專(zhuān)利名稱：：作為糖尿病患者血管重塑和心血管疾病治療的治療劑的未?；L(zhǎng)素釋放肽和類(lèi)似物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：該發(fā)明涉及血管重塑(vascularremodeling)和血管疾病的治療、用于治療心血管疾病的方法和藥物組合物、用于增加循環(huán)生血管細(xì)胞(circulatingangiogeniccell,CAC)數(shù)量和/或改善CAC功能的方法和藥物組合物、以及用于改善血管重塑和/或新血管形成的方法和藥物組合物。
背景技術(shù)：
：生長(zhǎng)素釋放肽((ihrelin，AG)是觀個(gè)氨基酸的肽，其從鼠胃中純化并鑒定出來(lái)，特征為在^r3殘基上存在η-辛?；揎?參考文獻(xiàn)1)。AG是生長(zhǎng)激素促分泌素受體(GHSR)的內(nèi)源性配體(參考文獻(xiàn)2、3)，并且除了生長(zhǎng)激素釋放性能，AG還在心血管系統(tǒng)(包括心臟、大血管的脈管系統(tǒng)和內(nèi)皮細(xì)胞)中檢測(cè)到，這表明其還可以影響血管生物學(xué)、血管生理學(xué)和動(dòng)脈粥樣化形成(參考文獻(xiàn)4、5、6)。去-酰基生長(zhǎng)素釋放肽(或未?；纳L(zhǎng)素釋放肽，UAG)是生長(zhǎng)素釋放肽的未?；问?，與AG相比，其在血漿和組織中的濃度更高，無(wú)法結(jié)合GHSR-Ia并且缺乏任何中樞活性(參考文獻(xiàn)7)。然而，UAG和AG共有多種生物活性，并在多種外周組織上有共同的結(jié)合位點(diǎn)。AG和UAG表現(xiàn)出類(lèi)似的GHS-R非依賴性生物活性，包括細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)(參考文獻(xiàn)9)和體內(nèi)成脂效應(yīng)(參考文獻(xiàn)10)。在大多數(shù)但并非全部的評(píng)價(jià)了UAG活性的細(xì)胞中，GHSR-Ia未被表達(dá)，這暗示這些與AG共有的多效性活性可能由不同于GHSR-Ia的另一種尚未被鑒定出的受體來(lái)介導(dǎo)。已證實(shí)UAG是生物活性肽，特別在代謝水平時(shí)顯著地表現(xiàn)出發(fā)揮抗-致糖尿病效果，如在下列文獻(xiàn)中所述美國(guó)專(zhuān)利7，485，620、美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)U.S.20080159991、美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)U.S.20080312133和W0/2008/145749。之前普遍地報(bào)道了AG和UAG直接作用于心肌細(xì)胞以通過(guò)激活存活傳導(dǎo)途徑來(lái)抑制試驗(yàn)性誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(參考文獻(xiàn)8)。AG還顯示出抑制在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)中的基礎(chǔ)和TNF-α-誘導(dǎo)的趨化細(xì)胞因子的產(chǎn)生與單核細(xì)胞粘附(參考文獻(xiàn)5)。還報(bào)道使用外源性AG治療人微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMVEC)顯著地增加了在這些細(xì)胞中的細(xì)胞增生、遷移、體外血管形成和ERK2磷酸化(參考文獻(xiàn)4)。近年來(lái)，Kleinzetal.(參考文獻(xiàn)35)證實(shí)AG和UAG在人中的血管緊張度的旁分泌調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用；更具體地，他們表明AG和UAG在人動(dòng)脈中具有血管擴(kuò)張劑作用。血管疾病加速是患有糖尿病的患者死亡和殘疾的主要原因。內(nèi)皮損傷被認(rèn)為代表糖尿病環(huán)境中的動(dòng)脈粥樣硬化血管疾病開(kāi)始和發(fā)展的關(guān)鍵步驟(參考文獻(xiàn)11)。之前報(bào)道高水平糖化終產(chǎn)物(AGE)在糖尿病情形中使血管重塑受損(參考文獻(xiàn)12)。AGE的形成和活性氧簇(ROS)的產(chǎn)生(作為對(duì)于糖尿病中的AGE的細(xì)胞應(yīng)答)看起來(lái)主要導(dǎo)致這些事件。血管重塑不僅專(zhuān)門(mén)依賴于居留的內(nèi)皮細(xì)胞的增生，而且與循環(huán)的內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)有關(guān)。近年來(lái)的數(shù)據(jù)證實(shí)，在具有心血管風(fēng)險(xiǎn)因素的患者(例如但不限于患有糖尿病的患者)中，EPC的數(shù)量減少，并且它們的功能收到損害(參考文獻(xiàn)13、14、15)。早期EPC和晚期EPC這兩種類(lèi)型的已有文獻(xiàn)描述。盡管它們享有共同的特征，但是它們?cè)谛螒B(tài)學(xué)、增生潛力和體外功能特性方面具有一些不同的特征。和晚期EPC不同，早期EPC在體外不采用典型的內(nèi)皮表型，但在體內(nèi)以間接旁分泌的方式促進(jìn)新血管形成。這導(dǎo)致將這些細(xì)胞重新定義為循環(huán)生血管細(xì)胞(CAC)。CAC是單核細(xì)胞-樣細(xì)胞，其可以從骨髓歸巢至新血管形成的部位，在血管損傷和原位分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞后的重新內(nèi)皮化過(guò)程中尤其是如此(參考文獻(xiàn)16)。令人信服的證據(jù)指出，隨著心血管風(fēng)險(xiǎn)因素分布增加，CAC數(shù)量減少，并且CAC的功能活性受到損害，因此需要將CAC遞送限制在(例如)發(fā)生血管新生的局部缺血位點(diǎn)。使用某些細(xì)胞因子進(jìn)行的治療引起CAC的骨髓(BM)轉(zhuǎn)移，這可能提供避免心血管風(fēng)險(xiǎn)的保護(hù)作用(參考文獻(xiàn)17、18)。氧化應(yīng)激在和糖尿病相關(guān)的血管組織損壞和內(nèi)皮損傷中發(fā)揮主要的作用。主要地，在這種情形中ROS的產(chǎn)生由高水平糖化終產(chǎn)物(AGEs)(特別地由CAC形成)誘導(dǎo)。十分需要設(shè)計(jì)一種方式來(lái)在處于有患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)或已患心血管疾病的患者中改善血管重塑和新血管形成，以預(yù)防或治療心血管疾病。一種方案是增加CAC細(xì)胞數(shù)量和/或改善CAC功能，這可通過(guò)下列方式來(lái)實(shí)現(xiàn)改善它們從骨髓的轉(zhuǎn)移、降低由AGEs誘導(dǎo)的ROS的形成、降低CAC衰老或凋亡率、和增強(qiáng)CAC分化成動(dòng)脈或靜脈表型(即，在體內(nèi)形成血管)的能力。此前關(guān)于AG可能對(duì)血管功能障礙和心臟保護(hù)具有影響的發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致評(píng)價(jià)UAG體外和體內(nèi)對(duì)于這兩方面的影響，和評(píng)價(jià)UAG對(duì)于CAC生物學(xué)的作用，這些明顯之前并未被證實(shí)。
發(fā)明內(nèi)容根據(jù)一方面，本發(fā)明涉及一種用于治療受試者中的心血管疾病的方法，該方法包括向所述受試者施用治療有效量的多肽，所述多肽包含SEQIDNO:1的氨基酸序列或其具有所述SEQIDNO1的生物活性的片段或類(lèi)似物。根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及一種用于在受試者中增加循環(huán)生血管細(xì)胞(CAC)數(shù)量和/或改善CAC功能的方法，該方法包括向所述受試者施用治療有效量的多肽，所述多肽包含SEQIDNO1的氨基酸序列或其具有所述SEQIDNO=I的生物活性的片段或類(lèi)似物。根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及一種用于在受試者中改善血管重塑和/或新血管形成的方法，該方法包括向所述受試者施用治療有效量的多肽，所述多肽包含SEQIDN0:1的氨基酸序列或其具有所述SEQIDNO1的生物活性的片段或類(lèi)似物。根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及一種用于治療心血管疾病的藥物組合物，包含治療有效量的多肽，其中所述多肽包含SEQIDNO1的氨基酸序列或其具有所述SEQIDNO=I的生物活性的片段或類(lèi)似物；和藥學(xué)上可接受的載體。根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及一種用于在受試者中增加循環(huán)生血管細(xì)胞(CAC)數(shù)量和/或改善CAC功能的分離的多肽，包含SEQIDNO:1的氨基酸序列或其具有所述SEQIDNO1的生物活性的片段或類(lèi)似物。根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及一種用于在受試者中改善血管重塑和/或新血管形成的分離的多肽，包含SEQIDNO1的氨基酸序列或其片段或類(lèi)似物。根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及一種用于在受試者中改善傷口愈合的分離的多肽，包含SEQIDNO1的氨基酸序列或其片段或類(lèi)似物。根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及一種用于改善與移植相關(guān)的植入物成功生長(zhǎng)的分離的多肽，包含SEQIDNO1的氨基酸序列或其片段或類(lèi)似物。根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及一種用于組織工程的分離的多肽，包含SEQIDNO1的氨基酸序列或其片段或類(lèi)似物。根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及治療有效量的多肽在制備治療受試者中的心血管疾病的藥物中的用途，所述多肽包含SEQIDNO1的氨基酸序列或其具有所述SEQIDNO=I的生物活性的片段或類(lèi)似物。根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及治療有效量的多肽在受試者中增加循環(huán)生血管細(xì)胞(CAC)數(shù)量和/或改善CAC功能中的用途，所述多肽包含SEQIDNO:1的氨基酸序列或其具有所述SEQIDNO1的生物活性的片段或類(lèi)似物。根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及治療有效量的多肽在制備在受試者中增加循環(huán)生血管細(xì)胞(CAC)數(shù)量和/或改善CAC功能的藥物中的用途，所述多肽包含SEQIDNO1的氨基酸序列或其具有所述SEQIDNO1的生物活性的片段或類(lèi)似物。根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及治療有效量的多肽在受試者中改善血管重塑和/或新血管形成中的用途，所述多肽包含SEQIDNO:1的氨基酸序列或其具有所述SEQIDNO=I的生物活性的片段或類(lèi)似物。根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及治療有效量的多肽在制備在受試者中改善血管重塑和/或新血管形成的藥物中的用途，所述多肽包含SEQIDNO:1的氨基酸序列或其具有所述SEQIDNO1的生物活性的片段或類(lèi)似物。附圖簡(jiǎn)述圖IA至IF示出UAG對(duì)于來(lái)自糖尿病相關(guān)氧化應(yīng)激的CAC的保護(hù)作用。在圖IA中，S期CAC百分?jǐn)?shù)通過(guò)FACS分析來(lái)評(píng)價(jià)。在圖IB至IF中，在所示時(shí)間段測(cè)量CAC的ROS產(chǎn)率。圖IE和IF證實(shí)，UAG(6-13)作為一種UAG片段也對(duì)于來(lái)自糖尿病相關(guān)氧化應(yīng)激的CAC具有保護(hù)作用。圖2A至2E示出UAG預(yù)防CAC衰老。在圖2A中，通過(guò)對(duì)于用AGE、UAG和AGE+UAG培養(yǎng)的CAC的酸性β-gal活性來(lái)評(píng)價(jià)衰老。在圖2B中，AGE-、UAG-和AGE+UAG-培養(yǎng)的CAC使用指示的抗體通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法來(lái)測(cè)試。在圖2C中，CAC用p53siRNA或雜亂序列(scrambledsequence)轉(zhuǎn)染。在圖2D中，評(píng)價(jià)來(lái)自年齡和性別匹配的用鹽水或UAG治療的糖尿病患者的CAC的酸性β-gal活性。在圖2E中，使用所示抗體通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法來(lái)測(cè)試從按照上述方式治療的糖尿病患者中回收的CAC。圖3A至3D示出UAG誘導(dǎo)的CAC轉(zhuǎn)移和動(dòng)脈說(shuō)明。在圖3A中，從II型糖尿病患者回收的CAC用代表性FACS分析⑶45、⑶14、⑶146和⑶105的表達(dá)。在圖中，在鹽水或UAG或AG治療后對(duì)從健康供體(N)和糖尿病患者(D)中回收的CAC進(jìn)行計(jì)數(shù)。在圖3C中，對(duì)于來(lái)自用UAG、AG或鹽水治療的糖尿病患者(D)或健康受試者(N)中的CAC，評(píng)價(jià)S期中細(xì)胞數(shù)。在圖3D中，對(duì)于來(lái)自按照上述方式培養(yǎng)的II型糖尿病患者或健康供體中的CAC細(xì)胞進(jìn)行Q-RT-PCR。對(duì)所示的動(dòng)脈和靜脈標(biāo)記進(jìn)行評(píng)估。圖4A至4F示出UAG誘導(dǎo)CAC在糖尿病鼠中轉(zhuǎn)移，暴露于UAG的CAC起到生血管性細(xì)胞的作用。在圖4A中，從糖尿病鼠(N0D/SCID和ob/ob)或野生型鼠回收的CAC用代表性FACS分析CD45、CD31、CD33和KDR的表達(dá)。在圖4B中，分析NOD/SCID，ob/ob和野生型鼠經(jīng)UAG或鹽水治療后提取的血液。在圖4C中，對(duì)得自不同鼠模型(使用或未使用UAG治療)的CAC，通過(guò)FACS分析來(lái)評(píng)價(jià)S期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。在圖4D中，對(duì)于來(lái)自按照上述方式培養(yǎng)的鼠模型中的CAC進(jìn)行Q-RT-PCR。對(duì)所示的動(dòng)脈和靜脈標(biāo)記進(jìn)行評(píng)估。在圖4E中，免疫組織化學(xué)分析含有IL-3和標(biāo)記的CAC(在植入SCID鼠中后回收)的Matrigelplug。組a(左圖)對(duì)應(yīng)于在鹽水治療后回收的CAC，組b(右圖)對(duì)應(yīng)于在UAG治療后回收的CAC。CAC形成功能性血管的能力記錄在組a中。黑色箭頭指出陽(yáng)性CAC細(xì)胞。在圖4F中，回收的Matrigelplug顯示大部分血管排列有人HLA類(lèi)I陽(yáng)性細(xì)胞。人或宿主衍生的血管的數(shù)量以柱狀圖的形式記錄。圖5A和5B示出UAG(UAG(1-28))和UAG(6_13)片段在CAC膜上具有結(jié)合位點(diǎn)。發(fā)明詳述為了便于參考，在全文中使用下列縮寫(xiě)和標(biāo)識(shí)AG生長(zhǎng)素釋放肽或?；纳L(zhǎng)素釋放肽UAG未?；纳L(zhǎng)素釋放肽或去-?；L(zhǎng)素釋放肽UAG(6-13)具有SEQIDNO1的殘基6至13的未?；纳L(zhǎng)素釋放肽GHSR生長(zhǎng)激素促分泌素受體CAC循環(huán)生血管細(xì)胞EPC內(nèi)皮祖細(xì)胞AGE高水平糖化終產(chǎn)物BM骨髓VEGF血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子FACS熒光激活細(xì)胞分類(lèi)術(shù)ROS活性氧簇已經(jīng)描述了在糖尿病環(huán)境中的血管重塑的損害(參考文獻(xiàn)32、3；3)。在患有I型或II型糖尿病的患者中，EPC的數(shù)量減少，并且它們的功能能力受到損害(參考文獻(xiàn)15、32)。不利的代謝應(yīng)激因子似乎主要導(dǎo)致?lián)p害功能活性和減少CAC向動(dòng)脈損傷位點(diǎn)的聚集(參考文獻(xiàn)15,34)ο血管生長(zhǎng)的誘導(dǎo)在多種病理?xiàng)l件下代表了吸引人的治療策略。心血管風(fēng)險(xiǎn)因素(例如糖尿病或肥胖癥)降低EPC易得性的發(fā)現(xiàn)限制了使用細(xì)胞療法治療那些理論上最需要該治療的患者的能力。本文所述發(fā)明提供了以下證據(jù)UAG可尤其阻止代謝應(yīng)激因子，恢復(fù)CAC數(shù)量和功能活性(表現(xiàn)為經(jīng)UAG-治療的細(xì)胞在體內(nèi)形成血管的能力)。本發(fā)明涉及UAG對(duì)于CAC作用的預(yù)料不到的發(fā)現(xiàn)。更具體地，其涉及下列預(yù)料不到的發(fā)現(xiàn)UAG使CAC遷移，保護(hù)CAC避免氧化應(yīng)激或和糖尿病相關(guān)的氧化應(yīng)激，降低CAC促進(jìn)的衰老發(fā)作和恢復(fù)CAC功能活性，增加CAC數(shù)量，預(yù)防在生理?xiàng)l件和糖尿病環(huán)境中在CAC中產(chǎn)生R0S，與CAC結(jié)合和/或解救CAC的功能損害。因此，該研究提供下列證據(jù)UAG可用作新型治療策略以改善或緩解具有心血管風(fēng)險(xiǎn)的受試者或患者中已受損的血管重塑，或治療患有心血管疾病或缺血性疾病的受試者或患者，增加CAC數(shù)量和改善CAC功能，改善植入物成功生長(zhǎng)(engraftment)，改善與例如器官或其部分的移植相關(guān)或在例如器官或其部分的移植之后的植入物成功生長(zhǎng)，用于或促進(jìn)體外或回體(exvivo)組織工程(例如但不限于血管工程化)，改善傷口愈合，改善糖尿病患者(例如患有糖尿病性潰瘍的糖尿病患者)中的傷口愈合。除非另外說(shuō)明，本文中使用的所有技術(shù)和科技術(shù)語(yǔ)具有和本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解相同的意思。細(xì)·碰為了本發(fā)明的目的，下列術(shù)語(yǔ)限定如下。在本申請(qǐng)中，術(shù)語(yǔ)“生長(zhǎng)素釋放肽”和“酰化的生長(zhǎng)素釋放肽”或“AG”可交換使用并且具有相同的意思。術(shù)語(yǔ)“未酰化的生長(zhǎng)素釋放肽”或“UAG”旨在表示具有SEQIDNO1中指出的氨基酸序列的肽(l-NH2Gly-Ser-Ser-Phe-Leu-Ser-Pro-Glu-His-Gln-Arg-Val-Gln-Gln-Arg-Lys-Glu-Ser-Lys-Lys-Pro-Pro-Ala-Lys-Leu-Gln-Pro-Arg-28；SEQIDNO:1)。UAG還可稱為UAG(1-28)。天然變體形式的未?；纳L(zhǎng)素釋放肽包括含有置換、添加或缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸的肽，這是由于編碼生長(zhǎng)素釋放肽的基因或其等位基因的核苷酸序列的不連續(xù)改變、或由于轉(zhuǎn)錄RNA的選擇性剪接而產(chǎn)生的。應(yīng)理解，所述改變基本上不會(huì)影響未?；纳L(zhǎng)素釋放肽的變體形式的性能、藥理學(xué)和生物學(xué)特性。這些肽可以是鹽的形式。特別地，所述分子的酸性官能團(tuán)可被其鹽衍生物所取代，例如但不限于三氟乙酸鹽?！半摹薄ⅰ岸嚯摹被颉暗鞍住笔侵溉我獍被徭湥徽撻L(zhǎng)度或翻譯后修飾(例如，糖基化或磷酸化)、或化學(xué)修飾、或含有非天然或不尋常氨基酸的那些，例如D-Tyr、鳥(niǎo)氨酸、氨基-己二酸。在本申請(qǐng)中所述術(shù)語(yǔ)可交換使用。術(shù)語(yǔ)“片段”或“其片段”是指肽(例如未?；纳L(zhǎng)素釋放肽)的氨基酸片段。未?；纳L(zhǎng)素釋放肽的片段短于觀個(gè)氨基酸殘基。因此未?；纳L(zhǎng)素釋放肽的片段的長(zhǎng)度可以是27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5或4個(gè)氨基酸殘基。例如，UAG的片段可以具有SEQIDNO1的殘基1-14，如SEQIDNO2中所示((UAG1-14)；Gly-Ser-Ser-Phe-Leu-Ser-Pro-Glu-HiS-Gln-Arg-Val-Gln-Gln)；SEQIDNO1的殘基1-18，如SEQIDNO3所示((UAG1-18)；Gly-Ser-Ser-Phe-Leu-Ser-Pro-Glu-His-Gln-Arg-Val-Gln-Gln-Arg-Lys-Glu-Ser)；SEQIDNO1的殘基1-5，如SEQIDNO4中所示((UAG1-5)；Gly-Ser-Ser-Phe-Leu)；SEQIDNO1的殘基17-28，如SEQIDNO5中所示((UAG17-28)；Glu-Ser-Lys-Lys-Pro-Pro-Ala-Lys-Leu-Gln-Pro-Arg)；SEQIDNO1的殘基6-13，如SEQIDNO6中所示((UAG6-13)；Ser-Pro-Glu-His-Gln-Arg-Val-Gln)；SEQIDNO1的殘基8-13，如SEQIDNO7中所示((UAG8-13)；Glu-His-Gln-Arg-Val-Gln)；或SEQIDNO1的殘基8-12，如SEQIDNO8中所示((UAG8-12)；Glu-His-Gln-Arg-VaI)或類(lèi)似物。保持UAG生物活性的任何其他UAG片段都為本發(fā)明所涵蓋。一些UAG片段記錄于美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)序列公開(kāi)號(hào)US20080312133和W0/2008/145749。在本發(fā)明的一些方面中，以“純化的”、“分離的”或“基本上純化的”形式使用多肽。當(dāng)多肽從天然伴隨它們的組分中分離時(shí)，它們是純化的”、“分離的”或“基本上純化的”。典型地，當(dāng)化合物為樣品中的全部物質(zhì)的至少60重量％、65重量％、70重量％、75重量％、80重量％、85重量％、90重量％、95重量％、96重量％、97重量％、98重量％或99重量％時(shí)，其是基本上純化的。術(shù)語(yǔ)“未?；纳L(zhǎng)素釋放肽的類(lèi)似物”、“未?；纳L(zhǎng)素釋放肽的片段的類(lèi)似物”或“其類(lèi)似物”是指未?；纳L(zhǎng)素釋放肽或其片段的結(jié)構(gòu)和功能類(lèi)似物，所述片段尤其能夠在本申請(qǐng)中描述的UAG的生物學(xué)功能方面取代UAG，例如但不限于預(yù)防和治療心血管疾病、保護(hù)CAC細(xì)胞避免氧化應(yīng)激或和糖尿病相關(guān)的氧化應(yīng)激，促進(jìn)血管重塑和新血管形成，增加CAC數(shù)量，改善CAC功能，保護(hù)CAC避免氧化應(yīng)激，抑制在生理?xiàng)l件和糖尿病環(huán)境中在CAC產(chǎn)生R0S，保護(hù)以避免和抑制CAC促進(jìn)的衰老發(fā)作相關(guān)的氧化應(yīng)激，結(jié)合至CAC膜，和增加CAC轉(zhuǎn)移和/或解救CAC的功能損害，如在本申請(qǐng)中所述。因此，這些結(jié)構(gòu)和功能類(lèi)似物將用于在本申請(qǐng)中所述的醫(yī)療條件下實(shí)現(xiàn)治療益處。簡(jiǎn)單結(jié)構(gòu)類(lèi)似物包含這樣的肽，所述肽和SEQIDNO1中闡述的未酰化的生長(zhǎng)素釋放肽顯現(xiàn)出同源性，或和其任何片段顯現(xiàn)出同源性。生長(zhǎng)素釋放肽的類(lèi)似物的例子是生長(zhǎng)素釋放肽_28(SEQIDNO1)是同種型、去Gln_14生長(zhǎng)素釋放肽(具有絲氨酸3的η-辛酸的修飾的27個(gè)氨基酸的肽)(其顯示存在于胃中)。其功能上等同于生長(zhǎng)素釋放肽，因?yàn)槠湟灶?lèi)似的結(jié)合親和性結(jié)合至GHSR-la，在克隆的細(xì)胞中引起Ca2+流出，并且誘導(dǎo)和生長(zhǎng)素釋放肽-類(lèi)似的效力的GH分泌。期望UAG還具有功能上等同于UAG的去Gln-14UAG。UAG的優(yōu)選類(lèi)似物和UAG片段的優(yōu)選類(lèi)似物為從天然UAG序列或天然UAG片段序列通過(guò)保守氨基酸置換改變的那些；即，使用另外類(lèi)似的特性置換殘基的那些。典型置換包括Ala、Val、Leu和lie中的那些；Ser和Thr中的那些；酸性殘基Asp和Glu中的那些；Asn和Gln中的那些；堿性殘基Lys和Arg中的那些；以及芳族殘基Phe和Tyr中的那些。特別優(yōu)選這樣的類(lèi)似物，其中數(shù)個(gè)(例如但不限于5-10、1-5或1-2個(gè))氨基酸以任何組合置換、缺失或添加。例如，UAG的類(lèi)似物和UAG在序列上的區(qū)別可以為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)氨基酸置換(優(yōu)選保守置換)、缺失、或添加或其組合。本文中提供本發(fā)明的肽的類(lèi)似物，其和本文中所述的氨基酸序列在其全長(zhǎng)上具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同源性，并且享有UAG的代謝效果或生物活性中的至少一種。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地鑒定未?；纳L(zhǎng)素釋放肽的類(lèi)似物序列或未?；纳L(zhǎng)素釋放肽的片段的類(lèi)似物序列。UAG的類(lèi)似物或其片段的類(lèi)似物(例如)為通過(guò)下列方式獲得的類(lèi)似物丙氨酸分區(qū)法、D-氨基酸或合成氨基酸置換、或肽的環(huán)化。UAG或其片段的類(lèi)似物可包含非天然編碼的氨基酸，其中非天然編碼氨基酸是指不是普通氨基酸、或吡咯賴氨酸或硒代半胱氨酸中的一種的氨基酸，或通過(guò)修飾(例如翻譯后修飾)天然編碼的氨基酸(包括但不限于20個(gè)普通氨基酸、或吡咯賴氨酸和硒代半胱氨酸)、但本身并未通過(guò)翻譯絡(luò)合而引入增長(zhǎng)的多肽鏈中而產(chǎn)生的氨基酸。這種非天然存在的氨基酸的例子包括但不限于N-乙?；咸烟前坊?L-絲氨酸、N-乙酰基葡萄糖胺基-L-蘇氨酸和0-磷酸酪氨酸。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“修飾的”是指對(duì)給定多肽做出的任何改變，例如改變多肽長(zhǎng)度、多肽的氨基酸序列、化學(xué)結(jié)構(gòu)、共翻譯修飾或翻譯后修飾。術(shù)語(yǔ)“翻譯后修飾”是指天然或非天然氨基酸的任何修飾，其在引入多肽鏈中后發(fā)生至這種氨基酸。只通過(guò)例子的方式，術(shù)語(yǔ)包括共翻譯體內(nèi)修飾、共翻譯體外修飾(例如無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)中)、翻譯后體內(nèi)修飾和翻譯后體外修飾。翻譯后修飾的例子為但不限于本發(fā)明的肽的糖基化、乙?；?、?；Ⅴ０坊?、羧化、磷酸化、引入鹽、酰胺或酯(特別是C-末端酯)和N-?；苌?。翻譯后修飾的類(lèi)型是熟知的。根據(jù)本發(fā)明的某些肽還可以是環(huán)化形式，使得N-或C-末端直接或通過(guò)插入接頭部分而頭尾連接，如果需要，這種部分本身通常包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基以按照這樣的方式連接主鏈，該方式為避免相對(duì)于非環(huán)化形式而改變肽的三維結(jié)構(gòu)。相對(duì)于非環(huán)化的肽，這些肽衍生物可具有改善的穩(wěn)定性和生物利用度。環(huán)化肽的方法是本領(lǐng)域熟知的，例如可通過(guò)在兩個(gè)側(cè)鏈官能團(tuán)之間形成二硫鍵、在一個(gè)側(cè)鏈官能團(tuán)和主鏈α-氨基或羧基官能團(tuán)之間形成酰胺或酯鍵、在兩個(gè)側(cè)鏈官能團(tuán)之間形成酰胺或酯鍵、或在主鏈α-氨基和羧基官能團(tuán)之間形成酰胺鍵來(lái)完成。這些環(huán)化反應(yīng)常規(guī)地在溶液中在高度稀釋的情況下進(jìn)行。通常完成環(huán)化，同時(shí)肽連接至樹(shù)脂。在固體載體上合成環(huán)肽的一種最普通的方式是使氨基酸的側(cè)鏈連接至樹(shù)脂。使用合適的保護(hù)策略，C-和N-末端可選擇地脫保護(hù)，并且在鏈裝配后環(huán)化到樹(shù)脂上。該策略被廣泛地使用，并且和叔丁氧基羰基(Boc)或9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)方案相容。然而，其限制為這樣的肽，該肽含有合適的側(cè)鏈官能度以連接至固體載體?？梢允褂枚喾N方案來(lái)獲得環(huán)肽的高效合成。一種合成環(huán)肽的方法基于同時(shí)從樹(shù)脂中切除的環(huán)化。在合適的肽序列通過(guò)固相合成裝配到樹(shù)脂上后或線性序列附加于樹(shù)脂上后，脫保護(hù)的氨基可以和其錨定活性連接基反應(yīng)以產(chǎn)生保護(hù)的環(huán)肽。通常，需要最終脫保護(hù)步驟來(lái)產(chǎn)生靶環(huán)肽。可使用Fmoc合成進(jìn)行內(nèi)酰胺化(環(huán)化的一種形式)以形成內(nèi)酰胺橋，可以引入在側(cè)鏈具有不同保護(hù)基的氨基酸，例如但不限于天冬氨酸(或谷氨酸)，其被β酯(或?qū)τ诠劝彼崾荵酯)的烯丙基酯保護(hù)；賴氨酸，其被N-ε的烯丙氧基氨基甲酸酯保護(hù)。在合成結(jié)束時(shí)，對(duì)于被Fm0C、B0C或和烯丙氧羰基不同的其他保護(hù)基保護(hù)的肽的N-末端，天冬氨酸和賴氨酸的烯丙基和烯丙氧羰基保護(hù)基可用(例如)鈀(0)脫保護(hù)，接著使用PyAOP(7-氮雜苯并三唑-1-基氧基三(吡咯烷基)憐六氟磷酸鹽)環(huán)化以制備內(nèi)酰胺橋。除非另有說(shuō)明，本文中命名的氨基酸是指L-型。本領(lǐng)域中易于識(shí)別的縮寫(xiě)被用于描述氨基酸，包括左旋氨基酸(L-氨基酸或L或L-型)和右旋氨基酸(D-氨基酸或D或D-型)、丙氨酸(Ala或A)、精氨酸(Arg或R)、天冬酰胺(Asn或N)、天冬氨酸(Asp或D)、半胱氨酸(Cys或C)、谷氨酸(Glu或E)、谷氨酰胺(Gln或Q)、甘氨酸(GIy或G)、組氨酸(His或H)、異亮氨酸(lie或I)、亮氨酸(Leu或L)、賴氨酸(Lys或K)、蛋氨酸(Met或M)、苯丙氨酸(Phe或F)、脯氨酸(Pro或P)、絲氨酸(Ser或幻、蘇氨酸(Thr或T)、色氨酸(Trp或W)、酪氨酸(Tyr或Y)和纈氨酸(Val或V)。天然肽序列內(nèi)的L-氨基酸殘基可被改變?yōu)榈鞍字型ǔ０l(fā)現(xiàn)的20個(gè)L-氨基酸中的任一個(gè)或相對(duì)于的D-氨基酸中的任一個(gè)、稀有氨基酸(例如但不限于4-羥基脯氨酸或羥基賴氨酸)、或非蛋白氨基酸(例如P-丙氨酸或高絲氨酸)。UAG肽還可以是融合蛋白的一部分。通常有利地包括另外的氨基酸序列，所述另外的氨基酸序列含有促分泌序列或引導(dǎo)序列、前導(dǎo)序列、有助于純化的序列(例如多個(gè)組氨酸殘基)、或在重組制備中用于穩(wěn)定的另外的序列。本發(fā)明涵蓋UAG或其片段任何其他類(lèi)似物、或保持UAG生物活性的任何其他修飾的UAG或其片段。提供UAG或其片段的功能和結(jié)構(gòu)類(lèi)似物中使用的通用方法和合成策略是通常使用和本領(lǐng)域熟知的，并且在下列文獻(xiàn)中有所描述，例如“P印ridesynthesisprotocols”ed，Μ.W.Pennigton&B.Μ·Dunn.MethodsinMolecularBiology.Vol35.HumanaPress,NJ.,1994；"Solidphasepeptidesynthesis"byStewart禾口Young,W.hFreeman&Co.,SanFrancisco,1969,Erickson禾口Merrifield；禾口"TheProteinss"Vol.2,p.255etseq.(Ed.Neurath禾口Hill),AcademicPress,NewYork,1976。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“同源性”是指同時(shí)保持等同的生物活性的兩個(gè)肽之間的序列類(lèi)似性。同源性可通過(guò)在比對(duì)序列中比較各位置而確定。氨基酸序列之間同源性的程度是在序列所共享的位置處相同或匹配氨基酸的數(shù)量的函數(shù)，使得“同源序列”是指享有同源性和等同的功能或生物活性的序列。同源百分率的評(píng)價(jià)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。確定肽的同源性、同一性和類(lèi)似性的方法編碼成可公開(kāi)獲得的計(jì)算機(jī)程序。確定兩個(gè)序列之間的同一性和類(lèi)似性的優(yōu)選計(jì)算機(jī)程序方法包括但不限于GCG程序包、BLASTP、BLASTN和FASTA。BLASTX程序可公開(kāi)得自NCBI和其他來(lái)源。熟知的SmithWaterman算法也可以用于確定同一性。用于多肽序列比較的優(yōu)選參數(shù)包括下列算法Needleman和Wunsch，J.MoIBiol.48:443-453(1970)；比較矩陣BL0SSUM62，來(lái)自Hentikoff和Hentikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89:10915-10919(1992)；空位罰分12；GapLengthPenalty:4。用于這些參數(shù)的程序可公開(kāi)得自為“空位”程序，其來(lái)自GeneticsComputerGroup,Madison,Wis0上述參數(shù)是用于氨基酸序列比較的默認(rèn)參數(shù)(和末端空位的無(wú)罰分(nopenaltyforendgap)一起)。本發(fā)明的多肽可以以本領(lǐng)域已知的任何合適的方式來(lái)制備。這些多肽包括分離的天然存在的多肽、重組制備的多肽、合成制備的多肽、或通過(guò)這些方法的組合而制備的多肽。制備這些多肽的方式和方法是本領(lǐng)域熟知的。本發(fā)明的某些方面使用UAG多核苷酸。這些多核苷酸包括編碼本申請(qǐng)中定義的UAG多肽、片段和類(lèi)似物的分離的多核苷酸。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”是指包含多個(gè)脫氧核糖核苷酸或核苷亞基的分子。核苷亞基之間的連接可由磷酸酯、膦酸酯、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯等提供，或由本領(lǐng)域已知的非磷酸酯基團(tuán)提供，例如肽核酸(PNA)中使用的類(lèi)肽型連接。連接基團(tuán)可以是手性或非手性的。寡核苷酸或多核苷酸的長(zhǎng)度可以為2個(gè)核苷亞基至數(shù)百或數(shù)千個(gè)核苷亞基。盡管寡核苷酸的長(zhǎng)度優(yōu)選為5至100個(gè)亞基，更優(yōu)選長(zhǎng)度為5至60個(gè)亞基，但是多核苷酸的長(zhǎng)度可更長(zhǎng)(例如，至多100)。多核苷酸可以是任何DNA和RNA。DNA可以是基因組DNA、基因組DNA文庫(kù)、衍生自細(xì)胞或組織的cDNA和合成DNA中的任一種形式。另外，在某些方面中，本發(fā)明可以使用載體，包括抗菌素、質(zhì)粒、粘?；蚴删！Ｉ婕氨景l(fā)明的多肽時(shí)，措辭“生物活性”、或“生物性能”或術(shù)語(yǔ)“活性”在本文中可互換使用，并且均是指本發(fā)明的多肽的藥理、生物或細(xì)胞能力，包括但不限于在UAG的生物功能方面取代UAG的能力，例如但不限于預(yù)防和/或治療心血管疾病、保護(hù)CAC細(xì)胞避免氧化應(yīng)激或和糖尿病相關(guān)的氧化應(yīng)激、促進(jìn)血管重塑和新血管形成、增加CAC數(shù)量、改善CAC功能、保護(hù)CAC避免氧化應(yīng)激，抑制在生理?xiàng)l件和糖尿病環(huán)境中在CAC產(chǎn)生R0S、保護(hù)以避免和抑制CAC促進(jìn)的衰老發(fā)作相關(guān)的氧化應(yīng)激、結(jié)合至CAC膜和增加CAC轉(zhuǎn)移和/或解救CAC的功能損害。治療應(yīng)用和治療在一方面，本發(fā)明提供一種用于治療處于心血管疾病或缺血性疾病的風(fēng)險(xiǎn)中或患有心血管疾病或缺血性疾病的受試者(例如患者)的方法。本發(fā)明還提供一種用于在受試者中改善血管重塑和/或新血管形成的方法。在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明提供一種用于在受試者中增加CAC的數(shù)量和改善CAC功能的方法。本發(fā)明還提供一種用于改善植入物成功生長(zhǎng)、更特別是改善與例如組織或器官或其任何部分的移植相關(guān)或在例如器官或其部分的移植之后的植入物成功生長(zhǎng)的方法。本發(fā)明還提供一種用于改善傷口愈合、改善植入物成功生長(zhǎng)和/或促進(jìn)組織工程的方法。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“治療”是指治療性治療以及阻止性和預(yù)防性措施。需要治療的那些包括已經(jīng)患有疾病或病癥或癥狀的那些、以及預(yù)防疾病、病癥或癥狀的那些。需要治療的那些還是病癥、疾病或癥狀已經(jīng)發(fā)生并且留下后果或疤痕的那些。治療還是指施用有效地改善或改良和疾病、病癥或癥狀相關(guān)的綜合癥的治療物質(zhì)，以減輕疾病、病癥或癥狀的嚴(yán)重性或治愈疾病、病癥或癥狀，或從產(chǎn)生就預(yù)防疾病、病癥或癥狀。在一方面，本發(fā)明的方法包括向受試者施用治療有效量的本文中定義的多肽的步驟，所述多肽享有和UAG本身相同的潛在治療適應(yīng)癥。這種多肽包含SEQIDN0:1的氨基酸序列或上述任何片段或任何類(lèi)似物，例如但不限于UAG(6-13)、UAG(8-12)和UAG(8_13)片段。受益于施用本發(fā)明的多肽的受試者包括但不限于處于患有心血管疾病或缺血性疾病風(fēng)險(xiǎn)、或正患有心血管疾病或缺血性疾病、或已經(jīng)患有心血管疾病或缺血性疾病的那些。例如這些受試者可以是患有I型或II型糖尿病的受試者和/或可以是患有肥胖癥的受試者。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“心血管疾病”是指涉及心臟或血管(動(dòng)脈和靜脈)的疾病。該術(shù)語(yǔ)是指影響心血管系統(tǒng)的任何疾病。它還指涉及動(dòng)脈硬化癥(動(dòng)脈疾病)的疾病。心血管疾病包括但不限于動(dòng)脈瘤、心絞痛、心律失常、心肌癥、腦血管意外(中風(fēng))、腦血管疾病、先天性心臟病、充血性心力衰竭、心肌炎、瓣膜疾病、冠狀動(dòng)脈疾病、擴(kuò)張型心肌病、舒張期功能障礙、心內(nèi)膜炎、高血壓(高血壓病)、肥厚型心肌病、二尖瓣脫垂、心肌梗塞(心臟病發(fā)作)、靜脈血栓性栓塞癥、局部缺血和傷口愈合。另外，下列人員將從施用本發(fā)明的多肽中受益患有或處于患有血管并發(fā)癥、和心血管疾病相關(guān)的代謝綜合癥或綜合癥X或肥胖癥、動(dòng)脈硬化癥、原發(fā)性動(dòng)脈粥樣硬化血管退化(例如中樞和外周動(dòng)脈病)風(fēng)險(xiǎn)的任何受試者，或需要血管重塑或需要新血管形成的任何受試者。如本文中所使用的，表述綜合癥X是指包括心血管疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)在內(nèi)的醫(yī)療病癥的組合。術(shù)語(yǔ)“氧化應(yīng)激”是指活性氧的產(chǎn)生和生物系統(tǒng)的容易使活性中間體解毒或容易使所得損害修復(fù)的能力之間的失衡。從增加CAC數(shù)量和/或改善CAC功能中受益的任何受試者或患者將從施用本發(fā)明的多肽中受益。CAC數(shù)量是指從骨髓歸巢至血管重塑的位點(diǎn)和/或新血管形成的位點(diǎn)的CAC的量或濃度。CAC功能是指CAC的下列性能轉(zhuǎn)移至內(nèi)皮化的位點(diǎn)(CAC轉(zhuǎn)移)，分化到內(nèi)皮細(xì)胞中和參與內(nèi)皮化。改善CAC功能是指導(dǎo)致更期望的條件CAC功能，例如，改善CAC轉(zhuǎn)移是指導(dǎo)致更期望的條件CAC轉(zhuǎn)移。需要血管重塑或血管修復(fù)和/或需要新血管形成的任何受試者也將從施用本發(fā)明的多肽中受益。術(shù)語(yǔ)“血管重塑”或“血管修復(fù)”是指成熟血管的直徑、厚度或結(jié)構(gòu)的任何持久性改變。術(shù)語(yǔ)“血管重塑”還包括旁系血管的形成。例如，在動(dòng)脈硬化癥中，血管重塑作為補(bǔ)償機(jī)制將血流保留在斑塊生長(zhǎng)面中，這易于引起動(dòng)脈的狹窄或縮小。術(shù)語(yǔ)“新血管形成”是指形成具有紅血球灌流的功能性微血管網(wǎng)絡(luò)。改善血管重塑和/或新血管形成是指導(dǎo)致更期望的條件血管重塑和/或新血管形成。本發(fā)明的多肽還可用于促進(jìn)移入例如移植接受者(例如動(dòng)物或人)中的細(xì)胞、組織和/或器官或其部分的成功生長(zhǎng)。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“植入物成功生長(zhǎng)(engraftment)”是指所移植的組織被納入宿主機(jī)體內(nèi)。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“植入物成功生長(zhǎng)”還是指這樣的過(guò)程，其中移植的干細(xì)胞或骨髓細(xì)胞遷移至骨髓并開(kāi)始產(chǎn)生血細(xì)胞。本文中所述的多肽還可用于再生醫(yī)學(xué)或組織工程中以開(kāi)發(fā)生物替代品，所述生物替代品恢復(fù)、保持或改善整個(gè)器官或其部分(例如心臟、血管、骨髓等)的組織功能。表述“組織工程”也是指制備能作為全功能單位被植入或能發(fā)育以便在植入后執(zhí)行必需功能的天然或合成的器官和組織。再生醫(yī)學(xué)或組織工程的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。本文中定義的多肽還可用于改善傷口愈合。在特定但非限制性例子中，本文中定義的多肽還可用于改善糖尿病患者中的傷口愈合，例如改善糖尿病潰瘍的愈合。術(shù)語(yǔ)“代謝紊亂”是指但不限于碳水化合物代謝紊亂、氨基酸代謝紊亂、有機(jī)酸代謝紊亂(有機(jī)酸尿癥)、脂肪酸氧化和線粒體代謝紊亂、嚇啉代謝紊亂、嘌呤或嘧啶代謝紊亂、類(lèi)固醇代謝紊亂、線粒體功能紊亂、過(guò)氧化物酶體功能紊亂、和溶酶體蓄積紊亂。術(shù)語(yǔ)“代謝綜合癥”是指增加心血管疾病和糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)的醫(yī)學(xué)病癥的聯(lián)合。本發(fā)明另一方面提供加入了至少一種本文所述多肽的任意藥物組合物。對(duì)于治療和/或藥物用途，本文中定義的多肽可配制以根據(jù)常規(guī)方法來(lái)用于(但不限于)靜脈內(nèi)、皮下、透皮、局部、口服、頰部、舌下、鼻、吸入、肺或胃腸外施用。靜脈內(nèi)注射可以是在常規(guī)時(shí)間期限內(nèi)通過(guò)團(tuán)塊或輸注來(lái)進(jìn)行。本文中定義的多肽還可直接施用至受試者內(nèi)的靶點(diǎn)，例如，通過(guò)生物導(dǎo)彈遞送至內(nèi)部或外部靶點(diǎn)或通過(guò)導(dǎo)管遞送至動(dòng)脈內(nèi)的位點(diǎn)ο作為混懸劑口服的活性成分(例如本文中定義的多肽)可以根據(jù)藥物制劑領(lǐng)域熟知的技術(shù)來(lái)制備，并且可含有但不限于用于賦形的微晶纖維素、作為助懸劑的海藻酸或海藻酸鈉、作為增粘劑的甲基纖維素和甜味劑/調(diào)味劑。作為速釋片劑，這些組合物可含有但不限于微晶纖維素、磷酸二鈣、淀粉、硬脂酸鎂和乳糖和/或其他賦形劑、粘合劑、膨脹劑、崩解劑、稀釋劑和潤(rùn)滑劑?；钚猿煞挚赏ㄟ^(guò)控釋遞送系統(tǒng)的方式來(lái)施用。通過(guò)鼻氣霧劑或吸入劑施用的制劑可制成(例如)鹽水中的溶液，使用苯甲醇或其他合適的防腐劑、增強(qiáng)生物利用度的吸收促進(jìn)劑、使用氟碳、和/或使用其他增溶或分散劑。本發(fā)明的多肽可以以靜脈內(nèi)(團(tuán)塊和輸注)、腹膜內(nèi)、皮下、在閉塞或不閉塞的情況下局部、或肌肉內(nèi)的形式施用。當(dāng)通過(guò)注射施用時(shí)，可注射的溶液或混懸液可使用本領(lǐng)域熟知的合適的無(wú)毒性、胃腸外可接受的稀釋劑或溶劑來(lái)配制。本發(fā)明的多肽還可被配制以用于局部施用。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“局部”包括能夠使化合物排列于(line)皮膚或粘膜組織的任何施用途徑。本文中定義的多肽的局部施用可用于在受試者中(例如)改善傷口愈合或改善傷口治療或用于原位治療。適于局部應(yīng)用的制劑可以為(例如)霜?jiǎng)?、涂劑、溶液劑、凝膠劑、軟膏劑、糊劑、石膏劑、漆劑、生物粘合劑等的形式，和/或可制備以含有脂質(zhì)體、膠束、微粒和/或微球。所述制劑可以是水性的，即含有水，或可以是非水性的，并且任選地和閉塞性覆層聯(lián)合使用，使得在施用至機(jī)體表面時(shí)和之后，從機(jī)體表面蒸發(fā)的水分保持在制劑內(nèi)。油膏劑(藥劑領(lǐng)域熟知的)是半固體制劑，其典型地基于凡士林或其他石油衍生物。使用的特定油膏劑的基底是本領(lǐng)域技術(shù)人員意識(shí)到的，并且將提供以最佳地遞送本文中定義的多肽，并且優(yōu)選地提供其他期望的特性，例如，柔軟性等。霜?jiǎng)?也是本領(lǐng)域熟知的)是粘性液體或半固體乳劑，水包油型或油包水型。霜?jiǎng)┑幕资撬上礈斓?，并且含有油相、乳化劑和水相。如藥劑領(lǐng)域的技術(shù)人員所意識(shí)到的，凝膠劑是半固體、混懸劑型體系。單相凝膠劑含有基本上均勻地分配在整個(gè)載體液體中的有機(jī)大分子，所述載體液體典型地是水性的，但也優(yōu)選含有醇和任選的油。優(yōu)選用于遞送化妝劑的涂劑是在無(wú)摩擦的情況下施用至皮膚表面的制劑，并且通常是液體或半液體制劑，其中固體顆粒(包括活性劑)存在于水或醇性基底中。涂劑通常是固體的混懸劑。糊劑是半固體劑型，其中活性劑懸浮在合適的基底中。取決于基底的性質(zhì)，糊劑在脂肪糊劑或由單相水性凝膠制備的那些之間分開(kāi)。石膏劑包含糊狀混合物，其直接或在浸透到基底材料(例如布)中后鋪展在機(jī)體上。本發(fā)明的制劑可溶解或分散在石膏中以制備醫(yī)用石膏劑。生物粘合劑是粘附至機(jī)體組織的表面的制劑。聚合物生物粘合劑制劑是本領(lǐng)域熟知的。制劑還可制備含有脂質(zhì)體、膠束、微粒和/或微球。脂質(zhì)體是微觀囊泡，其具有包含脂質(zhì)雙層的脂質(zhì)壁，并且可用作藥物遞送系統(tǒng)。膠束是本領(lǐng)域已知的，并且包含配置的表面活性劑分子，使得它們的極性頭基形成外部球殼，而疏水性烴鏈朝向球的中心取向，從而形成芯。微粒是在微米尺寸范圍內(nèi)的特定載體系統(tǒng)，通常用聚合物制備，其可用作藥物或疫苗(通常陷入顆粒內(nèi))的遞送系統(tǒng)。類(lèi)似地，微球可加入本發(fā)明的制劑和藥物遞送系統(tǒng)中。和脂質(zhì)體和膠束類(lèi)似，微球基本上囊封藥物或含有藥物的制劑。盡管不是必需的，但是微球通常由合成或天然存在的生物相容性聚合物形成，但還可包含帶電荷的脂質(zhì)，例如磷脂。適于局部施用的制劑的制備是本領(lǐng)域熟知的，并且在相關(guān)文本和文獻(xiàn)中有所描述。通常，藥物組合物包含至少一種本發(fā)明的多肽和本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的藥學(xué)上可接受的載體。取決于使用的劑型，所述組合物還可包含(例如)合適的賦形劑、稀釋劑、填充劑、增溶劑、防腐劑、鹽、緩沖劑和本領(lǐng)域熟知的其他材料中的一種或多種。組合物的方法是本領(lǐng)域熟知的。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的載體”旨在表示任何材料，其在下列意義上是惰性的其本身基本上不具有任何治療和/或預(yù)防效果，并且是非毒性的。藥學(xué)上可接受的載體可加入本發(fā)明的多肽中，目的是使其可以獲得具有可接受的技術(shù)性能的藥物組合物。這些載體的例子包括離子交換劑、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、血清蛋白(例如人血清白蛋白)、緩沖物質(zhì)(例如磷酸鹽)、甘氨酸、山梨酸、山梨酸鉀、飽和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、鹽或電解質(zhì)(例如硫酸魚(yú)精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉)、鋅鹽、膠體硅、三硅酸鎂、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素基物質(zhì)和PEG。用于局部或凝膠基形式的多肽的載體包括多糖，例如羧甲基纖維素鈉或甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯、聚氧乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、PEG、和木蠟醇。用于體內(nèi)施用的多肽必須是無(wú)菌的。這可通過(guò)在凍干和重構(gòu)之前或之后通過(guò)無(wú)菌濾膜過(guò)濾而實(shí)現(xiàn)。多肽通常以凍干形式或溶液的形式儲(chǔ)存。治療性多肽組合物通常置于具有無(wú)菌進(jìn)入孔的容器中，例如具有由皮下注射針頭穿透的塞子的靜脈內(nèi)溶液包或小瓶。對(duì)于本文中定義的方法中的用途，本發(fā)明還提供制造品或商業(yè)包裝或試劑盒，包含容器；容器上的標(biāo)簽；和當(dāng)在指示的水平處使用時(shí)，在容器內(nèi)包含本發(fā)明的多肽作為活性劑的組合物，其中所述組合物尤其有效地用于治療心血管疾病、和/或改善血管重塑或新血管形成、和/或增加CAC數(shù)量和改善CAC功能、和/或改善傷口愈合、和/或用于或促進(jìn)植入物成功生長(zhǎng)和/或組織工程。容器上的標(biāo)簽指示可以如何使用組合物?！爸委熡行Я俊笔侵敢孕枰膭┬秃蜁r(shí)間期限，有效地獲得期望的治療結(jié)果的量。治療有效量的本文中所述的肽可以根據(jù)因素來(lái)改變，例如疾病狀態(tài)、年齡、性別和個(gè)體重量、所述組合物在個(gè)體中引起期望的反應(yīng)的能力。劑量方案可被調(diào)節(jié)以提供最佳的治療反應(yīng)。治療有效量還是這樣的量，其中化合物的任何毒性或有害的效果勝過(guò)治療性有益效果?！邦A(yù)防有效量”是指以需要的劑型和時(shí)間期限，有效地獲得期望的預(yù)防結(jié)果的量，例如預(yù)防或抑制和胰島素水平和/或活性相關(guān)的病癥的發(fā)作。預(yù)防有效量可如上述用于治療有效量所述來(lái)確定。對(duì)于任何特定的受試者，特定的劑量方案可根據(jù)個(gè)體需要和管理或監(jiān)督所述組合物施用的人員的專(zhuān)業(yè)判斷隨時(shí)間調(diào)節(jié)。例如，本發(fā)明的肽(本文中也稱為“活性化合物”)的治療有效量或有效劑量是足以獲得下列效果的量在具有心血管風(fēng)險(xiǎn)的受試者或患者中改善或改良損害的血管重塑，或治療患有心血管疾病或缺血性疾病的受試者或患者，改善植入物成功生長(zhǎng)，改善與器官或其部分的移植相關(guān)或在器官或其部分的移植之后的植入物成功生長(zhǎng)，用于或改善或促進(jìn)體外或回體組織工程(例如但不限于血管工程化)，改善傷口愈合，改善糖尿病患者(例如患有糖尿病性潰瘍的糖尿病患者)中的傷口愈合。測(cè)量這些參數(shù)的方法和/或檢測(cè)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。本發(fā)明的治療有效量通常從約0.001μg/kg至約10mg/kg改變，更特別地從約0.01μg/kg至約10mg/kg改變，甚至更特別地從約1μg/kg至約lmg/kg改變。本發(fā)明還涵蓋在該范圍外但是具有期望的治療效果的治療有效量或有效劑量。在一個(gè)方面中，上述受試者是哺乳動(dòng)物，在進(jìn)一步的方面中，上述受試者是人。試驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析在下面提供的試驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析中，通過(guò)在糖尿病環(huán)境中進(jìn)行一些試驗(yàn)來(lái)重現(xiàn)心血管風(fēng)險(xiǎn)或病情。本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識(shí)到，獲得的數(shù)據(jù)可外推至是或可以確定和CAC生物功能的損害相關(guān)的其他生理?xiàng)l件或環(huán)境。UAG對(duì)于CAC細(xì)胞轉(zhuǎn)移和代謝的作用I.UAG保護(hù)CAC避免氧化應(yīng)激主要取決于活性氧簇(ROS)的產(chǎn)生，氧化應(yīng)激在和糖尿病相關(guān)的組織損害(參考文獻(xiàn)21)和內(nèi)皮損傷中發(fā)揮主要作用。UAG或AG保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞避免凋亡(參考文獻(xiàn)8)的觀察導(dǎo)致評(píng)價(jià)生長(zhǎng)素釋放肽同種型對(duì)于CAC生物學(xué)的作用。首先，評(píng)價(jià)響應(yīng)于UAG和AG的細(xì)胞周期進(jìn)程。如圖IA中所示，UAG而不是AG能夠誘導(dǎo)S期中細(xì)胞百分?jǐn)?shù)顯著增加，該作用在培養(yǎng)7天后仍然是明顯的。為了研究該作用是否依賴于抑制基線ROS的產(chǎn)生，進(jìn)行DCF-DA檢測(cè)。在圖IB中記錄的結(jié)果揭示出，和未治療的細(xì)胞相比時(shí)，UAG治療顯著地降低ROS產(chǎn)生的基線水平。當(dāng)使用AG時(shí)，無(wú)法檢測(cè)到保護(hù)作用(圖1B)。圖IE揭示出UAG的片段，即UAG(6-13)和未治療的細(xì)胞相比時(shí)，也降低ROS產(chǎn)生的基線水平。使用H2O2作為陽(yáng)性對(duì)照。AGE-介導(dǎo)的損害信號(hào)主要依賴于ROS產(chǎn)生(參考文獻(xiàn)四)。如圖IC和IF中所示，當(dāng)細(xì)胞用UAG或UAG(6-13)片段攻擊時(shí)，在AGE-培養(yǎng)的細(xì)胞中ROS產(chǎn)生的水平降低。和上述結(jié)果一致的是，使用AG不能檢測(cè)到效果。為了進(jìn)一步證實(shí)這些數(shù)據(jù)，將CAC分離自II型糖尿病患者，并進(jìn)行UAG或AG治療。圖ID中記錄的數(shù)據(jù)揭示出UAG而不是AG在糖尿病-回收的細(xì)胞中降低細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生。II.UAG預(yù)防CAC衰老除了DNA損害，應(yīng)激引起的信號(hào)也誘導(dǎo)衰老樣生長(zhǎng)停滯(參考文獻(xiàn)30)。p53、p21和pRb是衰老的主要調(diào)控劑，并且ROS產(chǎn)生通常被認(rèn)為是上游信號(hào)。之前示出衰老的促進(jìn)發(fā)作可在來(lái)自糖尿病患者的EPC中檢測(cè)到(參考文獻(xiàn)22)。上述數(shù)據(jù)導(dǎo)致評(píng)價(jià)是否ROS產(chǎn)生翻譯到衰老的促進(jìn)發(fā)作中，并且是否UAG可以解救該效果。為此，首先評(píng)價(jià)單獨(dú)或聯(lián)合UAG的AGE治療對(duì)于SA-β-gal活性的作用。和對(duì)于ROS產(chǎn)生的結(jié)果一致的是，UAG能夠減少衰老細(xì)胞的數(shù)量(圖2A)。另外，當(dāng)UAG加入AGE-培養(yǎng)的CAC中時(shí)，也可以檢測(cè)到SA-β-gal陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量顯著地減少(圖2A)。p53、p21和PRb在介導(dǎo)該事件中的作用由下列觀察結(jié)果證實(shí)UAG抑制AGE誘導(dǎo)的p53積聚、p21表達(dá)和Rb的磷酸化(圖2B)。另外，AGE-誘導(dǎo)的p53積聚和衰老樣生長(zhǎng)停滯通過(guò)沉默p53而受到抑制(圖2C)。為了進(jìn)一步證實(shí)這些數(shù)據(jù)，II型糖尿病患者進(jìn)行UAG治療。在治療12小時(shí)后，將CAC從UAG治療的和未治療的患者中回收并培養(yǎng)。如圖2D和2E所示，當(dāng)體內(nèi)施用時(shí)，UAG減少衰老細(xì)胞的數(shù)量并抑制P53積聚、Rb的磷酸化和p21表達(dá)。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí)p53-介導(dǎo)的傳導(dǎo)途徑有助于糖尿病環(huán)境中的損害的CAC功能，并且UAG可以抑制這些事件。III.UAG影響CAC轉(zhuǎn)移CAC生理性居住在BM中并且響應(yīng)于微環(huán)境改變而遷移至循環(huán)中。CAC轉(zhuǎn)移中的損害已經(jīng)報(bào)道在具有心血管風(fēng)險(xiǎn)因素的患者中(參考文獻(xiàn)19、31)。該觀察導(dǎo)致研究UAG治療對(duì)于BMCAC轉(zhuǎn)移的作用。為此，正常受試者和糖尿病患者用UAG或鹽水治療6小時(shí)。在治療后，將CAC從4個(gè)對(duì)照受試者和4個(gè)糖尿病患者中回收，并通過(guò)FACS分析分析和計(jì)數(shù)。如圖3A中所示，對(duì)于從UAG-治療的患者中回收的CAC的FACS分析證實(shí)確實(shí)回收的細(xì)胞是CAC，這由高表達(dá)的⑶45標(biāo)記、低頻率的⑶14單核細(xì)胞標(biāo)記與未表達(dá)的內(nèi)皮分化標(biāo)記⑶146和⑶105而示出。黑線是指用作陰性對(duì)照的免疫前IgG，并且灰線是指表面標(biāo)記表達(dá)。當(dāng)分析來(lái)自未治療的糖尿病患者或未治療的或治療的健康受試者中的CAC時(shí)，獲得類(lèi)似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未示出)。有趣地，和正常受試者相比，UAG治療而不是AG治療導(dǎo)致糖尿病患者中回收的細(xì)胞的數(shù)量明顯的增加(圖:3B)。在用AG或鹽水治療的糖尿病患者和對(duì)照之間未檢測(cè)到統(tǒng)計(jì)差異。為了證實(shí)它們的血管特征，從患者和對(duì)照中回收的細(xì)胞用IL-3培養(yǎng)；其能夠誘導(dǎo)衍生自外周血液和BM的CD45+細(xì)胞的增殖和動(dòng)脈形態(tài)發(fā)生(參考文獻(xiàn)28)。如圖3C中所示，從UAG-治療的糖尿病患者而不是從AG-治療的糖尿病患者中回收的細(xì)胞經(jīng)歷細(xì)胞增殖。另外，如圖3D中所記錄，當(dāng)通過(guò)用于動(dòng)脈標(biāo)記(肝配蛋白B2、刻缺蛋白1和刻缺蛋白4)或用于靜脈標(biāo)記(EphB4)的定量O^-RT-PCR來(lái)評(píng)價(jià)動(dòng)脈形態(tài)發(fā)生時(shí)，只發(fā)現(xiàn)得自UAG-治療的患者的細(xì)胞也能夠進(jìn)行動(dòng)脈說(shuō)明。這些數(shù)據(jù)還指示和糖尿病相關(guān)的CAC損害可通過(guò)UAG攻擊來(lái)解救。為了進(jìn)一步證實(shí)通過(guò)使用UAG處理患者和健康對(duì)照而獲得的數(shù)據(jù)，使用兩種不同的糖尿病鼠模型。用鹽水或UAG治療N0D/SCID鼠和ob/ob鼠不同時(shí)間間隔。本領(lǐng)域技術(shù)人員將熟悉N0D/SCID鼠和ob/ob鼠模型。在治療后，將細(xì)胞回收，通過(guò)FACS分析分析，計(jì)數(shù)和培養(yǎng)。如圖4A中所示，F(xiàn)ACS分析證實(shí)，對(duì)于人的負(fù)體，從UAG-治療的ob/ob鼠中回收的細(xì)胞表達(dá)⑶45標(biāo)記和⑶31、KDR而不是⑶33。黑線是指用作陰性對(duì)照的免疫前IgG，并且灰線是指表面標(biāo)記表達(dá)。當(dāng)分析來(lái)自未治療的糖尿病鼠以及未治療的或治療的野生型鼠中的CAC時(shí)，獲得類(lèi)似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未示出)。另外，和在非糖尿病N0D/SCID鼠中不同，在糖尿病N0D/SCID鼠中，UAG攻擊能夠增加回收的細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)(圖4B)。增加的循環(huán)CAC的數(shù)量還可以在用UAG攻擊的ob/ob鼠中檢測(cè)到。有趣地，從UAG-治療的ob/ob鼠中回收的細(xì)胞的數(shù)量平行于未治療的野生型鼠的情況，這指示出UAG將CAC的數(shù)量完全恢復(fù)至正常生理水平(圖4B)。和人負(fù)體一致的是，從UAG-攻擊的鼠中回收的CAC可以增殖(圖4C)，并且當(dāng)在IL-3存在下培養(yǎng)時(shí)獲得動(dòng)脈定型(圖4D)。UAG實(shí)現(xiàn)血管重塑和新血管形成IV.UAG治療解救糖尿病CAC的功能損害出現(xiàn)的數(shù)據(jù)表明祖細(xì)胞能夠引入現(xiàn)存的血管結(jié)構(gòu)中以形成新的血管并改善灌流(參考文獻(xiàn)33)。為了評(píng)價(jià)是否從UAG-治療的糖尿病患者中回收的CAC解救它們的血管形成能力，體內(nèi)檢測(cè)新生血管形成。為此，將含有IL-3和CSFE-標(biāo)記的CAC(從未治療的或UAG-治療的患者中回收)的Matrigelplug注射到SCID鼠中，在注射15天后，回收Matrigelplug并通過(guò)免疫組織化學(xué)分析。記錄在圖4E中的結(jié)果證實(shí)許多這些標(biāo)記的細(xì)胞形成功能血管，如通過(guò)在它們的腔中的紅血球所記載的那樣(圖4E，組b(右))。相反，當(dāng)使用從未治療的患者中回收的CAC時(shí)，不能檢測(cè)到功能血管(圖4E，組a(左))。為了排除新生血管衍生自宿主源的血管源性細(xì)胞的可能，使用抗-人HLA類(lèi)I和抗-鼠MHCII抗體來(lái)進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)大部分血管排列有人HLA類(lèi)I陽(yáng)性細(xì)胞(圖4F)。因此，這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步提供下列證據(jù)UAG治療改善CAC可用性和血管重塑能力。V.在人CAC上存在UAG結(jié)合位點(diǎn)通過(guò)評(píng)價(jià)IOOnM未標(biāo)記的UAG(1-28)和[125I-Tyr4]-UAG(0.25nM)競(jìng)爭(zhēng)這些結(jié)合位點(diǎn)，研究在CAC膜上存在UAG的特異性結(jié)合位點(diǎn)。還測(cè)試了存在IOOnMAG(1-28)(?；纳L(zhǎng)素釋放肽)>UAG(28-1)、生物失活生長(zhǎng)素釋放肽類(lèi)似物和合成UAG(6-1-NH2片段的情況下結(jié)合的特異性。這種競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合研究的結(jié)果(圖5A)揭示出[125I-Tyr4]-UAG和CAC膜的結(jié)合受到UAG(l-28)和UAG(6-13)而不是AG(1_28)或UAGQ8-1)的抑制。[125I-Tyr4]-UAG的特異性結(jié)合率(根據(jù)在不存在、對(duì)照和存在UAG的情況下結(jié)合率之間的差值來(lái)計(jì)算)表示對(duì)照值的約75%(P<0.001)，并且對(duì)來(lái)自兩種不同細(xì)胞制劑中的新鮮(0.25和0.26fmol)或凍融(0.20和0.33fmol)的CAC膜進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)來(lái)自產(chǎn)生足夠量的用于該試驗(yàn)的膜的CAC制劑的膜進(jìn)行飽和結(jié)合試驗(yàn)，揭示出放射配體和CAC膜的特異性結(jié)合是飽和的(圖5B)，在2nM處到達(dá)最大值，濃度和生理循環(huán)UAG水平一致。這些數(shù)據(jù)(數(shù)據(jù)未示出)Wkatchard分析暗示在CAC細(xì)胞上存在單一種類(lèi)(Hill系數(shù)接近1)的未?；纳L(zhǎng)素釋放肽結(jié)合位點(diǎn)，Kd為0.48nM，并且Bmax為10.7fmol/mg膜蛋白。這些結(jié)果指出UAG能夠以高的親和力結(jié)合至CAC細(xì)胞。材料和技術(shù)方案患者和對(duì)照-從6名II型糖尿病患者(性別，M/F5/1;HbAlc，8士1.2%；年齡-年，62.8士12.46；BMI,27.1士3.22肌酸肝，1.04士0.20mg/dl；腰圍(cm)，98.2士7.52，總膽固醇，192士50mmol/L，HDL膽固醇，46士13.98mmol/L,LDL膽固醇，113士39.77mmol/L,甘油三酯，157.5士Μ.23，空腹血糖1士19.04mg/dl無(wú)視網(wǎng)膜病，3名患者中有高血壓，血壓141/87mmHg;Ch0l/ap0B，1.3士0.1)中回收血液。所有都僅用飲食治療(糖尿病患者不使用其他藥物)。使用8名血液供體作為對(duì)照(性別，M/F4/4;年齡-年，26.6士4.65;BMI21.14士8.08，肌酸肝，0.96士0.063mg/dl，總膽固醇，162.13士10.79mmol/L，HDL膽固醇，49士10.4mmol/L,LDL膽固醇，86.25士17.72mmol/L，甘油三酯，132.13士27.10，無(wú)視網(wǎng)膜病，無(wú)高血壓血壓125/70mmHg，Chol/apoB,1.6士0.1)。所有受試者進(jìn)行下列測(cè)試UAG(3.0μg/kg/h從0至12小時(shí)靜脈內(nèi)輸注12h)；等滲鹽水(從0至12小時(shí)輸注)。在整夜空腹后，在通過(guò)緩慢輸注等滲鹽水而將留置導(dǎo)管置入前臂靜脈30分鐘后，在08.30-09.00a.m.開(kāi)始進(jìn)行所有試驗(yàn)。在Ohjh和1取出血液樣品。試劑-M199培養(yǎng)基(測(cè)試的內(nèi)毒素)、牛血清白蛋白、胎牛血清(FBS)、糖化人白蛋白(AGE)得自Sigma-Aldrich(StLouis,M0)。小牛血清(測(cè)試的內(nèi)毒素)得自HyClone(Logan,UT)0胰蛋白酶購(gòu)自Difco。硝基纖維素過(guò)濾器、辣根過(guò)氧化物酶-結(jié)合抗-兔IgG和抗-鼠IgG、分子量標(biāo)記與化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)得自AmershamBiosciences。酸性β-gal苷酶染色試劑盒得自Invitrogen0過(guò)氧化氫得自CarloErbareagents。通過(guò)Limulusamebocyte檢測(cè)(濃度<0.lng/ml)測(cè)試內(nèi)毒素污染的存在。人IL-3獲贈(zèng)自SandozPharmaLtd(Basel,Switzerland)。人UAG購(gòu)自PhoenixEuropeGmbH(Karlsruhe,Germany)?？贵w-單克隆抗_p53克隆DO-1、抗-CD31、抗-Flkl/KDR、抗-CD33FITC、抗-β-肌動(dòng)蛋白、抗-p21得自SantaCruzBiotechnology,Inc.(Heidelberg,Germany)。憐酸化-Rb來(lái)自CellSignaling^Technology(Beverly，MA)。抗-鼠CD45ΡΕ、抗-CD14ΡΕ、抗-人CD45FITC抗血清得自MiltenyiBiotecInc.(Auburn,CA,USA)抗-CD146-FITC抗體得自BioCytex(Marseille,France)ο抗-CD105FITC抗體購(gòu)自Tecnogeneticss.r.1.(MiIano,Italy)。第二FITC或PE抗體得自MiltenyiBiotechInc.和得自Sigma?？?人HLA類(lèi)I抗體得自Sigma-Aldrich，而抗-鼠MHCII抗體得自Chemicon(Temecula,CA,USA)。來(lái)自外周血液?jiǎn)魏思?xì)胞的CAC的分離和培養(yǎng)-將由FycollHistopaque1077(Sigma)分離的外周血液?jiǎn)魏思?xì)胞(PB-MNC)重懸于20%FBS199培養(yǎng)基中，并且放置在纖維結(jié)合蛋白-包覆的盤(pán)上(Biocoat,BectonDickinsonLabware)，如Hilletal.所述(參考文獻(xiàn)19)。對(duì)從正常供體和糖尿病患者中回收的CAC進(jìn)行人UAG研究。通過(guò)FACS分析評(píng)價(jià)有序細(xì)胞的純度(參考文獻(xiàn)20)。為了試驗(yàn)，將分離的CAC在5%C02、37°C下、在20μg/ml纖維結(jié)合蛋白-包覆的盤(pán)上、在EGM-2培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天，所述EGM-2培養(yǎng)基單獨(dú)或聯(lián)合1μMUAG和1.2mg/mlAGE含有10%FBS、氫化可的松、人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、胰島素生長(zhǎng)因子1、抗壞血酸、人表皮生長(zhǎng)因子、慶大霉素和兩性霉素-B(Cambrex,ffalkersville,MD,USA)。在選擇的試驗(yàn)中，將分離的CAC在補(bǔ)充10ng/ml的IL-3的EBM-2培養(yǎng)基(Cambrex,Walkersνi11e,MD,USA)中培養(yǎng)。FACS用于分析它們的表型(使用抗-⑶45、抗-⑶31、抗-⑶105、抗-⑶14抗體)(參考文獻(xiàn)22)。轉(zhuǎn)移檢測(cè)-評(píng)價(jià)從用UAG或鹽水治療Mi和12h的健康受試者和糖尿病患者中回收的CAC。MNC的總數(shù)量由3個(gè)獨(dú)立的研究者計(jì)數(shù)。CAC百分?jǐn)?shù)通過(guò)將從用UAG、AG或鹽水治療他和12h的糖尿病患者和健康供體中獲得的CAC和在時(shí)間O時(shí)回收的CAC進(jìn)行比較來(lái)計(jì)算。小干擾RNA(SiRNA)使內(nèi)源性p53沉默-為了獲得p53的失活，根據(jù)供應(yīng)商的說(shuō)明，將從使用或不使用AGE培養(yǎng)的正常受試者中回收的CAC由LipofectaminePLUS試劑(Invitrogen)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，其中載體pSUPERretro含有p53siRNA或雜化p53siRNA(對(duì)照siRNA)序列(1.5μg)jnBrummelkampetal.所述(參考文獻(xiàn)23)。含有p53siRNA和雜化p53siRNA的pSUPERretro由Dr.S.Soddu友好地提供。60h后制備全細(xì)胞提取物，在10%SDS-PAGE上分離，并用抗-p53抗體免疫印跡。ROS的檢測(cè)-在指示的培養(yǎng)條件下降DCF-DA(0.5μM最終濃度)加入CAC。在指示時(shí)間，細(xì)胞進(jìn)行FACS分析，并且按照上述方式進(jìn)行處理(參考文獻(xiàn)22)。使用H2O2作為陽(yáng)性對(duì)照。CAC衰老-通過(guò)對(duì)從在EGM2培養(yǎng)基中用UAG或AGE+UAG和鹽水培養(yǎng)4天的正常受試者或UAG-治療的糖尿病患者中回收的CAC的酸性β-gal活性來(lái)評(píng)價(jià)衰老(參考文獻(xiàn)22)。簡(jiǎn)言之，將CAC在磷酸鹽-緩沖鹽水中洗滌，在室溫下在2%多聚甲醛在固定3分鐘，在37°C下用新鮮SA-β-galstain溶液lmg/ml5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-卩比喃半乳糖苷(X-gal)、5mM/升亞鐵氰化鉀、5mM/升鐵氰化物、150mM/升NaCl、2mM/升MgCl2、0.01%去氧膽酸鈉和0.02%NonidetP-40溫育Mh。使SA-β-gal-陽(yáng)性細(xì)胞由3個(gè)獨(dú)立的研究者手工計(jì)數(shù)。蛋白質(zhì)印跡分析-將來(lái)自在UAG存在下聯(lián)合或不使用AGE培養(yǎng)的健康供體的CAC、以及來(lái)自用鹽水或UAG治療的糖尿病患者中回收的CAC胞溶。按照前面所述檢測(cè)蛋白濃度(參考文獻(xiàn)24)。將50μg的蛋白在SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分離，并轉(zhuǎn)移至硝基纖維素膜。如之前所述進(jìn)行和抗-P53、抗-p21與抗-磷酸化-Rb抗體的反應(yīng)，并用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)(AmershamBiosciences)來(lái)檢測(cè)(參考文獻(xiàn)20)。RNA分離和定量實(shí)時(shí)PCR-將來(lái)自用UAG或鹽水治療的糖尿病患者、健康受試者和鼠的CAC在EGM-2培養(yǎng)基中培養(yǎng)。使用人動(dòng)脈和靜脈細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照。如前所述，通過(guò)Q-RT-PCR進(jìn)行mRNA定量(參考文獻(xiàn)。通過(guò)使用比較性閾值循環(huán)方法來(lái)計(jì)算肝配蛋白B2、刻缺蛋白1、刻缺蛋白4和EphB4的相對(duì)表達(dá)。將使用的人和鼠引物序列進(jìn)行說(shuō)明(參考文獻(xiàn)25，26)。流式細(xì)胞計(jì)量-為了分析CAC細(xì)胞周期進(jìn)程，將從糖尿病、健康受試者、N0D/SCID，ob/ob和野生型鼠中回收的細(xì)胞在補(bǔ)充IL-3(10ng/ml)的EBM-2中培養(yǎng)，如前所述進(jìn)行FACS分析(參考文獻(xiàn)20)。如前所述通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)評(píng)價(jià)細(xì)胞表面分子(參考文獻(xiàn)24)。標(biāo)記-陽(yáng)性細(xì)胞的頻率表示為平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。體內(nèi)試驗(yàn)糖尿病和對(duì)照鼠-將鼠分成四組。記錄每組的血糖和胰島素的測(cè)定。十六只6周齡ob/ob鼠(血糖600士45mg/dL，胰島素5.5士0.9ng/ml)；十六只C56BL6/J野生型鼠(血糖150士18.2mg/dL，胰島素1士0.05ng/ml)；十只7周齡N0D/SCID鼠(血糖164士12.9mg/dL，胰島素1.2士.0.12ng/ml)；十只17周齡N0D/SCID(血糖536士36.3mg/dL，胰島素4.85士0.74ng/ml)。動(dòng)物程序符合CareandUseofLaboratoryResources指南(NationalInstitutesofHealthpublicationno.93-23,1985修訂)。血糖和血清胰島素測(cè)定-使用OneTouchII血糖儀(Lifescane，MountainView,CA)來(lái)測(cè)量血糖。根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明，使用鼠胰島素放射性免疫檢測(cè)試劑盒(LincoResearchimmunoassay,St.Charles,MO)測(cè)量血清胰島素。來(lái)自C57BL/6J、C57BL/6Job/ob鼠和N0D/SCID鼠的CAC的分離和培養(yǎng)-6周齡C57BL/6J(wt)和ob/ob鼠、7和17周齡N0D/SCID鼠購(gòu)自CharlesRiverLab(Lecco,Italy)。通過(guò)腹膜內(nèi)注射三溴乙醇(100mg/50mlip)來(lái)麻醉動(dòng)物。將血液樣品從左心室提取，如HofT所述(參考文獻(xiàn)27)。外周血液MNC通過(guò)Ficoll密度梯度離心法來(lái)分離。將回收的細(xì)胞洗滌兩次。將分離的細(xì)胞重懸，并且在20μg/ml纖維結(jié)合蛋白-包覆的盤(pán)上在EGM-2BulletKit培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在選擇的試驗(yàn)中，將分離的CAC在補(bǔ)充lOng/ml的IL-3的EBM-2培養(yǎng)基中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)移檢測(cè)-將鼠用UAG或鹽水治療12小時(shí)。將如上所述回收和純化的CAC置于培養(yǎng)基中，并且由三個(gè)獨(dú)立的研究者計(jì)數(shù)。通過(guò)比較CAC的數(shù)量/μL從左心室提取的血液來(lái)計(jì)算技術(shù)比。Matrigelplug檢測(cè)-對(duì)于鼠血管形成檢測(cè)，將未治療的或UAG-治療的CAC(得自II型糖尿病患者)計(jì)數(shù)，并重懸于DMEMGχ106，在250μLDMEM中)中。將細(xì)胞冷凍在冰中，用熒光染料羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯(CSFE，MolecularProbes)標(biāo)記，在4°C下加入含有IL-3(100ng/ml)的250μLMatrigel中，并在7周齡N0D/SCID鼠(5鼠/組)的腹部正中區(qū)域中皮下注射。在15天后，將鼠殺死，并且將Matrigelplug回收，并且固定在10%緩沖的甲醛溶液中，并且嵌入石蠟中用于免疫組織化學(xué)。免疫組織化學(xué)和免疫熒光-對(duì)于免疫組織化學(xué)，將來(lái)自Matrigelplug的石蠟-嵌入塊的切片收集到聚-賴氨酸-包覆的載玻片上。將內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性用6%H2O2在室溫下阻斷8分鐘。為了檢測(cè)熒光染料CSFE標(biāo)記的細(xì)胞，將抗-熒光素/OregonGreen多克隆Abs(MolecularProbes)在4°C下施加至載玻片過(guò)夜。將辣根過(guò)氧化物酶-標(biāo)記的抗兔Envision聚合物(DakoCytomation，Carpinteria,CA)溫育30分鐘。將反應(yīng)產(chǎn)物用3，3-二氨基苯聯(lián)胺顯色。忽略初級(jí)Ab或使用不相關(guān)兔血清IgG的置換作為陰性對(duì)照。對(duì)于各試驗(yàn)在x40倍下將陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)在4個(gè)非順序切片中進(jìn)行計(jì)數(shù)。對(duì)于免疫熒光，如前所述將樣品用抗-人HLAI和抗-鼠MHCII抗體進(jìn)行處理(參考文獻(xiàn)28)。MHCII或HLAI陽(yáng)性血管的數(shù)量通過(guò)在三個(gè)不同樣品中計(jì)數(shù)10個(gè)隨機(jī)選擇的區(qū)域來(lái)確定。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析-體外和體內(nèi)結(jié)果代表至少三個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)。進(jìn)行三次體外試驗(yàn)。使用Bio-RadGS250分子成像儀的密度計(jì)分析法用于計(jì)算蛋白激活或表達(dá)的誘導(dǎo)倍數(shù)的差異(*和§ρ<0.05，在試驗(yàn)和對(duì)照值之間有統(tǒng)計(jì)顯著性)。試驗(yàn)和對(duì)照值之間的差異顯著性使用Newman-Keuls多重比較檢驗(yàn)的方差分析來(lái)計(jì)算。在體內(nèi)試驗(yàn)中進(jìn)行類(lèi)似的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。應(yīng)理解，本說(shuō)明書(shū)中記錄的數(shù)據(jù)僅給出描述本發(fā)明，并且不可以認(rèn)為構(gòu)成其限制。盡管結(jié)合特定實(shí)施方案來(lái)描述了本發(fā)明，但是應(yīng)理解，其能夠進(jìn)一步修改，并且本申請(qǐng)旨在涵蓋任何變化、運(yùn)用、或運(yùn)用它的一般原理的修改，并且包括落在本發(fā)明附加的權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)的偏離作為本領(lǐng)域已知或?qū)嵺`的本公開(kāi)的內(nèi)容。在本說(shuō)明書(shū)中引用的所有文獻(xiàn)都通過(guò)弓I用的方式并入本文中。參考文獻(xiàn)列表1.KojimaM,HosodaH,DateY,NakazatoΜ,MatsuoHand.KangawaK；Ghrelinisagrowth-hormone-releasingacylatedpeptidefromstomach,Nature402656-660(1999).2.GnanapavanS,KolaB,BustinSA,MorrisDG,McGeeP,FaircloughP,BhattacharyaS,CarpenterR,GrossmanABandKorbonitsM；ThetissuedistributionofthemRNAofghrelinandsubtypesofitsreceptor,GHS-R,inhumans,J.Clin.Endocrinol.Metab.87:2988-2991(2002)·3.HowardAD,FeighnerSD,CullyDF,ArenaJP,LiberatorPL,RosenblumCl,HamelinM,HreniukDL,Palyha0C,AndersonJ,ParessPS,DiazC,ChouM,LiuKK,McKeeK-K,PongS-S,ChaungL-Y,ElbrechtA,DashkeviczM,HeavensR,RigbyM,SirinathsinghjiD,DeanDC,MeIiIIoDG,PatchettAA,NargundR,GriffinPR,DeMartinoJA,GuptaSK,SchaefferJA,SmithRG,VanderPloegLHT；Areceptorinpituitaryandhypothalamusthatfunctionsingrowthhormonerelease.Science273:974-977(1996).4.LiA，ChengG，ZhuGH,TarnawskiAS；Ghrelinstimulatesangiogenesisinhumanmicrovascularendothelialcells!ImplicationsbeyondGHrelease.Biochem.Byophis.Res.commun.353:238-43(2007).5.LiWG,GavrilaD，LiuX,WangL,GunnlaugssonS,StollLL,McCormickML,SigmundCD，TangC，WeintraubNL；Ghrelininhibitsproinflammatoryresponseandnuclearfactor-kappaBactivationinhumanendothelialcells.Circulation1092221-6(2004).6.DixitVD,SchafferEM,PyIeRS,CollinsGD，SakthivelSK,PalaniappanR，LillardJWJr,TaubDD；Ghrelininhibitsleptin—andactivation-inducedproinflammatorycytokinesexpressionbyhumanmonocytesandTcells.J.Clin.Inv.114:57-66(2004).7.vanderLeIyAJ,TschopMiHeimanMLiGhigoE；Biological,physiological,pathophysiological,andpharmacologicalaspectsofghrelin.EndocrRev25:426-457(2004).8.BaldanziG，F(xiàn)ilighedduN，CutrupiS，CatapanoF，BonissoniS，F(xiàn)ubiniA，MalanD，BajG，GranataR，BroglioF，PapottiM，SuricoN，BussolinoF，lsgaardJ，DeghenghiR，SinigagliaF，PratM，MuccioliG，GhigoE，GrazianiA；Ghrelinanddes-acylghrelininhibitcelldeathincardiomyocytesandendothelialcellsthroughERK1/2andPl3-kinase/AKT.JCellBiol.159:1029-37(2002)·9.DelhantyPJ，vanderEerdenBC,vanderVeldeM，GaunaC，PolsHA,JahrH，ChibaH，vanderLeIyAJ,vanLeeuwenJ；Ghrelinandunacylatedghrelinstimulatehumanosteoblastgrowthviamitogen-activatedproteinkinase(MAPK)/phosphoinositide3-kinase(PI3K)pathwaysintheabsenceofGHS-RIa.JEndocrinol.188:37-47(2006).10.ChoiK，RohSG，HongYH，ShresthaYB，HishikawaD，ChenC，KojimaM，KangawaK，SasakiS；Theroleofghrelinandgrowthhormonesecretagoguesreceptoronratadipogenesis.Endocrinology.144:754-9(2003).11.SorrentinoSA,BahlmannFH,BeslerC，MOllerM，SchulzS,KirchhoffN，DoerriesC，HorvathT，LimbourgA，LimbourgF，F(xiàn)liserD，HallerH，DrexlerH，LandmesserU；Oxidantstressimpairsinvivoreendothelializationcapacityofendothelialprogenitorcellsfrompatientswithtype2diabetesmellitusrestorationbytheperoxisomeproliferator-activatedreceptor-gammaagonistrosiglitazone.Circulation116:163-73(2007).12.BrizziMF,DentelliP，PavanM，RossoA，GambinoR，GraziaDeCesarisM，GarbarinoG，CamussiG，PaganoG，PegoraroL；DiabeticLDLinhibitscell-cycleprogressionviaSTAT5Bandp21(waf).JClinInvest.109:111-9(2002).13.ThumT，F(xiàn)raccarolloD，SchultheissM，F(xiàn)roeseS，GaluppoP，WidderJD,TsikasD，ErtlG，BauersachsJ；Endothelialnitricoxidesynthaseuncouplingimpairsendothelialprogenitorcellmobilizationandfunctionindiabetes.Diabetes56:666-74(2007).14.DimmelerS，ZeiherAM；Vascularrepairbycirculatingendothelialprogenitorcells:themissinglinkinatherosclerosis？JMoIMed.82671-7(2004).15.TepperOMiGalianoRD,CaplaJMiKalkaCiGagnePJ，JacobowitzGR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管疾病的風(fēng)險(xiǎn)中或患有心血管疾病。23.根據(jù)權(quán)利要求17至22中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述受試者患有I型或II型糖尿病。24.根據(jù)權(quán)利要求17至23中任一項(xiàng)所述的方法，其中以從約0.OOlμg/kg至約IOmg/kg變化的劑量施用所述多肽。25.根據(jù)權(quán)利要求17至24中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述片段包含SEQIDNO:1的殘基8至12或其類(lèi)似物。26.根據(jù)權(quán)利要求17至24中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述片段包含SEQIDNO1的殘基6至13或其類(lèi)似物。27.根據(jù)權(quán)利要求17至24中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述片段具有選自由SEQIDNO6、SEQIDN0:7、SEQIDNO:8及其類(lèi)似物構(gòu)成的組中的氨基酸序列。28.根據(jù)權(quán)利要求17至24中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述片段由氨基酸序列SEQIDNO6構(gòu)成。29.一種用于在受試者中改善血管重塑和/或新血管形成的方法，該方法包括向所述受試者施用治療有效量的多肽，所述多肽包含SEQIDNO:1的氨基酸序列或其具有所述SEQIDNO1的生物活性的片段或類(lèi)似物。30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述方法用于增加循環(huán)生血管細(xì)胞(CAC)數(shù)量和/或改善CAC功能。31.根據(jù)權(quán)利要求29或30所述的方法，其中以從約0.001μg/kg至約10mg/kg變化的劑量施用所述多肽。32.根據(jù)權(quán)利要求29至31中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述片段包含SEQIDN0:1的殘基8至12或其類(lèi)似物。33.根據(jù)權(quán)利要求29至31中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述片段包含SEQIDNO=I的殘基6至13或其類(lèi)似物。34.根據(jù)權(quán)利要求29至31中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述片段具有選自由SEQIDNO6、SEQIDN0:7、SEQIDNO:8及其類(lèi)似物構(gòu)成的組中的氨基酸序列。35.根據(jù)權(quán)利要求29至31中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述片段由氨基酸序列SEQIDNO6構(gòu)成。36.一種用于治療心血管疾病的藥物組合物，包含治療有效量的多肽，其中所述多肽包含SEQIDNO1的氨基酸序列或其具有所述SEQIDNO=I的生物活性的片段或類(lèi)似物；和藥學(xué)上可接受的載體。37.一種用于治療受試者中的心血管疾病的分離的多肽，包含SEQIDNO:1的氨基酸序列或其具有所述SEQIDNO:1的生物活性的片段或類(lèi)似物。38.一種用于在受試者中增加循環(huán)生血管細(xì)胞(CAC)數(shù)量和/或改善CAC功能的分離的多肽，包含SEQIDNO1的氨基酸序列或其具有所述SEQIDNO=I的生物活性的片段或類(lèi)似物。39.一種用于在受試者中改善血管重塑和/或新血管形成的分離的多肽，包含SEQIDNO1的氨基酸序列或其片段或類(lèi)似物。40.一種用于在受試者中改善傷口愈合的分離的多肽，包含SEQIDNO:1的氨基酸序列或其片段或類(lèi)似物。41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的分離的多肽，其中所述受試者患有糖尿病潰瘍。42.一種用于改善與移植相關(guān)的植入物成功生長(zhǎng)的分離的多肽，包含SEQIDN0:1的氨基酸序列或其片段或類(lèi)似物。43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的多肽，其中所述植入物成功生長(zhǎng)是器官移植后的植入物成功生長(zhǎng)。44.一種用于組織工程的分離的多肽，包含SEQIDNO:1的氨基酸序列或其片段或類(lèi)似物。45.治療有效量的多肽在治療受試者中的心血管疾病中的用途，所述多肽包含SEQIDNO1的氨基酸序列或其具有所述SEQIDNO1的生物活性的片段或類(lèi)似物。46.治療有效量的多肽在制備治療受試者中的心血管疾病的藥物中的用途，所述多肽包含SEQIDNO1的氨基酸序列或其具有所述SEQIDNO=I的生物活性的片段或類(lèi)似物。47.治療有效量的多肽在受試者中增加循環(huán)生血管細(xì)胞(CAC)數(shù)量和/或改善CAC功能中的用途，所述多肽包含SEQIDNO1的氨基酸序列或其具有所述SEQIDNO=I的生物活性的片段或類(lèi)似物。48.治療有效量的多肽在制備在受試者中增加循環(huán)生血管細(xì)胞(CAC)數(shù)量和/或改善CAC功能的藥物中的用途，所述多肽包含SEQIDNO:1的氨基酸序列或其具有所述SEQIDNO1的生物活性的片段或類(lèi)似物。49.治療有效量的多肽在受試者中改善血管重塑和/或新血管形成中的用途，所述多肽包含SEQIDNO:1的氨基酸序列或其具有所述SEQIDNO:1的生物活性的片段或類(lèi)似物。50.治療有效量的多肽在制備在受試者中改善血管重塑和/或新血管形成的藥物中的用途，所述多肽包含SEQIDNO1的氨基酸序列或其具有所述SEQIDNO=I的生物活性的片段或類(lèi)似物。全文摘要本發(fā)明涉及用于治療心血管疾病、用于增加循環(huán)生血管性細(xì)胞(CAC)數(shù)量和/或改善CAC功能的方法、和用于改善血管重塑和/或新血管形成的方法。該方法包括向受試者施用治療有效量的未酰化的生長(zhǎng)素釋放肽或多肽，所述未酰化的生長(zhǎng)素釋放肽或多肽包含SEQIDNO1的氨基酸序列或其具有SEQIDNO1的生物活性的片段或類(lèi)似物；和包含未?；纳L(zhǎng)素釋放肽或多肽的藥物組合物，所述未?；纳L(zhǎng)素釋放肽或多肽包含SEQIDNO1的氨基酸序列或其具有SEQIDNO1的生物活性的片段或類(lèi)似物。文檔編號(hào)A61P17/00GK102065883SQ200980122284公開(kāi)日2011年5月18日申請(qǐng)日期2009年6月12日優(yōu)先權(quán)日2008年6月13日發(fā)明者埃齊奧·吉戈,瑪麗亞·F·布里齊,賈姆皮羅·穆奇奧利申請(qǐng)人:阿利茲藥物股份有限公司