專利名稱：使用聚亞烷基二醇和過渡金屬分離生物大分子的方法
使用聚亞烷基二醇和過渡金屬分離生物大分子的方法
背景技術：
本發(fā)明涉及分離組合物中的生物大分子的方法。具體地，本發(fā)明涉及分離含有雜 質的組合物中的生物大分子的方法，所述方法包括添加聚亞烷基二醇至所述組合物中；添 加過渡金屬至所述組合物中；以及將所述生物大分子與雜質分離。生物大分子(Biological macromolecule)(艮口，生物大分子 (biomacromolecule))如重組蛋白或抗體在多種技術中很重要。傳統(tǒng)上，生物大分子使用如 下幾種不同的方法來純化例如，過濾、離心、尺寸排阻色譜、親和色譜、離子交換色譜、固定 金屬親和色譜或上述的組合，僅列出一些。純化方法一般是基于將生物大分子與在組合物 中與生物大分子共存的一種或多種雜質區(qū)別的生物大分子特征如大小、電荷或對配體的親 和力來選擇的。大量生物大分子是商業(yè)上重要的，并且以及時且經(jīng)濟有效的方法純化大量 生物大分子的能力是令人期望的。商業(yè)上重要的生物大分子包括例如，蛋白質和核酸，如DNA和RNA。通常在工業(yè) 規(guī)模上分離的生物大分子的兩個實例是單克隆抗體和融合蛋白。這些抗體和融合蛋白在多 種診斷和治療領域是有價值的并且已被用于治療多種疾病，如遺傳性和獲得性免疫缺陷疾 病和傳染性疾病。從工業(yè)規(guī)模的含有哺乳動物細胞或細菌細胞的生物反應器中收獲生物大分子一 般使用過濾或離心進行。然而，最近對于在細胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生增加量的蛋白產(chǎn)物的傾向需 要生物反應器在較高的細胞密度下操作，這增加了雜質的量，諸如DNA、宿主細胞蛋白和其 他培養(yǎng)基組分。污染物水平的提高產(chǎn)生了對細胞收獲操作(例如，過濾和離心步驟)以及 下游純化步驟(例如，色譜和透析步驟)二者更強的要求。這些較高濃度的雜質的存在可 能增加需要進行的純化步驟的數(shù)目，從而會增加成本并降低總體產(chǎn)物生產(chǎn)量。增加的蛋白 產(chǎn)物甚至能夠使一些色譜方法的容量飽和。生產(chǎn)純化的抗體的傳統(tǒng)方法可以包括離心、離子交換色譜(例如，DEAE或羥基 磷灰石)、免疫親和純化(例如，蛋白A或蛋白G)以及透析。參見例如，Antibodies A Laboratory Manual (抗體實驗室手冊)，Harlow 禾口 Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)。使用上述方法的組合是常見的，例如使用乙醇分級分離從血漿純化抗 體，然后進行離子交換色譜和/或辛酸(CA)沉淀。參見，例如McKirmey等人，J. Immunol. Methods96 :271-278 (1987)；美國專利第 4，164，495 號；4，177，188 號；RE 31，268 號； 4，939，176號；5, 164，487號和WO 2008/100578。此外，已經(jīng)利用發(fā)酵的酸化作用來改善抗 體和重組蛋白的回收率和穩(wěn)定性。參見，例如Lydersen等人，Annals New York Academy of Sciences 745:222-31(1994)。已經(jīng)開發(fā)了多種其他的方法用于分離和/或純化抗體。參見，例如美國專利第 7，038，017 號；7，064，191 號；6，846，410 號；5，429，746 號；5，151，504 號；5，110，913 號； 4，933，435號；4，841，024號；和4，801，687號。然而，這些方法中許多能夠導致大的原料體 積和回收率損失，在工業(yè)規(guī)模上具有高生產(chǎn)成本和/或具有低生產(chǎn)量。通過引入沉淀劑誘導生物大分子沉淀可能是回收生物大分子的快速且有效的方法。傳統(tǒng)的沉淀技術包括硫酸銨沉淀和辛酸沉淀。沉淀的一個傳統(tǒng)缺點是需要在沉淀完成 之后移除沉淀劑。由于這個缺點，通常將沉淀用作上游純化方法。沉淀的另一缺點是需要 高濃度的沉淀劑來達到期望的結果，從而產(chǎn)生了大量的廢棄產(chǎn)物。先前已使用聚乙二醇(PEG)來沉淀多種生物大分子。參見，例如hgham， K.，“ Precipitations of Proteins with Polyethylene Glycol (用聚乙二醇沉淀蛋 白)，〃 301-306(1990)和WO 2008/100578。發(fā)現(xiàn)PEG在多種環(huán)境中都不變性。然而，一 般使用高濃度的PEG來達到期望的結果，例如，總體積的20%。高濃度的PEG導致了體積的 顯著增加，產(chǎn)生了大量廢棄物并且增加了組合物的粘度。此外，所需的高濃度的PEG增加了 與純化相關的成本。先前也嘗試了金屬親和沉淀。參見，例如Van Dam, Μ.等人，“MetalAffinity Precipitation of Proteins (蛋白質的金屬親禾口沉淀)，‘‘Biotechno. Appl. Biochem, 492-502(1989)禾口 Zaworski， P. G.，等人，“Precipitation of Proteinsfrom Culture Supernatants Using Zinc (使用鋅從培養(yǎng)物上清液中沉淀蛋白質)，“Analytical Biochem 440-444(1988)。然而，也需要高濃度的鋅來達到期望的沉淀(高達80mM)。因此， 在這些高濃度下使用金屬親合法產(chǎn)生了大量的廢棄物并且顯著增加了成本。由于上述困難和缺陷，需要改進分離生物大分子的策略。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及在含有雜質的組合物中分離生物大分子的方法，所述方法包括(a) 添加聚亞烷基二醇至所述組合物中；(b)添加過渡金屬至所述組合物中；以及(c)將所述生 物大分子與雜質分離。聚亞烷基二醇和過渡金屬的組合容許將生物大分子與雜質協(xié)同分離 并且大大改善產(chǎn)率?？梢允褂枚喾N聚亞烷基二醇。在一些實施方式中，聚亞烷基二醇選自由下列組成 的組聚戊二醇、聚丁二醇、聚丙二醇或聚乙二醇。在一些實施方式中，聚亞烷基二醇是聚乙 二醇?？梢允褂枚喾N分子量的聚亞烷基二醇。在一些實施方式中，聚乙二醇具有1，OOODa 至20，OOODa之間的分子量。在一些實施方式中，聚乙二醇具有2，OOODa至15，OOODa之間 的分子量。在本發(fā)明的方法中可以使用多種濃度的聚亞烷基二醇。在一些實施方式中，組合 物中的聚亞烷基二醇的濃度為約0. 5%至約30% (w/v)。在一些實施方式中，組合物中的聚 亞烷基二醇為約2. 0%至約10% (w/v)。在本發(fā)明的一些實施方式中，聚亞烷基二醇在組合 物中為約1% -2% (w/v) ο本發(fā)明的方法中可以使用過渡金屬來增加生物大分子與雜質的分離。在一些實施 方式中，過渡金屬選自由下列組成的組鋅、鎳、酮、鈷或錳。在一些實施方式中，過渡金屬是 鋅。可以使用多種濃度的過渡金屬。在一些實施方式中，組合物中的過渡金屬的濃度為約 ImM至約50mM。在一些實施方式中，組合物中的過渡金屬的濃度為約2. 5mM至約15mM。在 一些實施方式中，組合物中的過渡金屬的濃度為約0. 5mM至約15mM。在一些實施方式中，組 合物中的過渡金屬的濃度為約1. 5mM至3. 5mM。可以使用多種方法來將生物大分子與雜質分離。在一些實施方式中，分離是通過 過濾組合物來進行，所述過濾形成了滲透流和固體流。在一些實施方式中，過濾由死端濾器進行。在一些實施方式中，生物大分子基本上在固體流中。在一些實施方式中，分離是通過 過濾組合物來進行，生物大分子保留在固體中，并且其中所述過濾產(chǎn)生了跨膜壓力；并且其 中所述跨膜壓力在過濾期間保持基本上恒定。在一些實施方式中，分離是通過使組合物經(jīng) 受離心來進行，所述離心形成了上清液和沉淀。在一些實施方式中，生物大分子基本上在沉 淀中?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明分離多種生物大分子。在一些實施方式中，生物大分子是蛋白。在 一些實施方式中，蛋白是可溶性蛋白。在一些實施方式中，蛋白是抗體。在一些實施方式中，本發(fā)明是從含有雜質的組合物中分離生物大分子的方法。在 一些實施方式中，組合物包含真核細胞材料。在一些實施方式中，雜質選自由下列組成的 組生長培養(yǎng)基組分、蛋白質、脂類、核酸、核糖核酸以及它們的組合。在一些實施方式中，本發(fā)明的方法與僅采用聚亞烷基二醇或過渡金屬的方法相比 增加了生物大分子從組合物中的回收。在一些實施方式中，聚亞烷基二醇和過渡金屬的添 加將生物大分子的回收率增加了高于3%。在一些實施方式中，聚亞烷基二醇和過渡金屬的 回收將生物大分子的回收率增加了高于10%。在一些實施方式中，與使用單獨的聚亞烷基 二醇或過渡金屬相比，當使用聚亞烷基二醇和過渡金屬二者時，生物大分子的回收是協(xié)同 的。在本發(fā)明的一些實施方式中，聚亞烷基二醇是分子量在1，OOODa至20，OOODa之間 的聚乙二醇；過渡金屬是鋅；分離是通過在溶液中沉淀生物大分子，并然后離心組合物以 分離沉淀物來進行；并且所述生物大分子是抗體。在本發(fā)明的一些實施方式中，聚亞烷基二醇是分子量在1，OOODa至20，OOODa之間 的聚乙二醇；過渡金屬是鋅；分離是通過在溶液中沉淀生物大分子，并然后過濾組合物以 分離所述生物大分子來進行；并且所述生物大分子是抗體。


圖1描繪了 pH對Ab C沉淀的影響。將Ab C的樣品滴定至pH 7、pH 8和pH 9， 并保持1小時(Ab C的等電點為約8. 5)。然后將樣品過濾以捕獲沉淀(如果存在)并檢測 在A28tl的吸光度。將滴定的樣品的吸光度測量與起始材料(“CCM”)相比較。滴定至pH7、 pH8和pH9的樣品的回收的吸光度分別為101.7%、99. 1%、100. 3%。這表明僅pH不足以 在收獲的產(chǎn)物濃度下引起沉淀。圖2描繪PEG 3350濃度(w/v)對沉淀和AbC回收率的影響。將收獲的Ab C樣品 調節(jié)至 pH 9.0 并且用 0% PEG 3350,4% PEG 3350,7% PEG3350U0% PEG 3350,13% PEG 3350和20% PEG 3350處理。將樣品在2_8°C下保持30-60分鐘并以14，OOOrpm離心3分 鐘。潷去上清液并在重懸緩沖液中重懸沉淀。通過尺寸排阻色譜使用收獲的Ab C樣品作 為對照來計算回收率。至少需要10% PEG 3350來沉淀Ab C并且達到> 95%的回收率。圖3A描繪pH和在不同PEG濃度下的PEG分子量的影響。將Ab C樣品滴定至pH 7、8和9并用5%、10%或15%的分子量為400、1000、3350和8000Da的PEG處理。數(shù)據(jù)顯 示PEG 1000-PEG 8000均在彡5%的量下產(chǎn)生高回收率。將樣品在2_8°C下保持30-60分 鐘并在14，OOOrpm下離心3分鐘。潷去上清液并在重懸緩沖液中重懸沉淀。通過尺寸排阻 色譜使用收獲的Ab C樣品作為對照來計算回收率。
圖;3B描述PEG分子量對Ab C回收率的影響。將Ab C樣品滴定至pH 8并在2_8°C 或環(huán)境溫度下用10% PEG 3350或PEG 8000處理。將樣品在2_8°C或環(huán)境溫度下保持30-60 分鐘并以14，OOOrpm離心3分鐘。潷去上清液并在重懸緩沖液中重懸沉淀。通過尺寸排阻 色譜使用收獲的Ab C樣品作為對照來計算回收率。PEG 3350和PEG 8000均產(chǎn)生高產(chǎn)率。圖4A描繪在PEG沉淀之前抗體Ab C制劑的純度，并且圖4B代表在pH 8. 0下用 10% PEG 8000沉淀之后抗體Ab C制劑的純度。圖5A描繪在PEG沉淀之前抗體Ab D制劑的純度，并且圖5B代表在pH 8. 0下用 10% PEG 8000沉淀之后抗體Ab D制劑的純度。圖6A描繪在PEG沉淀之前抗體Ab E制劑的純度，并且圖6B代表在pH 8. 0下用 10% PEG 8000沉淀之后抗體Ab E制劑的純度。圖7A描繪在PEG沉淀之前抗體Ab F制劑的純度，并且圖7B代表在pH 8. 0下用 10% PEG 8000沉淀之后抗體Ab F制劑的純度。圖8A描繪OmM ZnCl2和IOmM ZnClJiAb C的沉淀的影響。還呈現(xiàn)了在不同SiCl2 濃度下添加5% PEG的影響。圖8B描繪在PEG沉淀之前和在pH7. 2下用5 % PEG 3350和5mMZnCl2沉淀之后抗 體Ab C制劑的純度。圖9描繪在pH 7. 0下多種PEG和ZnCl2濃度對組合物中抗體的沉淀的影響。圖10描繪在pH 8. 0下多種PEG和^iCl2濃度對組合物中抗體的沉淀的影響。圖11描繪在pH 9. 0下多種PEG和^iCl2濃度對組合物中抗體的沉淀的影響。圖12描繪在咪唑存在下用PEG 3350和ZnCl2沉淀之后Ab F的尺寸排阻分析。隨 后通過離子交換步驟和疏水相互作用色譜步驟純化Ab F的重溶解部分。圖13描繪不同濃度的主體加料的Ab F沉淀的死端(Nutsche)過濾。差壓(psi) 與通過量(L/m2)顯示在(A)中，并且濾液體積(ml)與時間(分鐘)顯示在(B)中。圖14描繪了在體積倍數(shù)(diavolume，DV)遞增的洗滌溶液下洗滌的Ab F沉淀餅 的尺寸排阻分析。用箭頭突出了低分子量雜質(LMW)。圖15描繪了在存在和不存在咪唑的條件下通過用PEG和ZnCl2沉淀進行的低分 子量移除。10倍濃縮的Ab F HCCF顯示在(A)中。在不存在咪唑的條件下用PEG 3350和 SiCl2進行的Ab F沉淀顯示在(B)中(LMW水平為約6%)，并且在存在咪唑的條件下用3350 和ZnCl2進行的Ab F沉淀顯示在(C)中(LMW水平< 1 % )。
具體實施例方式發(fā)現(xiàn)添加聚亞烷基二醇和過渡金屬二者的組合改善了組合物中的生物大分子的 沉淀。這種生物大分子的沉淀導致生物大分子與組合物中存在的雜質分離。本發(fā)明涉及在 含有雜質的組合物中分離生物大分子的方法，所述方法包括(a)添加聚亞烷基二醇至所 述組合物中；(b)添加過渡金屬至所述組合物中；以及(c)將所述分離生物大分子與雜質分
1 O應注意，除非另外從文中清楚得知，否則術語“一個”或“一種”實體是指一種或多 種所述實體；例如，“一種蛋白”應理解為代表一種或多種蛋白。如此，術語“一個”(或“一 種”)、“一種或多種”以及“至少一種”在本文中可以互換使用。
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術語“分離了(isolating)”和“分離(isolation) ”是指將生物大分子與組合物 中存在的至少一種其他不期望的組分或雜質分離。術語“分離了”包括“純化了，，和“凈化 了”。不要求生物大分子的具體的分離水平，然而在一些實施方式中，至少50^^70^^80%, 90%、95%、96%、97%、98%或99% (w/w)的雜質與生物大分子分離。例如，在一些實施方 式中，生物大分子的分離將包括將生物大分子與組合物中最初存在的宿主細胞蛋白(HCP) 的80%分離。術語“凈化了(clarifying)，，和“凈化(clarification)，，是指從組合物中清除大 的粒子。例如，如應用于細胞培養(yǎng)物和生長培養(yǎng)基時，術語“凈化了 ”是指例如從細胞培養(yǎng) 物中清除原核和真核(例如，哺乳動物)細胞、脂類和/或核酸(例如，染色體和質粒DNA)。術語“純化了(purifying)”和“純化(purification) ”是指將本發(fā)明的生物大 分子與組合物中的雜質或其他污染物分離，而與雜質大小無關。因此，術語純化將涵蓋“凈 化”，但它還另外涵蓋在大小上小于在凈化期間清除的那些雜質的雜質，例如，蛋白質、脂 類、核酸和其他形式的細胞碎片、病毒碎片、污染細菌碎片、培養(yǎng)基組分以及類似物。不要 求生物大分子的具體的純化水平，然而在一些實施方式中，至少50 %、70 %、80 %、90 %或 95% (w/w)的雜質從生物大分子中純化。例如，在一些實施方式中，生物大分子的純化包括 將生物大分子與組合物中最初存在的HCP的80%分離。如本文所用的術語“協(xié)同”、“協(xié)同的”或“協(xié)同效應”描述具有大于加性的量值的
效應。在本發(fā)明的一些實施方式中，一齊使用聚亞烷基二醇和過渡金屬提供了生物大分子 的協(xié)同產(chǎn)物回收或協(xié)同沉淀。例如，如果單獨使用3% (w/v)聚亞烷基二醇沉淀5%的生物 大分子并且單獨使用IOmM終濃度的過渡金屬沉淀5%的同一生物大分子，則用3%聚亞烷 基二醇和IOmM過渡金屬一齊沉淀生物大分子的加性效應是沉淀10%的生物大分子。因此， 作為比較，當一齊使用3%聚亞烷基二醇和IOmM過渡金屬時的協(xié)同效應將生物大分子沉淀 至大于10%的任何程度。可以使用多種聚亞烷基二醇。在一些實施方式中，術語聚亞烷基可以是通式I的 化合物
權利要求
1.一種分離含有雜質的組合物中的生物大分子的方法，所述方法包括(a)添加聚亞烷基二醇至所述組合物中；(b)添加過渡金屬至所述組合物中；以及(c)將所述生物大分子與所述雜質分離。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述聚亞烷基二醇選自由下列組成的組聚戊二醇、 聚丁二醇、聚丙二醇或聚乙二醇。
3.如權利要求1所述的方法，其中所述聚亞烷基二醇是聚乙二醇。
4.如權利要求3所述的方法，其中所述聚乙二醇具有1，OOODa至20，OOODa之間的分子量。
5.如權利要求4所述的方法，其中所述聚乙二醇具有2，OOODa至15，OOODa之間的分子量。
6.如權利要求1所述的方法，其中所述添加聚亞烷基二醇產(chǎn)生了具有約0.5%至約 30% (w/v)的聚亞烷基二醇濃度的組合物。
7.如權利要求1所述的方法，其中所述添加聚亞烷基二醇產(chǎn)生了具有約2.0%至約 10% (w/v)的聚亞烷基二醇濃度的組合物。
8.如權利要求1所述的方法，其中所述過渡金屬選自由下列組成的組鋅、鎳、銅、鈷或猛。
9.如權利要求8所述的方法，其中所述過渡金屬是鋅。
10.如權利要求1所述的方法，其中所述添加過渡金屬產(chǎn)生了具有約ImM至約50mM的 過渡金屬濃度的組合物。
11.如權利要求1所述的方法，其中所述添加過渡金屬產(chǎn)生了具有約2.5mM至約15mM 的過渡金屬濃度的組合物。
12.如權利要求1所述的方法，其中(c)的所述分離是通過過濾所述組合物進行的，所 述過濾形成了滲透流和固體流。
13.如權利要求12所述的方法，其中所述過濾是通過死端濾器進行的。
14.如權利要求13所述的方法，其中所述生物大分子基本上在所述固體流中。
15.如權利要求1所述的方法，其中(c)的所述分離是通過使所述組合物經(jīng)受離心來進 行的，所述離心形成了上清液和沉淀。
16.如權利要求15所述的方法，其中所述生物大分子基本上在所述沉淀中。
17.如權利要求1所述的方法，其中所述生物大分子是蛋白質。
18.如權利要求17所述的方法，其中所述蛋白質是可溶性蛋白質。
19.如權利要求17所述的方法，其中所述蛋白質是抗體。
20.如權利要求1所述的方法，其中所述組合物包含真核細胞材料。
21.如權利要求1所述的方法，其中所述雜質選自由下列組成的組蛋白質、脂類、核 酸、核糖核酸、生長培養(yǎng)基以及它們的組合。
22.如權利要求1-21中任一項所述的方法，其中所述聚亞烷基二醇和過渡金屬的添加 將所述生物大分子的回收率增加了大于3%。
23.如權利要求1-21中任一項所述的方法，其中所述聚亞烷基二醇和過渡金屬的回收 將所述生物大分子的回收率增加了大于10%。
24.如權利要求1-14和17-23中任一項所述的方法，其中(c)中的所述分離是通過過 濾所述組合物進行的，其中所述過濾產(chǎn)生了跨膜壓力；并且其中所述跨膜壓力在過濾期間 保持基本上恒定。
25.如權利要求1所述的方法，其中(a)所述聚亞烷基二醇是具有1，OOODa與20，OOODa之間的分子量的聚乙二醇(b)所述過渡金屬是鋅(c)所述分離是通過沉淀溶液中的所述生物大分子，并然后離心所述組合物以分離沉 淀來進行的；并且(d)所述生物大分子是抗體。
26.如權利要求1所述的方法，其中(a)所述聚亞烷基二醇是具有1，OOODa與20，OOODa之間的分子量的聚乙二醇(b)所述過渡金屬是鋅(c)所述分離是通過沉淀溶液中的所述生物大分子，并然后過濾所述組合物以分離沉 淀來進行的；并且(d)所述生物大分子是抗體。
27.如權利要求146中任一項所述的方法，其中所述聚亞烷基二醇和所述過渡金屬的 添加對所述生物大分子的沉淀具有協(xié)同效應。
28.如權利要求1-27中任一項所述的方法，其中形成所述生物大分子的沉淀，并然后 洗滌該沉淀。
29.如權利要求觀所述的方法，其中用水洗滌所述沉淀。
30.如權利要求28所述的方法，其中用包含濃度為約0.5mM至約5mM的ZnCl2的溶液 洗滌所述沉淀。
31.如權利要求觀所述的方法，其中用包含濃度為約0.至約2. 5%.的聚亞烷基二 醇的溶液洗滌所述沉淀。
32.如權利要求1-31中任一項所述的方法，所述方法還包括使用選自由下列組成的組 的化合物以用于分離所述生物大分子a)咪唑；b)甘氨酸；c)色氨酸；d)半胱氨酸；e)組氨酸；f)組胺；以及g)氯化銨。
33.如權利要求32所述的方法，其中所述化合物是咪唑。
34.如權利要求1-33中任一項所述的方法，其中濃度在約0.5%至約5%(w/v)的范圍 內(nèi)的聚亞烷基二醇用于分離所述生物大分子。
35.如權利要求1-33中任一項所述的方法，其中濃度(w/v)選自由下列組成的組的聚 亞烷基二醇用于分離所述生物大分子a)約 0. 5% ；b)約1% ；c)約1. 5% ；d)約2% ；e)約2. 5% ；f)約3% ；g)約3. 5% ；h)約4% ；i)約4.5% ；以及 j)約 5%。
36.如權利要求1-33中任一項所述的方法，其中濃度在約0.5mM至約5mM的范圍內(nèi)的 過渡金屬用于分離所述生物大分子。
37.如權利要求1-33中任一項所述的方法，其中濃度選自由下列組成的組的過渡金屬 用于分離所述生物大分子a)約0. 5mM ；b)約ImM ；c)約1. 5mM ；d)約2mM ；e)約2. 5mM ；f)約3mM ；g)約3. 5mM ；h)約4mM ；i)約4.5mM ；以及 j)約 5mM。
38.如權利要求1所述的方法，其中將所述聚亞烷基二醇添加到所述組合物中以產(chǎn)生 約1.5% (w/v)的聚亞烷基二醇濃度并且其中將所述過渡金屬添加到所述組合物中以產(chǎn)生 約2. 5mM的過渡金屬濃度。
39.如權利要求1-38中任一項所述的方法，其中在添加聚亞烷基二醇或過渡金屬之前 濃縮所述生物大分子。
40.如權利要求1-38中任一項所述的方法，其中在添加聚亞烷基二醇和過渡金屬之前 濃縮所述生物大分子。
41.如權利要求39或40所述的方法，其中所述之前濃縮將分離所述生物大分子所需的 聚亞烷基二醇或過渡金屬的數(shù)量降低約2倍至約40倍。
42.如權利要求39或40所述的方法，其中所述之前濃縮將分離所述生物大分子所需的 聚亞烷基二醇或過渡金屬的數(shù)量降低選自由下列組成的組的倍數(shù)a)約2倍；b)約3倍；c)約4倍；d)約5倍；e)約10倍；f)約15倍；g)約20倍；h)約25倍；i)約30倍；j)約35倍；以及 k)約40倍。
43.如權利要求1至42中任一項所述的方法，其中所述生物大分子保留了與沉淀之前 或沉淀和洗滌之前的所述生物大分子的特異性活性相比約50%至約100%的生物活性。
44.如權利要求1至42中任一項所述的方法，其中所述生物大分子保留了與沉淀之前 或沉淀和洗滌之前的所述生物大分子的特異性活性相比為選自由下列組成的組的值的生物活性a)約50%b)約60%C)約70%d)約80%e)約90%f)約95%g)約 100%
全文摘要
本發(fā)明涉及分離組合物中的生物大分子的方法。具體地，本發(fā)明涉及分離含有雜質的組合物中的生物大分子的方法，所述方法包括添加聚亞烷基二醇至所述組合物中，添加過渡金屬至所述組合物中，以及將所述生物大分子與所述雜質分離。
文檔編號A61K35/12GK102065870SQ200980113706
公開日2011年5月18日 申請日期2009年4月16日 優(yōu)先權日2008年4月16日
發(fā)明者奧蘭多·A·雅克茲, 羅伯特·S·格榮克 申請人:比奧根艾迪克Ma公司