專利名稱：在皮膚傷口愈合中使用干細(xì)胞的組合物和方法
在皮膚傷口愈合中使用干細(xì)胞的組合物和方法相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求于2008年3月27日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)序列號(hào)61/039，941的 優(yōu)先權(quán)的權(quán)益，該申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用方式并入本文。發(fā)明領(lǐng)域本申請(qǐng)與制備和使用干細(xì)胞用于傷口愈合應(yīng)用的組合物和方法相關(guān)。背景慢性傷口仍是難以應(yīng)對(duì)的挑戰(zhàn)。盡管近期重組生長(zhǎng)因子和生物工程化皮膚方面取 得一定突破，但還有高達(dá)50%的慢性傷口用一年多的時(shí)間仍保持對(duì)治療的抗性。纖維蛋白封閉劑是一種外科手術(shù)式“膠水”，由人體的凝血蛋白制成，通常用于 在手術(shù)過(guò)程中控制出血。纖維蛋白封閉劑已被用于增強(qiáng)止血效果、封合組織、協(xié)助靶向給 藥，以及傷口治療。見(jiàn)如，美國(guó)專利公開(kāi)號(hào)2008/0181879、2008/0199513、2004/0229333和 2006/0M0555，以上文獻(xiàn)以引用方式并入本文。雖然，過(guò)去幾年，我們?cè)谥委熾y愈性傷口方 面已取得一定進(jìn)步，但先進(jìn)的治療手段對(duì)于相當(dāng)一部分(高達(dá)50慢性傷口，特別是持續(xù) 超過(guò)一年的傷口，仍不起作用。因此，仍需刺激急性和慢性傷口的愈合，達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理措施 或最近研發(fā)創(chuàng)新方法目前不能達(dá)到的水平。概要本發(fā)明提供了使用纖維蛋白封閉劑及其給藥系統(tǒng)的組合物和方法，其中纖維蛋白 封閉劑包括干/祖細(xì)胞。根據(jù)某些實(shí)施方式，本發(fā)明提供了在傷口患處局部施用纖維蛋白 封閉劑的方法，其中，纖維蛋白封閉劑由纖維蛋白原復(fù)合體成分、凝血酶成分及細(xì)胞成分的 混合物制成。根據(jù)某些實(shí)施方式，細(xì)胞成分包含一種或更多種的干/祖細(xì)胞(如間充質(zhì)干 細(xì)胞或外周血干細(xì)胞)和/或遺傳修飾干細(xì)胞。根據(jù)某些實(shí)施方式，細(xì)胞成分可能包含干 /祖細(xì)胞的混合物。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方式，纖維蛋白封閉劑包含至少1.5-2.0 X IO6個(gè)干/祖 細(xì)胞/每平方厘米。根據(jù)某些實(shí)施方式，纖維蛋白封閉劑通過(guò)將纖維蛋白原復(fù)合體(FC)成分、凝血酶 成分和細(xì)胞成分混合制成。FC/凝血酶的比率介于每25單位/毫升凝血酶2至10毫克/ 毫升纖維蛋白原之間。FC/凝血酶的比率優(yōu)選為約每25單位/毫升凝血酶約5毫克/毫升 纖維蛋白原。根據(jù)某些實(shí)施方式，纖維蛋白封閉劑通過(guò)將纖維蛋白原復(fù)合體(FC)成分和凝血 酶成分混合制成。在另一實(shí)施方式中，可在混合FC成分與凝血酶成分前，向FC成分中添加 細(xì)胞成分。根據(jù)某些實(shí)施方式，可向凝血酶成分中添加細(xì)胞成分。根據(jù)某些實(shí)施方式，可在 允許成分形成纖維蛋白凝膠前，向FC與凝血酶的混合物中添加細(xì)胞成分。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方式，蛋白酶抑制劑被排除在本發(fā)明的纖維蛋白封閉劑組合物之 外。本發(fā)明還提供了多種方法，用于浸漬或接種纖維蛋白封閉劑，以形成用于治療急 慢性傷口的治療制劑。這些方法包括為患者施用含有細(xì)胞成分的纖維蛋白封閉劑。根據(jù)某5些實(shí)施方式，纖維蛋白封閉劑為聚合凝膠或噴霧劑形態(tài)。在傷口愈合過(guò)程中，可按需要在傷 口患處施用本發(fā)明的纖維蛋白封閉劑一次、兩次、三次、四次、五次或以上等等。根據(jù)某些實(shí)施方式，本發(fā)明提供了治療急慢性傷口的方法。一般而言，患者的傷口 都可受益于本文所述組合物和方法，這對(duì)于該領(lǐng)域的普通技術(shù)人員是清楚的。根據(jù)優(yōu)選實(shí) 施方式，傷口是一種慢性皮膚傷口。在某實(shí)施方式中，我們按該領(lǐng)域的公知方法為患者施用纖維蛋白封閉劑，如注射、 噴涂、內(nèi)窺鏡施用或預(yù)制凝膠，以及該領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的其它方法。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明提供了一種纖維蛋白封閉劑，該纖維蛋白封閉劑含有 纖維蛋白原復(fù)合體(FC)成分、凝血酶成分和細(xì)胞成分，其中，用于形成凝膠的纖維蛋白原 濃度介于約2至約5毫克/毫升之間，細(xì)胞成分中含有一種或更多種干/祖細(xì)胞，纖維蛋白 封閉劑中含有至少1. 5-2. 0 X IO6個(gè)干/祖細(xì)胞/每平方厘米。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明提供了一種使用纖維蛋白封閉劑的方法，包括a)將 干/祖細(xì)胞與纖維蛋白封閉劑組合，來(lái)形成傷口封閉劑，該纖維蛋白封閉劑含有鈣凝血酶 和纖維蛋白原，其中，鈣凝血酶的濃度約為25單位/毫升，纖維蛋白原的濃度約為2至5毫 克/毫升，干/祖細(xì)胞的最終濃度至少約為1.5至2.0 X IO6個(gè)干/祖細(xì)胞/平方厘米；b) 將纖維蛋白封閉劑施用到皮膚傷口上，其中，所施用的纖維蛋白封閉劑為聚合凝膠或噴霧 劑的形態(tài)。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明提供了一種改善傷口患處瘢痕形成的方法，包括a) 將干/祖細(xì)胞與纖維蛋白封閉劑組合，來(lái)形成傷口封閉劑，該纖維蛋白封閉劑含有鈣凝血 酶和纖維蛋白原，其中，鈣凝血酶的濃度約為25單位/毫升，纖維蛋白原的濃度約為2至5 毫克/毫升，干/祖細(xì)胞的最終濃度至少約為1. 5至2. 0 X IO6個(gè)干/祖細(xì)胞/平方厘米； b)將纖維蛋白封閉劑施用到傷口患處，其中，所施用的纖維蛋白封閉劑為聚合凝膠或噴霧 劑的形態(tài)。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明提供了一種治療硬皮病的方法，包括a)將干/祖細(xì)胞 與纖維蛋白封閉劑組合，來(lái)形成傷口封閉劑，該纖維蛋白封閉劑含有鈣凝血酶和纖維蛋白 原，其中，鈣凝血酶的濃度約為25單位/毫升，纖維蛋白原的濃度約為2至5毫克/毫升，干 /祖細(xì)胞的最終濃度至少約為1.5至2.0 X IO6個(gè)干/祖細(xì)胞/平方厘米；b)將纖維蛋白 封閉劑施用到硬皮病潰瘍處，其中，所施用的纖維蛋白封閉劑為聚合凝膠或噴霧劑的形態(tài)。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明提供了一種制備纖維蛋白封閉劑的方法，包括提供纖 維蛋白原復(fù)合體(FC)成分、鈣凝血酶成分和細(xì)胞成分；向FC成分中添加細(xì)胞成分，再將FC 成分與鈣凝血酶成分混合；向組合的FC/細(xì)胞成分的混合物中添加鈣凝血酶成分，其中纖 維蛋白原的濃度約為2至5毫克/毫升，干/祖細(xì)胞的最終濃度至少約為1.5至2.0 X IO6 個(gè)干/祖細(xì)胞/平方厘米。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方式，干/祖細(xì)胞可能選自以下細(xì)胞骨髓衍生細(xì)胞、造血干細(xì)胞、 間充質(zhì)干細(xì)胞、外周血干細(xì)胞及其混合物和組合。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方式，干/祖細(xì)胞是極小 的胚胎樣(VSEL)干細(xì)胞。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方式，VSEL干細(xì)胞為0)3471^/0)45-或^^-17 lin7CD45"0根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方式，鈣凝血酶的濃度約為25單位/毫升。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方式，在三周的時(shí)間內(nèi)至少在傷口患處施用兩次纖維蛋白封閉劑。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方式，施用于傷口患處的纖維蛋白封閉劑為CO2Psi小于5psi的噴霧劑形態(tài)。 根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方式，纖維蛋白封閉劑局部施用于傷口患處。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方式，皮膚替代物 被施用于傷口患處。本發(fā)明還提供了用于制備纖維蛋白封閉劑的試劑盒，其包括a)含有纖維蛋白原 復(fù)合體成分的第一個(gè)小瓶或存儲(chǔ)容器，其中該小瓶任選包含細(xì)胞成分；及b)含有凝血酶成 分的第二個(gè)小瓶或存儲(chǔ)容器，如果第一個(gè)小瓶或存儲(chǔ)容器未包括細(xì)胞成分，則該試劑盒任 選含有具有細(xì)胞成分的第三個(gè)小瓶或存儲(chǔ)容器，所述試劑盒還包含其使用說(shuō)明。試劑盒還 可能包括用于在體外或體內(nèi)使用或施用纖維蛋白封閉劑的儀器。試劑盒還包含表征細(xì)胞成 分的工具。該工具包括用于識(shí)別干/祖細(xì)胞標(biāo)記的存在的試劑。用于識(shí)別干/祖細(xì)胞標(biāo)記 的存在的試劑包括但不限于抗體。本發(fā)明還提供了用于制備纖維蛋白封閉劑的試劑盒，其包括a)含有纖維蛋白原 復(fù)合體成分的第一個(gè)小瓶或存儲(chǔ)容器；及b)含有凝血酶成分的第二個(gè)小瓶或存儲(chǔ)容器，其 中該小瓶任選包含細(xì)胞成分，如果所述第二個(gè)小瓶或存儲(chǔ)容器未包括細(xì)胞成分，則該試劑 盒任選包含含有細(xì)胞成分的第三個(gè)小瓶或存儲(chǔ)容器，所述試劑盒還包含其使用說(shuō)明。試劑 盒還可能包括用于在體外或體內(nèi)使用或施用纖維蛋白封閉劑的儀器。試劑盒還可能包含表 征細(xì)胞成分的工具。本發(fā)明還提供了用于制備纖維蛋白封閉劑的試劑盒，其包括a)含有纖維蛋白原 復(fù)合體成分的第一個(gè)小瓶或存儲(chǔ)容器，其中，纖維蛋白原的濃度約為2至5毫克/毫升；及 b)含有凝血酶成分的第二個(gè)小瓶或存儲(chǔ)容器，該試劑盒還含有其使用說(shuō)明。根據(jù)某些實(shí)施 方式，本發(fā)明的試劑盒提供的凝血酶的濃度約為25單位/毫升。根據(jù)某些實(shí)施方式，本發(fā) 明的試劑盒提供，第一個(gè)小瓶或存儲(chǔ)容器任選包含細(xì)胞成分。根據(jù)某些實(shí)施方式，如所述第 一個(gè)小瓶或存儲(chǔ)容器未包含細(xì)胞成分，本發(fā)明的試劑盒提供含有細(xì)胞成分的任選的第三個(gè) 小瓶或存儲(chǔ)容器。根據(jù)某些實(shí)施方式，本發(fā)明的試劑盒還可能包括用于在體外或體內(nèi)使用 或施用纖維蛋白封閉劑的儀器。根據(jù)某些實(shí)施方式，本發(fā)明的試劑盒還可能包含表征細(xì)胞 成分的試劑。下文的詳細(xì)敘述中將清楚說(shuō)明本發(fā)明的其它特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)。但請(qǐng)注意，雖然下文的 詳細(xì)敘述和具體例子表明本發(fā)明的具體實(shí)施方式
，但僅以例示方式給出，因?yàn)樵擃I(lǐng)域的技 術(shù)人員通過(guò)詳細(xì)敘述即可清楚了解在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的各種變動(dòng)和修改。本發(fā)明的方法和組合物進(jìn)一步包括用于對(duì)干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞(如造血干細(xì)胞、 多能間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)或外周血干細(xì)胞(PBSC))進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和表征的方法和組合物。 應(yīng)用包括但不限于誘導(dǎo)的多潛能干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、極小的胚胎樣干細(xì)胞和之前等分和/ 或冷凍保存的細(xì)胞。附圖簡(jiǎn)介專利或申請(qǐng)文件中含有至少一張彩色圖片。根據(jù)請(qǐng)求和支付必要費(fèi)用，專利局將 提供含有彩色圖片的專利或?qū)＠暾?qǐng)公布的副本。

圖1A-E.骨髓衍生培養(yǎng)細(xì)胞的外觀形態(tài)及其從纖維蛋白的遷移。(A)從Ficoll分 離骨髓抽吸物接種2天后，在組織培養(yǎng)塑料中培養(yǎng)的細(xì)胞外觀?？梢杂^察到從圓形細(xì)胞到 梭形細(xì)胞的各種形態(tài)。(B)從培養(yǎng)的第5天開(kāi)始，細(xì)胞便開(kāi)始呈現(xiàn)梭形形態(tài)，通常是幾個(gè)細(xì)胞沿著長(zhǎng)軸相互連接。(C)在培養(yǎng)后期(10-12次傳代)，細(xì)胞變大，并一般不再呈現(xiàn)梭形形 態(tài)，而是較為罕見(jiàn)的多邊形形態(tài)。(D)在細(xì)胞于組織培養(yǎng)塑料中早期傳代時(shí)(最多10次傳 代)，我們通常可以看到極端的梭形細(xì)胞形態(tài)，伴有三維結(jié)構(gòu)的島發(fā)展。(E)作為含有骨髓 衍生細(xì)胞的纖維蛋白噴霧劑，在培養(yǎng)中接種梭形骨髓衍生細(xì)胞4小時(shí)后的遷移。所有附圖 均放大10倍。圖2A-D.用選定CD標(biāo)記對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行的免疫染色。骨髓衍生培養(yǎng)細(xì)胞在玻片中 生長(zhǎng)，并用CD標(biāo)記進(jìn)行免疫染色。這些代表性實(shí)例證明，培養(yǎng)的細(xì)胞對(duì)MSC標(biāo)記((A)CD^、 (B)⑶44、(C)CD90)呈陽(yáng)性，對(duì)造血標(biāo)記((D)⑶34)呈陰性。放大10倍。圖3A-E.培養(yǎng)的MSC分化的功能測(cè)定。(A)骨形成的代表性結(jié)果；采用鈣測(cè)定法， 對(duì)四名不同患者的培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行四次連續(xù)測(cè)試得出的結(jié)果。圖中還包括陽(yáng)性(已建立的 MSC細(xì)胞株)與陰性(人真皮纖維原細(xì)胞)對(duì)照。(B)使用油紅0測(cè)定在培養(yǎng)細(xì)胞代表性 例子中脂肪滴的脂肪組織形成；紅染的細(xì)胞表示脂肪負(fù)載細(xì)胞。(C)軟骨培養(yǎng)細(xì)胞顆粒染 色陽(yáng)性的代表性例子，其中使用番紅0。(D)軟骨的陰性對(duì)照，使用人真皮纖維原細(xì)胞。(E) 軟骨的陽(yáng)性對(duì)照，采用存檔軟骨組織。所有圖片均放大10倍。圖4A-D.將骨髓衍生培養(yǎng)的MSC施用于人體的急性傷口上。(A)用雙管注射器進(jìn) 行纖維蛋白聚合物噴涂，直接將細(xì)胞施用于傷口。箭頭所指位置為裝填凝血酶或含細(xì)胞的 纖維蛋白原溶液的各個(gè)針筒。附在注射器下噴射共用區(qū)的導(dǎo)管連接著C02。(B)在手術(shù)后立 即將培養(yǎng)細(xì)胞施用于基線傷口，按壓圖(A)所示雙管注射器的共用柱塞，距離創(chuàng)面床約2厘 米。套印小圖顯示受試者背部的大傷口，該受試者采用坐姿。未發(fā)現(xiàn)所噴涂材料有溢流情 況。(C)第6周的傷口外觀，圖中顯示創(chuàng)面床完全長(zhǎng)滿，并且上皮幾乎已完全重新愈合。(D) 第7周傷口完全愈合，并且如圖所示，第12周傷口依然保持愈合狀態(tài)。愈合傷口右側(cè)的粉 色區(qū)域是愈合的活檢部位。圖5A-B.人體傷口愈合率。通過(guò)纖維蛋白噴霧劑將自體骨髓衍生培養(yǎng)MSC施用于 人體的急慢性傷口。(A)去除皮膚癌后留下急性傷口的四名受試者的愈合軌跡。數(shù)字指四 位單個(gè)患者，數(shù)字旁邊的“ + ”或“_”分別表示用含有MSC的纖維蛋白噴霧劑或單獨(dú)使用纖 維蛋白噴霧劑治療的傷口。虛線也表示單獨(dú)使用纖維蛋白治療的傷口的愈合情況。4號(hào)患 者有一個(gè)傷口用細(xì)胞治療，兩個(gè)傷口單獨(dú)使用纖維蛋白治療(_a和_b)。(B)受試者慢性傷 口的愈合軌跡，均以含有MSC的纖維蛋白噴霧劑治療。圖6.施用MSC后第8天，急性傷口的免疫染色。對(duì)福爾馬林固定活檢樣本的連續(xù) 切片進(jìn)行CD29、CD45和作為人纖維原細(xì)胞的特異性標(biāo)記(纖維原細(xì)胞標(biāo)記FibM)的脯氨 酰羥化酶的免疫染色?！癮”、“b”和“C”分別表示放大4倍、10倍和2倍。藍(lán)染色是由于在 活檢樣本頂上施用了標(biāo)記藍(lán)墨水。左邊的兩列顯微圖片代表用含有MSC的纖維蛋白治療代 表性傷口的連續(xù)切片，右邊的一列圖片為單獨(dú)用纖維蛋白治療的對(duì)照傷口。就用MSC治療 的傷口而言，對(duì)CD^和纖維原細(xì)胞標(biāo)記(FibM)呈陽(yáng)性的梭形細(xì)胞出現(xiàn)在創(chuàng)面床的淺層，即 施用培養(yǎng)細(xì)胞的部位。免疫染色細(xì)胞看起來(lái)不同于對(duì)CD45，白細(xì)胞共同抗原(LCA)，呈陽(yáng)性 的。相反，如僅用纖維蛋白的一組所示，在單獨(dú)用纖維蛋白治療的創(chuàng)面床淺層，CM9表達(dá)細(xì) 胞和表達(dá)纖維原細(xì)胞標(biāo)記(FibM)的細(xì)胞不足。僅傷口深處顯現(xiàn)出這些標(biāo)記的免疫染色，多 數(shù)可能代表內(nèi)源性和更深的細(xì)胞成分。圖7A-D.施用MSC后第8天，急性人體傷口的彈性纖維。左側(cè)的圖片顯示兩種不同的彈性纖維染色方法。沃-馮二氏染劑將彈性纖維染成黑色，用特定彈性抗體進(jìn)行免疫 染色的彈性纖維呈紅色。箭頭所指的位置便是單個(gè)具代表性的彈性纖維。左上圖(A)和左 下圖(C)表示對(duì)照普通皮膚，右上圖(B)和右下圖(D)來(lái)自施用MSC的創(chuàng)面床淺層。所使 用的兩種染劑，都顯示新形成明確的彈性纖維。放大10倍。圖8A-D.將骨髓衍生培養(yǎng)細(xì)胞施用于人體的慢性傷口上。(A)基線受試者踝關(guān)節(jié) 處不愈合傷口 ； (B)第三次向現(xiàn)已開(kāi)始愈合的傷口施用含有MSC的纖維蛋白噴霧劑；(C)第 3個(gè)月，傷口幾乎已完全愈合。創(chuàng)面床已完全長(zhǎng)滿，僅有一小塊潰爛面。(D)傷口繼續(xù)愈合， 極少疤痕。照片顯示的第6個(gè)月創(chuàng)口完全閉合時(shí)的最終記錄。圖9.傷口愈合情況與施用的MSC數(shù)目的相互關(guān)系。圖片表示通過(guò)纖維蛋白噴霧 劑施用于傷口的MSC數(shù)目與慢性傷口患者的潰瘍面積在每次施用噴霧劑2-4周后的百分比 變化(n = 17個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn))的相互關(guān)系。采用施佩爾曼等級(jí)相關(guān)進(jìn)行分析；r = -0. 6389 (經(jīng) 同秩校正)，95%置信區(qū)間(-0. 8606至-0. 2135) ；ρ = 0. 0058。施用量大于IxlO6個(gè)細(xì)胞 /平方厘米傷口與隨后周)潰瘍面積縮減至少10%高度相關(guān)(Fisher精確檢驗(yàn)(雙 側(cè));p = 0. 0345)。圖10.在施用MSC之前和之后3周慢性傷口的免疫染色。對(duì)福爾馬林固定的代表 性慢性傷口活檢樣本的連續(xù)切片進(jìn)行CD^、CD45和作為人纖維原細(xì)胞的特異性標(biāo)記(纖維 原細(xì)胞標(biāo)記FibM)的脯氨酰羥化酶的免疫染色。所有圖片均放大10倍。左側(cè)和右側(cè)的圖 片分別表示單獨(dú)用纖維蛋白或含MSC的纖維蛋白噴霧劑治療傷口的情況。藍(lán)染色是由于在 活檢樣本頂上施用了標(biāo)記藍(lán)墨水。圖片顯示，在創(chuàng)面床淺層(即施用培養(yǎng)細(xì)胞的部位)對(duì) CD^和纖維原細(xì)胞標(biāo)記呈陽(yáng)性的梭形細(xì)胞。免疫染色細(xì)胞看起來(lái)不同于對(duì)CD45，白細(xì)胞共 同抗原(LCA)，呈陽(yáng)性的那些。圖11A-C.用MSC治療小鼠傷口愈合的組織學(xué)和效果。㈧在施用含有同源MSC的 纖維蛋白噴霧劑后5天，小鼠代表性傷口的組織學(xué)。創(chuàng)面床含有大量細(xì)胞；4倍。(B)將通 過(guò)纖維蛋白噴霧劑將以紅色熒光標(biāo)記的MSC施用于小鼠的傷口。第5天時(shí)，細(xì)胞已遷移入 創(chuàng)面床的真皮成分中。顯微圖片顯示圖(A)所示部位的相鄰組織切片；10倍。(C)圖片顯 示了用同源MSC治療小鼠尾部傷口時(shí)的愈合結(jié)果。向db/db小鼠及其對(duì)照同窩小鼠都施用 單獨(dú)的纖維蛋白或含MSC的纖維蛋白噴霧劑。每個(gè)點(diǎn)表示四只小鼠的平均值+SEM。圖12A-E.小鼠傷口中GFP+MSC的識(shí)別。C57BL/6小鼠尾部在受傷18天后的傷口顯 微圖片。我們用含有GFP+同源骨髓衍生培養(yǎng)MSC的纖維蛋白噴霧劑治療尾部傷口。用蔡司 Axioplan 2成像系統(tǒng)和Axio CAM分析冰凍切片。以FITC (510-560nm ； (A))識(shí)別出的GFP+ 血管(箭頭)。以光學(xué)顯微鏡濾光片(C)、德克薩斯紅(645/75nm ； (D))和DAPI (435-475nm ； (E))分析鄰近切片。我們通過(guò)這些濾光片，獲得一張合成顯微圖片，顯示綠色熒光的特異性 (B)0放大200倍。圖13.從患者自身皮膚長(zhǎng)出的角質(zhì)形成細(xì)胞片范例。圖14A-D. (A)生物工程皮膚的圖解范例活體雙層皮膚構(gòu)造(BSC) ； (B)結(jié)網(wǎng)過(guò) 程；(C)網(wǎng)狀織物；和⑶將網(wǎng)狀織物施用于傷口。圖15.提供了調(diào)節(jié)教導(dǎo)成分及將該成分施用于傷口的流程示意圖。圖16A-D.圖例說(shuō)明用MSC(滴劑而非噴霧劑)治療硬皮病手指潰瘍(局部性缺 血)。(A)顯示基線潰瘍和凹狀疤痕；(B)顯示通過(guò)纖維蛋白施用MSC ； (C)顯示潰瘍和凹狀疤痕輪廓；和(D)顯示施用纖維蛋白/MSC封閉劑。圖17.顯示用MSC治療硬皮病手指潰瘍(局部性缺血)的結(jié)果，8周后愈合情況依 然良好。圖18A-D.圖例說(shuō)明用MSC治療并用生物工程化皮膚覆蓋的硬皮病手指潰瘍(局 部性缺血)(A)顯示基線潰瘍和凹狀疤痕；(B)顯示將生物工程化皮膚覆蓋在MSC膠上； (C)顯示遞送含有MSC的纖維蛋白和生成的凝膠聚合物(治療后會(huì)立即緩解疼痛)；(D)顯 示4周后的治愈結(jié)果。傷口在8周后仍保持良好治愈狀態(tài)。圖19A-F.比較C57BL/6中的β _半乳糖染色將來(lái)自β _半乳糖苷酶陽(yáng)性小鼠 (A)和(B)的MSC施用于在C57BL/6背景下的同源受傷小鼠(C)和(D)。藍(lán)染色細(xì)胞顯示 在18天(E)和38天(F)后，纖維蛋白遞送細(xì)胞的存活率。詳細(xì)內(nèi)容纖維蛋白封閉劑通常由兩種人類血漿衍生成分組成(a)高濃縮纖維蛋白原復(fù)合 體(FC)，其主要由纖維蛋白原、纖連蛋白和催化量的因子X(jué)III和纖溶酶原組成；和(b)高 效力凝血酶。纖維蛋白封閉劑也可含有抑酶肽。通過(guò)凝血酶的作用，(溶解的)纖維蛋白 原首先轉(zhuǎn)化為自發(fā)凝聚的纖維蛋白單體，并形成所謂纖維蛋白凝塊。同時(shí)，溶液中的因子 XIII (FXIII)被鈣離子存在下的凝血酶激活為因子X(jué)llla。凝聚的纖維蛋白單體與可能存 在的任何剩余纖連蛋白交聯(lián)，通過(guò)形成新的肽鍵，進(jìn)而形成高分子量聚合物。通過(guò)該交聯(lián)反 應(yīng)，所形成的凝塊強(qiáng)度得到大幅提升。見(jiàn)如，美國(guó)專利公布號(hào)2008/0181879，該文獻(xiàn)通過(guò)引 用方式并入本文。通常，凝塊較好的粘附于傷口和組織表面，其產(chǎn)生粘著和止血的效果。因 此，纖維蛋白粘合劑通常用作兩成分粘合劑，其包含纖維蛋白原復(fù)合體(FC)成分和另外含 有鈣離子的凝血酶成分。纖維蛋白封閉劑的市售裝為T(mén)lSSEEL(Baxter)。TISSEEL由兩成分 纖維蛋白生物基質(zhì)組成，提供高濃縮的人類纖維蛋白原，用于封閉組織和停止彌漫性出血。 纖維蛋白封閉劑的其它市售裝包括BERIPLAST (Behringwerke AG, Marburg/Lahn, FRG)和 BIOCOL(CRTS，Lille, France)。本發(fā)明的纖維蛋白封閉劑通過(guò)將纖維蛋白原復(fù)合體(FC)成分、凝血酶成分和另 外的細(xì)胞成分組合制成。根據(jù)某些實(shí)施方式，可在添加凝血酶成分前在FC成分中添加細(xì)胞 成分。根據(jù)某些實(shí)施方式，也可向凝血酶成分中添加細(xì)胞成分。根據(jù)某些實(shí)施方式，可在允 許成分形成纖維蛋白凝膠前，向FC與凝血酶的混合物中添加細(xì)胞成分。FC/凝血酶比率可介于每25單位/毫升凝血酶2至10毫克/毫升纖維蛋白原之 間，其包括(例如)約每25單位/毫升凝血酶約2毫克/毫升纖維蛋白原、約每25單位/ 毫升凝血酶約2. 5毫克/毫升纖維蛋白原、約每25單位/毫升凝血酶約3毫克/毫升纖維 蛋白原、約每25單位/毫升凝血酶約3. 5毫克/毫升纖維蛋白原、約每25單位/毫升凝血 酶約4毫克/毫升纖維蛋白原、約每25單位/毫升凝血酶約4. 5毫克/毫升纖維蛋白原、 約每25單位/毫升凝血酶約5毫克/毫升纖維蛋白原、約每25單位/毫升凝血酶約5. 5 毫克/毫升纖維蛋白原、約每25單位/毫升凝血酶約6毫克/毫升纖維蛋白原、約每25單 位/毫升凝血酶約6. 5毫克/毫升纖維蛋白原、約每25單位/毫升凝血酶約7毫克/毫升 纖維蛋白原、約每25單位/毫升凝血酶約7. 5毫克/毫升纖維蛋白原、約每25單位/毫升 凝血酶約8毫克/毫升纖維蛋白原、約每25單位/毫升凝血酶約8. 5毫克/毫升纖維蛋 白原、約每25單位/毫升凝血酶約9毫克/毫升纖維蛋白原、約每25單位/毫升凝血酶約9. 5毫克/毫升纖維蛋白原，以及約每25單位/毫升凝血酶約10毫克/毫升纖維蛋白原。 FC/凝血酶比率優(yōu)選為約每25單位/毫升凝血酶約5毫克/毫升纖維蛋白原。FC/凝血酶 比率的優(yōu)選范圍包括約每25單位/毫升凝血酶約4至6毫克/毫升纖維蛋白原、約每25 單位/毫升凝血酶約4. 5至6毫克/毫升纖維蛋白原、約每25單位/毫升凝血酶約5至6 毫克/毫升纖維蛋白原、約每25單位/毫升凝血酶約5. 5至6毫克/毫升纖維蛋白原、約 每25單位/毫升凝血酶約4至5. 5毫克/毫升纖維蛋白原、約每25單位/毫升凝血酶約 4至5毫克/毫升纖維蛋白原，以及約每25單位/毫升凝血酶約4至4. 5毫克/毫升纖維 蛋白原。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方式，纖維蛋白原的密度/濃度介于約2至10毫克/毫升之間，其 包括，例如，約2毫克/毫升、約2. 5毫克/毫升、約3毫克/毫升、約3. 5毫克/毫升、約4 毫克/毫升、約4. 5毫克/毫升、約5毫克/毫升、約5. 5毫克/毫升、約6毫克/毫升、約 6. 5毫克/毫升、約7毫克/毫升、約7. 5毫克/毫升、約8毫克/毫升、約8. 5毫克/毫升、 約9毫克/毫升、約9. 5毫克/毫升，以及約10毫克/毫升纖維蛋白原。纖維蛋白原的密 度優(yōu)選約介于2至5毫克/毫升之間。纖維蛋白原密度/濃度的優(yōu)選范圍包括約4至6毫 克/毫升、約4. 5至6毫克/毫升、約5至6毫克/毫升、約5. 5至6毫克/毫升、約4至 5. 5毫克/毫升、約4至5毫克/毫升、約4至4. 5毫克/毫升、約2至6毫克/毫升、約2 至5毫克/毫升、約2. 5至5毫克/毫升、約3至5毫克/毫升，以及約3. 5至5毫克/毫 升。加入纖維蛋白原中的凝血酶量足以在約3至120秒內(nèi)形成聚合凝膠。優(yōu)選約3秒至60 秒間、約3秒至30秒間、約3秒至20秒間、約3秒至10秒間、約10秒至60秒間、約20秒 至60秒間、約30秒至60秒間，以及約30秒至120秒間。根據(jù)某些實(shí)施方式，本發(fā)明傷口封閉劑的基礎(chǔ)材料可以為能夠形成基質(zhì)并支持或 包膠細(xì)胞或細(xì)胞成分的任何蛋白(纖維蛋白原/纖維蛋白除外)或任何非蛋白聚合物(例 如，3M的CAVIL0N )。聚合物的密度/濃度可介于2. 5至10毫克/毫升。聚合物的密度/ 濃度介于約2至約10毫克/毫升之間，其包括，例如，約2毫克/毫升、約2. 5毫克/毫升、 約3毫克/毫升、約3. 5毫克/毫升、約4毫克/毫升、約4. 5毫克/毫升、約5毫克/毫升、 約5. 5毫克/毫升、約6毫克/毫升、約6. 5毫克/毫升、約7毫克/毫升、約7. 5毫克/毫 升、約8毫克/毫升、約8. 5毫克/毫升、約9毫克/毫升、約9. 5毫克/毫升，以及約10毫 克/毫升。聚合物的密度優(yōu)選約介于2至5毫克/毫升之間。聚合物密度的優(yōu)選范圍包括 約4至6毫克/毫升、約4. 5至6毫克/毫升、約5至6毫克/毫升、約5. 5至6毫克/毫 升、約4至5. 5毫克/毫升、約4至5毫克/毫升、約4至4. 5毫克/毫升、約2至6毫克/ 毫升、約2至5毫克/毫升、約2. 5至5毫克/毫升、約3至5毫克/毫升，以及約3. 5至5 毫克/毫升。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方式，纖維蛋白封閉劑為聚合凝膠或凝膠噴霧劑形態(tài)。應(yīng)優(yōu)化每種 成分的濃度，以防施用后溢流。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方式，纖維蛋白封閉劑包含治療有效量的干/祖細(xì)胞。細(xì)胞成分中 的細(xì)胞優(yōu)選從自體、同種異體或異種人或動(dòng)物源采集。優(yōu)選自體的動(dòng)物或人源。然后按本 文所述方式制備并分離干/祖細(xì)胞組合物。例如，本發(fā)明的纖維蛋白封閉劑含有細(xì)胞成分， 其包括濃度約IO6至個(gè)細(xì)胞/平方厘米的干/祖細(xì)胞。根據(jù)某些實(shí)施方式，細(xì)胞成分 中的干細(xì)胞劑量至少約為每平方厘米1.5-2.0 X IO6個(gè)干細(xì)胞或更多(例如，大于約IO7個(gè)細(xì)胞/平方厘米、大于約IO8個(gè)細(xì)胞/平方厘米、大于約IO9個(gè)細(xì)胞/平方厘米、大于約101° 個(gè)細(xì)胞/平方厘米、大于約IO11個(gè)細(xì)胞/平方厘米、大于約IO12個(gè)細(xì)胞/平方厘米、大于約 IO13個(gè)細(xì)胞/平方厘米、大于約IO15個(gè)細(xì)胞/平方厘米或大于約102°個(gè)細(xì)胞/平方厘米)。 也可采用富集干細(xì)胞制劑。本文所公開(kāi)發(fā)明的組合物和方法有用于治療有急慢性傷口的患者。慢性傷口包括 但不限于以下各項(xiàng)慢性缺血性皮膚病損；硬皮病潰瘍；動(dòng)脈潰瘍；糖尿病足潰瘍；壓迫性 潰瘍；靜脈曲張性潰瘍；不愈合性下肢傷口 ；炎癥狀態(tài)造成的潰瘍；和/或長(zhǎng)期傷口。雖然， 本文舉例說(shuō)明特定實(shí)施方式，應(yīng)理解也可利用類似的方法采用適當(dāng)?shù)淖泽w和/或同種異體 細(xì)胞治療其它類型的傷口。本文所公開(kāi)發(fā)明的組合物和方法有用于改善患者傷口患處的瘢痕形成。根據(jù)優(yōu)選 實(shí)施方式，這些方法可以改善、降低或減少燒傷患者的瘢痕形成。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方式，這些 方法可以治療急慢性傷口或損傷患者的肥厚性瘢痕，或降低其發(fā)生率或可能性。本發(fā)明的組合物和方法可用于治療慢性缺血性皮膚病損。根據(jù)某些實(shí)施方式，組 合物包含干/祖細(xì)胞懸液，施用于慢性缺血性皮膚病損、慢性皮膚潰瘍和/或糖尿病足潰瘍 等慢性皮膚病損的表面和周?chē)?。其它類型的慢性皮膚病損包括神經(jīng)性和缺血性慢性皮膚病 損(例如，輕度病損、IV級(jí)病損、V級(jí)病損等)?？刹捎迷擃I(lǐng)域熟知的技術(shù)向受試者施用本發(fā)明的纖維蛋白封閉劑，例如，可在所 需部位注射或噴涂、采用內(nèi)窺鏡技術(shù)、海綿狀載體、預(yù)制封閉劑或該領(lǐng)域已知的其它方法。 在一實(shí)施方式中，我們通過(guò)注射或噴涂封閉劑，在原位形成凝膠。根據(jù)某些實(shí)施方式，遞送作為細(xì)微噴霧劑的本發(fā)明的纖維蛋白封閉劑。根據(jù)優(yōu)選 實(shí)施方式，我們用帶有雙管注射器的纖維蛋白聚合物噴涂系統(tǒng)將本發(fā)明的纖維蛋白封閉劑 施用于傷口處。就此而言，纖維蛋白原成分可與細(xì)胞成分組合，然后用帶有雙管注射器的纖 維蛋白聚合物噴涂系統(tǒng)將這種組合施用于患處，該噴涂系統(tǒng)可以同時(shí)施用組合的FC/細(xì)胞 成分和凝血酶成分。纖維蛋白原和凝血酶在與創(chuàng)面床接觸時(shí)立即聚合為纖維蛋白。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方式，纖維蛋白封閉劑(例如，聚合纖維蛋白凝膠)可局部施用于傷 口患處。例如，可以凝膠的形式將纖維蛋白封閉劑局部施用于傷口患處，并散開(kāi)，均勻的覆 蓋在傷口(例如，不愈合性傷口)的表面區(qū)域。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方式，教導(dǎo)成分指提供小生境、 習(xí)生地或結(jié)構(gòu)支撐從而保證干細(xì)胞繁殖和分化的一種組織結(jié)構(gòu)(例如，聚合物或支架)。根 據(jù)某些實(shí)施方式，教導(dǎo)成分為皮膚替代物或細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)材料。皮膚替代物包括但不 限于以下各項(xiàng)無(wú)細(xì)胞敷料(例如，結(jié)合于尼龍織物或網(wǎng)的膠原)；自體表皮移植；無(wú)細(xì)胞， 同種異體真皮移植；牛膠原和軟骨素-6-硫酸鹽；豬小腸黏膜；可吸收性基質(zhì)中的人纖維原 細(xì)胞；牛膠原海綿中的人纖維原細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞；牛膠原基質(zhì)中的人纖維原細(xì)胞和角 質(zhì)形成細(xì)胞。見(jiàn)如，美國(guó)專利公開(kāi)號(hào)2007/0274963，該文獻(xiàn)通過(guò)引用方式并入本文。根據(jù)某些實(shí)施方式，為遞送纖維蛋白，纖維蛋白聚合物噴涂系統(tǒng)使用極小的CO2氣 流(即小于約IOp. s. i.)。CO2氣流的優(yōu)選范圍包括約lp. s. i.至IOp. s. i.、約lp. s. i.至 9p. s. i.、約 lp. s. i.至 8p. s. i.、約 lp. s. i.至 7p. s. i.、約 lp. s. i.至 6p. s. i.、約 lp. s. i.至 5p. s. i.、約 lp. s. i.至 4p. s. i.、約 lp. s. i.至 3p. s. i.、約 lp. s. i.至 2p. s. i.、 約 2p. s. i.至 5p. s. i.、約 3p. s. i.至 5p. s. i.、約 4p. s. i.至 5p. s. i.。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方 式，為遞送纖維蛋白，纖維蛋白聚合物噴涂系統(tǒng)會(huì)使用小于約5p. s. i.的CO2氣流。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方式，為遞送纖維蛋白，纖維蛋白聚合物噴涂系統(tǒng)使用小于約4. 5p. s. i.的(X)2氣 流。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方式，為遞送纖維蛋白，纖維蛋白聚合物噴涂系統(tǒng)使用小于約4p. s. i.的 CO2氣流。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方式，為遞送纖維蛋白，纖維蛋白聚合物噴涂系統(tǒng)使用小于約3. 5p. s. i.的CO2氣流。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方式，為遞送纖維蛋白，纖維蛋白聚合物噴涂系統(tǒng)使用小于 約3p.s.i.的CO2氣流。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方式，為遞送纖維蛋白，纖維蛋白聚合物噴涂系統(tǒng)使 用小于約2.5p.s.i.的CO2氣流。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方式，為遞送纖維蛋白，纖維蛋白聚合物噴 涂系統(tǒng)使用小于約2p. s. i.的CO2氣流。可對(duì)纖維蛋白原(含有干/祖細(xì)胞)和凝血酶進(jìn)行稀釋，以最佳的遞送聚合凝膠， 其立即附著于傷口上，而不會(huì)出現(xiàn)溢流情況，同時(shí)還使干/祖細(xì)胞保持存活，并從凝膠中遷 移出來(lái)。在傷口愈合過(guò)程中，可按需要在傷口患處施用本發(fā)明的纖維蛋白封閉劑一次、兩 次、三次、四次、五次、十次、二十次或以上等。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方式，至少間隔1周為患者施用 至少兩次纖維蛋白封閉劑。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方式，至少間隔2周為患者施用至少兩次纖維蛋 白封閉劑。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方式，至少間隔1周為患者施用至少三次纖維蛋白封閉劑。根據(jù) 優(yōu)選實(shí)施方式，至少間隔2周為患者施用至少三次纖維蛋白封閉劑。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方式，至 少間隔1周為患者施用至少四次纖維蛋白封閉劑。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方式，至少間隔2周為患 者施用至少四次纖維蛋白封閉劑。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方式，至少間隔1周為患者施用至少五次 纖維蛋白封閉劑。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方式，至少間隔2周為患者施用至少五次纖維蛋白封閉劑。根據(jù)某些實(shí)施方式，本發(fā)明提供含有浸漬或接種于纖維蛋白基質(zhì)中的干/祖細(xì)胞 的局部制劑的用途。本發(fā)明的組合物和方法所用的干/祖細(xì)胞可以為同種異體或自體干/ 祖細(xì)胞。干細(xì)胞的潛在來(lái)源包括人類胚胎干(hEQ細(xì)胞、從臍帶中采集的干細(xì)胞、從外周血 采集的干/祖細(xì)胞、骨髓衍生細(xì)胞、成體干細(xì)胞、多潛能干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、極小的胚胎樣 干細(xì)胞和之前等分和/或冷凍保存的細(xì)胞。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明的纖維蛋白封閉劑中的細(xì)胞成分可包括成體自體骨髓 衍生干細(xì)胞、成體自體PBSC或成體自體MSC。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明的纖維蛋白封閉劑 中的細(xì)胞成分可包括由成體自體骨髓衍生干細(xì)胞、成體自體PBSC或成體自體MSC中的兩種 或以上的混合物。成體干細(xì)胞或體干細(xì)胞是組織或器官的分化細(xì)胞中的一種未分化細(xì)胞。成體干細(xì) 胞可以自我更新，并可以分化，產(chǎn)生組織或器官的主要特異細(xì)胞類型。成體干細(xì)胞在活體中 的主要作用是維護(hù)和修復(fù)其所在組織。骨髓的非造血成分包括多能間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)，該細(xì)胞可以分化為脂肪、骨骼、 肌肉、軟骨和內(nèi)皮。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明的方法和組合物中使用了 MSC。骨髓衍生干 細(xì)胞主要發(fā)現(xiàn)在長(zhǎng)骨內(nèi)部(腿骨、髖骨、胸骨等)，并且組成“骨髓”。這些干細(xì)胞可以離開(kāi) 骨髓，并在血流中循環(huán)。可按該領(lǐng)域內(nèi)已知的物理步驟采集干細(xì)胞。干細(xì)胞使傷口內(nèi)的某些結(jié)構(gòu)重建成為可能。骨髓是造血干細(xì)胞的重要來(lái)源，造血 干細(xì)胞經(jīng)常可以再生血液中的成分和包括間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)在內(nèi)的非造血干細(xì)胞。自體 干細(xì)胞可通過(guò)幾種潛在機(jī)制有力的促進(jìn)傷口愈合。在適當(dāng)條件下，干細(xì)胞可復(fù)原或重建組 織室。Falanga, Lancet 366(9498) :1736_43，2005。不愈合性傷口中原有的真皮纖維原細(xì) 胞已形成異常表型，無(wú)益于適當(dāng)?shù)慕M織的修復(fù)。Falanga et al.，Tissue Eng. 2007 Jun ；13(6) 1299-3120具體而言，從不愈合性傷口培養(yǎng)的纖維原細(xì)胞對(duì)某些生長(zhǎng)因子(如血小 板源生長(zhǎng)因子-BB(PDGF-BB)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β 1 (TGF-β 1))的作用沒(méi)有反應(yīng)。對(duì)TGF-β 1 沒(méi)有反應(yīng)可能是由于II型TGF-β受體的衰減調(diào)節(jié)和關(guān)鍵信號(hào)分子(包括Smad3和MAPK) 的磷酸化下降。干細(xì)胞的采集本發(fā)明的干/祖細(xì)胞(例如，MSC、PBSC、VSEL等)可從骨髓、外周血(優(yōu)選動(dòng)員外 周血)、脾、臍帶血及其組合中采集。可采用該領(lǐng)域已知的任何方式從各個(gè)來(lái)源采集干/祖 細(xì)胞。一般而言，從受試者身上采集干/祖細(xì)胞的方法包括采集總有核細(xì)胞群，然后進(jìn)一步 富集細(xì)胞群的干/祖細(xì)胞。根據(jù)某些實(shí)施方式，本發(fā)明的干/祖細(xì)胞(例如，造血干細(xì)胞和/或MSC)從骨髓 中采集而來(lái)?？刹捎迷擃I(lǐng)域已知的任何方法采集骨髓衍生細(xì)胞。根據(jù)某些實(shí)施方式，可從 患者身上獲得骨髓抽取液。根據(jù)某些實(shí)施方式，可從患者身上獲得單獨(dú)的骨髓抽取液。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方式，干細(xì)胞/祖細(xì)胞為極小的胚胎樣(VSEL)干細(xì)胞。見(jiàn)如， W0/2007/067280,國(guó)際申請(qǐng)編號(hào)PCT/US2006/042780，該文獻(xiàn)通過(guò)引用方式全文并入本文。 在某些實(shí)施方式中，VSEL干細(xì)胞或其衍生物包括CD34+/1 in7CD45_或ka-Γ/Ι in7CD45_極 小胚胎樣(VSEL)干細(xì)胞。在某些實(shí)施方式中，VSEL干細(xì)胞的直徑約3-4微米，表達(dá)SSEA-1、 Oct-4、Rev-I和Nanog中的至少一種，細(xì)胞核很大，周?chē)h(huán)繞著一層很窄的細(xì)胞質(zhì)，染色質(zhì) (常染色質(zhì))呈開(kāi)放狀態(tài)。在某些實(shí)施方式中，包括VSEL干細(xì)胞或其衍生物組成的⑶45_細(xì)胞群分離自由人 源或小鼠源骨髓、外周血、脾、臍帶血及其組合構(gòu)成的組群。在某些實(shí)施方式中，誘導(dǎo)VSEL 干細(xì)胞或其衍生物形成類胚體樣球體的一種或更多種生長(zhǎng)因子包括表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、 纖維原生長(zhǎng)因子-2及其組合。在某些實(shí)施方式中，我們通過(guò)將VSEL干細(xì)胞或其衍生物與 C2C12細(xì)胞共同培養(yǎng)，為VSEL干細(xì)胞或其衍生物提供一種或更多種因子。在某些實(shí)施方式 中，VSEL干細(xì)胞為CXCR4+和/或AC133+。在部分實(shí)施例中，本文所公開(kāi)的方法和組合物進(jìn) 一步包括篩選為HLA-DR-、MHC class Γ、⑶9(Γ、⑶四-、⑶105—或其組合的細(xì)胞。本發(fā)明公 開(kāi)的主題還提供了包括多個(gè)極小胚胎樣(VSEL)干細(xì)胞的類胚體樣球體。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方式，干細(xì)胞/祖細(xì)胞采集自個(gè)體的外周血。根據(jù)一優(yōu)選實(shí)施方式， 可在血漿分離置換程序中采集干細(xì)胞，該程序通常利用血漿分離置換儀器。血漿分離置換 儀器的外觀與透析機(jī)相似，只是該儀器為離心機(jī)，而透析機(jī)則采用過(guò)濾技術(shù)?？梢栽诠w的 家中或采集中心采集干細(xì)胞。血液采集自一只手臂，然后輸入血漿分離置換儀器，進(jìn)行干細(xì) 胞分離和采集。全血的其余部分會(huì)重新輸入供體的體內(nèi)。注冊(cè)護(hù)士(RN)或其他核準(zhǔn)人員 會(huì)以正常采血方式在受試者的兩只手臂上插入針頭。然后，注冊(cè)護(hù)士會(huì)運(yùn)行血漿分離置換 儀器，來(lái)分離血液成分(紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血漿)，采集干細(xì)胞，并將全血的其余部分重新輸 入供體體內(nèi)。采集干細(xì)胞需要大約2-4小時(shí)，受試者在此期間要保持靜止?fàn)顟B(tài)。接受血漿 分離置換采血后，骨髓會(huì)很快向血流中釋放更多干細(xì)胞，替換所采集的干細(xì)胞。干細(xì)胞采集 量?jī)H占人體干細(xì)胞中的極小一部分。健康的個(gè)體可以迅速繁殖干細(xì)胞，替換損失的干細(xì)胞。 因此，本發(fā)明的程序不會(huì)減少體內(nèi)的干細(xì)胞。每年，會(huì)為采集血小板、紅細(xì)胞、血漿和干細(xì)胞 進(jìn)行數(shù)十萬(wàn)次血漿分離置換采血。經(jīng)實(shí)踐證明，這是一種安全有效的技術(shù)。根據(jù)某些實(shí)施方式，我們通過(guò)血漿分離置換程序從成人或兒童外周血中采集干細(xì)14胞和/或祖細(xì)胞，并進(jìn)行加工，優(yōu)化所采集干細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量，任選將干細(xì)胞冷凍保存， 在有需要時(shí)解凍，用于自體治療目的。根據(jù)一優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明提供了從人類受試者采 集自體成體干細(xì)胞的方法。該過(guò)程可能涉及通過(guò)血漿分離置換程序，從人類受試者的外周 血中采集成體干細(xì)胞；采集時(shí)，在所采集細(xì)胞上加耳標(biāo)，以便用于人類受試者；保存所采集 的細(xì)胞，以維持細(xì)胞的細(xì)胞完整性。人類受試者可以為成年人或非新生兒兒童。因此，上述 程序可進(jìn)一步包括采集成人或非新生兒兒童外周血干細(xì)胞，這些細(xì)胞在冷凍保存前按指定 劑量部分進(jìn)行等分，以便在從庫(kù)存中取出細(xì)胞時(shí)，不必解凍全部所采集細(xì)胞?？蓪?duì)包括成人或非新生兒兒童在內(nèi)的任何人進(jìn)行采集。此外，采集可涉及一個(gè)或 更多個(gè)采集步驟或采集期。例如，一個(gè)人可以至少進(jìn)行2次、3次或5次采集(例如，通過(guò) 血漿分離置換程序)。在每個(gè)采集步驟中，人體每千克體重所采集的總有核細(xì)胞數(shù)量可為 一百萬(wàn)(1 χ IO6)個(gè)或更多(例如、1 χ IO7U χ IO8U χ IO9U χ IO10U χ IO11U χ ΙΟ12、 1 χ IO13U χ IO14U χ ΙΟ15)。在優(yōu)選實(shí)施方式中，在單次采集中采集的細(xì)胞數(shù)量可等于或 大于 1 χ IO15 個(gè)總有核細(xì)胞，或至少在 ΙΟ14、1013、IOi2UOiiUO10, IO9、ΙΟ8、107、IO6 或 IO5 的數(shù) 量級(jí)上的總有核細(xì)胞，視供體的體重和年齡而定。依據(jù)將從供體身上采集的干/祖細(xì)胞的情況、數(shù)量和質(zhì)量，任選在供體已“成年” 或達(dá)到“成熟”年齡(除非特定文意另有所指，否則本文中的“成年”指并包括成年人和非 新生兒)和/或達(dá)到特定最低體重要求時(shí)采集干/祖細(xì)胞。例如，根據(jù)本發(fā)明一實(shí)施方 式，在受試者介于10至200公斤時(shí)采集干/祖細(xì)胞，或該體重范圍內(nèi)的任何范圍，如20至 40公斤。此外或替代地，根據(jù)本發(fā)明一實(shí)施方式，可要求受試者達(dá)到2-80歲間某年齡段內(nèi) (例如，2-10、10-15、12-18、16-20、20-26、26-30、30-35、30-40、40-45、40-50、55-60、60-65、 60-70和70-80歲)的特定年齡。收集的干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞也可以用離體過(guò)程擴(kuò)展。例如，可能需要擴(kuò)展和增殖 干細(xì)胞群、部分分化干細(xì)胞，以達(dá)到一個(gè)組織特定祖細(xì)胞群或?qū)⒏杉?xì)胞或祖細(xì)胞分化為完 全功能細(xì)胞。已為富集該等細(xì)胞群制定眾多方案。見(jiàn)如，美國(guó)專利第5，486，359號(hào)、美國(guó)專 利第5，753，506號(hào)和美國(guó)專利第5，736，396號(hào)，通過(guò)引用方式全文并入本文?？赡懿捎脭U(kuò) 增或分化干細(xì)胞或祖細(xì)胞的任何已知方案。例如，使用的策略可能包括培養(yǎng)干細(xì)胞或祖細(xì) 胞帶有或不帶早期和晚期生長(zhǎng)因子的不同混合物，帶有或不帶組織特定生長(zhǎng)或分化因子； 帶有或不帶血清；固定培養(yǎng)、快速培養(yǎng)基交換培養(yǎng)或持續(xù)灌注(生物反應(yīng)器)；和帶有或不 帶已建立的細(xì)胞飼養(yǎng)層。為實(shí)現(xiàn)干細(xì)胞最大的離體擴(kuò)增，應(yīng)滿足下列一般條件(i)分化應(yīng) 可逆地抑制或延遲(ii)自我再生應(yīng)得到最大的延長(zhǎng)。同樣，細(xì)胞擴(kuò)增后，必須采用方法，誘 導(dǎo)分化擴(kuò)增的細(xì)胞群，以將擴(kuò)增的細(xì)胞群轉(zhuǎn)化為成熟功能細(xì)胞或組織。干細(xì)胞增效劑在外周血細(xì)胞循環(huán)的干細(xì)胞/祖細(xì)胞的數(shù)量，可能會(huì)隨著在收集前輸注細(xì)胞生長(zhǎng) 因子而增加，例如粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)。常規(guī)地將生長(zhǎng)因子輸注至骨髓和外周血供 體，且不會(huì)產(chǎn)生任何長(zhǎng)期的不良反應(yīng)。不良副作用并不常見(jiàn)，但包括可能在長(zhǎng)骨、胸骨與骨 盆出現(xiàn)的疼痛、輕微頭痛、輕度惡心和體溫瞬時(shí)升高。給予成長(zhǎng)因子1-6天后，收集外周血 干細(xì)胞/祖細(xì)胞。輸注G-SCF后1-6天，用血漿分離置換儀器無(wú)菌收集外周血干細(xì)胞/祖 細(xì)胞。在優(yōu)選實(shí)施方式中，提供了包括給予干細(xì)胞增效劑的動(dòng)員大量外周血干細(xì)胞/祖細(xì)胞的方法。干細(xì)胞增效劑功能在于增加從人身上收集的干細(xì)胞/祖細(xì)胞數(shù)量或質(zhì) 量。這些試劑包括但不限于G-CSF、GM-CSF, dexamethazone、CXCR4受體抑制劑、白細(xì)胞介 素-1 (IL-I)、白細(xì)胞介素-3 (IL-3)、白細(xì)胞介素-8 (IL-8)、PIXY-321 (GM-CSF/IL-3 融合蛋 白)、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白、干細(xì)胞因子、促血小板生成素和生長(zhǎng)相關(guān)致癌基因，可作為單一試 劑或組合。在優(yōu)選實(shí)施方式中，提供了包括向疾病早期受試者給予G-CSF的動(dòng)員大量外周 血干細(xì)胞/祖細(xì)胞的方法。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方式，G-CSF在1至6天的期間內(nèi)給予疾病早期受試者，在受試者外 周血血漿分離置換時(shí)結(jié)束。優(yōu)選的是，在2天至6天的期間內(nèi)G-CSF給予疾病早期受試者 至少兩次。例如，可在第1天和第3天給予G-CSF，或可在第1天、第3天和第5天或可選 的第1天、第2天和第5天給予。最優(yōu)選的情況是，在3天的期間連續(xù)的天內(nèi)將G-CSF給予 疾病早期受試者兩次。因此，根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方式，在第1天和第2天向疾病早期受試者給予 G-CSF，然后在第3天進(jìn)行血漿分離置換。此外，根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方式，向受試者給予低劑量的G-CSF。因此，受試者可能接受約 1微克/千克/天至8微克/千克/天劑量的G-CSF。優(yōu)選的是，給予受試者劑量約2至7 微克/千克/天或等效劑量的G-CSF。更優(yōu)選的是，給予受試者劑量約4至6微克/千克/ 天或等效劑量的G-CSF。對(duì)于皮下注射而言，G-CSF劑量可從約50微克至約800微克，優(yōu)選 的是從約100微克至約600微克，更優(yōu)的是從約250微克至500微克，最優(yōu)的是從約300微 克至約500微克。根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，CXCR4受體拮抗劑或抑制劑可用作干細(xì)胞增效劑。 已發(fā)現(xiàn)能增加外周血干細(xì)胞/祖細(xì)胞數(shù)量的CXCR4抑制劑實(shí)例包括但不限于AMD3100、 ALX40-4C、T22、T134、T140和TAK-779。也見(jiàn)于美國(guó)專利第7，169，750號(hào)，通過(guò)引用方式全 文并入本文。該等干細(xì)胞增效劑可在收集步驟開(kāi)始前給予人。例如，增效劑可在收集步驟 開(kāi)始前至少一天、至少三天或至少一周給予。優(yōu)選的是，在2天至6天的期間內(nèi)CXCR4抑制 劑給予疾病早期受試者至少兩次。例如，可在第1天和第3天給予CXCR4抑制劑，或可在第 1天、第3天和第5天或可選的第1天、第2天和第5天給予。最優(yōu)選的情況是，在3天的期 間連續(xù)的天內(nèi)將CXCR4抑制劑給予疾病早期受試者兩次。因此，根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方式，在第1 天和第2天向疾病早期受試者給予CXCR4抑制劑，然后在第3天進(jìn)行血漿分離置換。選擇的給藥的配方和途徑將根據(jù)個(gè)別受試者、受試者要治療的病癥的性質(zhì)和通常 主治醫(yī)生的判斷量身定制。CXCR4抑制劑恰當(dāng)?shù)膭┝糠秶Q于這些考慮因素，但通常，化 合物的給藥范圍為約0. 1微克/公斤至5毫克/公斤體重；優(yōu)選范圍是約1微克/公斤至 300微克/公斤體重；更優(yōu)的是約10微克/公斤至100微克/公斤體重。因此，對(duì)于典型 的70公斤的人類受試者而言，劑量范圍為從約0. 7微克至350毫克；優(yōu)選的是約700微克 至21毫克；最優(yōu)的是約700微克至7毫克。相比如i.v.給藥等方式，化合物通過(guò)口服或經(jīng) 皮給藥方式劑量可能更高。干細(xì)胞加工在本發(fā)明一些實(shí)施方式中，收集干細(xì)胞/祖細(xì)胞后，會(huì)按照本領(lǐng)域所熟知的方法 力口工(見(jiàn)于如 Lasky, L. C. and Warkentin, P. I. ；Marrow and Stem Cell Processing for Transplantation ；AmericanAssociation of Blood Banks (2002))。在本發(fā)明的實(shí)施方式 中，加工可能包括下列步驟準(zhǔn)備容器(如試管)和標(biāo)簽、采樣和/或試驗(yàn)收集的物質(zhì)、離心、將物質(zhì)從收集容器轉(zhuǎn)移到儲(chǔ)存容器、添加冷凍保護(hù)劑等。在一些實(shí)施方式中，加工后，一 些加工過(guò)的干細(xì)胞/祖細(xì)胞可用于進(jìn)一步試驗(yàn)。細(xì)胞也可以加工，優(yōu)選是在開(kāi)展保存步驟之前。例如，加工可能涉及用某些細(xì)胞表 面標(biāo)志富集或消耗細(xì)胞。任何細(xì)胞表面標(biāo)志，包括本說(shuō)明書(shū)任何地方所述細(xì)胞表面標(biāo)志，可 用作富集或消耗的標(biāo)準(zhǔn)。此外，加工可能涉及在一個(gè)干細(xì)胞/祖細(xì)胞群或至少一個(gè)非干細(xì) 胞/祖細(xì)胞群中分析一個(gè)細(xì)胞的至少一個(gè)特征。特征可能是DNA或RNA序列。例如，基因 組DNA或RNA可能已部分或完全測(cè)序(確定)。或者，細(xì)胞的DNA或RNA特定區(qū)域可被測(cè) 序。例如，可能會(huì)提取細(xì)胞或細(xì)胞群的核酸?？赡苡脭U(kuò)增流程中的擴(kuò)增探針擴(kuò)增這些核酸 的特定區(qū)域。例如，擴(kuò)增流程可能是PCR或LCR。擴(kuò)增后，擴(kuò)增引物(擴(kuò)增的產(chǎn)物)可能會(huì) 被測(cè)序。此外，可用基因芯片、雜交或其它技術(shù)分析DNA和RNA。特定種類的組織分型可用于樣本鑒定或用于該等干細(xì)胞/祖細(xì)胞可能的同種異 體用途。這類信息可能包含基因型或表型信息。表型信息可能包含任何觀察或測(cè)量得出的 特征，不論是宏觀的或是系統(tǒng)級(jí)別或微觀層面、細(xì)胞或分子層面?；蛐托畔⒖赡苤柑囟▊€(gè) 別有機(jī)體的特定基因組成，包括個(gè)別基因組的基因組成中一個(gè)或更多個(gè)變異或突變和該基 因組成與疾病的可能關(guān)系。該表型信息實(shí)例是基因“指紋”和供體的人類白細(xì)胞抗原(HLA) 類型。在本發(fā)明一些實(shí)施方式中，干細(xì)胞/祖細(xì)胞將按確定劑量被鑒定和等分至恰當(dāng)容器 的方式加工。在優(yōu)選實(shí)施方式中，干細(xì)胞/祖細(xì)胞富集群的細(xì)胞數(shù)量可能等于或大于h IO8的 總有核細(xì)胞總數(shù)，或至少在107，或IO6或105，或IO4的數(shù)量級(jí)上，視乎供體的重量和年齡。 可能會(huì)等分該等細(xì)胞，以便滿足一個(gè)劑量的細(xì)胞數(shù)量?jī)?chǔ)存在一個(gè)冷凍細(xì)胞袋或試管中。該 流程包括“成套儲(chǔ)存”的獨(dú)特流程，讓個(gè)人能夠收回大量細(xì)胞，用于自體用途，而無(wú)需融化全 部數(shù)量的儲(chǔ)存細(xì)胞(更多詳情于下文討論)。干細(xì)胞富集或分類富集過(guò)程優(yōu)選包含按大小和/或細(xì)胞標(biāo)志分類細(xì)胞。例如，干細(xì)胞包含替代CD34+ 細(xì)胞測(cè)量的約0. 1-1.0%的有核細(xì)胞總數(shù)。因此，干細(xì)胞可按照其⑶34表達(dá)分類。就本發(fā)明的一個(gè)方面而言，通過(guò)本發(fā)明的方法收集的細(xì)胞可分類為至少兩個(gè)亞 群，其可單獨(dú)或一起(如在同一小瓶中)冷藏。所述細(xì)胞的至少兩個(gè)亞群可能是干細(xì)胞/ 祖細(xì)胞的兩個(gè)亞群。但是，所述細(xì)胞的至少兩個(gè)亞群可能是(1)干細(xì)胞群或干細(xì)胞/祖細(xì) 胞富集群( 非干細(xì)胞群或干細(xì)胞/祖細(xì)胞消耗群。此外，也可預(yù)見(jiàn)到，兩個(gè)亞群(即上文 (1)和O))可能會(huì)放在一起冷藏?？筛鶕?jù)與干細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞表面標(biāo)志對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行分類。由于此為本發(fā)明富集干 細(xì)胞的一個(gè)實(shí)施方式，因此，細(xì)胞分類的實(shí)用標(biāo)志無(wú)需專門(mén)在干細(xì)胞中表達(dá)。未在干細(xì)胞中 專門(mén)表達(dá)的細(xì)胞標(biāo)志仍在富集干細(xì)胞中有效。還應(yīng)注意，分化細(xì)胞的標(biāo)志也對(duì)本發(fā)明的方 法有效，因?yàn)槔?，這些標(biāo)志可用于選擇性去除分化細(xì)胞，從而在余下的細(xì)胞群中富集干細(xì) 胞。可在本發(fā)明任何流程中使用的標(biāo)志、細(xì)胞表面或其它，至少包括下列
權(quán)利要求
1.纖維蛋白封閉劑，其含有纖維蛋白原復(fù)合體(FC)成分、凝血酶成分和細(xì)胞成分， 其中，用于形成凝膠的纖維蛋白原濃度介于約2至5毫克/毫升之間，細(xì)胞成分含有一種或更多種干/祖細(xì)胞，并且纖維蛋白封閉劑含有至少1.5-2.0 X IO6個(gè)干/祖細(xì)胞/平 方厘米。
2.權(quán)利要求1所述組合物，干/祖細(xì)胞選自以下細(xì)胞骨髓衍生細(xì)胞、造血干細(xì)胞、間 充質(zhì)干細(xì)胞、外周血干細(xì)胞及其混合物和組合。
3.權(quán)利要求1所述組合物，其中干/祖細(xì)胞為骨髓衍生細(xì)胞。
4.權(quán)利要求1所述組合物，其中干/祖細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞。
5.權(quán)利要求1所述組合物，其中干/祖細(xì)胞為外周血干細(xì)胞。
6.使用纖維蛋白封閉劑的方法，其包括a)將干/祖細(xì)胞與纖維蛋白封閉劑組合，來(lái)形 成傷口封閉劑，該纖維蛋白封閉劑含有鈣凝血酶和纖維蛋白原，其中，鈣凝血酶的濃度約為 25單位/毫升，纖維蛋白原的濃度約為2至5毫克/毫升，并且干/祖細(xì)胞的最終濃度至 少約為1.5至2.0 X IO6個(gè)干/祖細(xì)胞/平方厘米；b)將纖維蛋白封閉劑施用到皮膚傷口 上，其中，所施用的纖維蛋白封閉劑為聚合凝膠或噴霧劑的形態(tài)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述方法，在三周的時(shí)間內(nèi)至少在傷口患處施用兩次纖維蛋白封閉劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述方法，干/祖細(xì)胞為骨髓衍生細(xì)胞、造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、 外周血干細(xì)胞及其混合物和組合。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述方法，其中施用于傷口患處的纖維蛋白封閉劑為CO2Psi小于 5psi的噴霧劑形態(tài)。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述方法，纖維蛋白封閉劑局部施用于傷口患處。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述方法，皮膚替代物施用于傷口患處。
12.改善傷口患處瘢痕形成的方法，包括a)將干/祖細(xì)胞與纖維蛋白封閉劑組合，來(lái) 形成傷口封閉劑，該纖維蛋白封閉劑含有鈣凝血酶和纖維蛋白原，其中，鈣凝血酶的濃度約 為25單位/毫升，纖維蛋白原的濃度約為2至5毫克/毫升，干/祖細(xì)胞的最終濃度至少 約為1.5至2.0 X IO6個(gè)干/祖細(xì)胞/平方厘米；b)將纖維蛋白封閉劑施用到傷口患處上， 其中，所施用的纖維蛋白封閉劑為聚合凝膠或噴霧劑的形態(tài)。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述方法，在三周的時(shí)間內(nèi)至少在傷口患處施用兩次纖維蛋白封 閉劑。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述方法，干/祖細(xì)胞為骨髓衍生細(xì)胞、造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì) 胞、外周血干細(xì)胞及其混合物和組合。
15.根據(jù)權(quán)利要求12所述方法，施用于傷口患處的纖維蛋白封閉劑為CO2Psi小于5psi 的噴霧劑形態(tài)。
16.根據(jù)權(quán)利要求12所述方法，纖維蛋白封閉劑局部施用于傷口患處。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述方法，向傷口患處施用皮膚替代物。
18.根據(jù)權(quán)利要求12所述方法，傷口為燒傷的結(jié)果。
19.根據(jù)權(quán)利要求12所述方法，該瘢痕為肥厚性瘢痕。
20.制備纖維蛋白封閉劑的方法，包括提供纖維蛋白原復(fù)合體(FC)成分、鈣凝血酶 成分和細(xì)胞成分；向FC成分中添加細(xì)胞成分，再將FC成分與鈣凝血酶成分混合；向組合的FC/細(xì)胞成分的混合物中添加鈣凝血酶成分，其中纖維蛋白原的濃度約為2至5毫克/毫 升，干/祖細(xì)胞的最終濃度至少約為1.5至2.0 X IO6干/祖細(xì)胞/平方厘米。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述方法，鈣凝血酶的濃度約為25單位/毫升。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述方法，干/祖細(xì)胞選自以下細(xì)胞骨髓衍生細(xì)胞、造血干細(xì) 胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、外周血干細(xì)胞及其混合物和組合。
23.用于制備纖維蛋白封閉劑的試劑盒，其包括a)含有纖維蛋白原復(fù)合體成分的第 一個(gè)小瓶或存儲(chǔ)容器，其中，纖維蛋白原的濃度約為2至5毫克/毫升；及b)含有凝血酶成 分的第二個(gè)小瓶或存儲(chǔ)容器，該試劑盒還包含其使用說(shuō)明。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述試劑盒，凝血酶的濃度約為25單位/毫升。
25.根據(jù)權(quán)利要求23所述試劑盒，所述第一個(gè)小瓶或存儲(chǔ)容器任選包含細(xì)胞成分。
26.根據(jù)權(quán)利要求23所述試劑盒，如果所述第一個(gè)小瓶或存儲(chǔ)容器不含有細(xì)胞成分， 該試劑盒任選包含裝有細(xì)胞成分的第三個(gè)小瓶或存儲(chǔ)容器。
27.根據(jù)權(quán)利要求23所述試劑盒，該試劑盒進(jìn)一步包括在體外或體內(nèi)使用或施用纖維 蛋白封閉劑的儀器。
28.根據(jù)權(quán)利要求23所述試劑盒，該試劑盒還包含表征細(xì)胞成分的試劑。
29.纖維蛋白封閉劑，其包含纖維蛋白原復(fù)合體(FC)成分、凝血酶成分和細(xì)胞成分，其 中，用于形成凝膠的纖維蛋白原濃度介于約2至5毫克/毫升之間，細(xì)胞成分含有一種或更 多種干/祖細(xì)胞，纖維蛋白封閉劑含有至少1.5-2.0 X IO6個(gè)干/祖細(xì)胞/每平方厘米，其 中干/祖細(xì)胞為極小胚胎樣(VSEL)干細(xì)胞。
30.根據(jù)權(quán)利要求四所述方法，其中的VSEL干細(xì)胞為⑶34+/lin_/⑶45_或&￡1-17 lin7CD45"0
31.使用纖維蛋白封閉劑的方法，包括a)將干/祖細(xì)胞與纖維蛋白封閉劑組合，來(lái)形 成傷口封閉劑，該纖維蛋白封閉劑含有鈣凝血酶和纖維蛋白原，其中，鈣凝血酶的濃度約為 25單位/毫升，纖維蛋白原的濃度約為2至5毫克/毫升，干/祖細(xì)胞的最終濃度至少約為 1. 5至2. 0 X IO6個(gè)干/祖細(xì)胞/平方厘米，其中的干/祖細(xì)胞為極小胚胎樣(VSEL)干細(xì) 胞；b)將纖維蛋白封閉劑施用到皮膚傷口上，其中，所施用的纖維蛋白封閉劑為聚合凝膠 或噴霧劑的形態(tài)。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述方法，其中VSEL干細(xì)胞為0)347111170)45_或&￡1-171化7 CD45-。
33.改善傷口患處瘢痕形成的方法，包括a)將干/祖細(xì)胞與纖維蛋白封閉劑組合，來(lái) 形成傷口封閉劑，該纖維蛋白封閉劑含有鈣凝血酶和纖維蛋白原，其中，鈣凝血酶的濃度約 為25單位/毫升，纖維蛋白原的濃度約為2至5毫克/毫升，干/祖細(xì)胞的最終濃度至少 約為1. 5至2. 0 X IO6個(gè)干/祖細(xì)胞/平方厘米，其中的干/祖細(xì)胞為極小胚胎樣(VSEL) 干細(xì)胞；b)將纖維蛋白封閉劑施用到傷口患處，其中，所施用的纖維蛋白封閉劑為聚合凝 膠或噴霧劑的形態(tài)。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述方法，其中VSEL干細(xì)胞為CD34+/lin7CD45_或ka-l+/lin7 CD45- 。
35.制備纖維蛋白封閉劑的方法，包括提供纖維蛋白原復(fù)合體(FC)成分、鈣凝血酶 成分和細(xì)胞成分；向FC成分中添加細(xì)胞成分，再將FC成分與鈣凝血酶成分混合；向組合的FC/細(xì)胞成分的混合物中添加鈣凝血酶成分，其中纖維蛋白原的濃度約為2至5毫克/毫 升，干/祖細(xì)胞的最終濃度至少約為1.5至2.0 X IO6個(gè)干/祖細(xì)胞/平方厘米，其中的干 /祖細(xì)胞為極小胚胎樣(VSEL)干細(xì)胞。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述方法，其中的VSEL干細(xì)胞為⑶34+/lin_/⑶45_或ka-1+/ lin7CD45"0
37.治療硬皮病的方法，包括a)將干/祖細(xì)胞與纖維蛋白封閉劑組合，來(lái)形成傷口封 閉劑，該纖維蛋白封閉劑含有鈣凝血酶和纖維蛋白原，其中，鈣凝血酶的濃度約為25單位/ 毫升，纖維蛋白原的濃度約為2至5毫克/毫升，干/祖細(xì)胞的最終濃度至少約為1. 5至 2.0 X IO6個(gè)干/祖細(xì)胞/平方厘米；b)將纖維蛋白封閉劑施用到硬皮病潰瘍處，其中，所 施用的纖維蛋白封閉劑為聚合凝膠或噴霧劑的形態(tài)。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述方法，在三周的時(shí)間內(nèi)至少在傷口患處施用兩次纖維蛋白封 閉劑。
39.根據(jù)權(quán)利要求37所述方法，干/祖細(xì)胞為骨髓衍生細(xì)胞、造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì) 胞、外周血干細(xì)胞及其混合物和組合。
40.根據(jù)權(quán)利要求37所述方法，施用于傷口患處的纖維蛋白封閉劑為CO2Psi小于5psi 的噴霧劑形態(tài)。
41.根據(jù)權(quán)利要求37所述方法，纖維蛋白封閉劑局部施用于傷口患處。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述方法，皮膚替代物施用于傷口患處。
全文摘要
本文提供了使用干/祖細(xì)胞用于治療急和慢性傷口或促進(jìn)急和慢性傷口愈合的治療方法的組合物和方法。
文檔編號(hào)A61K38/36GK102046188SQ200980119753
公開(kāi)日2011年5月4日 申請(qǐng)日期2009年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月27日
發(fā)明者V·法蘭加 申請(qǐng)人:尼奧斯泰姆公司