專利名稱：包含漿膜下筋膜的分離的細胞外基質(zhì)材料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明通常屬于醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域，特別地屬于可用于組織移植的醫(yī)學(xué)材料方面。
背景技術(shù)：
作為進一步的背景，已提出將多種細胞外基質(zhì)(ECM)材料用于醫(yī)學(xué)移植、細胞培養(yǎng)和其他相關(guān)應(yīng)用。例如，已提出含有源自小腸、胃或膀胱組織的粘膜下層的醫(yī)學(xué)移植物和細胞培養(yǎng)材料。參見，例如，美國專利 Nos. 4，902，508,4, 956，178,5, 281，422,5, 554，389、 6，099，567 禾口 6，206，931 ο 此夕卜，Cook Biotech Incorporated, West Lafayette, Indiana 最近制造了多種商品名為SURGISIS 、STRATASIS 和OASIS 的基于小腸粘膜下層的醫(yī)學(xué)材料。也提出源自肝基底膜的醫(yī)學(xué)材料，例如在美國專利No. 6，379，710中。同樣地，已提出將源自羊膜(參見例如美國專利Nos. 4，361，552和6，576，618)和源自腎小囊膜(參見2003年1月9日公布的國際PCT專利申請No. WO 03/002165)的ECM材料用于醫(yī)學(xué)和/ 或細胞培養(yǎng)應(yīng)用。然而，許多這些材料受限于它們的尺寸和強度。在某些應(yīng)用中，必須將這些材料的多個帶或片耦合或者結(jié)合在一起以獲得移植物，該移植物足夠大以覆蓋所需區(qū)域，而同時仍然保持足夠的強度以避免再植入的需要。對于以上所述，顯而易見的是仍然需要可用于各種醫(yī)學(xué)應(yīng)用，特別是需要較大尺寸和/或相對伸展的移植物的那些應(yīng)用中的可選擇的醫(yī)學(xué)材料。本發(fā)明提供了這種醫(yī)學(xué)材料，以及其制備和使用方法。

發(fā)明內(nèi)容
在一個方面，本發(fā)明提供了一種適用于提供組織移植物的材料。所述材料包含細胞外基質(zhì)材料的分離片，該細胞外基質(zhì)材料得自動物，尤其是豬類動物的腹壁，并包含來自動物腹壁的漿膜下筋膜。所述細胞外基質(zhì)材料包含膠原和彈性蛋白，并基本上不含天然細胞。該細胞外基質(zhì)材料所需地為生物吸收性的，并能在某些具體實施方案中保留來自動物的天然硫酸糖胺聚糖。該細胞外基質(zhì)材料可具有至少1磅的斷裂拉伸強度和/或至少約 50%的斷裂伸長。在另一方面，本發(fā)明提供了一種細胞外基質(zhì)移植材料的制備方法，該方法包括提供自動物，尤其是豬類動物的腹壁分離的組織片段，所述組織片段包含漿膜下筋膜和粘附的漿膜下脂肪。例如機械去除至少一些漿膜下脂肪以制得包含漿膜下筋膜的組織膠原層。 將膠原層去細胞化，也可處理膠原層以降低其脂質(zhì)含量。在某些有利的形式中，在加工之后，組織膠原層保留天然硫酸糖胺聚糖，具有至少1磅的斷裂拉伸強度，和/或至少約50% 的斷裂伸長。在另一方面，本發(fā)明提供了一種治療患者的方法。所述方法包括將本文所述的細胞外基質(zhì)材料移植至患者。在優(yōu)選的形式中，例如在疝修復(fù)程序的實施中，進行移植以提供患者軟組織的支撐。
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通過本文進一步的描述，本發(fā)明的另外的具體實施方案以及特征和優(yōu)點將是顯而易見的。


圖1顯示了豬類腹壁的層，其用于從中得到片段以制備移植材料。
具體實施例方式為了促進本發(fā)明原理的理解的目的，現(xiàn)在將參照顯示于附圖中的具體實施方案， 并使用特定的語言描述該具體實施方案。盡管如此，應(yīng)該理解不旨在由此限制本發(fā)明的范圍，在本文認為本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通常可想到所示醫(yī)學(xué)材料的變化和修改，以及其中所示的本發(fā)明原理的進一步應(yīng)用。如上所公開的，本發(fā)明提供了可用于提供醫(yī)學(xué)程序的組織移植物的分離的去細胞化的細胞外基質(zhì)(ECM)材料?，F(xiàn)在轉(zhuǎn)向附圖，圖1顯示了豬的腹壁10的層的圖示。圖1也為包括例如牛類、羊類和馬類動物的其他動物的腹壁的代表，自其可獲得ECM材料。所述層包含壁層腹膜11、漿膜下筋膜12、漿膜下脂肪13、后筋膜14、腹肌15、前筋膜16、皮下脂肪 17，和真皮18。本文所述的細胞外基質(zhì)移植材料包含漿膜下筋膜12，以及任選的自腹壁的剩余結(jié)構(gòu)層分層的壁層腹膜11。因此，優(yōu)選的本發(fā)明的細胞外基質(zhì)移植材料不含或者基本上不含后筋膜14、腹肌15、前筋膜16、皮下脂肪17，和真皮18。本文所用的“基本上不含” 意指排除的組分不存在，除了可能作為痕量殘留檢測，例如組成移植材料的不多于0. 5重量％。移植材料的漿膜下筋膜源自動物，優(yōu)選溫血脊椎動物，更優(yōu)選非人類溫血脊椎動物(如豬類、羊類、牛類或馬類動物)的腹壁。特別優(yōu)選豬類動物源。在一個優(yōu)選的具體實施方案中，可用于本發(fā)明的腹膜和筋膜可如下獲得收集腹壁，自壁分層組織片段，所述壁包括壁層腹膜、漿膜下筋膜和來自相鄰組織(包括存在于組織源中的肌肉層和/或其他層) 的其他組織(例如脂肪組織)的至少部分。然后所需地進一步加工包含壁層腹膜和漿膜下筋膜的組織片段以制備適合用作移植材料的含膠原(“膠原的”)且含彈性蛋白(“彈性蛋白的”)片。進一步加工可以去除壁層腹膜或保留壁層腹膜的那些的方式進行。因此，在某些具體實施方案中，制得的移植材料不含或者基本上不含壁層腹膜，在某些其他具體實施方案中，制得的移植材料包含壁層腹膜。可使用任何合適的方式加工包含壁層腹膜11、漿膜下筋膜12和漿膜下脂肪13的每一個的至少部分的收集的組織片段，從而去除漿膜下脂肪13。合適的去除方式可包括，例如，例如用鈍刀片機械研磨脂肪組織。如需要，可通過將多層材料浸入異丙醇或適于去除脂肪組織的任何其他液體介質(zhì)中一段去除另外的脂肪所需的時間而去除另外的漿膜下脂肪 13或任何其他脂肪組織。在一個優(yōu)選具體實施方案中，首先刮擦分離的材料以去除漿膜下脂肪13的部分。在刮擦之后，用有機溶劑處理材料，例如通過浸入異丙醇(IPA) (1重量份材料相對10體積份IPA) 30分鐘，從而去除脂質(zhì)。該去除脂質(zhì)的處理步驟通常進行至少一次，但可進行多次(例如2、3、4或甚至5或更多次)。優(yōu)選的本發(fā)明的經(jīng)處理的ECM移植材料具有15重量％以下，更優(yōu)選10重量％以下，在某些具體實施方案中為5重量％以下的天然脂質(zhì)含量。
本文所述的細胞外基質(zhì)材料的一個優(yōu)點是它們可以較大尺寸自單獨收集的腹壁組織片制得，而同時保持用于醫(yī)藥目的的充足的強度性質(zhì)。自組織源分離的許多其他材料 (例如其他ECM材料)需要連接多個材料片以制得比任何單獨片更大的片狀移植物，由此得到用于某些醫(yī)藥用途(如疝移植物)的具有充足尺寸和強度的整個片。本文所述的細胞外基質(zhì)移植材料可自足夠成熟和大的動物收集以免于需要使用多個側(cè)面連接的片，盡管如需要可形成這種連接的構(gòu)造。在某些具體實施方案中，包括單獨的或連接至壁層腹膜的漿膜下筋膜的經(jīng)加工的細胞外基質(zhì)移植物具有至少20厘米的寬度和至少20厘米的長度。本發(fā)明的細胞外基質(zhì)材料可通過將材料移植至患者而用于處理多種醫(yī)學(xué)癥狀，包括涉及患者的組織損壞的那些。在這方面，本發(fā)明的醫(yī)學(xué)材料可用于治療受損組織，并可施用至患者的外部結(jié)構(gòu)(例如皮膚)，或可植入患者內(nèi)，例如從而在疝修復(fù)或骨盆底重建的情況中提供組織支撐。因此，本發(fā)明的醫(yī)學(xué)材料可以多種形式設(shè)置以適應(yīng)其所需的使用位置。 本發(fā)明的醫(yī)學(xué)材料可摻入一種或多種藥物或其他醫(yī)藥試劑，并可在施用至患者之后洗脫那些物質(zhì)，由此消除或減少物質(zhì)的全身用藥的需要，并最小化了全身毒性和不良反應(yīng)的風(fēng)險。通常，當(dāng)醫(yī)學(xué)材料設(shè)置為施用至組織時，將醫(yī)學(xué)材料切割至或設(shè)置為其最終用途所需的尺寸。在某些具體實施方案中，材料的尺寸可大于其施用的組織缺損。以此方式調(diào)節(jié)材料的尺寸提供了容易的對周圍組織的粘附。例如，一旦將調(diào)節(jié)尺寸的醫(yī)學(xué)材料置于需要治療的區(qū)域之上、之內(nèi)或周圍時，可使用任何幾種已知的合適粘附方法將醫(yī)學(xué)材料更牢固地粘附至周圍組織或其他結(jié)構(gòu)。合適的粘附方法包括，例如裝訂(stapling)、縫合、粘合等。優(yōu)選地，醫(yī)學(xué)材料通過縫合更牢固地粘附至周圍組織或其他材料。目前本領(lǐng)域中可得到多種合成材料用作縫合線。例如，包括Prolene 、Vicryl 、Mersilene 、Panacryl 和 Monocry 1 的縫合線可考慮用于本發(fā)明中。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知其他縫合材料。本領(lǐng)域公知的醫(yī)學(xué)粘合劑也可與本發(fā)明的醫(yī)學(xué)材料結(jié)合使用以更牢固地將材料粘附至組織或其他結(jié)構(gòu)。在優(yōu)選的具體實施方案中，包含腹膜和下漿膜下筋膜的細胞外基質(zhì)材料可為生物吸收性材料，當(dāng)將其植入患者中時，其所需地支撐組織重塑，從而隨時間而由患者組織代替。在許多情況中，醫(yī)學(xué)材料顯示可重塑性質(zhì)，使得重塑過程在數(shù)天或數(shù)星期的過程中發(fā)生。在優(yōu)選的具體實施方案中，重塑過程在約5天至約12星期的時間內(nèi)發(fā)生，在此期間過程中植入材料被再吸收并由患者組織代替。在如此進行時，優(yōu)選的本發(fā)明的ECM材料可支撐或引起血管生成至材料內(nèi)，從而促進新的患者組織的發(fā)育。為了這些目的，某些優(yōu)選的本發(fā)明的ECM材料不使用如戊二醛的化學(xué)交聯(lián)劑進行處理以避免在植入時導(dǎo)致材料永久 (permanent)0然而，如果在給定情況下需要，在其他具體實施方案中本發(fā)明的ECM材料可含有引入的非天然交聯(lián)。例如，可在將ECM材料自其來源分離之后的任何時候用交聯(lián)劑對ECM 材料進行處理。增加在醫(yī)學(xué)材料內(nèi)和/或在兩個或兩個以上醫(yī)學(xué)材料的層壓層(laminated layers)之間的交聯(lián)含量(或數(shù)目)可用于提高其強度。然而，在醫(yī)學(xué)材料內(nèi)引入的交聯(lián)也會影響醫(yī)學(xué)材料被吸收和重塑至患者組織的能力。因此，在引入交聯(lián)的某些具體實施方案中，可明智地控制在ECM材料中加入的交聯(lián)水平以保持ECM材料的可重塑特性。當(dāng)使用時，ECM材料的引入的交聯(lián)可通過光交聯(lián)技術(shù)，或通過應(yīng)用交聯(lián)劑(如通過化學(xué)交聯(lián)劑)，或通過由脫水或其他方式引起的蛋白質(zhì)交聯(lián)而獲得?？墒褂玫幕瘜W(xué)交聯(lián)劑包括，例如，如戊二醛的醛，如碳二亞胺的二亞胺，例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基) 碳二亞胺氫氯化物，核糖或其他糖，?；B氮化物，磺酸基-N-羥基琥珀酰胺，或聚環(huán)氧化合物(包括例如聚縮水甘油醚，如可以商品名DENACOL EX810購自Nagese Chemical Co.， Osaka，Japan的乙二醇二縮水甘油醚，和以商品名DENACOL EX 313也購自Nagese Chemical Co.的甘油聚甘油醚)。通常，當(dāng)使用時，聚甘油醚或其他聚環(huán)氧化合物每分子具有2至約 10個環(huán)氧基團。當(dāng)考慮含有兩個或多個ECM材料層的分層構(gòu)造時，可另外交聯(lián)層壓板的層以將 ECM材料的多個層彼此結(jié)合。ECM材料的交聯(lián)也可通過將基體暴露于UV輻射，通過用如轉(zhuǎn)谷氨酰酶和賴氨?；醯拿柑幚砟z原基基體，以及通過光交聯(lián)進行催化。因此，可在彼此耦合之前、在彼此耦合過程中和/或在彼此耦合之后將另外的交聯(lián)加入單獨的層。可選擇地，可滾動或堆疊兩個或兩個以上多層醫(yī)學(xué)材料部分，或者一個材料部分在自身上折疊至少一次，然后使用不同于化學(xué)交聯(lián)的結(jié)合技術(shù)(如真空壓制、凍干或其他脫水加熱結(jié)合條件和/或粘合劑、膠或其他結(jié)合劑的使用)將材料融合或結(jié)合在一起。合適的粘合劑可包括例如膠原凝膠或糊、明膠、纖維蛋白膠或其他包含反應(yīng)活性單體或聚合物的試劑(例如氰基丙烯酸鹽粘合劑)。同樣地，可使用化學(xué)交聯(lián)劑，如戊二醛、甲醛、環(huán)氧化物、京尼平或其衍生物、碳化二亞胺化合物、聚環(huán)氧化合物或其他類似試劑(包括在如上討論中確定的其他那些)獲得或促進結(jié)合。也可使用這些的一種或多種與脫水引發(fā)的結(jié)合的組合?？墒褂枚喾N脫水引發(fā)的結(jié)合方法以將本發(fā)明的ECM材料的部分融合在一起。在一個優(yōu)選具體實施方案中，在脫水條件下壓縮ECM材料的多個層。術(shù)語“脫水條件”可包括促進或引發(fā)水從多層醫(yī)學(xué)材料去除的任何機械或環(huán)境條件。為了促進壓縮材料的脫水，壓縮基體結(jié)構(gòu)的兩個表面的至少一個為透水的。可任選地通過在壓縮表面的外部應(yīng)用吸墨 (blotting)材料，加熱基體結(jié)構(gòu)或吹掃空氣或其他惰性氣體而進一步提高材料的脫水。將 ECM層彼此脫水結(jié)合的特別有用的方法包括凍干，例如冷凍干燥或蒸發(fā)冷卻條件。脫水結(jié)合的另一方法為真空壓制。在真空壓制過程中，彼此強制接觸的多層醫(yī)學(xué)材料的脫水有效地將材料彼此粘結(jié)，甚至是在不存在用于獲得結(jié)合的其他試劑下，盡管可使用這種試劑并同時也至少部分利用脫水引起的結(jié)合。在充足的壓縮和脫水下，可使得多層醫(yī)學(xué)材料形成通常單一的層壓結(jié)構(gòu)。在本發(fā)明的一些方面中，有利的是在相對溫和的溫度暴露條件下進行干燥操作， 所述條件將對本發(fā)明的ECM材料(例如天然膠原結(jié)構(gòu)和存在的潛在的生物活性物質(zhì))的潛在有害影響最小化。因此，在本發(fā)明的一些形式中優(yōu)選使用如下干燥操作，該干燥操作不或基本上不持續(xù)暴露于人體溫度以上或略微更高，即不高于約38°C的溫度下而進行。這些包括，例如，在約38°C以下的真空壓制操作，在約38°C以下的鼓風(fēng)干燥，或者不使用主動加熱-在約室溫(約25°C)下或使用冷卻的這些過程的任一種。當(dāng)然，相對較低的溫度條件也包括凍干條件。當(dāng)制得時，ECM材料可任選地保留原生自源組織的生物活性組分。例如，腹膜和 /或筋膜可包括一種或多種天然生長因子，如纖維母細胞生長因子-2(FGF-2)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)或其組合。同樣地，本發(fā)明的ECM材料可包含如一種或多種硫酸糖胺聚糖 (sGAGs)(如硫酸肝素)、一種或多種非硫酸糖胺聚糖(如透明質(zhì)酸)，和/或一種或多種糖蛋白(如纖連蛋白)的其他生物材料。因此，一般而言，可任選地加工本發(fā)明的ECM以保留一種或多種直接或間接引發(fā)細胞響應(yīng)的天然生物活性組分，所述細胞響應(yīng)如細胞形貌、增殖、生長、蛋白質(zhì)或基因表達的變化。經(jīng)加工的本發(fā)明的ECM材料通常包含豐富的膠原。這種天然源ECM材料將大部分包含非無規(guī)取向的膠原纖維。經(jīng)加工的ECM材料也通常包含彈性蛋白。當(dāng)加工ECM材料以保留如上所述的天然生物活性組分時，該ECM材料可將這些組分作為分散于膠原纖維之間、之上和/或之內(nèi)的固體而保留。用于本發(fā)明的特別合意的材料包含顯著量的這種分散的非膠原和非彈性蛋白固體，所述非膠原和非彈性蛋白固體在合適的染色下在光學(xué)顯微鏡觀察下易于確定。在某些本發(fā)明的具體實施方案中，這種非膠原和非彈性蛋白固體可構(gòu)成材料干重的顯著百分比，例如在本發(fā)明的各種具體實施方案中至少約1重量％，至少約3重量％，和至少約5重量％。本發(fā)明的ECM材料也可顯示血管生成特性，并因此可有效引起移植該材料的主體中的血管生成。關(guān)于此點，血管生成為身體制造新的血管以產(chǎn)生增加的對組織的血液供給的過程。因此，當(dāng)血管生成材料與主體組織接觸時，其促進或激勵新血管的形成。最近開發(fā)了體內(nèi)血管生成對生物材料植入的響應(yīng)的測量方法。例如，一個這種方法使用皮下植入模型測定材料的血管生成特性。參見C. Heeschen等人的Nature Medicine 7 (2001)，No. 7， 833-839。當(dāng)與熒光微血管造影技術(shù)結(jié)合時，該模型可提供生物材料內(nèi)血管生成的定量和定性測量。C. Johnson 等人的 Circulation Research 94 (2004)，No. 2，262-268。此外，除了包含天然生物活性組分之外或者作為天然生物活性組分的替代物，可將非天然生物活性組分(如通過重組技術(shù)或其他方法合成制得的那些)摻入本發(fā)明的ECM 材料中。這些非天然生物活性組分可為對應(yīng)于在組織中天然存在的那些但可能具有不同種類的源自天然或重組制得的蛋白質(zhì)(例如施用于來自如豬的其他動物的組織的人類蛋白質(zhì))。在某些形式中，可將如FGF-2、血小板衍生生長因子(PDGF)和/或VEGF的一種或多種非天然生長因子加入ECM材料。所述非天然生物活性組分也可為藥品。可摻入本發(fā)明所用的材料之內(nèi)和/或之上的說明性的藥品包括，例如，抗生素、如血液凝固因子的血栓促進物質(zhì)，例如凝血酶、纖維蛋白原、抗炎劑、抗增生劑、止痛劑和其他?？稍陬A(yù)制造步驟、就在程序(例如通過將材料浸入含有如頭孢唑啉的合適抗生素的溶液中)之前或者在將材料移植入患者的過程中或之后將這些物質(zhì)施用至多層醫(yī)學(xué)材料?？赏ㄟ^任何合適的方式將非天然生物活性組分施用至本發(fā)明的ECM材料。合適的方式可包括，例如，噴霧、浸漬、沉浸等。若其他化學(xué)或生物組分包含于ECM材料中，非天然生物活性組分可在這些其他組分之前、與這些其他組分一起或者這些其他組分之后進行施用。在一個具體實施方案中，非天然生物活性組分的涂層可在ECM材料的任一側(cè)或兩側(cè)形成。“涂層”意指施用非天然生物活性組分以覆蓋ECM材料表面的指定部分。在某些具體實施方案中，可施用非天然生物活性組分以形成基本上覆蓋本發(fā)明的ECM材料的至少一側(cè)的整個表面區(qū)域的涂層。在其他具體實施方案中，可將如本文所述的那些的非天然生物活性組分基本上均勻地摻入整個本發(fā)明的ECM材料中。本發(fā)明的ECM材料優(yōu)選為高度純化的，例如Cook等人的美國專利No. 6，206，931 中所述。因此，優(yōu)選的ECM材料顯示約12內(nèi)毒素單位(EU) /克以下，更優(yōu)選約5EU/克，且最優(yōu)選約IEU/克以下的內(nèi)毒素水平。作為另外的優(yōu)選，本發(fā)明的ECM材料可具有約1集落形成單位(CFU)/克以下，更優(yōu)選約0.5CFU/克以下的生物負載。真菌水平合意地同樣較低， 例如約ICFU/克以下，更優(yōu)選約0. 5CFU/克以下。核酸水平優(yōu)選為約5微克/毫克以下，更優(yōu)選為約2微克/毫克以下，且病毒水平優(yōu)選為約50噬斑形成單位(PFU) /克以下，更優(yōu)選約5PFU/克以下。美國專利No. 6，206，931中所教導(dǎo)的ECM組織的這些和另外的性質(zhì)可為本發(fā)明的ECM材料的特性。在另外的具體實施方案中，本發(fā)明的ECM材料可經(jīng)受擴展材料的工藝。在某些形式中，這種擴展的材料可通過使ECM材料與一種或多種堿性物質(zhì)接觸直至材料擴展而形成。說明性地，所述接觸足以將ECM材料擴展至其原總體積的至少120% (即1. 2倍)，或者在一些形式中擴展至其原體積的至少約2倍。之后，任選地例如通過中和和/或潤洗而將擴展的材料自堿性介質(zhì)分離。收集的擴展的材料可以任何合適的方式使用。說明性地，可在具有所需形狀或構(gòu)造的移植結(jié)構(gòu)的形成中將擴展的材料用生物活性組分富集、干燥和/或模制等。在某些具體實施方案中，擴展的ECM材料結(jié)構(gòu)可為高度壓縮性和擴展性的，使得該材料被壓縮以例如自管狀傳遞器件的內(nèi)腔(lumen)內(nèi)傳遞，之后在自器件調(diào)配(deployment) 時擴展而固定在患者內(nèi)，引起患者內(nèi)的神經(jīng)束(tract)關(guān)閉，和/或引起止血。擴展的材料可通過本發(fā)明的ECM材料與含有氫氧化鈉的水性溶液或其他介質(zhì)的受控接觸而形成。材料的堿處理可導(dǎo)致材料的物理結(jié)構(gòu)的變化，從而導(dǎo)致其擴展。這種變化可包括材料中的膠原的變性。在某些具體實施方案中，優(yōu)選的是將材料擴展至其原總體積的至少約3倍，至少約4倍，至少約5倍，或至少約6倍或甚至更大倍數(shù)。擴展的量級與數(shù)種因素相關(guān)，包括例如在待擴展的材料的處理中所用的堿性介質(zhì)的濃度或PH、暴露時間和溫度。ECM材料通常包含膠原纖維的網(wǎng)絡(luò)，其具有天然存在的分子內(nèi)交聯(lián)和天然存在的分子間交聯(lián)。當(dāng)進行本文所述的擴展加工時，天然存在的分子內(nèi)交聯(lián)和天然存在的分子間交聯(lián)可保留于加工的膠原基體材料而足以保持膠原基體材料為完整的膠原片材；然而，膠原片材中的膠原纖維會變性，且膠原片材可具有比起始材料的厚度更大的堿加工厚度，例如為原厚度的至少120%，或為原厚度的至少2倍。說明性地，用于處理ECM材料的堿性物質(zhì)的濃度在約0. 5至約2M的范圍內(nèi)，更優(yōu)選約IM的濃度。此外，在某些具體實施方案中，堿性物質(zhì)的pH為約8至約14。在優(yōu)選的方面中，堿性物質(zhì)具有約10至約14，最優(yōu)選約12至約14的pH。除了濃度和pH之外，如溫度和暴露時間的其他因素將有助于擴展的程度，如上所述。在此方面，在某些變體中，將ECM材料暴露于堿性物質(zhì)在約4至約45 °C的溫度下進行。 在優(yōu)選的具體實施方案中，所述暴露在約25至約40°C的溫度下進行，最優(yōu)選37°C。此外， 暴露時間為至少約1分鐘直至約5小時或更多。在一些具體實施方案中，暴露時間為約1 至約2小時。在一個特別優(yōu)選的具體實施方案中，在約37°C的溫度下將ECM材料暴露于pH 為14的NaOH的IM溶液約1. 5至2小時。這種處理導(dǎo)致膠原變性和材料的相當(dāng)大的擴展。 材料的膠原基體的變性可作為材料的膠原填充(packing)特性的變化(例如起始材料的緊密束縛膠原網(wǎng)絡(luò)的顯著破壞)而得以觀察。非擴展的材料可具有緊密束縛膠原網(wǎng)絡(luò)，當(dāng)通過肉眼或在適度放大(例如IOOx放大)下觀察時，該緊密束縛膠原網(wǎng)絡(luò)呈現(xiàn)基本上均勻連續(xù)的表面。相反地，當(dāng)在相同放大(例如約IOOx)下觀察時，擴展的膠原材料可具有完全不同的表面，其表面不是連續(xù)的，而是在許多區(qū)域中呈現(xiàn)膠原股或束，所述膠原股或束由在股或束之間的材料中的大量間隙所分隔。因此，擴展的ECM材料通常比對應(yīng)的非擴展的ECM 材料更顯得多孔的。此外，在許多情況中，相比于未處理的起始材料，擴展的ECM材料經(jīng)證實(例如通過測量增加的透水性或其他液體通道)具有增加的孔隙率。擴展的ECM材料的更多泡和多孔的結(jié)構(gòu)可使得材料可被鑄塑或制備成用于制備醫(yī)學(xué)材料和器件的多種海綿或泡沫形狀。在這種堿處理之后，可將ECM材料自堿性介質(zhì)分離并加工以進一步使用。說明性地，可在ECM材料的進一步加工以形成本發(fā)明的結(jié)構(gòu)或其他組合物之前，中和和/或用水潤洗收集的材料以自材料去除堿性。起始材料(即在用堿性物質(zhì)處理之前)可任選地包含除了膠原和彈性蛋白之外的天然組分。用堿性物質(zhì)處理材料可降低一種、一些或全部的這種天然組分的量。在某些具體實施方案中，材料用堿性物質(zhì)進行受控處理足以產(chǎn)生基本上不含核酸和脂質(zhì)，并潛在地也不含生長因子、糖蛋白、糖胺聚糖和蛋白聚糖的材料。在某些具體實施方案中，可將一種或多種外源的或內(nèi)源的生物活性組分，例如類似于在擴展加工過程中自ECM材料去除的那些，返回至材料。例如，可將生長因子、糖蛋白、糖胺聚糖和/或蛋白聚糖再補充至擴展的ECM材料。這些生物活性組分可通過任何合適的方法返回至材料。例如，在某些形式中，含有這些組分的組織提取物(如美國專利 No. 6，375，989中所述)可以制得并施用至ECM材料(所述組織提取物自該ECM材料去除)。 在一個具體實施方案中，ECM材料可在組織提取物中培養(yǎng)充足的時間以使得包含于其中的生物活性組分與材料締合。所述組織提取物可例如由非擴展的ECM組織獲得，所述非擴展的ECM組織與用于制備被再補充的擴展的ECM材料的非擴展的ECM組織具有相同類型。用于將生物活性組分返回或引入至多層醫(yī)學(xué)材料的其他方式包括本領(lǐng)域公知的噴霧、浸漬、 沉浸等。本文所述的ECM材料可用于制造任何合適形式的組合物或器件。合適的形式包括，例如片、多孔固體泡沫、粉末、栓塞、管、固體圓柱體、在液體介質(zhì)中的懸浮體、凝膠或包括溶劑化的ECM組分的溶液。本發(fā)明的單個分離的去細胞化的ECM層的厚度隨著動物(該ECM層自所述動物分離)的不同而不同，包括基于動物的物種、年齡或尺寸等的變化。優(yōu)選的這種單個層具有在約500至約1000微米，更優(yōu)選約600至900微米，且最優(yōu)選約750至約850微米范圍內(nèi)的厚度(水合)。單個ECM層在水合時合意地具有至少約1磅的斷裂拉伸強度，和在某些形式中在約1至5磅范圍內(nèi)的斷裂拉伸強度。單個ECM層合意地為高伸展性的，當(dāng)其水合時具有至少約50%，通常在約50%至約80%范圍內(nèi)的斷裂伸長。關(guān)于此點，本文所指的斷裂拉伸強度和斷裂伸長可根據(jù)ASTM D882(2002)或等同方法確定。單個ECM層在水合時合意地顯示在約0. 5至約2磅范圍內(nèi)的基于5-OProlene縫合尺寸和2毫米的咬合深度的縫合保留強度。類似地，單個ECM層在水合時合意地顯示在約200至約1000千帕范圍內(nèi)的爆破強度。特別優(yōu)選具有這種厚度、斷裂拉伸強度、斷裂伸長、縫合保留強度和/或爆破強度的本發(fā)明的豬源ECM層。若需要獲得提高的機械或其他物理性質(zhì)，可以任何合適的方式將多個ECM材料層結(jié)合在一起，所述合適的方式包括在加熱、非加熱或凍干條件下的脫水加熱結(jié)合，使用本文所述的粘合劑、膠或其他結(jié)合劑，用化學(xué)試劑或輻射(包括UV輻射)交聯(lián)，或這些彼此的任意結(jié)合或這些與如上所述的其他合適的方法的任意結(jié)合。例如，可制得具有彼此結(jié)合的2、 3、4、5、6或更多個ECM層的結(jié)構(gòu)。在這種結(jié)構(gòu)中，ECM層可直接彼此疊加以完全重疊，或者可排布為僅部分重疊，由此產(chǎn)生具有比任何單獨考慮的ECM層更大表面積的總片。完全重疊和僅部分重疊的ECM層的組合也可用于形成本發(fā)明的結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的腹膜/漿膜下筋膜 ECM層的一個優(yōu)點是它們可以相對較大的表面積尺寸得以分離，由此消除或減少了部分重疊分別的ECM層以獲得相對較大的片結(jié)構(gòu)的需要。一貫地，在本發(fā)明的某些優(yōu)選具體實施方案中，多層壓片結(jié)構(gòu)包含至少兩個彼此結(jié)合并形成重疊區(qū)域的腹膜/漿膜下筋膜ECM層， 其中所述重疊區(qū)域具有至少400平方厘米的表面積。在這種結(jié)構(gòu)中，所述至少兩個ECM層可完全重疊以提供具有400平方厘米或更大的表面積的結(jié)構(gòu)，或者可僅部分重疊但具有足夠重疊的材料以形成至少400平方厘米的重疊表面積。在每種情況中，400平方厘米的重疊區(qū)域可包括至少20厘米的長度和至少20厘米的寬度(垂直于長度測得)。這種結(jié)構(gòu)可提供給ECM片器件大的增強且穩(wěn)定的材料區(qū)域，例如以在如疝修復(fù)或骨盆底重建中用于提供軟組織支撐。用本文所述的ECM材料制得的無菌醫(yī)學(xué)產(chǎn)品可不含如合成聚合物材料的合成材料，或者可例如在多層層壓結(jié)構(gòu)中包含與一種或多種合成(例如合成聚合物)材料結(jié)合的 ECM材料。例如，多層醫(yī)學(xué)材料可包含例如通過縫合、粘合劑等粘附至細胞外基質(zhì)組織的合成制得的層。這種合成制得的材料可包括非生物吸收性或生物吸收性合成聚合物材料，如聚四氟乙烯(PTFE，例如GORE-TEX材料)、尼龍、聚丙烯、聚氨酯、硅酮、DACRON聚合物、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、乙醇酸和乳酸的共聚物(PLGA共聚物)、聚己酸內(nèi)酯或本領(lǐng)域公知的其他。包含本發(fā)明的ECM材料的醫(yī)學(xué)產(chǎn)品可在醫(yī)學(xué)包裝中以無菌形式提供。包裝產(chǎn)品的最終殺菌可例如通過輻射、環(huán)氧乙烷氣體或任何其他合適的殺菌技術(shù)實現(xiàn)，可相應(yīng)地選擇醫(yī)學(xué)包裝的材料和其他性質(zhì)。本發(fā)明的ECM材料可以脫水或水合態(tài)進行包裝。ECM材料的脫水可通過本領(lǐng)域公知的任何方式，包括上文所述的任何那些而得以實現(xiàn)。優(yōu)選地，包裝的ECM材料為凍干的或真空壓制的材料。如需要，可在用于治療患者之前使用合適的液體，如無菌水或無菌水性緩沖液將脫水ECM材料再水合?？蛇x擇地，ECM材料可以其脫水形式施用至患者。為了提高本發(fā)明的方面及它們的特征和優(yōu)點的進一步理解的目的，提供了如下特定實施例。應(yīng)理解這些實施例為說明性的，且不限定本發(fā)明的方面。實施例1細胞外基質(zhì)移植材料的制備在食品加工廠，在加工線上的位點收集組織片段，在所述加工線處用中線切口打開完整豬類體腔，并去除前肋和所有器官。在身體每一側(cè)的體壁皮瓣的后邊緣上形成切口， 在體壁的每一側(cè)取下組織片段以制得具有大約相等尺寸(1英尺xl. 5英尺)的兩個組織片段。這些片段包含腹膜、漿膜下筋膜和漿膜下脂肪。經(jīng)確定后筋膜不是該組織片段的一部分。取決于沿著所述片段的位置，所述漿膜下脂肪為約0.5至約1厘米厚。放置包含內(nèi)臟腹膜和壁層腹膜兩者的腹膜。丟棄內(nèi)臟腹膜，該內(nèi)臟腹膜經(jīng)確定為帶有血管的白色厚網(wǎng)絡(luò)的透明薄膜。用手使用Teflon片(1/8”厚)在兩側(cè)刮擦組織片段以去除脂肪。在該操作過程中觀察到組織片段為抗撕裂的。在刮擦之后每個組織片段稱重為大約143克。一旦稱重，在含有100毫升乙醇(200標(biāo)準(zhǔn)酒精度(proof))、12毫升過乙酸(PPA) 和1990毫升高純水的溶液中將每個組織片段消毒。所述片段在該溶液中搖動大約2小時， 隨后在高純水中潤洗5次，每次5分鐘。然后將片段在高純水中儲存。觀察說明在所述加工過程中使得片段不含或基本上不含壁層腹膜。將如上所述所得組織片段施用至釘住的聚甲醛樹脂(delrin)板并冷凍干燥。這生成具有不同的光滑側(cè)和粗糙側(cè)的白色厚凍干片。這些片在純異丙醇(IPA)中(1重量份片對10重量份IPA)潤洗兩次，每次潤洗30分鐘，從而去除脂質(zhì)。在IPA處理之后，所述片在高純水中潤洗兩次，每次5分鐘。然后將片在高純水中儲存。測試一片水合片的厚度和探針爆破(probe burst)。厚度值為0. 734毫米、0. 755毫米、0. 811毫米、0. 804毫米、0. 796 毫米，和0. 818毫米，平均厚度為0. 786毫米且標(biāo)準(zhǔn)偏差為0. 034毫米。觀察到的探針爆破力為125牛頓、89. 2牛頓和98牛頓，平均為104. 1牛頓，標(biāo)準(zhǔn)偏差為18. 6牛頓。實施例2測試天然脂質(zhì)含量通常如實施例1所述獲得2批材料。通過機械刮擦、用100%異丙醇(IPA) (1 10 重量體積)三次處理進行化學(xué)脫脂，用過乙酸(PAA)溶液消毒，用高純水洗滌四次而加工腹壁組織片段。每一批由2片組成，總共測試四片。從每一片上切割四個4x7厘米的樣品， 得到每批8個樣品，總共16個樣品。將每個樣品稱重(初始重量)，滾動并置于具有10毫升100%乙醇的1.5毫升離心管中。將管置于管架(tube holder)中，并將該架置于旋轉(zhuǎn)搖動器的一側(cè)上，在室溫下大約24小時。在24小時之后，排掉乙醇，將10毫升100%丙酮置入每個管中。然后將該架放置回搖動器上，在室溫下大約24小時。在24小時之后，排掉丙酮，在通風(fēng)櫥中使樣品空氣干燥大約24小時。隨后將樣品干燥大約48小時并稱重(最終重量)。由初始重量減去最終重量并除以初始重量而計算得到脂質(zhì)含量。在材料中的平均測得脂質(zhì)含量測定為8. 4% 士6. 4%。實施例3測試天然透明質(zhì)酸含量通常如實施例1所述獲得2批材料。通過機械刮擦、用100%異丙醇(IPA) (1 10 重量體積)三次處理進行化學(xué)脫脂，用過乙酸(PAA)溶液消毒，用高純水洗滌四次而加工腹壁組織片段。每一批由2片組成，總共測試四片。從每一片上切割四個12毫米的盤狀樣品，得到每批8個樣品，總共16個樣品。將每個樣品稱重(初始重量)，滾動并置于具有450 微升無菌磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)和50微升蛋白酶K的1. 5毫升離心管中，在56°C下45分鐘。然后用組織研磨器粉碎樣品，每個樣品90秒。將具有樣品的管在4°C下在12000g下離心5分鐘以使得任何未消化的材料成粒。通過將10微升消化的樣品加入390微升PBS，接著通過渦流而得到上清液的1 40的稀釋。通過Corgenix HAELISA試劑盒(kits)根據(jù)制造商的指示測量透明質(zhì)酸含量。由樣品透明質(zhì)酸含量除以樣品初始重量而計算得到透明質(zhì)酸重量含量。在材料中的平均測得透明質(zhì)酸含量測定為13士24. 5微克/克。實施例4測試天然硫酸糖胺聚糖(sGAG)含量
通常如實施例1所述獲得2批材料。通過機械刮擦、用100%異丙醇(IPA) (1 10 重量體積)三次處理進行化學(xué)脫脂，用過乙酸(PAA)溶液消毒，用高純水洗滌四次而加工腹壁組織片段。每一批由2片組成，總共測試四片。從每一片上切割8個12毫米的盤狀樣品，得到每批16個樣品，總共32個樣品。將每個樣品稱重(初始重量)，滾動并置于具有 450微升無菌PBS和50微升蛋白酶K的1. 5毫升離心管中，在56°C下45分鐘。然后用組織研磨器粉碎樣品，每個樣品90秒。然后將具有樣品的管在15000rpm下離心10分鐘以使得任何未消化的材料成粒。使用Blyscan sGAG試驗分析32個樣品中的16個的sGAG含量。每個測試樣品由 90微升高純水和10微升樣品消化液組成。所有管進行渦流5秒，然后加入1. 0毫升Blyscan 染料試劑。所述管在室溫下培養(yǎng)30分鐘，并進行渦流4次，每個樣品5秒。然后在15000rpm 下旋轉(zhuǎn)每個樣品10分鐘，去除所得上清液。將每個顆粒再懸浮于1. 0毫升的來自Blyscan Assay試劑盒的解離試劑。所有樣品在攪拌下在37°C下培養(yǎng)1小時，進行渦流3次，每個管進行5秒渦流。將所得溶液的100微升小份(aliquots)制成一式三份并移液至96孔板的兩個孔中。取在656納米處的吸光度讀數(shù)。生成用于Blyscan sGAG試驗的GAG標(biāo)樣的標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用DMMB法分析剩余16個樣品的sGAG含量。將單獨的樣品置于1. 5毫升印pendorf離心管中，將180微升無菌PBS和20微升蛋白酶K溶液加入每個管中。樣品在間歇渦流下在56°C下消化15分鐘。使用20微克/毫升、50微克/毫升和100微克/毫升的在高純水中的提純肝素生成肝素標(biāo)準(zhǔn)曲線。將100微升小份的DMMB樣品制成一式三份并置于15毫升離心管中。將100微升小份的空白(高純水)和肝素標(biāo)準(zhǔn)一式三份，也置于15毫升離心管中。將2.5毫升DMMB 溶液加入每個管中。溶液進行渦流，將每個管的100微升小份等分至96孔板的孔中。取在 600納米處的吸光度讀數(shù)。生成肝素標(biāo)準(zhǔn)濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。自肝素標(biāo)準(zhǔn)曲線或GAG標(biāo)準(zhǔn)曲線計算sGAG濃度。由sGAG含量除以樣品重量確定 sGAG的重量含量。使用Blyscan試驗的平均測得sGAG含量為1656微克/克士3164微克/ 克。使用DMMB法的平均測得sGAG含量為1070微克/克士460微克/克。實施例5在通過各種方法加工的材料中測試天然可見核和天然脂質(zhì)含量通常如實施例1所述獲得4批材料。腹壁組織片段通過機械刮擦進行加工以去除致密脂肪組織層。每一批由2片組成，總共測試8片。將每個片切割為9個7x10厘米的樣品。來自每一批的一個樣品在攪拌下在5體積％水性乙醇溶液中的0. 2體積％過乙酸中進行化學(xué)加工2小時的時間(“PAA組”)，來自每一批的一個樣品通常如2008年6月5日的國際公開 No. W02008067085(Cook Biotech Incorporated)，公布的在 2007 年 10 月 23 日提交的國際申請No. PCT/US2007/082238的實施例13中所述進行化學(xué)加工(“ ‘085組”)。剩余28個樣品隨機分為兩組。如表1所示，第一組在異丙醇(IPA)和丙酮溶液中進行處理， 而第二組在氯仿和甲醇溶液中進行處理，從而導(dǎo)致天然脂質(zhì)水平的降低。表 權(quán)利要求
1.一種具有高彈性和強度的生物吸收性膠原和彈性細胞外基質(zhì)移植材料，其包含自豬類動物的腹壁分離的高伸展性細胞外基質(zhì)材料的分離的生物吸收性層，所述細胞外基質(zhì)材料包含膠原和彈性蛋白，并具有包括來自腹壁的漿膜下筋膜的天然層狀結(jié)構(gòu)，其中所述細胞外基質(zhì)材料基本上不含天然細胞，且進一步地，其中所述細胞外基質(zhì)材料具有至少一磅的斷裂拉伸強度和至少約50%的斷裂伸長。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的移植材料，其中所述細胞外基質(zhì)材料具有15重量％以下的脂質(zhì)含量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的移植材料，其中所述天然層狀結(jié)構(gòu)也包含來自腹壁的壁層腹膜。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的移植材料，其中所述材料用氧化消毒劑進行消毒。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的移植材料，其中所述氧化消毒劑包含過氧化合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的移植材料，其中所述過氧化合物為過酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的移植材料，其中所述過氧化合物為過乙酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的移植材料，其中所述層具有至少20厘米的長度和至少20厘米的寬度。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的移植材料，其中所述細胞外基質(zhì)材料不含F(xiàn)GF-2。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的移植材料，其中所述細胞外基質(zhì)材料包含透明質(zhì)酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的移植材料，其包含至少兩個彼此結(jié)合的所述層。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的移植材料，其還包含允許液體通過移植材料的穿孔。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的移植材料，其中所述片彼此脫水加熱結(jié)合。
14.根據(jù)任意前述權(quán)利要求所述的移植材料，其為脫水形式并在無菌條件下密封在包裝內(nèi)。
15.一種治療患者的方法，其包括將如權(quán)利要求1-13任一項所述的移植材料植入患者ο
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中進行所述植入以支撐患者的軟組織。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中進行所述植入以修復(fù)疝。
18.一種具有高彈性的細胞外基質(zhì)移植材料的制備方法，該方法包括提供自豬類動物的腹壁分離的組織片段，所述組織片段包含天然層結(jié)構(gòu)和粘附的漿膜下脂肪，所述天然層結(jié)構(gòu)至少包含來自腹壁的漿膜下筋膜；自組織片段機械去除漿膜下脂肪以制得包含漿膜下筋膜的組織膠原層； 用液體介質(zhì)處理組織膠原層以去除天然脂質(zhì)；以及將組織膠原層去細胞化；以及其中在所述處理和去細胞化之后，所述組織層具有至少1磅的斷裂拉伸強度和至少約 50%的斷裂伸長。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其還包括將組織膠原片浸入包含氧化消毒劑的溶液中。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述消毒劑包括過乙酸。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述溶液還包含乙醇。
22.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述方法還包括將組織膠原片殺菌。
23.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述液體介質(zhì)包括有機溶劑。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述有機溶劑為異丙醇。
25.根據(jù)權(quán)利要求18-24中任意項所述的方法，其還包括在所述處理和去細胞化之后干燥組織膠原片。
全文摘要
本發(fā)明描述了自動物腹壁分離并包含腹壁的漿膜下筋膜層的純化的細胞外基質(zhì)材料。這種醫(yī)學(xué)材料可在治療受損組織中以及在提供修復(fù)疝的組織支撐的某些方面發(fā)現(xiàn)用途。本發(fā)明也描述了相關(guān)的制造方法和用途。
文檔編號A61L27/50GK102176929SQ200980125052
公開日2011年9月7日 申請日期2009年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月1日
發(fā)明者B·沙阿, K·L·哈里根 申請人:庫克生物科技公司