專利名稱：用于光動(dòng)力療法和壞死腫瘤成像的rgd-(細(xì)菌)葉綠素綴合物的制作方法
用于光動(dòng)力療法和壞死腫瘤成像的RGD-(細(xì)菌)葉綠素綴合物技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于腫瘤學(xué)領(lǐng)域并涉及通過(guò)腫瘤靶向光動(dòng)力學(xué)成像檢測(cè)壞死腫瘤區(qū)以及 使用光敏劑(特別是葉綠素和細(xì)菌葉綠素衍生物與含有RGD基序或RGD肽模擬物的肽的綴 合物)通過(guò)腫瘤靶向光動(dòng)力療法治療所述腫瘤。
定義和縮略語(yǔ)
Bchla 細(xì)菌葉綠素a 五環(huán)7,8,17，18-四氫卟啉，具有第5個(gè)碳環(huán)(isocyclic ring)，一個(gè)中心Mg原子，在173位上有一個(gè)植基或櫳牛兒基櫳牛兒基，在132位上有一個(gè) COOCH3基團(tuán)，在132位上有一個(gè)H原子，在2、7、12、18位上有甲基，在3位上有一個(gè)乙?；?在8位上有一個(gè)乙基，本文稱為化合物丄；Bphe 細(xì)菌脫鎂葉綠素a (其中中心Mg被兩個(gè)H 原子置換的Bchl) ；Bpheid 細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯酸a(由無(wú)中心金屬原子的Bphe衍生，C_172 無(wú)甲酸)；Chl 葉綠素；紅螺菌菌綠素(Rhodobacteriochlorin)四環(huán)7，8，17，18-四氫卟 啉，17位上有一個(gè)-CH2CH2COOH基團(tuán)，在13位上有一個(gè)-C00H，在2、7、12、8位上有甲基，在 3和8位上有乙基；Pd-Bpheid =Pd-細(xì)菌脫鎂葉綠甲酯酸a ；EC 內(nèi)皮細(xì)胞；ECM 胞外基質(zhì)； NIR 近紅外；PDT 光動(dòng)力療法；RGD-4C 環(huán)狀九肽CDCRGDCFC_NH2 ；ROS 活性氧類。
整篇說(shuō)明書(shū)中使用細(xì)菌葉綠素衍生物的IUPAC編號(hào)。使用該命名法，天然細(xì)菌葉 綠素在132和172位攜帶兩個(gè)羧酸酯，無(wú)論如何在133和173位上它們是被酯化的。
背景技術(shù)：
癌癥患者中，原發(fā)瘤和轉(zhuǎn)移瘤的壞死和低氧與腫瘤侵襲性和預(yù)后差強(qiáng)相關(guān)。達(dá) 到一定大小的實(shí)體瘤，生長(zhǎng)速度超過(guò)其氧氣供應(yīng)，變得低氧并最終壞死。在位于距營(yíng)養(yǎng)血 管超過(guò)70 μ m的腫瘤區(qū)，間質(zhì)氧壓力降低，而距離超過(guò)150-180 μ m時(shí)，細(xì)胞變得幾乎缺氧 (Vaupel等，2001)。一般認(rèn)為，壞死是由血管瓦解引起的慢性缺血和超過(guò)血管生成速度的快 速腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的結(jié)果(Leek等，1999))。
實(shí)體瘤中的壞死區(qū)經(jīng)歷了形態(tài)改變。開(kāi)始時(shí)，原有結(jié)構(gòu)基本上保持，壞死細(xì)胞保持 其整體形狀，但卻變成高度嗜酸性的。一段時(shí)間后，這種形式被液化性壞死所替代，其中細(xì) 胞結(jié)構(gòu)分解(Leek等，1999)。
壞死和低氧兩者已被充公證實(shí)是預(yù)后差的標(biāo)志。有研究提出，在上尿路移行細(xì)胞 癌、惡性間皮瘤和腎細(xì)胞癌(RCC)中，將壞死作為癌癥結(jié)果的獨(dú)立預(yù)測(cè)物并且作為用于預(yù) 后目的的極有力的工具(Edwards等，2003 ；Sengupta等，2005 ；Lee等，2007)。
在侵襲性乳腺癌中，壞死與高血管密度和血管生成、高水平局灶性巨噬細(xì)胞浸潤(rùn) 和患者生存期縮短有關(guān)(Kato等，1997 ；Lee等，1997 ；Leek等，1999 ；Tomes等，2003)。中心 性壞死，這是侵襲性乳腺癌的普遍特征，與結(jié)局差和腫瘤侵襲有關(guān)。研究表明，巨噬細(xì)胞被 由低氧或垂死腫瘤細(xì)胞釋放的趨化因子吸引至壞死腫瘤(Leek等，1999)。與非粉刺型(非 侵襲性)原位管癌(DCIQ不同，在粉刺型(侵襲性)DCIS的管腔中發(fā)現(xiàn)大量壞死區(qū)(Cutuli 等，2002)。在達(dá)360 μ m直徑的DCIS病灶中心的壞死和低氧，在瘤細(xì)胞的性質(zhì)和行為上有著明顯的生物學(xué)差異。因此認(rèn)為導(dǎo)管中壞死的存在與否可作為DCIS分級(jí)切實(shí)可行的標(biāo)準(zhǔn) (Bussolati 等，2000)。
研究顯示，這種腫瘤類型的大部分的壞死與低氧有關(guān)(Tomes等，200 。低氧和缺 氧使腫瘤細(xì)胞受到氧化應(yīng)激。研究顯示，長(zhǎng)期的低氧條件提高突變率，加快腫瘤進(jìn)程，增加 血管生成和轉(zhuǎn)移潛力并激活促生長(zhǎng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。對(duì)氧化應(yīng)激的適應(yīng)常常使腫瘤細(xì)胞對(duì)某 些治療方式產(chǎn)生抗性(Brown等，2001)。
壞死與低氧之間的關(guān)聯(lián)性得到了非常充分的證實(shí)，然而可能存在不會(huì)達(dá)到壞死的 低氧條件，或者存在不一定反映急性或嚴(yán)重低氧的壞死(Dewhirst 1998)。低氧有若干種標(biāo) 記基因，其中有低氧誘導(dǎo)因子I(HIFl)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1和碳酸酐酶IX。只有檢出所有三 種標(biāo)記才能確定壞死的分類(Tomes等，200 ，這使得通過(guò)基因表達(dá)來(lái)鑒定壞死區(qū)變得頗 為復(fù)雜。
已知壞死和低氧條件在癌癥療法中產(chǎn)生大量問(wèn)題。低氧腫瘤區(qū)對(duì)放射治療具有相 對(duì)抗性，因?yàn)榉派涔?radiation assault)推進(jìn)不良，而且因?yàn)榭勺罱K存在于腫瘤體積 (tumor volume)中的干細(xì)胞對(duì)治療的反應(yīng)不佳，導(dǎo)致了腫瘤再生長(zhǎng)(Brown等，1998 ;Dean 等，200 。因?yàn)榇蠖鄶?shù)化療試劑因與循環(huán)細(xì)胞相互作用而致細(xì)胞死亡，所以因低氧造成的 細(xì)胞停滯(cell arrest)導(dǎo)致對(duì)常規(guī)化學(xué)療法產(chǎn)生抗性，使非增殖細(xì)胞或慢增殖細(xì)胞不受 損害(Tarmock，1978)。此外，低氧條件通常產(chǎn)生改變藥物性質(zhì)的酸性環(huán)境，使藥物的活性降 低(Tannock 等，1989)。
實(shí)體瘤化學(xué)療法的更多問(wèn)題之一包括將治療劑運(yùn)輸?shù)侥[瘤，尤其是運(yùn)輸?shù)降脱鹾?壞死區(qū)(domain)。腫瘤通常含有具有異質(zhì)血流的不規(guī)則滲漏微血管和大的血管間距離。除 不存在適當(dāng)淋巴引流和高間質(zhì)壓力以外，這些特征使得擴(kuò)散成為腫瘤中營(yíng)養(yǎng)物和藥物的血 管外運(yùn)輸?shù)淖钪匾臋C(jī)制。然而，由于無(wú)規(guī)則血管形成，所以比起正常組織中的細(xì)胞，許多 腫瘤細(xì)胞位于距毛細(xì)血管更遠(yuǎn)的距離，這反映在細(xì)胞部位處抗腫瘤藥的濃度不足中。而且， 因缺乏淋巴引流引起的間質(zhì)液壓升高降低了對(duì)流攝取(convection uptake)，并進(jìn)一步抑 制藥物(特別是大分子)分布到腫瘤細(xì)胞內(nèi)(Minchinton等，2006)。
因此，在體內(nèi)檢測(cè)腫瘤內(nèi)低氧和壞死區(qū)的能力極為重要。對(duì)低氧腫瘤區(qū)的了解可 有助于選擇正確的治療法一或者通過(guò)在治療前或治療期間提高腫瘤氧合作用，或通過(guò)利 用低氧的策略(Weinmarm等，2004)。采用該方法，應(yīng)用低氧激活的細(xì)胞毒素例如2-環(huán)丙 基-吲哚并醌(ind0l0quin0neS)、AQ4N、替拉扎明(TPZ)和PR-104可有助于改進(jìn)治療效果 (Brown 等，2004 ；Lee 等，2007 ；Patterson 等，2007)。
組織病理學(xué)和免疫組織化學(xué)常常用來(lái)鑒定壞死和低氧；然而，它們是有創(chuàng)的，而且 不能夠進(jìn)行原位檢測(cè)。原位方法包括核磁共振成像(MRI) (Kamel等，2003 ；Metz等，2003)、 血氧水平依賴性MRI (Kerman等，1997)、正電子發(fā)射斷層攝影術(shù)(PET) (Lehtio等，2004)和 彌散加權(quán)MRI (Lang等，1998)。
用于MRI的壞死親和性造影劑(Necrosis-avid contrast agent,NACA)可分成卟 啉型造影劑和非卟啉型造影劑。最為人所知的卟啉型NACA之一是大部分在壞死區(qū)邊緣表 現(xiàn)特異性壞死蓄積(necrosisaccumulation)的gadophrin-2。有研究認(rèn)為蓄積機(jī)制以血 清白蛋白(SA)運(yùn)輸為基礎(chǔ)，但最新研究對(duì)這種方法提出了質(zhì)疑(Hofmarm等，1999 ；Ni等， 2005)。
大多數(shù)惡性細(xì)胞在血管不存在時(shí)無(wú)法生長(zhǎng)到臨床可檢測(cè)到的腫瘤塊。這就是為什 么達(dá)到一定大小(大約2-3mm3)的腫瘤必須轉(zhuǎn)變成血管生成表型以支持其生長(zhǎng)。向血管生 成表型的轉(zhuǎn)變可以表示血管生成因子和血管生成抑制物的表達(dá)失衡。血管生成因子的過(guò)量 表達(dá)和血管生成抑制物的減量調(diào)節(jié)兩者都是必需的并且足以誘導(dǎo)新血管生長(zhǎng)，這兩個(gè)過(guò)程 通常同時(shí)發(fā)生以啟動(dòng)腫瘤血管生成(Cao，2005)。
腫瘤中代表血管的生化特征可包括血管生成相關(guān)分子，例如某些整聯(lián)蛋白。細(xì)胞 粘附受體的整聯(lián)蛋白家族包括在胞外基質(zhì)中或細(xì)胞表面上識(shí)別糖蛋白配體的截然不同的 對(duì)種α β異二聚體。整聯(lián)蛋白家族的多個(gè)成員，包括α5β 1、α8β 1、α IIbi3 3、ανβ3、 ανβ5、ανβ6禾口 ανβ 8，均識(shí)別其配體內(nèi)的Arg-Gly-Asp (RGD)基序。這些配體包括纖連 蛋白、血纖蛋白原、玻連蛋白、馮維勒布蘭德因子(von Willebrand factor)和許多其它大 的糖蛋白(Takagi，2004)。因此，研究表明含有RGD基序的分子提供用于選擇性攝取及隨后 成像并檢測(cè)原發(fā)瘤病灶、壞死區(qū)和靶向療法的新的機(jī)會(huì)。這個(gè)研究領(lǐng)域受到越來(lái)越多的注 意。有大量有關(guān)使用RGD標(biāo)記的成分用于成像的報(bào)道(Temming等，2005)。文獻(xiàn)中報(bào)導(dǎo)的 主要缺點(diǎn)是在4-5mm下腫瘤部位報(bào)告成分(importing element)的濃度不夠。這就是為什 么RGD靶向成像的使用主要限于PET掃描這種更靈敏的方法。
了解腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移形成、腫瘤-宿主相互作用和血管生成需要腫瘤模型，這可容 易地跟蹤腫瘤細(xì)胞，甚至在其各自水平上。用于直接測(cè)量腫瘤的最有意義的生物參數(shù)的現(xiàn) 有方法僅可通過(guò)有創(chuàng)終點(diǎn)法(invasive end-point procedure)獲得(Lyons，200 。這類 方法大多數(shù)包括組織病理學(xué)檢查或免疫組織化學(xué)，它們是緩慢的、有創(chuàng)的，而且不一定是靈 敏的方法(Yang等，2000)。因此，有必要引入能夠直接顯現(xiàn)腫瘤組織、無(wú)創(chuàng)的并且能夠在細(xì) 胞和分子兩個(gè)水平上測(cè)量腫瘤相關(guān)參數(shù)的新方法。
近年來(lái)，已開(kāi)發(fā)出若干無(wú)創(chuàng)性方法MRI和光譜法、PET、單光子發(fā)射型計(jì)算層析X 射線照相術(shù)(single photon emission computedtomography)和計(jì)算層析X射線照相術(shù) (Lyons,2005)。
有若干基于轉(zhuǎn)基因的成像方法。這些方法使得無(wú)創(chuàng)性測(cè)量具有優(yōu)良腫瘤特異性的 多個(gè)生物參數(shù)、活的模型動(dòng)物中的整體成像和轉(zhuǎn)移檢測(cè)成為可能。這些方法中有兩種是生 物發(fā)光成像和熒光成像。
光學(xué)生物發(fā)光是以下列三種組分為基礎(chǔ)酶螢光素酶、底物螢光素和腺苷三磷酸 (ATP)。在該方法中，不需要光激發(fā)來(lái)產(chǎn)生光發(fā)射。然而，如果這些組分之一不存在，則不能 夠檢測(cè)。該方法由于良好的信噪比值而能夠高通量地監(jiān)測(cè)細(xì)胞存活力或細(xì)胞功能(Lyons， 2005)。螢光素酶/螢光素方法的主要缺點(diǎn)是解剖和圖像分辨率低，因此需要相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間 從麻醉動(dòng)物中采集足夠的光子以形成圖像。再者，組織深度加大和外源遞送底物的需要削 弱了體內(nèi)光發(fā)射(Yang等，2000 ;Ly0ns，2005)。此外，難以進(jìn)行離體實(shí)驗(yàn)，因?yàn)锳TP需要酶 活性。重要的是，該方法包括主觀參數(shù)化法，降低了它的定量?jī)r(jià)值。
通過(guò)光學(xué)熒光成像監(jiān)測(cè)腫瘤進(jìn)展的另一種方法是以用穩(wěn)定的熒光蛋白(例如綠 色熒光蛋白(GFP)和紅色熒光蛋白(RFP))轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞為基礎(chǔ)。在該方法中，在可檢出發(fā) 射光之前需要外部激發(fā)。該方法的主要缺點(diǎn)是(1)隨組織深度加大，激發(fā)光和發(fā)射光易于 減弱，和( 非標(biāo)記細(xì)胞的自身熒光加大噪音(Lyons，200 。主要優(yōu)點(diǎn)包括多個(gè)報(bào)道分子 波長(zhǎng)使得能夠多重成像；與用于分析方法的多種離體方法(例如新鮮組織分析)高度兼容；對(duì)于成像不需要準(zhǔn)備步驟，這使得它特別適于在活組織中進(jìn)行肉眼觀察；該方法是外部的 并且是無(wú)創(chuàng)性的；該方法提供移植動(dòng)物的內(nèi)部生長(zhǎng)腫瘤和轉(zhuǎn)移的實(shí)時(shí)熒光光學(xué)成像，其可 給出整體圖像，而且還可給出從原發(fā)病灶和轉(zhuǎn)移中提取的單細(xì)胞的圖像(Yang等，2000; Lyons, 2005).整體成像是了解腫瘤發(fā)育最必須的工具之一。因此，通過(guò)用GFP或RFP對(duì)腫 瘤細(xì)胞進(jìn)行遺傳標(biāo)記，可獲得原發(fā)瘤和轉(zhuǎn)移瘤的外部整體成像(Yang等，2000)。
熒光標(biāo)記法適于體內(nèi)、新鮮組織和體外檢測(cè)。采用表達(dá)熒光蛋白的腫瘤細(xì)胞能夠 使活的動(dòng)物成像并跟蹤不同時(shí)間點(diǎn)的腫瘤進(jìn)展。RFP的發(fā)射波長(zhǎng)比GFP的長(zhǎng)，因此能夠使 顯微鏡可觀察的腫瘤生長(zhǎng)的靈敏度和分辨率更高(GFP激發(fā)波長(zhǎng)-489nm，發(fā)射波長(zhǎng)-508nm， RFP激發(fā)波長(zhǎng)-558nm，發(fā)射波長(zhǎng)_583歷)。
原位管癌(DCIS)包括出現(xiàn)惡變并在乳腺導(dǎo)管腔內(nèi)蓄積的細(xì)胞的克隆增殖，無(wú)證 據(jù)顯示侵襲至附近乳腺間質(zhì)和超過(guò)上皮基底膜以外。如果早期不接受治療，非侵襲性DCIS 病灶便非常有可能轉(zhuǎn)變成危及生命的侵襲性疾病。在廣泛使用乳房X線攝影術(shù)后，診斷患 有早期DCIS的患者的數(shù)目激增，因此推薦的治療方式從乳房切除術(shù)(接近100%治愈率) 向保乳(BC)手術(shù)(BCS)轉(zhuǎn)變，例如局部病灶切除術(shù)或乳腺微創(chuàng)手術(shù)(Kepple等，2004)，任 選伴RT和內(nèi)分泌輔助療法。然而，最近發(fā)現(xiàn)與乳房切除術(shù)后相比，在BCS后，甚至當(dāng)同時(shí)進(jìn) 行RT時(shí)，同側(cè)(同一乳房)或?qū)?cè)(另一乳房)兩者的復(fù)發(fā)率都較高，特別是年齡< 40的 患者(消退率25-35% ;Bijker N等，2006 ；Cutuli等，2002)。此外，多病灶病變給部分切除 帶來(lái)困難，對(duì)于被發(fā)現(xiàn)對(duì)腫瘤完全消退是決定性的邊緣的持續(xù)受累也是如此(Cellini等， 2005)。此外，生理和心理負(fù)擔(dān)以及局部病灶切除術(shù)和隨后的RT的可能的美容結(jié)果都十分 重要。在乳腺癌療法中，這些缺點(diǎn)使現(xiàn)今DCIS的治療和管理成為有爭(zhēng)議的問(wèn)題，并且激起 對(duì)治療和預(yù)后的新的和/或補(bǔ)充方式進(jìn)行研究。
DCIS是一種惡性腫瘤的生物學(xué)異質(zhì)形式，具有不同的臨床表現(xiàn)、組織學(xué)特征、細(xì) 胞特征和生物潛能。被歸類為粉刺型(侵襲性)癌和非粉刺型(非侵襲性)癌，其中粉刺 型是高級(jí)級(jí)別，具有可能更為侵襲性的亞型，在腺管腔內(nèi)特征性地包含大的壞死區(qū)，細(xì)胞為 明顯的非典型細(xì)胞。預(yù)期大約2/3患有低級(jí)別到中等級(jí)別DCIS的患者罹患多病灶同側(cè)疾 病，不同病灶之間的間隔可達(dá)lcnKCutuli等，2002)。高級(jí)別病灶往往連續(xù)的，間隔小于 5mm(Cutuli 等，2005)。
非侵襲性DCIS自然發(fā)展成為侵襲性乳腺腫瘤可能要花15-20年，累及14_60% 的確診女性(Burstein等，2004)。實(shí)際上，DCIS似乎代表了乳腺癌發(fā)展的某個(gè)階段，其中 界定侵襲性乳腺癌的許多分子事件已經(jīng)存在(Cutuli等，2002 ；Holland等，1990)。準(zhǔn)確 地講，如果不治療，則約30%的低級(jí)別病灶將發(fā)展成侵襲性癌癥(Sanders等，200 。直徑 大于2. 5cm的病灶常常伴發(fā)可能不超過(guò)0. Imm的隱匿性微小侵襲性腫瘤(microinvasive tumor)。腫瘤邊緣的受累情況提供重要的預(yù)后標(biāo)志。接近切緣(小于Imm)或陽(yáng)性邊緣、高 級(jí)別和/或粉刺型壞死區(qū)與較大的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。
像許多其它癌癥一樣，在乳腺癌中，新血管形成(血管生成)在局部腫瘤進(jìn)展和 遠(yuǎn)距離轉(zhuǎn)移發(fā)展中起著主要作用(Boehm-Viswanathan，2000 ;Kieran等，2003)。發(fā)現(xiàn)與周 圍的正常組織相比，DCIS組織中的微血管密度(MVD)顯著較高(Guidi等，1994 ；Guidi等， 1997 ；Guinebretiere等，1994)。具有最高血管密度的纖維囊性病灶與較大的乳腺癌風(fēng)險(xiǎn) 有關(guān)(Guidi 等，1994 ；Guidi 等，1997 ；Guinebretiere 等，1994)。侵襲性 DCIS 病灶的組織病理學(xué)檢查結(jié)果與MVD提高和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)增加有關(guān)(Guidi等，1997 ； khneider等，2005)。臨床病理相關(guān)性也證實(shí)了血管生成在乳腺癌發(fā)展中的重要作用，使 之成為DCIS療法和預(yù)后的頗有吸引力的靶標(biāo)(Folkman, 1997 ；Krippl等，2003 ；Relf等， 1997)。由套疊引起的血管共選擇、生長(zhǎng)(Patan等，1996)、血管擬態(tài)和血管發(fā)生是天然存在 的過(guò)程，可降低腫瘤對(duì)典型血管生成的依賴。特別重要的是幾乎完全依賴于血管發(fā)生的炎 癥性乳腺癌的研究結(jié)果，似乎是因?yàn)榘┘?xì)胞無(wú)能力與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合。
DCIS對(duì)極致密血管床的極度依賴使抗血管生成(抑制新血管形成)和抗血管(現(xiàn) 有血管的閉塞/破壞)療法(Shimizu等，2005 ;Thorpe，2004)成為局部BC療法的誘人選 擇(Schneider等，2005 ；Folkman, 1996)。事實(shí)上，抗血管生成藥物例如貝伐單抗(一種抗 VEGF-A受體抗體)和SUOl 1248 (一種VEGF受體酪氨酸的抑制劑)正處于II期臨床試驗(yàn)中。 有趣的是，發(fā)現(xiàn)他莫昔芬也具有抗血管生成活性。然而，日趨增多的大量證據(jù)說(shuō)明抗血管生 成方法的不足。這些不足包括需要長(zhǎng)期治療、“抗性-抗性理論(resistance to resistance theory)”(Schneider 等，2005 ；Streubel 等，2004)和藥代動(dòng)力學(xué)抗性(pharmacokinetic resistance)的部分失效。根據(jù)這些障礙，抗血管方法目前似乎更有前景，預(yù)期不需要長(zhǎng)期 治療就能根除整個(gè)腫瘤(Folkman，2004)。血管靶向治療的一種有前景的新興手段是通過(guò)光 動(dòng)力療法(VTP)。
同樣地，靶向順磁金屬(具有適度馳豫性(relaxivity))、發(fā)射正電子的化學(xué)實(shí) 體(例如64Cu)，或針對(duì)DCIS的致密血管床的熒光探針，將開(kāi)啟檢測(cè)相關(guān)病灶、邊緣界定和 預(yù)后的新途徑，正如下文中所述。研究表明乳腺癌病灶的熒光檢測(cè)在至多IOmm的深度是 有效的(BrittOn，2006)。用Gd作為造影劑的動(dòng)態(tài)MRI以腫瘤血管系統(tǒng)的滲漏增加為基 礎(chǔ)，目前用于乳腺腫瘤定位(Rankin，2000)。然而，目前使用的MRI受可用造影劑積分時(shí)間 (integration time)短的限制，所述造影劑短暫停留但不被腫瘤組織選擇性攝取。
光動(dòng)力療法(PDT)在選定的治療部位產(chǎn)生突發(fā)的細(xì)胞毒性活性氧類(R0Q。由于 其壽命短，ROS毒性局限于發(fā)光部位。PDT通常由5個(gè)步驟組成1.靜脈內(nèi)(IV)給予光敏 劑；2.使所需濃度的光敏劑到達(dá)靶組織的一段時(shí)間；3.用高強(qiáng)度激光(對(duì)于連續(xù)照射高達(dá) 1W)通過(guò)用于深層組織照射的細(xì)(0. 4mm以下直徑)光導(dǎo)纖維經(jīng)皮或經(jīng)間質(zhì)照射靶組織，由 此局部產(chǎn)生細(xì)胞毒性的ROS ；4.出現(xiàn)腫瘤壞死并根除腫瘤；
5.組織重塑和愈合。
血管靶向PDT (VTP)的目的在于在受治療組織血管內(nèi)產(chǎn)生R0S，這可通過(guò)在給予致 敏物(sensitizer)后隨即通過(guò)組織照射，或通過(guò)使用不會(huì)從循環(huán)中溢出的致敏物來(lái)完成。 我們的實(shí)驗(yàn)室已開(kāi)發(fā)出幾代細(xì)菌葉綠素致敏物(本文稱為“Bchl衍生物”或“BchlD”)。合 成的化合物(Rosenbach-Belkin等，1996 ；US 5，650, 292)，在能夠使光深入穿透受治療者 組織的OTR(750-765nm)中具有非常強(qiáng)的吸收，確保了以高能流率QOmW-IW)在圓柱狀纖 維周圍達(dá)4cm的治療直徑。在照射時(shí)，通過(guò)循環(huán)BchlD在腫瘤中和附近產(chǎn)生局部高濃度的 R0S(0H-和O2-根)，導(dǎo)致在照射數(shù)分鐘內(nèi)血液凝固和腫瘤血管穿孔，隨后腫瘤血管系統(tǒng)完全 停滯。用一些Bchl衍生物，觀察到內(nèi)皮細(xì)胞直接中毒(Gross等，2003 ；Mazor等，2005)。究 其原因還在研究之中，與周圍正常組織的血管相比，腫瘤血管反應(yīng)顯著較快較激烈。治療功 效導(dǎo)致高的治愈率(60-90%動(dòng)物存活)(Mazor等，2005)。重要的是，靜脈內(nèi)注射的致敏物 很快從受治療動(dòng)物的循環(huán)中清除(T1/2約為數(shù)分鐘至數(shù)小時(shí)，(Mazor等，200 )，避免了長(zhǎng)期的皮膚毒性，并在需要時(shí)允許重復(fù)治療。在患者的局限性前列腺癌的II期臨床試驗(yàn)中， 其中放射療法失敗(Weersink等，2005)，基于BchlD的VTP總的來(lái)講導(dǎo)致50-60%受治療患 者中腫瘤病灶成功根除以及組織重塑。在動(dòng)物模型和人的二次治療(Π/ΙΙΙ期臨床試驗(yàn)) 中，每療程似乎產(chǎn)生類似或較高的治愈率(取決于藥物和光劑量)，在2-3療程后，提高預(yù)期 的總體成功率達(dá)約90%。重要的是，在使用較高劑量致敏物的動(dòng)物研究中發(fā)現(xiàn)每個(gè)療程都 有顯著較高的治愈率。
腫瘤的光動(dòng)力療法(PDT)包括給予光敏劑和局部光照射的組合，兩者本身是無(wú)害 組分，但是在分子氧存在下，它們能夠產(chǎn)生可以消除細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性氧類(R0Q。作為 二元治療方式，當(dāng)與常用的化學(xué)療法或放射療法相比時(shí)，PDT允許較高的特異性，并且具有 較高選擇性而又并非毀滅性的潛力(Dougherty等，1998)。
近年來(lái)本發(fā)明的發(fā)明人(Zilberstein等，2001 ；Schreiber 等，2002 ;Gross 等， 1997 ；Zilberstein 等，1997 ；Rosenbach-Belkin 等，1996 ；Gross 等，2003a ；Koudinova 等， 2003 ；Preise等，2003 ；Gross等，2003b)及在以下專利公布號(hào)中報(bào)導(dǎo)了在PDT中應(yīng)用新的 細(xì)菌葉綠素(Bchl)衍生物作為致敏物:US 5，726，169、US 5，650，292、US5, 955，585、US 6，147，195、US 6，740，637、US 6，333，319、US6, 569，846、US 7，045，117、DE 41 21 876、EP 1 24 6826、W02004/045492、W0 2005/120573。Bchl衍生物的光譜、光物理學(xué)和光化學(xué)使之 成為最佳集光分子，具有優(yōu)于現(xiàn)用于PDT的其它致敏物的明顯優(yōu)勢(shì)。這些Bchl衍生物大部 分是極性的，并且在循環(huán)中停留非常短的時(shí)間，幾乎不外滲到其它組織中(Brandis，2003 ； Mazor等，2005)。因此，這些化合物是血管靶向PDT (VTP)良好的候選分子(candidate)，這 有賴于在血管內(nèi)短時(shí)(5-10分鐘)與光短暫相遇，并且有賴于腫瘤血管對(duì)PDT產(chǎn)生的細(xì)胞 毒性ROS的較高敏感性。
由我們的研究小組進(jìn)行的最新研究表明，最初的光敏作用是血管內(nèi)快速發(fā)展成缺 血性閉塞且在照射期間停滯。這個(gè)過(guò)程還促進(jìn)光化學(xué)誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化作用(LPO)和主要 局限于腫瘤血管系統(tǒng)的早期內(nèi)皮細(xì)胞死亡(Koudinova等，2003)。由于自由基鏈反應(yīng)的光 獨(dú)立性發(fā)展連同進(jìn)行性低氧，LPO和細(xì)胞死亡擴(kuò)展到血管區(qū)室以外以覆蓋整個(gè)腫瘤間質(zhì)組 織，直到在PDT后M小時(shí)左右達(dá)到腫瘤完全壞死。因此，PDT的最初作用是阻斷供血并誘 導(dǎo)低氧，其以第二種方式引發(fā)以腫瘤根除告終的一系列分子和病理生理學(xué)事件。重要的是， 該方法取決于正常血管和腫瘤血管對(duì)所產(chǎn)生的ROS的反應(yīng)之間的差異。
相同申請(qǐng)人的國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朩O 2008/023378(通過(guò)引用其整體結(jié)合到本文中， 如同全部公開(kāi)于本文中一樣)，公開(kāi)了卟啉、葉綠素和細(xì)菌葉綠素(Bchl)衍生物與含 有RGD基序的肽或與RGD肽模擬物的新綴合物及其在體內(nèi)光動(dòng)力療法以及診斷腫瘤和 不同血管疾病(例如年齡相關(guān)性黃斑變性)的方法中的用途。具體地講，Bchl衍生物 c (RGDfK) -Pd-MLT (化合物M)在原發(fā)瘤的異種移植物中蓄積高達(dá)4_8 μ Μ,并長(zhǎng)時(shí)間保持在 腫瘤部位，能夠?qū)崿F(xiàn)信號(hào)蓄積和良好的信噪比。
熒光標(biāo)記法適于體內(nèi)、新鮮組織和體外檢測(cè)。c (RGDfK) -Pd-MLT在近紅外(NIR)處 具有能夠檢出的固有熒光。c (RGDfK) -2H-MLT具有高達(dá)3倍的發(fā)光能力，因此可以成為甚至 更好的靶向成像的候選分子。在此項(xiàng)研究中，我們披露了這些分子開(kāi)啟了在人乳腺腺癌模 型中精確檢測(cè)腫瘤邊緣和壞死的可能性。檢測(cè)腫瘤邊緣和壞死是迄今為止在腫瘤治療中存 在的兩個(gè)最具有挑戰(zhàn)性的問(wèn)題。此外，兩者是在治療后腫瘤再生長(zhǎng)的可靠預(yù)測(cè)物。因此，預(yù)期在未來(lái)臨床應(yīng)用時(shí)，前述RGD衍生物適用于在手術(shù)臺(tái)上檢測(cè)腫瘤和壞死。
發(fā)明_既述
根據(jù)本發(fā)明的研究現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，與非壞死腫瘤區(qū)相比，上述W02008/023378中披露 的RGD-(細(xì)菌)葉綠素綴合物在壞死腫瘤區(qū)的歸巢和蓄積長(zhǎng)久得多。
因此，本發(fā)明涉及所述RGD-細(xì)菌葉綠素和RGD-葉綠素綴合物用于微創(chuàng)腫瘤靶向 成像、腫瘤靶向光動(dòng)力療法和/或壞死腫瘤的在線預(yù)后(on-line prognosis)的用途及其 方法。
附圖簡(jiǎn)述


圖1表示用于用紅色熒光蛋白(RFP)轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞系的質(zhì)粒。IA :PDsRed2-Nl質(zhì) 粒(Clontech，Palo Alto, CA)，IB :pDsRed-Monomer-Hyg-Cl(Clontech,Palo Alto,CA)，IC 修飾 pDsRed-Monomer-Hyg-Cl。
圖2A-2B表示在暴露3秒鐘后用熒光顯微鏡(Nikon，放大倍數(shù)X10)檢出的圖1 的轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光克隆。2A:MDA-MB-231RFP克隆1(G418抗性)。2B :MDA_MB_231RFP克隆 3(潮霉素抗性)。
圖3A-;3B表示切離的腫瘤圖像和MDA_MB_231_RFP腫瘤橫截面的組織學(xué)分析(H&E 染色)。3A 大腫瘤(約Icm3)。3B 小腫瘤(約0. 5cm3) (ND-壞死區(qū)，VD-有活力區(qū))。
圖 4A-4B 表示下述化合物 13 在 MDA-MB-231-RFP 常位腫癌(orthotopic tumor) (腫瘤大小約lcm3)中的蓄積。給小鼠注射化合物叢。藥物注射后從15分鐘到M小時(shí)拍 攝圖像。4A(上圖)紅色熒光成像。4B (下圖)熒光成像。
圖5A-5B表示化合物旦在MDA_MB_231_RFP常位腫瘤(腫瘤大小約Icm3)中的蓄 積。給小鼠注射化合物叢。藥物注射后從第1天到第7天拍攝圖像。5A(上圖)紅色熒 光成像。5B (下圖)熒光成像。
圖6A-6B表示化合物Π在MDA-MB-231-RFP常位腫瘤(腫瘤大小約0. 5cm3)中的 蓄積。給小鼠注射化合物叢。藥物注射后從20分鐘到M小時(shí)拍攝圖像。6A(上圖)紅 色熒光成像。6B (下圖)熒光成像。
圖7A-7B表示化合物Π在MDA-MB-231-RFP常位腫瘤(腫瘤大小約0. 5cm3)中的 蓄積。給小鼠注射化合物Π。藥物注射后從第1天到第3天拍攝圖像。7A(上圖)紅色 熒光成像。7B (下圖)熒光成像。
圖8是表示與旁側(cè)(collateral side)相比腫瘤中化合物叢熒光信號(hào)測(cè)量值的 曲線圖。在9只動(dòng)物的腫瘤和旁側(cè)測(cè)量了熒光信號(hào)，單位為光子/秒/cm2。化合物叢注射 后從15分鐘到216小時(shí)采集結(jié)果。提供了每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上全部動(dòng)物的平均結(jié)果以及腫瘤和 旁側(cè)之間的熒光比。
圖9A-9B表示化合物M在MDA-MB-231-RFP常位腫瘤(腫瘤大小約Icm3)中的蓄 積。給小鼠注射化合物絲。藥物注射后從1小時(shí)到M小時(shí)拍攝圖像。9A(上圖)紅色熒 光成像。9B (下圖)熒光成像。
圖10A-10B表示化合物M在MDA-MB-231-RFP常位腫瘤(腫瘤大小約Icm3)中的 蓄積。給小鼠注射化合物絲，藥物注射后從第1天到第7天拍攝圖像。10A(上圖)紅色 熒光成像。10B (下圖)熒光成像。
圖1IA-IIB表示化合物M在MDA-MB-231-RFP常位腫瘤(腫瘤大小約0. 5cm3)中的蓄積。給小鼠注射化合物絲，藥物注射后從20分鐘到對(duì)小時(shí)拍攝圖像。IlA(上圖) 紅色熒光成像。IlB(下圖)熒光成像。
圖12A-12B表示化合物M在MDA-MB-231-RFP常位腫瘤(腫瘤大小約0. 5cm3)中 的蓄積。給小鼠注射化合物M，藥物注射后從第1天到第2天拍攝圖像。12A(上圖)紅 色熒光成像。12B (下圖)熒光成像。
圖13A-i;3B表示化合物叢在MLS_mBanana常位腫瘤(腫瘤大小約Icm3)中的蓄 積。給小鼠注射化合物叢。藥物注射后從1小時(shí)至M小時(shí)拍攝圖像。13A(上圖)紅色 熒光成像。13B (下圖)熒光成像。
圖14A-15B表示化合物叢在MLS_mBanana常位腫瘤(腫瘤大小約Icm3)中的蓄 積。給小鼠注射化合物叢。藥物注射后從第1天到第4天拍攝圖像。14A(上圖)紅色熒 光成像。14B (下圖)熒光成像。
圖15A-15B表示化合物Π在MLSiBanana常位腫瘤(腫瘤大小約0. 5cm3)中的 蓄積。給小鼠注射化合物O。藥物注射后從10分鐘到M小時(shí)拍攝圖像。15A(上圖)紅 色熒光成像。15B (下圖)熒光成像。
圖16A-16B表示化合物Π在MLS_mBanana常位腫瘤(腫瘤大小約0. 5cm3)中的 蓄積。給小鼠注射化合物叢。藥物注射后從第1天到第4天拍攝圖像。16A(上圖)紅色 熒光成像。16B (下圖)熒光成像。
圖17A-17B表示化合物叢在人卵巢MLS-mBanana原發(fā)壞死腫瘤和無(wú)壞死腫瘤中 蓄積的比較?；衔飬沧⑸浜?天拍攝圖像。拍攝化合物叢的體內(nèi)整體肌R熒光的圖像。 17A 無(wú)壞死腫瘤(約0. 5cm3)。17B 壞死腫瘤(約Icm3)。
圖18A-18B表示化合物迆在MDA-MB-231-RFP常位腫瘤(腫瘤大小約Icm3)中的 蓄積。給小鼠注射化合物迆，藥物注射后從5分鐘到對(duì)小時(shí)拍攝圖像。18A(上圖)紅色 熒光成像。18B (下圖)熒光成像。
圖19A-19B表示化合物型在MDA_MB_231_RFP常位腫瘤(腫瘤大小約Icm3)中的 蓄積。給小鼠注射化合物迆，藥物注射后從第1天到第3天拍攝圖像。19A(上圖)紅色 熒光成像。19B (下圖)熒光成像。
圖20A-20B表示化合物些在MDA_MB_231-RFP常位無(wú)壞死腫瘤(腫瘤大小約 0. 5cm3)中的蓄積。給小鼠注射化合物型，藥物注射后從10分鐘到對(duì)小時(shí)拍攝圖像。20A(上 圖)紅色熒光成像。20B (下圖)熒光成像。
圖21A-21B表示化合物些在MDA_MB_231-RFP常位無(wú)壞死腫瘤(腫瘤大小約 0. 5cm3)中的蓄積。給小鼠注射化合物型，藥物注射后從第1天到第3天拍攝圖像。21A(上 圖)紅色熒光成像。21B (下圖)熒光成像。
圖22A-22D表示當(dāng)在給予游離c (RGDfK)后1小時(shí)給予時(shí)，化合物Π在常位人乳 腺M(fèi)DA-MB-231-RFP原發(fā)瘤(腫瘤大小約0. 5cm3)中蓄積的競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法。在給予化合物叢 后對(duì)小時(shí)拍攝圖像。22A、22B-紅色熒光成像；22C、22D-OTR熒光成像。22A、22C 在給予游 離c (RGDfK)后1小時(shí)給予化合物叢(競(jìng)爭(zhēng))。22B、22D 對(duì)照，只給予化合物Π。
圖23A-23F表示藥物注射后10分鐘測(cè)定的在MDA_MB_231_RFP常位腫瘤的活力區(qū) 對(duì)比壞死區(qū)中化合物叢的蓄積。23A、2!3B和23C(上圖)，分別是整個(gè)動(dòng)物的體內(nèi)整體照 片、紅色熒光圖像和NIR熒光圖像；23D、23E和23F(下圖)，分別是切離腫瘤(將腫瘤切成兩半)(ND-壞死區(qū)，VD-有活力區(qū))的照片、紅色熒光圖像和NIR熒光圖像。
圖24A-24F表示藥物注射后1小時(shí)測(cè)定的在MDA_MB_231_RFP常位腫瘤的活力區(qū) 對(duì)比壞死區(qū)中化合物叢的蓄積。圖24A、24B、24C(上圖)和MDJ4EJ4F(下圖)分別如 上述圖 23A、23B、23C 和 23D、23E、23F 中所述。
圖25A-25F表示藥物注射后4小時(shí)測(cè)定的在MDA_MB_231_RFP常位腫瘤的活力區(qū) 對(duì)比壞死區(qū)中化合物叢的蓄積。圖25A、25B、25C(上圖)和25D、25E、25F(下圖)分別如 上述圖 23A、23B、23C 和 23D、23E、23F 中所述。
圖^A_26F表示藥物注射后M小時(shí)測(cè)定的在MDA_MB_231_RFP常位腫瘤的活力區(qū) 對(duì)比壞死區(qū)中藥物化合物的蓄積。圖(上圖)和(下圖)分 別如上述圖23A、23B、23C和23D、23E、23F中所述。
圖27A-27F表示藥物注射后3天測(cè)定的在MDA_MB_231_RFP常位腫瘤的活力區(qū)對(duì) 比壞死區(qū)中化合物叢的蓄積。圖27A、27B、27C(上圖)和27D、27E、27F(下圖)分別如上 述圖 23A、23B、23C 和 23D、23E、23F 中所述。
圖^A-28F表示藥物注射后5天測(cè)定的在MDA_MB_231_RFP常位腫瘤的活力區(qū)比 對(duì)壞死區(qū)中化合物叢的蓄積。圖(上圖)和(下圖)分別如上 述圖 23A、23B、23C 和 23D、23E、23F 中所述。
圖^A-29F表示藥物注射后7天測(cè)定的在MDA_MB_231_RFP常位腫瘤的活力區(qū)對(duì) 比壞死區(qū)中化合物Π的蓄積。圖(上圖)和 D、 E、 F(下圖))分別如上 述圖 23A、23B、23C 和 23D、23E、23F 中所述。
圖30A-30F表示藥物注射后9天測(cè)定的在MDA_MB_231_RFP常位腫瘤的活力區(qū)對(duì) 比壞死區(qū)中化合物M的蓄積。圖30A、30B、30C(上圖)和30D、30E、30F(下圖)分別如上 述圖 23A、23B、23C 和 23D、23E、23F 中所述。
圖31A-31F表示注射后7天測(cè)定的在中心性壞死的MLS_mBanana腫瘤中化合物叢 的蓄積。圖31A、32B、33C(上圖)和34D、35E、36F(下圖))分別如上述圖23A、2!3B、23C和 23D、23E、23F 中所述。
圖32A-32F表示藥物注射后7天測(cè)定的在MLS-mBanana腫瘤的非中心性壞死中化 合物叢的蓄積。圖30A、30B、30C(上圖)和30D、30E、30F(下圖)分別如上述圖23A、23B、 23C 和 23D、23E、23F 中所述。
圖33A-33D表示切離腫瘤圖像和MDA_MB_231_RFP腫瘤橫截面的組織學(xué)分析(H&E 染色)。33A 腫瘤橫切片表面照片(肉眼可見(jiàn)外觀)。33B:橫切片表面的組織學(xué)圖像(顯 微鏡可見(jiàn)外觀)。33C :3;3B中被圈區(qū)域的中等放大倍數(shù)圖(medium power view)。33D 壞 死和有活力組織間界面區(qū)域的高放大倍數(shù)圖(high power view)。
圖34A-34B表示人MDA_MB_231_RFP對(duì)PDT的局部反應(yīng)的代表性實(shí)例。在具有 MDA-MB-231-RFP異種移植物(約0. 5cm3)的小鼠背部經(jīng)靜脈內(nèi)注射7. 5mg/kg化合物Π，8 小時(shí)后透過(guò)皮膚照射。34Α:從第0天(治療前)和治療后1、4、7、12和90天拍攝的照片。 34Β 體內(nèi)整體紅色熒光成像。
實(shí)施本發(fā)明的方式
本發(fā)明的主要目的是提供將致敏物特別靶向壞死腫瘤的壞死區(qū)的光敏劑綴合物。 腫瘤靶向光動(dòng)力療法(PDT)具有一些優(yōu)于用常規(guī)化學(xué)療法靶向腫瘤的優(yōu)勢(shì)。第一，在常規(guī)被靶向藥物蓄積期間，它常常是有活性的，除非它是前藥，而被靶向光敏劑直到局部照射后 才有活性。第二，常規(guī)被靶向藥物可結(jié)合并同樣作用于歸巢地址存在的不需要的靶標(biāo)，而靶 向光敏劑只在相關(guān)照射部位被激活。
因此，從大的方面來(lái)看，本發(fā)明涉及含RGD的肽或RGD肽模擬物與葉綠素或細(xì)菌葉 綠素光敏劑的綴合物在微創(chuàng)腫瘤靶向成像、腫瘤靶向PDT和/或壞死腫瘤的在線預(yù)后中的 用途。
術(shù)語(yǔ)“含RGD的肽”或“RGD肽”在本文中可互換使用，是指含有Arg-Gly-Asp (RGD) 序列的肽，亦稱為RGD基序。本文使用的術(shù)語(yǔ)“ RGD肽模擬物，，是指模擬肽并具有RGD基序 的化合物，特別是非肽化合物。
已知R⑶肽與細(xì)胞的整聯(lián)蛋白受體相互作用，具有啟動(dòng)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程的潛力 并影響多種疾病。出于這些原因，整聯(lián)蛋白R(shí)GD結(jié)合部位被視為頗有吸引力的藥物靶標(biāo)。
含RGD的肽可為線性肽或環(huán)肽，由4-100個(gè)、優(yōu)選5_50個(gè)、5_30個(gè)、5_20個(gè)或者更 優(yōu)選5-10個(gè)氨基酸殘基組成。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，RGD肽由4、5、6、7、9或25個(gè)、最 優(yōu)選由5個(gè)氨基酸殘基組成。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“氨基酸”包括20種天然存在的氨基酸以及非天然氨基酸。
適用于本發(fā)明的天然氨基酸的實(shí)例包括但不限于Ala、Arg、Asp、Asn、Cys, His、 Gin、Glu、Gly、lie、Leu、Lys> Met、Phe> Pro、Ser> Thr> Trp> Tyr 禾口 Val。
非天然氨基酸的實(shí)例包括但不限于4-氨基丁酸(Abu)、2_氨基己二酸、二氨基丙 (Dap)酸、羥賴氨酸、高絲氨酸、高纈氨酸、高亮氨酸、正亮氨酸(Nle)、正纈氨酸(Nva)、鳥(niǎo)氨 酸(Om)、TIC、萘丙氨酸(Nal) ,Phe的環(huán)-甲基化衍生物、Phe的鹵化衍生物或鄰甲基_Tyr。
本文中的術(shù)語(yǔ)“氨基酸”還包括修飾氨基酸例如發(fā)生在體內(nèi)翻譯后的修飾，例如羥 脯氨酸、磷酸絲氨酸和磷酸蘇氨酸；D-修飾；氨基端基團(tuán)或Lys的游離氨基的?；蛲榛?化、優(yōu)選甲基化；羧端基團(tuán)或者Asp或Glu的游離羧基的酯化或酰胺化；以及Ser或Tyr的 羥基的酯化或醚化。
術(shù)語(yǔ)“氨基酸”包括D-氨基酸和L-氨基酸兩者。因此，用于本發(fā)明綴合物的肽可 以是全D-氨基酸(甘氨酸除外)、全L-氨基酸或L，D-氨基酸。為了防止肽被生物體中的 酶切割，氨基酸的D-修飾和肽鍵的N-烷基化是最有利的。在本發(fā)明中，D-氨基酸用小寫(xiě) 字母表示，如本文使用的SEQ ID NO 1的肽環(huán)RGDfK中的D-苯丙氨酸‘f’殘基。
本發(fā)明還包括環(huán)肽。肽可以通過(guò)多種方法環(huán)化，例如形成二硫化物、硫化物，尤其 在N端和C端或氨基酸側(cè)鏈的羧基和氨基官能團(tuán)之間形成內(nèi)酰胺。環(huán)化可通過(guò)本領(lǐng)域已知 的任何方法獲得，例如通過(guò)酰胺鍵形成，例如通過(guò)在鏈中的各個(gè)位置(-C0-NH或-NH-CO鍵) 上摻入Glu、Asp、Lys、0m、二氨基丁(Dab)酸、二氨基丙(Dap)酸。主鏈-主鏈間的環(huán)化還 可以通過(guò)摻入式 H-N((CH2)n-C00H) -C (R) H-COOH 或 H-N((CH2)n_NH2) -C (R) H-COOH 的修飾氨 基酸來(lái)獲得，其中η = 1-4，且其中R是氨基酸的任何天然或非天然的側(cè)鏈。
環(huán)化還可通過(guò)摻入兩個(gè)Cys殘基經(jīng)形成S-S鍵而獲得。另外的側(cè)鏈_側(cè)鏈間環(huán)化 可通過(guò)形成式-(CH2)n-S-CH2-CO-的相互作用鍵而獲得，其中η = 1或2，這是可行的，例如 通過(guò)加入Cys或高Cys以及其游離SH基團(tuán)與例如溴乙?；疞ys、0m、Dab或Dap反應(yīng)。
在一些實(shí)施方案中，RGD肽可以是 US 6, 576, 239, EP 0927045 和 WO 2008/023378 中所披露的肽，通過(guò)引用其整體結(jié)合到本文中，如同全部公開(kāi)于本文一樣。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，按照本發(fā)明使用的肽是SEQ ID NO 1的環(huán)戊肽RGDfK， 其中‘f’表示D-Phe殘基。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，肽是本文用來(lái)提高RGD基序在結(jié)合整聯(lián)蛋白受體中 的重要性的SEQ ID NO 2的環(huán)戊肽RADfK。本發(fā)明又一個(gè)有用的環(huán)肽是SEQ ID NO 9的九 肽CDCRGDCGC，本文稱為‘RGD-4C’，其含有4個(gè)半胱氨酸殘基，在分子中形成兩個(gè)二硫鍵。
RGD基序的天冬氨酸殘基非常易被化學(xué)降解，導(dǎo)致喪失生物活性，而這種降解可通 過(guò)二硫鍵經(jīng)環(huán)化來(lái)防止。在穩(wěn)定性提高的同時(shí)，與線性肽相比，環(huán)肽在抑制玻連蛋白對(duì)細(xì)胞 的附著方面具有較高能力。合成肽中RGD序列兩側(cè)殘基的數(shù)目和性質(zhì)對(duì)該序列如何被各整 聯(lián)蛋白受體識(shí)別具有重大影響。芳族殘基可能在使整聯(lián)蛋白的結(jié)合部位有利于接觸方面特 別重要。靶向ανβ3的環(huán)狀RGD肽被不依賴于液相胞吞途徑的整聯(lián)蛋白內(nèi)化，所述途徑不 改變細(xì)胞表面功能整聯(lián)蛋白受體的數(shù)目。此外，環(huán)狀RGD肽在溶酶體中于15分鐘后達(dá)到飽 和的過(guò)程中保持或降解，只有少部分可離開(kāi)溶酶體并達(dá)到細(xì)胞胞質(zhì)。
在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，R⑶肽選自以下環(huán)肽⑴四肽環(huán)RGDK (SEQ ID NO 3)、 五肽環(huán)RGDf-n (Me) K (SEQ ID NO :4)，其中f表示D-Phe, f和K之間的肽鍵是甲基化的；以 及五肽環(huán)RGDyK (SEQID NO :5)，其中y表示D-Tyr。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，含R⑶的肽是線性的，可選自六肽GRGDSP (SEQ ID NO :6)、 七肽 GRGDSPK (SEQ ID NO 7)和 25 聚物(GRGDSP) 4K (SEQ ID NO :8)。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施 方案中，線性肽是GRGDSP。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，RGD肽通過(guò)其外圍的官能團(tuán)(例如C00H)與光敏劑 葉綠素或細(xì)菌葉綠素大環(huán)直接連接，與RGD肽的氨基末端基團(tuán)或游離氨基形成酰胺CO-NH2基團(tuán)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，RGD肽通過(guò)間隔臂/橋連基與光敏劑大環(huán)連接，間隔臂/ 橋連基例如但不限于被末端官能團(tuán)例如OH、C00H、SO3H, COSH或NH2取代的C1-C25亞烴基 (hydrocarbylene)、優(yōu)選C1-Cltl亞烷基或亞苯基，因此形成醚、酯、酰胺、硫代酰胺或磺酰胺基團(tuán)。
在一些實(shí)施方案中，光敏劑與RGd肽模擬物綴合。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，RGD肽模擬物是包含被11個(gè)原子的鏈間隔開(kāi)來(lái)的胍 和羧基端基的非肽化合物，至少5個(gè)所述原子為碳原子，且所述鏈包含一個(gè)或多個(gè)0、S或 N原子并且可被以下基團(tuán)任選取代氧代、硫代、鹵素、氨基X1-C6烷基、羥基或羧基，或者所 述鏈的一個(gè)或多個(gè)原子可形成3-6元碳環(huán)或雜環(huán)。該類型的化合物參見(jiàn)相同申請(qǐng)人的WO 93/09795和WO 2008/023378，通過(guò)引用其整體結(jié)合到本文中，如同全部公開(kāi)于本文中一 樣。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，上述RGD肽模擬物在鏈中包含N原子并且被氧代基團(tuán) 取代。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，RGD肽模擬物具有下式
H2N-C ( = NH) NH- (CH2) 5-C0_NH-CH (CH2) - (CH2) 2_C00H 或-NH-RGD-CO-NH- (CH2) 2-哌 嗪子基-(CH2) 2-NH-。
用于本發(fā)明的光敏劑是葉綠素或細(xì)菌葉綠素衍生物，其可以是天然的葉綠素或細(xì) 菌葉綠素或者葉綠素或細(xì)菌葉綠素的合成的非天然衍生物，包括這樣化合物，其中在大環(huán) 中和/或在外圍經(jīng)過(guò)修飾，和/或中心Mg原子可不存在或被適用于診斷目的和/或PDT目的的其它金屬原子置換。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及其中光敏劑為式I、式II或式III的葉綠素或細(xì)菌葉綠素的綴合物及其藥學(xué)上可接受的鹽和旋光異構(gòu)體
R^0(III)
其中
M 表示 2H 或選自以下的原子Mg、Pd、Pt、Co、Ni、Sn、Cu、Zn、Mn、In、Eu、Fe、Au、 Al、Gd、Dy、Er、Yb、Lu、Ga、Y、Rh、Ru、Si、Ge、Cr、Mo、P、Re、Tl 和 Tc 及其同位素和放射性同位素；
X 為 0 或 N-R7;
R1, R，2 和 & 各自獨(dú)立地為 Y-IV -NR9R' 9 或-N+&R，9R，，辦-；
或者式II中的R1和&與它們所連接的碳原子一起形成包含RGD肽或RGD肽模擬 物的環(huán)；
Y 為 0或S;
R2 為 H、OH 或 C00& ；
R3 為 H、OH、C1-C12 烷基或 C1-C12 烷氧基；
R4 為-CH = CR9R' 9、-CH = CR9Hal, -CH = CH-CH2-NR9R' 9、-CH = CH-CH2-N+R9R' 9R”9A\ -CH0, -CH = NR9, -CH = N+R9R' 9A\ -CH2-OR9, -CH2-SR9, -CH2-Hal、-C H2-R9、-CH2-NR9R，9、-CH2-N+R9R，9R，VT、-CH2-CH2R9、-CH2-CH2Hal、-CH2-CH2OR9、-CH2-CH2SR9、-CH2-CH2 -NR9R' 9、-CH2-CH2-N+R9R' 9R”9A\ -COCH3> C(CH3) = CR9R' 9、-C(CH3) = CR9Hal, -C(CH3)= NR9、-CH (CH3) = N+R9R，9A_、-CH (CH3) -Ha 1、-CH (CH3) -OR9、-CH (CH3) -SR9, -CH (CH3) -NR9R，9、-CH (CH3) -N+R9R' 9R，9A-或-C 三 CR9 ；
R’4為甲基或甲?；?；
& 為=0、= S, = N-R9,= N+R9R' 9A\ = CR9R' 9 或=CR9-Hal ；
R7, R8, R9, R' 9 和 R”9 各自獨(dú)立地為
(a) H；
(WC1-C25 烴基；
(c) C1-C25烴基、優(yōu)選C1-C25烷基、烯基或炔基、更優(yōu)選C1-Cltl或C1-C6烷基，其被 一個(gè)或多個(gè)選自以下的官能團(tuán)取代鹵素、硝基、氧代、OR、SR、橋氧基(epoxy)、橋硫基 (印ithio)、-CONRR'、-COR、C00R、_0S03R、_S03R、-SO2R, -NHSO2R, -SO2NRR' -NRR，、= N-OR、 =N-NRR'、-C ( = NR) -NRR，、-NR-NRR'、- (R) N-C ( = NR) -NRR，、0 — NR-、> C = NR、- (CH2) n-NR-C0R，、- (CH2) n-C0-NRR，、-0- (CH2) n_0R、-0- (CH2) n_0_ (CH2) n-R、-PRR，、-OPO3RR'、-PO2HR 和-P03RR’，其中R和R’各自獨(dú)立地為H、烴基或雜環(huán)基，R”為烴基或雜環(huán)基；
(d) C1-C25烴基、優(yōu)選C1-C25烷基、更優(yōu)選C1-Cltl或C1-C6烷基，其被一個(gè)或多個(gè)選自 以下的官能團(tuán)取代帶正電荷的基團(tuán)、帶負(fù)電荷的基團(tuán)、在生理?xiàng)l件下轉(zhuǎn)化成帶正電荷的基 團(tuán)的堿性基團(tuán)和在生理?xiàng)l件下轉(zhuǎn)化成帶負(fù)電荷的基團(tuán)的酸性基團(tuán)；
(e) C1-C25烴基、優(yōu)選C1-C25烷基、更優(yōu)選C1-Cltl或C1-C6烷基，其含有一個(gè)或多個(gè)雜 原子和/或一個(gè)或多個(gè)碳環(huán)或雜環(huán)部分；
(f) C1-C25烴基、優(yōu)選C1-C25烷基、更優(yōu)選C1-Cltl或C1-C6烷基，其含有一個(gè)或多個(gè)雜 原子和/或一個(gè)或多個(gè)碳環(huán)或雜環(huán)部分且被上述(c)和(d)中定義的一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)取 代；
(g) C1-C25烴基、優(yōu)選C1-C25烷基、更優(yōu)選C1-Cltl或C1-C6烷基，其被氨基酸、肽、優(yōu)選 RGD肽、蛋白質(zhì)、單糖、寡糖、多糖的殘基或多齒配體及其與金屬的螯合物取代；或者
(h)氨基酸、肽(優(yōu)選RGD肽或RGD肽模擬物)、蛋白質(zhì)、單糖、寡糖、多糖的殘基或 多齒配體及其與金屬的螯合物；
R7還可為-NRR’，其中R和R’各自為H或C1-C25烴基、優(yōu)選C1-C25烷基、更優(yōu)選C1-Cltl 或C1-C6烷基，其被帶負(fù)電荷的基團(tuán)優(yōu)選SO3-任選取代；
當(dāng)禮、R，2和R6各自獨(dú)立地為Y-R8時(shí)，R8還可為H+或陽(yáng)離子R+10 ；
R+10為金屬、銨基團(tuán)(ammonium group)或有機(jī)陽(yáng)離子；
A—為生理上可接受的陰離子；
m 為 0 或 1;
在7-8位上的虛線表示任選的雙鍵；
且式I、式II或式III的所述葉綠素或細(xì)菌葉綠素衍生物含有至少一個(gè)含RGD的肽殘基。
在一個(gè)實(shí)施方案中，在7-8位上的虛線表示雙鍵，光敏劑是式I、式II或式III的 葉綠素。式I化合物分別為葉綠素a和b，其中M為Mg，在173位上的隊(duì)為植基氧基，在132 位上的&為COOCH3,在132位上的R3為H原子，&為0，在3位上的R4為乙烯基，在7-8位 上的虛線表示雙鍵，或者在7位上的R’ 4為甲基且在8位上的R4為乙基，或者在7位上的 R’ 4為甲?；以?位上的R4為乙基，葉綠素a和b的衍生物可具有不同的金屬原子和/ 或不同的取代基R^mR’ 4和/或&。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，7-8位是氫化的，光敏劑為式I、式II或式III的細(xì)菌葉綠 素。式I化合物為細(xì)菌葉綠素a，其中M為Mg，173位上的R1為植基氧基或櫳牛兒基櫳牛兒 基氧基，在132位上的&為COOCH3,在132位上的R3為H原子，&為0，R4在3位上為乙酰 基且在8位上為乙基，在7-8位上的虛線不存在，且細(xì)菌葉綠素a的衍生物可具有不同的金 屬原子和/或不同的取代基R1^ R2> R3> R4和/或R5O
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“烴基”是指任何直鏈或支鏈、飽和或不飽和、無(wú)環(huán)或環(huán)狀(包 括芳族)烴基原子團(tuán)，其具有1-25個(gè)碳原子、優(yōu)選1-20個(gè)、更優(yōu)選1-6個(gè)、最優(yōu)選2-3個(gè)碳 原子。烴基可為烷基，優(yōu)選1-4個(gè)碳原子，例如甲基、乙基、丙基、丁基；或烯基、炔基、環(huán)烷 基、芳基(例如苯基)或芳烷基(例如芐基)，或者在式I、式II或式III化合物的17位，它 是衍生自天然Chl和Bchl化合物的原子團(tuán)，例如櫳牛兒基櫳牛兒基(2，6_ 二甲基-2，6-辛 二烯基)或植基O，6，10，14-四甲基-十六碳-14-烯-16-基)。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“碳環(huán)部分”是指在環(huán)中只含碳原子的單環(huán)或多環(huán)化合物。碳 環(huán)部分可以是飽和的(即環(huán)烷基)，或不飽和的(即環(huán)烯基)，或芳族的(即芳基)。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“烷氧基”是指基團(tuán)(C1-C25)烷基-0-，其中C1-Cm烷基如上定 義。烷氧基的實(shí)例為甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、丁氧基、異丁氧基、叔丁氧基、戊 氧基、己氧基、-OC15H31、_0C16H33、-0C17H35、-OC18H37等。本文使用的術(shù)語(yǔ)“芳氧基”是指基團(tuán) (C6-C18)芳基-0-，其中C6-C18芳基如上定義，例如苯氧基和萘氧基。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“雜芳基”或“雜環(huán)部分”或“雜芳族基”或“雜環(huán)基”是指衍生自 含有1-3個(gè)選自0、S和N的雜原子的單環(huán)或多環(huán)雜芳族環(huán)的原子團(tuán)。具體實(shí)例為吡咯基、 呋喃基、噻吩基、吡唑基、咪唑基、嚷唑基、噻唑基、吡啶基、喹啉基、嘧啶基、1，3，4-三嗪基、 1，2，3_三嗪基、1，3，5_三嗪基、苯并呋喃基、異苯并呋喃基、吲哚基、咪唑并[1,2-a]吡啶 基、苯并咪唑基、苯并噻唑基和苯并嚷唑基。
任何“碳環(huán)”、“芳基”或“雜芳基”可被以下一個(gè)或多個(gè)原子團(tuán)取代例如鹵素、 C6-C14 芳基、CfC25 烷基、硝基、OR、SR、-COR、-C00R、_S03R、-SO2R, -NHSO2R, -NRR，、- (CH2) n-NR-C0R’和-(CH2)n-CO-NRR'。要理解的是，當(dāng)多環(huán)雜芳族環(huán)被取代時(shí)，取代基可在任何碳 環(huán)和/或雜環(huán)中。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“商素”是指氟、氯、溴或碘。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，綴合物中的光敏劑是式I、式II或式III的葉綠素或 細(xì)菌葉綠素，其含有至少一個(gè)帶負(fù)電荷的基團(tuán)和/或至少一個(gè)在生理PH下轉(zhuǎn)化成帶負(fù)電荷 的基團(tuán)的酸性基團(tuán)。
本文中定義的“帶負(fù)電荷的基團(tuán)”是衍生自酸的陰離子，包括羧酸根(C00_)、硫代 羧酸根(cos_)、磺酸根(so3_)和磷酸根(po32_)，“在生理?xiàng)l件下轉(zhuǎn)化成帶負(fù)電荷的基團(tuán)的酸性基團(tuán)”包括羧酸基(-C00H)、硫代羧酸基(-C0SH)、磺酸基(-SO3H)和磷(-PO3H2)酸基。 具有在生理?xiàng)l件下轉(zhuǎn)化成一個(gè)或多個(gè)帶負(fù)電荷的基團(tuán)的BChl衍生物參見(jiàn)相同申請(qǐng)人的WO 2004/045492，通過(guò)引用其整體結(jié)合到本文中，如同全部公開(kāi)于本文一樣。
在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明綴合物中的光敏劑是式II的葉綠素或細(xì)菌 葉綠素，其中R6為-NR9R' 9，R9為H，R，9為被SO3H或其堿性鹽取代的C1-C10烷基。綴合物 最優(yōu)選包含式II的細(xì)菌葉綠素衍生物，其中&為-NH-(CH2)2-SO3K或-NH-(CH2) 3-S03K。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，綴合物中的光敏劑是式I、式II或式III的葉綠素 或細(xì)菌葉綠素，其含有至少一個(gè)帶正電荷的基團(tuán)和/或至少一個(gè)在生理PH下轉(zhuǎn)化為帶正電 荷的基團(tuán)的堿性基團(tuán)。
本文中定義的“帶正電荷的基團(tuán)”是指衍生自含N基團(tuán)或不含N的錫基團(tuán)的陽(yáng)離 子。由于腫瘤內(nèi)皮的特征在于陰離子部位的數(shù)目增多，因此帶正電荷的基團(tuán)或在生理?xiàng)l件 下轉(zhuǎn)化成帶正電荷的基團(tuán)的堿性基團(tuán)可提高本發(fā)明綴合物的靶向效率。
本文使用的“衍生自含N基團(tuán)的陽(yáng)離子”是指例如但不限于銨-N+ (RR’ R”)、胼錨 -(R)N-N+(R，R，，)、銨氧基(ammoniumoxy)O — N+(RR，)-、亞胺錨(iminium) > C = N+(RR，)、 脒錨(amidinium)-C( = RN)-N+R' R” 或胍錨-(R) N-C ( = NR)-N+R' R” 基團(tuán)，其中 R、R，和 R”各自獨(dú)立地為H、烴基、優(yōu)選如本文中定義WC1-C6烷基、苯基或芐基、或雜環(huán)基，或者在銨 基團(tuán)中，R、R’和R”中的一個(gè)可為0H，或者銨基團(tuán)中R、R’和R”中的兩個(gè)，或者胼輸、銨氧 基、亞胺輸、脒輸或胍輸基團(tuán)中的R和R’，與它們所連接的N原子一起形成3-7元飽和環(huán)， 其任選含有一個(gè)或多個(gè)選自0、S或N的雜原子且任選在另外的N原子上被進(jìn)一步取代，或 者所述陽(yáng)離子衍生自雜芳族環(huán)中含有一個(gè)或多個(gè)N原子的化合物。
在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的綴合物含有式-N+(RR’ R”)的銨基團(tuán)，其中 R、R’和R”各自獨(dú)立地為H或任選取代的如本文中定義的烴基或雜環(huán)基，或者其中之一可 為OH。-N+(RR’ R”)銨基團(tuán)可為仲銨(secondary ammonium)，其中原子團(tuán)R、R’或R”中的 任兩個(gè)為H ；叔銨，其中R、R’或R”中僅一個(gè)為H ；或季銨，其中R、R’或R”中的每一個(gè)為任 選取代的如本文中定義的烴基或雜環(huán)基。當(dāng)R、R’或R”中的一個(gè)為OH時(shí)，該基團(tuán)為羥基銨 基團(tuán)。優(yōu)選銨基團(tuán)為季銨基團(tuán)，其中R、R’和R”各自為C1-C6烷基，例如甲基、乙基、丙基、丁 基、己基。銨基團(tuán)在分子中可為端基，或者它可存在于分子的烷基鏈中。
在胼鏘-(R)N-N+ (R，R”)、脒鏘-C ( = NR) -N+R，R”和胍錨-(R) N-C ( = NR) -N+R，R” 基團(tuán)中，R、R’和R”各自可獨(dú)立地為H或烴基或雜環(huán)基，或者R’和R”與它們所連接的N原 子一起形成如本文定義的3-7元飽和環(huán)。這類基團(tuán)的實(shí)例包括其中R為H，R’和R”各自為 C1-C6烷基(例如甲基、乙基、丙基、丁基、己基)的基團(tuán)。
在銨氧基0 —N+(RR，)-和亞胺輸:> C = N+(RR，)基團(tuán)中，R和R，各自可獨(dú)立地 為H或烴基、優(yōu)選C1-C6烷基、或雜環(huán)基，或者R和R’與它們所連接的N原子一起形成如本 文定義的3-7元飽和環(huán)。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，葉綠素或細(xì)菌葉綠素衍生物含有式-N+(RR’ R”)的 環(huán)狀銨基團(tuán)，其中R、R’和R”中的兩個(gè)與N原子一起形成下文中定義的3-7元飽和環(huán)。
本文中定義的由R、R’和R”中的兩個(gè)與它們所連接的N原子一起形成的“3-7元飽和環(huán)”可以是只含N的環(huán)，例如氮雜環(huán)丙烷、吡咯烷、哌啶、哌嗪或氮雜蕈，或者它可含有選自0和S的其它雜原子，例如嗎啉或硫代嗎啉。哌嗪環(huán)中另外的N原子可被烷基(例如 C1-C6烷基)任選取代，該烷基可被鹵素、OH或氨基取代。衍生自所述飽和環(huán)的輸.基團(tuán)包括丫丙啶,鏘、批咯烷鏘、哌啶鐠、哌嗪錨、嗎啉鏘、硫代嗎啉錨和氮雜蕈錨。
如本文定義的“衍生自含N雜芳族原子團(tuán)的陽(yáng)離子”是指衍生自N-雜芳族化合物 的陽(yáng)離子，其可為任選含有0、S或額外N原子的單環(huán)或多環(huán)化合物。陽(yáng)離子衍生自其中的 環(huán)應(yīng)含有至少一個(gè)N原子并且為芳族，但是其它環(huán)(如有的話)，可以是部分飽和的。N-雜芳族陽(yáng)離子的實(shí)例包括吡唑錨、咪唑錨、嚷唑鏘、噻唑鐠、吡啶錨、啼啶鏘、喹啉輸、異喹 啉鏘、1,2,4-三嗪鏘、1,3,5-三嗪鏘和嘌呤錨。
帶正電荷的基團(tuán)還可以是輸基團(tuán)但不含氮，例如但不限于憐[-P+(RR' R”)]、鐘 [-As+(RR' R”)]、氧鏘[-O+(RR')]、锍[_S+(RR，)]、硒鏘[-Se+(RR')]、碲錨[_Te+(RR，)]、 銻鏘[-Sb+(RR' R”)]或鉍錨[-Bi+(RR' R”)]基團(tuán)，其中R、R，和R”各自獨(dú)立地為H、烴基 或雜環(huán)基，優(yōu)選C1-C6烷基(例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基或己基)，或芳基，優(yōu)選苯基。
式-P+ (RR' R”)憐基團(tuán)的實(shí)例包括其中R、R，和R”各自為甲基、乙基、丙基、丁基或 苯基，或者R為甲基、乙基、丙基、丁基或己基以及R’和R”均為苯基的基團(tuán)。式-As+(RR’R”) 鐘基團(tuán)的實(shí)例包括其中R、R’和R”各自為甲基、乙基、丙基、丁基或苯基的基團(tuán)。式-S+(RR’) 锍基團(tuán)的實(shí)例包括其中R和R’各自為甲基、乙基、丙基、丁基、苯基、芐基、苯乙基、或取代烴 基的基團(tuán)。
本文中定義的“在生理?xiàng)l件下轉(zhuǎn)化為帶正電荷的基團(tuán)的堿性基團(tuán)”從理論上講至 少是在生理?xiàng)l件下可產(chǎn)生如本文定義的帶正電荷的基團(tuán)的任何堿性基團(tuán)。應(yīng)當(dāng)注意的是， 本文使用的生理?xiàng)l件不僅僅是指血清，而且還是指機(jī)體內(nèi)不同的組織和細(xì)胞區(qū)室。
這類含N堿性基團(tuán)的實(shí)例包括而不限于可產(chǎn)生銨基團(tuán)的任何氨基、可產(chǎn)生亞胺輸. 基團(tuán)的任何亞胺基團(tuán)、可產(chǎn)生胼錫.基團(tuán)的任何胼基團(tuán)、可產(chǎn)生銨氧基基團(tuán)的任何氨基氧基 (aminoxy)、可產(chǎn)生脒輸基團(tuán)的任何脒基團(tuán)、可以產(chǎn)生胍輸基團(tuán)的任何胍基團(tuán)，所有基團(tuán)如 本文中定義。其它實(shí)例包括膦基和巰基。
因此，本發(fā)明的綴合物可含有至少一個(gè)在生理?xiàng)l件下轉(zhuǎn)變?yōu)閹д姾傻幕鶊F(tuán)的堿 性基團(tuán)，例如-NRR，、-C( = NR)-NR，R”、-NR-NR，R”、- (R) N-C ( = NR)-NR，R”、0 — NR-或 > C = NR，其中R、R’和R”中的每一個(gè)獨(dú)立地為H、烴基，優(yōu)選C1-C25烷基，更優(yōu)選C1-Cltl或 C1-C6烷基，或雜環(huán)基，或者R、R’和R”中的兩個(gè)與N原子一起形成3-7元飽和環(huán)，其任選含 有0、S或N原子且任選在另外的N原子上被進(jìn)一步取代，或者堿性基團(tuán)為含N雜芳族原子 團(tuán)。
3-7元飽和環(huán)可以是氮雜環(huán)丙烷、吡咯烷、哌啶、嗎啉、硫代嗎啉、氮雜草或哌嗪， 其在額外N原子上被C1-C6烷基任選取代，該烷基被商素、羥基或氨基任選取代，且含N雜芳 族原子團(tuán)可以是吡唑基、咪唑基、碟唑基、噻唑基、吡啶基、喹啉基、異喹啉基、嘧啶基、1，2， 4-三嗪基、1，3，5-三嗪基或嘌呤基。
具有帶正電荷的基團(tuán)或在生理?xiàng)l件下向其轉(zhuǎn)變的基團(tuán)的BChl衍生物參見(jiàn)相同申 請(qǐng)人的WO 2005/120573，通過(guò)引用其整體結(jié)合到本文中，如同全部公開(kāi)于本文一樣。
在一個(gè)實(shí)施方案中，光敏劑為式II的葉綠素或細(xì)菌葉綠素，且&為堿性基團(tuán)-NR9R' 9，其中&為H，R’ 9為被堿性基團(tuán)-NRR’或-NH-(CH2) 2_6_NRR’取代的C1-C6烷基， 其中R和R’各自獨(dú)立地為H、被NH2任選取代的C1-C6烷基或者R和R’與N原子一起形成 5-6元飽和環(huán)，其任選含有0或N原子且在另外的N原子上任選被-(CH2) 2_6-NH2進(jìn)一步取 代。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，光敏劑為式II的細(xì)菌葉綠素，且Ii6S-NH-(CH2)3-NH-(CH2)3 -NH2, -NH- (CH2) 2-1-嗎啉代或-NH- (CH2) 3_ 哌嗪子基-(CH2) 3_NH2。
在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，R1和& 一起形成包含RGD肽或RGD肽模擬物的環(huán)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，光敏劑為式III的葉綠素或細(xì)菌葉綠素，且X為-NR7, R7 為-NRR’，R為H，R’為被SO3-或其堿性鹽取代的C1-C6烷基，光敏劑優(yōu)選為細(xì)菌葉綠素，且 X 為-NR7, R7 為-NH-(CH2)3-SO3K15
在另一個(gè)實(shí)施方案中，R7、R8,9各自為被一個(gè)或多個(gè)-OH基團(tuán)取代的 C1-C6烷基。例如，光敏劑為式II的葉綠素或細(xì)菌葉綠素且&為-NR9R' 9，&為H，R’ 9為 HOCH2-CH(OH) -CH2-。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，光敏劑為式II的葉素或細(xì)菌葉綠素，且&為-NR9R'9，&為 H，R’ 9為被多齒配體或其與金屬的螯合物取代C1-C6烷基。多齒配體的實(shí)例包括而不限于 EDTA(乙二胺四乙酸)、DTPA (二亞乙基三胺五乙酸)或大環(huán)配體D0TA。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施 方案中，多齒配體為DTPA，R6為-NH- (CH2) 3_NH_DTPA，金屬為Gd。
陽(yáng)離子R8+可以是衍生自堿金屬或堿土金屬的一價(jià)或二價(jià)陽(yáng)離子，例如K+、Na+、 Li+、NH4\ Ca2+，更優(yōu)選K+ ；或R8+為衍生自胺或含N基團(tuán)的有機(jī)陽(yáng)離子。
如本文中的定義，R7, R8, R9和R’ 9中定義的C「C25烴基可被一個(gè)或多個(gè)選自以下 的官能團(tuán)任選取代鹵素、硝基、氧代、OR、SR、橋氧基、橋硫基、氮雜環(huán)丙烷、-CONRR'、-C0R、 C00R、-0S03R、-S03R、-S02R、-NHS02R、-SO2NRR' -NRR'、 = N_0R、 = N-NRR'、-C (= NR) -NRR，、-NR-NRR'、- (R) N-C ( = NR) -NRR，、0 — NR-、> C = NR、- (CH2) n_NR_C0R，、- (CH2) n-C0-NRR，、-0- (CH2) n-0R、-0- (CH2) n_0_ (CH2) n-R、-PRR，、-OPO3RR'、-PO2HR, -PO3RR'； 一個(gè)或 多個(gè)帶負(fù)電荷的基團(tuán)，例如 COO-、COS-、-OSO3-、-SO3-、-OPO3R-、-PO2H-、-PO32-和-PO3R-；和 / 或 一個(gè)或多個(gè)帶正電荷的基團(tuán)，例如-P+(RRT)、-As+(RRT)、-0+(RR，)、-S+(RR，),-Se+(RR') ,-Te+(RR‘)、-Sb+(RR，R”)、-Bi+(RR，R”)、0 — N+(RR，)-、> C = N+(RR，)、-N+(RR，R”)、-(R) N-N+(RR，R”)、-(R)N-C( = HN)-N+RR' R”、_C( = NH)_N+(RR，R”)、或 N-雜芳族陽(yáng)離子，例 如吡唑輸、咪唑錫、Hf唑輸、噻唑錫、吡啶輸、喹啉輸、嘧啶輸、1，2，4-三嗪傲、1，3，5-三嗪 輸和嘌呤輸；其中η為1-6的整數(shù)，R、R’和R”各自獨(dú)立地為H、烴基或雜環(huán)基，或者R、R’ 和R”中的兩個(gè)與它們所連接的N原子一起形成3-7元飽和環(huán)，其任選含有一個(gè)或多個(gè)選自 0、S或N的雜原子且任選在另外的N原子上被進(jìn)一步取代。R7、&、I 9和R’9中定義的C1-C25 烴基還可被單糖、寡糖或多糖殘基(例如糖基)、或氨基酸殘基、肽或蛋白質(zhì)、優(yōu)選RGD-肽取 代。另外，和R’9各自可獨(dú)立地為單糖、寡糖或多糖的殘基(例如糖基)，或氨基酸殘 基、肽或蛋白質(zhì)，或多齒配體例如DTPA、D0TA、EDTA等及其與金屬的螯合物。
在基團(tuán)OR和SR中，當(dāng)R為H時(shí)，該基團(tuán)分別表示羥基和巰基，當(dāng)R不是H時(shí)，則代 表醚和硫化物。在基團(tuán)-PRR’中，當(dāng)R和R’為H時(shí)，表示膦基。在基團(tuán)-COR中，當(dāng)R為H 時(shí)，表示醛的甲?；?CH0，而當(dāng)R不是H時(shí)，它便是酮的殘基，例如烷基羰基和芳基羰基。在 基團(tuán)COOR中，當(dāng)R不是H時(shí)，這便是羧酸酯基團(tuán)，例如烷氧基羰基和芳氧基羰基。同樣地，在基團(tuán)-0S03R、-S03R、-S02R、-OPO3RR'、-PO2HR 和-PO3RR'中，當(dāng) R 禾口 R，不是 H 時(shí)，表示酯。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案申，光敏劑是未金屬化的，即M為2H。在其它優(yōu) 選的實(shí)施方案中，光敏劑為如上文中定義的金屬化的，M更優(yōu)選為PcUCu或Mn，最優(yōu)選為Pd 或Cu。
在本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案中，光敏劑為式I、式II或式III、更優(yōu)選式II的 Bchl，M為2H、Cu、Mn或Pd。在其它實(shí)施方案中，光敏劑為式I、式II或式III、更優(yōu)選式II 的 Chl，M 為 2H、Cu 或 Mn。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，綴合物包含式II的光敏劑Bchl，其中M為Pd、Mn、Cu 或2H ;m為0諷為NH-P，其中P為與NH-直接連接或通過(guò)間隔物連接的含RGD的肽或RGD 肽模擬物的殘基；R’ 2為甲氧基；R4在3位上為乙酰基且在8位上為乙基；R’ 4為甲基；R6 為-NH- (CH2)n-S03lfe+，其中 η 為 2 或 3，Me+ 為 Na+ 或 K+。
在本發(fā)明的一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，綴合物包含式II的Bchl，其中M為2Η，R1 為NH-P，其中P為SEQ ID NO 1的含RGD的肽c (RGDfK)的殘基，R，2為甲氧基，R4在3位 上為乙酰基且在8位上為乙基，R’ 4為甲基，I^6S-NH-(CH2)2-SO3K,本文稱為化合物Π或 c(RGDfK)-2H-MLT。
在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，M為PcbRpR’ 2、R4、R’ 4、&如上定義，P為SEQ ID NO 1 的 c (RGDfK)，本文稱為化合物 M 或 c (RGDfK) -Pd-MLT。
在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，M為Mn，&、R’ 2、R4、R，4、&如上定義，P為c (RGDfK)， 本文稱為化合物 或c (RGDfK) -Mn-MLT,或者M(jìn)為Cu，該綴合物在本文中稱為化合物邊或 c(RGDfK)-Cu-MLT。
在又一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，式II中Bchl的M為2H，R’ 2、R4、R’ 4和&如上定 義,R1SNH-P,其中 P 為 SEQ ID NO :2 的 C (RADfK)，本文稱為化合物堅(jiān)或 c (RADfK)-2H-MLT， 或者 P 為 SEOID NO :5 的 c (RGDyK)。
在其它更優(yōu)選的實(shí)施方案中，M為2禮禮、1 ’ 2、R4、R’ 4和&如上定義，P為選自以下 的線性肽SEQ ID NO :6 的GRGDSP或SEQID NO :7 的GRGDSPK或 SEQ ID NO :8 的(GRGDSP) 4， 最優(yōu)選P為GRGDSP，該綴合物在本文中稱為化合物巡或線性GRGDSP-2H-MLT。
在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，在式II的Bchl中，M為Pd，m為0，Ii1SNH-P,其中 P為c (RGDfK)，R’ 2為甲氧基，R4在3位上為乙?；以?位上為乙基，R’ 4為甲基，和& 為-NH- (CH2) 3-S03K,或者 P 為 SEQ ID NO 4 的環(huán)肽 RGDf-n (Me) K,和 R6 為-NH- (CH2) 2_S03K。
另外更優(yōu)選的實(shí)施方案涉及與SEQ ID NO 7的線性肽GRGDSI3K或SEQ ID NO 8的 (GRGDSP)4的綴合物，其中式II的Bchl的中心金屬原子為Pd ；m、R，2、R4、R，4如上定義，R1 為 HH-P，且 & 為-NH- (CH2) 2_S03K。
在甚至還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，綴合物包含式II的Bchl，其中M為Pd;m、R’ 2、 R4> R，4 如上定義，R1 為 NH-CH[(-(CH2)2-C0-NH-P]2，其中 P 為 SEQ ID NO 5 的含 RGD 的肽 c (RGDyK)的殘基，且 & 為-NH- (CH2) 2_S03K，本文稱為化合物巡或 c (RGDyK) 2_2H_MLT。
在本發(fā)明另外兩個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，在式II的Bchl中，M為Pd或2H;m為0 ； R1為朋寸，其中P為C(RGDfK) (SEQ ID NO 1)的殘基，R’ 2為甲氧基；R4在3位上為乙酰基 且在8位上為乙基；R’ 4為甲基，&為-NH-CH2-CH (OH)-CH20H。
在再一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，綴合物包含如上所述的R⑶肽，優(yōu)選與式II的24Bchl 綴合的 c (RGDfK)，其中 M 為 2H ;m、R” R，2、R4、R，4 如上定義，且 & 為 NH- (CH2) 3_NH_ (C H2) 3-NH2、-NH- (CH2) 2-嗎啉代或-NH- (CH2)「哌嗪子基 _ (CH2) 3_NH2。
另外更優(yōu)選的實(shí)施方案涉及包含式II的Bchl的綴合物或其與Gd的螯合物，其中 M為2H ;m為0 ；禮為NH-c (RGDfK)，R’ 2為甲氧基，R4在3位上為乙?；以?位上為乙基， R，4 為甲基；且 & 為-NH- (CH2) 3-NH-C0-DTPAo
本發(fā)明還涉及優(yōu)選的綴合物，其包含式II的光敏劑Bchl，其中M為Pd或2H;m為 0 為NH-P，其中P為與NH-直接連接或通過(guò)間隔物連接的RGD肽模擬物的殘基；R’2為甲 氧基；R4在3位上為乙?；以?位上為乙基；R’4為甲基；且Ii6S-NH-CH2-CH(OH)-CH2-OH 或-NH- (CH2) 2-S03K。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，綴合物包含式III的Bchl，其中M為Pd 為 NH-P，其中P為與NH-直接連接或通過(guò)間隔物連接的含RGD的肽或RGD肽模擬物的殘基；R4 在3位上為乙?；以?位上為乙基；R’ 4為甲基；X為N-R7，且R7為-NH-(CH2) 3-S03lfe+， 其中Me+為Na+或K+。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，綴合物包含式I的Bchl，其中M為Mn ；禮為NH-P，其中P 為與NH-直接連接或通過(guò)間隔物連接的含RGD的肽或RGD肽模擬物的殘基；R2為OH ；R3為 COOCH3, R4在3位上為乙?；以?位上為乙基；R’4為甲基；且&為0。在更優(yōu)選的實(shí)施方 案中，M 為 2H 或 Mn，P 為 SEQ ID NO 1 的含 RGD 的肽 c (RGDfK)或 SEQ ID NO 3 的 c (RGDK)的殘基。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，綴合物包含式II的Chl，其中M選自Mn、Cu或2H ；R1為NH-P， 其中P為與NH-直接連接或通過(guò)間隔物連接的含RGD的肽或RGD肽模擬物的殘基；R4在3 位上為乙烯基且在8位上為乙基；R’ 4為甲基；且&為-NH-(CH2) 2-S03lfe+，其中Me+為Na+ 或K+。
在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，在式II的Chl中，M為2H或Cu或Mn，R4、R’ 4和&如上 定義，光敏劑與SEQ ID NO 1的五環(huán)的含RGD的肽c (RGDfK)綴合。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，隊(duì)和& 一起形成包含-NH-RGD-CO-NH- (CH2) 2_NH_或-NH-RGD -CO-NH-(CH2)2-哌嗪子基-(CH2)2-NH-的環(huán)。在一個(gè)實(shí)施方案中，綴合物包含式II的Bchl， 其中m為0 ；R’2為甲氧基；R4在3位上為乙?；以?位上為乙基；R’4為甲基；且R1和& 兩個(gè)一起形成包含-NH-RGD-CO-NH- (CH2) 2_NH_的環(huán)，且M為Pd或M為2H，或者隊(duì)和& 一 起形成包含-NH-RGD-CO-NH- (CH2) 2_哌嗪子基-(CH2) 2_NH_的環(huán)，且M為Pd。
工業(yè)實(shí)用性
對(duì)于在本發(fā)明中的應(yīng)用，將綴合物配制在包含藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物 中。
在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物用于光動(dòng)力療法(PDT)，更準(zhǔn)確地講是用于腫瘤靶 向PDT。在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物用于診斷目的，用于壞死腫瘤區(qū)的可視化。
可按照本發(fā)明，通過(guò)使中心金屬原子適合特定的技術(shù)，來(lái)應(yīng)用若干診斷技術(shù)。
對(duì)于通過(guò)動(dòng)態(tài)熒光成像進(jìn)行的壞死腫瘤區(qū)診斷，光敏劑中的M為2H或選自Pd和 Zn的金屬。
對(duì)于通過(guò)放射性診斷技術(shù)進(jìn)行的壞死腫瘤區(qū)診斷，光敏劑中的M為選自以下的放 射性同位素^Cu^CCc、67^!、·!!、19^、6^、11、和51Cr。在一個(gè)實(shí)施方案中，放射性診斷技術(shù)是正電子發(fā)射斷層攝影術(shù)(PET)，且M為64Cu或67Cu。在另一個(gè)實(shí)施方案中，放射 性診斷技術(shù)是單光子發(fā)射斷層攝影術(shù)(SPET)，且M為選自以下的放射性同位素99mTc、67Ga、 195Pt,111In^51Cr 和 60Coo
對(duì)于通過(guò)分子核磁共振成像(MRI)進(jìn)行的壞死腫瘤區(qū)診斷，M為選自以下的順磁 金屬M(fèi)n3+、CU2+Je3+、EU3+、Gd3+和Dy3+，或者光敏劑被多齒配體的金屬螯合物取代，所述金屬 如前文中定義。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于通過(guò)動(dòng)態(tài)熒光成像使壞死腫瘤區(qū)成像的方 法，所述方法包括
(a)給予疑似患有帶有壞死區(qū)的腫瘤的受治療者本發(fā)明的綴合物，其中M為2H或 選自Pd和Si的金屬；
(b)在給予綴合物后至少24-48小時(shí)期間以1_8小時(shí)的時(shí)間間隔照射受治療者并 測(cè)定可疑區(qū)域的熒光，其中在M-48小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間后具有熒光的區(qū)域表示存在壞死腫瘤 區(qū)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于上述方法的綴合物是化合物叢或化合物M，腫瘤 是乳腺腫瘤或卵巢腫瘤，在藥物(綴合物)注射后3-8天，優(yōu)選5-8天可觀察到壞死區(qū)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于通過(guò)放射性診斷技術(shù)診斷壞死腫瘤區(qū)的方 法，所述方法包括
(a)給予疑似患有腫瘤的受治療者本發(fā)明的綴合物，其中M為選自以下的放射性 同位素64CU、67CU、99mTC、67Ga、2(llTl、195Pt、6°C0、mh 或 51Cr。
(b)在給予綴合物后至少M(fèi)-48小時(shí)期間以1-8小時(shí)的時(shí)間間隔用成像掃描儀對(duì) 受治療者進(jìn)行掃描，測(cè)定可疑區(qū)域的放射水平，其中在M-48小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間具有放射性 的區(qū)域表示存在壞死腫瘤區(qū)。
本發(fā)明還提供用于診斷壞死腫瘤區(qū)的分子核磁共振成像(MRI)方法，所述方法包 括以下步驟
(a)給予疑似患有腫瘤的受治療者如本文定義的綴合物，其中M為選自以下的順 磁金屬:Mn3\ Cu2+、Fe3+、Eu3+、Gd3+ 或 Dy3+ ；和
(b)通過(guò)在所述給藥之前(零時(shí))在患者體內(nèi)產(chǎn)生目標(biāo)靶區(qū)的至少一幅MR圖像以 及在所述給藥之后至少M(fèi)-48小時(shí)、優(yōu)選96小時(shí)在第二個(gè)或更多個(gè)時(shí)間點(diǎn)上產(chǎn)生一幅或多 幅MR圖像，而對(duì)患者進(jìn)行核磁共振成像；和
(c)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行加工和分析以診斷所述壞死腫瘤區(qū)的存在與否。
本發(fā)明還提供在手術(shù)前用于對(duì)腫瘤邊緣作圖的方法，所述方法包括給予有需要的 受治療者本文中定義的綴合物，在給予綴合物后頭2-M小時(shí)，對(duì)受治療者進(jìn)行照射，并使 腫瘤、優(yōu)選乳腺腫瘤成像而進(jìn)行掃描，因此在手術(shù)準(zhǔn)備中給腫瘤邊緣作圖。
本發(fā)明還提供用于局部乳腺癌、尤其原位管癌(DCIS)的微創(chuàng)治療、檢測(cè)和預(yù)后 策略，所述策略包括(i)給予受治療者本文中定義的綴合物，優(yōu)選RGD-Bchl綴合物，從而 RGD-Bchl綴合物特異性歸巢并蓄積在壞死腫瘤區(qū)，(ii)通過(guò)以高精度用于腫瘤檢測(cè)和腫 瘤邊緣界定的上述任何方法對(duì)用RGD-BChl衍生物治療的受治療者進(jìn)行腫瘤靶向成像，以 及通過(guò)MRI、熒光和PET SCAN方法預(yù)后；和(iii)允許保乳和重塑的局部壞死區(qū)的腫瘤靶 向光動(dòng)力療法(PDT)。
用于本發(fā)明的RGD肽-光敏劑綴合物特別適用于壞死腫瘤的腫瘤靶向PDT，并可用 于治療癌性疾病。
因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的綴合物可用于腫瘤領(lǐng)域以通過(guò)癌前狀態(tài)和若 干癌癥類型的PDT用于治療，所述癌癥類型例如但不限于黑素瘤、前列腺、腦、結(jié)腸、卵巢、 乳腺、結(jié)腸直腸、頭頸部、由乳腺癌引起的胸壁腫瘤、皮膚、肺、食道和膀胱癌和腫瘤。所述化 合物可用于治療原發(fā)移性壞死腫瘤以及轉(zhuǎn)移性壞死腫瘤。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法用于治療局部乳腺癌，尤其原位管癌。
本發(fā)明提供用于壞死腫瘤的腫瘤光動(dòng)力療法的方法，所述方法包括(a)給予有 需要的個(gè)體本發(fā)明的RGD肽-光敏劑綴合物；和(b)在注射綴合物后至少M(fèi)小時(shí)，優(yōu)選2、 3、4、5、6、7或8天，通過(guò)本文所述的任何方法，在確定存在壞死區(qū)后照射腫瘤局部及其壞死 區(qū)。
在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及檢測(cè)腫瘤壞死的新的方法，所述方法以熒光Chl/ Bchl-RGD綴合物在壞死腫瘤區(qū)的選擇性攝取和長(zhǎng)期蓄積為基礎(chǔ)。Chl/Bchl致敏物與歸巢 于內(nèi)皮和腫瘤細(xì)胞的特異性受體的配體綴合。然后，一旦Chl/Bchl以足夠高的濃度蓄積 和并從周圍組織清除后，便通過(guò)照射腫瘤體積和緊接的附近，開(kāi)始以光動(dòng)力學(xué)的方式產(chǎn)生 ROS。
化合物M的Bchl組分在近紅外線(NIR)處具有可以檢測(cè)固有熒光。使用化合物 M的最新實(shí)驗(yàn)顯示，在原發(fā)瘤的異種移植物中蓄積高達(dá)4_8uM?；衔颩長(zhǎng)時(shí)期保留在腫 瘤部位，使得信號(hào)蓄積和良好的信噪比成為可能。該分子的這些能力可能取決于Bchl和血 清白蛋白之間的相互作用，使該分子成為定向成像和最終定向療法的良好的候選分子。另 一種Bchl衍生物化合物叢，具有高達(dá)3倍的發(fā)光能力，因此可以是甚至更好的靶向成像的 候選分子。這些分子開(kāi)啟了在人乳腺腺癌模型中精確檢測(cè)腫瘤邊緣和壞死的可能性。檢測(cè) 腫瘤邊緣和壞死是迄今為止在腫瘤治療中存在的兩個(gè)最具有挑戰(zhàn)性的問(wèn)題。此外，兩者是 在治療后腫瘤再生長(zhǎng)的可靠預(yù)測(cè)物。因此，預(yù)期在未來(lái)的臨床應(yīng)用時(shí)，前述RGD衍生物適用 于在手術(shù)臺(tái)上檢測(cè)腫瘤和壞死。
本發(fā)明引進(jìn)了實(shí)現(xiàn)與RGD肽綴合的Chl/Bchl衍生物在有活力腫瘤組織中短暫停 留后在壞死腫瘤區(qū)長(zhǎng)期蓄積的新的方法。蓄積的化合物可用于有活力(在給藥后短期內(nèi)) 或壞死(在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi))腫瘤區(qū)的體內(nèi)成像，以及用于通過(guò)PDT的腫瘤療法、通過(guò)改變Bchl 中心金屬或通過(guò)與小的治療劑進(jìn)一步綴合的化療或同位素放射療法。以化合物叢和化合 物M為例對(duì)新的方法進(jìn)行了說(shuō)明。已把C(RGDfK)鑒定為在血管生成中上調(diào)的ανβ5整聯(lián)蛋白的高度特異性配體?；衔?5部分提供在OTR時(shí)具有強(qiáng)自身熒光的綴合 物，使之適用于在組織攝取后的熒光成像。
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，RGD部分是化合物叢和化合物M在小的(無(wú)壞死)腫瘤和大的 (壞死)腫瘤兩者中的特異性蓄積中必不可少的，因?yàn)閷?duì)于未綴合的化合物些，沒(méi)有觀察到 短期或長(zhǎng)期的蓄積。此外，經(jīng)治療小鼠的化合物型的總體清除率比綴合化合物的顯著較 快。通過(guò)本文描述的競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)對(duì)RGD待定機(jī)制作出補(bǔ)充，其中在化合物叢后不久或同時(shí)注 射過(guò)量的游離c (RGDfK)，防止了稍后被腫瘤組織攝取。
在壞死和無(wú)壞死腫瘤之間觀察到在化合物Π蓄積中的巨大差異。因此，還沒(méi)有發(fā) 展成壞死的小的MDA-MB-231-RFP腫瘤(約0. 5cm3)顯示-在藥物注射后1-6. 5小時(shí)內(nèi)化合物叢在腫瘤中快速蓄積，隨后是快速(< M小時(shí))清除。在稍后的時(shí)間內(nèi)，當(dāng)大部分剩 余藥物限于清除器官(主要是腎但也可以是肝)中時(shí)，在腫瘤中僅可檢出非常少量的藥物。 與其它器官相比，自藥物注射后48小時(shí)起，已發(fā)展成壞死的大的MDA-MB-231-RFP( > Icm3) 腫瘤顯示出較慢的達(dá)到峰值腫瘤濃度比的蓄積。自藥物注射后M小時(shí)起，腫瘤質(zhì)量中的平 均藥物濃度僅輕微降低。這些結(jié)果對(duì)于壞死腫瘤區(qū)是普遍的，但因腫瘤類型而有所不同。此 外，對(duì)于化合物1在壞死和無(wú)壞死腫瘤中的蓄積方式之間觀察到類似差異，不同之處在于 在肝中觀察到較慢的清除率，使化合物叢成為用于臨床應(yīng)用的更好的候選分子。
或許，在乳腺癌模型和卵巢癌腫瘤模型中，本文所觀察到的化合物叢在壞死區(qū)和 無(wú)壞死區(qū)的蓄積速率之間的差異，與兩個(gè)腫瘤類型的微環(huán)境的不同性質(zhì)有關(guān)。在乳腺腫瘤 觀察到腫瘤體積和微血管密度之間的相反關(guān)系隨著腫瘤體積增加，每立方厘米的微血管 密度顯著降低。因此，整聯(lián)蛋白的濃度變得按比例地降低，因此整聯(lián)蛋白依賴性藥物蓄積的 速率應(yīng)按比例地降低。
所提供的數(shù)據(jù)最突出的特征是藥物熒光從活力部位明顯轉(zhuǎn)移至壞死腫瘤體積，其 由給予化合物叢后不同時(shí)間壞死MDA-MB-231-RFP腫瘤的切離腫瘤熒光成像得到證實(shí)。根 據(jù)藥物蓄積對(duì)RGD部分的依賴性，多步驟蓄積是可能的，其中第一步包括化合物迆部分 (2H-MLT)從血清白蛋白分子中解離，被微血管系統(tǒng)、有活力的腫瘤細(xì)胞及或許巨噬細(xì)胞或 嗜中性粒細(xì)胞中的ανβ3整聯(lián)蛋白有效攝取。據(jù)信該步驟后接著是化合物叢被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)或 胞轉(zhuǎn)遷移進(jìn)入壞死區(qū)，并且在此長(zhǎng)時(shí)間缺乏從中的引流作用(drainage)。在無(wú)壞死腫瘤中， 藥物通過(guò)由整個(gè)腫瘤構(gòu)成的有活力區(qū)域快速蓄積，但是因?yàn)椴淮嬖趬乃?，所以藥物快速?除。當(dāng)注射化合物M時(shí)，切離腫瘤熒光結(jié)果與化合物叢獲得的結(jié)果類似。
在其它腫瘤模型(即MLS-mBanana、人卵巢癌)中，觀察到壞死和無(wú)壞死腫瘤的 蓄積率的類似差異。然而，在速率和蓄積方式上存在一些變化，可能反映了不同的腫瘤類 型?；衔飬苍跓o(wú)壞死MLS-mBanana腫瘤中快速蓄積，然后慢慢清除掉。在壞死腫瘤中 藥物在第一小時(shí)內(nèi)在有活力邊緣達(dá)到最大濃度，然后轉(zhuǎn)移到壞死區(qū)，在給藥后M小時(shí)在此 達(dá)到最大濃度。與MDA-MB-231-RFP相比，在MLS-mBanana中以高濃度快速蓄積，反映了在 MLS-mBanana細(xì)胞中整聯(lián)蛋白受體的較高濃度。
用化合物叢治療的動(dòng)物的大腫瘤和小腫瘤的組織學(xué)分析似乎支持所提出的蓄積 方式，并提供了一些有關(guān)潛在機(jī)制的線索。在頭幾小時(shí)內(nèi)有活力腫瘤區(qū)和化合物旦熒光有 非常好的重疊，在給藥后M小時(shí)和更長(zhǎng)時(shí)間，叢的熒光和壞死區(qū)間有非常好的重疊。
有許多藥物和造影劑在與淋巴引流差和靜脈回流慢有關(guān)的腫瘤中蓄積的報(bào)道。之 前有研究提出這種現(xiàn)象，稱為高通透性和保持(EPR)作用，作為以非特異性方式靶向腫瘤 組織的方法。有可能的是，Era說(shuō)明了化合物叢或化合物M在壞死區(qū)和無(wú)壞死腫瘤中的 蓄積方式。最近有研究提出，血清白蛋白(SA)-藥物絡(luò)合物通過(guò)腫瘤血管系統(tǒng)滲透到間質(zhì) 腫瘤組織中以說(shuō)明這類蓄積(Tanaka，Siiramoto等，2004)。文獻(xiàn)中有若干實(shí)例顯示，分子 與SA綴合導(dǎo)致將分子遞送至腫瘤甚至遞送至壞死區(qū)。事實(shí)上，本發(fā)明的發(fā)明人之前指出帶 負(fù)電荷的水溶性Bchl衍生物對(duì)SA具有高親和力。因此，在給藥后化合物叢或化合物M 可能通過(guò)Bchl部分與SA締合，在血液中循環(huán)，并通過(guò)如上闡釋的EI3R作用與SA —起滲入 (extravagate)到腫瘤組織中。如果那樣的話，預(yù)期化合物型作為突出的化學(xué)實(shí)體在壞死 區(qū)蓄積，然而，由于化合物些在所研究的腫瘤中的保留短暫，可排除通過(guò)Era作用蓄積的可能性。
或者，當(dāng)Bchl-RGD衍生物遇到α V β 3或α V β 5整聯(lián)蛋白時(shí)，它可從SA載體上脫 落，并且以比SA分子更高的親和力通過(guò)RGD組成部分與整聯(lián)蛋白結(jié)合。在這種最初的連接 后，化合物叢或化合物M可通過(guò)胞吞擴(kuò)散至上皮細(xì)胞，或跨越上皮細(xì)胞進(jìn)行胞轉(zhuǎn)。藥物直 接遷移到胞外基質(zhì)(ECM)中也是可能的。在這些情況下，根據(jù)濃度梯度進(jìn)行的藥物移動(dòng)將 趨向于壞死區(qū)，在此化合物叢或化合物M開(kāi)始達(dá)到其最低濃度。
曾提出的c(RGDfK)-2H/Pd-MLT與整聯(lián)蛋白的相互作用可能意味著在壞死腫瘤區(qū) 的蓄積是嗜中性粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞依賴性的。相當(dāng)一段時(shí)間就已知活化的嗜中性粒細(xì)胞和 巨噬細(xì)胞表達(dá)整聯(lián)蛋白。組織學(xué)結(jié)果表明，嗜中性粒細(xì)胞停留在壞死區(qū)(雖然大部分在邊 緣中)。由文獻(xiàn)得知，在侵襲性乳腺癌中存在高的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)(Leek，Landers等，1999)。 對(duì)于NACA (Necrosis Avid Contrast Agents，壞死親和性造影劑)，發(fā)現(xiàn)從壞死病灶中的 最終清除在給藥后要花幾天，對(duì)應(yīng)于天然愈合過(guò)程，期間壞死組織日漸被浸潤(rùn)，被炎性細(xì)胞 (主要是嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞)吞噬，并且被肉芽組織代替。因此，認(rèn)為 壞死中保留的NACA將通過(guò)吞噬作用與壞死材料一道被清除掉。因此，在NACA-壞死結(jié)合后 第二次巨噬細(xì)胞攝取也可解釋其局部富集。因此有人提出，有可能是壞死區(qū)的吸引及在其 中的保留依賴于聚集在壞死區(qū)的嗜中性粒細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞的吸引。
熒光Chl/Bchl在壞死區(qū)的可能的靶向和長(zhǎng)期保留，使得它們能夠被早期檢出，并 且有助于預(yù)測(cè)腫瘤預(yù)后和治療方式。此外，它開(kāi)啟了遞送引發(fā)低氧的藥物的途徑。
下面通過(guò)下列非限制性實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明。實(shí)施例
材料與方法
(i)化合物-按照相同申請(qǐng)人的WO 2008/023378中所述，制備Bchl衍生物、 RGD-肽及其綴合物。本文這些綴合物和化合物用與W02008/023378相同的阿拉伯?dāng)?shù)字表示 (化合物45除外)。
化合物n[c(RGDfK)-2H_MLT] :31-氧代_15_甲氧基羰基甲基-紅螺菌菌綠素 131- -磺乙基)酰胺-173-c (RGDfK)酰胺鉀鹽。
化合物M [c (RGDfK)-Mn-MLT]錳(111)31-氧代_15_甲氧基羰基甲基-紅螺菌菌 綠素131- -磺乙基)酰胺-173-(環(huán)RGDfK)酰胺鉀鹽。
化合物邊[(3 (RGDfK) -Cu-MLT]銅(II) 31-氧代_15_甲氧基羰基甲基-紅螺菌菌 綠素131- -磺乙基)酰胺-173-(環(huán)RGDfK)酰胺鉀鹽。
化合物M[c (RGDfK) -Pd-MLT]鈀31-氧代_15_甲氧基羰基-甲基-紅螺菌菌綠 素131- -磺乙基)酰胺-173-c (RGDfK)酰胺鉀鹽。
化合物型[2H-MLT] :31-氧代_15_甲氧基羰基甲基-螺紅菌-菌綠素131- -磺 乙基)酰胺鉀鹽。
化合物26「線性GRGDSP-2H-MLT1 :31-氧代_15_甲氧基羰基甲基-紅螺菌菌綠素 13^(2-磺乙基)酰胺-173-(GRGDSP)酰胺鉀鹽。
化合物36「c (RGDyK),-2H-MLT1 =31-氧代-15-甲氧基羰基甲基-紅螺菌菌綠素 13^(2-磺乙基)酰胺-173-雙(環(huán)RGDfK)酰胺鉀鹽。
化合物45「c (RADfK) -2H-MLT] :31-氧代-15-甲氧基羰基甲基-紅螺菌菌綠素 131- -磺乙基)酰胺-173-(環(huán)RADfK)酰胺鉀鹽。
(ii)細(xì)胞系一從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，Manassas, VA)獲得 MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞。MLS-pRSETB-mBanana轉(zhuǎn)染的抗嘌羅霉素的人卵巢癌細(xì)胞由 Michal Neeman 教授(Department ofBiological Regulation, Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel)惠贈(zèng)。
(iii)用紅色熒光蛋白(RFP)轉(zhuǎn)染的MDA-MB-231-兩種質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)染攜帶新 霉素抗性基因的pDsRed2-Nl(Cl0ntech，Palo Alto, CA)(圖ΙΑ)，及攜帶潮霉素抗性基因 的修飾的 pDsRed-Monomer-Hyg-Cl (Clontech, Palo Alto, CA)，其中圖 IB 中所示質(zhì)粒的 DsRed-Monomer基因被pDsRed2 (得自pDsRed2_Nl質(zhì)粒，圖1C)替換。對(duì)于轉(zhuǎn)染，按照生產(chǎn) 商的方案使用 Lipofectamine 2000 (Invitrogen )。
(iv)組織培養(yǎng)一將MDA-MB-231-RFP細(xì)胞在補(bǔ)充了 lmmol/L丙酮酸鈉、10 %胎 牛血清(FCS)、250 μ g/ml潮霉素、0. 06mg/ml青霉素和0. lmg/ml鏈霉素的RPMI 1640培 養(yǎng)基中維持。細(xì)胞在潮濕環(huán)境(5% C02，95%空氣)中在37°C下生長(zhǎng)成為單層細(xì)胞。將 MLS-mBanana細(xì)胞在補(bǔ)充了 lmmol/L丙酮酸鈉、10%胎牛血清(FCS)、10 μ g/ml嘌羅霉素、 0. 06mg/ml青霉素和0. lmg/ml鏈霉素的MEM-α培養(yǎng)基中維持。細(xì)胞在潮濕環(huán)境(5% CO2, 95%空氣)中在37°C中生長(zhǎng)成單層細(xì)胞。
(ν)動(dòng)物一遵照 Weizmann Institute of Science (Rehovot，Israel)的機(jī)構(gòu)動(dòng)物 管理與使用委員會(huì)的準(zhǔn)則(1996)，在動(dòng)物設(shè)施中關(guān)養(yǎng)雌性CDl裸小鼠(7-8周齡，約25g)， 并且按任意進(jìn)食飲水處理。
(vi)小鼠腫瘤模型一MDA-MB-231-RFP熒光人乳腺癌細(xì)胞和MLS-mBanana熒光人 卵巢癌細(xì)胞(5X IO6的100 μ 1鹽水溶液)用胰蛋白酶消化，在分會(huì)合時(shí)收集，然后接種到雌 性小鼠背部和乳房脂墊。使腫瘤生長(zhǎng)成為兩種所需大小一壞死腫瘤(約lcm3，3-4周內(nèi)) 和無(wú)壞死腫瘤(約0. 5cm3,1-2周內(nèi))。
(vii)整體熒光成像一通過(guò)腹膜內(nèi)注射30 μ 1 85 15氯胺酮賽拉嗪的混合物 使小鼠麻醉。對(duì)于監(jiān)測(cè)乳房脂墊中的藥物蓄積，按15mg藥物/kg體重將化合物叢、化合物 巡或化合物M經(jīng)靜脈內(nèi)注射到小鼠尾靜脈。通過(guò)體內(nèi)光學(xué)成像系統(tǒng)IVIS 100 (Xenogen Corp. , Alameda, CA)監(jiān)測(cè)紅色熒光蛋白(RFP)、pRSETB-mBanana和光敏劑熒光。用于腫瘤 成像的主濾片組包括500-550nm下的激發(fā)濾片和575-650nm下的發(fā)射濾片；用于減去組織 自體熒光的背景濾片組包括460-490nm下的激發(fā)濾片和575-650nm下的發(fā)射濾片。藥物成 像主濾片組包括665-695nm下的激發(fā)濾片和810-875nm下的發(fā)射濾片。圖像在相同的曝光 時(shí)間內(nèi)獲得，用線條彩色標(biāo)尺說(shuō)明以供進(jìn)行定性比較。
(viii)壞死腫瘤中的熒光信號(hào)測(cè)量一從整體體內(nèi)圖像標(biāo)出腫瘤邊緣(目標(biāo)區(qū) (R0I))，圈出邊緣內(nèi)的熒光信號(hào)用光子/秒表示。在旁側(cè)用相同的ROI測(cè)量光子/秒。另 外，對(duì)于背景測(cè)量，在3只未治療小鼠中測(cè)量腫瘤和旁側(cè)R0I，取平均值。將各個(gè)ROI的熒光 測(cè)量值除以面積得到歸一化螢光信號(hào)強(qiáng)度，單位為光子/秒/cm2?；衔飬沧⑸浜髲?5 分鐘到216小時(shí)收集信號(hào)測(cè)量值。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，減去背景，計(jì)算得到平均，計(jì)算得到腫 瘤邊緣和旁側(cè)熒光之間的比率。
(ix)化合物Π和游離C(RGDfK)結(jié)合之間的競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法一在注射化合物13 (HOnmol)之前1小時(shí)給小鼠注射過(guò)量(8. 5ymol)的游離c (RGDfK)肽。對(duì)照組只注射 化合物I^(HOnmol)?；衔飬沧⑸浜驧小時(shí)拍攝熒光照片。按(vii)中所述使用熒光 成像主濾片組。
(χ)切離腫瘤熒光成像--將15mg/kg化合物叢經(jīng)靜脈內(nèi)注射到小鼠尾靜脈中。 處死小鼠，切除腫瘤，切開(kāi)兩半，使用Xenogen IVIS 系統(tǒng)在不同的時(shí)間間隔成像對(duì)于 MDA-MB-231-RFP為10分鐘、1小時(shí)、4小時(shí)和24小時(shí)、3天、5天和7天，對(duì)于MLS-mBanana 為7天。用于熒光成像的濾片組見(jiàn)(vii)。
(xi)組織學(xué)一在切除實(shí)驗(yàn)后，將腫瘤在3. 7%甲醛中固定，并包埋在石蠟塊中。切 片在標(biāo)準(zhǔn)條件下用蘇木精-伊紅(H&E)染色。
(xii) PDT方案一將7. 5mg/kg或15mg/kg化合物叢注射到被麻醉的小鼠靜脈內(nèi)。 照射腫瘤10分鐘或30分鐘。藥物光照間隔為藥物注射后8小時(shí)或M小時(shí)。使用755nm 二極管激光器以lOOmW/cm2 (CeramOptec，Germany)進(jìn)行經(jīng)皮照射。在避光對(duì)照組中，將藥 物注射到小鼠靜脈內(nèi)，將小鼠放入無(wú)光籠內(nèi)M小時(shí)。在光照對(duì)照組中，小鼠不注射藥物，但 用lOOmW/cm2照射10分鐘。在PDT后頭兩天內(nèi)，按需給小鼠止痛(每天2. 5mg/kg氟尼辛 (Flunexin))。
實(shí)施例1.用熒光蛋白轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞
為了建立以穩(wěn)定方式表達(dá)RFP的細(xì)胞系，進(jìn)行了轉(zhuǎn)染步驟?？赏ㄟ^(guò)熒光顯微鏡和 其它熒光成像方法在體內(nèi)和體外(組織/細(xì)胞)對(duì)這類細(xì)胞系進(jìn)行檢測(cè)。選擇已知產(chǎn)生自 發(fā)性中心性壞死的人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系用于此目的。使用兩種質(zhì)粒(圖1A、圖1C)， 獲得穩(wěn)定克隆后，通過(guò)熒光顯微鏡檢測(cè)(見(jiàn)圖2A-2B)。由修飾的pDsRed-Monomer-Hyg-Cl 質(zhì)粒所產(chǎn)生的克隆(圖1C)發(fā)出較強(qiáng)熒光。選出用修飾的pDsRed-Monomer-Hyg-Cl轉(zhuǎn)染的 克隆3(圖2B)以進(jìn)一步使用。
組成型表達(dá)RFP的轉(zhuǎn)染細(xì)胞在體外和體內(nèi)的熒光強(qiáng)度不隨著時(shí)間的變化而降低。 未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞無(wú)紅色自體熒光。
實(shí)施例2.壞死腫瘤模型一組織病理學(xué)分析
為了證實(shí)MDA-MB-231-RFP細(xì)胞產(chǎn)生合適的壞死模型，使MDA_MB_231_RFP腫瘤發(fā) 展成兩種大小。按照材料與方法部分(xi)中所述進(jìn)行了組織學(xué)和組織病理學(xué)分析。結(jié)果 見(jiàn)圖3A和圖;3B。約Icm3的大腫瘤具有非常顯著的壞死區(qū)(圖3A)，而約0. 5cm3的小腫瘤 沒(méi)有壞死區(qū)(圖3B)。
實(shí)施例3.原發(fā)壞死MDA-MB-231-RFP異種移植物腫瘤中化合物叢攝取的體內(nèi)熒 光成像
對(duì)化合物叢在壞死MDA-MB-231-RFP腫瘤(彡Icm3)的蓄積方式進(jìn)行了體內(nèi)檢查。 圖4A-4B和圖5A-5B說(shuō)明采用Xenogen IVIS 系統(tǒng)，在CD-1雌性裸小鼠的乳房墊中，化合 物叢在常位人乳腺M(fèi)DA-MB-231-RFP原發(fā)瘤中的熒光信號(hào)蓄積。使用上文材料與方法部分 (vii)中所述的濾片組，同時(shí)記錄了整體動(dòng)物圖像。每1-1. 5小時(shí)以及在注射化合物叢后 M小時(shí)(圖4A-4B)，然后接下來(lái)7天中每M小時(shí)(圖5A-5B)獲取動(dòng)態(tài)熒光圖像達(dá)9小 時(shí)。在注射化合物叢后不久，可檢測(cè)整個(gè)動(dòng)物體的OTR熒光，這反映出循環(huán)中的高藥物濃 度。在注射后頭9小時(shí)觀察到從循環(huán)中快速清除，隨之在肝中蓄積，在某種程度上在腫瘤中蓄積(圖4B)。次日，化合物叢保持在腫瘤中的蓄積，而從肝中完全清除，提供了在>3天 直到注射后的7天跟蹤期間結(jié)束時(shí)的腫瘤成像(圖5B)，之后極緩慢地清除。整個(gè)實(shí)驗(yàn)中 腫瘤大小和位置不變，正如紅色體內(nèi)整體圖像中所見(jiàn)(圖4A和圖5A)。在腫瘤大小彡Icm3 的9只研究動(dòng)物中觀察到類似結(jié)果。
實(shí)施例4.在原發(fā)無(wú)壞死MDA-MB-231-RFP異種移植物腫瘤中化合物叢攝取的體 內(nèi)熒光成像
接著在彡0. 5cm3的無(wú)壞死腫瘤中對(duì)相同參數(shù)進(jìn)行了研究。圖6A-6B和圖7A-7B表 示來(lái)自移植了 MDA-MB-231-RFP的CD-I雌性裸小鼠中的化合物叢和RFP的熒光信號(hào)。采用如上所述的IVIS 系統(tǒng)并按與實(shí)施例3相同的時(shí)間間隔對(duì)藥物蓄積方式成像，但只限于 3天，因?yàn)榈侥菚r(shí)藥物完全清除。這些無(wú)壞死腫瘤中的蓄積方式與壞死腫瘤中所觀察到的 顯著不同。在注射后約2小時(shí)在腫瘤中及在肝中后不久(藥物注射后3.5小時(shí))，化合物 I^OTR熒光達(dá)到峰值(圖6B)。與得自壞死腫瘤的化合物叢的分辨熒光不同，注射后2天， 從無(wú)壞死腫瘤中幾乎無(wú)法觀測(cè)到熒光(圖7A)。在16只動(dòng)物的平均熒光測(cè)量值中，藥物注 射后1-6. 5小時(shí)檢出峰值腫瘤熒光。
實(shí)施例5. MDA-MB-231-RFP壞死腫瘤中化合物Π攝取和清除的動(dòng)力學(xué)
為了半定量地評(píng)價(jià)化合物叢在壞死腫瘤中的蓄積方式，計(jì)算得到化合物叢在9 只小鼠的壞死腫瘤中的平均熒光信號(hào)，并相對(duì)于216小時(shí)在若干時(shí)間點(diǎn)上作圖(圖8)。自 注射后12小時(shí)起向前，與旁側(cè)的等同對(duì)照區(qū)相比，來(lái)自腫瘤的熒光信號(hào)變得特別地強(qiáng)。腫 瘤和旁側(cè)之間的熒光比及時(shí)增加并在距192小時(shí)約8小時(shí)之時(shí)達(dá)到穩(wěn)定期。
實(shí)施例6.化合物M在常位MDA-MB-231-RFP原發(fā)壞死異種移植物腫瘤中的攝取
采用實(shí)施例3中所描述的相同實(shí)驗(yàn)設(shè)置，對(duì)金屬化綴合物M(C(RGDfK)-Pd-MLT) 在壞死原發(fā)MDA-MB-231-RFP腫瘤中的體內(nèi)蓄積方式進(jìn)行了研究。
結(jié)果見(jiàn)圖9A-9B和圖10A-10B，結(jié)果表明在注射化合物M后不久可測(cè)出熒光，反 映了循環(huán)中藥物濃度高。在注射后頭8小時(shí)觀察到循環(huán)快速清除，隨之在肝中蓄積，以及在 某種程度上在腫瘤中蓄積(圖9B)。次日，化合物M保持在腫瘤中蓄積，然而，觀察到未完 全從肝中清除(圖10B)。顯然，從注射后約3天起，化合物M可用作腫瘤的選擇性成像分 子，其后具有極緩緩的清除率。然而，比起化合物叢，它的特異性略微較小。腫瘤大小和位 置在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有改變，如紅色體內(nèi)整體圖像所見(jiàn)一樣(圖9A和10A)。這些腫瘤大小 ^ Icm3的結(jié)果是在3只動(dòng)物中觀察的。
實(shí)施例7.化合物M在常位MDA-MB-231-RFP原發(fā)無(wú)壞死異種移植物腫瘤中的攝 取
如上文實(shí)施例4中所述，采用與實(shí)施例6中規(guī)定相同的時(shí)間間隔，在移植在CD-I 雌性裸小鼠中的MDA-MB-231-RFP無(wú)壞死腫瘤(約0. 5cm3)中對(duì)來(lái)自化合物M和RFP的熒 光信號(hào)進(jìn)行了研究，但只限于2天，因?yàn)榈侥菚r(shí)藥物完全從腫瘤中清除。結(jié)果見(jiàn)圖11A-11B 和1圖12A-12B，結(jié)果表明對(duì)于化合物叢，在無(wú)壞死腫瘤中的蓄積方式顯著不同于在壞死腫 瘤中所觀察到的方式。在注射后約2. 5小時(shí)的腫瘤中和在肝中后不久(藥物注射后5. 5小 時(shí)，圖11B)，化合物M^R-光達(dá)到峰值。與來(lái)自壞死腫瘤的化合物M的分辨熒光不同，在 注射后M小時(shí)從無(wú)壞死腫瘤中幾乎無(wú)法觀察到熒光(圖12B)。在藥物注射后1-4. 5小時(shí) 檢測(cè)峰值腫瘤熒光(5只動(dòng)物的平均熒光測(cè)量值)。
實(shí)施例8.化合物Π在植入在小鼠乳房墊中的MLS-mBanana原發(fā)壞死腫瘤中的攝 取
為了證實(shí)上述實(shí)驗(yàn)中所獲得的概括性結(jié)果，在從MLS-mBanana人卵巢癌細(xì)胞系中 產(chǎn)生的不同腫瘤類型中，對(duì)化合物叢在壞死區(qū)中的蓄積進(jìn)行了進(jìn)一步研究。圖13A-i;3B和圖14A-14B所示結(jié)果表明，采用如材料與方法部分(vii)中所述的Xenogen IVIS 系統(tǒng)，化合物Π的熒光信號(hào)在經(jīng)皮下(s. c.)移植到CD-I雌性裸小鼠乳房墊中的人卵巢 MLS-mBanana原發(fā)瘤中蓄積。按與上文實(shí)施例3中所述相同的時(shí)間間隔監(jiān)測(cè)蓄積方式，限于 4天，因?yàn)樗幬锏侥菚r(shí)完全清除。在注射后不久，從肝和腫瘤中大多檢測(cè)到化合物I^OTR發(fā) 出熒光。在注射后頭8小時(shí)發(fā)生從循環(huán)中快速清除，隨之在肝和腫瘤中蓄積(圖13B)。2 天后，化合物叢保持在腫瘤中的蓄積而從肝中完全清除，提供無(wú)環(huán)境干擾的腫瘤選擇性成 像(圖14B)。從MLS-mBanana壞死腫瘤中的清除比從MDA-MB-231-RFP壞死腫瘤中的清除 顯著較快，在第3天幾乎完成。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中腫瘤大小和位置沒(méi)有改變，正如紅色體內(nèi)整體 圖像中所觀察的一樣(圖13A和14A)。這些結(jié)果是在腫瘤大小彡Icm3的3只動(dòng)物中觀察 的。
實(shí)施例9.化合物叢在植入小鼠乳房墊的MLS-mBanana原發(fā)無(wú)壞死腫瘤中的攝取
鑒于顯示無(wú)長(zhǎng)期藥物蓄積的無(wú)壞死MDA-MB-231-RFP腫瘤的結(jié)果，對(duì)MLS-mBanana 無(wú)壞死腫瘤中的長(zhǎng)期蓄積進(jìn)行了研究。圖15A-15B和圖16A-16B中所示結(jié)果表示化合物叢 在MLS-mBanana無(wú)壞死腫瘤中的熒光信號(hào)。按照材料與方法部分(vi)中所述，使用與實(shí)施 例4中所述相同的時(shí)間間隔，限于4天，因?yàn)榈侥菚r(shí)藥物幾乎完全清除，對(duì)蓄積方式進(jìn)行了 監(jiān)測(cè)。無(wú)壞死腫瘤中的蓄積方式與壞死腫瘤的有些相似。在注射后1小時(shí)的腫瘤中化合物 13NIR熒光達(dá)到峰值(圖15B)。從第1小時(shí)起對(duì)肝中的蓄積進(jìn)行了檢測(cè)。
當(dāng)在同一線性熒光標(biāo)尺上比較壞死和無(wú)壞死腫瘤時(shí)，壞死腫瘤中的化合物叢濃 度似乎比圖17A-17B中所顯示的無(wú)壞死的高得多。在
藥物注射后1-3. 5小時(shí)檢測(cè)出峰值腫瘤熒光G只動(dòng)物的平均熒光測(cè)量值)。
實(shí)施例10.化合物Π蓄積依賴于c (RGDfK)部分
為了確定化合物叢的腫瘤攝取和所得到的OTR熒光信號(hào)的蓄積是否由RGD部分 驅(qū)動(dòng)，進(jìn)行了兩個(gè)實(shí)驗(yàn)。在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)在化合物叢注射后不同時(shí)間的熒光信號(hào)的蓄 積與注射游離2H-MLT(化合物些)的CDl裸小鼠的進(jìn)行了比較，所述CDl裸小鼠在乳房墊 中移植了 MDA-MB-231-RFP的無(wú)壞死(< 0. 5cm3)和壞死(約Icm3)腫瘤。第二個(gè)實(shí)驗(yàn)在化 合物叢和游離C(RGDfK)之間進(jìn)行了競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法。
10. 1化合物型在MDA-MB-231-RFP原發(fā)壞死和無(wú)壞死腫瘤中的攝取化合物型初 次注射后每1-1. 5小時(shí)持續(xù)8. 5-9小時(shí)和在24小時(shí)(圖18A-18B和圖20A-20B)及余下3 天每M小時(shí)(圖19A-19B和圖21A-21B)獲取壞死和無(wú)壞死腫瘤的動(dòng)態(tài)熒光圖像。在注射 后5-10分鐘，化合物些OTR熒光信號(hào)在腫瘤中達(dá)到最大濃度，如果觀察到任何濃度的話。 熒光信號(hào)值比化合物叢的最大觀察值(在長(zhǎng)得多的時(shí)間間隔下)小約2個(gè)數(shù)量級(jí)。在注 射后20分鐘熒光信號(hào)值已降到無(wú)意義。同時(shí)，熒光信號(hào)大部分在肝和在心臟蓄積。在3只 具有壞死腫瘤的動(dòng)物(圖18B)和2只無(wú)壞死腫瘤的動(dòng)物(圖20B)中觀察到相同的作用方 式。
10. 2與MDA-MB-231-RFP原發(fā)無(wú)壞死腫瘤結(jié)合的化合物叢和游離c (RGDfK)之間的競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法
為了證實(shí)特異性結(jié)合，通過(guò)游離C(RGDfK)配體進(jìn)行了試圖阻斷化合物Π蓄積 的實(shí)驗(yàn)。如實(shí)施例3中所述在有或沒(méi)有之前注射C(RGDfK)時(shí)給予化合物叢。結(jié)果見(jiàn)圖 22A-22D。當(dāng)在給予游離C(RGDfK)后給予化合物叢時(shí)，在M小時(shí)后在腫瘤中來(lái)檢測(cè)到蓄 積(圖22C)，而當(dāng)只給予化合物叢時(shí)，在對(duì)照組中，可在腫瘤中檢測(cè)出蓄積(圖22D)，說(shuō)明 化合物叢通過(guò)c (RGDfK)部分與腫瘤結(jié)合。
實(shí)施例11.化合物Π在MDA-MB-231-RFP壞死腫瘤區(qū)中的特異性蓄積
壞死和無(wú)壞死乳腺腫瘤異種移植物植入乳房墊中顯著不同的動(dòng)態(tài)熒光圖，激發(fā)了 對(duì)腫瘤組織學(xué)與化合物叢熒光信號(hào)蓄積之間的關(guān)系進(jìn)行研究。因此，在注射化合物叢后 的規(guī)定時(shí)間切除腫瘤，并切成兩半。在若干時(shí)間點(diǎn)(注射后10分鐘、1小時(shí)、4小時(shí)和M小 時(shí)、3天、5天和7天)使用材料與方法部分(vii)中所述的Xenogen IVIS 系統(tǒng)拍攝圖像。 圖23- 所示結(jié)果表示化合物叢在不同時(shí)間點(diǎn)的熒光蓄積。對(duì)于每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，測(cè)試了 3只 動(dòng)物。藥物注射后從10分鐘到4小時(shí)，僅觀察有活力區(qū)域的藥物熒光(圖23-2 。4小 時(shí)后，存在向壞死區(qū)的某種擴(kuò)散。自注射后3天起，蓄積方式回復(fù)(reverted)熒光完全轉(zhuǎn) 移到壞死區(qū)，其中有一些殘余熒光擴(kuò)散到周圍有活力的細(xì)胞中(圖27F)。5天和7天同樣 觀察到這些結(jié)果(圖觀-29)。重要的是，在注射后M小時(shí)，從壞死區(qū)已清楚觀察到特異性 腫瘤熒光，具有較強(qiáng)的藥物熒光，但與3天間隔的相比，腫瘤邊界的界線不是十分清晰(圖 ^F)。在這組實(shí)驗(yàn)中表明，隨著時(shí)間推移，化合物叢從有活力區(qū)向壞死區(qū)移動(dòng)，并在該處長(zhǎng) 時(shí)間特異性蓄積。
實(shí)施例12.化合物M在MDA-MB-231-RFP壞死腫瘤區(qū)中的特異性蓄積
鑒于所觀察到的化合物叢的蓄積方式，對(duì)其它Bchl衍生物進(jìn)行了測(cè)定。監(jiān)測(cè)了 化合物M的蓄積方式，并獲得類似結(jié)果。藥物注射后9天切離腫瘤的結(jié)果見(jiàn)圖30A-30F。 采用如上所述的Xenogen IVIS 系統(tǒng)拍攝圖像。如圖30F中所見(jiàn)，藥物注射后9天，藥物清 晰存在于壞死腫瘤區(qū)。在全部研究動(dòng)物中觀察到這些結(jié)果(N = ； )。當(dāng)在藥物注射后3天 和5天切離腫瘤時(shí)，也觀察到類似結(jié)果(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)N = 3)。
實(shí)施例13.化合物叢在MLS-mBanana壞死腫瘤區(qū)中的特異性蓄積
在MDA-MB-231-RFP腫瘤的壞死區(qū)中觀察到的化合物Π和化合物M的蓄積，為研 究這種現(xiàn)象的普遍性及其在療法和成像中的可能應(yīng)用提供了動(dòng)力。因此，使用不同類型的 腫瘤-MLS-mBanana人卵巢癌。這里結(jié)果有些不同。在大多數(shù)情況下，該腫瘤類型的壞死方 式不是中心性的，也就是說(shuō)，存在廣泛彌散性壞死，它不是特別局限于腫瘤中部或從腫瘤的 一個(gè)部位產(chǎn)生。在這些情況下，蓄積并不如此長(zhǎng)久。在觀察到中心性壞死的幾個(gè)病例中，蓄 積方式與MDA-MB-231-RFP腫瘤中的相似。圖31-32表示藥物注射后7天所獲得的結(jié)果。正 如所見(jiàn)，當(dāng)觀察到中心性壞死時(shí)，藥物清晰地存在于腫瘤的壞死區(qū)(圖31F)當(dāng)無(wú)中心性壞 死時(shí)，則不存在(圖32F)。
實(shí)施例14.壞死腫瘤的切離腫瘤圖像和組織切片
切離MDA-MB-231-RFP壞死腫瘤，將腫瘤的組織切片染色(蘇木精和伊紅(H&E))。 圖33A-33D表示藥物注射4小時(shí)后切離的有活力腫瘤和壞死腫瘤區(qū)的組織切片。這些觀察 結(jié)果可補(bǔ)充之前所獲得的RFP和化合物Π組織分布成像。如圖33Α中所見(jiàn)，大部分質(zhì)量由 不透明黃褐色壞死組織組成。從圖33Β中可見(jiàn)，可注意肉眼可見(jiàn)特征和顯微鏡可見(jiàn)特征之間的關(guān)系。壞死組織在中部是嗜酸性到高嗜酸性的,具有廣泛的核溶解及較少的核固縮和 核裂。有輕微多病灶嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)至壞死組織，大部分在壞死區(qū)邊緣。有活力區(qū)域限 于腫瘤外圍。它們由無(wú)序增殖的瘤細(xì)胞組成，排列成密集的細(xì)胞層(圖33D)。瘤細(xì)胞為圓 形變?yōu)椴灰?guī)則，具有高核質(zhì)比和不規(guī)則泡狀核。對(duì)于有活力和壞死區(qū)兩者，注射后4小時(shí)化 合物叢的熒光令人滿意地與組織學(xué)結(jié)果一致(圖25F)。對(duì)于所研究的壞死腫瘤，包括沒(méi)有 注射藥物的對(duì)照腫瘤，都獲得相似關(guān)聯(lián)性。
實(shí)施例15.使用化合物旦進(jìn)行體內(nèi)PDT研究
一般來(lái)講，對(duì)于體內(nèi)PDT研究，如上所述將將熒光MDA-MB-231-RFP乳腺癌細(xì)胞 或MLS-mBanana卵巢癌細(xì)胞經(jīng)皮下接種到雌性小鼠背部或乳房脂墊，使之生長(zhǎng)至壞死 (彡Icm3)或無(wú)壞死(約0. 5cm3)大小，來(lái)產(chǎn)生小鼠腫瘤模型。以7. 5_1 ^igAg之間的不同 濃度，經(jīng)靜脈內(nèi)給麻醉小鼠注射藥物。照射腫瘤10分鐘或30分鐘，藥物光照間隔為藥物注 射后4-M小時(shí)之間。
為了獲得最佳治療條件，采用幾個(gè)方案研究化合物對(duì)CD-I裸小鼠中的 MDA-MB-231-RFP腫瘤的作用，結(jié)果概括于表1。
如表1中所見(jiàn)，似乎對(duì)于壞死和無(wú)壞死腫瘤兩者，7. 5mg藥物/kg體重和10分鐘照 射提供最佳光動(dòng)力治療結(jié)果。圖34A-34B中所示結(jié)果表明完全治愈無(wú)壞死MDA-MB-231-RFP 腫瘤。治療后1天檢查出水腫，接著是輕微壞死，然后在4天后為更大規(guī)模的壞死。到第7 天，觀察到腫瘤變平(flattering)。PDT后90天傷口愈合，動(dòng)物被治愈。如之前RFP熒光中所述，使用fenogen IVIS 系統(tǒng)，同樣對(duì)結(jié)果進(jìn)行了研究。90天后，沒(méi)有腫瘤熒光信號(hào)。
權(quán)利要求
1.含RGD的肽或RGD肽模擬物與葉綠素或細(xì)菌葉綠素光敏劑的綴合物在微創(chuàng)腫瘤靶向 成像、腫瘤靶向光動(dòng)力療法(PDT)和/或壞死腫瘤的在線預(yù)后中的用途，其中所述光敏劑是 下式I、式II或式III的葉綠素或細(xì)菌葉綠素及其藥學(xué)上可接受的鹽和旋光異構(gòu)體
2.權(quán)利要求1的用途，其中任何C1-C25烴基為C1-C25,優(yōu)選C1-Cltl，更優(yōu)選C2-C3的烷基、 烯基或炔基。
3.權(quán)利要求1的用途，其中在7-8位上的所述虛線表示雙鍵，所述光敏劑是式I、式II 或式III的葉綠素。
4.權(quán)利要求1的用途，其中在7-8位上的所述虛線不存在，且所述光敏劑為式I、式II 或式III的細(xì)菌葉綠素。
5.權(quán)利要求1的用途，其中每個(gè)R4獨(dú)立地為乙?；⒁蚁┗?、乙基或1-羥基乙基原子 團(tuán)或所述1-羥基乙基原子團(tuán)的醚或酯。
6.權(quán)利要求1的用途，其中所述光敏劑選自⑴式I或式II的細(xì)菌葉綠素，其中在3 位上的R4為乙?；?位上的R4為乙基，R’ 4為甲基，7-8位被氫化，或(ii)式I或式II的葉綠素，其中在3位上的R4為乙烯基，在8位上的R4為乙基，R’ 4為甲基，在7-8位上有 雙鍵。
7.權(quán)利要求6的用途，其中所述葉綠素或細(xì)菌葉綠素含有至少一個(gè)選自以下的帶負(fù)電 荷的基團(tuán)C00_、C0S_、S03_或P032_或至少一個(gè)選自以下的在生理PH下轉(zhuǎn)化成帶負(fù)電荷的基 團(tuán)的酸性基團(tuán)C00H、COSH、SO3H或PO3H2，或它們的鹽。
8.權(quán)利要求7的用途，其中所述葉綠素或細(xì)菌葉綠素為式II的葉綠素或細(xì)菌葉綠素， R6為-NR9R' 9，其中&為H，且R’ 9為被SO3H或其堿性鹽取代的C1-C10烷基。
9.權(quán)利要求8 的用途，其中 & 為-NH- (CH2) 2-S03K 或-NH- (CH2) 3_S03K。
10.權(quán)利要求1的用途，其中所述式I、式II或式III的葉綠素或細(xì)菌葉綠素 含有至少一個(gè)帶正電荷的基團(tuán)，其選自輸、基團(tuán)或衍生自選自以下含N基團(tuán)的陽(yáng)離 子:-N+ (RR，R”)、- (R) N-N+ (RR，R”)、0 — N+ (RR，) -、> C = N+ (RR，)、-C ( = NRR) -N+RR' R” 和-(R)N-C( = NR)-N+RR' R”基團(tuán)，其中R、R，和R”各自獨(dú)立地為H、烴基或雜環(huán)基，或者R、 R’和R”中的兩個(gè)與它們所連接的N原子一起形成3-7元飽和環(huán)，其任選含有一個(gè)或多個(gè)選 自0、S或N的雜原子且任選在另外的N原子上被進(jìn)一步取代，所述陽(yáng)離子為端基或位于烷 基鏈內(nèi)的基團(tuán)。
11.權(quán)利要求10的用途，其中所述陽(yáng)離子是式-N+(RR’R”)的銨基團(tuán)，其中R、R’和R” 中的每一個(gè)獨(dú)立地為H、烴基或雜環(huán)基，或者R、R’和R”中的兩個(gè)與N原子一起形成3-7元 飽和環(huán)，其任選含有0、S或N原子且任選在另外的N原子上被進(jìn)一步取代，所述環(huán)選自氮雜 環(huán)丙烷、吡咯烷、哌啶、嗎啉、硫代嗎啉、氮雜草或哌嗪，其在額外N原子上被C1-C6烷基任選 取代，所述C1-C6烷基被商素、羥基或氨基任選取代。
12.權(quán)利要求10的用途，其中所述帶正電荷的基團(tuán)是衍生自含有一個(gè)或多個(gè)N原子和任選0或S原子的雜芳族化合物的陽(yáng)離子，所述陽(yáng)離子選自吡唑_、咪唑輸、Ig唑銀、噻唑鏘、批啶錨、喹啉鏘、異喹啉錨、嘧啶鏘、I，2，4-三嗪錨、I，3，5-三嗪鐠和嘌呤錨。
13.權(quán)利要求10的用途，其中所述鏘基團(tuán)選自-0+(RR，)、-S+(RR，)、-k+(RR，)、-Te+(RR ，)、-P+(RR，R”)、-As+(RR，R”)、-Sb+(RR，R”)和-Bi+(RR，R”)，其中 R、R，和 R”各自獨(dú)立地為H、烴基或雜環(huán)基。
14.權(quán)利要求1的用途，含有至少一個(gè)在生理?xiàng)l件下轉(zhuǎn)變?yōu)閹д姾傻幕?團(tuán)的堿性基團(tuán)，所述堿性基團(tuán)為端基或烷基鏈內(nèi)的基團(tuán)，并且選自_NRR’、-C(= NR) -NR，R，，-NR-NR' R，，、- (R) N-C ( = NR) -NR，R，，、0 — NR-或〉C = NR，其中 R、R，禾口 R，，中 的每一個(gè)獨(dú)立地為H、任選取代的烴基或雜環(huán)基，或者R、R’和R”中的兩個(gè)與N原子一起形 成3-7元飽和環(huán)，其任選含有0、S或N原子且任選在另外的N原子上被進(jìn)一步取代，或者所 述堿性基團(tuán)為含N雜芳族原子團(tuán)。
15.權(quán)利要求14的用途，其中所述3-7元飽和環(huán)選自氮雜環(huán)丙烷、吡咯烷、哌啶、嗎啉、 硫代嗎啉、氮雜草或哌嗪，其在額外的N原子上被C1-C6烷基任選取代，所述C1-C6烷基被鹵 素、羥基或氨基任選取代，所述含N雜芳族原子團(tuán)為吡唑基、咪唑基、碟唑基、噻唑基、吡啶 基、喹啉基、異喹啉基、嘧啶基、1，2，4-三嗪基、1，3，5-三嗪基或嘌呤基。
16.權(quán)利要求15的用途，其中所述光敏劑為式II的葉綠素或細(xì)菌葉綠素，&為堿性基 團(tuán)-NR9R' 9，其中&為H，R’ 9為被堿性基團(tuán)-NRR’或-NH-(CH2) 2_6_NRR’取代的C1-C6烷基，其中R和R’各自獨(dú)立地為H、被NH2任選取代的C1-C6烷基，或者R和R’與N原子一起形成 5-6元飽和環(huán)，其任選含有0或N原子且任選在另外的N原子上被_(CH2)2_6-NH2進(jìn)一步取 代。
17.權(quán)利要求16的用途，其中所述光敏劑為式II的細(xì)菌葉綠素，Ii6S-NH-(CH2)3-NH-( CH2) 3-NH2、-NH- (CH2) 2-l-嗎啉代或-NH- (CH2) 3_ 哌嗪子基-(CH2) 3_NH2。
18.權(quán)利要求1的用途，其中所述光敏劑為式II的葉綠素或細(xì)菌葉綠素，R1和&一起 形成包含RGD肽或RGD肽模擬物的環(huán)。
19.權(quán)利要求1的用途，其中所述光敏劑為式III的葉綠素或細(xì)菌葉綠素，X為-NR7,R7 為-NRR’，R為H，R’為被SO3-或其堿性鹽取代的C2_6_烷基。
20.權(quán)利要求19的用途，其中所述光敏劑為式III的細(xì)菌葉綠素，X為-NR7，且R7 為-NH-(CH2) 3-S03K。
21.權(quán)利要求1的用途，其中M為2H或選自Pd、Mn或Cu的金屬，優(yōu)選式I、式II或式 III的細(xì)菌葉綠素，更優(yōu)選式II的細(xì)菌葉綠素，其中M為2H、Pd或Cu。
22.權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)的用途，其中含RGD的肽為由4-100個(gè)、優(yōu)選5-50個(gè)、5-30 個(gè)、5-20個(gè)、更優(yōu)選5-10個(gè)天然氨基酸、修飾天然氨基酸或非天然氨基酸組成的全L、全D 或L，D-線性肽或環(huán)肽。
23.權(quán)利要求22的用途，其中天然氨基酸選自Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、His、Gln、Glu、 Gly, lie、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr 和 Val，所述修飾包括 D-修飾、氨基端 基團(tuán)或賴氨酸游離氨基的烷基化或?；?、羧端基團(tuán)或天冬氨酸或谷氨酸游離羧基的酯化或 酰胺化以及絲氨酸或酪氨酸游離羥基的醚化或酯化。
24.權(quán)利要求23的用途，其中所述含RGD的肽為環(huán)肽。
25.權(quán)利要求M的用途，其中所述環(huán)肽選自C(RGDfK)(SEQ IDNO 1)，其中f表示 D-Phe ；c (RGDK) (SEQ ID NO 3) ；c (RGDf-n (Me) K) (SEQ ID NO :4) ；c (RGDyK) (SEQ ID NO :5)， 其中 y 為 D-Tyr ；或者 CDCRGDCGC (SEQ ID NO :9)；優(yōu)選五肽 c (RGDfK)。
26.權(quán)利要求23的用途，其中含RGD的肽為選自以下的環(huán)肽六肽GRGDSP(SEQ ID NO 6)、七肽 GRGDSPK (SEQ ID NO 7)或 25 聚物(GRGDSP) 4K (SEQ ID NO :8)。
27.權(quán)利要求1的用途，其中所述綴合物選自本文亦稱為c(RGDfK)-2H-MLT的化合物 叢、本文亦稱為c (RGDfK) -Pd-MLT的化合物M。
28.權(quán)利要求1的用途，其中所述腫瘤是具有壞死區(qū)的原發(fā)瘤或轉(zhuǎn)移瘤。
29.權(quán)利要求27的用途，其中所述腫瘤是含有壞死區(qū)的原發(fā)瘤或轉(zhuǎn)移瘤，其選自黑素 瘤、前列腺、腦、結(jié)腸、卵巢、乳腺、結(jié)腸直腸、頭頸部、由乳腺癌引起的胸壁腫瘤、皮膚、肺、食 道和膀胱癌和腫瘤。
30.權(quán)利要求觀的用途，其中所述腫瘤是局部乳腺癌，尤其是原位管癌(DCIS)。
31.一種用于通過(guò)動(dòng)態(tài)熒光成像對(duì)包含壞死區(qū)的腫瘤成像方法，所述方法包括(a)給予疑似患有帶有壞死區(qū)的腫瘤的受治療者權(quán)利要求1中限定的綴合物，其中M為 2H或選自Pd和Si的金屬；(b)在給予綴合物后至少24-48小時(shí)的時(shí)間內(nèi)以1-8小時(shí)的時(shí)間間隔照射受治療者并 測(cè)定可疑區(qū)域的熒光，其中在M-48小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間后顯示熒光的區(qū)域表明存在所述壞死 腫瘤區(qū)。
32.權(quán)利要求30的方法，其中所述綴合物是化合物叢或化合物M，所述腫瘤是乳腺腫 瘤或卵巢腫瘤，并且在藥物注射后3-8天壞死區(qū)顯現(xiàn)。
33.一種用于通過(guò)放射性診斷技術(shù)診斷包含壞死區(qū)的腫瘤的方法，所述方法包括(a)給予疑似患有腫瘤的受治療者權(quán)利要求1中限定的綴合物，其中M為選自以下的放 射性同位素:64Cu,67Cu,99fflTc,67Ga,201Tl,195Pt^60Co,111In 或 51Cr ；(b)在給予綴合物后至少M(fèi)-48小時(shí)的時(shí)間內(nèi)以1-8小時(shí)的時(shí)間間隔用成像掃描儀對(duì) 受治療者進(jìn)行掃描，并測(cè)定可疑區(qū)域的放射水平，其中在M-48小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間后表現(xiàn)放 射性的區(qū)域表明存在所述壞死腫瘤區(qū)。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述放射性診斷技術(shù)是正電子發(fā)射斷層攝影術(shù)(PET)，且 M 為 64Cu 或 67Cu。
35.權(quán)利要求33的方法，其中所述放射性診斷技術(shù)是單光子發(fā)射斷層攝影術(shù)(SPET)， 且M為選自以下的放射性同位素:99mTc,67Ga,195Pt,111In^51Cr和60Coo
36.一種用于診斷包含壞死區(qū)的腫瘤的分子核磁共振成像(MRI)方法，所述方法包括 以下步驟(a)給予疑似患有腫瘤的受治療者權(quán)利要求1的綴合物，其中M為選自以下的順磁金 屬:Mn3\ Cu2+、Fe3+、Eu3+、Gd3+ 或 Dy3+ ；和(b)通過(guò)在所述給藥之前(零時(shí))在患者體內(nèi)產(chǎn)生目標(biāo)靶區(qū)的至少一幅MR圖像以及 在所述給藥之后至少M(fèi)-48小時(shí)、優(yōu)選96小時(shí)在第二個(gè)或更多個(gè)時(shí)間點(diǎn)上產(chǎn)生一幅或多幅 MR圖像對(duì)患者進(jìn)行核磁共振成像；(c)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析以診斷所述壞死腫瘤區(qū)存在與否。
37.一種用于在手術(shù)前對(duì)腫瘤邊緣作圖的方法，所述方法包括給予有需要的受治療者 權(quán)利要求1中限定的綴合物，并在給予所述綴合物后頭2-M小時(shí)使腫瘤邊緣優(yōu)選乳腺腫瘤 邊緣成像。
38.一種用于局部乳腺癌、尤其原位管癌(DCIQ的微創(chuàng)治療、檢測(cè)和預(yù)后策略，所述策 略包括(i)給予受治療者權(quán)利要求1中限定的綴合物，優(yōu)選在壞死腫瘤區(qū)中特異性歸巢和 蓄積的RGD-Bchl衍生物，(ii)通過(guò)權(quán)利要求31-37中任一項(xiàng)的方法對(duì)用RGD-BChl衍生物 治療的受治療者進(jìn)行腫瘤靶向成像，以實(shí)現(xiàn)高精度腫瘤檢測(cè)和腫瘤邊緣界定以及通過(guò)MRI、 熒光和PET SCAN方法預(yù)后；和(iii)對(duì)于局部壞死區(qū)進(jìn)行腫瘤靶向光動(dòng)力療法(PCT)以進(jìn) 行保乳和重塑。
全文摘要
本發(fā)明提供與非壞死腫瘤區(qū)相比在壞死腫瘤區(qū)歸巢和蓄積長(zhǎng)久得多的RGD-葉綠素和RGD-細(xì)菌葉綠素綴合物，其用于微創(chuàng)腫瘤靶向成像、腫瘤靶向光動(dòng)力療法和/或壞死腫瘤的在線預(yù)后。
文檔編號(hào)A61K51/04GK102036684SQ200980115901
公開(kāi)日2011年4月27日 申請(qǐng)日期2009年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月27日
發(fā)明者A·舍茨, L·戈?duì)柕轮x德, Y·薩洛蒙 申請(qǐng)人:耶達(dá)研究及發(fā)展有限公司