專利名稱：：包括α2,3-和α2,6-唾液酸化的重組FSH的制作方法包括α2，3-和α2，6-唾液酸化的重組FSH本發(fā)明涉及用于治療不育的促性腺激素。具體地，本發(fā)明涉及促卵泡激素(FSH)。所述促性腺激素是一組在男性和女性中調(diào)節(jié)生殖腺功能的異二聚體糖蛋白激素。它們包括促卵泡激素(FSH)，黃體生成素(LH)和絨毛膜促性腺激素(CG)。FSH由垂體前葉腺自然分泌，并且發(fā)揮功能以支持卵泡發(fā)育和排卵。FSH包含對于其它糖蛋白激素LH和CG也是常見的92個氨基酸的α-亞基，以及賦予該激素生物學特異性的FSH獨有的111個氨基酸的β-亞基(Pierce和Parsons，1981)。每個亞基通過增加復雜的糖殘基進行翻譯后修飾。兩個亞基都攜帶關(guān)于N-連接的聚糖附著的2個位點，α亞基在氨基酸52和78處，β-亞基在氨基酸殘基7和M處(Rathnam和Saxena，1975，Saxena和Rathnam，1976)。因此，F(xiàn)SH糖基化到約30質(zhì)量％(Dias和VanRoey.2001.Fox等2001)。從更年期后人尿中純化的FSH已經(jīng)在不育治療中使用了許多年；其在自然生殖中促進排卵并且提供卵母細胞用于輔助生殖技術(shù)。FSH的兩種重組形式，Gonal-F(Serono)和Puregon(Organon)在20世紀90年代中期是可獲得的。這些都在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中表達(Howies，1996)。存在與FSH制劑相關(guān)的相當大的異質(zhì)性，其涉及在存在的不同的同分異構(gòu)體的量上的不同。單獨的FSH同工型顯示相同的氨基酸序列，但是在它們翻譯后修飾的程度上不同；具體的同工型特征為糖分枝結(jié)構(gòu)的異質(zhì)性以及唾液酸(末端糖)結(jié)合量的不同，這兩者都顯示影響具體的同工型生物活性。自然FSH的糖基化是高度復雜的。在自然來源的垂體FSH中的聚糖可以包含廣泛范圍的結(jié)構(gòu)，其可以包括二觸角聚糖、三觸角聚糖和四觸角聚糖的組合(Pierce和Parsons，1981.Ryan等.，1987。Baenziger和Green，1988)。所述聚糖可以具有其它的修飾核心巖藻糖基化、平分型葡糖胺、用乙?；樘前费由斓逆湣⒉糠只蛲耆僖核峄?sialylation)，具有α2，3和α2，6連接的唾液酸化，和取代半乳糖的硫酸化的半乳糖胺(Dalpathado等，2006)。此外，在單獨的糖基化位點的聚糖結(jié)構(gòu)的分布之間存在差異。在來自個體的血清以及來自絕經(jīng)期后婦女尿液的FSH中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)相當水平的聚糖復雜性(Wide等.，2007)。重組FSH產(chǎn)品的糖基化反映在宿主細胞系中存在的糖基轉(zhuǎn)移酶范圍?，F(xiàn)存的rFSH產(chǎn)品來自改造的中國倉鼠卵巢細胞(CH0細胞)。在CHO來源的rFSH中的聚糖修飾范圍比在來自垂體提取物或尿液的天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的那些更有限。在CHO來源的rFSH中發(fā)現(xiàn)的減少的聚糖異質(zhì)性的實例包括缺少平分型葡糖胺和降低含量的核心巖藻糖基化和乙?；樘前费由?Hard等，1990)。此外，CHO細胞僅能夠使用α2，3連接加入唾液酸(Kagawa等，1988，Takeuchi等，1988，Svensson等·，1990)。這不同于天然產(chǎn)生的FSH，其包含具有α2，3和α2，6_連接的唾液酸混合物的聚糖。已經(jīng)證實當與垂體、血清或絕經(jīng)期后尿液FSH比較時，重組FSH制劑(Organon)在具有低于4的等電點(pi)的FSH(考慮酸性同工型)的量上不同(U1Ioa-Aguirre等.1995)。與重組產(chǎn)物Gonal-fGerono)和Puregon(Organon)比較，在尿制備物中的酸性同工型的量高得多(Andersen等.2004)。這必定反映在rFSH中更低摩爾含量的唾液酸，因為用硫酸鹽修飾的帶負電荷的聚糖的含量在FSH中很低。與天然FSH比較，更低的唾液酸含量是兩種商購FSH產(chǎn)品的特征，并且因此必定反映制備方法中的限制(Bassett和Driebergen,2005)。存在大量的科學工作，其分析并嘗試解釋在不同個體之間的FSH糖基化變化以及在排卵周期過程中的變化。一項重要討論涉及這樣的觀察，即FSH濃度和唾液酸含量在所述周期的排卵前期過程中都減少。減少的唾液酸含量導致更具堿性的FSH，其都清除地更快，并且在體外至少在靶受體處更有效(Zambrano等1996)。關(guān)于這些變化的生物相關(guān)性以及它們可以怎樣涉及選擇優(yōu)勢卵泡的問題仍舊未得到解決(由Ulloa-Aguirre綜述，2003)。已經(jīng)關(guān)于來自多種來源的物質(zhì)記載了FSH的循環(huán)壽命。這些物質(zhì)中的一些已經(jīng)基于總分子電荷進行分離，如通過它們的Pi表征，其中更多的酸等同于更高的負電荷。如以前所指出的，對于總分子電荷的主要貢獻者是每種FSH分子的總唾液酸含量。例如，rFSH(Organon)具有約8m0l/m0l的唾液酸含量，而尿來源的FSH具有更高的唾液酸含量(deLeeuw等·1996)。在大鼠中的相應血漿清除率是0.34和0.14ml/min(U1Ioa-Aguirre等.2003)。在另一個實例中，其中將重組FSH樣品分為高和低pi級分，高pi(更低唾液酸含量)級分的體內(nèi)功效減少并且其具有更短的血漿半衰期(D’Antonio等.1999)。已經(jīng)報道在排卵周期的后期階段循環(huán)的更具堿性的FSH是由于α2，3唾液酸-轉(zhuǎn)移酶在垂體前葉中的下調(diào)，其由增加水平的雌二醇所導致(Damian-Matsumara等.1999.Ulloa-Aguirre等.2001)。尚未報道關(guān)于α2，6唾液酸-轉(zhuǎn)移酶的結(jié)果。FSH和rFSH的總唾液酸含量不是直接可比較的，因為唾液酸一般通過兩種方式連接。垂體/血清/尿FSH都包括α2，3和α2，6_連接的唾液酸，其中主要為前者。然而，CHO細胞來源的重組體僅包括α2，3(Kagawa等，1988，Takeuchi等，1988，Svensson等·，1990)。除了后者更低的唾液酸總含量以外，在天然產(chǎn)物和目前的重組產(chǎn)物之間存在另一種差異。CHO細胞普遍用于生產(chǎn)藥用人重組蛋白。結(jié)構(gòu)分析已經(jīng)鑒定唾液酸專門通過α2，3-連接來連接。(Kagawa等，1988，Takeuchi等，1988，Svensson等.，1990)。許多人糖蛋白包括α2，3_和α2，6_連接的混合物。因此，使用CHO系統(tǒng)表達的重組蛋白在它們的末端唾液酸連接類型上與它們的天然對應物不同。在生產(chǎn)藥用的生物制劑上這是一項重要的考慮因素，因為糖部分可以有助于所述分子的藥理學性質(zhì)。具有這樣的rFSH產(chǎn)品是理想的，所述rFSH產(chǎn)品更接近地復制或模擬由人尿生產(chǎn)的產(chǎn)品的生理化學和藥物代謝動力學性質(zhì)。具有這樣的rFSH產(chǎn)品是理想的，其與已知重組產(chǎn)物比較，具有一種或多種提高的藥物代謝動力學性質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，提供這樣的重組FSH(“rFSH”或“recFSH”)，其包括α2，3唾液酸化和α2，6唾液酸化和，任選地，α2，8唾液酸化。根據(jù)本發(fā)明的rFSH(或rFSH制劑)的全部唾液酸化的10%以上是α2，3_唾液酸化，例如全部唾液酸化的65-85%可以是α2，3_唾液酸化。本發(fā)明的rFSH(或rFSH制劑)的全部唾液酸化的50%以下可以是α2，6-唾液酸化，例如全部唾液酸化的15-35%可以是α2，6-唾液酸化。本發(fā)明的rFSH(或rFSH制劑)的全部唾液酸化的5%以下可以是α2，8-唾液酸化，例如全部唾液酸化的0.1-4%可以是α2，8-唾液酸化。根據(jù)本發(fā)明的rFSH(或rFSH制劑)可以具有6m0l/m0l以上，例如6mol/m0l-15m0l/m0l之間的唾液酸含量(以唾液酸的摩爾數(shù)與蛋白的摩爾數(shù)的比率表示)。申請人:已經(jīng)發(fā)現(xiàn)唾液酸連接的類型，α2，3-或α2，6_，可以具有對FSH的生物清除率的巨大影響。與CHO細胞系相比，人細胞系可以表達唾液酸通過α2，3和α2，6連接的重組FSH。在實施例4中，制備這樣的重組FSH細胞系，其表達包含具有低水平的α2，3-和α2，6_連接的唾液酸的聚糖的FSH(圖6)。這種堿性物質(zhì)，具有有限的唾液酸含量(圖4)，在大鼠中從循環(huán)中非常快地清除，如所預期的(圖7)。接著，通過加入編碼α2，6-唾液酸-轉(zhuǎn)移酶的基因?qū)λ黾毎颠M行第二個改造步驟(實施例幻。得到的rFSH是高度唾液酸化的，顯示可與尿FSH比較的唾液酸含量和pi分布(圖幻。然而，所述物質(zhì)以與具有低唾液酸含量的原始物質(zhì)相當?shù)乃俾蕪拇笫蟮难h(huán)中非?？斓厍宄?圖8)。這是意外的觀察，因為已知在天然和生物活性FSH上的一定比例的唾液酸是α2，6_連接的。發(fā)現(xiàn)α2，6_唾液酸化的rFSH的清除率是通過在肝中發(fā)現(xiàn)的脫唾液酸糖蛋白(ASGP)受體介導(實施例9)。這通過使用過量的另一種所述受體的底物來瞬時阻斷ASGP受體而得以證實。在受體被脫唾液酸胎球蛋白阻斷的情況下，恢復了關(guān)于高度唾液酸化的物質(zhì)的預期清除率(圖9)。這維持了數(shù)小時，直到阻斷被消除，并且α2，6連接的高度唾液酸化的rFSH恢復了其快速清除率。通過改造人細胞系以表達rFSH和α2，3唾液酸轉(zhuǎn)移酶來制備具有α2，3和α2，6-連接的唾液酸的混合物的重組FSH(實施例4和幻。表達的產(chǎn)物是高度酸性的并且攜帶α2，3_和α2，6_連接的唾液酸的混合物；后者由內(nèi)源的唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性提供(圖6)。與在常規(guī)CHO細胞中表達的rFSH比較，這具有兩個優(yōu)勢首先，由于這兩種唾液酸轉(zhuǎn)移酶的組合活性，所以所述物質(zhì)是更加高度唾液酸化的；其次，所述物質(zhì)更接近地類似于天然FSH0與CHO細胞來源的重組產(chǎn)物比較，這可能在生物學上是更加適合的，所述重組產(chǎn)物僅產(chǎn)生α2，3連接的唾液酸(Kagawa等，1988，Takeuchi等，1988，Svensson等.，1990)并且具有減少的唾液酸含量(Ulloa-Aguirre等.1995.，Andersen等.2004)。申請人:令人驚奇地發(fā)現(xiàn)與其它重組產(chǎn)物相比，本發(fā)明的rFSH可以更接近地復制或模擬天然人尿產(chǎn)物的生理化學和藥物代謝動力學性質(zhì)。換言之，本發(fā)明的rFSH可以更接近于“天然”FSH。關(guān)于給藥等，這可能具有明顯的優(yōu)勢。此外，更“天然”或更“人化”的產(chǎn)品對于可能需要治療的患者可能是更理想的，盡管在某種意義上，人工意味著盡可能的“是天然的”。與其它重組產(chǎn)物比較，在糖(例如聚糖)結(jié)構(gòu)上更接近于天然(例如人尿)FSH的重組產(chǎn)物可能具有其它優(yōu)勢(例如藥物代謝動力學優(yōu)勢)。因此，本發(fā)明是FSH的重組形式，其攜帶α2，3和α2，6唾液酸的混合物并且因此更接近地類似于天然FSH。與現(xiàn)存的重組產(chǎn)物比較，預期這種化合物關(guān)于控制的卵巢刺激，在IVF技術(shù)中的應用，以及排卵誘導的應用將導致卵巢的更天然的刺激。根據(jù)本發(fā)明，提供包含α2，3唾液酸化和α2,6唾液酸化的重組FSH(“rFSH”或“recFSH”)(和/或重組FSH制劑)。rFSH或rFSH制劑可以任選地進一步包含α2，8唾液酸化。在本文中，術(shù)語“重組FSH制劑”包括用于例如藥物應用的制劑，其包含重組FSH。在本發(fā)明的實施方案中，所述rFSH可以作為單一同工型或作為同工型的混合物存在。根據(jù)本發(fā)明的rFSH(或rFSH制劑)可以具有6m0l/m0l以上的唾液酸含量[以唾液酸的摩爾數(shù)與蛋白的摩爾數(shù)的比率表示](實施例8)，例如6m0l/m0l-15m0l/m0l，例如8mol/mol-14mol/mol,例如10mol/mol-14mol/mol,例如llmol/mol-14mol/mol,例如12mol/mol-14mol/mol，例如12mol/mol-13mol/mol。本發(fā)明的rFSH可以在人細胞系中生產(chǎn)或表達。根據(jù)本發(fā)明的rFSH(或rFSH制劑)的全部唾液酸化的10%以上可以是α2，3_唾液酸化。例如，全部唾液酸化的20，30，40，50，60，70，80或90%以上可以是α2，3-唾液酸化。所述rFSH(或rFSH制劑)可以以全部唾液酸化的65-85%的量，例如全部唾液酸化的70-80%，例如全部唾液酸化的71-79%的量包括α2，3_唾液酸化。本發(fā)明的rFSH(或rFSH制劑)的全部唾液酸化的50%以下可以是α2，6-唾液酸化。例如，全部唾液酸化的40，30，20，10，5%以下可以是α2，6-唾液酸化。所述rFSH(或rFSH制劑)可以以全部唾液酸化的15-35%的量，例如全部唾液酸化的20-30%，例如全部唾液酸化的21-%的量包括α2，6-唾液酸化。本發(fā)明的rFSH(或rFSH制劑)的全部唾液酸化的5%以下可以是α2，8_唾液酸化。例如，全部唾液酸化的2.5%以下可以是α2，8-唾液酸化。所述rFSH(或rFSH制劑)可以以全部唾液酸化的0.1到4%，例如全部唾液酸化的0.5-3%，例如全部唾液酸化的0.5-2.5%的量包括α2，8-唾液酸化。所謂唾液酸化，意味著在FSH糖結(jié)構(gòu)上存在著唾液酸殘基的量。α2，3-唾液酸化意味著在2，3位置處的唾液酸化(如本領(lǐng)域中公知的)和α2,6唾液酸化意味著在2，6位置處的唾液酸化(如本領(lǐng)域中公知的)。因此，“％的全部唾液酸化可以是α2，3唾液酸化”指在FSH中存在的唾液酸殘基的總數(shù)的％在2，3位置處被唾液酸化。術(shù)語“%的全部唾液酸化是α2，6-唾液酸化”指在FSH中存在的唾液酸殘基的總數(shù)的％在2，6位置處被唾液酸化。根據(jù)本發(fā)明的rFSH(或rFSH制劑)可以具有6質(zhì)量％以上(例如，6質(zhì)量％-15質(zhì)量％，例如，7質(zhì)量％-13質(zhì)量％，例如，8質(zhì)量％-12質(zhì)量％，例如，11質(zhì)量％-15質(zhì)量％，例如，12質(zhì)量％-14質(zhì)量％)的唾液酸含量(每個FSH分子唾液酸化的量)(基于蛋白質(zhì)的質(zhì)量，而不是蛋白質(zhì)加上糖的質(zhì)量)。在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中表達的重組FSH專門包含α2，3唾液酸化(Kagawa等，1988，Takeuchi等.1988，Svensson等.1990)。本發(fā)明的rFSH可以在人細胞系中生產(chǎn)或表達。其可以簡化生產(chǎn)方法(并使其更有效)，因為操作和控制例如細胞生長培養(yǎng)基以維持唾液酸化與已知方法相比可能是較不關(guān)鍵的。所述方法也可以是更有效的，因為與已知rFSH產(chǎn)品的生產(chǎn)比較，只有少量堿性rFSH產(chǎn)生；產(chǎn)生更多的酸性rFSH并且分離/去除堿性FSH是不存在問題的。rFSH可以在Per.C6細胞系，Per.C6來源的細胞系或修飾的Per.C6細胞系中生產(chǎn)或表達。所述細胞系可以使用α2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶進行修飾。所述細胞系可以使用α2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶修飾。備選地，或另外地，所述rFSH可以包含由[細胞系]的內(nèi)源唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性提供的α2，6_連接的唾液酸(α2，6唾液酸化)。所述rFSH可以使用α2，3_和/或α2，6_唾液酸轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生。所述rFSH可以使用α2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生。rFSH可以包含由內(nèi)源唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性提供的α2，6_鏈接的唾液酸((12，6唾液酸化)。根據(jù)本發(fā)明，在另一方面，提供產(chǎn)生如本文所述的rFSH和/或rFSH制劑的方法(根據(jù)本發(fā)明的各方面)，所述方法包含在人細胞系中生產(chǎn)或表達rFSH的步驟，所述人細胞系例如，Per.C6細胞系，Per.C6來源的細胞系，或修飾的Per.C6細胞系，例如已經(jīng)用α2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶修飾的細胞系。所述rFSH結(jié)構(gòu)包含聚糖部分?？梢园l(fā)生分支作用，結(jié)果是聚糖可以具有1，2，3，4個以上的末端糖殘基或“觸角”，如本領(lǐng)域中眾所周知的。本發(fā)明的rFSH可以具有聚糖，其中唾液酸化存在于單-觸角和/或二觸角和/或三觸角和/或四觸角的結(jié)構(gòu)上。rFSH可以優(yōu)選地包含單唾液酸化的，二唾液酸化的，三唾液酸化的和四唾液酸化的聚糖結(jié)構(gòu)，具有如下的相對量9-15%單唾液酸化；27-30%二唾液酸化；30-36%三唾液酸化和25-%四唾液酸化(例如，如通過帶電荷的聚糖的WAX分析所顯示，如在實施例8c中所顯示)。根據(jù)本發(fā)明，在另一方面，提供在人細胞系中產(chǎn)生的(例如表達的)rFSH。所述rFSH可以包括α2，3-和α2，6_唾液酸化?？梢栽赑er.C6細胞系，Per.C6來源的細胞系或修飾的Per.C6細胞系中生產(chǎn)或表達rFSH?？梢允褂忙?，3_唾液酸轉(zhuǎn)移酶修飾所述細胞系?？梢允褂忙?，6_唾液酸轉(zhuǎn)移酶修飾細胞系。備選地或另外地，rFSH可以包含由[細胞系]的內(nèi)源唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性提供的α2,6-連接的唾液酸(α2，6唾液酸化)。rFSH(或rFSH制劑)的全部唾液酸化的10%以上可以是α2，3-唾液酸化，例如全部唾液酸化的65-85%可以是α2，3-唾液酸化。本發(fā)明的rFSH(或rFSH制劑)的50%以下的全部唾液酸化可以是α2，6_唾液酸化，例如15-35%的全部唾液酸化可以是α2，6_唾液酸化。本發(fā)明的rFSH(或rFSH制劑)的5%以下的全部唾液酸化可以是α2，8-唾液酸化，例如0.5_4%的全部唾液酸化可以是α2，8-唾液酸化。所述rFSH可以具有6m0l/m0l以上的唾液酸含量，例如6m0l/m0l-15m0l/m0l之間的唾液酸含量(以唾液酸的摩爾數(shù)與蛋白質(zhì)的摩爾數(shù)的比率表不)。根據(jù)本發(fā)明，在另一方面，提供包含含有α2，3-唾液酸化和α2，6_唾液酸化(例如，如上提及)的rFSH的藥物組合物。所述藥物組合物還可以包含hCG和/或LH?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何方式獲得hCG。在本文中使用的hCG包含人來源的和重組hCG。可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法從任何適當來源(例如，尿和胎盤)純化人來源的hCG。表達和純化重組hCG的方法是本領(lǐng)域中眾所周知的。LH可以通過本領(lǐng)域中已知的任何方法獲得。LH，如本文所用，包含人來源的和重組LH?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何方法從任何適當?shù)膩碓?例如，尿)純化人來源的LH。表達和純化重組LH的方法是本領(lǐng)域中已知的。所述藥物組合物可以用于治療不育，例如，用于在例如輔助生殖技術(shù)(ART)，排卵誘導或?qū)m內(nèi)人工受精(IUI)中。所述藥物組合物可以例如用于這樣的醫(yī)學適應證，在所述適應證中使用已知FSH制劑。本發(fā)明還提供本文所述的rFSH和/或rFSH制劑(根據(jù)本發(fā)明的各方面)用于制備治療不育的藥物的應用?？梢詫⒈景l(fā)明的藥物組合物配制為用于任何藥物施用途徑的眾所周知的組合物，所述藥物施用途徑例如口服、直腸、腸胃外、透皮(例如，貼片技術(shù))、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、intrasusternal、陰道內(nèi)、腹膜內(nèi)、局部(粉末、藥膏或滴劑)或作為頰含或鼻噴霧劑。典型的組合物包含藥用載體，如水溶液、非毒性賦形劑，包括鹽和防腐劑，緩沖劑等，如特別在雷明頓藥物科學(Matt出版公司，197第15版，在1405-1412和1461-87頁中，以及在國家藥典(nationalformulary)XIV第十四版(美國藥物協(xié)會(AmericanPharmaceuticalAssociation),1975)中所述。適合的水性和非水性藥物載體、稀釋劑、溶劑或賦形劑的實例包括水、乙醇、多元醇(如甘油，丙二醇，聚乙二醇，等)，羧甲基纖維素及其適合的混合物，植物油(如橄欖油)，和可注射的有機酯如油酸乙酯。本發(fā)明的組合物還可以包含添加劑如，但不限于防腐劑、濕潤劑、乳化劑和分散劑。可以包含抗細菌劑和抗真菌劑以防止微生物的生長，并且包括，例如對羥基苯甲酸酯類、氯丁醇、苯酚、山梨酸等。此外，包含等張劑如糖、氯化鈉等可能是需要的。在一些情形中，為了實現(xiàn)延長的作用，需要延緩自皮下或肌內(nèi)注射的FSH(和其它活性成分，如果存在的話)的吸收。這可以通過使用具有較差水溶性的結(jié)晶或無定形物質(zhì)的液體混懸液來實現(xiàn)。FSH吸收的速率于是取決于其溶出速率，其又可以取決于晶體大小和晶體形式。備選地，腸胃外施用的FSH組合形式的延緩吸收通過將所述FSH組合溶解或懸浮在油賦形劑中實現(xiàn)?？勺⑸溟L效制劑形式可以通過在可生物降解的聚合物如聚交酯-聚乙交酯中形成FSH(和其它藥劑，如果存在的話)的微膠囊基質(zhì)來進行制備。取決于FSH與聚合物的比率以及所用的特定聚合物的性質(zhì)，可以控制FSH釋放的速率。其它可生物降解的聚合物的實例包括聚乙烯吡咯烷酮，聚(原酸酯)，聚(酐)等。可注射的長效制劑也通過將FSH包埋在脂質(zhì)體或微乳中進行制備，所述脂質(zhì)體或微乳可與體組織相容?？勺⑸渲苿┛梢岳缤ㄟ^經(jīng)過留住細菌(bacterial-retaining)的濾器進行過濾，或通過摻入無菌固體組合物形式的滅菌劑來進行滅菌，所述無菌固體組合物可以溶解或分散在無菌水或其它無菌可注射介質(zhì)中，之后立即使用?？梢詫⒖勺⑸渲苿┰谌魏芜m合的容器中提供，所述容器例如瓶子、預先填充的注射器、注射藥筒等?？勺⑸渲苿┛梢宰鳛檫@樣的產(chǎn)品供應，所述產(chǎn)品具有包含F(xiàn)SH的藥物組合物(任選地具有hCG，LH等)。如果存在超過一種活性成分(即FSH，和例如hCG或LH)，這些可以適合于單獨或在一起施用。如果單獨施用，施用可以是順序的。所述產(chǎn)品可以在任何適合的包裝中供應。例如，產(chǎn)品可以包含許多含有FSH，hCG，或FSH和hCG的組合的預先填充的注射器，在泡眼包裝或其它裝置里包裝注射器以保持無菌。產(chǎn)品可以任選地包含使用所述FSH和hCG制劑的說明書。根據(jù)本領(lǐng)域中的常規(guī)實踐調(diào)整藥物組合物中各種成分的pH和提取物濃度。見GOODMAN禾口GILMAN，sTHEPHARMACOLOGICALBASISFORTHERAPEUTICES(治療劑的藥物基礎)，第7版。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的組合物作為用于腸胃外施用的組合物供應。制備腸胃外制劑的一般方法是本領(lǐng)域中已知的并且在REMINGTON;THESCIENCEANDPRACTICEOFPHARMACY(雷明頓藥物科學和實踐)，上文，第780-820頁中描述。腸胃外組合物可以以液體制劑或作為固體供應，所述固體與無菌可注射介質(zhì)混合，之后立即施用。在尤其優(yōu)選的實施方案中，腸胃外組合物以易于施用和同樣劑量的劑量單位形式供應。發(fā)明詳述現(xiàn)在參照下面的實施例和附圖更詳細地描述本發(fā)明圖1顯示pFSHα/β表達載體的質(zhì)粒圖譜；圖2顯示α2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(ST3GAL4)表達載體；圖3顯示α2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(ST6GAL1)表達載體；圖4顯示由穩(wěn)定表達FSH的Per.C6細胞生產(chǎn)的重組FSH的等電聚焦；圖5顯示在用α2，3_或α2，6_唾液酸轉(zhuǎn)移酶改造后，通過由穩(wěn)定表達FSH的Per.C6細胞生產(chǎn)的重組FSH的等電聚焦分析的克隆的實例；圖6顯示Per.C6FSH的唾液酸連接的分析；圖7顯示Per.C6FSH樣品的代謝清除率(MCRs)；圖8顯示α2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶改造的Per.C6FSH樣品的MCRs；圖9顯示α2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶改造的Per.C6FSH樣品的MCRs；圖10顯示α2，3_唾液酸轉(zhuǎn)移酶改造的Per.C6FSH樣品的MCRs；圖11顯示根據(jù)Meelman和Pohley(1953)的方法，通過親代Per.C6rFSH的Per.C6rFSH克隆導致的卵巢重量增力口(ovarianweightaugmentation)；圖12顯示通過改造的(α2，6_唾液酸轉(zhuǎn)移酶)Per.C6rFSH導致的Per.C6rFSH克隆的卵巢重量增加；和圖13顯示通過改造的(α2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶)Per.C6rFSH導致的Per.C6rFSH克隆的卵巢重量增加。序列選擇人FSH根據(jù)Fiddes和Goodman.(1981)使用FSHa多肽的基因編碼區(qū)。序列登記為AH007338，并且在構(gòu)建時，不存在該蛋白序列的其它變體。該序列在本文中稱為SEQID1。根據(jù)Keene等(1989)使用FSHβ多肽的基因編碼區(qū)。將所述序列登記為ΝΜ_000510，并且在構(gòu)建時，不存在該蛋白序列的其它變體。該序列在本文登記為SEQID2。唾液酸轉(zhuǎn)移酶α2，3_唾液酸轉(zhuǎn)移酶-根據(jù)Kitagawa和Paulson(1994)使用β-半乳糖苷0-2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶4(02，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶，513641^4)的基因的編碼區(qū)。將序列登記為L23767，并且在本文稱為SEQID3。α2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶-根據(jù)Grundmarm等(1990)使用β-半乳糖酰胺(galactosamide)α-2，6_唾液酸轉(zhuǎn)移酶1(α2，6_唾液酸轉(zhuǎn)移酶，ST6GAL1)的基因編碼區(qū)。將序列登記為ΝΜ_003032并且在本文稱為SEQID4。實施例實施例1FSH表達載體的構(gòu)建分別使用引物組合FSHa-fw和FSHa-rev和FSHb-fw和FSHb-rec，通過PCR擴增FSHa多肽(AH007338，SEQID1)禾口FSH3多肽(NM_003032，SEQID2)的編碼序列。FSHa-fw5’-CCAGGATCCGCCACCATGGATTACTACAGAAAAATATGC-3，F(xiàn)SHa-rev5’-GGATGGCTAGCTTAAGATTTGTGATAATAAC-3’FSHb-fw5’-CCAGGCGCGCCACCATGAAGACACTCCAGTTTTTC-3，F(xiàn)SHb-rev5’-CCGGGTTAACTTATTATTCTTTCATTTCACCAAAGG-3’將得到的擴增FSHβDNA用限制性酶AscI和HpaI消化，并將其插入在攜帶新霉素選擇標記的CMV驅(qū)動的哺乳動物表達載體的AscI和HpaI位點中。類似地，將FSHαDNA用BamHI和NheI消化，并將其插入到在已經(jīng)包含F(xiàn)SHi^多肽DNA的表達載體上的位點BamHI禾口NheI中。將載體DNA用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)的DH5α菌株。選擇60個克隆用于擴增，并且57個包含含有FSHa和β的載體。選擇這些中的20個用于測序并且所有的包含正確的根據(jù)SEQID1和SEQID2的序列。選擇質(zhì)粒pFSHA+B#17用于轉(zhuǎn)染(圖1)。實施例2ST3表達載體的構(gòu)建使用引物組合2，3STfw和2，3STrev，通過PCR擴增β-半乳糖苷α_2，3_唾液酸轉(zhuǎn)移酶4(ST3，L23767，SEQID3)的編碼序列。2,3STfw5’-CCAGGATCCGCCACCATGTGTCCTGCAGGCTGGAAGC-3’2,3STrev5，-TTTTTTTCTTAAGTCAGAAGGACGTGAGGTTCTTG-3，將得到的擴增的ST3DNA用限制性酶BamHI和AflII進行消化，并將其插入在攜帶潮霉素抗性標記的CMV驅(qū)動的哺乳動物表達載體上的BamHI和AflII位點中。將所述載體如前述擴增，并且測序。克隆pST3#l(圖2)包含正確的根據(jù)SEQID3的序列，并將其選擇用于轉(zhuǎn)染。實施例3ST6表達載體的構(gòu)建使用引物組合2，6STfw和2，6STrev，將β-半乳糖酰胺α-2，6_唾液酸轉(zhuǎn)移酶1的編碼序列(ST6,NM_003032,SEQID4)通過PCR進行擴增。2,6STfw5’-CCAGGATCCGCCACCATGATTCACACCAACCTGAAG-3，2,6STrev5，-TTTTTTTCTTAAGTTAGCAGTGAATGGTCCGG-3，將得到的擴增的ST6DNA用限制性酶BamHI和AflII進行消化，并將其插入攜帶潮霉素抗性標記的CMV驅(qū)動的哺乳動物表達載體上的BamHI和AflII位點中。將所述載體如前述擴增并且測序。克隆pST6#ll(圖3)包含正確的根據(jù)SEQID4的序列并將其選擇用于轉(zhuǎn)染。實施例4pFSHA+B在PER.C6細胞中的穩(wěn)定表達。轉(zhuǎn)染分離和克隆的篩選。通過在單一質(zhì)粒中表達FSH的多肽鏈產(chǎn)生生產(chǎn)FSH的Per.C6克隆(見實施例1)。為了獲得穩(wěn)定的克隆，使用關(guān)于pFSHA+B構(gòu)建體的基于脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染試劑。在補充了10%FCS并包含G418的VPRO中選擇穩(wěn)定的克隆。在轉(zhuǎn)染后三周，G418抗性克隆生長。選擇共250個克隆用于分離。在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)分離的克隆直到70-80%匯合。使用FSH選擇性ELISA測定上清液的FSH蛋白含量，并且使用cAMP積累測定法(CAMPaccumulationassay)，在克隆的細胞系中測定關(guān)于FSH受體的藥理學活性。表達功能蛋白的克隆(98)進一步培養(yǎng)擴增到M孔、6孔和T80燒瓶。在產(chǎn)生足量的物質(zhì)的T80燒瓶中開始關(guān)于確定來自7個克隆的物質(zhì)的生產(chǎn)率和質(zhì)量的研究。在如前述的補充培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞7天，并且收集上清液。使用FSH選擇性ELISA測定生產(chǎn)率。確定所述物質(zhì)的等電圖譜(實施例6)。代表性樣品顯示在圖4中。將來自IEF的信息用于關(guān)于代謝清除率分析來選擇克隆(實施例9)。關(guān)于唾液酸轉(zhuǎn)移酶改造，選擇具有足夠生產(chǎn)率和質(zhì)量的克隆(005，104，179，223，144)。實施例5唾液酸化水平在過量表達α2，3-或α2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的細胞中增加。pST3或pST6在表達FSH的PER.C6細胞中穩(wěn)定表達；轉(zhuǎn)染分離和克隆篩選。通過從在Per.C6細胞中的各個質(zhì)粒(見實施例2和3)表達α2，3唾液酸轉(zhuǎn)移酶或α2，6唾液酸轉(zhuǎn)移酶來產(chǎn)生生產(chǎn)高度唾液酸化FSH的Per.C6克隆，所述Per.C6細胞已經(jīng)表達了FSH的兩條多肽鏈(見實施例4)。選擇在實施例4中提及的由PER.C6細胞產(chǎn)生的四個克隆它們的性質(zhì)，所述性質(zhì)包括生產(chǎn)率，良好生長曲線，功能蛋白的產(chǎn)生，和包含一些唾液酸化的產(chǎn)生的FSH。如前在實施例4中所述產(chǎn)生穩(wěn)定的克隆。共分離來自α2，3_唾液酸轉(zhuǎn)移酶程序的202個克隆和來自α2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶程序的210個克隆，將其擴增并測定。關(guān)于α2，3-研究的最終克隆數(shù)是12個，關(guān)于α2，6-研究是30個。α2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶克隆適應于無血清培養(yǎng)基以及混懸液條件。使用FSH選擇性ELISA，在FSH受體細胞系中的功能反應，IEF(實施例6)，代謝清除率(實施例9)和MeelmanPohley分析(實施例10)測定如前的克隆。將結(jié)果與商購重組FSH(G0nal-f，Serono)和親代FSHPer.C6細胞系進行比較。將代表性樣品顯示在圖5中。一些克隆沒有顯示唾液酸化的增加，但是可以觀察到與不表達α2，3-或α2，6_唾液酸轉(zhuǎn)移酶的FSH比較，由大多數(shù)克隆產(chǎn)生的FSH具有顯著提高的唾液酸化(即，平均而言更多的FSH同工型，更多數(shù)量的唾液酸)。結(jié)論即為，在Per.C6細胞中FSH與唾液酸轉(zhuǎn)移酶一起的表達導致與僅表達FSH的細胞比較，增加水平的唾液酸化的FSH。實施例6通過等電聚焦分析Per.C6產(chǎn)生的FSH同工型的pi電泳定義為帶電荷的分子通過電場經(jīng)過溶劑運輸帶電的分子。生物分子經(jīng)過電場的移動性將取決于場強、分子上的凈電荷、分子的大小和形狀、離子強度和分子遷移經(jīng)過的介質(zhì)的性質(zhì)。等電聚焦(IEF)是基于它們的pi分離蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)。Pl是這樣的pH，在所述PH蛋白質(zhì)不帶凈電荷并在電場中不會遷移。FSH同工型的唾液酸含量精細地改變每種同工型的Pl點，可以使用這種技術(shù)研究以顯現(xiàn)來自每種克隆的Per.C6FSH同工型。使用等電聚焦分析在細胞培養(yǎng)物上清液中的Per.C6產(chǎn)生的FSH同工型的等電點。如在實施例4和5中所述產(chǎn)生來自Per.C6FSH克隆的細胞培養(yǎng)基。在兩性電解質(zhì)溶液pH3.0-7.0中，在pH3.0-7.0梯度的天然條件下，在包含5%聚丙烯酰胺的NovexIEF凝膠上分離Per.C6FSH樣品。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到支持的硝基纖維素上，并且使用顯現(xiàn)條帶的一級抗-FSHa單克隆抗體、二級抗小鼠IgG堿性磷酸酶綴合的抗體和5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸酯(BCIP)和氮藍四唑(NBT)試劑來顯現(xiàn)。如在圖4和5中所顯示，所述條帶代表包含不同數(shù)量唾液酸分子的FSH的同工型。使用這種方法，鑒定產(chǎn)生具有更多數(shù)量唾液酸分子的FSH同工型的克隆。用α2，3-或α2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶進行的改造導致具有更多唾液酸和更低pi的克隆。實施例7Per.C6FSH的唾液酸連接的分析使用基于凝集素的聚糖區(qū)分方法分析復合糖。使用這種方法，可以表征與硝基纖維素結(jié)合的糖蛋白和復合糖。凝集素選擇性識別特定部分，例如α2，3連接的唾液酸。使用的凝集素與類固醇半抗原洋地黃毒苷綴合，這使得能夠進行結(jié)合的凝集素的免疫學檢測。使用標準SDS-PAGE技術(shù)分離來自親代克隆(沒有另外的唾液酸轉(zhuǎn)移酶)，α2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶改造的克隆和α2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶改造的克隆的純化的Per.C6FSH。將商購重組FSH(Gonal-f，Serono)用作標準物。根據(jù)制造商的說明書，使用DIG聚糖區(qū)分試劑盒(目錄號11210238001，羅氏)分析唾液酸。與黑接骨木(Sambucusnigra)凝集素(SNA)的陽性反應指示末端連接(2-6)唾液酸。與朝鮮槐(Maackiaamurensis)凝集素II(MAA)的陽性反應指示末端連接(α2-3)的唾液酸。簡言之，親代克隆005包含低水平的α2，3-和α2，6_唾液酸。用α2，3_唾液酸轉(zhuǎn)移酶改造的克隆包含高水平的α2，3-唾液酸連接和低水平的α2，6_唾液酸連接。用α2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶改造的克隆包含高水平的α2，6-唾液酸連接和低水平的α2，3_唾液酸連接。標準的對照Gonal-f僅包括α2，3_唾液酸連接。這與關(guān)于在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中產(chǎn)生的重組蛋白已知的情況是一致的(Kagawa等，1988，Takeuchi等，1988，Svensson等·，1990)。結(jié)論為，用α2，3-或α2，6_唾液酸轉(zhuǎn)移酶改造Per.C6FSH細胞成功地增加與樣品中FSH綴合的唾液酸分子的數(shù)量。實施例8a總唾液酸量化唾液酸是被認為是單糖的蛋白結(jié)合的糖并且與其它單糖如半乳糖、甘露糖、葡糖胺、半乳糖胺和巖藻糖組合存在。根據(jù)制造商的手冊(Sigma，Sialic-Q)，使用酶促唾液酸量化試劑盒測量在純化的rFSH上的總唾液酸(實施例11)。簡言之，N-乙酰基神經(jīng)氨酸醛縮酶催化唾液酸為N-乙?；鵰armoasine和丙酮酸。可以通過β-NADH和乳酸脫氫酶將丙酮酸還原為乳酸?？梢砸苑止夤舛扔嬀_測量B-NADH氧化。使用基于Lowry方法(Lowry等，1951)的商業(yè)二喹啉甲酸(bicinchoninicacid)(BCA)測定試劑盒(Sigma，B9643)，在微量滴定板中測量蛋白濃度。測量Per.C6FSH的總唾液酸含量并且發(fā)現(xiàn)其大于6m0l/m0l。實施例汕α2，3，α2，6和α2，8唾液酸的相對量的量化使用已知技術(shù)測量α2，3，α2，6和α2，8唾液酸在純化的rFSH(實施例11)上的相對百分比量。將rFSH的每個樣品固定化(凝膠塊)，洗滌，還原，烷基化并且用PNGaseF消化過夜。接著，將N-聚糖進行提取和處理。用如在Royle等中詳述的熒光團2AB標記用于NP-HPLC和WAX-HPLC分析的N-聚糖。所述N-聚糖在TSK酰胺柱上的正常相(NP)HPLC上運行(如在Royle等中所述)，其停留時間以葡萄糖單位(GU)表示。將提取、合并的聚糖(如上提取)的樣品用不同的唾液酸酶消化以確定連接。NAN1(重組唾液酸酶)釋放α2，3連接的非還原末端唾液酸(NeuNAc和NeuNGc)，ABS(產(chǎn)脲節(jié)桿菌(Arthrobacterureafaciens)唾液酸酶)釋放α2,3,α2，6和α2，8連接的非還原末端唾液酸(NeuNAc和NeuNGc)。通過NP-HPLC分析樣品，從而允許將未消化的樣品與用NANl消化的樣品和用ABS消化的樣品進行比較。三個NP-HPLC痕量(未消化的，NANl消化的，ABS消化的)比較顯示用ABS和NAm進行的消化提供不同的結(jié)果。其顯示樣品具有攜帶α2，3，α2，6和α2，8連接的唾液酸。從在未消化的聚糖庫中存在的結(jié)構(gòu)計算相對百分比，并且發(fā)現(xiàn)其關(guān)于α2，3唾液酸化是65%-85%的范圍(例如，77.75%)；關(guān)于α2，6唾液酸化是15-35%的范圍(例如，21.46%)；并且關(guān)于02，8唾液酸化是0.的范圍。實施例8c單、二、三和四觸角唾液酸化的結(jié)構(gòu)的相對量的量化使用已知技術(shù)，測量從純化的rFSH(實施例11)提取的聚糖上的單、二、三和四唾液酸化的結(jié)構(gòu)的相對百分比量。將rFSH的每個樣品固定化(凝膠塊)，洗滌，還原，烷基化并用PNGaseF消化過夜。接著，對N-聚糖進行提取和處理。用熒光團2AB標記用于NP-HPLC和WAX-HPLC分析的N-聚糖，如在Royle等中所述。如在Royle等中所述進行弱陰離子交換(WAX)HPLC以通過電荷分離N-聚糖(實施例8b)，其中將胎球蛋白N-聚糖標準物用作參照。根據(jù)它們包含的唾液酸的數(shù)量洗脫聚糖。所有的樣品包括單(1S)，二(2S)，三(3S)和四GS)唾液酸化結(jié)構(gòu)。發(fā)現(xiàn)唾液酸化結(jié)構(gòu)的相對量在下列比率(1S2S4S4S)中9-15%27-30%30-36%25-29%(例如10.2428.6535.4925.62)。實施例9確定rFSH的代謝清除率為了確定Per.C6FSH樣品的代謝清除率(MCR)，將清醒的雌性大鼠(每個克隆3只動物)在O時間點，用rFSHd-lOyg/大鼠，基于樣品的ELISA量化，DRGEIA1288)推注到尾靜脈中。在測試樣品注射后1，2，4，8，12，M和32小時，從尾尖提取血液樣品(400μ1)。通過離心收集血清，并且通過ELISA(DRGEIA1288)測定FSH含量。脫唾液酸糖蛋白受體(ASGP-R)識別脫唾液酸化(半乳糖-末端)的糖蛋白，如脫唾液酸胎球蛋白(ASF)。(Pricer和Ashwell，1971.VanLenten和Ashwel1，1972)。ASGP受體和結(jié)合的脫唾液酸化糖蛋白被內(nèi)在化到細胞中，在所述細胞中受體被再循環(huán)并且配體被降解(Regoeczi等，1978，Steer和Ashwell，1980)。為了研究Per.C6FSH物質(zhì)是否通過該機制清除，將ASGP-R用脫唾液酸胎球蛋白飽和。如關(guān)于共同施用最少7500倍摩爾過量的脫唾液酸胎球蛋白以飽和ASGP-R達1_2小時來測定親代、α2，6或α2，3_唾液酸轉(zhuǎn)移酶改造的物質(zhì)的代謝清除率。由親代Per.C6FSH克隆產(chǎn)生的物質(zhì)包含一些更長的MCR物質(zhì)，但是高比例的物質(zhì)被迅速清除(圖7)。使用α2，6-或α2，3_唾液酸轉(zhuǎn)移酶改造包含唾液酸化程度最高物質(zhì)的先導克隆005(實施例幻。盡管用α2，6_唾液酸轉(zhuǎn)移酶改造的克隆顯示增加的唾液酸化(圖5)，但是在MCR中沒有提高(圖7)。ASGR的阻斷恢復α2，6物質(zhì)的MCR到標準物的MCR，證實即使具有增加的α2，6連接，所述物質(zhì)也被迅速清除(圖8)。用α2，3_唾液酸轉(zhuǎn)移酶進行的改造導致這樣的克隆，其具有與標準物相當?shù)腗CR(圖9)，并且改變的唾液酸含量與關(guān)于FSH的同工型已知的唾液酸含量一致(圖10)。實施例10Steelman-Pohley體內(nèi)測定法為了證實在FSH上增加的唾液酸含量導致增加的生物學作用，檢查了由高度唾液酸化的FSH、如在實施例5中產(chǎn)生的FSH導致的大鼠的卵巢重量的增加。根據(jù)Meelman和Pohley(1953)的方法分析由于Per.C6rFSH克隆導致的卵巢重量的增加。通過ELISA(DRG，EIA-U88)量化來自過濾的細胞培養(yǎng)基樣品的Per.C6rFSH。在5個不同的劑量(3只動物/劑量)測試樣品(Per.C6rFSH)和標準物(Gonal-frFSH)。以50，100，200，400，和800ng/大鼠給藥Gonal-f。使用它們相對于Gonal-f的AUC值來計算樣品劑量，典型地為0.05-10μg/大鼠。結(jié)論即為，由親代Per.C6FSH克隆(圖11)產(chǎn)生的唾液酸化不足(undersialylated)的物質(zhì)在卵巢重量增加測定中并沒有商購的rFSH那樣有效。進行改造以增加另外的α2，6_連接的唾液酸轉(zhuǎn)移酶增加了唾液酸含量，但是沒有提高體內(nèi)測定法的功效(圖12)。然而，另外的α2，3-連接顯著提高了功效(圖13)并且兩種重組FSH制劑(Per.C6和CHO-來源)在該測定法中顯示了非常類似的性質(zhì)。實施例11生產(chǎn)和純化綜述開發(fā)了一種在PER.C6細胞中生產(chǎn)FSH的方法，其在無血清培養(yǎng)基中混懸培養(yǎng)。在下面描述所述方法并且將其應用于一些生產(chǎn)FSH的PER.C6細胞系。使用由Lowry等.(1976)所述的方法的改進方法來制備來自親代克隆005，α2,3-克隆007和α2，6克隆059的FSH(1976)。對于PER.C6-FSH的生產(chǎn)，使所述細胞系適應于無血清培養(yǎng)基，即Excell525(JRHBiosciences(JRH生物科學))。首先將所述細胞在T80培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)到形成70%-90%匯合單層。傳代后，將細胞重新懸浮在無血清培養(yǎng)基，Excell525+4mML-谷氨酰胺中到0.3xl06細胞/ml的細胞密度。將25ml的細胞混懸液置于250ml搖瓶中，并在5%CO2下，在37°C，在IOOrpm搖動。在達到>IxlO6細胞/ml的細胞密度后，將細胞繼代培養(yǎng)到0.2或0.3xl06細胞/ml的細胞密度，并且在搖瓶中，在37°C，5%CO2和IOOrpm進一步培養(yǎng)。對于FSH的生產(chǎn)，將細胞轉(zhuǎn)移到無血清生產(chǎn)培養(yǎng)基，即VPR0CJRHBiosciences(JRH生物科學))中，其支持PER.C6細胞的生長到非常高的細胞密度(在批次培養(yǎng)物中通常為>IO7細胞/ml)。首先，將所述細胞在Excell525中培養(yǎng)到>IxlO6細胞/ml，接著在IOOOrpm離心5分鐘，并隨后懸浮在VPRO培養(yǎng)基+6mML-谷氨酰胺中到IxlO6細胞/ml的密度。接著，將細胞在37°C，5%C02和lOOrpm，在搖瓶中培養(yǎng)7-10天。在該階段過程中，將所述細胞培養(yǎng)到>IO7細胞/ml的密度。在細胞生命力開始下降后收獲培養(yǎng)基。將所述細胞在IOOOrpm離心5分鐘，并將所述上清液用于FSH的量化和純化。使用ELISA(DRGEIA1288)確定FSH的濃度。隨后，使用由Lowry等.(1976)所述方法的改進方法進行FSH的純化。這通過在DEAE纖維素上的層析法，在kphadexGlOO上的凝膠過濾，在羥基磷灰石上的吸附層析法，和制備聚丙烯酰胺電泳來實現(xiàn)。在所有的層析方法中，通過RIA(DRGEIA1288)和IEF(實施例6)證實免疫反應性FSH的存在。參考文獻AndersenCY,WestergaardLG,禾口vanWelyΜ.(2004).FSHisoformcompositionofcommercialgonadotrophinpreparations-.aneglectedaspect？(1!'^!/的FSH，被忽視的方面？)R印rodBiomedOnline(生殖醫(yī)學在線).9),231-236.AreyBJ,StevisΡΕ,DeecherDC,ShenES,FrailDE,Negro-VilarA,禾口LopezFJ.(1997)InductionofpromiscuousGproteincouplingofthefollicle-stimulatinghormone(FSH)receptor:anovelmechanismfortransducingpleiotropicactionsofFSHisoforms(促卵泡激素(FSH)受體的非種系選擇性的G蛋白偶聯(lián)一種FSH同工型的轉(zhuǎn)導多向性作用的新機制).MolEndocrinol.(分子內(nèi)分泌學)11(5),517-526.BaenzigerJU禾口GreenED.(1988).Pituitaryglycoproteinhormoneoligosaccharides:structure,synthesisandfunctionoftheasparagine-1inkedoligosaccharidesonlutropin,follitropinandthyrotropin(垂體||蛋白激素寡糖在促黃體激素、促濾泡素和促甲狀腺素上的天冬酰胺-連接的寡糖的結(jié)構(gòu)、合成和功能).BiochimBiophysActa.(牛物化學牛物物理學報)947(2),287-306.BassettRM,禾口DriebergenR.(2005).Continuedimprovementsinthequalityandconsistencyoffollitropinalfa,recombinanthumanFSH(在促卵泡激素α重組人FSH的質(zhì)量和一致性上的持續(xù)改善).R印rodBiomedOnline(生殖生物醫(yī)學在線)·10(2),169-177.Damian-MatsumuraP,ZagaV,MaldonadoA,Sanchez-HernandezC,TimossiC,禾口Ulloa-AguirreΑ.(1999).Oestrogensregulatepituitaryalpha2,3-sialyltransferasemessengerribonucleicacidlevelsinthefemalerat(:!!大鼠中雌激素調(diào)節(jié)垂體α2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶信使核糖核酸水平).JMolEndocrinol.(內(nèi)分泌學雜志)23(2),153-165.D’AntonioΜ.，BorrelliF.，DatolaΑ.，BucciR.，MasciaΜ.，PollettaP.，PiscitelliD.,禾口PapoianR.(1999)Biologicalcharacterizationofrecombinanthumanfolliclestimulatinghormoneisoforms(重組人促卵泡激素同工型的生物學表征).HumanR印roduction(人類生殖)，1160-1167DalpathadoDS,IrunguJ,GoEP,ButnevVY,NortonK,BousfieldGR,禾口DesaireH.(2006).Comparativeglycomicsoftheglycoproteinfolliclestimulatinghormone:glycopeptideanalysisofisolatesfromtwomammalianspecies(糖蛋白促卵泡激素的比較糖組學來自2個哺乳動物物種的分離株的糖肽分析).Biochemistry(生物化學).45(28),8665-8673.無拷貝DiasJA,VanRoeyP.(2001).Structuralbiologyofhumanfollitropinanditsrec印tor(人促濾泡素及其受體的結(jié)構(gòu)生物學).ArchMedRes.(醫(yī)學研究進展)32(6),510-519Fiddes,J.C.禾口Goodman,H.Μ.(1979)Isolation,cloningandsequenceanalysisofthecDNAforthealpha-subunitofhumanchorionicgonadotropin(A絨毛膜促性腺激素的α亞基的cDNA的分離、克隆和序列分析).NatUre(自然)，觀1，351-356.Flack,Μ.R.，Bennet,Α.P.，F(xiàn)roehlich,J.Anasti,JN禾口Nisula，B.(1994).Increasedbiologicalactivityduetobasicisoformsinrecombinanthumanfollicle-stimulatinghormoneproducedinahumancellline(由于在人細胞系中產(chǎn)生的重組人促卵泡激素的堿性同工型的增加的生物學活性).J.Clin.Endocrino1.Metab(臨床內(nèi)分泌學代謝雜志).,79,756-760FoxKM,DiasJA,禾口VanRoeyP.(2001).Three-dimensionalstructureofhumanfollicle-stimulatinghormone(人促卵泡激素的三維結(jié)構(gòu))·MolEndocrinol.(分子內(nèi)分泌學)15(3),378-89GrabenhorstE,HoffmannA,NimtzΜ,ZettlmeisslG，禾口ConradtHS.(1995).ConstructionofstableBHK-21cellscoexpressinghumansecretoryglycoproteinsandhumanGal(beta1-4)GlcNAc-Ralpha2,6-sialyltransferasealpha2,6-linkedNeuAcispreferentiallyattachedtotheGal(betal—4)GlcNAc(beta1—2)Man(alpha1-3)-branchofdiantennaryoligosaccharidesfromsecretedrecombinantbeta-traceprotein(共表達人分泌糖蛋白和人Gal(β1-4)GlcNAc-Rα2，6_唾液酸轉(zhuǎn)移酶α2，6_連接的NeuAc的穩(wěn)定的ΒΗΚ-21細胞的構(gòu)建優(yōu)先地連接于來自分泌的重組β痕量蛋白的二觸角寡糖的fell(β1-4)GlcNAc(β1-2)Man(α1-3)-分支).EurJBiochem.(歐洲生物化學雜志)232(3),718-25.GreenED禾口BaenzigerJU.(1988).Asparagine-Iinkedoligosaccharidesonlutropin,follitropin,andthyrotropin.II.Distributionsofsulfatedandsialylatedoligosaccharidesonbovine,ovine,andhumanpituitaryglycoproteinhormones(在促黃體激素、促卵泡激素和促甲狀腺激素上的天冬酰胺連接的寡糖II.在牛、綿羊和人垂體糖蛋白激素上的硫酸化和唾液酸化寡糖的分布).JBiolChem(生物化學雜志)·263(1)，36-44.Grundmann,U.，Nerlich,C.，Rein,Τ.禾口Zettlmeissl，G.(1990).CompletecDNAsequenceencodinghumanbeta-galactosidealpha-2,6-sialyltransferase(IS5Aβ-半乳糖苷α_2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的完整的cDNA序列).GNucleicAcidsRes.(G核酸研究)18(3),667Howies,C.Μ.(1996).GeneticengineeringofhumanFSH(Gonal-F)(人FSH(Gonal-F)的基因改造)·HumR印rod.Update(人生殖更新)，坌，172-191.KagawaY,TakasakiS,UtsumiJ,HosoiK,ShimizuH,KochibeN,禾口KobataΑ.(1988).Comparativestudyoftheasparagine-1inkedsugarchainsofnaturalhumaninterferon-beta1andrecombinanthumaninterferon-beta1producedbythreedifferentmammaliancells(由三種不同的哺乳動物細胞產(chǎn)生的天然人干擾素-β1和重組人干擾素-β1的天冬酰胺-連接的糖鏈的比較研究).JBiolChem(生物化學雜志)·263(33)，17508-17515.Keene,J.L.,Matzuk,Μ.M.,Otani,T.,Fauser,B,C,J,Μ.,Galway,Α.B.,Hsueh,A.J.W.禾口Boime,I.(1989).ExpressionofBiologicallyactiveHumanFollitropininChineseHamsterOvaryCells(在中國倉鼠卵巢細胞中的生物學活性的人促卵泡激素的表達).TheJournalofBiologicalChemistry(生物化學雜志)，264(9)，4769-4775.Kitagawa,H.禾口Paulson，J.C(1994)Cloningofanovelalpha2,3-sialyltransferasethatsialylatesglycoproteinandglycolipidcarbohydrategroups(使糖蛋白和糖脂質(zhì)糖基團唾液酸化的新的α2，3_唾液酸轉(zhuǎn)移酶的克隆).J.Biol.Chem(生物化學雜志).269(2)，1394-1401.LeeEU，RothJJfIPaulsonJC(1989)AlterationofterminalglycosylationsequencesonN-IinkedoligosaccharidesofChinesehamsterovarycellsbyexpressionofbeta-galactosidealpha2,6-sialyltransferase(通過β-半乳糖苷α2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的表達改變在中國倉鼠卵巢細胞的N-連接的寡糖的末端糖基化序列).JBiolChem(生物化學雜志).264Q3)，13848-13855.deLeeuw,R.,Mulders,J.,Voortman,G.Rombout,F.Damm,J.禾口Kloosterboer,L.(1996)Structure-functionrelationshipofrecombinantfolliclestimulatinghormone(Puregon)(重組促卵泡激素(Puregon)的結(jié)構(gòu)-功能關(guā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AGGACATCTACCTGCTTGGAAAAGCCACACTGCCTGGC1201.TTCCGGACCATTCACTGCTAAOp-ST6GAL1的蛋白序列1MIHTNLKKKFSCCVLVFLLFAVICVffKEKKKGSYYDSFKLQTKEFQVLKSLGKLAMGSDS權(quán)利要求1.重組FSH(rFSH)，其包括α2，3_和α2，6_唾液酸化。2.根據(jù)權(quán)利要求1的重組FSH，其具有emol/mol以上的唾液酸含量(以唾液酸摩爾數(shù)與蛋白的摩爾數(shù)的比率表示)。3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的重組FSH，其具有6m0l/m0l至15m0l/m0l的唾液酸含量。4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的重組FSH，其中全部唾液酸化的10%以上是α2，3_唾液酸化。5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的重組FSH，其以全部唾液酸化的65-85%的量包括α2,3-唾液酸化。6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的重組FSH，其以全部唾液酸化的70-80%的量包括α2,3-唾液酸化。7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的重組FSH，其中全部唾液酸化的50%以下是α2，6_唾液酸化。8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的重組FSH，其以全部唾液酸化的15-35%的量包括α2,6-唾液酸化。9.據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的重組FSH，其以全部唾液酸化的20-30%的量包括α2，6-唾液酸化。10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的重組FSH，其還包括α2，8-唾液酸化。11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的重組FSH，其中所述唾液酸含量是6質(zhì)量％以上。12.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的重組FSH，其由人細胞系生產(chǎn)或表達。13.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的重組FSH，其由Per.C6細胞系，Per.C6衍生的細胞系或修飾的Per.C6細胞系生產(chǎn)或表達。14.根據(jù)權(quán)利要求12或13的重組FSH，其中所述細胞系已經(jīng)使用α2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶進行修飾。15.根據(jù)權(quán)利要求12-14中任一項的重組FSH，其包括由內(nèi)源唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性提供的α2，6-連接的唾液酸(02，6唾液酸化)。16.在人細胞系中表達的重組FSH。17.根據(jù)權(quán)利要求16的重組FSH，其中全部唾液酸化的10%以上是α2,3-唾液酸化。18.根據(jù)權(quán)利要求16或17的重組FSH，其以全部唾液酸化的65-85%的量包括α2，3-唾液酸化。19.根據(jù)權(quán)利要求16-18中任一項的重組FSH，其中全部唾液酸化的50%以下是α2，6-唾液酸化。20.根據(jù)權(quán)利要求16-19中任一項的重組FSH，其以全部唾液酸化的15-35%的量包括α2,6-唾液酸化。21.根據(jù)權(quán)利要求16-20中任一項的重組FSH，其包括6m0l/m0l以上的唾液酸含量[以唾液酸摩爾數(shù)與蛋白的摩爾數(shù)的比率表示]。22.根據(jù)權(quán)利要求16或21中任一項的重組FSH，其包括α2，3_唾液酸化和α2，6_唾液酸化。23.一種重組FSH制劑，其包括α2，3-和α2，6_唾液酸化。24.根據(jù)權(quán)利要求23的制劑，其是藥物制劑。25.根據(jù)權(quán)利要求23或M的制劑，其具有emol/mol以上的唾液酸含量(以唾液酸的摩爾數(shù)與蛋白的摩爾數(shù)的比率表示)。26.根據(jù)權(quán)利要求23-25中任一項的制劑，其中全部唾液酸化的10%以上是α2，3-唾液酸化。27.根據(jù)權(quán)利要求2346中任一項的制劑，其以全部唾液酸化的65-85%的量包括α2，3-唾液酸化。28.根據(jù)權(quán)利要求23-27中任一項的制劑，其中全部唾液酸化的50%以下是α2，6_唾液酸化。29.根據(jù)權(quán)利要求23-中任一項的制劑，其以全部唾液酸化的15-35%的量包括α2，6-唾液酸化。30.根據(jù)權(quán)利要求23-29中任一項的制劑，其在人細胞系中生產(chǎn)或表達。31.一種藥物組合物，其包含包括α2，3-唾液酸化和02，6-唾液酸化的評5扎32.根據(jù)權(quán)利要求31的藥物組合物，其中全部唾液酸化的10%以上是α2，3_唾液酸化。33.根據(jù)權(quán)利要求31或32的藥物組合物，其以全部唾液酸化的65-85%的量包括α2，3-唾液酸化。34.根據(jù)權(quán)利要求31-33中任一項的藥物組合物，其中全部唾液酸化的50%以下是α2,6-唾液酸化。35.根據(jù)權(quán)利要求31-33中任一項的藥物組合物，其以全部唾液酸化的15-35%的量包括α2，6-唾液酸化。36.一種藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-22中任一項的rFSH和/或根據(jù)權(quán)利要求23-30中任一項的制劑。37.根據(jù)權(quán)利要求31-36中任一項的藥物組合物，其還包含hCG和/或LH。38.根據(jù)權(quán)利要求31-37中任一項的藥物組合物，其用于治療不育。39.一種治療不育的方法，其包含向受試者施用包含根據(jù)權(quán)利要求1-22中任一項的rFSH的組合物和/或根據(jù)權(quán)利要求23-30中任一項的制劑和/或根據(jù)權(quán)利要求31-37中任一項的藥物組合物的步驟。40.根據(jù)權(quán)利要求1-22中任一項的rFSH和/或根據(jù)權(quán)利要求23-30中任一項的rFSH制劑在制備用于治療不育的藥物中的應用。41.一種生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求1-22中任一項的rFSH和/或根據(jù)權(quán)利要求23-30中任一項的rFSH制劑的方法，所述方法包括在人細胞系中生產(chǎn)或表達所述rFSH的步驟。全文摘要包含重組FSH(rFSH)的制劑。文檔編號A61K38/24GK102066414SQ200980121391公開日2011年5月18日申請日期2009年4月16日優(yōu)先權(quán)日2008年4月16日發(fā)明者丹尼爾·普拉克辛,伊恩·科廷厄姆,理查德·博伊德·懷特申請人:輝凌國際制藥(瑞士)有限公司