jié)；Ad5-7.5R只含有7.5個軸重復(fù)；Ad5_AF不含有纖維。(B)病毒被注射到生物傳感器芯片上并與評價的FX結(jié)合。顯示出扣除的感應(yīng)譜 (FX-FXI)。箭頭表示試劑注射的開始和結(jié)束。(C)在存在或不存在生理FX水平的情況下，將HepG2細胞暴露于每種腺病毒。
細胞結(jié)合的腺病毒進行定量。誤差棒表示SEM。(D)將純化的Ad5六鄰體蛋白固定，并分析與FX的結(jié)合。顯示出以7種不同 濃度的FX(50至0.781 μ g/ml，以2倍連續(xù)稀釋)注射的感應(yīng)譜。分析重復(fù)三次。注射 EDTA再生生物傳感器芯片的表面。箭頭表示試劑注射的開始和結(jié)束。圖3.HVR修飾過的Ad5載體中FX結(jié)合與腺病毒感染的分析(A)來自Ad5和Ad5HVR48突變體的Ad六鄰體HVRs的氨基酸序列比對。黑底白字為相同殘基，灰底黑字為相似殘基，白底黑字為不同殘基。表示出HVRs(l-7)。(B)通過SPR分析(扣除的FX-FXI感應(yīng)譜)，用來自Ad48的HVRs代替 Ad5HVRs去除了 Ad5與FX結(jié)合。箭頭表示試劑注射的開始和結(jié)束。(C)在4°C下，在存在或不存在生理FX水平的情況下，將SKOV3細胞暴露于所 示的每種腺病毒lh。提取DNA并定量細胞結(jié)合的腺病毒。誤差棒表示SEM。(ρ < 0.05 與不存在FX相比)。(D)在37°C下，在存在或不存在生理FX水平的情況下，將SKOV3細胞暴露于 所示的每種腺病毒3h。感染后48h，定量轉(zhuǎn)基因表達。誤差棒表示SEM。(ρ <0.05與 不存在FX相比)。(E)通過血管內(nèi)途徑以5X109、2X IOltl或5X IOltl或VP/小鼠，向MF-1小鼠注 射Ad5或Ad5HVR48，并且在48h時采集螢光素酶圖像并定量為光子通量。肌肉內(nèi)注射 作為比較顯示。誤差棒表示 SEM。*p = 0.00018，**p = 0.00002, ***ρ = 0.01368 與 Ad5相比。圖4.由FX_Ad5復(fù)合物造成的肝的基因轉(zhuǎn)移是通過FX中的外部位點(exosite)介
導(dǎo)(A)扣除的SPR感應(yīng)譜(FX-FXI)顯示出NAPc2或Ixolaris與FX結(jié)合而不抑制 后續(xù)的FX_Ad5結(jié)合。箭頭表示試劑注射的開始和結(jié)束。(B)在存在或不存在生理FX士漸增濃度的NAPc2或Ixolaris的條件下，將
HepG2細胞暴露于AdKOl。在感染后72h定量轉(zhuǎn)導(dǎo)。誤差棒表示SEM。*〃p<0.01 與AdKOl+FX相比。(C)MF-I小鼠用對照花生油或華法林預(yù)處理，并且在有或沒有單獨的FX或者 用3倍摩爾過量的NAPc2或Ixolaris預(yù)先孵育的FX的預(yù)先注射的情況下，向小鼠注射 4XlOllVPAjH^mAdStj 48h后，進行肝中的β _半乳糖苷酶水平的定量ELISA，并與通 過單獨的FX灌注達到的肝中的水平比較。誤差棒表示SEM。< 0.05與對照相比。圖5.由蛇毒蛋白X-bp造成的Ad5與FX的結(jié)合的藥理阻斷阻斷了體內(nèi)肝轉(zhuǎn)導(dǎo)。(A)扣除的SPR感應(yīng)譜(FX-FXI)顯示出高親和力的X_bp結(jié)合(X_bp注射后 RU升高)，并且去除了后續(xù)的FX_Ad5結(jié)合(Ad5注射后RU無變化)。箭頭表示試劑注 射的開始和結(jié)束。(B)在單獨FX或者與X-bp以不同F(xiàn)X X_bp摩爾比預(yù)先孵育的FX(如所示) 的存在下，將HepG2細胞暴露于AdKOl。* 〃 ρ < 0.0001與無X_bp相比。誤差棒表 示 SEM。(C)MF-I小鼠用對照花生油或華法林預(yù)處理，并且在有或沒有單獨FX或者用3 倍摩爾過量的X-bp預(yù)先孵育的FX的預(yù)先注射的條件下，向小鼠注射4X IO11VP/小鼠的 Ad5。*p = 0.006 ； = 0.0002。誤差棒表示 SEM。(D)在Ad5注射前30min，向MF-1小鼠(未經(jīng)華法林處理)注射X_bp。48h 后，通過ELISA定量肝基因轉(zhuǎn)移(條形圖)，并通過對β-半乳糖苷酶染色顯像(未顯 示)。= 0.0002)誤差棒表示SEM。 圖6.FX與替代人腺病毒血清型結(jié)合 (A)顯示的是系統(tǒng)樹，其基于通過ClustalW進行的六鄰體HVR氨基酸序列比對并通過Treeview (http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/treeview.html)顯不，該系統(tǒng)樹顯不 了 FX結(jié)合物(binder) ( “ + ”、“++”或“+++” )和非結(jié)合物(“_” )以及通過SPR
測定的FX結(jié)合強度。未通過SPR測試的Ad病毒以灰色顯示。(B)代表性SPR感應(yīng)譜描述了表現(xiàn)出與FX強結(jié)合(++或+++)、弱結(jié)合⑴或 不結(jié)合的人腺病毒血清型。插圖顯示放大的Y軸以表示弱結(jié)合(Ad35)或不可檢測的結(jié) 合(Ad26和Ad48)。箭頭表示注射的開始和結(jié)束。(C)在存在或不存在生理FX的情況下，將HepG2細胞暴露于每種腺病毒。提 取DNA并定量細胞結(jié)合的腺病毒。誤差棒表示SEM。(ρ <0.05與不存在FX相比)。 圖像顯示在37°C下，在存在/不存在FX的情況下，暴露3h后轉(zhuǎn)基因(eGFP)的表達。圖7.在存在和不存在FX的情況下，由Ad5、Ad5HVR48和Ad48介導(dǎo)的體外 MDA-BB-435細胞的結(jié)合與轉(zhuǎn)導(dǎo)。(A)在4°C下，將細胞暴露于1000VP/細胞lh，收獲細胞并提取DNA用于 Taqman分析和基因組定量。(B)在37°C下，將細胞暴露于5000VP/細胞3h，在感染后 48h洗滌并收獲細胞。從收獲的細胞定量轉(zhuǎn)基因表達并以蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)化。*p<0.05 與不存在FX相比。NS=無顯著差異。圖8.FX的絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域在細胞結(jié)合中的作用。在Ad5 (1000VP/細胞)和FX或者與rNAPc2或蜱抗凝血肽(TAP ；作為對照)
預(yù)先孵育的FX的存在下，將HepG2細胞在4°C下在無血清培養(yǎng)基中孵育lh。通過實時 PCR定量病毒的細胞結(jié)合。NS=無顯著差異。圖9.凝血因子解救由Ad5造成的肝轉(zhuǎn)導(dǎo)的體內(nèi)評價。為了評價凝血因子“解救(rescue)”小鼠中肝轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力，在腺病毒注射前3 天和1天，向動物(MFl遠交小鼠，6-12周齡，約30g)皮下給予133mg/小鼠的華法林 (Sigma-Aldrich，Dorset, UK)(懸浮于花生油中)。在病毒注射前30分鐘，向小鼠注射 凝血因子。根據(jù)小鼠的因子VII、IX、X、XI和蛋白C的生理濃度(分別為10、90、 170、30和60nM)以及小鼠的循環(huán)血漿體積(約2ml)，小鼠被給予了足夠恢復(fù)至生理水平 的凝血因子(分別為1.25、10、20、9.6和7.2微克/小鼠)。靜脈內(nèi)注射4X IO11VP/小 鼠的病毒。處死時(48h)收獲器官，并通過商業(yè)ELISA(RocheDiagnostics，Mannheim, Germany)定量β _半乳糖苷酶的活性水平。圖10.FVIK FIX、FX、FXI 和 PC 與 Ad5 六鄰體結(jié)合。根據(jù)生產(chǎn)商的說明書(Biacore)，通過胺偶聯(lián)，將純化的Ad5六鄰體(521RU)固 定于CM5生物傳感器芯片上。通過SPR，分析凝血因子FX(A)、FVII (B)、PC(C)、 FIX(D)和FXI(E)的結(jié)合。針對對照的扣除的感應(yīng)譜顯示了重復(fù)三次的以11個不同濃 度的凝血因子的注射。通過注射5mM EDTA來再生傳感器芯片。圖ll.X-bp對大鼠中Ad5的肝靶向的影響。Ad5注射(1 X IO11VP/大鼠)前30min，向Wistar Kyoto大鼠注射鹽水或3倍摩 爾過量的X-bp FX的X-bp (= Ι. μ g/gX-bp)。注射后5天，收集肝并將β -半乳糖 苷酶定量或利用X-gal正面(en face)顯示。* ρ < 0.0001與Ad5相比。圖12.來自不同人腺病毒血清型的六鄰體蛋白的HVRs和側(cè)翼支架序列的比對。圖13.來自不同物種的FX序列的比對。
圖14.腺病毒六鄰體克隆策略，其示出用于同源重組的中間體和穿梭質(zhì)粒。圖15.用對照Ad5CMVlacZ和不同的六鄰體HVR交換突變腺病毒載體感染的 HeLa細胞中β _半乳糖苷酶轉(zhuǎn)基因表達的分析。轉(zhuǎn)染后48小時分析值。圖16.SKOV3細胞中對照Ad5CMVlacZ和不同HVR-六鄰體突變腺病毒的結(jié)合能 力的分析。展示了相對于媒介對照的倍數(shù)增加。圖17.用對照Ad5CMVlacZ和不同HVR-六鄰體突變腺病毒載體感染的SKOV3 細胞中半乳糖苷酶轉(zhuǎn)基因表達的分析。*ρ< 0.05與單獨病毒相比。圖18.用對照Ad5CMVlacZ和不同HVR-六鄰體突變腺病毒載體感染的SKOV3 細胞中，半乳糖苷酶轉(zhuǎn)基因表達的分析。展示了相對于媒介對照的倍數(shù)增加。圖19.用對照Ad5CMVlacZ和不同HVR-六鄰體突變腺病毒載體感染的SKOV3 細胞中半乳糖苷酶轉(zhuǎn)基因表達的分析。展示了相對于媒介對照的倍數(shù)增加。圖20.用對照Ad5CMVlacZ和不同HVR-六鄰體點突變腺病毒載體感染的HeLa 細胞中β “半乳糖苷酶轉(zhuǎn)基因表達的分析。轉(zhuǎn)染后48小時分析值。圖21.SKOV3細胞中，對照Ad5CMVlacZ和不同點突變腺病毒結(jié)合能力的分析。圖22.用對照Ad5CMVlacZ和不同點突變六鄰體腺病毒載體感染的SKOV3細胞 中半乳糖苷酶轉(zhuǎn)基因表達的分析。圖23.用對照Ad5CMVlacZ和不同點突變六鄰體腺病毒載體感染的SKOV3細胞 中半乳糖苷酶轉(zhuǎn)基因表達的分析。展示了相對于媒介對照的倍數(shù)增加。圖24.來自注射了 Ad5CMVlacZ或點突變六鄰體腺病毒的小鼠的200 μ g肝蛋白
中半乳糖苷酶轉(zhuǎn)基因表達的分析。圖25.通過表面等離子體共振進行的FX-腺病毒顆粒相互作用的分析。圖26.Ad5六鄰體與FX之間的接觸點。展示了來自人腺病毒血清型5、35、50、 49和26的氨基酸序列。方框表示高變區(qū)，箭頭表示推定的FX結(jié)合位點。發(fā)明詳述腺病毒腺病毒是含有線性雙鏈DNA基因組的的無包膜病毒，其感染包括人在內(nèi)的各種 哺乳動物物種。該基因組的長度通常約30_38kp，并且編碼許多基因，包括稱為早期基因 (Ela、Elb、E2a、E2b、E3、E4)和晚期基因(Li、L2、L3、L4、L5)，基因組側(cè)翼有
5’和3’反向末端重復(fù)(ITR)的。該基因組還含有包裝信號。該基因組被包圍在衣殼中，所述衣殼由三種主要蛋白組成，即五鄰體、六鄰體 和纖維。腺病毒通常用作基因轉(zhuǎn)移載體來將異源(即非腺病毒的)DNA遞送到靶細胞或靶 組織。所述異源DNA通常包含異源基因或由異源基因組成(通常稱為轉(zhuǎn)基因)。這樣的載體缺乏一個或多個病毒復(fù)制必需的基因。通常使病毒基因從基因組缺 失，并由異源基因代替。因此，這些載體是復(fù)制缺陷的，并且不能造成生產(chǎn)性感染，所 述生產(chǎn)性感染導(dǎo)致與母體相同的病毒后代的產(chǎn)生(除非同一細胞還被能夠彌補存在于載 體基因組中的缺陷的輔助病毒感染)。目前已經(jīng)產(chǎn)生了三代腺病毒載體。第一代缺乏El基因。第二代將El和/或E3的缺失與E2和/或E4的缺失組合。第三代僅保留了 ITRs和包裝信號，而基因組其 余部分被異源DNA代替，并且通常稱為“空殼(gutless)”或“空殼(gutted)”載體， 或者“輔助病毒依賴性腺病毒(helper-dependent adenoviruses) ”，因為它們依賴于輔助腺 病毒來供給所有的病毒蛋白。參見Alba et al. (2005)的綜述。本說明書中所用的術(shù)語“腺病毒”意圖包括這些復(fù)制缺陷的載體以及可復(fù)制的 病毒。本說明書中所用的術(shù)語“轉(zhuǎn)導(dǎo)”是指通過基因轉(zhuǎn)移載體將異源基因引入靶細胞或 靶組織的過程。在體外，腺病毒通過柯薩奇病毒和腺病毒受體(CAR)感染肝細胞。然而，這種 感染途徑在體內(nèi)并不明顯。已知許多突變降低或去除通過CAR的感染；實例描述于De Geest etal, 2005、O' Riordan et al, 1999、Niuetal.，2007、Lanciotti et al.，2003。對 于通過涉及六鄰體蛋白和FX的機制的肝細胞的腺病毒感染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的體外研究，使用包含 該突變的病毒是可取的。另外地或可選地，使用不表達CAR或僅以低水平表達CAR的 細胞類型用于體外轉(zhuǎn)導(dǎo)是可取的。實例為SKOV3細胞(Kim etal., 2002.)。腺病毒六鄰體蛋白六鄰體蛋白提供了腺病毒中抗原性的主要來源。在人中至少存在49種已知血清 型(參見圖6A)。不同血清型的六鄰體蛋白包含序列的支架和7個稱為高變區(qū)(HVRs) 的高度可變的表面環(huán)，所述序列的支架在血清型之間是相對保守的并且形成六鄰體蛋白 的主要結(jié)構(gòu)片段。這些示于圖12中。因此，在 Ad5 中，HVRl 具有序列 EAATALEINLEEEDDDNEDEVDEQAEQQK THVFGQAPYSGINITK，HVR2 具有序列 GVEGQTP，HVR3 具有序列 QWYETEINH， HVR4 具有序列 GILVKQQNGKLES，HVR5 具有序列 F STTEATAGNGDNLTP，HVR6 具 有序列 PTIKEGNSRELM，并且 HVR7 具有序列 INTETLTKVKPKTGQENGWEKDATE。在Ad26 中，HVRl 具有序列 TKEKQGTTGGVQQEKDVTKTF GVAATGGINITN, HVR2 具有序列 GTDETAENGKKD，HVR3 具有序 列 NWQENEA，HVR4 具有序列 AKFKPVNEGEQPKD，HVR5 具有序列 LDIDFAYFDVPGGSPPAGGSGEEYKA，HVR6 具有序列 PGTSDNSSEINL，并且 HVR7 具有序列 GTNSTYQGVKITNGNDGAEESEWEKDDA。在Ad48 中，HVRl 具有序列 EKKNGGGSDANQMQTHTFGVAAMGGIEITA， HVR2具有序列GIDATKEEDNGKE，HVR3具有序列NWQDSDN，HVR4具有序列 AKFKTPEKEGEEPKE, HVR5 具有序列 FDIPSTGTGGNGTNVNFKP，HVR6 具有序列 PGKEDASSESNL,并且 HVR7 具有序列 GTNAVYQGVKVKTTNNTEWEKDTA?？梢酝ㄟ^與Ad5序列單獨比對，或者直接通過圖12來鑒定其它血清型中對應(yīng)的 HVRs。當(dāng)將給定的六鄰體蛋白與參考六鄰體蛋白比對以獲得最大序列同一性時，可能 會鑒定出如圖12所示鑒定支架序列和HVRs。參考六鄰體蛋白可以是如圖12所示的任 何六鄰體蛋白，例如Ad5。因此，全長六鄰體蛋白具有7個HVRs和8個支架區(qū)。用 于本發(fā)明的六鄰體蛋白優(yōu)選地具有與例如Ad5的至少一種圖12顯示出序列的六鄰體蛋白 的對應(yīng)支架區(qū)具有至少60%，例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少 85%,至少90%或至少95%的同一性的支架區(qū)。Ad5六鄰體蛋白的全長序列為
1MATPSMMPQW SYMHISGQDA SEYLSPGLVQ FARATETYFS LNNKFRNPTV APTHDVTTDR61SQRLTLRFIP VDREDTAYSY KARFTLAVGD NRVLDMASTY FDIRGVLDRG PTFKPYSGTA121YNALAPKGAP NPCEWDEAAT ALEINLEEED DDNEDEVDEQ AEQQKTHVFG QAPYSGINIT181KEGIQIGVEG QTPKYADKTF QPEPQIGESQ WYETEINHAA GRVLKKTTPM KPCYGSYAKP241TNENGGQGIL VKQQNGKLES QVEMQFFSTT EAAAGNGDNL TPKVVLYSED VDIETPDTHI301SYMPTIKEGN SRELMGQQSM PNRPNYIAFR DNFIGLMYYN STGNMGVLAG QASQLNAVVD361LQDRNTELSY QLLLDSIGDR TRYFSMWNQA VDSYDPDVRI IENHGTEDEL PNYCFPLGGV421INTETLTKVK PKTGQENGWE KDATEFSDKN EIRVGNNFAM EINLNANLWR NFLYSNIALY481LPDKLKYSPS NVKI SDNPNT YDYMNKRVVA PGLVDCYINL GARWSLDYMD NVNPFNHHRN541AGLRYRSMLL GNGRYVPFHI QVPQKFFAIK NLLLLPGSYT YEWNFRKDVN MVLQSSLGND601LRVDGASIKF DSICLYATFF PMAHNTASTL EAMLRNDTND QSFNDYLSAA NMLYPIPANA661TNVPISIPSR NWAAFRGWAF TRLKTKETPS LGSGYDPYYT YSGSIPYLDG TFYLNHTFKK721VAITFDSSVS WPGNDRLLTP NEFEIKRS VD GEGYNVAQCN MTKDWFLVQM LANYNIGYQG781FYIPESYKDR MYSFFRNFQP MSRQVVDDTK YKDYQQVGIL HQHNNSGFVG YLAPTMREGQ841AYPANFPYPL IGKTAVDSIT QKKFLCDRTL WRIPFSSNFM SMGALTDLGQ NLLYANSAHA901LDMTFEVDPM DEPTLLYVLF EVFDVVRVHQPHRGVIETVYLRTPFSAGNATT(登錄號 AAW65514.1 ； GI: 58177707)Ad5六鄰體蛋白中的氨基酸位置可以如該序列所示地編號。然而，有時使用替 代的編號，其中不計算起始的甲硫氨酸殘基；隨后的Ala殘基被指定為位置1。因此，例 如，根據(jù)所用的編號系統(tǒng)，上文所示序列中位置451處的谷氨酸殘基可以被指定為E450 或E451。然而，在上下文考慮時，在整個本說明書中，哪種編號應(yīng)用于任何給定殘基是 清楚的。HVR為可變的序列，通常其天然包含約7至約60個氨基酸。然而，據(jù)信可以 允許不同長度的HVRs。HVR可以但不是必須與圖12所示的血清型的HVR具有大于約 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%或 95%的序列同一性。HVR的長度可以為5至150個氨基酸。通常，其長度為約5至約100個氨基 酸。例如，其長度可以為約7個氨基酸至約60個氨基酸(“約”表示+/-10%)。
例如，HVRl可以為約20至約60個氨基酸，例如21至54個氨基酸。 HVR2可以為約5至約20個氨基酸，例如8至14個氨基酸。
HVR3可以為約5至約15個氨基酸 HVR4可以為約5至約25個氨基酸 HVR5可以為約5至約25個氨基酸 HVR6可以為約5至約20個氨基酸
例如7至9個氨基酸。 例如6至18個氨基酸。 例如9至20個氨基酸。 例如11至14個氨基酸。 HVR7可以為約15至約35個氨基酸，例如21至29個氨基酸。 在HVRl中，在對應(yīng)于Ad5六鄰體蛋白的Alal71[在上文提供的登錄號為
AAW65514.1 ； GI: 58177707的序列中表示為Alal72]的位置處具有Ala殘基是可取的。另外地或可選地，在對應(yīng)于Ad5六鄰體蛋白的Ilel78[在上文提供的登錄號為 AAW65514.1 ； GI 58177707的序列中表示為Ilel79]的位置處具有Ile殘基是可取的。在HVR5中，在對應(yīng)于Ad5六鄰體蛋白的Phe266[在上文提供的登錄號為 AAW65514.1 ； GI: 58177707的序列中表示為Phe267]的位置處具有Phe殘基是可取 的。另外地或可選地，在對應(yīng)于Ad5六鄰體蛋白的Phe265[在上文提供的登錄號為 AAW65514.1 ； GI 58177707的序列中表示為Phe266]的位置處具有Phe或Tyr殘基是可 取的。在HVR6中，在對應(yīng)于Ad5六鄰體蛋白的Ser310[在上文提供的登錄號為 AAW65514.1 ； GI: 58177707的序列中表示為Ser311]的位置處具有Ala或Ser殘基， 和/或在對應(yīng)于Ad5六鄰體蛋白的Aot309[在上文提供的登錄號為AAW65514.1 ； GI: 58177707的序列中表示為Aot310]的位置處具有Ser或Aot殘基，和/或在對應(yīng)于Ad5六 鄰體蛋白的Met314[在上文提供的登錄號為AAW65514.1 ； GI: 58177707的序列中表示 為Met315]的位置處具有Met或Leu殘基是可取的。在HVR7中，在對應(yīng)于Ad5六鄰體蛋白的Trp438[在上文提供的登錄號為 AAW65514.1 ； GI: 58177707的序列中表示為Trp439]的位置處具有Trp殘基是可取 的。另外地或可選地，在對應(yīng)于Ad5六鄰體蛋白的Val428[在上文提供的登錄號為 AAW65514.1 ； GI: 58177707的序列中表示為Val429]的位置處具有Val或Ile殘基是可取的。在一些實施方案中，當(dāng)相對于野生型或母體HVR序列進行突變(如取代或缺失) 時，所得的HVR與野生型或母體HVR的差別為最多5個殘基是可取的，例如最多4個殘 基、最多3個殘基、最多2個殘基或者最多1個殘基。因此，例如，修飾過的Ad5六鄰體蛋白可以含有HVR3、HVR5和/或HVR7， 它們與野生型Ad5HVR3、HVR5和/或HVR7序列的差別為最多5個殘基，例如最多4
個殘基、最多3個殘基、最多2個殘基或者最多1個殘基。例如，HVR5序列與野生型HVR5序列的差別為最多5個殘基、4個殘基、3個 殘基、2個殘基或者1個殘基，這包括對應(yīng)于Ad5HVR5的位置269和/或270的殘基[在 上文提供的登錄號為AAW65514.1 ； GI 58177707的序列中表示為Thr270和Glu271]。 所述HVR5序列可以在這些位置處具有殘基Pro和/或Gly。野生型HVR序列可以為 Ad5HVR5。HVR7序列與野生型HVR7序列的差別為最多5個殘基、4個殘基、3個殘基、
2個殘基或者1個殘基，這包括對應(yīng)于Ad5HVR7的位置420、422、423和425[在上文提 供的登錄號為AAW65514.1 ； GI: 58177707的序列中表示為位置421、423、424和426] 中的一個或多個的殘基。所述HVR7序列可以在這些位置處具有殘基420Gly、422Asn, 423Ser和/或425Tyr中的一個或多個。因此，考慮為整體的六鄰體蛋白可以與圖12中的六鄰體蛋白之一(如Ad5)的整 體序列具有至少60%的同一性，例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少 85%,至少90%或至少95%的同一性，但是其不需要達到這樣，只要支架序列具有所需 程度的同一性。嵌合六鄰體蛋白包含來自第一血清型的支架片段以及至少一個來自第二血清型的HVR。例如，嵌合六鄰體蛋白可以含有來自Ad2或Ad5血清型的支架，例如Ad5 血清型，以及來自另一血清型的HVRs3、5和7中的一個或多個，特別是HVR5和/或 HVR7。所述其它血清型可以為(例如)Adl7、Ad20、Ad25、Ad26、Ad28、Ad29、Ad44 或Ad48，例如Ad26或Ad48。在一些實施方案中，僅HVR5、僅HVR7或者僅HVR5和 HVR7來自其它血清型，并且其它HVRs來自與支架相同的血清型是可取的。然而，支架和HVR都可以含有相對于圖12所示的序列的修飾或突變，例如取 代。能夠與FX Gla結(jié)合的六鄰體片段可以包含如圖12所示的六鄰體蛋白的至少20、 至少50、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至 少800或至少900個連續(xù)氨基酸，或其變體，所述變體如上文所述，除了支架區(qū)，與圖12 所示的任何序列具有至少60%的序列同一性。所述六鄰體片段可以包含至少1個HVR， 并且可以包含2、3、4、5、6或7個HVRs。應(yīng)當(dāng)理解，圖12沒有示出相關(guān)六鄰體蛋白的第一或最終(第8)支架區(qū)的全長序 列。應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)規(guī)定了與特定支架區(qū)的序列同一性的程度時，其意指那些區(qū)的全長序 列，而不是簡單地意指圖12所示的那些區(qū)的片段。因子 X(FX)FX是凝血因子，其含有Gla、EGFU EGF2和絲氨酸蛋白酶(SP)結(jié)構(gòu)域。FX
蛋白的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)示于圖1中，并且來自不同物種的FX的代表性序列示于圖13中。Gla結(jié)構(gòu)域含有45個氨基酸，包括許多遺傳編碼的谷氨酸殘基，它們?nèi)哭D(zhuǎn)變 為Y-羧基谷氨酸。Gla結(jié)構(gòu)域已被發(fā)現(xiàn)參與到與六鄰體蛋白的相互作用。分離的Gla結(jié) 構(gòu)域(或其能夠與六鄰體蛋白結(jié)合的片段)發(fā)現(xiàn)了在本發(fā)明許多方面的用途。該Gla結(jié)構(gòu) 域可以與諸如人Gla結(jié)構(gòu)域的圖13種所示的Gla結(jié)構(gòu)域之一具有至少80%、至少85%、 至少90%或至少95%的序列同一性。通常，Y-羧基谷氨酸殘基是保守的，因為它們被 認(rèn)為在鈣結(jié)合中起作用，并且與六鄰體蛋白的相互作用是鈣依賴性的。依賴于Gla與六 鄰體之間相互作用的體外實施的方法通常在鈣離子的存在下發(fā)生。包含Gla結(jié)構(gòu)域的構(gòu)建 體還可以包含一個或多個來自FX的其它結(jié)構(gòu)域，例如EGFl結(jié)構(gòu)域，但是可能也有EGF2 結(jié)構(gòu)域。通常，它們不包含SP結(jié)構(gòu)域，但是如果存在SP，則SP可以包含減少或去除與 硫酸類肝素蛋白多糖結(jié)合的突變或修飾。EGFl結(jié)構(gòu)域、EGF2結(jié)構(gòu)域或SP結(jié)構(gòu)域可以 與圖13所示的對應(yīng)結(jié)構(gòu)域之一具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的序列 同一性。因子X結(jié)合蛋白因子X結(jié)合蛋白(X-bp)是分離自尖吻蝮的蛇毒的蛋白。其與FXGla結(jié)構(gòu)域結(jié) 合，并且能夠抑制與六鄰體蛋白的相互作用。因子X結(jié)合蛋白由兩個亞基組成。亞基的 序列和與FX的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)示于Mizuno et al.，2001。因此，鏈A被認(rèn)為具有以下序列DCSSGWSSYE GHCYKVFKQS KTWADAESFC TKQVNGGHLV SIESSGEADF VGQLIAQKIKSAKIHVWIGL RAQNKEKQC S IEWSDGSSIS YENWIEEESK KCLGVHIETG FHKWENFYCEQQDPFVCEA鏈B 被認(rèn)為具有以下序列DCPSDWSSYE GHCYKPFNEP KNWADAENFCTQQHTGSHLV SFQSTEEADF VVKLAFQTFDYGIFWMGLSK IWNQCNWQWS NAAMLKYTDW AEESYCVYFK STNNKWRSIT CRMIANFVCEFQA本發(fā)明涉及X-bp的類似物的使用，所述類似物含有相對于上文給出的序列的一 個或多個修飾或者突變，但是保留與FX Gla結(jié)合的能力。例如，這樣的類似物可以包含 與鏈A具有至少80 %的序列同一性的第一多肽鏈以及與鏈B具有至少80 %的序列同一性 的第二多肽鏈，其中所述類似物能夠與FX Gla結(jié)合。所述類似物保留鏈A的E98和KlOO和/或鏈B的K100、N103、R107和Rl 12 中的一個或多個是可取的，因為這些殘基被認(rèn)為參與接觸Gla結(jié)構(gòu)域。保留鏈A 的 S20、S61、A62、K63、H65、E99、E115、N116、F117、Y118、 E120、Q12U Q122、D123 以及鏈 B 的 Y61、163、Y95、Y98、S108 中的一個或多個也
是可取的，因為這些殘基被認(rèn)為參與Gla結(jié)合中與水分子的相互作用。這些位點處的保 守性取代是可以接受的。序列同源件、突變和修飾本說明書中涉及特定氨基酸序列的突變或修飾可以包括點突變，即特定氨基酸 的缺失、取代和插入。非保守性取代可能特別適合于產(chǎn)生具有改變的與FX的結(jié)合的六鄰 體變體，因為具有非保守性突變的突變體或變體比具有保守性取代的突變體或變體更不 可能保留原始功能。然而，保守性取代在產(chǎn)生變體六鄰體蛋白中也可以是有用的，例如 在支架區(qū)。保守性突變還可以見于含有FX(如Gla)序列或X-bp序列的構(gòu)建體中，其目 的是要保留野生型功能，例如與六鄰體或Gla結(jié)合。然而，應(yīng)當(dāng)清楚，修飾不需要總是涉及點突變。例如，修飾可以涉及將氨基酸 序列段交換為氨基酸序列代替段，所述氨基酸序列代替段具有相同或不同的長度，并且 與原始序列具有或多或少的序列同一性。例如，用隨機產(chǎn)生的序列代替HVR序列是可取 的，目的是測試改變的Gla結(jié)合。實際上，可以生成測試蛋白的群體(如“文庫”)用 于篩選，從而鑒定具有所需結(jié)合性質(zhì)的合適序列，每種測試蛋白包含諸如HVR的給定區(qū) 中的不同序列。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)熟知用于這樣的文庫的構(gòu)建和篩選的合適技術(shù)。保守性取代可以定義為一種氨基酸類別中的取代和/或如下文所示在 BLOSUM62矩陣中得分為正的取代，因此非保守性取代可以定義為氨基酸類別間的取代 或在BLOSUM62矩陣中得分不為正的取代。根據(jù)一種分類，氨基酸類別為酸性、堿性、不帶電極性和非極性的，其中酸性 氨基酸為Asp和Glu;堿性氨基酸為Arg、Lys和His ；不帶電極性氨基酸為Asn、Gin、 Ser、Thr 禾PTyr ；以及非極性氨基酸為 Ala、Gly、VaL Leu、lie、Pro、Phe> Met、Trp 和 Cys。根據(jù)另一分類，氨基酸類別為小親水、酸/酰胺/親水、堿性、小疏水和芳香 的，其中小親水氨基酸為Ser、Thr, Pro、Ala和Gly ；酸/酰胺/親水氨基酸為Am、 Asp> Glu和Gln;堿性氨基酸為His、Arg和Lys ；小疏水氨基酸為Met、lie、Leu和 Val ；以及芳香氨基酸為Phe、Tyr和Trp。在BLOSUM62矩陣中得分為正的保守性取代如下
權(quán)利要求
1.抑制肝細胞或脾細胞的腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法，其包括使所述肝細胞或脾細胞與所述 腺病毒在能夠抑制FX與腺病毒六鄰體蛋白之間的相互作用的試劑的存在下接觸。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其包括給予個體所述試劑和所述腺病毒。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其包括在給予所述腺病毒前，用所述試劑預(yù)處理所述個體。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其包括在給予前，將所述試劑與所述腺病毒預(yù)先混合。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其是在含有FX的環(huán)境中體外或離體實施的。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述腺病毒含有抑制所述腺病毒與柯薩奇病毒和腺 病毒受體(CAR)結(jié)合的突變。
7.如權(quán)利要求5或權(quán)利要求6所述的方法，其中所述肝細胞是不具有CAR表達或具 有低CAR表達的細胞，例如SKOV3細胞。
8.如前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述抑制劑與FX的Gla結(jié)構(gòu)域結(jié)合。
9.如前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述抑制劑選自(i)來自尖吻蝮(Deinagkistrodonacutus)的FX結(jié)合蛋白(X_bp)或其能夠與FX結(jié)合并抑制與六鄰體蛋白的相互作用的功能性片段；(ii)特異性針對FX的抗體，例如特異性針對FX的Gla結(jié)構(gòu)域的抗體；或者(iii)可溶性分子，其包含能夠結(jié)合FXGla的腺病毒六鄰體蛋白的至少一個片段，所 述分子可以是全長六鄰體蛋白，或者可以包含全長六鄰體蛋白。
10.如權(quán)利要求1至7中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述抑制劑與腺病毒六鄰體 蛋白結(jié)合。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述抑制劑為ω特異性針對六鄰體蛋白的抗體，例如特異性針對所述六鄰體蛋白的HVR的抗 體；或者(ii)FX類似物，其包含足以與六鄰體蛋白結(jié)合的Gla結(jié)構(gòu)域的片段，并且缺乏SP結(jié) 構(gòu)域或者包含所述SP結(jié)構(gòu)域的修飾使得它不能介導(dǎo)腺病毒與肝細胞或脾細胞之間的相互 作用。
12.如前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述腺病毒或六鄰體蛋白是 Ad2或Ad5血清型的。
13.如前述權(quán)利要求中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述腺病毒是基因轉(zhuǎn)移載體或 意圖用作基因轉(zhuǎn)移載體。
14.能夠抑制FX與腺病毒六鄰體蛋白之間的相互作用的試劑在制備用于抑制肝細胞 或脾細胞的腺病毒感染的藥物中的用途。
15.能夠抑制FX與腺病毒六鄰體蛋白之間的相互作用的試劑，其用于抑制肝細胞或 脾細胞的腺病毒感染。
16.能夠抑制FX與腺病毒六鄰體蛋白之間的相互作用的試劑，其用于醫(yī)學(xué)治療方法。
17.藥物制劑，其包含能夠抑制FX與腺病毒六鄰體蛋白之間的相互作用的試劑以及 腺病毒，所述試劑和腺病毒都與藥學(xué)上可接受的載體組合。
18.試劑盒，其包含第一組合物和第二組合物，所述第一組合物包含能夠抑制FX與 腺病毒六鄰體蛋白之間的相互作用的試劑和腺病毒，所述第二組合物包含腺病毒。
19.如權(quán)利要求18所述的試劑盒，其中每種組合物為包含各自的抑制劑或腺病毒以及 藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。
20.將基因遞送至靶細胞或靶組織的方法，其包括使所述細胞或組織與腺病毒基因轉(zhuǎn) 移載體和靶向劑接觸，其中所述靶向劑包含能夠與所述腺病毒基因轉(zhuǎn)移載體的六鄰體蛋 白結(jié)合的FXGla結(jié)構(gòu)域的片段，與能夠結(jié)合所述靶細胞或靶組織的結(jié)合劑連接。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述靶向劑包含F(xiàn)X組分，所述FX組分包含完 整的FX Gla結(jié)構(gòu)域。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述FX組分包含Gla-EGFl或 Gla-EGF 1-EGF2，或者由 Gla-EGFl 或 Gla_EGFl_EGF2 組成。
23.如權(quán)利要求20至22中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述FX組分不包含F(xiàn)XSP 結(jié)構(gòu)域，或者包含修飾，使得FX結(jié)構(gòu)域不能介導(dǎo)腺病毒與肝細胞或脾細胞之間的相互作用。
24.如權(quán)利要求20至23中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述結(jié)合劑包含表達于所 述靶細胞或靶組織表面的分子的配體或受體，或其足以與所述分子結(jié)合的片段。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述結(jié)合劑包含特異性針對表達于所述細胞或組 織表面的任何分子的抗體或適體，表達于所述細胞或組織表面的受體的配體，或者能夠 與存在于所述細胞或組織表面的碳水化合物結(jié)合的凝集素。
26.如權(quán)利要求24或權(quán)利要求25所述的方法，其中與所述結(jié)合劑所結(jié)合的結(jié)合伴侶 對于靶細胞類型是特異性的，例如腫瘤特異性抗原。
27.如權(quán)利要求20至26中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述靶向劑為融合蛋白， 所述融合蛋白包含單一多肽鏈，所述多肽鏈包含所述結(jié)合劑與所述FX組分。
28.如權(quán)利要求20至27中任一權(quán)利要求所述的方法，其包括在給予所述腺病毒前， 用所述靶向劑預(yù)處理個體。
29.如權(quán)利要求20至27中任一權(quán)利要求所述的方法，其包括在給予前將所述靶向劑 與所述腺病毒預(yù)先混合。
30.如權(quán)利要求20至29中任一權(quán)利要求所述的靶向劑。
31.如權(quán)利要求20至29中任一權(quán)利要求所述的靶向劑在制備用于通過腺病毒向靶細 胞或靶組織進行基因轉(zhuǎn)移的藥物中的用途。
32.如權(quán)利要求20至29中任一權(quán)利要求所述的靶向劑，其用于通過腺病毒向靶細胞 或靶組織進行基因轉(zhuǎn)移。
33.如權(quán)利要求20至29中任一權(quán)利要求所述的靶向劑，其用于醫(yī)學(xué)治療的方法。
34.藥物制劑，其包含如權(quán)利要求20至29中任一權(quán)利要求所述的靶向劑以及腺病 毒，所述靶向劑和腺病毒都與藥學(xué)上可接受的載體組合。
35.試劑盒，其包含第一組合物和第二組合物，所述第一組合物包含如權(quán)利要求20至 29中任一權(quán)利要求所述的靶向劑，所述第二組合物包含腺病毒。
36.如權(quán)利要求35所述的試劑盒，其中每種組合物為包含各自的靶向劑或腺病毒以及 藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。
37.篩選能夠調(diào)節(jié)肝細胞或脾細胞的腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的試劑的方法，其包括使測試試劑與 第一物質(zhì)和第二物質(zhì)接觸，所述第一物質(zhì)包含能夠結(jié)合FX的腺病毒六鄰體蛋白的片段， 所述第二物質(zhì)包含能夠結(jié)合腺病毒六鄰體蛋白的FX Gla結(jié)構(gòu)域的片段，以及測定所述六 鄰體片段與所述FX Gla片段之間的結(jié)合。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，其中所述第一物質(zhì)包含⑴至少一個HVR ；(ii)任選地具有中間支架序列的2個或更多個(如2個、3個、4個、5個、6個或7 個)HVRs;或者(iii)完整的六鄰體蛋白。
39.如權(quán)利要求37或權(quán)利要求38所述的方法，其中所述六鄰體蛋白或其片段具有野 生型序列，例如Ad2或Ad5血清型的。
40.如權(quán)利要求37或權(quán)利要求38所述的方法，其中所述六鄰體蛋白或其片段在所述 支架或HVRs中含有相對于野生型六鄰體蛋白的一個或多個突變或者修飾。
41.如權(quán)利要求40所述的方法，其中所述六鄰體蛋白或其片段在HVR中含有相對于 對應(yīng)的野生型HVR的一個或多個點突變，所述點突變調(diào)節(jié)與FX的結(jié)合。
42.如權(quán)利要求37至39中任一權(quán)利要求所述的方法，其中HVR3、HVR5和/或 HVR7 源自 Adl7、Ad20、Ad25、Ad26、Ad28、Ad29、Ad44 或 Ad48。
43.如權(quán)利要求37至42中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述第二物質(zhì)包含 FX Gla-EGF 1、Gla_EGFl_EGF2 或 Gla_EGFl-EGF2-SP，或者由 FXGla-EGFl、 Gla-EGF 1-EGF2 或 Gla_EGFl-EGF2-SP 組成。
44.如權(quán)利要求37至43中任一權(quán)利要求所述的方法，其包括在存在和不存在所述測 試試劑的情況下，確定所述六鄰體片段與所述FXGla片段間的結(jié)合，以及如果結(jié)合在存 在所述試劑與不存在所述試劑的情況下不同，則選擇所述測試試劑。
45.如權(quán)利要求44所述的方法，其在鑒定出或選擇了合適的測試試劑后，包括以下另 外的步驟使所述測試試劑與肝細胞或脾細胞及腺病毒接觸，以及確定所述肝細胞或脾 細胞的所述腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。
46.如權(quán)利要求45所述的方法，其包括在存在和不存在所述測試試劑的情況下，比較 所述肝細胞或脾細胞的所述腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。
47.如權(quán)利要求45或46所述的方法，其中所述腺病毒為攜帶報告基因的基因轉(zhuǎn)移載 體，所述報告基因的表達在轉(zhuǎn)導(dǎo)的肝細胞或脾細胞中是可檢測的。
48.篩選具有改變的FX親和力的腺病毒六鄰體蛋白的方法，其包括提供包含能夠結(jié)合FX的腺病毒六鄰體蛋白的片段的物質(zhì)；使所述物質(zhì)與能夠結(jié)合腺病毒六鄰體的FX Gla結(jié)構(gòu)域的片段接觸；以及確定所述六鄰體片段與所述FX Gla片段之間的結(jié)合。
49.如權(quán)利要求48所述的方法，其中所述物質(zhì)包含⑴至少一個HVR ；(ii)任選地具有中間支架序列的2個或更多個(如2個、3個、4個、5個、6個或7 個)HVRs;或者(iii)完整的六鄰體蛋白。
50.如權(quán)利要求48或49所述的方法，其包括提供至少第一和第二所述物質(zhì)，每種物質(zhì)包含各自的第一和第二腺病毒六鄰體片段；使每種所述物質(zhì)與能夠結(jié)合六鄰體蛋白的FX Gla結(jié)構(gòu)域的片段接觸；以及確定每種所述六鄰體片段與所述FX Gla片段之間的結(jié)合。
51.如權(quán)利要求50所述的方法，其中所述第一六鄰體片段與所述第二六鄰體片段除了 一個或多個HVR序列以外是相同的。
52.如權(quán)利要求50或權(quán)利要求51所述的方法，其中所述第二六鄰體片段在HVRs3、 5和7的一個或多個中包含相對于所述第一六鄰體片段的一個或多個突變或者修飾。
53.如權(quán)利要求50至52中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述第二六鄰體片段在對 應(yīng)于以下的殘基處含有相對于所述第一六鄰體片段的一個或多個突變(如取代、缺失或 添加)⑴Ad5六鄰體蛋白的Thr268、Thr269和/或Glu270[在登錄號為AAW65514.1 ； GI: 58177707 的序列中顯示為 Thr269、Thr270 和 Glu271]；(ii)Ad5六鄰體蛋白的 Ile420、Asn42U Thr422、Glu423、Thr424、Leu425、Asp447 或 Lys448[在登錄號為 AAW65514.1 ; GI: 58177707 的序列中顯示為 Ile421、Asn422、 Thr423、Glu424、Thr425、Leu426、Asp448 或 Lys449];(iii)Ad5 六鄰體蛋白的 Glu450、Arg452 和 Val453[在登錄號為 AAW65514.1 ； GI 58177707的序列中顯示為Glu451、Arg453和Val454]；和/或(iv)Ad5六鄰體蛋白的 Glu212、Thr213、Glu214、Ile215、Asn216, Ser267、 Met314、Asn421、Thr426、Ser446 或 Asn449[在登錄號為 AAW65514.1 ; GI: 58177707 的序列中顯示為 Glu213、Thr214、Glu215、Ile216、Asn217、Ser268、Met315、 Asn422、Thr427、Ser447 或 Asn450]。
54.如權(quán)利要求53所述的方法，其中所述第二六鄰體片段在對應(yīng)于Thr269的位置處 含有Pro或Asp，和/或在對應(yīng)于Glu270的位置處含有Gly或Ser。
55.如權(quán)利要求53所述的方法，其中所述第二六鄰體片段在對應(yīng)于Ile420、Thr422、 Glu423和Leu425中的1個、2個、3個或全部4個的殘基處含有突變。
56.如權(quán)利要求55所述的方法，其中所述第二六鄰體片段在對應(yīng)于Ile420的位置處含 有Gly，在對應(yīng)于Thr422的位置處含有Aot，在對應(yīng)于Glu423的位置處含有Ser或Ala， 和/或在對應(yīng)于Leu425的位置處含有Tyr。
57.如權(quán)利要求53所述的方法，其中所述第二六鄰體片段在對應(yīng)于Ad5的Glu450[在 以下提供的登錄號為AAW65514.1 ； GI: 58177707的序列中顯示為Glu451]的位置處含有 突變，并且其中在該位置處引入中性或帶正電荷的殘基，例如Gin、lie、Leu、VaL Arg 或 Lys。
58.如權(quán)利要求51所述的方法，其中所述第一六鄰體片段具有野生型六鄰體序列，并 且所述第二六鄰體片段具有嵌合六鄰體序列，所述嵌合六鄰體序列包含來自所述第一六 鄰體蛋白的支架序列和來自不同野生型六鄰體蛋白的一個或多個HVRs。
59.如權(quán)利要求58所述的方法，其中所述第二六鄰體片段的HVR3、HVR5和HVR7 的一個或多個與所述支架序列源自不同的血清型。
60.如權(quán)利要求58或權(quán)利要求59所述的方法，其中所述第一六鄰體片段是血清型Ad2 或Ad5的。
61.如權(quán)利要求60所述的方法，其中所述第二六鄰體序列具有嵌合六鄰體序列，所述 嵌合六鄰體序列包含來自Ad2或Ad5的支架片段和至少一個來自Adl7、Ad20、Ad25、 Ad26、Ad28、Ad29、Ad44 或 Ad48 中至少一個的 HVR 序列。
62.如權(quán)利要求48至61中任一權(quán)利要求所述的方法，其還包括選擇含有具有所需的 Gla或FX結(jié)合特性的片段的物質(zhì)，生成含有包含各自片段的六鄰體蛋白的腺病毒，使所 述腺病毒與肝細胞或脾細胞接觸，以及確定所述肝細胞或脾細胞的所述腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。
63.如權(quán)利要求62所述的方法，其中所述腺病毒為攜帶報告基因的基因轉(zhuǎn)移載體，所 述報告基因的表達在轉(zhuǎn)導(dǎo)的肝細胞或脾細胞中是可檢測的。
64.篩選具有改變的轉(zhuǎn)導(dǎo)肝細胞或脾細胞的能力的腺病毒的方法，其包括提供包含第一六鄰體蛋白的第一腺病毒；提供包含第二六鄰體蛋白的第二腺病毒；以及比較所述第一腺病毒與所述第二腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)肝細胞或脾細胞的能力，其中所述第 一六鄰體蛋白與所述第二六鄰體蛋白的差別在于(i)HVR3序列和HVR7序列中的一個或多個；(ii)HVR5中對應(yīng)于Ad5六鄰體蛋白的Thr268、Thr269和/或Glu270[在登錄號為 AAW65514.1 ； GI 58177707的序列中顯示為Thr269、Thr270和Glu271]的殘基處的點突變；(iii)所述支架序列中對應(yīng)于Ad5六鄰體蛋白的Ser267、Met314、Asn42UThr426、 Ser446、Asn449, Glu450、Arg452 和 Val453[在登錄號為 AAW65514.1 ; GI : 58177707 的序列中顯示為 Ser268、Met315、Asn422、Thr427、Ser447、Asn450, Glu451、Arg453 和Val454]的殘基處的一個或多個氨基酸；和/或(iv)修飾過的六鄰體蛋白為嵌合六鄰體蛋白，其中HVR5源自與母體六鄰體蛋白不 同的血清型的六鄰體蛋白。
65.如權(quán)利要求64所述的方法，其中所述第一六鄰體蛋白與所述第二六鄰體蛋白除了 所述差別以外是相同的。
66.如權(quán)利要求65所述的方法，其中所述第一腺病毒與所述第二腺病毒除了所述差別 以外是相同的。
67.如權(quán)利要求64至66中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述第一六鄰體蛋白與所 述第二六鄰體蛋白的差別在于位于HVR7中的對應(yīng)于Ad5六鄰體蛋白的Ile420、Asn42U Thr422, Glu423, Thr424, Leu425, Asp447 或 Lys448[在登錄號為 AAW655Ill ; GI : 58177707 的序列中表示為 Ile421、Asn422、Thr423、Glu424、Thr425、Leu426、Asp448 和Lys449]殘基處的一個或多個突變，或者位于HVR3中的對應(yīng)于Ad5六鄰體蛋白的Glu212、Thr213、Glu214、Ile215、 Asn216[在登錄號為 AAW65514.1 ; GI: 58177707 的序列中顯示為 Glu213、Thr214、 Glu215、Ile216、Asn217、Ser268、Met315、Asn422, Thr427、Ser447 和 Asn450]殘基 處的一個或多個突變。
68.如權(quán)利要求64至67中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述第一六鄰體蛋白與所述第二六鄰體蛋白的差別在于對應(yīng)于Ad5的Glu450[在以下提供的登錄號為 AAW65514.1 ； GI: 58177707的序列中顯示為Glu451]的位置處的突變，并且其中所述第 二六鄰體蛋白在該位置攜帶中性或帶正電荷的殘基，例如Gin、lie、Leu、VaL Arg或 Lys。
69.如權(quán)利要求64至66中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述第一六鄰體蛋白為野 生型六鄰體蛋白，并且所述第二六鄰體蛋白為嵌合六鄰體蛋白，所述嵌合六鄰體蛋白具 有來自所述第一六鄰體蛋白的支架序列和來自至少一種不同野生型六鄰體蛋白的HVR3、 HVR5和HVR7的至少一個。
70.如權(quán)利要求69所述的方法，其中HVR3、HVR5和HVR7中的一個或多個與所述 支架源自不同的血清型。
71.如權(quán)利要求69或權(quán)利要求70所述的方法，其中所述第一六鄰體蛋白是血清型Ad2 或Ad5的，并且所述第二六鄰體蛋白的HVR3、HVR5和HVR7中的一個或多個源自血清 型 Adl7、Ad20、Ad25、Ad26、Ad28、Ad29、Ad44 或 Ad48 中的一種或多種。
72.如權(quán)利要求71所述的方法，其中所述第一六鄰體蛋白是血清型Ad5的，并且 HVR5和HVR7之一或兩者源自Ad26。
73.如權(quán)利要求64至72中任一權(quán)利要求所述的方法，其包括提供編碼所述第一六鄰 體蛋白的第一核酸序列，并且修飾所述第一核酸以產(chǎn)生編碼所述第二六鄰體蛋白的第二 核酸序列。
74.如權(quán)利要求64至73中任一權(quán)利要求所述的方法，其包括使至少分別的第一肝細 胞和第二肝細胞或者第一脾細胞和第二脾細胞與至少所述第一腺病毒和所述第二腺病毒 在FX的存在下體外接觸，并確定所述細胞的所述腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。
75.如權(quán)利要求74所述的方法，其中所述腺病毒包含減少與CAR結(jié)合的突變，和/或 其中所述肝細胞為具有低CAR表達或不具有CAR表達的細胞類型，例如SKOV3細胞。
76.如權(quán)利要求74所述的方法，其包括將所述第一腺病毒和所述第二腺病毒給予分別 的第一非人個體和第二非人個體，并確定肝細胞或脾細胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)。
77.如權(quán)利要求64至76中任一權(quán)利要求所述的方法，其包括選擇具有改變的(如增 強的或降低的)肝細胞或脾細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的腺病毒。
78.調(diào)節(jié)腺病毒的肝或脾感染性的方法，其包括提供母體腺病毒六鄰體蛋白；修飾所述母體六鄰體蛋白以產(chǎn)生具有改變的FX親和力的修飾過的六鄰體蛋白；以及產(chǎn)生包含所述修飾過的六鄰體蛋白的腺病毒；從而所述腺病毒與包含所述母體六鄰體蛋白的腺病毒相比，具有改變的轉(zhuǎn)導(dǎo)肝細胞 或脾細胞的能力，其中所述母體六鄰體蛋白與所述修飾過的六鄰體蛋白的差別在于(i)HVR3和HVR7中的一個或多個；(ii)HVR5中對應(yīng)于Ad5六鄰體蛋白的Thr268、Thr269和/或Glu270[在登錄號為 AAW65514.1 ； GI 58177707的序列中顯示為Thr269、Thr270和Glu271]的殘基處的點突變；(iii)所述支架序列中對應(yīng)于Ad5六鄰體蛋白的Ser267、Met314、Asn421、Thr426、 Ser446、Asn449、Glu450、Arg452 和 Val453[在登錄號為 AAW65514.1 ; GI : 58177707的序列中顯示為 Ser268、Met315、Asn422, Thr427、Ser447、Asn450、Glu451、Arg453 和Val454]的殘基處的一個或多個氨基酸；和/或(iv)所述修飾過的六鄰體蛋白為嵌合六鄰體蛋白，其中HVR5源自與所述母體六鄰 體蛋白不同的血清型的六鄰體蛋白。
79.修飾過的腺病毒六鄰體蛋白，其與母體六鄰體蛋白的差別在于(i)HVR3和HVR7中的一個或多個；(ii)HVR5中對應(yīng)于Ad5六鄰體蛋白的Thr268、Thr269和/或Glu270[在登錄號為 AAW65514.1 ； GI 58177707的序列中顯示為Thr269、Thr270和Glu271]的殘基處的點突變；(iii)所述支架序列中對應(yīng)于Ad5六鄰體蛋白的Ser267、Met314、Asn421、Thr426、 Ser446、Asn449、Glu450、Arg452 和 Val453[在登錄號為 AAW65514.1 ; GI : 58177707 的序列中顯示為 Ser268、Met315、Asn422, Thr427、Ser447、Asn450、Glu451、Arg453 和Val454]的殘基處的一個或多個氨基酸；和/或(iv)所述修飾過的六鄰體蛋白為嵌合六鄰體蛋白，其中HVR5源自與所述母體六鄰 體蛋白不同的血清型的六鄰體蛋白；從而包含所述修飾過的六鄰體蛋白的腺病毒與包含所述母體六鄰體蛋白的其它方面 相同的腺病毒相比，具有改變的轉(zhuǎn)導(dǎo)肝細胞或脾細胞的能力。
80.如權(quán)利要求78或權(quán)利要求79所述的方法或六鄰體蛋白，其中所述母體六鄰體蛋 白與所述修飾過的六鄰體蛋白除了所述差別以外是相同的。
81.如權(quán)利要求80所述的方法，其中所述母體腺病毒與所述修飾過的腺病毒除了所述 差別以外是相同的。
82.如權(quán)利要求78至81中任一權(quán)利要求所述的方法或六鄰體蛋白，其中所述母體 六鄰體蛋白與修飾過的六鄰體蛋白的差別在于位于HVR7中的對應(yīng)于Ad5六鄰體蛋白 的 Ile420、Asn421、Thr422、Glu423、Thr424、Leu425、Asp447 或 Lys448[在登錄號 為 AAW65514.1 ; GI 58177707 的序列中顯示為 Ile421、Asn422、Thr423、Glu424、 Thr425、Leu426、Asp448和Lys449]殘基處的一個或多個突變，或者位于HVR3中的對應(yīng)于Ad5六鄰體蛋白的Glu212、Thr213、Glu214、Ile215、 Asn216[在登錄號為 AAW65514.1 ; GI: 58177707 的序列中顯示為 Glu213、Thr214、 Glu215、Ile216、Asn217, Ser268、Met315、Asn422, Thr427、Ser447 和 Aot450]殘基 處的一個或多個突變。
83.如權(quán)利要求82所述的方法或六鄰體蛋白，其中所述修飾過的六鄰體蛋白在對應(yīng)于 Thr269的位置處含有Pro或Asp，和/或在對應(yīng)于Glu270的位置處含有Gly或Ser。
84.如權(quán)利要求82所述的方法或六鄰體蛋白，其中所述母體六鄰體蛋白與所述修飾過 的六鄰體蛋白的差別在于對應(yīng)于Ile420、Thr422、Glu423和Leu425中的1個、2個、3個 或全部4個的殘基處的突變。
85.如權(quán)利要求84所述的方法或六鄰體蛋白，其中所述修飾過的六鄰體蛋白在對應(yīng)于 Ile420的位置處含有Gly，在對應(yīng)于Thr422的位置處含有Asn，在對應(yīng)于Glu423的位置 處含有Ser或Ala，和/或在對應(yīng)于Leu425的位置處含有Tyr。
86.如權(quán)利要求78至85中任一權(quán)利要求所述的方法或六鄰體蛋白，其中所述母體六鄰體蛋白與所述修飾過的六鄰體蛋白的差別在于對應(yīng)于Ad5的Glu450[在以下提供的登錄 號為AAW65514.1 ； GI: 58177707的序列中顯示為Glu451]的位置處的突變，并且其中所 述修飾過的六鄰體蛋白在該位置攜帶中性或帶正電荷的殘基，例如Gin、lie、Leu、VaL Arg 或 Lys。
87.如權(quán)利要求78至86中任一權(quán)利要求所述的方法或六鄰體蛋白，其中所述母體六 鄰體蛋白為野生型六鄰體蛋白，并且所述修飾過的六鄰體蛋白為嵌合六鄰體蛋白，所述 嵌合六鄰體蛋白具有來自所述母體六鄰體蛋白的支架序列以及來自至少一種不同的野生 型六鄰體蛋白的HVR3、HVR5和HVR7中的至少一個。
88.如權(quán)利要求87所述的方法或六鄰體蛋白，其中HVR3、HVR5和HVR7中的一個 或多個與所述支架源自不同的血清型。
89.如權(quán)利要求88所述的方法或六鄰體蛋白，其中所述母體六鄰體蛋白是血清型Ad2 或Ad5的，并且所述修飾過的六鄰體蛋白的HVR3、HVR5和HVR7中的一個或多個源自 血清型 Adl7、Ad20、Ad25、Ad26、Ad28、Ad29、Ad44 或 Ad48 中的一種或多種。
90.如權(quán)利要求89所述的方法或六鄰體蛋白，其中所述第一六鄰體蛋白是血清型Ad5 的，并且HVR5和HVR7之一或兩者源自Ad26。
91.如權(quán)利要求78或者80至90中任一權(quán)利要求所述的方法，其包括提供編碼所述母 體六鄰體蛋白的第一核酸序列，并且修飾所述第一核酸以產(chǎn)生編碼所述修飾過的六鄰體 蛋白的第二核酸序列。
92.核酸，其編碼如權(quán)利要求79至90中任一權(quán)利要求所述的修飾過的六鄰體蛋白。
93.包含如權(quán)利要求92所述的核酸的表達載體。
94.包含如權(quán)利要求92所述的核酸或如權(quán)利要求93所述的表達載體的宿主細胞。
95.包含如權(quán)利要求79至90中任一權(quán)利要求所述的修飾過的六鄰體蛋白的腺病毒。
96.通過如權(quán)利要求78或者80至91的任一中所述的方法產(chǎn)生的修飾過的腺病毒。
97.如權(quán)利要求95或96所述的腺病毒，其是基因遞送載體。
98.如權(quán)利要求97所述的腺病毒，其用于醫(yī)學(xué)治療方法。
99.如權(quán)利要求97所述的腺病毒，其用于基因遞送方法。
100.如權(quán)利要求97所述的腺病毒在制備用于基因遞送或基因治療的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于調(diào)節(jié)腺病毒對肝細胞和諸如脾細胞的其它細胞類型的向性的材料和方法。本發(fā)明涉及以下發(fā)現(xiàn)病毒六鄰體蛋白的高變區(qū)(HVRs)與凝血因子FX的Gla結(jié)構(gòu)域相互作用作為體內(nèi)感染過程的部分。本發(fā)明提供了破壞六鄰體與FX相互作用，從而減少肝細胞與脾細胞的感染的手段，以及包含Gla結(jié)構(gòu)域或其片段從而將腺病毒載體定向于所需的靶細胞或靶組織類型的靶向劑的用途。
文檔編號A61K38/16GK102014948SQ200980112169
公開日2011年4月13日 申請日期2009年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月7日
發(fā)明者安德魯·貝克, 約翰·麥克維, 西蒙·沃丁頓 申請人:安德魯·貝克, 約翰·麥克維, 西蒙·沃丁頓