專利名稱：包含PRFA^*突變體李斯特菌的組合物及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的領(lǐng)域總體涉及用于表達(dá)包括異源多肽在內(nèi)的多肽的新型重組李斯特菌 (Listeria)。尤其是，本發(fā)明涉及可用于疫苗組合物的在I^rfA中含有突變的重組細(xì)菌。
背景技術(shù)：
對基于重組單核細(xì)胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes, Lm)疫苗與其 它重組疫苗平臺相比的優(yōu)點的認(rèn)識，有助于它們當(dāng)前的開發(fā)和在早期臨床試驗中的通行評 價。這些優(yōu)點包括實用性考慮因素諸如用于生產(chǎn)的直接發(fā)酵法，以及諸如即使在保護(hù)性Lm 特異性免疫的存在下反復(fù)施用的能力等其它理想特征(Bower，H. G.等(1999) Infection and Immunity 67 :253-258 ；Starks,H.等(2004)J Immunol 173 :420-427,Stevens,R.等 人O005)Vaccine 23:1479-1490)。該疫苗平臺的一個主要原理是基于小鼠李斯特菌病模 型中保護(hù)的公知關(guān)聯(lián)響應(yīng)于以單核細(xì)胞增生性李斯特菌進(jìn)行的單免疫而誘導(dǎo)的長壽的功 能性 CD4+ 和 CD8+ 記憶 T 細(xì)胞(Harty, J. T.等人(2000) Ann Rev Immunol 18 :275-308 ； Pamer，E. G. (2004) Nat. Rev. Immunol. 4 :812-823)。現(xiàn)在有大量公開文件可證實重組單核細(xì) 胞增生性李斯特菌疫苗由于強(qiáng)健的先天和適應(yīng)性細(xì)胞免疫而在數(shù)種動物模型中的顯著功 效(Brockstedt, D. G.等人(2004)Proc Natl Acad Sci U S A 101 :13832-13837 ；Bruhn, K. W.等人 Q007)Microbes Infect 9 :1226-1235 ；Paterson,Y.和Maciag，P.C. (2005) Curr Opin Mol Ther 7 =454-460) 0已報道了將重組單核細(xì)胞增生性李斯特菌疫苗用于治療癌 癥和腫瘤(例如見 Brockstedt 等人 Q004)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 :13832-13837 ； Brockstedt 等人(2005)Nature Med. 11 :853-860) ；Starks 等人(2004)J.Immunol. 173 420-427 ；Shen 等人(1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 :3987-3991)。例如，美國專利公開 號 2005/(^81783、2005/0249748、2004/0228877 和 2004/0197343 中也報道了基于李斯特菌 的疫苗，將各篇上述文件通過引用整體并入本文。因此，基于重組Lm的疫苗代表了解決對 可引發(fā)功能性細(xì)胞免疫從而預(yù)防或治療感染如HIV、HCV、結(jié)核和瘧疾以及癌癥的有效疫苗 的急迫全球性需求的新興方法。未來幾年的結(jié)果將表明在臨床前研究中觀察到的強(qiáng)力活性 是否能轉(zhuǎn)變?yōu)閷θ梭w的有效性。由于單核細(xì)胞增生性李斯特菌是在免疫受損的個體中具有增加毒力的食物傳 播病原體，因此減毒疫苗平臺是在人中進(jìn)一步評估的先決條件(Lorber，B. (1997)Clin Infect Dis 24 1-9)0衍生于野生型株10403S的活減毒疫苗平臺和光化學(xué)失活疫苗平臺 都已有描述(Brockstedt, D. G.等人(2005)Nat Med 11 :853-860 ；Brockstedt, D. G.等人 (2004) Proc Natl Acad Sci U S A 101 :13832-13837)?；顪p毒疫苗株缺失acU和 inlB毒 力基因(單核細(xì)胞增生性李斯特菌AactA/AinlB)，所述毒力基因缺失聯(lián)合限制了在肝臟
8中的生長，肝臟正是野生型生物體感染的主要靶器官。這種聯(lián)合缺失阻斷了經(jīng)由MlB肝細(xì) 胞生長因子受體相互作用的直接肝細(xì)胞感染(Dramsi，S.等人(1995)Mol Microbiol 16: 251-261)以及從被感染的肝存留Kupffer細(xì)胞經(jīng)由ActA介導(dǎo)的細(xì)胞至細(xì)胞的傳播而在肝 細(xì)胞中的間接傳播。與靜脈內(nèi)注射(IV)野生型Lm的小鼠相比，靜脈內(nèi)注射(IV)單核細(xì)胞 增生性李斯特菌AactA/AinlB的小鼠中的肝毒性顯著降低，所述肝毒性通過血清肝功檢 測(LFTs)谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)測定。此外，在給予逐增劑量的基于單核 細(xì)胞增生性李斯特菌AactA/Δ inlB株的食蟹猴中進(jìn)行的2種GLP毒性研究中，肝毒性最 小并且無劑量限制(數(shù)據(jù)未公開)。單核細(xì)胞增生性李斯特菌AactA/AinlB疫苗株構(gòu)成 了 2項正在對患晚期癌癥的成年對象進(jìn)行的FDA批準(zhǔn)的1期臨床試驗的基礎(chǔ)。第二種疫苗 平臺稱為殺死但具有代謝活性(Killed But Metabolically Active，KBMA)，源于單核細(xì)胞 增生性李斯特菌Δ actA/ Δ inlB,并且還同時攜帶了 uvrA和uvrB的缺失，uvrA和uvrB是 編碼核苷酸切除修復(fù)(NER)途徑的DNA修復(fù)酶的基因。KBMA疫苗(單核細(xì)胞增生性李斯特 菌Δ actA/ Δ inlB/ Δ uvrAB)對通過合成補骨脂素、S_59和長波UV光的聯(lián)合處理進(jìn)行光化 學(xué)失活非常敏感。在被殺死時，KBMA單核細(xì)胞增生性李斯特菌疫苗能夠瞬時表達(dá)其基因產(chǎn) 物，從而使其逃避吞噬溶酶體并誘導(dǎo)功能性細(xì)胞免疫和針對野生型單核細(xì)胞增生性李斯特 菌與疫苗病毒侵襲的保護(hù)(Brockstedt, D. G.等人(2005)Nat Med 11 :853-860)。是充當(dāng)中心毒力調(diào)節(jié)物的細(xì)胞內(nèi)激活轉(zhuǎn)錄因子，其作用是能夠使單核細(xì)胞 增生性李斯特菌在哺乳動物內(nèi)或作為腐生生物的生長生活方式如“化身博士”(Dr. Jekyll and Mr. Hyde)所述那樣二元化(Gray, M.J.等人 Q006nnfect Immun 74:2505-2512)。 PrfA敲除株不具毒力(Vazquez-Boland，J. A.等人 Q001)Clin Microbiol Rev 14: 584-640)。在野生型Lm中，PrfA在感染宿主細(xì)胞時表達(dá)，并進(jìn)而誘導(dǎo)包括分別編碼李斯特 溶素O(LLO)和磷脂酶C的hly和plcA基因的prfA調(diào)節(jié)子的表達(dá)。組合時，這些基因產(chǎn)物介 導(dǎo)該細(xì)菌由吞噬溶酶體的嚴(yán)酷微環(huán)境中逃逸。PfrA還調(diào)節(jié)內(nèi)化素基因(例如，inlA和inlB) 的轉(zhuǎn)錄，所述內(nèi)化素基因編碼有助于受體介導(dǎo)的非吞噬細(xì)胞的感染的配體(kortti，Μ.等 人Q007)Microbes Infect) 0通過將異源基因與hly或actA啟動子連接，所述I^rfA依 賴啟動子能夠用于驅(qū)動重組單核細(xì)胞增生性李斯特菌疫苗中的Ag表達(dá)(Gurm，G. R.等 人 O001)J Immunology 167 :6471-6479 ；Shen, H.等人(199 Proc Natl Acad Sci 92 3987-3991)。可導(dǎo)致I^rfA依賴基因的組成型激活的I^rfA中的氨基酸取代物統(tǒng)稱為I^rfA* 突變體(Ripio, M.T.等人(1997) J Bacteriol 179 :1533-1540 ；Scortti, M.等人(2007) Microbes Infect)。多種具有超溶血表型的野生型單核細(xì)胞增生性李斯特菌株具有prfA中 的突變，最常見為G145S，與實驗室獲得株如10403S相比，G145S可產(chǎn)生增加的毒力(Ripio， Μ. Τ.等人(1997) J Bacteriol 179:1533-1540)。類似地，通過化學(xué)誘變法選擇的I^rfA依 賴基因表達(dá)增加的其它prfA突變體也具有對小鼠增加的毒力(Sietron-Rama，L. Μ.等人 (2003) Mol Microbiol 48 :1537-1551)。免疫之前對I^rfA依賴基因的誘導(dǎo)可通過多種機(jī)制 增強(qiáng)疫苗的功效，所述機(jī)制包括在宿主細(xì)胞胞質(zhì)溶膠中增加吞噬溶酶體逃逸和I^rfA依賴 編碼抗原的表達(dá)，產(chǎn)生更強(qiáng)力的⑶4+和⑶8+T細(xì)胞應(yīng)答。對于開發(fā)具有增加功效的疫苗，理想的是改善用于異源抗原向受感染細(xì)胞(特別 是抗原遞呈細(xì)胞)的胞質(zhì)溶膠中的李斯特菌介導(dǎo)的輸送方法。還繼續(xù)需要可增強(qiáng)基于Lm 的疫苗的效能或降低基于Lm的疫苗的毒性的進(jìn)一步改進(jìn)，從而有助于其最終臨床開發(fā)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了包含可用作異源抗原輸送載體的毒力基因的組成型突變體激活劑 的李斯特菌。在一些實施方式中，通過PrfA調(diào)節(jié)子的組成型激活，可增強(qiáng)李斯特菌的異源 多肽和/或多核苷酸向受感染細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠中的輸送。提供了含有李斯特菌的組合物如 藥物組合物和疫苗。還提供了利用李斯特菌誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，或者治療或預(yù)防治療哺乳動物 疾病的方法。在一方面，本發(fā)明提供了包含編碼突變體多肽的多核苷酸的重組李斯特菌 屬細(xì)菌；和包含PrfA應(yīng)答調(diào)控元件和編碼異源多肽的多核苷酸的重組多核苷酸。編碼異源 多肽的多核苷酸可操縱地連接于PrfA應(yīng)答調(diào)控元件。在一些方面，異源多肽是非細(xì)菌的。 在本發(fā)明的一些方面，PrfA*突變體多肽包含選自Y63C、E77K、L149F、G145S、G155S和S183A 的突變。在一些方面，I^fA*突變體多肽是G155S突變。在本發(fā)明的一些方面，所述重組多 核苷酸編碼包含信號肽和異源多肽的融合蛋白。在本發(fā)明的一些方面，PrfA應(yīng)答調(diào)控元件 選自hly啟動子、plcA啟動子、plcB啟動子、mpl啟動子、hpt啟動子、inlC啟動子、inlA啟 動子、inlB啟動子、prfA啟動子和actA啟動子。在一些方面，prfA應(yīng)答調(diào)控元件是actA啟 動子。在本發(fā)明的一些方面，所述信號肽是選自單核細(xì)胞增生性李斯特菌的ActA信號肽、 單核細(xì)胞增生性李斯特菌的LLO信號肽、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的^φ45信號 肽、炭疽桿菌(Bacillus anthracis)的保護(hù)抗原信號肽、單核細(xì)胞增生性李斯特菌的p60 信號肽、枯草桿菌(Bacillus subtilis)的WioD信號肽、secA2信號肽和Tat信號肽的信 號肽。在一些方面，所述信號肽是單核細(xì)胞增生性李斯特菌的ActA信號肽。在一些方面， 所述融合蛋白包含ActA的前100個氨基酸。在本發(fā)明的一些方面，重組李斯特菌屬細(xì)菌包含含有抗原的異源多肽，所述抗原 選自腫瘤相關(guān)抗原、腫瘤相關(guān)抗原衍生的多肽、傳染病抗原和傳染病抗原衍生的多肽。在一 些方面，所述傳染病抗原來自病毒或異源傳染病病原體，該病毒或異源傳染病病原體選自 肝炎病毒、流感病毒、人類免疫缺陷病毒、乳頭瘤病毒、單純皰疹病毒1、單純皰疹病毒2、巨 細(xì)胞病毒、結(jié)核分枝桿菌、惡性瘧原蟲或沙眼衣原體。肝炎病毒的實例包括，但不限于甲肝 病毒、乙肝病毒或丙肝病毒。在本發(fā)明的一些方面，包含毒力基因的組成型突變體激活劑的李斯特菌屬于物種 單核細(xì)胞增生性李斯特菌。在一些方面，重組李斯特菌屬細(xì)菌是減毒的；例如對于細(xì)胞至細(xì) 胞的傳播、進(jìn)入非吞噬細(xì)胞、增殖或DNA修復(fù)中的一種或多種方面。在一些情況下通過actA 突變、inlB突變、uvrA突變、uvrB突變、uvrC突變、核酸靶向的化合物或uvrAB突變和靶向 核酸的化合物中的一種或多種使李斯特菌減毒。在一些情況下，靶向核酸的化合物是補骨 脂素。在一些方面，本發(fā)明提供了重組I^rfA*李斯特菌屬細(xì)菌，其中該菌的核酸通過與可直 接與核酸反應(yīng)的靶向核酸的化合物進(jìn)行反應(yīng)而得到修飾，從而使該菌在增殖方面被減弱。 在一些情況下，該菌包含可使被修飾的菌在增殖方面減弱的核酸交聯(lián)物。在一些情況下，該 菌包含使菌在增殖方面被減弱的補骨脂素-核酸加合物。在一些情況下，該菌還包含可減 弱該菌修復(fù)其被修飾核酸的能力的遺傳突變。在本發(fā)明的一些方面，該菌包含actA、inlB、 uvrA和uvrB中的失活突變；并且該菌的增殖已通過補骨脂素_核酸交聯(lián)物被減弱。在本 發(fā)明的一些方面，PrfA*李斯特菌被殺死但具有代謝活性(KBMA)。
本發(fā)明提供了包含重組李斯特菌屬細(xì)菌，以及藥學(xué)上可接受的賦形劑、佐劑 和共刺激分子中的一種或多種的藥物組合物。在一些方面，所述組合物還包含治療劑。本發(fā)明提供了誘導(dǎo)宿主的針對非李斯特菌抗原的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包 括對宿主施用有效量的組合物，所述組合物包含編碼I^fA*突變體多肽的重組李斯特菌屬 細(xì)菌；和包含PrfA應(yīng)答調(diào)控元件以及編碼異源多肽的多核苷酸從而編碼可操縱地連接于 prfA應(yīng)答調(diào)控元件的抗原的重組多核苷酸。在一些方面，本發(fā)明提供了增強(qiáng)非李斯特菌抗 原在宿主中的免疫原性的方法。在一些方面，本發(fā)明提供了預(yù)防或治療宿主中的非李斯特 菌的傳染病癥或癌性病癥的方法。在一些方面，所述抗原選自腫瘤相關(guān)抗原、腫瘤相關(guān)抗原 衍生的多肽、傳染病抗原和傳染病抗原衍生的多肽。在一些方面，所述免疫應(yīng)答是先天免疫 應(yīng)答；在一些方面所述免疫應(yīng)答是適應(yīng)性免疫應(yīng)答。在本發(fā)明的一些方面，所述宿主是人。 在本發(fā)明的一些方面，本發(fā)明的重組李斯特菌增大響應(yīng)于I^rfA*重組李斯特菌的施用而引 起的對所編碼抗原特異性的T細(xì)胞功能。本發(fā)明提供了誘導(dǎo)或增強(qiáng)宿主中的免疫應(yīng)答的方法，其中重復(fù)施用本發(fā)明的重組 PrfA*李斯特菌屬細(xì)菌。在一些方面，首先施用本發(fā)明的重組I^rfA*李斯特菌屬細(xì)菌，然后 一次或多次施用非李斯特菌免疫原性組合物。在一些情況下，首先施用非李斯特菌免疫原 性組合物，然后一次或多次施用本發(fā)明的重組I^fA*李斯特菌屬細(xì)菌。在本發(fā)明的一些方面，與其中編碼異源多肽的多核苷酸的表達(dá)受野生型I^rfA多 肽控制的重組李斯特菌屬細(xì)菌誘導(dǎo)的抗原的免疫原性相比，抗原的免疫原性得到增強(qiáng)。在 一些情況下，增強(qiáng)的免疫原性包括MCP-I、IL-6、IFN- y , TNFa或IL_12p70中的一種或任 意組合的表達(dá)增加。本發(fā)明提供了重組李斯特菌屬細(xì)菌的制備方法。例如，將在I^rfA-應(yīng)答調(diào)控元件 控制下的編碼異源多肽的重組多核苷酸穩(wěn)定地引入到I^rfA*李斯特菌屬細(xì)菌中。在一些情 況下所述異源多肽與信號序列融合。在一些方面，編碼異源多肽的重組多核苷酸整合在李 斯特菌染色體中。在一些情況下，編碼異源多肽的重組多核苷酸整合在李斯特菌染色體的 tRNAarg基因中或actA基因中。在一些方面，將編碼I^rfA*突變體多肽的重組多核苷酸穩(wěn)定 地引入到含有非功能性PrfA等位基因的李斯特菌屬細(xì)菌中。


圖1顯示了對單核細(xì)胞增生性李斯特菌prfA*疫苗株的表征。(A)利用pPL2位點 特異性整合載體構(gòu)建表達(dá)四個疫苗病毒T細(xì)胞表位(AMR、C4L、K3L和B8R)和以連接物序 列間隔并與ActA的前100個氨基酸(ActANlOO)融合的卵清蛋白SL8表位的單核細(xì)胞增生 性李斯特菌Quadvac株。(B)異源蛋白在酵母提取肉湯中的表達(dá)。(C)受感染J774巨噬細(xì) 胞中感染后7小時時異源Ag的表達(dá)。(D)受感染DC2. 4樹突細(xì)胞中感染后2. 5小時時異源 ^Vg的表達(dá)。(E)J774巨噬細(xì)胞中同基因型單核細(xì)胞增生性李斯特菌疫苗株的細(xì)胞內(nèi)生長。圖2顯示了由疫苗株誘導(dǎo)的改善的先天免疫和適應(yīng)性免疫。(A)單靜脈內(nèi)施 用 5 X IO6Cfu 的單核細(xì)胞增生性李斯特菌 Δ actA/ Δ inlB/WT prfA、PrfA*G155S、PrfA*G145S 和ft~fA*Y63C株后8小時確定的血清細(xì)胞因子/趨化因子水平。細(xì)胞因子/趨化因子通過 流式微球陣列(CBA)確定。各符號表示單個動物。數(shù)據(jù)為至少2次實驗中具有代表性的一 次實驗的數(shù)據(jù)。(B，C)活減毒疫苗株誘導(dǎo)更高量級的抗原特異性免疫。以5X106cfu的單核細(xì)胞增生性李斯特菌 Δ actA/ Δ inlB/WTprfA、PrfA*G155S、PrfA*G145S 和 PrfA*Y63C 株對C57BL/6小鼠進(jìn)行靜脈內(nèi)免疫?？乖禺愋訲細(xì)胞應(yīng)答通過接種后7天的應(yīng)答峰的細(xì) 胞內(nèi)細(xì)胞因子染色來確定。(B)顯示了各組代表性動物的點印跡。(C)顯示了各組5只動 物的平均值士標(biāo)準(zhǔn)差。圖3顯示增強(qiáng)的KBMA單核細(xì)胞增生性李斯特菌疫苗的免疫原性。(A)單靜脈 內(nèi)施用1 X IO8顆粒的KBMA單核細(xì)胞增生性李斯特菌Δ actA/ Δ inlB/WT prfA、PrfA*G155S、 PrfA*G145S和ft~fA*Y63C株后8小時確定的血清細(xì)胞因子/趨化因子水平。細(xì)胞因子/趨 化因子通過流式微球分析(CBA)確定。各符號表示單個動物。(B，C)KBMA單核細(xì)胞增生性 李斯特菌I^fA*株誘導(dǎo)更高量級的抗原特異性免疫。以1 X IO8顆粒的KBMA單核細(xì)胞增生 性李斯特菌 Δ actA/ Δ inlB/WT prfA、PrfA*G155S、PrfA*G145S 和 PrfA*Y63C 株對 C57BL/6 小鼠進(jìn)行靜脈內(nèi)免疫。通過接種后7天的應(yīng)答峰的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色確定抗原特異性T 細(xì)胞應(yīng)答。(B)顯示了各組代表性動物的點印跡。(C)顯示了各組5只動物的平均值士標(biāo) 準(zhǔn)差。圖4顯示了通過KBMA單核細(xì)胞增生性李斯特菌I^rfA*株引起的T細(xì)胞應(yīng)答的改善 的效能。(A，B)以HBSS (左圖)或1 X IO8顆粒的KBMA單核細(xì)胞增生性李斯特菌Δ actA/ Δ inlB/WT prfA,PrfA*G155S,PrfA*G145S 和 PrfA*Y63C 株對 C57BL/6 小鼠進(jìn)行靜脈內(nèi)或肌 肉內(nèi)(如圖指明)免疫兩次(相隔2周)。7天后，通過以gB2(對照；中間峰)、A24R負(fù)載 的靶(右峰)或B8R負(fù)載的靶(左鋒)侵襲小鼠而確定體內(nèi)細(xì)胞溶解活性。(A)顯示了各 組代表性動物的直方圖。(B)顯示了靜脈內(nèi)或肌肉內(nèi)接種的小鼠對A42R和B8R特異性的體 內(nèi)細(xì)胞溶解活性。各符號表示個體動物。(C)顯示了以各種劑量的KBMA單核細(xì)胞增生性李 斯特菌Δ actA/ Δ inlB/WT prfA或ft~fA*G155S相隔2周接種2次后對B8R特異性的體內(nèi) 細(xì)胞溶解活性。顯示了各具有5只動物的組的平均值士標(biāo)準(zhǔn)差。(D)顯示了對通過野生 型單核細(xì)胞增生性李斯特菌進(jìn)行的2XLD5(I侵襲的保護(hù)性免疫。以IXlO8顆粒的KBMA單 核細(xì)胞增生性李斯特菌Δ actA/ Δ inlB/WT prfA或ft~fA*G155S對Balb/c小鼠進(jìn)行靜脈內(nèi) 免疫一次。HBSS用作對照。侵襲后3天收集脾臟并鋪板用于CFU。通過學(xué)生T檢驗確定， WT prfA和prfA*G155S之間的log-保護(hù)具有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異。(E)以1 X 107pfu的疫 苗病毒進(jìn)行腹膜內(nèi)侵襲后卵巢內(nèi)的病毒滴度。以IX IO8顆粒的KBMA單核細(xì)胞增生性李斯 特菌Δ actA/ Δ inlB/WT prfA或prfA*G155S對C57BL/6小鼠進(jìn)行2次靜脈內(nèi)接種。疫苗 病毒侵襲后5天確定病毒滴度。各符號表示個體動物。通過學(xué)生T檢驗確定，WT 和 PrfA*G155S之間的log-保護(hù)具有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異。圖5顯示I^rfA*增強(qiáng)了編碼HPV E7的KBMA單核細(xì)胞增生性李斯特菌疫苗的免疫 原性。在最后接種后7天，在應(yīng)答峰處通過細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色確定HPV E7特異性T細(xì)胞 應(yīng)答。㈧以活李斯特菌進(jìn)行的單接種的數(shù)據(jù)。⑶以KBMA進(jìn)行的初免-加強(qiáng)接種的數(shù)據(jù)。圖6顯示I^rfA*增強(qiáng)了編碼HPV E7的KBMA單核細(xì)胞增生性李斯特菌疫苗的免疫 原性。在最后接種后7天，在應(yīng)答峰處通過細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色確定LLO特異性T細(xì)胞應(yīng) 答。(A)以活李斯特菌進(jìn)行的單接種的數(shù)據(jù)。(B)以KBMA進(jìn)行的初免-增強(qiáng)接種的數(shù)據(jù)。圖 7 顯示 PrfA、PrfA*G155S, PrfA*G145S 和 PrfA*Y63C 的氨基酸序列。
具體實施例方式I 導(dǎo)言本發(fā)明部分基于以下發(fā)現(xiàn)當(dāng)抗原在李斯特菌的毒力基因的組成型突變體激活劑 的控制下表達(dá)時，可增強(qiáng)對該抗原的免疫應(yīng)答。單核細(xì)胞增生性李斯特菌的二元生活方式 被比作“化身博士”(Dr. Jekyll and Mr. Hyde)。作為腐生生物，李斯特菌在環(huán)境中以無害的 生命形式存活。然而，在感染哺乳動物宿主時，李斯特菌通過表達(dá)多種可使李斯特菌在哺乳 動物生理條件下生長和繁衍的毒力基因而變得有害。在從無害的腐生生物生活方式到有害 的毒力生活方式的轉(zhuǎn)變中，PrfA蛋白發(fā)揮了關(guān)鍵作用。I^rfA響應(yīng)于包括溫度、pH、鐵濃度、 糖濃度和活性氧簇在內(nèi)的多種刺激而激活。通過I^rfA依賴基因的組成型表達(dá)，已經(jīng)部分鑒 定了 I^rfA的突變體。所述組成型I^rfA突變體被稱為突變體。在一些情況下，已表 明組成型PrfA*突變體多肽表現(xiàn)出李斯特菌的超毒力表型，例如G155S PrfA*突變體。本發(fā)明提供了用于刺激針對抗原的免疫應(yīng)答的重組李斯特菌屬細(xì)菌。在本發(fā)明的 一些方面，所述重組李斯特菌屬細(xì)菌包含PrfA等位基因突變從而I^rfA蛋白組成型表達(dá)。重 組李斯特菌還包含多肽；例如在I^rfA應(yīng)答調(diào)控元件控制下的抗原。在一些情況下，所述多 肽可以是融合蛋白，其中信號序列與該多肽連接。PrfA應(yīng)答調(diào)控元件的實例包括，但不限于 act A啟動子、hly啟動子、plcA啟動子、inlA啟動子、inlB啟動子和prfA啟動子。在本發(fā)明的一些方面，異源多肽是腫瘤抗原；在本發(fā)明的一些方面，多肽是與傳染 病相關(guān)的抗原。在本發(fā)明的一些方面，異源多肽是非李斯特菌的多肽；在本發(fā)明的一些方 面，異源多肽是非細(xì)菌多肽。在本發(fā)明的一些方面，所述李斯特菌是單核細(xì)胞增生性李斯特菌。在一些情況下， 李斯特菌被減毒以用于細(xì)胞至細(xì)胞的傳播和/或進(jìn)入非吞噬細(xì)胞。在一些情況下，李斯特 菌包含actA和/或inlB的失活突變。在一些情況下，李斯特菌是actA inlB雙缺失突變 體。在一些情況下，李斯特菌包含至少一個核酸修復(fù)基因如uVrA、uVrB、uVrC或重組修復(fù)基 因的失活突變。例如，所述李斯特菌可以是uvrAB缺失突變體。在一些情況下，所述細(xì)菌還 包含核酸交聯(lián)劑(例如補骨脂素)。在本發(fā)明的一些方面，李斯特菌被滅活，但具有代謝活 性(KBMA)。還提供了包含上述方面的李斯特菌的藥物組合物、免疫原性組合物和/或疫苗。 在一些方面，所述藥物組合物還包含藥學(xué)上可接受的載體。在本發(fā)明的一些方面，所述李斯 特菌還包含佐劑。在本發(fā)明的一些方面，本發(fā)明的李斯特菌與治療劑聯(lián)合使用。在一些情況下，將李 斯特菌與治療劑一起施用；在一些情況下，將李斯特菌在治療劑之前施用。在一些情況下， 李斯特菌在治療劑之后施用。本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的重組李斯特菌的方法。在一些情況下，本發(fā)明提供了 誘導(dǎo)針對抗原的免疫應(yīng)答的方法。在一些情況下，本發(fā)明提供了增強(qiáng)抗原的免疫原性的方 法。在一些情況下，與在野生型I^rfA多肽控制下在李斯特菌中表達(dá)的抗原的免疫原性相 比，抗原的免疫原性得到增強(qiáng)。增強(qiáng)的免疫原性可以通過本領(lǐng)域中已知的方法測定。在一 些方面，可以通過測定已知由免疫應(yīng)答誘導(dǎo)的細(xì)胞因子、趨化因子和多肽提高的表達(dá)，從而 測定增強(qiáng)的免疫原性。例如，MCP-I、IL-6、IFN-Y、TNF α和/或IL-12 ρ70。在本發(fā)明的 一些方面，所述已知由免疫應(yīng)答誘導(dǎo)的細(xì)胞因子、趨化因子和多肽提高的表達(dá)可以是，與由
權(quán)利要求
1.一種重組李斯特菌屬細(xì)菌，所述重組李斯特菌屬細(xì)菌包含(a)編碼I^fA*突變體多肽的多核苷酸；和(b)重組多核苷酸，所述重組多核苷酸包含(i) PrfA應(yīng)答調(diào)控元件；和( )編碼異源多肽的多核苷酸，其中所述編碼異源多肽的多核苷酸可操縱地連接于所 述prfA應(yīng)答調(diào)控元件，并且其中所述異源多肽是非細(xì)菌的多肽或者是異源傳染病病原體 的抗原。
2.如權(quán)利要求1所述的重組李斯特菌屬細(xì)菌，其中所述I^rfA*突變體多肽包含選自 Y63C、E77K、L149F、G145S、G155S 和 S183A 的突變。
3.如權(quán)利要求2所述的重組李斯特菌屬細(xì)菌，其中所述I^rfA*突變體多肽包含G155S突變。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項所述的重組李斯特菌屬細(xì)菌，其中所述重組多核苷酸編碼 融合蛋白，該融合蛋白包含信號肽和所述異源多肽。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的重組李斯特菌屬細(xì)菌，其中所述prfA應(yīng)答調(diào)控元 件選自hly啟動子、plcA啟動子、plcB啟動子、mpl啟動子、hpt啟動子、inlC啟動子、inlA 啟動子、inlB啟動子、prfA啟動子和actA啟動子。
6.如權(quán)利要求5所述的重組李斯特菌屬細(xì)菌，其中所述prfA應(yīng)答調(diào)控元件是actA啟 動子。
7.如權(quán)利要求4所述的重組李斯特菌屬細(xì)菌，其中所述信號肽是選自單核細(xì)胞增生 性李斯特菌的ActA信號肽、單核細(xì)胞增生性李斯特菌的LLO信號肽、乳酸乳球菌的Usp45 信號肽、炭疽桿菌的保護(hù)抗原信號肽、單核細(xì)胞增生性李斯特菌的P60信號肽、枯草桿菌的 PhoD信號肽、secA2信號肽和Tat信號肽的信號肽。
8.如權(quán)利要求7所述的重組李斯特菌屬細(xì)菌，其中所述信號肽是單核細(xì)胞增生性李斯 特菌的ActA信號肽。
9.如權(quán)利要求4所述的重組李斯特菌屬細(xì)菌，其中所述融合蛋白包含ActA的前100個氨基酸。
10.如權(quán)利要求1-9中任一項所述的重組李斯特菌屬細(xì)菌，其中所述異源多肽包含選 自腫瘤相關(guān)抗原、腫瘤相關(guān)抗原衍生的多肽、傳染病抗原和傳染病抗原衍生的多肽的抗原。
11.如權(quán)利要求10所述的重組李斯特菌，其中所述異源多肽是選自K-Ras、H-Ras, N-Ras、12-K-I as、間皮素、PSCA、NY-ESO-U WT-1、存活素、gplOO、PAP、蛋白酶 3、SPAS-U B-raf、酪氨酸激酶、mdm-2、MAGE、RAGE、MART-1、bcr/abl、Her-2/neu、α 甲胎蛋白、乳腺珠 蛋白、hTERT (端粒酶)、PSA和CEA的抗原，或包含選自K_I as、H-I as、N-I as、12-K_I as、間皮 素、卩50々、附450-1、111-1、存活素4 100、？4 、蛋白酶3、5 45-1、8-位廠酪氨酸激酶、111(1111-2、 MAGE、RAGE、MART-1、bcr/abl、Her-2/neu、α 甲胎蛋白、乳腺珠蛋白、hTERT (端粒酶)、PSA 和CEA的抗原所衍生的多肽。
12.如權(quán)利要求10所述的重組李斯特菌屬細(xì)菌，其中所述傳染病抗原來自病毒或異源 傳染病病原體，該病毒或異源傳染病病原體選自肝炎病毒、流感病毒、人類免疫缺陷病毒、 乳頭瘤病毒、單純皰疹病毒1、單純皰疹病毒2、巨細(xì)胞病毒、結(jié)核分枝桿菌、惡性瘧原蟲或 沙眼衣原體。
13.如權(quán)利要求12所述的重組李斯特菌屬細(xì)菌，其中所述傳染病抗原來自甲肝病毒、 乙肝病毒或丙肝病毒。
14.如權(quán)利要求1-13中任一項所述的重組李斯特菌屬細(xì)菌，其中所述李斯特菌屬細(xì)菌 屬于單核細(xì)胞增生性李斯特菌種。
15.如權(quán)利要求1-14中任一項所述的重組李斯特菌屬細(xì)菌，所述重組李斯特菌屬細(xì)菌 在細(xì)胞至細(xì)胞的傳播、進(jìn)入非吞噬細(xì)胞、增殖或DNA修復(fù)的一個方面或多個方面減弱。
16.如權(quán)利要求15所述的重組李斯特菌屬細(xì)菌，其中所述李斯特菌通過以下方式中的 一種或多種方式被減毒a.actA 突變；b.inlB 突變；c.uvrA 突變；d.uvrB 突變；e.uvrC 突變；f.核酸靶向的化合物；或g.uvrAB突變和靶向核酸的化合物。
17.如權(quán)利要求16所述的重組李斯特菌屬細(xì)菌，其中所述靶向核酸的化合物是補骨脂ο
18.如權(quán)利要求1-14中任一項所述的重組李斯特菌屬細(xì)菌，其中所述細(xì)菌的核酸通過 與和該核酸直接反應(yīng)的靶向核酸的化合物反應(yīng)而得到修飾，從而減弱所述細(xì)菌的增殖。
19.如權(quán)利要求1-14中任一項所述的重組李斯特菌屬細(xì)菌，其中所述細(xì)菌包含減弱經(jīng) 修飾細(xì)菌增殖的核酸交聯(lián)物。
20.如權(quán)利要求1-14中任一項所述的重組李斯特菌屬細(xì)菌，其中所述細(xì)菌包含減弱所 述細(xì)菌增殖的補骨脂素-核酸加合物。
21.如權(quán)利要求18-20中任一項所述重組李斯特菌屬細(xì)菌，其中所述細(xì)菌還包含減弱 所述細(xì)菌修復(fù)其經(jīng)修飾核酸能力的基因突變。
22.如權(quán)利要求21所述的重組李斯特菌屬細(xì)菌，其中所述細(xì)菌包含actA、inlB、uvrA 和uvrB中的失活突變；并且其中已通過補骨脂素-核酸交聯(lián)物減弱所述細(xì)菌的增殖。
23.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含權(quán)利要求1-22中任一項所述的重組李斯特 菌屬細(xì)菌以及藥學(xué)上可接受的賦形劑、佐劑和共刺激分子中一種或多種。
24.如權(quán)利要求23中所述的藥物組合物，其中所述組合物還包含治療劑。
25.一種在宿主中誘導(dǎo)針對非李斯特菌抗原的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括對所述 宿主施用有效量的組合物，所述組合物含有重組李斯特菌屬細(xì)菌，所述重組李斯特菌屬細(xì)菌包含(a)編碼I^fA*突變體多肽的多核苷酸；和(b)重組多核苷酸，所述重組多核苷酸包含(i) PrfA應(yīng)答調(diào)控元件；和( )編碼異源多肽的多核苷酸，其中所述編碼異源多肽的多核苷酸可操縱地連接于所述PrfA應(yīng)答調(diào)控元件，并且其中所述異源多肽包含所述抗原。
26.一種在宿主中增強(qiáng)非李斯特菌抗原的免疫原性的方法，所述方法包括對所述宿主 施用有效量的組合物，所述組合物含有重組李斯特菌屬細(xì)菌，所述重組李斯特菌屬細(xì)菌包含(a)編碼I^fA*突變體多肽的多核苷酸；和(b)重組多核苷酸，所述重組多核苷酸包含(i) PrfA應(yīng)答調(diào)控元件；和( )編碼異源多肽的多核苷酸，其中所述編碼異源多肽的多核苷酸可操縱地連接于所述PrfA應(yīng)答調(diào)控元件，其中所述異源多肽包含所述抗原。
27.一種預(yù)防或治療宿主中非李斯特菌的傳染病癥或癌性病癥的方法，所述方法包括 對所述宿主施用有效量的組合物，所述組合物含有重組李斯特菌屬細(xì)菌，所述重組李斯特 菌屬細(xì)菌包含(a)編碼I^fA*突變體多肽的多核苷酸；和(b)重組多核苷酸，所述重組多核苷酸包含(i) PrfA應(yīng)答調(diào)控元件；和( )編碼異源多肽的多核苷酸，其中所述編碼異源多肽的多核苷酸可操縱地連接于所 述PrfA應(yīng)答調(diào)控元件。
28.如權(quán)利要求25-27中任一項所述的方法，其中所述I^rfA*突變體多肽包含選自 Y63C、E77K、L149F、G145S、G155S 和 S183A 的突變。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其中所述I^rfA*突變體多肽包含G155S突變。
30.如權(quán)利要求25-27中任一項所述的方法，其中所述重組多核苷酸編碼融合蛋白，該 融合蛋白包含信號肽和所述異源多肽。
31.如權(quán)利要求25-27中任一項所述的方法，其中所述prfA應(yīng)答調(diào)控元件選自hly啟 動子、PlcA啟動子、plcB啟動子、mpl啟動子、hpt啟動子、inlC啟動子、inlA啟動子、inlB 啟動子、PrfA啟動子和actA啟動子。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述prfA應(yīng)答調(diào)控元件是actA啟動子。
33.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述信號肽是選自單核細(xì)胞增生性李斯特菌的 ActA信號肽、單核細(xì)胞增生性李斯特菌的LLO信號肽、乳酸乳球菌的Usp45信號肽、炭疽桿 菌的保護(hù)抗原信號肽、單核細(xì)胞增生性李斯特菌的P60信號肽、枯草桿菌的W10D信號肽、 secA2信號肽和Tat信號肽的信號肽。
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述信號肽是單核細(xì)胞增生性李斯特菌的ActA信 號肽。
35.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述融合蛋白包含ActA的前100個氨基酸。
36.如權(quán)利要求25-27中任一項所述的方法，其中所述異源多肽是非細(xì)菌的。
37.如權(quán)利要求25-27中任一項所述的方法，其中所述異源多肽包含選自腫瘤相關(guān)抗 原、腫瘤相關(guān)抗原衍生的多肽、傳染病抗原和傳染病抗原衍生的多肽的抗原。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，其中所述異源多肽是選自K-Ras、H-Ras、N-Ras、 12-K-I as、間皮素、PSCA、NY-ESO-U WT-1、存活素、gplOO、PAP、蛋白酶 3、SPAS-U B-raf, 酪氨酸激酶、mdm-2、MAGE、RAGE、MART-I、bcr/abl、Her-2/neu、α 甲胎蛋白、乳腺珠蛋白、hTERT (端粒酶)、PSA和CEA的抗原，或者包含選自K_I as、H-I as、N-I as、12-K_I as、間皮素、 PSCA, NY-ESO-U WT-1、存活素、gplOO、PAP、蛋白酶 3、SPAS-U B_raf、酪氨酸激酶、mdm_2、 MAGE、RAGE、MART-I、bcr/abl、Her-2/neu、α 甲胎蛋白、乳腺珠蛋白、hTERT (端粒酶)、PSA 和CEA的抗原衍生的多肽。
39.如權(quán)利要求37所述的方法，其中所述傳染病抗原來自病毒或異源傳染病病原體， 該病毒或異源傳染病病原體選自肝炎病毒、流感病毒、人類免疫缺陷病毒、乳頭瘤病毒、單 純皰疹病毒1、單純皰疹病毒2、巨細(xì)胞病毒、結(jié)核分枝桿菌、惡性瘧原蟲或沙眼衣原體。
40.如權(quán)利要求39所述的方法，其中所述傳染病抗原來自甲肝病毒、乙肝病毒或丙肝 病毒。
41.如權(quán)利要求25-27中任一項所述的方法，其中所述李斯特菌屬細(xì)菌屬于單核細(xì)胞 增生性李斯特菌種。
42.如權(quán)利要求25-27中任一項所述的方法，其中所述李斯特菌在細(xì)胞至細(xì)胞的傳播、 進(jìn)入非吞噬細(xì)胞、增殖或DNA修復(fù)的一個方面或多個方面減弱。
43.如權(quán)利要求42所述的方法，其中所述李斯特菌通過以下方式中的一種或多種方式 被減毒a.actA 突變；b.inlB 突變；c.uvrA 突變；d.uvrB 突變；e.uvrC 突變；f.核酸靶向的化合物；或g.uvrAB突變和靶向核酸的化合物。
44.如權(quán)利要求43所述的方法，其中所述靶向核酸的化合物是補骨脂素。
45.如權(quán)利要求25-27中任一項所述的方法，其中所述細(xì)菌的核酸通過與該核酸直接 反應(yīng)的靶向核酸的化合物反應(yīng)而得到修飾，從而減弱所述細(xì)菌的增殖。
46.如權(quán)利要求25-27中任一項所述的方法，其中所述細(xì)菌包含減弱經(jīng)修飾細(xì)菌增殖 的核酸交聯(lián)物。
47.如權(quán)利要求25-27中任一項所述的方法，其中所述細(xì)菌包含減弱所述細(xì)菌增殖的 補骨脂素-核酸加合物。
48.如權(quán)利要求45-47中任一項所述的方法，其中所述細(xì)菌還包含減弱所述細(xì)菌修復(fù) 其經(jīng)修飾核酸能力的基因突變。
49.如權(quán)利要求25-27中任一項所述的方法，其中所述細(xì)菌包含actA、inlB、uvrA和 uvrB的失活突變；并且其中已通過補骨脂素-核酸交聯(lián)物減弱所述細(xì)菌的增殖。
50.如權(quán)利要求25或沈所述的方法，其中所述免疫應(yīng)答包括先天免疫應(yīng)答。
51.如權(quán)利要求25或沈所述的方法，其中所述免疫應(yīng)答包括適應(yīng)性免疫應(yīng)答。
52.如權(quán)利要求25-27中任一項所述的方法，其中所述重組李斯特菌屬細(xì)菌與佐劑和/ 或共刺激分子一起施用。
53.如權(quán)利要求25-27中任一項所述的方法，其中所述重組李斯特菌屬細(xì)菌與治療劑 聯(lián)合施用。
54.如權(quán)利要求25-27中任一項所述的方法，其中所述重組李斯特菌屬細(xì)菌的施用反 復(fù)進(jìn)行。
55.如權(quán)利要求25-27中任一項所述的方法，其中在所述李斯特菌屬細(xì)菌的第一次施 用之后約2周后，重復(fù)所述重組李斯特菌屬細(xì)菌的第二次施用。
56.如權(quán)利要求25-27中任一項所述的方法，其中在所述重組李斯特菌屬細(xì)菌施用后， 施用疫苗，該疫苗不含有活的、具有代謝活性的李斯特菌并且編碼所述非李斯特菌抗原。
57.一種增強(qiáng)哺乳動物中針對非李斯特菌抗原的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括對所 述哺乳動物施用有效加強(qiáng)劑量的編碼所述非李斯特菌抗原的權(quán)利要求1-22中任一項所述 的重組李斯特菌，其中所述哺乳動物此前已被施用有效初免劑量的提供所述非李斯特菌抗 原的疫苗，其中(a)所述疫苗不含有活的、具有代謝活性并且編碼所述非李斯特菌抗原的李斯特菌；和(b)所述疫苗含有編碼所述非李斯特菌抗原的裸露DNA。
58.如權(quán)利要求沈所述的方法，其中針對所述抗原的免疫原性相對于下述抗原的免疫 原性得到增強(qiáng)該抗原由含有所述編碼異源多肽的多核苷酸的重組李斯特菌屬細(xì)菌誘導(dǎo)， 其中所述編碼異源多肽的多核苷酸的表達(dá)受到野生型I^rfA多肽的控制。
59.如權(quán)利要求沈所述的方法，其中增強(qiáng)的免疫原性包括MCP-I、IL-6、IFN-Y ,TNFa 或IL-12p70的一種或任意組合的表達(dá)增加。
60.如權(quán)利要求25-27中任一項所述的方法，其中所述宿主是人。
61.一種制備重組李斯特菌屬細(xì)菌的方法，所述方法包括在李斯特菌屬細(xì)菌中穩(wěn)定地 引入編碼異源多肽的重組多核苷酸，其中所述李斯特菌屬細(xì)菌包含編碼I^fA*突變體多肽的多核苷酸；和，其中所述異源多肽是非細(xì)菌的；和，其中在引入到所述李斯特菌屬細(xì)菌中之后，所述編碼異源多肽的重組多核苷酸可操縱 地連接于I^fA應(yīng)答調(diào)控元件。
62.如權(quán)利要求61所述的方法，其中所述重組多核苷酸包含與所述異源多肽可操縱地 連接的所述I^rfA-應(yīng)答調(diào)控元件。
63.如權(quán)利要求61所述的方法，其中所述重組多核苷酸編碼融合蛋白，該融合蛋白包 含信號多肽和所述異源多肽。
64.如權(quán)利要求61所述的方法，其中所述編碼異源多肽的重組多核苷酸整合在所述李 斯特菌染色體中。
65.如權(quán)利要求64所述的方法，其中所述編碼異源多肽的重組多核苷酸整合在所述李 斯特菌染色體的因中。
66.如權(quán)利要求63所述的方法，其中所述信號多肽是ActA信號多肽，并且其中，所述編 碼異源多肽的重組多核苷酸被引入所述李斯特菌的actA基因中。
67.一種制備重組李斯特菌屬細(xì)菌的方法，其中將(a)編碼突變體多肽的重組多核苷酸，和(b)編碼異源多肽的重組多核苷酸，穩(wěn)定地引入李斯特菌屬細(xì)菌中，其中所述李斯特菌屬細(xì)菌包含非功能性PrfA等位基因，并且其中在引入所述編碼異源多肽的重組多核苷酸之后所述核酸可操縱地連接于I^rfA 應(yīng)答調(diào)控元件。
68.如權(quán)利要求67所述的方法，其中所述編碼異源多肽的重組多核苷酸可操縱地連接 于ft^A-應(yīng)答調(diào)控元件。
69.如權(quán)利要求67所述的方法，其中所述重組多核苷酸編碼融合蛋白，該融合蛋白包 含信號多肽和所述異源多肽。
70.如權(quán)利要求67所述的方法，其中所述編碼I^rfA*突變體多肽的重組多核苷酸整合 在所述李斯特菌染色體中。
71.如權(quán)利要求67所述的方法，其中所述編碼異源多肽的重組多核苷酸整合在所述李 斯特菌染色體中。
72.如權(quán)利要求70所述的方法，其中可操縱地連接于I^rfA-應(yīng)答調(diào)控元件的所述編碼 異源多肽的重組多核苷酸整合在所述李斯特菌染色體的tRNA"g基因中。
73.如權(quán)利要求69所述的方法，其中所述信號多肽是ActA信號多肽，并且其中將編碼 異源多肽的所述核酸引入到所述李斯特菌的actA基因中。
全文摘要
本發(fā)明提供了重組李斯特菌，所述重組李斯特菌組成型表達(dá)PrfA并且包含編碼例如腫瘤或傳染劑抗原的多肽的多核苷酸，所述多核苷酸可操縱地連接于PrfA應(yīng)答調(diào)節(jié)劑。本發(fā)明提供了用于誘導(dǎo)或加強(qiáng)免疫應(yīng)答和/或疾病治療的利用李斯特菌的方法和其組合物。本發(fā)明還提供了所述細(xì)菌的制備方法。
文檔編號A61K39/12GK102076843SQ200980123864
公開日2011年5月25日 申請日期2009年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月19日
發(fā)明者D·G·布洛克斯泰德, J·斯庫伯, P·M·勞爾, T·W·小杜本斯蓋, W·S·小盧科特, W·漢森 申請人:艾杜羅生物科技公司