專利名稱：新型可溶性cd83多肽、制劑及使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新型可溶性CD83(sCD83)多肽和編碼該多肽的核酸、改良的(sCD83) 制劑，以及該蛋白質(zhì)和制劑在治療或預(yù)防變態(tài)反應(yīng)、自身免疫性疾病和移植排斥中的用途。
背景技術(shù)：
CD83為來自蛋白質(zhì)的免疫球蛋白(“Ig”)超家族的分子(參見例如Zhou等人 (1999) J. Immunol. 149 :735_742 ；還參見美國專利 No. 7，169，898 ；綜述參見 Fujimoto 和 Tedder ((2006) J. Med. Dent. Sci. 53 :86_91)。CD83作為成熟樹突細(xì)胞的差示標(biāo)記物。盡管 CD83的確切功能還有待確定，但已報導(dǎo)可溶形式的CD83結(jié)合未成熟和成熟樹突細(xì)胞兩者 (參見Lechmann等人(2001) (J. Exp. Med. 194:1813-1821))。作者還報導(dǎo)，該蛋白質(zhì)降低在 體外成熟的樹突細(xì)胞的CD80和CD83表達，且其在體外抑制樹突細(xì)胞刺激T細(xì)胞的能力(還 參見 Lechmann 等人(2002) Trends in Immunology 23 :273_275)。同樣，Kruse 等人(2000) (J. Exp. Med. 191 1581-1589)報導(dǎo) GC7 (N(I)-脒基-1，7-二氨基庚烷)干擾 CD83mRNA 的核 質(zhì)易位，從而阻止⑶83的表面表達和顯著抑制這些DC對T淋巴細(xì)胞的激活。其他人還報 導(dǎo)了體內(nèi)可溶形式的CD83的存在(參見例如Hock等人(2002) Int. Immunol. 13 :959_967)。 用HSV-I-感染的DC進行的研究表明，病毒感染導(dǎo)致CD83降解，并抑制CD83mRNA的轉(zhuǎn)運； 通過HSV-I的該可能的逃避機理進一步支持⑶83對DC生物學(xué)的重要性(參見例如Kruse 等人(2000) J. Virol. 74 :7127_7136)。成熟的CD83包括三個結(jié)構(gòu)域胞外Ig樣結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。人 ⑶83胞外結(jié)構(gòu)域(h⑶83ext，s⑶83的一種形式)包含由至少兩個外顯子編碼的單個Ig樣 (V型)結(jié)構(gòu)域(參見例如 Zhou等人(1999) J. Immunol. 149 :735_742 ；GenBank ID#Z11697)， 且在成熟的樹突細(xì)胞(“mDC”)的細(xì)胞表面上強烈表達。美國專利No. 7，169，898 公開了人 CD83 (hCD83) cDNA 的核酸序列(SEQ ID NO :1)。 全長h⑶83所對應(yīng)的氨基酸序列示于SEQ ID N0:2。SEQ ID NO :2的氨基酸殘基1_19對應(yīng)信 號序列，其從成熟蛋白質(zhì)(氨基酸殘基20-205)中切割出來。hCD83胞外結(jié)構(gòu)域(hCD83ext) 由SEQ ID N0:3編碼。對應(yīng)的hCD83ext氨基酸序列示于SEQ ID NO :4，同時也是SEQ ID NO 2的氨基酸殘基20-144?？缒そY(jié)構(gòu)域和細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域分別對應(yīng)SEQ IDNO 2的氨基酸殘 基145-166和SEQ ID NO 2的氨基酸殘基167-205。野生型hCD83ext包含3個糖基化位點 (即SEQ ID NO 4的氨基酸殘基60、77和98)和5個半胱氨酸殘基(即SEQ ID NO 2的氨 基酸殘基27、35、100、107和129，其對應(yīng)SEQ ID NO :4的氨基酸殘基8、16、81、88和110)。hCD83ext 抑制 DC 介導(dǎo)的 T 細(xì)胞刺激(Lechmann 等人 J. Exp. Med. (2001) 194 1813-1821)，并對治療多發(fā)性硬化癥的小鼠模型有效(實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)； Zinser等人(2004) J. Exp. Med. 200 :345_351)。這些研究使用hCD83胞外結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域 另外還包含在蛋白質(zhì)氨基末端的凝血酶切割位點的4氨基酸部分(Gly-Ser-Pro-Gly ；SEQ ID NO 41)和跨膜結(jié)構(gòu)域的第一個氨基酸(lie)，并且示于SEQ ID NO :5。PCT公布W02004/046182公開了可溶性CD83突變體，其中SEQ ID NO 5的第5個
4半胱氨酸殘基從半胱氨酸突變?yōu)榻z氨酸，以產(chǎn)生SEQ ID N0:6(以下稱為h⑶83ext-m5)， 并提議在治療自身免疫性疾病(如多發(fā)性硬化癥)和移植中使用hCD83eXt-m5和野生型 hCD83ext。Zinser 等人(Immunobiology (2006) 211 :449_453)公開了 野生型 hCD83ext 形 成同型二聚體，借此胞外結(jié)構(gòu)域的前4個半胱氨酸(即SEQ ID NO 2的氨基酸殘基27、35、 100和107，其對應(yīng)SEQ ID NO :5和NO :6的氨基酸殘基12、20、85和92)參與分子內(nèi)二硫鍵 的形成，且第5個半胱氨酸(即SEQ IDNO 1的氨基酸殘基129或SEQ ID NO 5和NO 6的 氨基酸殘基114)決定同型二聚體的分子間橋連。Zinser等人還公開了兩個h⑶83ext同 種型(即野生型二聚體和hCD83ext-m5突變單體)在體外測試中具有相似的抑制能力，且 兩個h⑶83ext同種型的生物學(xué)(體內(nèi))半衰期類似，為2-3小時。此外，通過使用EAE模 型，Zinser等人公開了可溶性⑶83的單體突變體同種型(即h⑶83ext_m5)與二聚體野生 型hCD83ext同種型具有相似的體內(nèi)抑制活性?？紤]到sCD83的重要的治療應(yīng)用，本申請人認(rèn)識到需要用于治療或預(yù)防不希望的 免疫應(yīng)答(例如自身免疫性疾病、變態(tài)反應(yīng)和移植排斥)的改良的SCD83多肽及其制劑。本 發(fā)明滿足了該需求，并提供了其他優(yōu)勢。序列表簡述SEQ ID NO 1表示包含信號序列的編碼全長人⑶83蛋白質(zhì)的cDNA。SEQ ID NO 2表示包含信號序列的編碼全長人⑶83蛋白質(zhì)的氨基酸序列。SEQ ID NO 3表示編碼人CD83胞外結(jié)構(gòu)域(hCD83ext)的氨基酸序列的cDNA。SEQ ID NO 4表示人CD83胞外結(jié)構(gòu)域(hCD83ext)的氨基酸序列。SEQ ID NO 5表示在氨基末端還包含氨基酸殘基(Gly-Ser-Pro-Gly ；SEQ ID NO 41)和在羧基末端還包含跨膜結(jié)構(gòu)域的第一個氨基酸(Ile)的人CD83胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸 序列。SEQ ID NO 6表示其中在位置114的第5個半胱氨酸已突變?yōu)榻z氨酸殘基的SEQ ID NO 5的變體。SEQ IDSEQ ID
切割位點隔開。SEQ ID
結(jié)構(gòu)域。SEQIDSEQIDSEQIDSEQIDSEQIDSEQIDSEQIDSEQIDSEQIDSEQID
5
NO 7表示其中殘基Xaa表示任何氨基酸的SEQ ID NO 5的變體。
NO 8表示GST-hCD83ext融合蛋白。GST和hCD83ext結(jié)構(gòu)域通過凝血酶
NO :9表示還包含跨膜結(jié)構(gòu)域的第一個氨基酸(Ile)的野生型h⑶83胞外
NO 10表示編碼SEQ ID NO 9的m5 C2S突變體的DNA。
NO 11 表示 SEQ ID NO 9 的 m5 C2S 突變體。
NO 12表示編碼SEQ ID NO 9的m2 C2S突變體的DNA。
NO 13 表示 SEQ ID NO 9 的 m2C2S 突變體。
NO 14表示編碼SEQ ID NO 9的m3 C2S突變體的DNA。
NO 15 表示 SEQ ID NO 9 的 m3C2S 突變體。
NO 16表示編碼SEQ ID NO 9的m4 C2S突變體。
NO 17 表示 SEQ ID NO 9 的 m4 C2S 突變體。
NO 18表示編碼SEQ ID NO 9的m2，3 C2S突變體的DNA。
NO 19 表示 SEQ ID NO 9 的 m2，3 C2S 突變體。
SEQIDNO20表示編碼SEQ ID NO 9的m3，4 C2S突變體的DNA。
SEQIDNO21 表示 SEQ ID NO 9 的 m3，4 C2S 突變體。
SEQIDNO22表示編碼SEQ ID NO :9的m2，5 C2S突變體的DNA。
SEQIDNO23 表示 SEQ ID NO 9 的 m2，5 C2S 突變體。
SEQIDNO24表示編碼SEQ ID NO :9的m3，5 C2S突變體的DNA。
SEQIDNO25 表示 SEQ ID NO 9 的 m3，5 C2S 突變體。
SEQIDNO26表示編碼SEQ ID NO :9的m4，5 C2S突變體的DNA。
SEQIDNO27 表示 SEQ ID NO 9 的 m4, 5 C2S 突變體。
SEQIDNO28表示編碼SEQ ID NO :9的m2，3，5 C2S突變體的DNA。
SEQIDNO: 表示 SEQ ID N0:9 的 m2，3，5 C2S 突變體。
SEQIDNO30表示編碼SEQ ID NO :9的m3，4，5 C2S突變體的DNA。
SEQIDNO:31 表示 SEQ ID N0:9&m3，4，5 C2S 突變體。
SEQIDNO:32表示用于在SEQ ID NO :9的第2個半胱氨酸上進行C2S誘變的引物。
SEQ ID NO 33表示用于在SEQ ID NO 9的第3個半胱氨酸上進行C2S誘變的引 物。
SEQ ID NO :；34表示用于在SEQ IDNO :9的第四個半胱氨酸上進行C2S誘變的引物。
SEQ ID NO :；35表示來自Pan trogloytes (黑猩猩)的CD83蛋白質(zhì)，且對應(yīng)NCBI 參考序列XP_518M8. 2。
SEQ ID NO :36 表示來自 Canis lupus famiIiaris (狗)的 CD83 蛋白質(zhì)，且對應(yīng) NCBI 參考序列XP_852647. 1。
SEQ ID NO :37表示來自Bos taurus (牛)的CD83蛋白質(zhì)，且對應(yīng)NCBI參考序列 ΝΡ_001040055. 1。
SEQ ID NO :38表示來自Mus musculus (小鼠)的CD83蛋白質(zhì)，且對應(yīng)NCBI參考 序列NP_033986. 1。
SEQ ID NO :39表示來自Rattus norvegicus (挪威大鼠)的CD83蛋白質(zhì)，且對應(yīng) NCBI 參考序列XP_341510. 2。
SEQ ID NO :40表示來自Gallus gallus (紅原雞)的CD83蛋白質(zhì)，且對應(yīng)NCBI參 考序列XP_418^. 1。
SEQ ID NO :41 對應(yīng) Gly-Pro-Ser-Gly。


圖1為使用選項-maxitiers 2、通過MUSCLE版本3. 6產(chǎn)生的蛋白質(zhì)序列比對 (參見 Edgar RC (2004) Nucleic Acids Res 32(5) :1792-7)。NP_00424. 1 (SEQ ID NO :2) 為人 CD83 蛋白質(zhì)(SEQ ID NO :2)。XP_518248. 2 為黑猩猩 CD83 蛋白質(zhì)(SEQ ID NO :35)。 XP_852647. 1 為狗 CD83 蛋白質(zhì)(SEQ ID NO :37)。NP_001040055. 1 為牛 CD83 (SEQIDN0 37)。NP_033986. 1 為小鼠 CD83 (SEQ ID NO :38)。XP_341510. 2 為大鼠 CD83 (SEQIDN0 :39)。 XP_41829. 1為紅原雞⑶83 (SEQ ID NO :40)。加下劃線的氨基酸殘基可被任意氨基酸取代。 加下劃線和粗體氨基酸優(yōu)選可被保守氨基酸取代。未加下劃線的氨基酸殘基為未取代的。6
圖2為質(zhì)粒pGEX2HiCD83ext的示意圖。
圖3顯示使用80 (泳道2)、40 (泳道3)、20 (泳道4)、10 (泳道5_8)或5 (泳道9_13) U/mL的凝血酶在柱上進行凝血酶切割GST-h⑶83ext后，被洗脫的級分的SDS-PAGE解析圖。 泳道7和8顯示用10U/mL凝血酶消化和谷胱甘肽洗脫后獲得的GST級分。泳道11-13顯 示用5U/mL凝血酶消化和谷胱甘肽洗脫后獲得的GST級分。泳道1 分子量標(biāo)記。凝血酶 (Sigma)中存在的污染物蛋白質(zhì)示于虛線框內(nèi)。
圖4A顯示通過使用陰離子交換色譜法的h⑶83ext的精制(polishing)步驟的典 型的二峰色譜圖包括兩個主要的峰。圖4B顯示每個精制級分的SDS-PAGE分析。泳道2_5 表示第一個峰，泳道6-9表示第二個峰。泳道1表示上樣到陰離子交換色譜柱進行精制的 GST處理后(post-GST)樣品。請注意h⑶83ext在第一個峰中，而其他污染物蛋白質(zhì)在第 二個峰中。用硝酸銀染色凝膠。
圖5顯示使用還原SDS-PAGE和考馬斯藍染色的不同h⑶83ext樣品批次的分析。 蛋白質(zhì)樣品儲存在_20°C，并在20mM Tris、50mM NaCl、50%甘油中配制，泳道3的樣品不含 甘油。這些批次是在幾個不同的日期制成的，因此在進行分析之前已被儲存不同的時間長 度(即泳道2-10分別為4、3、3、2、10.5、9.5、6.5、6、6個月)。箭頭指示單體的位置。此外， 可以看見較高分子量的物質(zhì)，可能對應(yīng)多聚體形式。較低分子量形式對應(yīng)降解產(chǎn)物，或可能 通過非常規(guī)的分子內(nèi)二硫鍵介導(dǎo)的修飾的單體。
圖6顯示使用非還原SDS-PAGE和考馬斯藍染色的不同h⑶83ext樣品批次的分 析，且突出顯示單體和二聚體的遷移。蛋白質(zhì)樣品儲存在-20°C，并且除了不含甘油的泳道 3的樣品以外，在20mM Tris、50mM NaCl、50%甘油中配制。這些批次是在幾個不同的日期 制成的，因此在進行分析時已具有不同的“年齡”(即泳道2-10分別為4、3、3、2、10· 5,9. 5、 6. 5、6、6個月)。泳道3、6和7中的箭頭突出顯示幾種可能通過非常規(guī)分子內(nèi)二硫鍵介導(dǎo) 的不常見的h⑶83ext物質(zhì)。
圖7顯示通過(A)還原SDS-PAGE、(B)非還原SDS-PAGE和(C)Western印跡法的 hCD83ext樣品的分析。SDS凝膠用硝酸銀進行染色，以使得較高多聚合物質(zhì)(如三聚體和 四聚體)可見。通過Wfestern印跡法確定所有的這些物質(zhì)與h⑶83ext有關(guān)。
圖8為顯示來自h⑶83m-2，5的精制步驟的峰的AEC色譜圖。
圖9顯示純化的⑶83m-2，5級分的還原SDS-PAGE分析。
圖10顯示純化的⑶83m-2，5級分的非還原SDS-PAGE分析。
圖11顯示使用圓二色性(⑶)的⑶83m-2，5的光譜分析。
圖12顯示CD83m_2，5的分光熒光分析。
圖13顯示使用圓二色性的⑶83m-2的光譜分析。
圖14為顯示來自h⑶83m-3的精制步驟的峰的AEC色譜圖。
圖15顯示使用SDS-PAGE (圖15)、⑶(圖16和圖17)和分光熒光法(圖18)對純 化的⑶83m-3SDS-PAGE分析進行結(jié)構(gòu)表征，結(jié)果與野生型h⑶83ext和⑶83m_5相似。
圖16顯示使用CD，對配制在20mM Tris、50mM NaCl.pH 7. 5中的CD83m_3和野生 型CD83 (批次004-04)的光譜分析。
圖17顯示使用⑶的⑶83m-3 (配制為pH 7. 0或7. 5)的光譜分析。
圖18顯示配制為7. 0或7. 5的⑶83m_3的分光熒光分析。7
圖19顯示單體形式的h⑶83ext_m3、h⑶83ext_m5和單體和二聚體形式的野生型 hCD83ext的非還原SDS-PAGE分析。
圖20顯示單體形式的hCD83ext-m3 (m3)、hCD83ext_m5 (m5)和單體和二聚體形式 的不同日制成的三種野生型hCD83ext制劑(004_4、007和02 的非還原SDS-PAGE分析， 其經(jīng)過或未經(jīng)過NEM的預(yù)處理以防止二硫鍵的擾亂。
圖21顯示hCD83ext-m3、hCD83ext_m5和三種不同的野生型hCD8;3ext制劑的大小 排阻色譜法的結(jié)果。所有的制劑均經(jīng)過NEM處理，以防止二硫鍵的擾亂。第一個(左)峰 表示二聚體，而第二個(右)峰表示單體。
圖 22 顯示 hCD83ext-m3 (m3)、hCD83ext_m5 (m5)和三種不同的野生型 hCD8;3ext 制 劑(wt 004-4、wt 007 和 wt 023)的還原 SDS-PAGE 分析。
圖23顯示突變單體hCD83ext_m5和兩種不同的野生型hCD83ext制劑(004-4和 023)的大小排阻色譜法的結(jié)果。
圖M顯示兩種不同的h⑶83ext_m5制劑(501和502)和6種不同的野生型 hCD8;3ext 制劑(007、100、021、023、80 和 90)的非還原 SDS-PAGE 分析。
圖25顯示不同的hCD83ext_m5和野生型hCD8;3ext制劑的非還原Western印跡分 析。
圖沈顯示通過產(chǎn)生TNFa的單核細(xì)胞的百分比或通過每個細(xì)胞產(chǎn)生的TNF α的 平均量測量的，不同的野生型hCD83ext、hCD83ext-m3和hCD83ext_m5制劑通過LPS/IFN γ 刺激的靈長類PBMC來抑制TNF α的產(chǎn)生的能力。
圖27顯示通過產(chǎn)生TNFa的單核細(xì)胞的百分比或通過每個細(xì)胞產(chǎn)生的TNF α的 平均量(MFU)測量的，野生型hCD83ext、hCD83ext-m3和hCD83ext-m5(均配制為pH7. 6)通 過LPS/IFN γ刺激的靈長類PBMC來抑制TNF α的產(chǎn)生的能力。
圖觀顯示通過產(chǎn)生TNFa的單核細(xì)胞的百分比或通過每個細(xì)胞產(chǎn)生的TNF α的 平均量(MFU)測量的，野生型hCD83ext (配置為pH 4. 5或5. 5)和hCD83ext_m5 (配置為pH 7. 6)通過LPS/IFN γ刺激的靈長類PBMC來抑制TNF α的產(chǎn)生的能力。
圖四顯示通過產(chǎn)生TNFa的單核細(xì)胞的百分比或通過每個細(xì)胞產(chǎn)生的TNF a 的平均量(MFU)測量的，野生型h⑶83ext(配置為pH 4. 5或5. 5)或突變體形式的 hCD83ext-m3 (配置為 pH 5. 5)和 hCD83ext_m5 兩種制劑(配置為 pH 7. 6)通過 LPS/IFN γ 刺激的靈長類PBMC來抑制TNF α的產(chǎn)生的能力的差異。
圖30顯示通過產(chǎn)生TNFa的單核細(xì)胞的百分比測量的，野生型h⑶83ext (批次 ARG-021，配制為pH 7. 6)和4種單體突變hCD83ext_m3 (配置為pH 4. 5或5. 5)通過LPS/ IFN γ刺激的人PBMC來抑制TNF α的產(chǎn)生的能力的差異。
圖31-35顯示通過非還原(左泳道)和還原(右泳道)SDS-PAGE分析的pH和溫 度對野生型h⑶83ext (批次021)的影響。
圖36為顯示P0D140上大鼠腎臟同種異體移植的病理分級的圖。中值分?jǐn)?shù)0 = 正常；1 =最小改變；2 =輕度改變；3 =中等改變；4 =顯著改變。
圖37為顯示P0D140上大鼠腎臟同種異體移植的免疫組織化學(xué)分級的圖。0 =正 常；1 =最小改變；2 =輕度改變；3 =中等改變；4 =顯著改變。8發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了具有改良的穩(wěn)定性的新型可溶性CD83(sCD83)多肽。一方面，提供 了分離的s⑶83多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO 7或與氨基酸序列SEQ ID NO :7具 有至少70%同一性的氨基酸序列；其中氨基酸殘基1、2、3、4和130中的一個或多個可選地 缺失，且氨基酸殘基12、20、85、92和114為表1任一排中所示的氨基酸。優(yōu)選地，氨基酸殘 基85為半胱氨酸以外的氨基酸，最優(yōu)選地，氨基酸殘基85為絲氨酸。
在另一方面，提供了分離的s⑶83多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO :7或與氨基 酸序列SEQ ID NO :7具有至少70%同一性的氨基酸序列；其中SEQ ID NO 7的氨基酸殘基 12、20、85和92中的一個或多個缺失或為半胱氨酸以外的氨基酸；且可選地，氨基酸殘基1、 2、3、4和130中的一個或多個缺失。
優(yōu)選地，分離的sCD83 多肽包含選自 SEQ ID NO 13、SEQ ID NO :15、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO :19、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :25、SEQ ID NO :27、SEQ IDNO 29和SEQ ID NO 31的氨基酸序列；其中可選地，氨基酸殘基1 缺失。
在另一方面中，提供了編碼本發(fā)明的多核苷酸的核酸以及包含該多核苷酸的載體 和細(xì)胞。該載體和細(xì)胞可用于產(chǎn)生本文公開的sCD83組合物。
本文提供的SCD83多肽可用于治療或預(yù)防受試者中不希望的免疫應(yīng)答，例如自身 免疫性疾病、移植排斥和變態(tài)反應(yīng)。因此，提供了包含新型SCD83多肽的藥物組合物，以及 使用該新型sCD83多肽組合物治療自身免疫性疾病、移植排斥和變態(tài)反應(yīng)的方法。
在再另一方面中，提供了在哺乳動物移植受體中改善移植結(jié)果的方法，包括向所 述受體施用治療有效量的前述sCD83多肽和一種或多種免疫抑制劑，其中該免疫抑制劑與 所述多肽協(xié)同作用以改善移植結(jié)果。
具體實施方式
本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，可溶性CD83(sCD83)、特別是對應(yīng)SEQ ID NO :5和SEQ ID NO: 6的h⑶83ext多肽在儲存中失去穩(wěn)定性。令人驚奇的是，據(jù)發(fā)現(xiàn)，h⑶83ext的第3個半胱 氨酸殘基的突變導(dǎo)致提高的穩(wěn)定性和類似的生物活性。該結(jié)果是意想不到的，因為如上討 論，Zinser 等人(Immunobiology (2006) 211 :449-453)公開了 h⑶83ext 形成同型二聚體， 而h⑶83ext的前4個半胱氨酸參與分子內(nèi)二硫鍵的形成。因此，根據(jù)Zinser所述，人們將 會預(yù)期，hCD83ext的前四個半胱氨酸中的每一個對維持胞外結(jié)構(gòu)域的適當(dāng)?shù)臉?gòu)型都是關(guān)鍵 的。意想不到的是，對這些半胱氨酸殘基的突變會提高穩(wěn)定性。此外，發(fā)現(xiàn)當(dāng)在低PH下、優(yōu) 選在pH 4. 0-5. 0，最優(yōu)選在pH約4. 5緩沖時，還可以進一步提高穩(wěn)定性。野生型s⑶83蛋 白質(zhì)看起來是不穩(wěn)定的，且對影響溫度、PH、脫酰胺作用和水解的條件敏感。
表1示出了在hCD83ext的5個半胱氨酸殘基中的一個或多個具有氨基酸取代的 一些本發(fā)明的新型SCD83多肽。術(shù)語“不是Cys”是指半胱氨酸以外的任意標(biāo)準(zhǔn)或非標(biāo)準(zhǔn) 的氨基酸。優(yōu)選地，半胱氨酸殘基的取代為保守取代，從而具有極性、不帶電R基團的氨基 酸(如絲氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺，和非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸硒代半胱氨酸)取 代半胱氨酸?？蛇x地，半胱氨酸殘基可以缺失，而不被取代。表1顯示SEQ ID N0:7中為半 胱氨酸殘基的取代或缺失的潛在位點的5個氨基酸位置。SEQ ID NO :7為SEQ ID NO 5的 變體，其中SEQ ID而5的5個半胱氨酸殘基(即殘基12、20、85、92和114)中的一個或多9個可缺失或被可替代的氨基酸取代。
表 1
SEQ ID NO 7的CD83ext變體的非限定性實例
權(quán)利要求
1.一種分離的s⑶83多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO 7或與氨基酸序列SEQ ID NO :7具有至少70%同一性的氨基酸序列；其中SEQ ID NO :7的氨基酸殘基12、20、85和92 中的一個或多個缺失或為半胱氨酸以外的氨基酸；且可選地，氨基酸殘基1、2、3、4和130中 的一個或多個缺失。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽，其中氨基酸殘基85為半胱氨酸以外的氨基酸殘基。
3.如權(quán)利要求2所述的多肽，其中氨基酸殘基12、20、92和114為半胱氨酸。
4.如權(quán)利要求3所述的多肽，其中氨基酸殘基85為絲氨酸。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的多肽，其中所述序列同一性為至少95%。
6.如權(quán)利要求5所述的多肽，其中所述序列同一性為100%。
7.如權(quán)利要求1所述的多肽，其由選自SEQID N0:7、SEQ ID NO :7的氨基酸殘基 1-129、SEQ ID NO 7的氨基酸殘基5-1 和SEQ ID NO 7的氨基酸殘基5-130的序列組 成。
8.如權(quán)利要求7所述的多肽，其中氨基酸殘基12、20、92和114為半胱氨酸。
9.如權(quán)利要求8所述的多肽，其中氨基酸殘基85為絲氨酸。
10.一種分離的 sCD83 多肽，其包含選自 SEQ ID NO 13,SEQ ID NO 15,SEQ ID NO: 17、 SEQ ID NO :19, SEQ ID N0:21、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :25, SEQ ID NO :27、SEQ ID NO: 29和SEQ ID NO :31的氨基酸序列；其中可選地，氨基酸殘基1 缺失。
11.一種含有權(quán)利要求1-10中任一項所述的多肽的藥物組合物。
12.—種編碼權(quán)利要求1-10中任一項所述的多肽的多核苷酸。
13.一種治療或預(yù)防哺乳動物受試者中不需要的免疫應(yīng)答的方法，包括向所述受試者 施用權(quán)利要求1-10中任一項所述的多肽。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述不希望的免疫應(yīng)答選自自身免疫性疾病、移 植排斥和變態(tài)反應(yīng)。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述自身免疫性疾病選自系統(tǒng)性紅斑狼瘡、1型糖 尿病、天皰瘡、格雷夫斯病、橋本甲狀腺炎、重癥肌無力、自體心肌炎、多發(fā)性硬化癥、類風(fēng)濕 性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、自身免疫性葡萄膜視網(wǎng)膜炎、血管炎、慢性炎性腸病、克羅恩病或潰瘍性 結(jié)腸炎、白赫鐵列夫癥、強直性脊柱炎和慢性阻塞性肺病(COPD)。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述不希望的免疫應(yīng)答為移植排斥。
17.如權(quán)利要求13-16中任一項所述的方法，其進一步包括施用環(huán)孢菌素A(CsA)；雷帕 霉素加上抗-⑶45RB單克隆抗體；和他克莫司(Π(506)加上嗎替麥考酚酯(MMF)中的一種 或多種。
18.權(quán)利要求1-10中任一項所述的多肽在制備用于治療或預(yù)防哺乳動物受試者中不 希望的免疫應(yīng)答的藥物中的用途。
19.如權(quán)利要求18所述的用途，其中所述不希望的免疫應(yīng)答選自自身免疫性疾病、移 植排斥和變態(tài)反應(yīng)。
20.如權(quán)利要求19所述的用途，其中所述自身免疫性疾病選自系統(tǒng)性紅斑狼瘡、1型糖 尿病、天皰瘡、格雷夫斯病、橋本甲狀腺炎、重癥肌無力、自體心肌炎、多發(fā)性硬化癥、類風(fēng)濕 性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、自身免疫性葡萄膜視網(wǎng)膜炎、血管炎、慢性炎性腸病、克羅恩病或潰瘍性 結(jié)腸炎、白赫鐵列夫癥、強直性脊柱炎和慢性阻塞性肺病(COPD)。
21.一種改善哺乳動物移植受體中移植結(jié)果的方法，其包括向所述受體施用治療有效 量的權(quán)利要求1-10中任一項所述的多肽和一種或多種免疫抑制劑，其中所述免疫抑制劑 與所述多肽協(xié)同作用以改善移植結(jié)果。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述免疫抑制劑為環(huán)孢菌素A。
23.如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述免疫抑制劑為雷帕霉素加上抗-CD45RB單克 隆抗體；或他克莫司(Π(506)加上嗎替麥考酚酯(MMF)。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于治療或預(yù)防不希望的免疫應(yīng)答的組合物和方法。該組合物涉及新型可溶性CD83(sCD83)多肽和編碼該多肽的核酸、改良的(sCD83)制劑，以及該多肽和制劑在治療或預(yù)防變態(tài)反應(yīng)、自身免疫性疾病和移植排斥中的用途。本發(fā)明提供了包含SEQ ID NO7或與SEQ ID NO7具有至少70％同一性的氨基酸序列的sCD83多肽；其中，SEQ ID NO7的氨基酸殘基12、20、85和92中的一個或多個為半胱氨酸以外的氨基酸；且可選地，氨基酸殘基1、2、3、4和130中的一個或多個缺失。
文檔編號A61K48/00GK102036690SQ200980118634
公開日2011年4月27日 申請日期2009年5月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月23日
發(fā)明者C-H·周, M·莫-楊, S·布蘭德 申請人:阿哥斯醫(yī)療公司