專利名稱：新型核酸轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的制作方法
新型核酸轉(zhuǎn)移系統(tǒng)本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，和特別地旨在提出新型的在基因療法中有用的載體 以用于核酸的載體化?；虔煼ㄖ饕谑褂糜糜谥委熌康牡暮怂幔瑥亩兄讷@得“DNA-藥物”。起初 局限于遺傳性遺傳病的情形(其中將病因性基因的功能性拷貝引入到受遺傳性缺陷侵害 的體細(xì)胞中)，而如今基因轉(zhuǎn)移已擴(kuò)展至治療獲得性疾病例如癌癥。最近，基因療法已擴(kuò)展至轉(zhuǎn)移短的核酸序列，其目的是要么修飾基因的表達(dá)(例 如，外顯子跳躍)，要么通過遺傳重組來修復(fù)病因性基因異常(例如，短的DNA序列，DNA/RNA 嵌合體)，要么抑制基因的表達(dá)(例如，siRNA或“小干擾RNA”，反義寡核苷酸)。本發(fā)明的發(fā)明者更特別地對該最后一種類型的治療策略感興趣。RNA干擾是在進(jìn)化過程中高度保守的現(xiàn)象。它基于這樣的機(jī)制，所述機(jī)制使用通常 包含21至25個(gè)核苷酸的、通常雙鏈的小RNA (稱為siRNA)，其一旦被轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，就通過 與mRNA (信使RNA)的序列互補(bǔ)性來阻斷mRNA的翻譯。這些siRNA可以就這樣轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，或者可以源自尺寸更大的RNA分子的降解。在后一種情況下，在細(xì)胞中存在的雙鏈RNA首先由稱為切酶(Dicer)( “切割器 (eminceuse) ”)的III型核糖核酸酶進(jìn)行加工。所述切酶將雙鏈RNA均切割成21至25個(gè) 堿基對，從而形成siRNA。然后，切酶將siRNA轉(zhuǎn)移至多蛋白復(fù)合體，RISC復(fù)合體(RNA誘導(dǎo) 的沉默復(fù)合體)。siRNA的一條鏈(稱為“過客鏈(passenger)”)被清除，而另一條鏈(稱 為“引導(dǎo)鏈(guide)”)則將RISC復(fù)合體導(dǎo)向具有與引導(dǎo)鏈互補(bǔ)的序列的mRNA。如果siRNA 和靶mRNA之間的互補(bǔ)性是完全的，那么RISC復(fù)體就切割靶mRNA，后者被降解并因而不再翻 譯成蛋白質(zhì)。因此，就這樣轉(zhuǎn)染的或者源自更長RNA的切割的siRNA導(dǎo)致靶基因表達(dá)的沉默。 幾個(gè)非互補(bǔ)的堿基就足以阻止切割。因此，該機(jī)制非常特異于siRNA和其靶標(biāo)(mRNA)的序 列。然而，在許多病理學(xué)狀態(tài)中，許多基因過表達(dá)或者在錯(cuò)誤的地點(diǎn)或在錯(cuò)誤的時(shí)刻 表達(dá)。能夠抑制這些病理性表達(dá)的可能性是對于治療這許多疾病來說的重要希望，在這許 多疾病中最重要的是癌癥，但也有病毒或自身免疫原因的疾病。siRNA的使用代表了用于研究某些基因的功能的令人感興趣的工具。這是因?yàn)?，?過阻斷靶基因的表達(dá)，可以經(jīng)由缺陷來確定其功能。然而，該治療策略的體內(nèi)運(yùn)用還提出了許多困難，尤其是在實(shí)施方面。這是因?yàn)椋?在基因療法的情形下核酸的轉(zhuǎn)染主要遇到三個(gè)障礙。首先，為了有效，核酸必須應(yīng)當(dāng)?shù)竭_(dá)特異地瞄準(zhǔn)的靶細(xì)胞，并穿過細(xì)胞膜，而不被 生物體降解。其次，核酸的轉(zhuǎn)染此外還應(yīng)當(dāng)是在毒性方面可接受的。最后，核酸分子具有低 的體內(nèi)穩(wěn)定性。為了克服這些困難，已經(jīng)提出了幾項(xiàng)載體化技術(shù)以用于將核酸分子轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中。第一項(xiàng)技術(shù)使用腺病毒(AAV，“腺伴隨病毒”)，其為重組病毒。另一種轉(zhuǎn)染方式，電轉(zhuǎn)移，在于在給細(xì)胞注射核酸分子后，在所考慮的細(xì)胞的水平上施加電場。事實(shí)上，盡管 這頭兩種方法使得能夠獲得令人滿意的基因轉(zhuǎn)移水平，但是另一方面，它們在毒性方面具 有缺點(diǎn)。恰好使得能夠擺脫該缺點(diǎn)的另一項(xiàng)技術(shù)是利用合成載體。通常用于核酸轉(zhuǎn)染的 合成載體的實(shí)例為例如脂復(fù)合物(Iipoplexes)，其是核酸與陽離子脂質(zhì)的復(fù)合物，任選地 與中性脂質(zhì)相聯(lián)合。基本上，這些帶正電荷的載體通過非特異的靜電相互作用而內(nèi)在化 到細(xì)胞中。作為實(shí)例，已就其在核酸遞送系統(tǒng)中的用途，對殼聚糖(一種包含非乙?；?β-D-葡糖胺殘基的帶正電荷的多糖)進(jìn)行了廣泛研究。因此，從!LdeMartimprey等人， Nucleic Acids Res. 2008 ；36(1)中獲知了這樣的siRNA遞送系統(tǒng)，其中將siRNA吸附在“核 心/冠”類型的納米顆粒的表面上，所述核心包含聚(氰基丙烯酸異丁酯)并且所述冠包含 殼聚糖。然而，利用脂質(zhì)陽離子的遞送系統(tǒng)的運(yùn)用通常需要在體內(nèi)使用之前進(jìn)行大量的調(diào) 整，以期望最佳的轉(zhuǎn)染效率。此外，核酸/合成載體復(fù)合物的形成并不總是立即的，并且在合成方面可以是限 制性的。此外，與病毒載體相比，合成載體對于在靜脈內(nèi)注射后靶向組織來說具有較低的體 內(nèi)效率。最后，由于其陽離子性質(zhì)，所有這些系統(tǒng)具有與帶負(fù)電荷的細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)強(qiáng)烈相互 作用的天然傾向，這可以引起聚集現(xiàn)象和毒性反應(yīng)。本發(fā)明的目標(biāo)恰好在于，提出新的用于核酸轉(zhuǎn)染的具有非陽離子性質(zhì)的合成載體 化方式，其使得能夠應(yīng)對前述的缺點(diǎn)。特別地，本發(fā)明由發(fā)明人的出人意料的發(fā)現(xiàn)而產(chǎn)生，即包含10至40個(gè)核苷酸的核 酸分子與角鯊烯類基團(tuán)類型的至少Cw的烴化合物或其類似物的偶聯(lián)導(dǎo)致形成納米顆粒， 從而構(gòu)成在載體化和轉(zhuǎn)染方面有效的遞送系統(tǒng)，其還在毒性方面是可接受的。WO 2006/090029已經(jīng)描述了，當(dāng)其被共價(jià)偶聯(lián)至吉西他濱(一種親水的且極性的 分子)時(shí)，角鯊烯在水性介質(zhì)中自發(fā)形成具有百來個(gè)納米的納米顆粒的能力。尤其，通過如 此合成的衍生物的兩親性行為(角鯊烯部分代表了疏水部分，而吉西他濱部分代表了親水 部分)來解釋在此之中的該能力。與所有預(yù)期相反，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，角鯊烯及其類似物形成納米顆粒的該能力，在 當(dāng)其與小尺寸的核酸分子(例如siRNA或反義寡核苷酸)(然而其具有依然比在WO 2006/090029中所考慮的核苷類似物的分子量高很多的分子量)共價(jià)聯(lián)合時(shí)也可以表現(xiàn)出 來。出人意料地，此外還證實(shí)，如此形成的納米顆粒具有足夠小的尺寸(幾十至幾百納米)， 以與通過全身途徑在基因療法中應(yīng)用相容。因此，根據(jù)第一個(gè)方面，本發(fā)明涉及復(fù)合物，其由與至少一個(gè)具有角鯊烯結(jié)構(gòu)的至 少C18的烴化合物或其類似物共價(jià)偶聯(lián)的至少一個(gè)包含10至40個(gè)核苷酸的核酸分子形成。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，所述包含10至40個(gè)核苷酸的核酸分子為反 義寡核苷酸，或者十分特別優(yōu)選地為RNA分子，特別是siRNA分子。因此，本發(fā)明的目標(biāo)旨在根據(jù)本發(fā)明的復(fù)合物，其中所述核酸分子為RNA分子，特 別是siRNA分子。其他核酸分子也能夠通過根據(jù)本發(fā)明的載體化系統(tǒng)來進(jìn)行運(yùn)送，例如適配體。在這方面，十分特別地可以使用對于治療癌癥有用的序列，例如RET/PTC1 siRNA和RET/PTC 3siRNA(甲狀腺乳頭狀癌)、EWS_fIilsiRNA(尤文肉瘤)、抗-ICAM反義寡 核苷酸和抗-ICAM siRNA(Kretschmer-Kazemi Far, R.等人，Nucl. Acids Res. 200331 4417-4424)、抗-RhoA 和抗-Rho C siRNA(Pille 等人，(2005) · Anti-RhoA and anti-RhoCsiRNAs inhibit the proliferation and invasiveness of MDA-MB-23lbreast cancer celles in vitro and in vivo. Mol Ther 11, 267-574)、抗 _K_ras siRNA (Martin SE 等人，Multiplexing siRNAs to compressRNAi-based screen size in human cells. Nucleic Acids Res. 2007 ；35 (8))以及抑制生長因子例如VEGF-A和VEGF-C (Α或B型血管 內(nèi)皮生長因子)表達(dá)的siRNA (Filleur等人，Cancer Res，2003)。特別地，RET/PTCls iRNA是具有與嵌合癌基因RET/PTC1 (甲狀腺乳頭狀癌 (Papillary Thyroid Carcinoma))互補(bǔ)的序列的siRNA，其由于染色體重排而產(chǎn)生，和特別 地由于原癌基因RET(具有酪氨酸激酶活性的膜受體)的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域與另一個(gè)基因 的5’末端融合(在H4的情況下)而產(chǎn)生。尤其在患有甲狀腺乳頭狀癌的受試者中檢測到 該嵌合癌基因。已篩選、選擇和克隆了幾種RET/PTCls iRNA (H. De Martimprey等人，2007，參見下 面)°根據(jù)本發(fā)明更特別地考慮RET/PTC1 siRNA的序列。因此，本發(fā)明的目標(biāo)旨在根據(jù)本發(fā)明的復(fù)合物，其中所述核酸分子為RET/PTCls iRNA，其具有下述序列5' -C⑶UACCAUCGAGGAUCCAdAdA-3‘ (SEQ ID NO :1)。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)，形成根據(jù)本發(fā)明的復(fù)合物的兩個(gè)實(shí)體通過酯、醚、硫 醚、二硫鍵化合物、磷酸酯或酰胺類型(優(yōu)選地，二硫鍵化合物類型)的共價(jià)鍵相偶聯(lián)。根據(jù)一個(gè)特別的實(shí)施方案，復(fù)合物由與至少兩個(gè)具有角鯊烯結(jié)構(gòu)的至少Cw的烴 化合物或其類似物共價(jià)偶聯(lián)的至少一個(gè)包含10至40個(gè)核苷酸的核酸分子形成。本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)旨在根據(jù)本發(fā)明的復(fù)合物的納米顆粒，如前面所描述的。根據(jù)另一個(gè)目標(biāo)，本發(fā)明旨在制備根據(jù)本發(fā)明的納米顆粒的方法，其特征在于，所 述方法至少包括-將根據(jù)本發(fā)明的復(fù)合物分散在至少一種有機(jī)溶劑例如醇(例如乙醇)中，其濃度 足以當(dāng)在攪拌下且通常逐滴地向水相中添加所得的混合物時(shí)，獲得以在所述水相中的懸浮 液形式的所述復(fù)合物的納米顆粒的瞬時(shí)形成，和-需要時(shí)，分離所述納米顆粒。特別優(yōu)選地，在根據(jù)本發(fā)明的復(fù)合物中和在從該復(fù)合物開始形成的納米顆粒中所 使用的 siRNA 為 RET/PTC1 siRNA (SEQ ID NO :1)。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)，本發(fā)明旨在根據(jù)本發(fā)明的復(fù)合物和/或相應(yīng)的納米顆 粒，其用于在治療和/或預(yù)防癌癥，尤其是內(nèi)分泌性癌癥，和更特別地甲狀腺乳頭狀癌中使 用，或者用于在治療和/或預(yù)防病毒性病理學(xué)狀態(tài)中使用。本發(fā)明還旨在藥物組合物，其包含至少一種根據(jù)本發(fā)明的復(fù)合物和/或納米顆 粒，以及與之相聯(lián)合的至少一種藥學(xué)上可接受的載體。·具有角鯊烯結(jié)構(gòu)的烴化合物在本發(fā)明的范圍內(nèi)，“具有角鯊烯結(jié)構(gòu)的化合物”是包含至少一個(gè)角鯊烯類基團(tuán) (尤其如下文所定義)的化合物。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，當(dāng)將其與水性介質(zhì)放在一起時(shí)，“角鯊烯類基團(tuán)(radical squalenoyle)，，能夠重現(xiàn)由角鯊烯和/或其衍生物所表現(xiàn)出的自組織特性。特別地，根據(jù)本發(fā)明的“角鯊烯類基團(tuán)”可以通過由異戊二烯單元形成的線性的烴 結(jié)構(gòu)來概括，所述烴結(jié)構(gòu)可以由下面的式(I)來表示
權(quán)利要求
1.復(fù)合物，其由與至少一個(gè)具有角鯊烯結(jié)構(gòu)的至少C18的烴化合物或其類似物共價(jià)偶 聯(lián)的至少一個(gè)包含10至40個(gè)核苷酸的核酸分子形成。
2.根據(jù)前一項(xiàng)權(quán)利要求的復(fù)合物，其中所述具有角鯊烯結(jié)構(gòu)的至少Cw的烴化合物或 其類似物由下述式(I)的基團(tuán)來表示
3.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的復(fù)合物，其中所述具有角鯊烯結(jié)構(gòu)的至少Cw的烴化 合物為1，1，，2-三-去甲角鯊烯酸。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的復(fù)合物，其中所述包含10至40個(gè)核苷酸的核酸分子 為RNA分子。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的復(fù)合物，其中所述RNA分子為si RNA分子。
6.根據(jù)前一項(xiàng)權(quán)利要求的復(fù)合物，其中所述siRNA為RET/PTClsiRNA。
7.根據(jù)前一項(xiàng)權(quán)利要求的復(fù)合物，其特征在于，所述RET/PTClsiRNA具有下面的核苷 酸序列5' -C⑶UACCAUCGAGGAUCCAdAdA-3 ‘ (SEQ IDNO :1)。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的復(fù)合物，其中所述共價(jià)偶聯(lián)為酯、醚、硫醚、二硫鍵化 合物、磷酸酯或酰胺類型的共價(jià)鍵，優(yōu)選地二硫鍵化合物類型的共價(jià)鍵。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的復(fù)合物，其由下述通式(II)來表示
10.根據(jù)前一項(xiàng)權(quán)利要求的復(fù)合物，其中X為二硫鍵化合物共價(jià)連接，并且Z表示式 (I)的基團(tuán)，其中m表示1和η表示2。
11.在權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)之中所描述的復(fù)合物的納米顆粒。
12.根據(jù)前一項(xiàng)權(quán)利要求的納米顆粒，其平均尺寸為30至500nm，特別地50至250nm， 甚至100至400nm。
13.制備根據(jù)權(quán)利要求11或12中任一項(xiàng)的納米顆粒的方法，其特征在于，所述方法至 少包括-將根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的復(fù)合物分散在至少一種有機(jī)溶劑中，其濃度足以 當(dāng)在攪拌下向水相中添加所得的混合物時(shí)，獲得以在所述水相中的懸浮液形式的所述復(fù)合 物的納米顆粒的瞬時(shí)形成，和-需要時(shí)，分離所述納米顆粒。
14.根據(jù)權(quán)利要求11或12之一的納米顆粒，其用于在治療和/或預(yù)防癌癥，尤其是內(nèi) 分泌性癌癥，和更特別地甲狀腺乳頭狀癌中使用。
15.藥物組合物，其包含至少一種在權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)之中所描述的復(fù)合物和 /或在權(quán)利要求11或12之一中所描述的納米顆粒，以及與之相聯(lián)合的至少一種藥學(xué)上可接 受的載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及復(fù)合物，其由與至少一個(gè)具有角鯊烯結(jié)構(gòu)的至少C18的烴化合物或其類似物共價(jià)偶聯(lián)的至少一個(gè)包含10至40個(gè)核苷酸的核酸分子形成。
文檔編號A61K31/7088GK102083847SQ200980124754
公開日2011年6月1日 申請日期2009年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月16日
發(fā)明者C·馬爾維, D·德馬埃勒, L·馬薩德, M·拉瓦內(nèi), P·庫夫勒爾 申請人:國家科研中心, 巴黎第十大學(xué)