專利名稱：誘發(fā)對于Globo H及SSEA3的特異免疫反應的組合物以及其在癌癥治療中的用途的制作方法
誘發(fā)對于Globo H及SSEA3的特異免疫反應的組合物以及 其在癌癥治療中的用途相關(guān)申請本案已向美國臨時申請案第61/061，968號作過申請的優(yōu)先權(quán)(2008年6月16日 申請)，其內(nèi)容在此以其全文并入作為參考資料。
背景技術(shù)：
Globo H是一種在各種上皮癌中過表達的癌癥抗原。已建議此種抗原可作為癌癥 免疫治療的靶標。盡管已研發(fā)出可誘發(fā)對抗Globo H的抗體反應的疫苗，但因Globo H的 低抗原性，其抗癌功效并不令人滿意。因此仍需要可誘發(fā)靶向Globo H的高量免疫反應的 新疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是根據(jù)無法預見的發(fā)現(xiàn)(I)Globo H的立即前驅(qū)物SSEA3在乳癌干細胞 中有高量的表達，并因此可作為乳癌治療的適當靶標，以及⑵α -半乳糖苷基-神經(jīng)酰胺 (a-GalCer)是一種有效的佐劑，其可促進抗-Globo H及抗-SSEA3抗體的生成。因此，本發(fā)明一方面提出一種免疫組合物，其含有Globo H或其片段(如，SSEA3) 以及一佐劑(如，α-GalCer)。Globo H或其片段可與匙孔戚血藍蛋白(KLH)復合。在給予 至對象(如，人類)體內(nèi)時，此種免疫組合物可誘發(fā)靶向GloboH或其片段的免疫反應(如， 抗體生成)，并因此可有效治療癌癥(如，乳癌、前列腺癌、卵巢癌、及肺癌)。另一方面，本發(fā)明涉及一種制備對于Globo H或其片段具有特異性的抗體的方法， 其是對一非人類哺乳動物(如，小鼠、兔、山羊、綿羊、或馬)給予上述的免疫組合物，并自該 哺乳動物分離可結(jié)合Globo H或其片段的抗體。又另一方面，本發(fā)明提出一種以可抑制2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶I(FUTl)或2-巖藻糖 基轉(zhuǎn)移酶2(FUD)活性的第一劑來治療癌癥的方法。FUTl及FUT2兩者皆參與Globo H的 生物合成。此劑可以是阻礙FUT1/FUT2與其底物間交互作用的抗體或抑制FUTl或FUT2表 達的干擾RNA(如，siFUTl或siFUT2)。選擇性地，靶向FUTl的第一劑可與能抑制FUT2活 性的第二劑合并。在一實例中，第一劑為siFUTl而第二劑為siFUT2。該免疫組合物或該第一及第二劑對于治療癌癥以及生產(chǎn)治療癌癥的藥劑的用途 也在本發(fā)明范圍的內(nèi)。本發(fā)明的各種具體實例于下文詳述。本發(fā)明的其它特征或優(yōu)勢將可由下文圖表及 各種具體實例的詳細敘述以及權(quán)利要求范圍而清楚呈現(xiàn)。在不須進一步說明的情形下，相信所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本文的敘述可將 本發(fā)明應用至其最廣范圍。因此，下文的敘述應僅被視為說明而不以任何方式限制本發(fā)明 的范圍。附圖簡要說明附圖首次被描述。
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圖1描述Globo H(GH)中的六糖抗原表位及其片段的結(jié)構(gòu)的圖表。欄A 六糖抗 原表位的結(jié)構(gòu)。欄B 六糖抗原表位及七種其片段的結(jié)構(gòu)。圖2顯示單以KLH-復合的Globo H以及同時以KLH-復合的Globo H及α-GalCer 免疫的小鼠中抗-Globo H及抗-SSEA3抗體的量的圖表。圖3顯示siFUTl及siFUT2對FUTl及FUT2在乳癌細胞中的表達的作用的圖表。 欄A 在MB157細胞中，藉由siFUTl抑制FUTl的表達。欄B 在T-47D細胞中，通過siFUTl 及siFUT2分別抑制FUTl及FUT2的表達。圖4顯示siFUTl及siFUT2對抑制異種移植乳癌的作用的圖表。欄a 顯示siFUTl 及siFUT2抑制乳癌增長的圖表。欄b 顯示siFUTl及siFUT2降低腫瘤塊重量的圖表。
具體實施例方式除非此處另有說明，否則與本發(fā)明有關(guān)的科學和技術(shù)名詞與所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù) 人員通常所了解的意義相同。如此處所述，除非另有說明，否則下列名詞具有其所屬的意 義。除非內(nèi)文需要，否則單數(shù)名詞應包括復數(shù)的涵意以及復數(shù)名詞應包括單數(shù)的涵 意。此處所使用的冠詞"a"和"an"指該冠詞的一或多于一個(即，至少一個)的語法 受詞。例如，“一組件”意指一個組件或多于一個的組件。已發(fā)現(xiàn)Globo H以及其立即前驅(qū)物SSEA3兩者皆可作為癌癥治療中的靶標。因此，本發(fā)明的實施例之一是一種治療癌癥的方法，其是對需要其的對象給予一 有效量的免疫組合物，該組合物包含Globo H或其片段(如SSEA-3，也稱為( 以及一佐 劑。目標癌癥的類型包括，但不限于，乳癌(包括1-4期)、肺癌(如，小細胞肺癌)、肝癌 (如，肝細胞癌及膽管癌)、口腔癌、胃癌(包括T1-T4)、結(jié)腸癌、鼻咽癌、皮膚癌、腎癌、腦瘤 (如，星形細胞瘤、多形性膠質(zhì)母細胞瘤、及腦脊髓膜瘤)、前列腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、膀 胱癌、以及子宮內(nèi)膜瘤、橫紋肌肉瘤、骨肉瘤、平滑肌肉瘤、及胃腸道基質(zhì)瘤。本文所用的術(shù) 語“治療”是指對一對象施用或給予包括一或多種活性劑的組合物，該對象具有癌癥、癌癥 的癥狀、或是傾向癌癥的素因，該施用及給予的目的為治愈、治療、緩和、減輕、改變、補救、 改善、改進、或影響該癌癥、癌癥的癥狀、或是傾向癌癥的素因。本文所用的“有效量”是指 在單獨使用或是結(jié)合一或多種其它活性劑的情形下，欲對該對象產(chǎn)生治療作用所需的各活 性劑的量。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，有效量會根據(jù)給予的途徑、賦形劑的使用、以及其它活 性劑的共使用而各有不同。用于上述方法中的免疫組合物可含有一聚糖(即，含有糖分子部分的分子)，其是 Globo H或其片段，以及一佐劑。Globo H是含有六糖抗原表位(示于圖1，欄A)，并視情形 含有一非糖分子部分的聚糖。其片段是含有該六糖抗原表位以及，如適用，該非糖分子部分 的片段的聚糖。該些寡糖可由常規(guī)方法制備(參見，Huang et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 :15-20(2006)).如需要，其可與非糖分子部分連結(jié)。任何上述的聚糖可與一蛋白載體(諸如，KLH)復合。其可接著與佐劑及視情形 的醫(yī)藥可接受性載體(如，磷酸緩沖鹽水，或碳酸氫鹽溶液)混合，以經(jīng)由公知的方法而形 成免疫組合物(如，疫苗)。參見，如，美國專利No. 4，601，903 ；4, 599，231 ；4, 599，230 ’及 4，596，792。該組合物可被制備為可注射物、液態(tài)溶液、或乳液，且該載體是根據(jù)給予的方式及途徑并根據(jù)標準醫(yī)藥實務而選擇。適當?shù)尼t(yī)藥載體及稀釋劑，以及為其使用的醫(yī)藥輔 14^ ^ Remington' s Pharmaceutical Sciences。α -GalCer
作為佐劑。佐劑的其它實例包括，但不限于，霍亂毒素、大腸桿菌忌熱性腸毒素(LT)、脂質(zhì) 體、免疫刺激性復合物(ISCOM)、或免疫刺激性序列寡脫氧核苷酸(ISS-ODN)。該組合物也 可包括可協(xié)助體內(nèi)輸送的聚合物。參見，Audran R. et al. Vaccine21 1250-5，2003 ；以及 Denis-Mize et al. Cell Immunol.，225 12-20，2003。在需要時，其尚可含有少量的輔助物 質(zhì)，諸如，濕潤及乳化劑，或PH緩沖劑，以增進該組合物誘發(fā)對抗Globo H或其片段中的糖 分子部分的免疫反應的能力。本文所述的免疫組合物可由腸外給予(如，靜脈注射、皮下注射、或肌內(nèi)注射)?；?者，可能需要其它給予模式，包括栓劑及口服調(diào)配物。就栓劑而言，黏合劑及載體可包括，例 如，聚烯烴基二醇或三酸甘油脂?？诜{(diào)配物可包括正常使用的賦形劑，諸如，舉例而言，醫(yī) 藥級的糖精、纖維素、碳酸鎂、及其類似者。該些組合物可為溶液、懸浮液、錠劑、丸劑、膠囊、 持續(xù)釋放調(diào)配物、或粉末的形式，且其含有10-95 %的本文所述免疫組合物。該免疫組合物是以可與該投劑調(diào)配物兼容的方式進行給予，且其給予量為具有治 療有效性、保護性、及免疫原性的量。給予的量取決于該待治療的對象，包括，例如，該個體 的免疫是統(tǒng)合成抗體及(如需要)產(chǎn)生細胞中介性免疫反應的能力。給予所需活性成分的 精確量是由執(zhí)業(yè)醫(yī)師的判斷決定。然而，適當?shù)膭┝糠秶捎杀绢I(lǐng)域技術(shù)人員輕易決定。起 始給予及強化劑的適當方案也是可變的，但可包括一起始的給予再接續(xù)后續(xù)的給予。該疫 苗的劑量也可能取決于給予途徑，并根據(jù)該宿主的尺寸而變化。本發(fā)明的免疫組合物也可用于在動物體內(nèi)產(chǎn)生抗體以進行抗體的制備，該些抗體 可用于癌癥的治療及診斷。在動物(如，小鼠、兔、山羊、綿羊、或馬)體內(nèi)制備單克隆及多 克隆抗體及其片段的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。參見，例如，Harlow and Lane, (1988) Antibodies ALaboratory Manual, Cold SpringHarbor Laboratory, New York。術(shù)語“抗 體”包括完整的免疫球蛋白分子以及其片段，如，F(xiàn)ab、F(ab' )2、Fv、scFv(單鏈抗體)、及 dAb(域抗體；Ward，et. al. (1989) Nature, 341, 544)。本發(fā)明的另一實施例是一種通過抑制FUTl及/或FUT2 (兩者皆負責GloboH的生 物合成)活性治療癌癥的方法。FUTl及FUT2為熟知的2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，其經(jīng)由一 α-1， 2鍵結(jié)將海藻糖單元轉(zhuǎn)移至寡糖底物的還原端。參見，如，NCBI Gene ID :2523及NCBI Gene ID :2524ο在一實例中，通過對需要其的對象給予一有效量可阻礙FUT1/FUT2及其底物間交 互作用的抗體(意即，對FUT1/FUT2或其底物具有特異性的抗體)以實行前面描述的方法。一般而言，為生產(chǎn)這樣的抗體，F(xiàn)UT1/FUT2、其片段、或其底物可與載體蛋白(如， KLH)復合，如需要，與佐劑混合，然后注射至宿主動物。在動物體內(nèi)產(chǎn)生的抗體可接著 以公知的方法純化，如，親和色譜分析法。通常使用的動物包括，兔、小鼠、天竺鼠、及大 鼠。根據(jù)宿主物種，可使用各種佐劑來增強免疫反應，并且包括，佛朗氏佐劑(Freimd’ s adjuvant (完全及非完全))、礦物膠諸如氫氧化鋁、CpG、表面活性物質(zhì)諸如脫脂酸卵磷脂、 多聚醇(pluronicpolyols)、聚陰離子、肽、油乳化液、鑰孔戚血藍蛋白、及二硝基酚。有效的 人類佐劑包括BCG (bacilie Calmette-Guerin，卡介苗)及短棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)。
多克隆抗體，抗體分子的異質(zhì)群體，存在于被免疫對象的血清中。單克隆抗體， (針對FUT 1/FUT2或其底物的)抗體的同質(zhì)群體，可使用標準雜交瘤細胞技術(shù)制備(參 見，例如，Kohler et al. (1976) Eur J Immunol 6，292 ；及 Hammerling et al. (1981) Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas, Elsevier, N. Y.)。具體而言，單克隆抗 體可通過任何可提供由培養(yǎng)的連續(xù)細胞系產(chǎn)生抗體分子的技術(shù)獲得，諸如描述于Kohler et al. (1975)Nature 256，495 及美國專利 No. 4，376，110 ;the human B-cell hybridoma technique (Kosbor et al. (1983)Immunol Today 4，72) ；Cole et al. (1983)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80,2026,及 EBV-hybridoma technique (Cole et al. (1983)Monoclonal Antibodies and CancerTherapy, Alan R. Liss, Inc. , pp. 77-96)。該些抗體可為任何免疫 球蛋白族，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD、及任何其亞族。本發(fā)明中生產(chǎn)單克隆抗體的雜交 瘤細胞可培養(yǎng)于體外或體內(nèi)。在體內(nèi)產(chǎn)生高效價單克隆抗體的能力為特別有用的生產(chǎn)方 法。另外，可使用為生產(chǎn)“嵌合抗體”發(fā)展的技術(shù)。參見，如，Morrisonet al. (1984)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81,6851 ；Neuberger et al. (1984)Nature312,604 ；及 Takeda et al. (1984) Nature 314,452.嵌合抗體是一分子，其不同部分來自不同動物物種，諸如具有 來自小鼠單株抗體的可變區(qū)以及來自人類免疫球蛋白的固定區(qū)的那些?；蛘撸尚薷纳a(chǎn) 單鏈抗體的技術(shù)(美國專利No. 4，946，778及4，704，692)以產(chǎn)生單鏈Fv抗體的噬菌體基 因庫。單鏈抗體是通過以氨基酸鍵連結(jié)重鏈及輕鏈的Fv區(qū)而形成。此外，抗體片段可通 過已知的技術(shù)生產(chǎn)。例如，該些片段包括，但不限于，可通過以胃蛋白酶切割抗體分子而產(chǎn) 生的F(ab，)2片段，以及可通過還原F(ab，)2的雙硫鍵而產(chǎn)生的Fab片段?？贵w通過本領(lǐng) 域中已知的方法可被人源化。例如，具有所需結(jié)合特異性的單株抗體透過商業(yè)可被人源化 Gcotgen，Scotland ；以及 Oxford Molecular, Palo Alto, Calif) 完全的人類抗體，諸如 該些在轉(zhuǎn)基因動物中被表達的，也為本發(fā)明的特征。參見，如，Green et al. (1994)Nature Genetics 7，13 ；及美國專利 No. 5，545，806 及 5，569，825。在另一實例中，上述方法可被實行，其通過給予需癌癥治療的對象有效量的一或 多種雙鏈RNA (dsRNAs)，經(jīng)由RNA干擾來抑制FUTl和/或FUT2的表達，從而降低Globo H 的量。RNA干擾(RNAi)是dsRNA將同源的特定序列的信使RNA導向降解的程序。在哺乳類 細胞中，RNAi可通過雙21-核苷酸的小干擾RNA(SiRNA)被引發(fā)而不活化宿主的干擾素反應。dsRNA可通過本領(lǐng)域中已知的方法合成。參見，如，Caruthers et al.，1992， Methods in Enzymology 211,3-19 ；Wincott et al. ,1995, Nucleic Acids Res. 23, 2677-2684；Wincott et al.,1997, Methods Mol. Bio. 74,59 ；Brennan et al.,1998, Biotechnol. Bioeng. ,61,33-45 ；以及 Brennan，美國專利 No. 6，001, 311。其也可由表達載 體被轉(zhuǎn)錄并且使用標準技術(shù)分離出來。如上所述的dsRNA或載體通過諸如 Akhtar et al.，1992，Trends Cell Bio. 2，139 所描述的方法可被遞送至癌癥細胞。例如，使用微脂體、水凝膠、環(huán)糊精、生物可降解的納米 膠囊、或具生物黏附性的微球可將其引入細胞。或者，通過直接注射或輸液泵的使用，可局 部地遞送dsRNA或載體。其它的途徑包括使用各種運輸及載送系統(tǒng)，例如，透過偶合物及生 物可降解的聚合物的使用。作為一實例，上述dsRNA含有與CGCGGACTTGAGAGATCCTTT互補的第一鏈，或其互補鏈(如，描述于下，實施例2中的siFUTl)。在另一實例中，該dsRNA含有 與CTATGTCCATGTCATGCCAAA互補的第一鏈，或其互補鏈(如，描述于下，實施例2中的 siFUT2)。為促進遞送，上述dsRNA或可表達該dsRNA的DNA質(zhì)體可與一陪伴劑(chaperone agent)復合。在此處使用的“復合”意謂兩個體被聯(lián)結(jié)，較佳地具有足夠的親和力，其使因 兩個體聯(lián)結(jié)而來的治療效益得以實現(xiàn)?！皬秃稀卑ü矁r或非共價鍵結(jié)以及其它形式的聯(lián) 結(jié)，諸如一個體在另一個體表面或內(nèi)部的陷入(entrapment)，或其一或兩者在第三個個體 (如，微胞)表面或內(nèi)部的陷入。陪伴劑可為自然界存在的物質(zhì)，諸如蛋白質(zhì)(如，人類血清白蛋白、低密度脂蛋 白、或球蛋白)、碳水化合物(如，葡聚糖、普魯蘭多糖、幾丁質(zhì)、幾丁聚糖、菊糖、環(huán)糊精、或 糖醛酸)、或脂質(zhì)。其也可為重組或合成分子，諸如合成的多氨基酸聚合物(如，聚賴氨酸、 聚L-天冬氨酸、聚L-谷氨酸、苯乙烯-馬來酸酐共聚物、聚乳酸-甘醇酸共聚物、二乙烯基 醚-馬來酸酐共聚物、N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺共聚物、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚氨酯、 聚乙基丙烯酸、N-異丙基丙烯酰胺聚合物、及聚磷腈?；蛘?，陪伴劑可為微胞、微脂體、納米 微粒、或微球，而dsRNA或DNA質(zhì)體被封裝其中。在一實例中，陪伴劑作為一或多種膜融合劑、凝聚劑、或靶向劑的附著基質(zhì)。膜融合劑對局部pH具有易響應性。例如，當遇到內(nèi)體內(nèi)部的pH時，其可引起其立 即周圍中的物理變化(如，滲透性質(zhì)的改變，其中斷或增進內(nèi)體膜的通透性)，因而促進釋 放dsRNA或DNA質(zhì)體至宿主細胞的細胞質(zhì)中。較佳的膜融合劑可改變帶電量，例如，在pH 低于生理范圍(如，在pH 4.5-6.5)時變?yōu)橘|(zhì)子化。膜融合劑可為含有當曝露于特定pH范 圍時可改變帶電量(如，質(zhì)子化)的氨基的分子。該些膜融合劑包括具有多氨基鏈的聚合 物(如，聚乙烯亞胺)以及膜破壞劑(如，蜂毒素)。其它實例包括聚組氨酸、聚咪唑、聚乙 烯亞胺、蜂毒素、及聚甲醛物質(zhì)(如，陽離子聚甲醛)。凝聚劑與dsRNA或DNA質(zhì)體相互作用(如，攻擊、容納、或結(jié)合)并且引起其凝聚 (如，縮小dsRNA/質(zhì)體的尺寸)，因而保護dsRNA/質(zhì)體對抗降解作用。較佳地，凝聚劑包 含一部分(如，一帶電部分)，其經(jīng)由，如，離子相互作用力，與dsRNA或DNA質(zhì)體相互作用。 凝聚劑的實例包括聚賴氨酸、精胺、亞精胺、多胺或其四級鹽、偽肽-多胺、精氨酸、脒、精蛋 白、陽離子脂質(zhì)、陽離子卟啉、及α螺旋肽。在無進一步闡述之下，相信本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)以上說明將本發(fā)明運用至其最 完全的程度。以下特定實例應被理解為僅是例示說明，而無論如何不以任何方式限制本說 明書中的其它部分。所有本文中引用的文獻并入本文作為參考資料。實施例1以KLH-復合的Globo H以及α -GalCer誘發(fā)對于Globo H及SSEA3具 有特異性的抗體Globo H-KLH 購自于 Optimer Pharmaceuticals。三組(一組兩只)的 6 周齡 雌 BALB/b 小鼠(BioLASCO)分別被注射(s. c.)以 PBS( “對照小鼠”)、0. 6 μ gKLH-Globo H (" Globo H 小鼠”)、以及 0. 6μ g KLH-Globo H 與 2yg α-GalCer 的組合(“Globo H-GalCer 小鼠”)，每周一次共三周。最后一次注射后10天收集各組小鼠的血清，并依據(jù)Huang et al. ,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 :15-20(2006)所描述的方法偵測對于 Globo H及 SSEA3 具有特異性的抗體。簡言之，血清以3% BSA/PBS緩沖液1 25稀釋，然后50ml的各稀釋血清在加濕室中與上黏附有Globo H及SSEA3的玻片共同培養(yǎng)1小時。玻片以0. 05% PBS/ Tween 20 (PBST)清洗三次然后接著在同一室中與100 μ 1的Cy5_復合山羊抗-小鼠IgG抗 體(1 200)共同培養(yǎng)?？諝飧稍锖螅Ｆ訮BST及水各清洗三次，然后以微陣列掃描儀 (GenePix 4000B ；Molecular Devices)測量從而釋放的熒光強度。以GenePix Pro軟件分 析如此獲得的結(jié)果。于Globo H小鼠，僅少量的抗-Globo H IgG抗體被偵測到而抗-SSEA IgG抗體的 量則偵測不到。參見圖2。不同的是，于Globo H-GalCer小鼠，抗-GloboH IgG及抗-SSEA IgG兩種抗體皆大量顯現(xiàn)。也參見圖2。該些發(fā)現(xiàn)指出GloboH-KLH與α-GalCer的組合是 一有效誘發(fā)抗-Globo H IgG及抗-SSEA IgG此兩種抗體的疫苗。實施例2經(jīng)由RNA干擾對FUTl及FUT2的抑制可降低Globo H的量FUTl及FUT2在MCF-7、ΜΒ157、及T-47D三種乳癌細胞中的mRNA的量通過定量 RT-PCR測定，如下。全RNA從該些癌細胞被提取出來，然后使用該RNA為模板而oligo (dT) 為引物經(jīng)由逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA。五十納克的cDNA進行RT-PCR，其使用下列引物L_futl CCTGCCAGACTCTGAGTTCC 及 AGGCTTAGCCAATGTCCAGA 以及 L_fut2 :GGGAGTTACCGGTGCAGATA 及 R-fut2 :GTCCCAGTGCCT TTGATGTT。RT-PCR在以下條件下實行使用 ABI Prism 7000序列偵 測系統(tǒng)，50°C經(jīng)2min，95°C經(jīng)lOmin，接著進行40循環(huán)的95°C經(jīng)IOsec及60°C經(jīng)lmin，然后 使用ABI Prism 7000SDS軟件(Applied Biosystems)分析如此獲得的結(jié)果進而得到FUTl 及FUT2在各細胞是中mRNA量的循環(huán)數(shù)閾值(Ct值)。以同細胞中的HPRTl的mRNA量正 常化Ct值以得到Δ Ct值。使用FUTl在MCF-7中的Δ Ct值來正?；疐UTl或FUT2在各細 胞是中的ACt值。mRNA量的變化倍數(shù)根據(jù)以下公式計算s_H—。 使用HRPTl及GAPDH作為內(nèi)部對照。未發(fā)現(xiàn)FUTl的mRNA量在三種乳癌細胞之間有顯著差異。另一方面，在MCF-7及 MB157細胞中，幾乎偵測不到FUT2的mRNA，然而在!"470細胞中的FUT2的mRNA量較其它兩 種細胞高6000倍。經(jīng)由RNA干擾降低FUTl及FUT2的量如下?？赊D(zhuǎn)譯為siFUTl的核苷酸序列(含 有與CGCGGACTTGAGAGATCCTTT互補的序列)及可轉(zhuǎn)譯為siFUT2的核苷酸序列(含有與 CTATGTCCATGTCATGCCAAA互補的序列)被克隆進到VSV-G-偽型慢病毒載體中然后與套裝 質(zhì)體pMD. G及PCMV Δ R8. 91 —同引入細胞中。在轉(zhuǎn)染48及72小時后收獲如此產(chǎn)生 的慢病毒微粒并且以超高速離心法(25，000rpm，90分鐘)密集的。該些能夠表達siFUTl 及siFUT2的病毒微粒在8 μ g/mL凝聚胺(Sigma-Aldrich Corp.)存在下與ThT_47D或 MB157 (于6孔培養(yǎng)盤植入hlO5細胞/孔)共同培養(yǎng)。在96小時后收獲細胞然后通過定 量RT-PCR測定FUTl及FUT2的mRNA量如上述。如圖3所示，siFUTl成功地降低了在MB157細胞中FUTl的mRNA量(見欄A)。相 似地，siFUTl及siFUT2分別降低了 FUTl及FUT2在T-47D細胞中的mRNA量。參見圖3，欄 B0使用AlexaFluor488-VK_9抗體經(jīng)由流式細胞計數(shù)分析測定在MB 157及 T-47D細胞中的Globo H的量，如下。細胞的等分試樣(各含IxlO5細胞)首先 % anti-GloboH-Alexa488(Vk9 ；參 B Chang et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA105 11667-11672(2008))在冰上共同培養(yǎng)1小時，然后與生物素化-UEAl (VectorLaboratories)在冰上共同培養(yǎng)1小時，最后與FITC-復合的鏈親和素(Jackson ImmunoResearch)在冰上共同培養(yǎng)1小時。細胞接著使用FACSCant0流式細胞計數(shù)器進行 流式細胞計數(shù)分析，然后通過CellQuest程序(BD Biosciences)分析如此獲得的數(shù)據(jù)。由 此研究獲得的結(jié)果顯示，在MB157細胞中經(jīng)由RNA干擾以抑制FUTl表達造成Globo H的量 減少，而經(jīng)由RNA干擾以抑制FUT2表達造成在T-47D細胞中的Globo H的量減少。實施例3SiFUTl及SiFUT2的抗癌作用抑制癌細胞的增長乳癌細胞MB157及T-47D被植入96孔培養(yǎng)盤(Corning)中，每孔IxlO4細胞。該 些細胞接著與如上實施例2所述可表達SiFUTl或siFUT2的病毒微?；旌?，或不與其混合， 接著以300g離心5min進行旋轉(zhuǎn)感染(spin infection)。M小時后，加入最終濃度為1 10稀釋的阿爾瑪藍(alamar blue,AbD Serotec)至細胞，然后細胞在37°C、5% CO2中培養(yǎng) 3hr0接著，以SpectraMax M2視讀器測量于M4nm及590nm的吸收。細胞在同條件下以新 鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)，在起初植入過程后48、72、及96小時后再次測量于M4nm及590nm的吸收。 由此研究獲得的結(jié)果顯示，相較于未受感染者，以病毒細胞感染的MB157及T-47D細胞兩者 的增長率皆降低。以上數(shù)據(jù)說明通過siRNA抑制FUTl及FUT2的表達造成癌細胞增長的抑 制。抑制乳腺球群細胞的形成以可表達siFUTl或siFUT2的病毒微粒感染的MB157及T-47D細胞被以1，000 細胞/ml的密度懸浮于輔加以0. 4% BSA、20ng/ml EGF、20ng/ml bFGF、5ug/ml胰島素、 IM氫化皮質(zhì)酮(hydrocortisone)、4 μ g/ml肝素、Ix B27輔加物、以及1 %甲基纖維素 (Sigma-Aldrich)的DMEM/F12培養(yǎng)液中。懸浮的細胞接著植入超低吸附培養(yǎng)盤(Costar) 中并且在適合條件下培養(yǎng)以容許乳腺球群細胞的形成。如此形成的初級乳腺球群細胞每周 饋料培養(yǎng)。為進行次級乳腺球群細胞培養(yǎng)，收獲初級乳腺球群細胞，以胰蛋白酶(Gibco)分 散，離心成團粒，以1，000細胞/ml懸浮于上述培養(yǎng)液中。懸浮的細胞接著依據(jù)上述方法培 養(yǎng)以容許次級乳腺球群細胞的形成。表達siFUTl的MB157及T-47D細胞所形成的乳腺球 群細胞數(shù)目皆僅為未受感染者的50%，其指出siFUTl顯著地降低癌細胞形成乳腺球群細 胞的能力。相似地，表達siFUT2的T-47D細胞所形成的乳腺球群細胞數(shù)目僅為未受感染者 的17%。此結(jié)果顯示，如同siFUTl，siFUT2也顯著地降低癌細胞形成乳腺球群細胞的能力。降低致癌性使用六周齡的balb/c裸鼠及N0D/SCID小鼠，于各小鼠的側(cè)邊以 17-β-estradiol (1.7mg/ml)行皮下注射。于八周齡的雌balb/c裸鼠其乳腺脂肪墊注射 ⑴穩(wěn)定表達siFUT的MB157細胞(IxlO7), ( )對照載體ΜΒ157細胞(IxlO7)，(iii)穩(wěn)定 表達 siFUTl 的 T-47D 細胞(5xl06)，(iv)穩(wěn)定表達 siFUT2 的 T-47D 細胞(5xl06)，以及(ν) 對照載體 T-47D 細胞(5χ106)，以上皆懸浮于 0. Iml 的 50% Matrigel (BD Biosciences)及 50%具輔加的RPMI-1640培養(yǎng)液中。在該些經(jīng)處理小鼠中形成的腫瘤尺寸于各個時間點通 過測量其長⑴及寬⑷定期追蹤。腫瘤體積計算如下V= ji/6X1XWX[1+W]/20動物 最終被犧牲后切下腫瘤并秤重。如圖4欄a所示，以對照載體處理的小鼠其腫瘤隨時間持續(xù)增長，然而在以可表達 siFUTl或siFUT2的細胞處理的小鼠中，腫瘤增長率被顯著地降低。該些小鼠的腫瘤塊重量也顯著地低于以對照載體處理。參見圖4欄b。改變細胞形態(tài)及黏著能力雖然一般的T-47D細胞為似正方形，表達SiFUTl及siFUT2的T-47D細胞為小的 圓形細胞并形成密集群集。在表達SiFUTl的MB-157細胞觀察到類似的形態(tài)變化。使用RT-CES儀測定細胞黏著。簡言之，ACEA’ s 96微量盤以纖維連接蛋白05 μ g/ ml, Sigma), IV 型膠原蛋白(2μ g/ml, BD Biosciences)，或?qū)诱尺B蛋白(5μ g/ml, Sigma) (以上皆以PBS稀釋適當倍數(shù))于37°C涂布Ihr然后于37°C以BSA阻斷l(xiāng)hr。MB157 及T-47D細胞以2. 5x IO4每100 μ 1培養(yǎng)液植入經(jīng)涂布的ACEA，s 96微量盤。使用RT-CES 在1小時內(nèi)每IOmin追蹤細胞黏著。加入Globo H神經(jīng)酰胺(50 μ g/ml于無血清培養(yǎng)液 中)至某些細胞以檢驗其是否抵消SiFUTl及siFUT2的作用。結(jié)果指出，相較于不表達任 一 siRNA的細胞以及以Globo H神經(jīng)酰胺挽回siRNA造成的黏著抑制，siFUTl及siFUT2降 低癌細胞對于聚苯乙烯的細胞黏著0. 63倍。抑制細胞遷移表達siFUTl及siFUT2的細胞的遷移能力在傷口愈合分析中被首次檢驗，如下。 MB157及T-47D細胞以含血清培養(yǎng)液培養(yǎng)于12孔培養(yǎng)盤直到其生長達到60%滿。細胞接 著以述于上實施例1中的病毒微粒感染或引入一對照質(zhì)體。該些細胞在2天的培養(yǎng)期間 內(nèi)達到100%滿。接著細胞進行一夜的饑餓處理，然后以20μ 1塑料吸頭銳利地創(chuàng)傷匯合 的單層細胞。以輔加以血清的RPMI培養(yǎng)液清洗后，細胞被培養(yǎng)于RPMI培養(yǎng)液中然后使 用可控制溫度及(X)2的時差顯微鏡檢驗的。每4h共3天或每池共1天獲取細胞的相差 (phase-contrast)影像。細胞遷移的速率使用Metamorph軟件決定，其測量細胞在一欲知 時間內(nèi)移動的距離。結(jié)果指出，相較于以對照質(zhì)體轉(zhuǎn)染的細胞，siFUTl抑制T47-D及MB158 細胞的遷移各為2. 81及2. 13倍。外源性加入的Globo H神經(jīng)酰胺可挽回表達siFUTl及 siFUT2的細胞其降低的遷移能力。此資料指出所觀察的遷移降低是因經(jīng)由RNA干擾抑制 FUTl及FUT2表達而使Globo H的量降低而造成。綜而言之，以上結(jié)果說明，通過抑制FUTl及FUT2表達并且因此降低Globo H的量， siFUTl及siFUT2在癌癥治療中是有效的。其它實施例可依任何的組合結(jié)合此專利說明書中所公開的全部特性。此專利說明書中所公開 的每一特性可被用于相同、等效或類似目的的另類特性所取代。因此，除非另有說明，否則 公開的每一種特性僅為一系列普通等效或類似特性的實施例。從上述的描述，所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員可容易地確認本發(fā)明的必要特征，并可 對本發(fā)明作出各種的改變和修飾以適應各種的用途和狀況而不偏離其精神和范圍。因此， 其它實施例也在權(quán)利要求范圍的中。
權(quán)利要求
1.一種免疫組合物，其包括聚糖及α-半乳糖苷基-神經(jīng)酰胺，其中該聚糖為Globo H 或其片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫組合物，其特征在于，該聚糖為GloboH。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫組合物，其特征在于，該聚糖為SSEA3。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫組合物，其特征在于，該聚糖或其片段與匙孔戚血藍蛋白復合。
5.一種免疫組合物，其包括SSEA3及佐劑。
6.一種治療癌癥的方法，其包括對需要其的對象給予一有效量的根據(jù)權(quán)利要求1所述 的免疫組合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，該癌癥選自由乳癌、前列腺癌、卵巢癌、以 及肺癌所組成的組。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，該癌癥為乳癌。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，該聚糖為GloboH且該免疫組合物誘發(fā)對 抗Globo H的免疫反應。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，該聚糖為SSEA3且該免疫組合物誘發(fā)對 抗SSEA3的免疫反應。
11.一種治療癌癥的方法，其包括對需要其的對象給予一有效量的根據(jù)權(quán)利要求5所 述的免疫組合物。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，該癌癥選自由乳癌、肺癌、肝癌、口腔 癌、胃癌、結(jié)腸癌、鼻咽癌、皮膚癌、腎癌、腦瘤、前列腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、以及膀胱癌所 組成的組。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，該癌癥為乳癌。
14.一種生產(chǎn)對于Globo H或其片段具有特異的抗體的方法，其包括對一非人類哺乳 動物給予有效量的包含Globo H或其片段的組合物及α-半乳糖苷基-神經(jīng)酰胺以誘發(fā)可 結(jié)合Globo H或其片段的抗體的產(chǎn)生，并分離出該抗體。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，該組合物包含GloboH。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，該組合物包含SSEA3。
17.一種治療癌癥的方法，其包括對需要其的對象給予一有效量的可抑制2-巖藻糖基 轉(zhuǎn)移酶I(FUTl)或2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶2 (FUD)活性的第一劑，其中該劑為可阻礙FUTl或 FUT2與其底物間交互作用的抗體或抑制FUTl或FUT2表達的干擾RNA。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，該第一劑為小干擾RNA(siRNA)。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，該siRNA為siFUTl或siFUT2。
20.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，該第一劑可抑制FUTl活性并且進一步 給予該對象有效量的可抑制FUT2活性的第二劑，該第二劑為可阻礙FUT2與其底物間交互 作用的抗體或抑制FUT2表達的干擾RNA。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，該第一及第二劑為siRNA。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，該第一及第二劑分別為siFUTl及 siFUT2。
23.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，該癌癥為乳癌。
全文摘要
本發(fā)明提供一種含有Globo H或其片段(如，SSEA3)以及一佐劑(如，α-GalCer)的免疫組合物，用以誘發(fā)對抗Globo H或其片段的免疫反應，以及其在癌癥治療中的用途。也公開了一種通過抑制FUT1及FUT2(兩者皆參與Globo H的生物合成)其一的活性以治療癌癥的方法。
文檔編號A61K31/7008GK102065868SQ200980123721
公開日2011年5月18日 申請日期2009年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月16日
發(fā)明者志輝·王, 愛麗絲·L·于, 約翰·于 申請人:中央研究院