專利名稱：用于組織工程和骨再生的結(jié)構(gòu)化多孔三斜磷鈣石的三維基質(zhì)及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及組織工程領(lǐng)域，具體而言，涉及骨再生領(lǐng)域。本發(fā)明涉及三斜磷鈣石的 多孔三維基質(zhì)一其是生物相容的、具有結(jié)構(gòu)化孔隙、被預(yù)定義、并且是可再吸收的，以及 涉及能夠生產(chǎn)所述材料的合成方法及其應(yīng)用。這些基質(zhì)是用于細(xì)胞定居和增殖的完美基 質(zhì)，由于其具有諸如生物相容性、再吸收性、骨誘導(dǎo)性、血管再形成等有利性質(zhì)，使得其能夠 應(yīng)用于組織工程和骨再生中。
背景技術(shù)：
骨質(zhì)量和品質(zhì)的損失是一個(gè)嚴(yán)重的健康問(wèn)題，在老年患者中更加常見。利用三維材料——最初在體外由祖細(xì)胞定居——在骨質(zhì)缺損的再生方面獲得的 成功很大程度上取決于所述材料的特性和結(jié)構(gòu)。近一個(gè)世紀(jì)以來(lái)，生物材料被用于修復(fù)或代替肌骨骼系統(tǒng)的骨段。應(yīng)用自體骨移植物(即來(lái)自個(gè)體本身)是用于充填骨腔以及用于手術(shù)重建術(shù)的廣 泛使用的方法。然而，骨供應(yīng)有限，并且患者必須經(jīng)受額外的創(chuàng)傷，以便得到移植物。另一 種選擇是供體同種異體移植物，其也具有缺陷，諸如新形成速度較慢，較低的成骨能力、再 吸收速度，較低的血管再形成，以及較高的致病體免疫源應(yīng)答和傳播風(fēng)險(xiǎn)。理想的是獲得類似于骨的材料，所述材料是生物相容的，不呈現(xiàn)不利的生物反應(yīng)， 并且是可再吸收的，以及隨著新組織形成能夠被逐漸降解，因此漸進(jìn)地將載荷傳遞給新骨， 避免用于將移植物移出的第二次外科手術(shù)。這樣的材料是理想的降解產(chǎn)物易于清除且無(wú) 毒，并具有骨誘導(dǎo)性，誘導(dǎo)骨組織形成。在生物體中，骨降解和再吸收通過(guò)破骨細(xì)胞進(jìn)行。該破骨細(xì)胞來(lái)自固定于骨表面 的單核細(xì)胞。固定后，它們開始向外部釋放質(zhì)子，目的是降低外部介質(zhì)的PH。由于這種酸性 環(huán)境，構(gòu)成骨的部分礦物成分的羥基磷灰石晶體被溶解。骨的羥基磷灰石被溶解為無(wú)定形 磷酸鈣顆粒，這些顆粒被巨噬細(xì)胞消滅，或者溶解為Ca2+和Po/—離子，這些離子蓄積在胞外 液中。這些離子向毛細(xì)血管擴(kuò)散，進(jìn)入體循環(huán)，經(jīng)過(guò)腎通過(guò)尿排出。這些被釋放的離子也可 以被成骨細(xì)胞再使用而形成新骨。破骨細(xì)胞通過(guò)酶作用過(guò)程也負(fù)責(zé)骨的有機(jī)相的降解。在用于骨修復(fù)的新型生物材料方面的研究嘗試盡可能多地減少對(duì)骨移植物的需 求，尋求人造替代物——其隨著時(shí)間被再吸收和/或與相鄰的骨結(jié)合，并且用作骨質(zhì)疏松性 骨折中的固定物。骨替代物的機(jī)械性能盡可能地類似于松質(zhì)骨替代物的機(jī)械性能。此外，所 述材料必須有助于骨折的穩(wěn)定性并且足夠耐受性以便減小必需的外部支持物或固定時(shí)間。 所述材料必須是可再吸收的、生物相容的、并且具有骨誘導(dǎo)性，即所述材料必須吸引間充質(zhì) 細(xì)胞和位于植入物附近的其他細(xì)胞類型并且有利于這些細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞，所述材料也 具骨傳導(dǎo)性，也就是說(shuō)，所述材料必須充當(dāng)新骨形成的模子。尋求與天然生物體的相似性，迄今為止，用于骨植入物的不可再吸收的材料正在 被可再吸收的材料取代。這些生物材料不干擾所形成的新骨的發(fā)育和生長(zhǎng)，因?yàn)樗鼈冎饾u被宿主組織取代。此外，它們具有更高的生物相容性，它們自然地參與骨再建，并且在骨再 生之后不必通過(guò)手術(shù)去除它們。這些材料必須保留足夠的時(shí)間以便恰當(dāng)?shù)墓窃偕靡园l(fā) 生，并且逐漸分解而不傷害患者以及不干涉骨的恰當(dāng)發(fā)育和生長(zhǎng)。形成礦物磷酸鈣的生物材料在骨再生領(lǐng)域中特別令人關(guān)注，因?yàn)樗鼈冾愃朴谔烊?骨的礦物相，并且由于其相對(duì)穩(wěn)的晶體結(jié)構(gòu)，其易進(jìn)行骨再建以及再吸收。被用作骨替代物的可再吸收材料包括磷酸鈣、羥基磷灰石(HAP)、磷酸三鈣 (β -TCP)和透鈣磷石二水合物(DCPDGtubbs等，2004 ；Schnettler等，2004)。這些材料由 于其與骨的礦物成分的化學(xué)的和晶質(zhì)的相似性而具有優(yōu)異的生物相容性，但是具有與體內(nèi) 可溶性和再吸收能力有關(guān)的困難。羥基磷灰石(HAP)是這些材料中的一種，已引起最大的關(guān)注。這種材料本身是 骨的無(wú)機(jī)相并且因此已經(jīng)被廣泛用在骨再生中。其實(shí)例是一些商業(yè)產(chǎn)品諸如Interpore 200 、Interpore 500 、Cerasorb⑧和Collagraft 然而，由于其具有最穩(wěn)定的晶體結(jié) 構(gòu)之一的事實(shí)，該材料再吸收緩慢。HAP是具有最高生物相容性的材料，因?yàn)槠涫桥c由骨形成的晶體形態(tài)最類似的材 料，但是其在體內(nèi)不是可再吸收的。該材料的降解通過(guò)與具有低PH的溶液接觸以及通過(guò)吞 噬作用發(fā)生。借助溶解，無(wú)定形磷酸鈣顆粒被釋放，并且其能夠被巨噬細(xì)胞通過(guò)吞噬作用消 除，或者被埋入所形成的新骨中。巨噬細(xì)胞可溶解這些顆粒并使Ca和P歸還于生物體的庫(kù) 中(Frayssinet等，1999 ；Benahmed等，1996)。然而，還沒有觀察到這些顆粒引起破骨細(xì)胞 激活(Frayssinet 等，1999)。所進(jìn)行的所有研究確證了該材料被植入生物體中之后的耐降解性，這是由于其在 生理性PH下的可溶性差。與被再吸收達(dá)85%的基于B-TCP的那些材料相比，在動(dòng)物體內(nèi)這 種類型的植入物在6個(gè)月內(nèi)被再吸收5. 4%。(Eggli等，1988)。在人體中，由Bi0-Oss(HAP)制造的植入物被認(rèn)為是不可再吸收的，原因在于所進(jìn) 行的研究表明，由于破骨細(xì)胞活性，對(duì)于它們被再吸收而言，3-6年之間是必需的(Taylor 等，200 。該種材料在生物體中存在如此長(zhǎng)的時(shí)間可干擾骨的再建過(guò)程，以及干擾骨整合 能力(Affe 等，2005 ；De Boever 2005)。因此，這種材料傳統(tǒng)上被用在含有機(jī)材料的混合物中作為聚合物以增加其再吸 收。這些應(yīng)用的實(shí)例如US5866155中所述，其描述了羥基磷灰石摻入聚乳酸基質(zhì)中，或如 US-A5741329所述，其是US5866155的變型，意圖糾正在將粘漿摻入生物體中后源自介質(zhì)的 局部酸化的幾種缺陷。為此目的，為了改進(jìn)磷酸鈣的再吸收能力以及增加其骨傳導(dǎo)能力，近年來(lái)已經(jīng)使 用了結(jié)晶磷酸鈣相，其與羥基磷灰石6相比穩(wěn)定性較差，諸如β -TCP和DCPD(透鈣磷石)， 其在體內(nèi)具有更好的可溶性和再吸收用。相比ΗΑΡ，β -TCP具有更多的骨傳導(dǎo)性和更好的再吸收作用(Franco等，2006)。其 被認(rèn)為是適度可再吸收的材料，在體內(nèi)研究中已經(jīng)觀察到，其在動(dòng)物中的再吸收需要至少 一年以及在人體中的再吸收至少需要6至8個(gè)月(Wiltfang等，2003 ;SiAa等，2004)。其降 解增加鈣沉積，并且這與較高的堿性磷酸酯酶活性相關(guān)，該酶參與骨形成(Trisi等，2003 ； Sugawara 等,2004)。DCPD也是生物相容的、骨傳導(dǎo)性的，并且由于在生理學(xué)pH下最可溶，其是最可再吸收的。這使得新骨更迅速的形成。其在生理環(huán)境中生物降解并且其被鄰近細(xì)胞再吸收 (Tris等，2003)。其證實(shí)在體內(nèi)再吸收比HAP和β -TCP快高達(dá)3倍(Herron等，2003 ；Chow 等，2003 ；Tas & Bhaduri 2004 ；Tamini 等，2006 ；)。研究表明部分DPDC材料在其植入之后可被轉(zhuǎn)化成HAP，其可使通過(guò)破骨細(xì)胞進(jìn)行 的植入物的消除延遲數(shù)周(Constanz等，1998)。這種轉(zhuǎn)化可使細(xì)胞酸化介質(zhì)，并使材料的 生物相容性減小以及其再吸收降低。Mg和Ca鹽(碳酸鈣)的添加或其與β-TCP的結(jié)合可 阻止這種轉(zhuǎn)化。使用這種材料觀察到，在介入后第四周O^llet等，2006)和第八周(Constanz等， 1998)之后，骨的生成和材料的消除以平衡的方式發(fā)生。這是重要的，原因在于如果降解大 于合成，將產(chǎn)生不穩(wěn)定性和炎性反應(yīng)。因此，在這些磷酸鈣中，透鈣磷石(DP⑶)是在骨再生上最受關(guān)注的材料之一。由 于其令人感興趣的性質(zhì)，目前存在針對(duì)原位定位設(shè)計(jì)的透鈣磷石粘漿。因此，例如，專利 US6733582和US2006213398要求保護(hù)具有原位定位的透鈣磷石粘菜，Chronoss Inject 是該類型的已經(jīng)上市的產(chǎn)品。然而，這種材料在滅菌時(shí)存在很大的問(wèn)題，原因在于當(dāng)其被加 熱時(shí)會(huì)分解，這使得適當(dāng)?shù)臏缇兊美щy?，F(xiàn)有技術(shù)考慮了與可被用作骨材料替代物的粘漿的滅菌相關(guān)的不同出版物， 以及有關(guān)用于制備所述基質(zhì)及其滅菌的方法的不同出版物。然而，如在日本專利申請(qǐng) JP2004018459所反映的，當(dāng)所述粘漿通過(guò)高壓滅菌器被滅菌時(shí)，所述粘漿的特性被改變，轉(zhuǎn) 變?yōu)楂@得這樣的骨礦物替代物，該骨礦物替代物在再吸收、穩(wěn)定性和定居及其他必要性質(zhì) 方面不滿足其在骨再生中應(yīng)用所必需的特性。如DPCD所發(fā)生的情況，三斜磷鈣石以類似的時(shí)間和方式在體內(nèi)被再吸收。其在包 圍植入物的細(xì)胞外組織中的生理學(xué)PH下逐漸被溶解，并且定居所述三斜磷鈣石的真正細(xì) 胞(上皮細(xì)胞、破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、巨噬細(xì)胞...)將負(fù)責(zé)在骨中所發(fā)生的其消除或其再使用。文件諸如美國(guó)申請(qǐng)US2006(^63443提出三斜磷鈣石——無(wú)水磷酸二鈣(DCPA)，其 通過(guò)透鈣磷石脫水、與其他磷酸鈣生物材料結(jié)合獲得。由于這種組合，滅菌結(jié)果對(duì)于在植入 物和骨再生中使用這些材料而言是不可接受的。另外，這些材料是反應(yīng)中間體并且不是具 有可被用于骨再生技術(shù)領(lǐng)域中的自身能力的結(jié)構(gòu)。另外，對(duì)于恰當(dāng)?shù)墓窃偕?，生物材料具有適當(dāng)?shù)目紫妒潜匦璧?，這允許細(xì)胞定 居和增殖、血管化作用、接觸面增加以及因此與宿主組織的相互作用的表面增加——其使 得骨再生加速。這些特性必須伴隨恰當(dāng)?shù)脑傥账俣?，此再吸收速度提供?xì)胞再生所需的 時(shí)間。因此，Gbureck, Uwe等，2007年，涉及通過(guò)三維印刷技術(shù)制備的透鈣磷石和三斜磷 鈣石植入物。為獲得所述植入物，首先獲得透鈣磷石的基質(zhì)，所述透鈣磷石被熱水脫水，轉(zhuǎn) 化成三斜磷鈣石。然而，所述文章的表2顯示，在所述文章中定義為三斜磷鈣石的磷酸鈣材 料僅具有63%的三斜磷鈣石含量，其沒有指定尺寸或其孔隙分布，具有非結(jié)構(gòu)化孔隙。因 此，所述結(jié)構(gòu)對(duì)于本發(fā)明的目的無(wú)效。US6605516提出具有受控的解剖學(xué)形狀的骨替代物，其精確地適于損傷的形態(tài)。所 述替代物通過(guò)化學(xué)聚合的磷酸鈣粘漿材料形成。該發(fā)明也涉及孔生(porogSnicas)相和模，通過(guò)使用所述模，能夠獲得具有大孔結(jié)構(gòu)和外部幾何形狀的磷酸鈣。然而，在其具體實(shí) 施方式中，該發(fā)明提出透鈣磷石材料，沒有提出三斜磷鈣石材料，并且其中所述呈現(xiàn)的大孔 結(jié)構(gòu)對(duì)于本發(fā)明的目的不是有效的。因此，本發(fā)明提供具有高度熱穩(wěn)定性——這允許通過(guò) 高壓滅菌法滅菌所述材料——的三斜磷鈣石基質(zhì)(三斜磷鈣石的亞穩(wěn)磷酸鈣相)，因此簡(jiǎn) 化了滅菌過(guò)程，并且由于其孔的特定結(jié)構(gòu)排列——該排列是材料的特定設(shè)計(jì)的結(jié)果，其涉 及由現(xiàn)有技術(shù)提出的材料的骨誘導(dǎo)能力的改進(jìn)，原因在于其以具有定義的結(jié)構(gòu)化大孔特征 的多孔塊體的形式合成，這增加了比表面積以及與成骨細(xì)胞接觸的面積，并且促進(jìn)了細(xì)胞 的養(yǎng)分轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，這是骨產(chǎn)生的決定性因素，所有這些還結(jié)合其在適宜的時(shí)間內(nèi)具有高再 吸收能力，以便相鄰細(xì)胞定居所述材料并能夠用生理骨基質(zhì)代替被再吸收的材料。本發(fā)明基質(zhì)的體外降解不影響細(xì)胞增殖，此外它們是生物活性的、無(wú)細(xì)胞毒性的、 非誘變?cè)吹囊约把合嗳莸摹?br>
發(fā)明內(nèi)容
為了使生物材料能夠產(chǎn)生穩(wěn)定的骨再生，植入?yún)^(qū)域的細(xì)胞、來(lái)自鄰近骨的成骨細(xì) 胞、來(lái)自骨髓的間充質(zhì)干細(xì)胞和來(lái)自體循環(huán)的內(nèi)皮細(xì)胞能夠同時(shí)和同質(zhì)地定居于生物材 料。隨著生物材料逐漸被再吸收以及新的血管系統(tǒng)的發(fā)育——這將提供新組織存活必需的 血液供給，這使新的生理學(xué)骨基質(zhì)能夠形成。與該方面相關(guān)的要考慮的一個(gè)重要性質(zhì)是孔隙，因?yàn)槠溆绊懮锝到饽芰?孔隙 程度越高，再吸收作用越好)和細(xì)胞定居。所述材料必須具有允許內(nèi)皮細(xì)胞定居(用于新 血管的形成)和骨細(xì)胞定居的孔徑和互相連接。此外，微孔和互相連接的性質(zhì)允許養(yǎng)分和 氣體的擴(kuò)散以及也允許細(xì)胞活動(dòng)的典型代謝產(chǎn)物的擴(kuò)散。骨不是致密材料，相反其具有彼 此互通的不同的孔隙。互連的孔的系統(tǒng)使密質(zhì)(皮質(zhì)的)骨與松質(zhì)骨相通(

圖16)?？紫?在從100-150 μ m(密質(zhì)骨中)到500-600 μ m(松質(zhì)骨中)的范圍內(nèi)。本發(fā)明提出新型組織工程系統(tǒng)，其意圖通過(guò)處理治愈策略而不是僅僅修復(fù)的策略 來(lái)再生骨結(jié)構(gòu)。所述再生應(yīng)用于骨質(zhì)疏松癥。組織工程被認(rèn)為是改進(jìn)、維持和修復(fù)器官和組織中的病理的學(xué)科?；诮M織工程 的系統(tǒng)的創(chuàng)造包括有活力的細(xì)胞、特別針對(duì)生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用設(shè)計(jì)的生物相容材料和在治療的 所有期間內(nèi)調(diào)節(jié)細(xì)胞活性的信號(hào)分子的結(jié)合。因此，本發(fā)明提供具有非隨機(jī)即有序或預(yù)定義孔隙的幾何形狀的基質(zhì)，其由三斜 磷鈣石形成，在該基質(zhì)的設(shè)計(jì)中，骨的孔隙已經(jīng)被考慮到，以便發(fā)生新血管形成和細(xì)胞定 居。所述材料以滅菌狀態(tài)呈現(xiàn)，隨時(shí)備用，且由于其特殊的設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)了特定的孔結(jié)構(gòu)排布， 即，先前確定的和誘導(dǎo)有序的孔隙的空間排布和空間構(gòu)型，與其他磷酸鈣(包括含三斜磷 鈣的其他磷酸鈣組合)相比，其骨誘導(dǎo)能力改進(jìn)。所述基質(zhì)以多孔塊體的形式獲得，所述多孔塊體由大孔隙、中孔隙和微孔隙特性 來(lái)限定，這些特性增加比表面積以及與成骨細(xì)胞的接觸面積，這促進(jìn)細(xì)胞的養(yǎng)分轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò) 程一其是骨生成的決定性因素。本發(fā)明的這些三斜磷鈣石基質(zhì)的設(shè)計(jì)已經(jīng)考慮到天然骨的特征性孔隙，這種孔隙 允許新血管形成和細(xì)胞定居。本發(fā)明的新基質(zhì)通過(guò)適合骨再生的生物材料三斜磷鈣石形成，三斜磷鈣石是一種脫水DP⑶(DPC)。所述基質(zhì)由至少95% 士5%三斜磷鈣石形成，優(yōu)選由95%三斜磷鈣石形 成，更優(yōu)選由100%三斜磷鈣石形成。材料的痕量對(duì)應(yīng)于β-磷酸四鈣。該材料的體外降解 不影響細(xì)胞增殖，并且此外其是生物活性的、無(wú)細(xì)胞毒性的、非誘變?cè)吹囊约把合嗳莸模?如實(shí)施例4所示。由于它們的設(shè)計(jì)和組成，本發(fā)明的基質(zhì)在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間期間內(nèi)被再吸收，以便鄰近 的細(xì)胞定居所述材料并能夠用生理骨基質(zhì)代替被再吸收的材料?；|(zhì)涉及在骨再生中有用的任何三維結(jié)構(gòu)，其允許細(xì)胞生長(zhǎng)以及侵入它的細(xì)胞的增殖。細(xì)胞被理解為-成人間充質(zhì)干細(xì)胞，優(yōu)選源自脂肪組織，但是它們也可來(lái)自骨髓或者已經(jīng)證明是 這些細(xì)胞源的任何其他位置。這些細(xì)胞可被用于分化為成骨細(xì)胞或內(nèi)皮系。-從骨片獲得的成骨細(xì)胞。-內(nèi)皮細(xì)胞。-成人間充質(zhì)干細(xì)胞的組合，其是未分化的或分化的成骨細(xì)胞或內(nèi)皮系、成骨細(xì) 胞、破骨細(xì)胞、來(lái)自骨的骨細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。大孔當(dāng)孔具有大于或等于100微米的直徑時(shí)為大孔。中孔當(dāng)孔具有小于100微米但大于或等于10微米的直徑時(shí)為中孔。微孔當(dāng)孔具有小于10微米的直徑時(shí)為大孔。無(wú)定形基質(zhì)具有隨機(jī)的、非有序的和非預(yù)定義的孔隙的基質(zhì)，其不遵從有序的、 預(yù)先確定的孔隙的空間分布和空間構(gòu)型，無(wú)論所述孔隙是天然的(材料固有的)還是被誘 導(dǎo)的。結(jié)構(gòu)化基質(zhì)或具有結(jié)構(gòu)化孔隙的基質(zhì)具有非隨機(jī)的、有序的或預(yù)先確定的孔隙 的基質(zhì)，其具有先前確定的且誘導(dǎo)的有序孔隙的空間分布和空間構(gòu)型。本發(fā)明的基質(zhì)是具 有結(jié)構(gòu)化孔隙、具有預(yù)定義孔隙的基質(zhì)，這樣的孔隙賦予所述基質(zhì)一系列理想性質(zhì)，以便它 們用于骨再生中。骨誘導(dǎo)通過(guò)添附至所述材料的骨的新形成作用，形成具有成骨細(xì)胞活性的細(xì)胞 增殖的骨架，形成新骨。所述骨誘導(dǎo)是刺激成骨作用的行為或過(guò)程。成骨作用骨組織的產(chǎn)生或發(fā)育，經(jīng)過(guò)間充質(zhì)細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞。骨再生新骨的形成，該新骨在再建過(guò)程之后與預(yù)先存在的骨相同。在骨再生中， 產(chǎn)生反應(yīng)，在該反應(yīng)中涉及到血管、細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)。本發(fā)明的生物材料可應(yīng)用于組織工 程和骨再生，并且因此可用于下述骨病理學(xué)的治療肥大或非肥大假關(guān)節(jié)骨壞死骨質(zhì)疏松癥在去除假體、切除腫瘤之后由生物化學(xué)和代謝性疾病或先天性疾病引起的骨質(zhì)缺 損損傷和創(chuàng)傷的治療骨折的治療必須涉及修復(fù)骨組織的任何病理學(xué)
頌面骨質(zhì)缺損的治療應(yīng)用牙植入物之前的骨質(zhì)增大。細(xì)胞定居細(xì)胞在生物材料上擴(kuò)展的能力，即細(xì)胞能夠增殖并增加細(xì)胞群，直到侵 入整個(gè)基質(zhì)的能力。對(duì)定居基質(zhì)的能力的量度是分析隨時(shí)間在生物材料上的細(xì)胞數(shù)目(增 殖圖的數(shù)據(jù))。細(xì)胞粘附細(xì)胞與其他細(xì)胞或基質(zhì)結(jié)合的能力。粘附可通過(guò)特定的相互作用，諸如 靜電力發(fā)生并且由通過(guò)稱為粘附分子的特定蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)。粘附生物材料的能力可通過(guò)在顯 微鏡下觀察在生物材料上排列的細(xì)胞進(jìn)行分析。細(xì)胞與生物材料之間的接觸面將是細(xì)胞對(duì) 該生物材料的親和力的典型量度。在第一方面，本發(fā)明涉及由多孔三斜磷鈣石形成的具有結(jié)構(gòu)化孔隙的生物相容 性三維基質(zhì)(在下文中稱為本發(fā)明的基質(zhì))，其包含具有結(jié)構(gòu)化孔隙的三斜磷鈣石的三 維基質(zhì)，所述結(jié)構(gòu)化孔隙對(duì)應(yīng)直徑在350-650 μ m之間的圓柱形大孔，彼此均勻地間隔 0. 4-0. 6mm。所述三斜磷鈣石具有內(nèi)在的材料孔隙，在該內(nèi)在的材料孔隙上所指示的結(jié)構(gòu)化 大孔隙被誘導(dǎo)。在本發(fā)明的基質(zhì)中，結(jié)構(gòu)化孔隙在基質(zhì)的最大區(qū)域內(nèi)分布，這使得所述基質(zhì)穩(wěn)定 地維持其機(jī)械穩(wěn)定性。在具體的實(shí)施方式中，所述最大區(qū)域是在消除基質(zhì)的外部周邊區(qū)域 之后剩余的區(qū)域，所述周邊區(qū)域?qū)挾确秶?. 1至0. 9mm之間，優(yōu)選寬度為0. 5mm。因此，用于成骨作用的材料必須模仿骨的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能以在宿主細(xì)胞中實(shí)現(xiàn) 恰當(dāng)?shù)慕Y(jié)合。業(yè)已證明，由孔隙確定的結(jié)構(gòu)和在骨再生中使用的材料的孔徑在體外和體內(nèi)都影 響骨形成?？讓?duì)發(fā)生骨組織形成是必要的，原因在于它們?cè)试S成骨細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞的遷 移和增殖并且也允許血管化作用。因此，本發(fā)明的材料由于其孔隙特性，提供實(shí)現(xiàn)恰當(dāng)?shù)墓?再生必需的條件，所述孔隙特性允許對(duì)于骨再生這樣的效果所必需的細(xì)胞類型的定居和增殖。利用其他材料的基質(zhì)進(jìn)行的體外結(jié)果顯示，低孔隙率刺激成骨作用，原因在于發(fā) 生細(xì)胞集合，其通過(guò)刺激成骨作用而抑制增殖。這些相同的實(shí)驗(yàn)顯示，高孔隙率不影響細(xì) 胞粘附但是的確增加增殖，原因在于接觸面的增加，并且氧氣和養(yǎng)分的運(yùn)輸也得以促進(jìn) (Takahashi等，2004年)。根據(jù)這些結(jié)果，成骨作用不受孔大小的影響，但是在低孔數(shù)目的 情況下，成骨作用的確增加。另外，在體內(nèi)，細(xì)胞在材料中的結(jié)合和滲透以及其血管化作用對(duì)其被結(jié)合到個(gè)體 的組織而言是必需的。高孔隙和孔大小，諸如由本發(fā)明基質(zhì)提供的那些孔和孔大小有利于 這些要求。最初，根據(jù)首次研究，對(duì)于要進(jìn)行的細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程而言，骨形成所需的最小 孔直徑被認(rèn)為是約ΙΟΟμπι。然而，目前提出大于300μπι的直徑，原因在于這些大孔的存在 增加骨形成，這是由于它們?cè)试S毛細(xì)管在其中形成這樣的事實(shí)。血管化作用影響成骨作用 的發(fā)展。具有小直徑的孔有利于低氧性條件，并且不誘導(dǎo)成骨作用而是誘導(dǎo)軟骨形成。因此，本發(fā)明基質(zhì)的長(zhǎng)且大的通道形孔允許其血管化作用以及成骨作用的發(fā)展。此外，具有大直徑的孔增加接觸面，這也增加與宿主組織相互作用的表面，這將加 速通過(guò)巨噬細(xì)胞進(jìn)行的降解。
在具有隨機(jī)孔隙的幾何形狀的無(wú)定形基質(zhì)的情況中，可以形成的血管網(wǎng)絡(luò)在生物 材料的結(jié)構(gòu)中是不規(guī)則的，并且將不能與骨的血管網(wǎng)絡(luò)連接，這樣植入物將不能與受體的 組織有效結(jié)合。然而，本發(fā)明的基質(zhì)采用的孔隙結(jié)構(gòu)考慮引入具有合適大小的孔，以實(shí)現(xiàn)必需細(xì) 胞種類的共存和在整個(gè)植入物中骨和血管框架的形成，此外實(shí)現(xiàn)與被允許的受體區(qū)域的連 接，以便能發(fā)生組織結(jié)合。新設(shè)計(jì)引入完全貫穿材料結(jié)構(gòu)的圓柱形(通道形)大孔，直徑350_650μπι，用于相 鄰組織的細(xì)胞的適當(dāng)?shù)募?xì)胞定居(就不同的細(xì)胞類型以及足夠數(shù)目的每種細(xì)胞類型而言) 以及與受體組織的結(jié)合。此外，在整個(gè)結(jié)構(gòu)中，其含有微孔網(wǎng)絡(luò)，用于養(yǎng)分、氣體和細(xì)胞代謝 廢物的充分?jǐn)U散。如在圖13中可觀察到的，就本發(fā)明基質(zhì)在細(xì)胞定居方面的優(yōu)勢(shì)可顯示于在掃描 電子顯微鏡下觀察的直接細(xì)胞研究中。然而，如在圖14中所示，在獲得本發(fā)明的粘漿的過(guò) 程中產(chǎn)生的無(wú)定形生物材料(顯示非結(jié)構(gòu)化的且非預(yù)定義的大孔分布)具有不與內(nèi)部結(jié)構(gòu) 連接的孔。換言之，大孔的數(shù)目不足，并且它們的分布不適合細(xì)胞的適當(dāng)定居，這些細(xì)胞大 部分轉(zhuǎn)移到材料的表面。在形成新骨的過(guò)程中的成功與參與該過(guò)程以及參與整個(gè)生物材料內(nèi)一致性血管 網(wǎng)絡(luò)形成的骨形成細(xì)胞的量直接相關(guān)。因此，如圖14所示，本發(fā)明的具有結(jié)構(gòu)化孔隙的材 料基質(zhì)(其具有有序的、誘導(dǎo)的和預(yù)先確定的大孔的空間分布和空間構(gòu)型)，允許細(xì)胞在整 個(gè)生物材料內(nèi)廣泛定居，養(yǎng)分和信號(hào)分子能夠更大程度擴(kuò)散——這將決定細(xì)胞行為。因此，本發(fā)明的基質(zhì)，具有高的孔隙百分比，特別是高的大孔隙百分比，在該基質(zhì) 中存在具有大直徑(> 300 μ m，特別是在350至650 μ m之間，優(yōu)選為500士60 μ m)且為連 續(xù)通道形式的孔，所述基質(zhì)將增加手術(shù)后植入物的骨整合。在第二方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明基質(zhì)的合成方法，其包括形成具有結(jié)構(gòu)化孔隙的 三斜磷鈣石的基質(zhì)，包括在酸性磷酸鈣與堿性磷酸鈣之間的固化反應(yīng)過(guò)程中，通過(guò)組合使用孔誘導(dǎo)劑、緩 凝劑和機(jī)械方法，形成固相，其對(duì)應(yīng)于透鈣磷石的多孔基質(zhì)。-使該固相與蒸餾水混合，產(chǎn)生液相。-在固化過(guò)程中將一個(gè)或多個(gè)模施用于步驟2中獲得的粘漿中，所述模之一具有 圓柱狀沖孔，其直徑在350 μ m至650 μ m之間，更優(yōu)選為500 μ m士60 μ m,以在基質(zhì)中產(chǎn)生直 徑在350至650 μ m之間、更優(yōu)選為500 μ m士60 μ m的垂直圓柱形孔，所述圓柱形孔的間隔 距離在0. 4-0. 6mm之間，更優(yōu)選間隔距離為0. 5mm士60 μ m。滅菌所述多孔透鈣磷石并將其熱轉(zhuǎn)化為多孔三斜磷鈣石。具體而言，在所使用的合成方法中，在步驟1中得到的產(chǎn)物產(chǎn)生固相，其與蒸餾水 混合產(chǎn)生液相。作為優(yōu)選的實(shí)施方式，本發(fā)明提出使用β-磷酸三鈣作為堿性磷酸鈣，以及 使用單磷酸鈣作為酸性磷酸鹽。根據(jù)本發(fā)明，為進(jìn)行混合，堿性磷酸鹽/酸性磷酸鹽的摩爾比是1. 6-1. 8，時(shí)間為 約10分鐘，孔誘導(dǎo)劑的濃度是l-20wt%，緩凝劑的濃度在0. 4-0. 6wt%之間；優(yōu)選地，堿 性磷酸鹽/酸性磷酸鹽的摩爾比為1. 785，孔誘導(dǎo)劑的濃度是3-lOwt %，緩凝劑的濃度是 0. 54wt%。
堿性磷酸鹽/酸性磷酸鹽進(jìn)行混合的摩爾比是1. 6-1. 8，優(yōu)選1. 785，混合時(shí)間為 約10分鐘。碳酸鈣以l-20wt%之間、優(yōu)選3-10wt%之間的濃度添加。作為固化反應(yīng)的緩 凝劑，本發(fā)明提出使用焦磷酸鈉，其比例為0. 4-0. 6wt%,0. 為優(yōu)先選擇。使因此獲得的此種固相與液相(蒸餾水)以3的粉末/液體(P/L)比率混合。關(guān)于本發(fā)明中使用的酸性和堿性磷酸鈣、孔誘導(dǎo)劑和緩凝劑，本領(lǐng)域技術(shù)人員知 曉待使用的不同的可能化合物以及組合。所得到的膏體填充模，所述模允許獲得本發(fā)明的基質(zhì)，其具有上面指出的孔的結(jié) 構(gòu)化分布。用于形成生物材料的本發(fā)明所述的模涉及具有圓柱形沖孔的任何模，所述圓柱形 沖孔的底部具有350與650μπι之間的直徑，所述圓柱形沖孔彼此間隔0. 4與0. 6mm之間。 所述模可以由硅酮、金屬、耐受性塑料材料或允許該模用于其應(yīng)用中的任何類型的材料進(jìn) 行構(gòu)建。所述?？删哂腥魏纹谕男螤睿@取決于修復(fù)每位患者的特定骨質(zhì)缺損所需 的形狀和尺寸，除生物材料的內(nèi)在孔隙之外，所得到的生物材料始終保持本發(fā)明的生物 材料的典型孔隙特征，即直徑在350μπι與650μπι之間的圓柱形大孔，更優(yōu)選直徑為 500 μ m士60 μ m，所述大孔彼此均勻地間隔0. 4mm與0. 6mm之間，更優(yōu)選間隔0. 5mm士60 μ m。所述模允許獲得本發(fā)明的基質(zhì)，在該基質(zhì)中，結(jié)構(gòu)化孔隙分布在基質(zhì)的最大區(qū)域 中，這使得所述基質(zhì)穩(wěn)定地保持其機(jī)械穩(wěn)定性。在具體的實(shí)施方式中，所述模允許獲得這樣的基質(zhì)，其中分布有結(jié)構(gòu)化孔隙的最 大區(qū)域是除去基質(zhì)的周邊區(qū)域之后剩余的區(qū)域，周邊區(qū)域的寬度在0. 1與0. 9mm之間，優(yōu)選 寬度為0. 5mmο本發(fā)明也考慮使用一種以上的模-第一種模，其能夠獲得期望形狀的三斜磷鈣石基質(zhì)但是沒有結(jié)構(gòu)化孔隙。-第二種模，其在平面表面上具有圓柱形沖孔，所述圓柱形沖孔的直徑在350μ m 與650 μ m之間，優(yōu)選500 μ m士60 μ m,并且所述圓柱形沖孔彼此間隔0. 4mm與0. 6mm之間， 優(yōu)選500 μ m士60 μ m。所述第二種模必須在移走第一種模之后應(yīng)用，將用第一種模獲得的部 分引入所述第二種模中。第二種模覆蓋有蓋，如圖Ic所示。因此，本發(fā)明的生物材料可以以顆粒狀物、片、圓柱體等形式以及以對(duì)修復(fù)患者的 特定骨質(zhì)缺損有用的任何其他形式呈現(xiàn)。在本發(fā)明的優(yōu)選方面，所述模是顆粒狀物或圓柱體的形式，其直徑在2mm與50mm 之間，優(yōu)選在2mm與15mm之間，其高度在Imm與50mm之間，優(yōu)選在Imm與5mm之間，以及更 優(yōu)選-所述圓柱體直徑為10mm，高度為3至5mm，優(yōu)選3或5mm，具有64個(gè)沖孔，或-所述圓柱體直徑為8mm，高度為3至5mm，優(yōu)選3或5mm，具有39個(gè)沖孔，或-所述圓柱體直徑為7mm，高度為3至5mm，優(yōu)選3或5mm，具有28個(gè)沖孔，或-所述圓柱體直徑為5mm，高度為3mm，具有12個(gè)沖孔，在所有情況中，沖孔是圓柱形的，直徑為500 μ m士60 μ m，彼此間隔 500 μ m士60 μ m,并且相對(duì)于沒有沖孔的5mm(從顆粒狀物的邊緣處量取)的周邊區(qū)域分布。
在粘漿開始固化之后一分鐘，在其凝固結(jié)束之前將粘漿置于模中約30分鐘，將其 取出，由模所確定的孔已經(jīng)形成。一旦其已經(jīng)完全固化，使所形成的透鈣磷石基質(zhì)在120與 130°C之間進(jìn)行高壓滅菌M-25分鐘，其轉(zhuǎn)化為三斜磷鈣石，使其完全滅菌并適于使用。在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的方面，第一種模由硅酮制備，并且具有適于要被制造的本 發(fā)明基質(zhì)大小的顆粒狀物或圓柱體的腔。在具體實(shí)施方式
中，所述腔具有2mm與50mm之間 的、優(yōu)選2mm與15mm之間的直徑，以及Imm與50mm之間的、優(yōu)選Imm與5mm之間的高度，并 且更優(yōu)選-所述腔直徑為10mm，高度為3mm至5mm，優(yōu)選mm3或5mm，-所述腔直徑為8mm，高度為3mm至5mm，優(yōu)選3mm或5mm，-所述腔直徑為7mm，高度為3mm至5mm，優(yōu)選3mm或5mm，-所述腔直徑為5mm，高度為3mm。上述第一種模不參與大孔的形成。在本發(fā)明的這個(gè)方面，第二種模是金屬的，其具有先前部分中每一個(gè)的尺寸，并且 在其底部，其具有均勻分布的500 μ m士60 μ m圓柱形沖孔，它們彼此間隔500 μ m士60 μ m, 所述沖孔產(chǎn)生基質(zhì)的大孔組成部分，且其相對(duì)于沒有沖孔的0. 5mm(從顆粒狀物的邊緣處 量取)的最小周邊區(qū)域分布。在具體的實(shí)施方式中，所述金屬模有2mm與50mm之間的、優(yōu) 選2與15mm之間的直徑，以及1與50mm之間的、優(yōu)選1與5mm之間的高度，并且更優(yōu)選-所述金屬模直徑為10mm，高度為3mm至5mm，優(yōu)選3mm或5mm，64個(gè)沖孔，或-所述金屬模直徑為8mm，高度為3mm至5mm，優(yōu)選3mm或5mm，39個(gè)沖孔，或-所述金屬模直徑為7mm，高度為3mm至5mm，優(yōu)選3mm或5mm，28個(gè)沖孔，或-所述金屬模直徑為5mm，高度為3mm，12個(gè)沖孔，在所有情況相對(duì)于沒有沖孔的0. 5mm(從顆粒狀物的邊緣處量取)的最小周邊區(qū)域。在這種情況下，該過(guò)程與前面的過(guò)程相同，其不同之處在于在混合固相和液相之 后，立刻填充第一硅酮模。在生物材料結(jié)束其固化之前，將該部分從硅酮模中移出。所述部 分隨后被加入具有沖孔的金屬模中(用根據(jù)圖Ic的金屬蓋覆蓋)，直到固化在37°C水浴中 30分鐘后結(jié)束。凝固后，將它們從金屬模中移出，得到具有確定的孔隙的圓柱形部分。所形 成的基質(zhì)在120與130°C之間進(jìn)行高壓滅菌M-25分鐘，它們轉(zhuǎn)化為三斜磷鈣石，使其完全 滅菌并適于使用。使用這些模產(chǎn)生具有結(jié)構(gòu)化孔隙的三斜磷鈣石顆粒狀物。在具體的實(shí)施 方式中，所述顆粒狀物直徑為2mm與50mm之間，優(yōu)選2mm與15mm之間，以及高度為Imm與 50mm之間，優(yōu)選Imm與5mm之間，并且更優(yōu)選-所述顆粒狀物具有IOmm的直徑，3mm至5mm的高度，優(yōu)選3mm或5mm，還具有均勻 分布的64個(gè)大孔，所述大孔的直徑為500 μ m士60 μ m，彼此間隔500 μ m士60 μ m。-所述顆粒狀物具有8mm的直徑，3mm至5mm的高度，優(yōu)選3mm或5mm，還具有39個(gè) 大孔，所述大孔直徑為500 μ m士60 μ m，彼此間隔500 μ m士60 μ m。-所述顆粒狀物具有7mm的直徑，3mm至5mm的高度，優(yōu)選3mm或5mm，還具有28個(gè) 大孔，所述大孔直徑為500 μ m士60 μ m，彼此間隔500 μ m士60 μ m。-所述顆粒狀物具有0.5mm的直徑，0. 3mm的高度，還具有12個(gè)大孔，所述大孔直 徑為 500 μ m士60 μ m，彼此間隔 500 μ m士60 μ m。
在所有情況中，三斜磷鈣石顆粒狀物具有0. 5mm (從顆粒狀物的邊緣處量取)沒有 大孔的最小周邊區(qū)域，這使得它們保持在其應(yīng)用中所必需使用的機(jī)械穩(wěn)定性和強(qiáng)度條件。因此，在所述顆粒狀物中大孔的最終分布與沒有大孔的0. 5mm最小周邊區(qū)域以及 孔之間的大小和距離相關(guān)(如上所述)。本發(fā)明的產(chǎn)物可應(yīng)用于組織工程和骨再生領(lǐng)域。因此，通過(guò)定義的模獲得的本發(fā) 明的三斜磷鈣石基質(zhì)能夠用于細(xì)胞支持和生長(zhǎng)以及上面定義的應(yīng)用。在具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明的顆粒狀物以若干單元的形式應(yīng)用(作為若干部分 的組件)，對(duì)其進(jìn)行設(shè)置使得它們完全適應(yīng)骨質(zhì)缺損的空間，這便于養(yǎng)分、氣體和細(xì)胞均勻 進(jìn)入待被修復(fù)的整個(gè)空間中，由于所述設(shè)置促進(jìn)待被修復(fù)的空間得以恢復(fù)以及防止出現(xiàn)壞 死區(qū)。在優(yōu)選的方面，本發(fā)明涉及發(fā)明所述基質(zhì)用作間充質(zhì)細(xì)胞(包括脂肪源等不同來(lái) 源的)、成骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及成人間充質(zhì)干細(xì)胞組合的生長(zhǎng)支持的用途，以便這些細(xì)胞 用于骨再生中，所述成人間充質(zhì)干細(xì)胞組合是未分化的，或已分化為成骨細(xì)胞系或內(nèi)皮細(xì) 胞系、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、來(lái)自骨的骨細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞。相對(duì)于DCPD，本發(fā)明的具有結(jié)構(gòu)化孔隙的三斜磷鈣石基質(zhì)以較長(zhǎng)的時(shí)間和以類似 的方式在體內(nèi)被再吸收，這防止了它們轉(zhuǎn)化為HA的缺陷(如通過(guò)實(shí)施例10所示，其比較了 本發(fā)明的具有結(jié)構(gòu)化孔隙的基質(zhì)與以本發(fā)明基質(zhì)的結(jié)構(gòu)化孔隙制成的透鈣磷石基質(zhì))。因 此，所述基質(zhì)在生理學(xué)PH下將逐漸溶解在包圍植入物的細(xì)胞外組織中，并且定居于其中的
真正細(xì)胞(內(nèi)皮細(xì)胞、破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、巨噬細(xì)胞......)將負(fù)責(zé)所述基質(zhì)的消除或再
使用，如在骨中所發(fā)生的。此外，在獲得它們的過(guò)程中它們與碳酸鈣的結(jié)合將防止它們轉(zhuǎn)化 為 HAP。如在DP⑶的情況下所發(fā)生的，其再吸收開始于第四周與第八周之間，這是適合相 鄰細(xì)胞定居所述材料并且能夠用生理骨基質(zhì)代替再吸收材料的時(shí)間期間。其生物降解能力 適應(yīng)在生物體中發(fā)生的情況，其中缺損的骨的生長(zhǎng)能夠在2個(gè)月到6個(gè)月之間的期間內(nèi)發(fā) 生，這取決于骨的類型和缺損的大小(Francone V. 2004)。除生物降解能力之外，在基質(zhì)的研究中已經(jīng)考慮到其它性質(zhì)諸如本發(fā)明材料的粗 糙度和紋理。因此，根據(jù)在本發(fā)明的具有結(jié)構(gòu)化大孔隙的多孔三斜磷鈣石基質(zhì)上進(jìn)行的生 物學(xué)試驗(yàn)，展示了大于95%的與材料的粘附，其中細(xì)胞在與材料接觸時(shí)不改變其形態(tài)并且 定居于整個(gè)表面，如在任何功能性組織中一樣彼此相通。必須要考慮到，相對(duì)于松質(zhì)骨的抗性和彈性(彈性50_100MPa，壓力5_10MPa)，三 斜磷鈣石可顯示非常低的抗性和彈性。然而，等于骨的機(jī)械性能幾乎是不可能的。已經(jīng)證 明的是對(duì)于所述材料而言，其已經(jīng)達(dá)到足以支持細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)械性能，因?yàn)楫?dāng)細(xì)胞侵入材 料時(shí)，所述材料形成植入物的有機(jī)相并且機(jī)械性能將改善。本發(fā)明的多孔三斜磷鈣石的基 質(zhì)滿足這種要求。三斜磷鈣石材料是可再吸收的、生物活性的，并且具有類似于骨的特性。這種材料 允許在其表面和在其內(nèi)部的細(xì)胞生長(zhǎng)，一旦在骨質(zhì)缺損之中，其將允許細(xì)胞(內(nèi)皮細(xì)胞、成
骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞......)形成與健康骨相連的必需支架。隨后，由于破骨細(xì)胞的作用，三
斜磷鈣石將逐漸地一點(diǎn)點(diǎn)地被消除，而不經(jīng)歷轉(zhuǎn)化成羥基磷灰石，并且成骨細(xì)胞將逐漸合 成新的礦物相，其將逐漸取代三斜磷鈣石，完全消除最初的缺損。
因此，本發(fā)明的第一個(gè)目的涉及具有結(jié)構(gòu)化孔隙的三斜磷鈣石的三維基質(zhì)，其特 征在于，在其結(jié)構(gòu)內(nèi)具有直徑在350與650 μ m之間的垂直的圓柱形大孔，所述大孔其從一 端到另一端縱向穿過(guò)所述基質(zhì)，每個(gè)大孔之間存在0. 4-0. 6mm的距離。在具體的實(shí)施方式 中，大孔的直徑優(yōu)選為500 μ m士60 μ m。在另一具體實(shí)施方式
中，大孔之間的距離優(yōu)選為 500 μ m士60 μ m。本發(fā)明的另一目的涉及具有結(jié)構(gòu)化孔隙的三斜磷鈣石基質(zhì)，其三斜磷鈣石含量為 至少90 %，優(yōu)選為95 %以及更優(yōu)選為100 %。本發(fā)明的下述主題由具有結(jié)構(gòu)化孔隙的三斜磷鈣石基質(zhì)形成，所述基質(zhì)特征在于 通過(guò)對(duì)前體材料進(jìn)行熱轉(zhuǎn)化獲得。在具體的實(shí)施方式中，被熱轉(zhuǎn)化成三斜磷鈣石的所述前 體材料由固相混合物組成，所述固相由堿性磷酸鈣、酸性磷酸鈣、孔誘導(dǎo)劑和緩凝劑形成， 所述固相通過(guò)添加蒸餾水進(jìn)行固化。在另一具體實(shí)施方式
中，堿性磷酸鹽/酸性磷酸鹽的 摩爾比是1. 6-1. 8，孔誘導(dǎo)劑的濃度是l-20wt%，緩凝劑的濃度在0. 4-0. 6wt%之間，并且 (P/L)比為3。在另一具體實(shí)施方式
中，堿性磷酸鹽/酸性磷酸鹽的摩爾比是1.785，孔誘導(dǎo) 劑的濃度是3-10wt%，緩凝劑的濃度是034%。在另一具體實(shí)施方式
中，酸性磷酸鈣是磷 酸一鈣，堿性磷酸鈣是磷酸三鈣，孔誘導(dǎo)劑是碳酸鈣，緩凝劑是焦磷酸鈉。在另一具體 實(shí)施方式中，前體材料是透鈣磷石。本發(fā)明的另一目的由根據(jù)前述權(quán)利要求所述的具有結(jié)構(gòu)化孔隙的三斜磷鈣石的 三維基質(zhì)形成，其特征在于，所述基質(zhì)可以采用修復(fù)具體骨或組織缺損所需的任何類型的 形狀。在具體的實(shí)施方式中，所述基質(zhì)由底部直徑在2與50mm之間以及高度在1與50mm 之間的圓柱體構(gòu)成。在另一具體實(shí)施方式
中，所述圓柱體的底部直徑在2與15mm之間，高 度在1與5mm之間。在另一具體實(shí)施方式
中，所述圓柱體具有0. 5mm無(wú)大孔的最小周邊區(qū) 域。在其它具體的實(shí)施方式中，所述圓柱體具有-IOmm的直徑，5mm的高度，以及直徑為500 μ m士60 μ m的64個(gè)圓柱形大孔，所述 大孔彼此均勻的間隔500mm士60 μ m,并縱向穿過(guò)所述基質(zhì)，-IOmm的直徑，3mm的高度，以及直徑為500 μ m士60 μ m的64個(gè)圓柱形大孔，所述 大孔彼此均勻的間隔500 μ m士60 μ m,并縱向穿過(guò)所述基質(zhì)，-8mm的直徑，5mm的高度，以及直徑為500 μ m士 60 μ m的39個(gè)圓柱形大孔，所述大 孔彼此均勻的間隔500 μ m士60 μ m,并縱向穿過(guò)所述基質(zhì)，-8mm的直徑，3mm的高度，以及直徑為500 μ m士 60 μ m的39個(gè)圓柱形大孔，所述大 孔彼此均勻的間隔500 μ m士60 μ m,并縱向穿過(guò)所述基質(zhì)，-7mm的直徑，5mm的高度，以及直徑為500 μ m士 60 μ m的28個(gè)圓柱形大孔，所述大 孔彼此均勻的間隔500 μ m士60 μ m,并縱向穿過(guò)所述基質(zhì)，-7mm的直徑，3mm的高度，以及直徑為500 μ m士 60 μ m的28個(gè)圓柱形大孔，所述大 孔彼此均勻的間隔500 μ m士60 μ m,并縱向穿過(guò)所述基質(zhì)，-5mm的直徑，3mm的高度，以及直徑為500 μ m士 60 μ m的12個(gè)圓柱形大孔，所述大 孔彼此均勻的間隔500 μ m士60 μ m,并縱向穿過(guò)所述基質(zhì)，在所有這些圓柱體中，所述大孔的分布相對(duì)于自所述圓柱體的邊緣朝向其中心的 0. 5mm的周邊區(qū)域，該區(qū)域沒有大孔。本發(fā)明的另一目的涉及用于制備根據(jù)本發(fā)明前述目的三維基質(zhì)的模，其特征在于，所述模具有均勻分布的直徑350-650 μ m的沖孔，所述沖孔彼此均勻的間隔0. 4-0. 6mm 之間。所述模可由硅酮、金屬、耐受性塑料或允許其應(yīng)用的任何另一種材料形成，其能夠采 用任何類型的所需形狀。在具體的實(shí)施方式中，所述模是圓柱體的形式，所述圓柱體具有2與50mm之間的 底部直徑和1與50mm之間的高度。在另一具體實(shí)施方式
中，所述圓柱體具有2與15mm之 間的底部直徑和1與5mm之間的高度。在其它具體實(shí)施方式
中，所述圓柱體具有-IOmm的直徑，5mm的高度，以及64個(gè)圓柱形沖孔，所述沖孔的底部直徑為 500 μ m士 60 μ m,彼此均勻間隔 0. 5mm士 60 μ m,-IOmm的直徑，3mm的高度，以及64個(gè)圓柱形沖孔，所述沖孔的底部直徑為 500 μ m士 60 μ m,彼此均勻間隔 0. 5mm士 60 μ m,-8mm的直徑，5mm的高度，以及39個(gè)圓柱形沖孔，所述沖孔的底部直徑為 500 μ m士 60 μ m，彼此均勻間隔 0. 5mm士 60 μ m，-8mm的直徑，3mm的高度，以及39個(gè)圓柱形沖孔，所述沖孔的底部直徑為 500 μ m士 60 μ m，彼此均勻間隔 0. 5mm士 60 μ m，-7mm的直徑，5mm的高度，以及觀個(gè)圓柱形沖孔，所述沖孔的底部直徑為 500 μ m士 60 μ m，彼此均勻間隔 0. 5mm士 60 μ m，_7mm的直徑，3mm的高度，以及觀個(gè)圓柱形沖孔，所述沖孔的底部直徑為 500 μ m士 60 μ m，彼此均勻間隔 0. 5mm士 60 μ m，-5mm的直徑，3mm的高度，以及12個(gè)圓柱形沖孔，所述沖孔的底部直徑為 500 μ m士 60 μ m，彼此均勻間隔 0. 5mm士 60 μ m，在所有這些圓柱體中，所述沖孔相對(duì)于寬度為0. 5mm的沒有沖孔的周邊區(qū)域分 布，所述周邊區(qū)域在從圓柱體邊緣起朝向其內(nèi)部的方向上量取。本發(fā)明的下述目的涉及具有結(jié)構(gòu)化孔隙的三斜磷鈣石三維基質(zhì)的合成方法，其特 征在于包括下述步驟混合由堿性磷酸鈣、酸性磷酸鈣、孔誘導(dǎo)劑和緩凝劑形成的固相，所述固相通過(guò)添 加蒸餾水進(jìn)行固化，以產(chǎn)生液相在固化過(guò)程中在所述粘漿中應(yīng)用至少一種模，以產(chǎn)生直徑在350與650 μ m之間的 垂直的圓柱形大孔，其彼此均勻間隔0. 4-0. 6mm使所形成的前體材料滅菌并將其熱轉(zhuǎn)化成三斜磷鈣石。在具體的實(shí)施方式中，在所述方法的步驟1中，堿性磷酸鹽/酸性磷酸鹽的摩爾比 是1. 6-1. 8，孔誘導(dǎo)劑的濃度是l-20Wt%，緩凝劑的濃度在0. 4-0. 6wt%之間，并且(P/L)比 為3。在另一具體實(shí)施方式
中，堿性磷酸鹽/酸性磷酸鹽的摩爾比是1. 785，孔誘導(dǎo)劑的濃 度是3-10wt%，以及緩凝劑的濃度是034%。在另一具體實(shí)施方式
中，酸性磷酸鈣是磷酸 一鈣，堿性磷酸鈣是磷酸三鈣，孔誘導(dǎo)劑是碳酸鈣，緩凝劑是焦磷酸鈉。在另一具體實(shí) 施方式中，階段1的產(chǎn)物是透鈣磷石。在另一具體實(shí)施方式
中，在所述方法的步驟3中，熱滅菌通過(guò)高壓滅菌進(jìn)行。在另 一具體實(shí)施方式
中，所述高壓滅菌在120-130°C進(jìn)行M-25分鐘。在另一具體實(shí)施方式
中，在所述方法的步驟2中，所使用的模是在本發(fā)明的前述 目的中描述的模。在另一具體實(shí)施方式
中，在使用所述模之前，使用圓柱體的形式的硅酮模，其底部直徑在2與50mm之間，高度在1與50mm之間。在另一具體實(shí)施方式
中，所述硅 酮模具有2與15mm之間的底部直徑和1與5mm之間的高度。本發(fā)明的另一目的在于使用在本發(fā)明的前述目的中描述的模得到采用其形狀的 磷酸鈣。在具體的實(shí)施方式中，所述磷酸鈣由三斜磷鈣石組成。本發(fā)明的另一目的涉及具有結(jié)構(gòu)化孔隙的三斜磷鈣石的三維基質(zhì)作為細(xì)胞培養(yǎng) 物的支持物的用途。本發(fā)明的另一目的涉及具有結(jié)構(gòu)化孔隙的三斜磷鈣石的三維基質(zhì)，其特征在于它 們另外包含細(xì)胞。在具體的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是間充質(zhì)細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、骨細(xì) 胞、內(nèi)皮細(xì)胞或其組合。本發(fā)明的另一目的涉及含有或不含細(xì)胞的具有結(jié)構(gòu)化孔隙的三斜磷鈣石的三維 基質(zhì)用于制備骨結(jié)構(gòu)再生的治療劑的用途。在具體的實(shí)施方式中，所述骨結(jié)構(gòu)再生被實(shí)施， 以便消除骨質(zhì)疏松癥。附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明圖1 :a)固定在玻璃盤中的金屬部件，其與待被合成的三斜磷鈣石圓柱體尺寸相 同，b)硅酮模，由圖la)的部件獲得，其具有待被合成的部分的尺寸的腔，沒有考慮形成大 孔的時(shí)刻，c)金屬模，其具有金屬?zèng)_孔，所述金屬?zèng)_孔將在三斜磷鈣石的基質(zhì)中產(chǎn)生受控且 均勻的大孔隙。圖2 用于獲得三斜磷鈣石基質(zhì)的模實(shí)例的設(shè)計(jì)，其具有直徑為500士60mm、規(guī)則 且重復(fù)的間隔的垂直孔的均勻分布。圖3 從正面(a)和側(cè)面(b)觀察到的多孔三斜磷鈣石基質(zhì)的一種形式的照片。該 圖像顯示在基質(zhì)的結(jié)構(gòu)上規(guī)則分布的相同大小的圓柱形孔以及這些孔如何完全穿過(guò)所述 結(jié)構(gòu)。圖4 本發(fā)明的單體/顆粒狀物以及它們的尺寸的具體實(shí)施例a)直徑5mm(cp)和 高度3_(h)的顆粒狀物，其具有總計(jì)12個(gè)直徑為0. 5mm( cp.m )、彼此間隔距離0. 5mm(d. m)的大孔，b)直徑IOmm (φ)和高度3或5mm(h)的顆粒狀物，其具有總計(jì)64個(gè)直徑為 0. 5mm( φ.Π )、彼此間隔距離0. 5mm(d. m)的大孔，c)直徑8mm( φ )和高度3或5mm(h)的顆 粒狀物，其具有總計(jì)39個(gè)直徑為0. 5mm ( φ. η )、彼此間隔距離0. 5mm (d. m)的大孔，和d)直 徑7mm ( φ )和高度3或5mm(h)的顆粒狀物，其具有總計(jì)28個(gè)直徑為0. 5mm( cp.m )、彼此間 隔距離0.5mm(d.m)的大孔。它們中全部相對(duì)于沒有大孔的0. 5mm寬度的周邊區(qū)域。圖5 前體多孔透鈣磷石(熱處理之前)和在轉(zhuǎn)化和滅菌所述前體材料之后得到 的多孔三斜磷鈣石(熱處理之后)的X-射線衍射。出現(xiàn)在X-射線衍射圖中的3個(gè)最高峰 在上圖(a)的情況中定義了透鈣磷石，而下圖(b)所示衍射圖譜是三斜磷鈣石特有的。在 高壓滅菌器滅菌之后的樣品結(jié)構(gòu)分析(Rietveld分析法)顯示所述材料主要由95士5%的 三斜磷鈣石組成，余者是β-磷酸三鈣(也稱為β-TCP)。為確定材料的組成，將生物材料 的衍射圖與透鈣磷石(ICSD 016132)和三斜磷鈣石(ICSD 38128)的模型圖進(jìn)行比較。圖6 無(wú)定形三斜磷鈣石的正視圖(a)和側(cè)視圖(b)，即不具有結(jié)構(gòu)化孔隙。所看 到的孔隙是獲得其的過(guò)程中所固有的，該生物材料的大部分孔隙由微孔形成，在這些微孔 中不能實(shí)現(xiàn)細(xì)胞定居。(c)本發(fā)明的三斜磷鈣石基質(zhì)設(shè)計(jì)的圖像，其具有分布在該生物材料結(jié)構(gòu)中的孔——尺寸定義在約500 μ m。圖7 無(wú)受控孔隙的三斜磷鈣石生物材料在不同放大率下的掃描電子顯微鏡術(shù)圖 像。這些圖像顯示這樣的生物材料其是基本微孔性的(c)，并且最小限度地存在一些隨機(jī) 排列的大孔(b)，看上去像洞，大孔都沒有過(guò)所述基質(zhì)(a，b)。圖8 掃描電子顯微鏡術(shù)圖像，其顯示本發(fā)明的三斜磷鈣石生物材料，其具有在基 質(zhì)上分布的500 μ m的孔。圖9 本發(fā)明的三斜磷鈣石生物材料在細(xì)胞中的細(xì)胞毒性研究圖。從MTT 試驗(yàn)觀察到，在那些已經(jīng)與三斜磷鈣石接觸的細(xì)胞與那些沒有與三斜磷鈣石接觸的
細(xì)胞之間，不存在細(xì)胞增殖上的顯著不同，這允許做出結(jié)論本發(fā)明的具有結(jié)構(gòu)化孔 隙的三斜磷鈣石不是細(xì)胞毒性的。圖10 從小鼠淋巴瘤試驗(yàn)得到的相襯倒置顯微鏡圖像。作為該試驗(yàn)的結(jié)果，顯示 了被認(rèn)為是(a)和(b)陽(yáng)性(突變細(xì)胞，菌落生長(zhǎng))的孔或(c)和(d)陰性(非突變細(xì)胞， 沒有菌落)的孔的代表性圖像。圖11 在存在(三斜磷鈣石+S9)和不存在(三斜磷鈣石)代謝活化的情況下本 發(fā)明的具有結(jié)構(gòu)化孔隙的三斜磷鈣石的突變頻率的柱狀圖。所述頻率與存在和不存在代謝 活化的情況下使用的陰性和陽(yáng)性對(duì)照相比較，允許得出結(jié)論本發(fā)明的具有結(jié)構(gòu)化孔隙的 三斜磷鈣石不是誘變生物材料。圖12 本發(fā)明的三斜磷鈣石生物材料的血液相容性的試驗(yàn)。與本發(fā)明的三斜磷鈣 石接觸M小時(shí)的成骨細(xì)胞和AMSC的培養(yǎng)基用來(lái)測(cè)定與陽(yáng)性和陰性對(duì)照相比較的溶血百分 比。從圖中可以推斷，本發(fā)明的三斜磷鈣石是血液相容性生物材料。圖13 根據(jù)本發(fā)明的具有結(jié)構(gòu)化大孔隙的三斜磷鈣石的基質(zhì)在不同放大率下的 掃描電子顯微鏡術(shù)圖像。大孔允許間充質(zhì)干細(xì)胞定居生物材料的表面(a)和經(jīng)過(guò)所述大孔 被引入(b，d)。在(c)中觀察到大孔的縱切面。(c)細(xì)胞彼此相互作用，發(fā)射胞質(zhì)延伸，如 在組織中在生理學(xué)水平所發(fā)生的。圖14 在具有未受控孔隙的三斜磷鈣石生物材料中布置的間充質(zhì)干細(xì)胞的掃描 電子顯微鏡術(shù)圖像。可見，所述細(xì)胞在基質(zhì)的表面排列，沒有定居其內(nèi)部的可能性，原因在 于它們比表征所述生物材料的微孔隙具有顯著更大的尺寸。圖15 在具有未受控孔隙的三斜磷鈣石材料上布置的間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖(灰 色)與在本發(fā)明的具有結(jié)構(gòu)化孔隙的三斜磷鈣石材料上布置的間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖(黑 色)的比較。圖16 骨組織的形態(tài)圖1.密質(zhì)骨。2.松質(zhì)骨。3.哈佛系統(tǒng)。4.血管。5.哈佛 管。6.福耳克曼管。7.骨膜。8.骨襯。9.骨膜管。10.破骨細(xì)胞。11.成骨細(xì)胞。12.骨 細(xì)胞。圖17和18 =SEM圖像，其顯示在x40的放大率和x80的放大率下預(yù)分化成骨的不 同濃度的AMSC如何被布置在本發(fā)明的生物材料的同一個(gè)表面上。圖17a和b是關(guān)于沒有 細(xì)胞的生物材料，圖17c_h是關(guān)于所使用的從0. 5 X IO6到2 X IO6個(gè)細(xì)胞的不同細(xì)胞濃度。 圖18a-h是關(guān)于所使用的3X IO6到6X IO6個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞濃度。圖19 在培養(yǎng)物中數(shù)天之后細(xì)胞在(a)本發(fā)明的具有結(jié)構(gòu)化孔隙的三斜磷鈣石生 物材料的表面上和(b)在所述生物材料的大孔通道內(nèi)的共聚焦顯微鏡圖像。(b)的圖像顯示預(yù)分化的AMSC在生物材料的孔內(nèi)部的核(孔在其整體性上的重建通過(guò)系列圖像的組合 來(lái)實(shí)現(xiàn))。從這些圖像觀察到，隨著培養(yǎng)時(shí)間增加細(xì)胞在生物材料表面以及在大孔的壁上存 在何種程度的增加。圖20和21 在不同放大率下，預(yù)分化的AMSC細(xì)胞在生物材料中在不同結(jié)合時(shí)間 (1、4、7、10和15天時(shí)，在生物材料的表面中(分別為圖20a-e))以及自生物材料的大孔的 通道內(nèi)部(分別為圖21a_e)的方位SEM圖像。圖22和23 通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增，在單獨(dú)的AMSC細(xì)胞中，以及與生物材料結(jié)合4、7、 10和15天的未經(jīng)分化的(圖22) AMSC細(xì)胞和預(yù)分化的(圖23) AMSC細(xì)胞中，分析AMSC中 參與成骨作用的基因的表達(dá)，諸如骨連接素(OTN)、骨鈣蛋白(OCA)、骨橋蛋白(0PN)、1-型 膠原(C0L-1)、TGF-β 1和堿性磷酸酯酶(AP)的表達(dá)。根據(jù)凝膠可以推斷在未分化和預(yù) 分化細(xì)胞中，參與成骨作用的基因的表達(dá)是未修飾的，并且它們因此保持著它們的功能狀 態(tài)——旨在形成骨細(xì)胞，能夠合成細(xì)胞外基質(zhì)，取代逐漸降解的生物材料，以便使骨質(zhì)缺損 再生。圖24:免疫標(biāo)記的共聚焦顯微鏡圖像。圖M顯示了必須閱讀下列圖25至31每 一個(gè)圖方可進(jìn)行的觀察。因此，如可以觀察到的，圖M被分成4個(gè)部分觀察到，左上部分 (i)是指細(xì)胞的胞核染色，右上部分(ii)是指僅蛋白質(zhì)的標(biāo)記，左下部分(iii)是指細(xì)胞核 +蛋白質(zhì)的雙重染色，以及右下部分(iv)是指細(xì)胞核+蛋白質(zhì)+生物材料的三重染色。在 圖25-31中，各個(gè)圖像也被如上所示的分為圖a-f若干部分，所示的信息必須在各圖中進(jìn)行 解釋。圖25-26 在不同培養(yǎng)時(shí)間，在生物材料的表面(頂部視圖，圖2 和在通道內(nèi)部 (側(cè)面視圖，圖26)，預(yù)分化的AMSC的1-型膠原(C0L-1)的免疫標(biāo)記的共聚焦顯微鏡圖像。圖27-28 在不同培養(yǎng)時(shí)間，在生物材料的表面(頂部視圖，圖27)和在通道內(nèi)部 (側(cè)面視圖，圖觀)，預(yù)分化的AMSC的骨鈣蛋白的免疫標(biāo)記的共聚焦顯微鏡圖像。圖四-30 在不同培養(yǎng)時(shí)間，在生物材料的表面(頂部視圖，圖29)和在通道內(nèi)部 (側(cè)面視圖，圖30)，預(yù)分化的AMSC的骨橋蛋白的免疫標(biāo)記的共聚焦顯微鏡圖像。圖31 在生長(zhǎng)在生物材料的表面上(頂部視圖，圖31a_c)和通道內(nèi)部(側(cè)面視圖， 圖31d-f) 4天時(shí)，在預(yù)分化的AMSC中的1-型膠原、骨鈣蛋白和骨橋蛋白的免疫標(biāo)記的共聚 焦顯微鏡圖像。這些結(jié)果表明，存在于生物材料中的預(yù)分化的AMSC能夠合成和分泌與骨合 成相關(guān)的蛋白質(zhì)。圖32和33 通過(guò)SEM-EDX分析生物材料的基本元素以及與本發(fā)明的具有結(jié)構(gòu)化 孔隙的三斜磷鈣石結(jié)合4天和7天(圖3 以及10天和15天(圖3 的AMSC的基本元 素。左欄的圖像是指通道中心中的分離區(qū)域，基于其已經(jīng)進(jìn)行存在于細(xì)胞中的元素的分析 (右欄的圖像)。該圖表明元素的分布不同于在生物材料中所見的元素分布。因此，在與本 發(fā)明的具有結(jié)構(gòu)化孔隙的生物材料結(jié)合時(shí)，隨著時(shí)間通過(guò)細(xì)胞進(jìn)行的顆粒(鈣、磷和硅)的 合成增加。因此得出結(jié)論適合鈣鹽的形成條件被滿足，所述鈣鹽的形成對(duì)于骨的礦物相的 形成而言是必需的。圖34 =SEM-EDX圖像，其顯示在僅存在AMSC的區(qū)域中基本元素的分布。在鈣和磷 的圖像中，可看見由這兩種元素形成的電子致密顆粒(它們位于該區(qū)域的相同位置)。圖35 從不同濃度的預(yù)分化細(xì)胞獲得的TGF-β 1 (pg/ml)的分泌，所述預(yù)分化細(xì)胞在無(wú)三斜磷鈣石的情況下在培養(yǎng)物中生長(zhǎng)7天。能夠觀察到，對(duì)于較低的細(xì)胞濃度而言， TGF-β l(pg/ml)的濃度逐漸增加，而對(duì)于較高的細(xì)胞濃度而言，TGF-β l(pg/ml)的濃度輕 微下降或失去穩(wěn)定性，這是由于TGF-β 1的陰性反饋機(jī)制。圖36 隨時(shí)間變化從培養(yǎng)物中的預(yù)分化細(xì)胞獲得的TGF-β 1 (pg/ml)的分泌。將 2X IO6個(gè)細(xì)胞接種在6cm2表面上，在不同時(shí)間分析培養(yǎng)物中的分泌，觀察到典型的反饋機(jī) 制行為，其由下述組成合成和分泌增加，之后分泌減少，直到開始新的分泌增加。圖37 從不同濃度的預(yù)分化細(xì)胞獲得的TGF-β 1 (pg/ml)的分泌，所述預(yù)分化細(xì)胞 在生物材料上在培養(yǎng)物中生長(zhǎng)7天。從該圖可以觀察到培養(yǎng)基中因子的存在如何與生物材 料中細(xì)胞數(shù)目的增加相互關(guān)聯(lián)。圖38:隨時(shí)間變化從在培養(yǎng)物中在生物材料上生長(zhǎng)的預(yù)分化細(xì)胞中獲得的 TGF-β 1 (pg/ml)的分泌。將2X106個(gè)細(xì)胞接種在6cm2表面上，在不同時(shí)間分析培養(yǎng)物中 的分泌。從該圖推斷，從培養(yǎng)的第1天到第10天TGF-β 1分泌增加，該時(shí)間之后分泌開始 穩(wěn)定并適度的下降。實(shí)施例下述實(shí)施例用于解釋但并非限定本發(fā)明。實(shí)施例1 本發(fā)明所沭基質(zhì)的合成方法為合成本發(fā)明的基質(zhì)，使固相與雙蒸餾水(液相)混合。所述固相包括但不限于酸性磷酸鈣、堿性磷酸鈣、諸如碳酸鈣等的孔誘導(dǎo)劑和諸 如焦磷酸鈉等的緩凝劑。1.1固相的制備鈣粘漿的固相由堿性磷酸鈣和酸性磷酸鈣構(gòu)成。堿性磷酸鈣是β-磷酸三鈣 (β -TCP)，酸性磷酸鈣是磷酸一鈣。將這兩種組分以1. 785的摩爾比在研缽中用手混合10 分鐘。以重量百分比1-20%之間、優(yōu)選3-10%之間的濃度添加碳酸鈣。重量百分比0. 54% 的焦磷酸鈉被用作凝固反應(yīng)的緩凝劑。具體而言，為制備β -磷酸三鈣(β -TCP)，將34. 42g DCPD和10. Olg CC在玻璃研 缽中混合(摩爾比為2 1)并用手使其均勻15分鐘。將混合物在900°C的烘箱(Veckstar) 中加熱14小時(shí)。β-TCP的合成根據(jù)下述反應(yīng)發(fā)生2CaHP04 · 2H20+CaC03 — Ca3 (PO4) 2+5H20+C02然后篩分粉末并使用粒度小于322 μ m的粉末。1.2液相的制備和三斜磷鈣石海綿狀體的合成液相由蒸餾水或雙蒸餾水形成。稱重由0. 8g無(wú)水磷酸一鈣、1. 4g β -磷酸三鈣、12mg焦磷酸鈉和IlOmg碳酸鹽形 成的固相，并且以粉末-液體(P/L)比例3，在玻璃盤中使0.77ml液相混合30秒。1.3固化過(guò)程將粘漿在水浴中于37°C下固化30分鐘。固化反應(yīng)根據(jù)下述反應(yīng)發(fā)生Ca3 (PO4) 2+Ca (H2PO4) 2+8H20 — 4CaHP04 · 2H20在固化反應(yīng)過(guò)程中，碳酸氫鹽與介質(zhì)的氫離子反應(yīng)，分解成二氧化碳，形成腔，并 因此產(chǎn)生透鈣磷石的海綿狀基質(zhì)。1. 4洗滌過(guò)程
然后將生物材料在蒸餾水中洗滌幾次，以消除介質(zhì)中的酸殘留，直到達(dá)到接近7 的PH，這對(duì)于將在隨后步驟中進(jìn)行的細(xì)胞生長(zhǎng)是最適宜的。1. 5誘鈣磷石轉(zhuǎn)化為三斜磷鈣石的過(guò)稈在通過(guò)上述過(guò)程得到固化材料之后，使其滅菌。所述滅菌過(guò)程包括在120-130°C的 溫度范圍內(nèi)將所述固化材料高壓滅菌M-25分鐘。在該過(guò)程中，透鈣磷石轉(zhuǎn)化成三斜磷鈣石。透鈣磷石轉(zhuǎn)化為三斜磷鈣石的過(guò)程CaHPO4 · 2H20 — 120°C — CaHP04+2H20 (氣體)1.6無(wú)定形的多孔三斜磷鈣石某質(zhì)的合成方法在化合物如上所述方法被混合之后(實(shí)施例1. 1至1.幻，將得到的透鈣磷石粘漿 放置在具有目的形狀的表面上進(jìn)行固化并隨后進(jìn)行滅菌，因此獲得無(wú)定形基質(zhì)，其中存在 很少且分布不規(guī)則的大孔，如在圖6a和b中觀察到的。1. 7 H有結(jié)構(gòu)化孔傲的三斜磷I丐石某質(zhì)的合成方法在通過(guò)實(shí)施例1. 1至1. 2描述的過(guò)程得到粘漿之后，在開始固化之后一分鐘，將示 于圖2中的硅酮模應(yīng)用于該粘漿中30秒。在材料已經(jīng)固化之后，如上所述使其滅菌(實(shí)施 例 1. 5)。使用不同的模能夠獲得具有平均大小為500士60 μ m的圓柱形孔的材料，并且能 夠使微孔與通過(guò)孔誘導(dǎo)劑產(chǎn)生的大孔連接。圖3顯示通過(guò)本發(fā)明所述的過(guò)程生產(chǎn)的具有結(jié)構(gòu)化孔隙的三斜磷鈣石基質(zhì)的實(shí) 例。由于在固化反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生二氧化碳以及應(yīng)用上述模，得到的材料顯示為具有特定孔 分布的海綿狀外觀。因此獲得具有結(jié)構(gòu)化孔隙的無(wú)菌三斜磷鈣石生物材料，其能夠用作細(xì) 胞生長(zhǎng)的基質(zhì)且無(wú)需進(jìn)一步處理。圖5顯示樣品在高壓滅菌器中熱處理之前和之后的衍射圖。在圖4中可觀察到， 除滅菌所述材料之外，熱處理引起所述結(jié)構(gòu)從透鈣磷石向三斜磷鈣石的晶體轉(zhuǎn)化。實(shí)施例2 具有結(jié)構(gòu)化孔隙的特定三斜磷鈣石顆粒狀物的具體生產(chǎn)過(guò)程以舉例的方式并且為了獲得具有最優(yōu)選特征的粘漿的目的，將由0.8g無(wú)水磷酸 一鈣、1. 4g β -磷酸三鈣、12mg焦磷酸鈉和IlOmg碳酸鈣形成的粉末組分與0. 77ml水混合 30秒。在開始固化之后一分鐘，將下面所述的模應(yīng)用于粘漿30秒。2. 1在1^ 寸稈用單個(gè)ItlU獲f導(dǎo)H有結(jié)構(gòu)仆』,隙的圓柱形基質(zhì)為了該實(shí)施例的具體實(shí)施，使用具有下述尺寸和沖孔數(shù)的硅酮模a)直徑1cm，高度5mm或3mm，64個(gè)沖孔b)直徑0. 8cm,高度5_或3_，39個(gè)沖孔c)直徑0. 7cm,高度5_或3_，28個(gè)沖孔d)直徑0. 5cm,高度3mm，12個(gè)沖孔在所有模中，沖孔是圓柱形的，其直徑在500 μ m士60 μ m之間，所述沖孔彼此間隔 500 μ m士60 μ m,并且相對(duì)于沒有沖孔的0. 5mm的周邊區(qū)(從模的邊緣朝向模內(nèi)部量取)分 布。所述沖孔的結(jié)構(gòu)是描繪在圖2中的那些。在固化反應(yīng)過(guò)程中，如在實(shí)施例1. 7中所述，碳酸氫鹽與介質(zhì)的氫離子反應(yīng)，分解 成二氧化碳，形成腔，并因此產(chǎn)生透鈣磷石的海綿狀基質(zhì)。
然后將生物材料在蒸餾水中洗滌幾次，以消除介質(zhì)中的酸殘留，直到達(dá)到接近7 的PH，這對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)是最適宜的。隨后將所述材料滅菌。在高壓滅菌器中滅菌過(guò)程在130°C持續(xù)M分鐘，透鈣磷石 轉(zhuǎn)化成三斜磷鈣石，因此獲得無(wú)需進(jìn)一步處理就能夠用作細(xì)胞生長(zhǎng)的基質(zhì)的無(wú)菌的三斜磷 鈣石生物材料。因此，得到的材料由特定的海綿狀圓柱形顆粒狀物構(gòu)成，其由本發(fā)明的具有結(jié)構(gòu) 化孔隙的生物基質(zhì)形成，在每種情況下具有所示的尺寸，其中大孔均勻地分布在所述顆粒 狀物中。使用所指出的各種模能夠獲得下述具有均勻分布的圓柱形孔的基質(zhì)，所述孔的平 度孔尺寸為500 μ m士60 μ m,孔彼此間隔0. 5mm士60 μ m,能夠使微孔與通過(guò)孔誘導(dǎo)劑產(chǎn)生 的大孔相連接a)圓柱形顆粒狀物，直徑1cm，高度0. 5cm或0. 3cm,具有64個(gè)大孔(圖4b)b)圓柱形顆粒狀物，直徑0. 8cm,高度0. 5cm或0. 3cm,具有39個(gè)大孔(圖如)c)圓柱形顆粒狀物，直徑0. 7cm,高度0. 5cm或0. 3cm,具有28個(gè)大孔(圖4d)d)圓柱形顆粒狀物，直徑0. 5cm,高度0. 3cm,具有12個(gè)大孔(圖如)如在圖4中所示，所獲得的這些本發(fā)明的三斜磷鈣石顆粒狀物具有0. 5mm寬的沒 有大孔的周邊區(qū)(從顆粒狀物邊緣朝向其內(nèi)部量取)，這使得它們維持其應(yīng)用中所必需的 機(jī)械穩(wěn)定性和強(qiáng)度條件。2. 2 &體瓶胃藤寸禾早Φ·爾中豐草為了該實(shí)施例的具體實(shí)施，使用兩種類型的模，一種由硅酮制造(圖lb)，另一種 由金屬制造(圖lc)。硅酮模用于獲得合適大小的三斜磷鈣石圓柱體(在該階段不介入大孔隙的形 成)。為合成硅酮模，將與待要獲得的三斜磷鈣石部分具有相同尺寸的圓柱形部分首先 固定在玻璃盤中(圖la)。然后將液體硅酮添加在具有金屬部分的玻璃盤上，并等待其聚合。聚合后，將其從 玻璃盤中移走。所獲得的硅酮模具有待被制造的三斜磷鈣石單元的所述尺寸的腔(圖lb)。 具有待被制造的所述部分的尺寸的腔的所述硅酮模沒有沖孔，因此也不考慮形成大孔。獲得7種不同的硅酮模，其分別具有下述尺寸的圓柱形腔-直徑 10mm，高度 5mm 或 3mm，-直徑8mm，高度 5mm 或 3mm，-直徑 7mm，高度 3mm 或 5mm，-直徑 5mm，高度 3mm。另外，制造金屬模，其具有使用各種所示硅酮模獲得的各種三斜磷鈣石部分的尺 寸。所述金屬模由兩部分組成第一部件——具有產(chǎn)生可再現(xiàn)的大孔元件的沖孔，和蓋(圖 Ic)。具體而言，所制造的金屬模的尺寸如下a)直徑Icm,高度0. 5cm或0. 3cm,具有64個(gè)沖孔b)直徑0. 8cm,高度0. 5cm或0. 3cm,具有39個(gè)沖孔c)直徑0. 7cm,高度0. 5cm或0. 3cm,具有28個(gè)沖孔
d)直徑0. 5cm，高度0. 3cm，具有12個(gè)沖孔在所有的模中，沖孔是圓柱形的，其直徑包括在500 μ m士60 μ m之間，彼此間隔 500 μ m士60 μ m而分布，其分布相對(duì)于0. 5mm的沒有沖孔的周邊區(qū)(自圓柱體邊緣朝向其內(nèi)
部量取)。在模已經(jīng)被制造之后，根據(jù)下述過(guò)程產(chǎn)生三斜磷鈣石部分首先，用剛剛由混合固相和液相產(chǎn)生的產(chǎn)物填充硅酮模。第二，在生物材料結(jié)束其固化之前，將所述部分從硅酮模中移出。該過(guò)程簡(jiǎn)單，原 因在于該模像非常柔軟的橡膠。第三，將該部分引入具有沖孔的金屬模中并覆蓋。所述模被引入37°C的水浴中30 分鐘，直到固化結(jié)束。在完全凝固之后，將它們從金屬模中移出，獲得具有期望孔隙的圓柱形部分。使所形成的基質(zhì)在120與130°C之間經(jīng)歷高壓滅菌24-25分鐘，它們轉(zhuǎn)化為三斜磷 鈣石，使其完全滅菌并適于應(yīng)用。所得到的部分與在實(shí)施例Ia中獲得的部分具有相同的孔隙和尺寸(圖4)。棚列3 辦靴孔馳Ξ麵瓶麵瓶臓砠少丨、__ 研究3. 1微觀研究然后進(jìn)行無(wú)定形基質(zhì)的微觀結(jié)構(gòu)與具有結(jié)構(gòu)化孔隙的基質(zhì)的微觀結(jié)構(gòu)的比較試 驗(yàn)。為進(jìn)行該試驗(yàn)，通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的過(guò)程使用掃描電子顯微鏡術(shù)。無(wú)定形多孔三斜磷鈣石基質(zhì)的顯微結(jié)構(gòu)以無(wú)定形基質(zhì)形式排列的生物材料(圖6a，b)獲得不受控的孔隙。換言之，它們 顯示不規(guī)則的大孔分布，其是在實(shí)施例1. 1至1. 6所述的獲得粘漿的過(guò)程中產(chǎn)生的。無(wú)定 形基質(zhì)的大孔是生物材料中的腔并且不連接內(nèi)部結(jié)構(gòu)(圖7)。關(guān)于大孔的數(shù)目和分布，觀察到它們的缺乏。大孔的存在是最小程度的并且它們 被隨機(jī)排列(圖7)。因此，這些結(jié)構(gòu)不會(huì)有利于恰當(dāng)?shù)墓窃偕?，因?yàn)樗鼈儾惶峁┣‘?dāng)?shù)募?xì)胞定居和增 殖所必需的條件。結(jié)構(gòu)化多孔三斜磷鈣石的微觀結(jié)構(gòu)相反，圖6c和8顯示具有結(jié)構(gòu)化大孔的三斜磷鈣石的基質(zhì)。掃描顯微鏡術(shù)圖像顯 示具有結(jié)構(gòu)化大孔的三斜磷鈣石的基質(zhì)。掃描顯微鏡術(shù)圖像(圖8)顯示大孔的均勻分布。與先前的結(jié)構(gòu)相反，具有結(jié)構(gòu)化孔隙的三斜磷鈣石的基質(zhì)將有利于恰當(dāng)?shù)墓窃?生，因?yàn)樗錇榍‘?dāng)?shù)募?xì)胞定居和增殖的提供適當(dāng)條件。3.2體內(nèi)比較研究當(dāng)設(shè)計(jì)用于促進(jìn)骨再生的生物材料時(shí)最相關(guān)方面之一是開發(fā)具有適合細(xì)胞定居 和氣體與養(yǎng)分?jǐn)U散的孔隙的結(jié)構(gòu)。具體而言，大孔(100至500 μ M)許可最佳介質(zhì)——用于 在基質(zhì)中的細(xì)胞的結(jié)合定居，以及新血管形成，植入?yún)^(qū)域的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的遷移及 在所提供的整個(gè)結(jié)構(gòu)中新骨的均勻形成。在本發(fā)明中開發(fā)的具有結(jié)構(gòu)化孔隙的生物材料具有特征大孔結(jié)構(gòu)，其使基質(zhì)中提 供的成骨細(xì)胞能夠完全且均勻地分布，且另外允許受體組織的細(xì)胞能夠進(jìn)入，受體組織的細(xì)胞將定居于新結(jié)構(gòu)并與其結(jié)合，以便開始其再吸收過(guò)程以及形成新骨基質(zhì)，該新骨基質(zhì) 將逐漸沉積在植入物上以產(chǎn)生新骨，其機(jī)械和生理特征非常類似于原來(lái)的組織。為測(cè)定由本研究中開發(fā)的設(shè)計(jì)相對(duì)于大孔的非結(jié)構(gòu)化孔隙所形成的優(yōu)勢(shì)，進(jìn)行了 不帶有大孔構(gòu)建的三斜磷鈣石生物材料以及具有大孔隙的三斜磷鈣石生物材料之間的比 較研究。為此目的，使用綿羊，其體內(nèi)進(jìn)行脛骨中的關(guān)鍵缺損和通過(guò)骨接合術(shù)技術(shù)的穩(wěn)定 化。在所產(chǎn)生的缺損中，非結(jié)構(gòu)化三斜磷鈣石生物材料被施用在它們中的三只中，而結(jié)構(gòu)化 三斜磷鈣石生物材料被施用在另三只中，在所有綿羊中均留下相鄰的腿作為對(duì)照(其內(nèi)形 成關(guān)鍵缺損并使骨折穩(wěn)定，但是沒有填充生物材料)。在植入生物材料之前，將生物材料接 種相同數(shù)目的間充質(zhì)干細(xì)胞，其來(lái)自從綿羊獲得的脂肪組織。為測(cè)定新骨的形成，在植入后3個(gè)月和6個(gè)月進(jìn)行連續(xù)的放射照相對(duì)照和組織學(xué) 研究。結(jié)果顯示具有大孔性的生物材料相對(duì)于不具有大孔性的生物材料具有明顯的優(yōu)勢(shì)。 在植入3個(gè)月后，觀察到骨的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞在大孔性生物材料的整個(gè)結(jié)構(gòu)中更多的 定居，以及新骨的均勻形成。在第六個(gè)月，觀察到具有本發(fā)明設(shè)計(jì)的大孔性材料完全整合， 伴隨發(fā)生新血管形成，這將能夠產(chǎn)生穩(wěn)定的骨，其中養(yǎng)分和氧氣在其整體內(nèi)擴(kuò)散并且沒有 形成壞死區(qū)域。然而，當(dāng)生物材料不具有大孔構(gòu)建時(shí)，觀察到新骨組織的形成局限于植入物 周邊的區(qū)域，留下基質(zhì)的剩余部分沒有細(xì)胞定居——或者由先前接種的細(xì)胞或者由受體組 織的那些細(xì)胞引起，并且此外新血管形成的發(fā)生未被誘導(dǎo)。這些結(jié)果允許得出結(jié)論大孔性的三斜磷鈣石對(duì)于新骨的形成具有明顯的優(yōu)勢(shì)， 這是由于基質(zhì)的整個(gè)結(jié)構(gòu)被植入?yún)^(qū)域的細(xì)胞定居，以均勻的方式引起再吸收、骨基質(zhì)形成 以及新血管形成的誘導(dǎo)。實(shí)施例4 體外生物相容性研究在使本發(fā)明的具有結(jié)構(gòu)化孔隙的三斜磷鈣石材料與細(xì)胞結(jié)合之前，證明所述材料 是生物相容性是必要的。考慮到本發(fā)明的具有結(jié)構(gòu)化孔隙的三斜磷鈣石生物材料能夠被認(rèn)為是將與骨持 久接觸(接觸的期間大于30天)的可植入產(chǎn)品，所進(jìn)行的體外試驗(yàn)涉及細(xì)胞毒性、遺傳毒 性(致突變性)和血液相容性。4. 1細(xì)胞毒性利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，這些試驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞溶解(細(xì)胞死亡)、細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制以及由 保健產(chǎn)品、材料和/或其提取物引起的對(duì)細(xì)胞的其它作用。通過(guò)這種試驗(yàn)，其測(cè)定在研究下所述材料即具有結(jié)構(gòu)化孔隙的三斜磷鈣石是否對(duì) 細(xì)胞有毒性，是否影響它們的增殖和生存力。所分析的材料是在實(shí)施例1中獲得的具有結(jié)構(gòu)化孔隙的三斜磷鈣石基質(zhì)，其尺寸 是直徑1cm，高度5mm，具有64個(gè)大孔，利用PVC作為陽(yáng)性對(duì)照以及高密度聚乙烯作為陰性 對(duì)照。與提取的條件相關(guān)，因?yàn)椴牧系暮穸?gt; 0. 5mm,因此使3cm2的材料與充當(dāng)提取劑的 Iml培養(yǎng)基接觸。測(cè)試所述材料的細(xì)胞毒性所用的細(xì)胞系是在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培 養(yǎng)的小鼠成纖維細(xì)胞系。
通過(guò)MTT試驗(yàn)測(cè)定具有結(jié)構(gòu)化孔隙的三斜磷鈣石的細(xì)胞毒性和增殖。該試驗(yàn)基于 通過(guò)線粒體酶琥珀酸脫氫酶，使MTT代謝還原為有色化合物(甲月替)，并且根據(jù)已確定的 陽(yáng)性和陰性對(duì)照，測(cè)定已經(jīng)與本發(fā)明的三斜磷鈣石接觸的細(xì)胞的線粒體的功能。培養(yǎng)物中 的活細(xì)胞的量因此與所產(chǎn)生的甲月替的量成比例，并且因此與通過(guò)分光光度計(jì)記錄的吸光 度的量成比例。商品化細(xì)胞毒性標(biāo)準(zhǔn)生物材料被用作陽(yáng)性對(duì)照，而同樣是商品化的高密度聚乙烯 和vicryl被用作陰性對(duì)照。在圖9中，觀察到每種情況中關(guān)于細(xì)胞獲得的增殖曲線 的圖示。所獲得的結(jié)果沒有顯示細(xì)胞在本發(fā)明的結(jié)構(gòu)化三斜磷鈣石中與在陰性對(duì)照 中的增殖之間存在顯著的差異，這證明本發(fā)明的具有結(jié)構(gòu)化孔隙的三斜磷鈣石基質(zhì)不是細(xì) 胞毒性的生物材料。4. 2致突變件在遺傳毒性試驗(yàn)中，哺乳動(dòng)物或非哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)或其他技術(shù)被用來(lái)測(cè)定基因 突變、結(jié)構(gòu)或者染色體數(shù)目的變化以及由保健產(chǎn)品、材料和/或其提取物引起的其他DNA或 基因的改變。通過(guò)被稱為“小鼠淋巴瘤試驗(yàn)”的試驗(yàn)來(lái)測(cè)定本發(fā)明的具有結(jié)構(gòu)化孔隙的三斜磷 鈣石的體外致突變的可能。所述試驗(yàn)基于定量L5178TK+/-小鼠淋巴瘤細(xì)胞——所述細(xì)胞 在用具有結(jié)構(gòu)化孔隙的三斜磷鈣石生物材料處理之后是被誘導(dǎo)的或非誘導(dǎo)的——中的胸 苷激酶基因的突變。由于TK-/-突變而在胸苷激酶(TK)基因上不足的細(xì)胞能夠抵抗三氟 胸苷(TFT)的細(xì)胞毒性效應(yīng)。能夠產(chǎn)生TK的細(xì)胞對(duì)TFT敏感，這抑制代謝作用并中止細(xì)胞 分裂。因此，突變細(xì)胞在TFT存在下能夠增殖，而含有至少一個(gè)TK基因的等位基因的正常 細(xì)胞則不能。該試驗(yàn)在96孔板中進(jìn)行，并且在目測(cè)計(jì)數(shù)陽(yáng)性孔(圖IOa和b，其中觀察到細(xì) 胞菌落的生長(zhǎng))和陰性孔(圖IOc和d，其中沒有觀察到細(xì)胞菌落的生長(zhǎng))之后獲得最終 結(jié)果。在每個(gè)96孔板的陽(yáng)性孔和陰性孔已經(jīng)被計(jì)數(shù)之后，應(yīng)用針對(duì)該試驗(yàn)建立的一系列公 式，并且結(jié)果以突變頻率表達(dá)。為進(jìn)行該試驗(yàn)，在存在以及不存在合適的代謝活化系統(tǒng)的情況下，使細(xì)胞暴露于 待測(cè)試的產(chǎn)品，已知可能偶爾發(fā)生待測(cè)試的產(chǎn)品不是誘變的，但是體內(nèi)從該產(chǎn)品產(chǎn)生的代 謝產(chǎn)物是誘變的。最常用來(lái)體外模擬肝代謝的系統(tǒng)是被稱為S9的去線粒體片段——其已經(jīng)被添加 以輔助因子并且其得自用諸如Aroclor 12M等的酶誘導(dǎo)劑處理的鼠肝。因此，在細(xì)胞處理 之前，待測(cè)試的產(chǎn)品用被稱為S9的混合物處理2小時(shí)，并且在該時(shí)間之后，用離心該混合物 之后從其獲得的上清液處理細(xì)胞。下述產(chǎn)品用來(lái)處理細(xì)胞-作為陽(yáng)性對(duì)照·甲磺酸甲酯(MMS)，不存在代謝活化的情況。· 3-甲基膽蒽(3-MCA)，存在代謝活化的情況。-作為陰性對(duì)照· L5178YTK+/"細(xì)胞的培養(yǎng)基，溫育Mh?！?L5178YTK+/"細(xì)胞的培養(yǎng)基，在存在代謝活化的情況溫育Mh。
-作為待測(cè)試的產(chǎn)品· L5178YTK+/"細(xì)胞的培養(yǎng)基，與三斜磷鈣石生物材料溫育Mh?！?L5178YTK+/"細(xì)胞的培養(yǎng)基，在存在代謝活化的情況與三斜磷鈣石生物材料溫 育 24h。得到的結(jié)果(示于圖11中)顯示，在存在以及不存在代謝活化的情況下，觀察到， 在實(shí)驗(yàn)中使用的陰性對(duì)照誘導(dǎo)低突變頻率，類似于在存在具有結(jié)構(gòu)化孔隙的三斜磷鈣石時(shí) 進(jìn)行培養(yǎng)的細(xì)胞的突變頻率。用它們的培養(yǎng)基培養(yǎng)的突變細(xì)胞的存在是由于這些細(xì)胞的高 自發(fā)突變率，因此，這種突變頻率被確定為基本情況。關(guān)于陽(yáng)性對(duì)照，在L5178YTK+/-細(xì)胞 中誘導(dǎo)的突變頻率明顯高于被三斜磷鈣石或培養(yǎng)基誘導(dǎo)的突變頻率(比這兩種情況中的 突變頻率高大約7倍)。這些結(jié)果證實(shí)所述三斜磷鈣石不是誘變性的生物材料。4. 3血液相容件這些試驗(yàn)利用合適的模型或系統(tǒng)評(píng)價(jià)由與血液接觸的保健產(chǎn)品或材料引起的對(duì) 血液或其成分的影響。溶血試驗(yàn)測(cè)定由保健產(chǎn)品、材料和/或其提取物在體外引起的紅細(xì) 胞溶解程度以及血紅蛋白的釋放。本發(fā)明的具有結(jié)構(gòu)化孔隙的三斜磷鈣石的血液相容性通過(guò)比色測(cè)定來(lái)測(cè)定，所述 比色測(cè)定用于測(cè)定當(dāng)血液暴露于三斜磷鈣石時(shí)總的血紅蛋白和被釋放進(jìn)入血漿中的血紅 蛋白。已知生物材料處于固相，與三斜磷鈣石接觸M小時(shí)的細(xì)胞(成骨細(xì)胞和AMSC)的培 養(yǎng)基被測(cè)試。結(jié)果顯示，在所有情況下，校準(zhǔn)、樣品和質(zhì)量對(duì)照系的變化系數(shù)(％ CV)彡20% (除校準(zhǔn)6的情況外)，并且質(zhì)量對(duì)照系的2/3的值相對(duì)于理論值(％ PVDF) ^ 20%具有差 異百分比，因此該試驗(yàn)的結(jié)果在確定的驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)。所使用的化合物的溶血百分比為下述，將10. 19mg/ml血液的血紅蛋白濃度值看 作100%溶血
權(quán)利要求
1.具有結(jié)構(gòu)化孔隙的三斜磷鈣石的三維基質(zhì)，其特征在于，在其結(jié)構(gòu)中具有直徑在 350 μ m與650 μ m之間的垂直的圓柱形大孔，所述大孔從一端到另一端縱向穿過(guò)所述基質(zhì)， 各大孔相互之間的間隔在0. 4mm-0. 6mm之間。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有結(jié)構(gòu)化孔隙的三斜磷鈣石的三維基質(zhì)，其特征在于，所 述大孔的直徑優(yōu)選為500 μ m士 60 μ m。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的具有結(jié)構(gòu)化孔隙的三斜磷鈣石的三維基質(zhì)，其特征在于，所 述大孔相互之間的距離優(yōu)選為0. 5mm士60 μ m。
4.根據(jù)前述各項(xiàng)權(quán)利要求所述的具有結(jié)構(gòu)化孔隙的三斜磷鈣石的三維基質(zhì)，其特征在 于，所述基質(zhì)的三斜磷鈣石含量是至少90%。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的具有結(jié)構(gòu)化孔隙的三斜磷鈣石的三維基質(zhì)，其特征在于，所 述基質(zhì)的三斜磷鈣石含量?jī)?yōu)選為95%。
6.根據(jù)權(quán)利要求4和5所述的具有結(jié)構(gòu)化孔隙的三斜磷鈣石的三維基質(zhì)，其特征在于， 所述基質(zhì)的三斜磷鈣石含量更優(yōu)選為100%。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求所述的具有結(jié)構(gòu)化孔隙的三斜磷鈣石的三維基質(zhì)，其特征在于， 所述基質(zhì)通過(guò)對(duì)前體材料進(jìn)行熱轉(zhuǎn)化而獲得。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的具有結(jié)構(gòu)化孔隙的三斜磷鈣石的三維基質(zhì)，其特征在于，被 熱轉(zhuǎn)化成三斜磷鈣石的所述前體材料由固相混合物構(gòu)成，所述固相混合物由堿性磷酸鈣、 酸性磷酸鈣、孔誘導(dǎo)劑和緩凝劑形成，所述固相混合物通過(guò)添加蒸餾水被固化。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的具有結(jié)構(gòu)化孔隙的三斜磷鈣石的三維基質(zhì)，其特征在于，堿 性磷酸鹽/酸性磷酸鹽的摩爾比是1. 6-1. 8，孔誘導(dǎo)劑的濃度是l-20wt%，緩凝劑的濃度在 0. 4-0. 6wt%之間，且粉末/液體的比例為3。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的具有結(jié)構(gòu)化孔隙的三斜磷鈣石的三維基質(zhì)，其特征在于，所 述堿性磷酸鹽/酸性磷酸鹽的摩爾比是1. 785，所述孔誘導(dǎo)劑的濃度是3-lOwt %，所述緩凝 劑的濃度是0. 5#t%。
11.根據(jù)權(quán)利要求7至10所述的具有結(jié)構(gòu)化孔隙的三斜磷鈣石的三維基質(zhì)，其特征 在于，所述酸性磷酸鈣是磷酸一鈣，所述堿性磷酸鈣是β -磷酸三鈣，所述孔誘導(dǎo)劑是碳酸 鈣，以及所述緩凝劑是焦磷酸鈉。
12.根據(jù)權(quán)利要求7至11所述的具有結(jié)構(gòu)化孔隙的三斜磷鈣石的三維基質(zhì)，其特征在 于，所述前體材料是透鈣磷石。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求所述的具有結(jié)構(gòu)化孔隙的三斜磷鈣石的三維基質(zhì)，其特征在于， 所述基質(zhì)能夠采用修復(fù)特定骨或組織缺損所需的任何類型的形狀。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的基質(zhì)，其特征在于，所述基質(zhì)由圓柱體構(gòu)成，所述圓柱體的 底部直徑在2mm至50mm之間，高度在Imm至50mm之間。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的基質(zhì)，其特征在于，所述圓柱體的底部直徑在2mm至15mm 之間，高度在Imm至5mm之間。
16.根據(jù)權(quán)利要求14-15所述的基質(zhì)，其特征在于，其具有0.5mm的無(wú)大孔的最小周邊 區(qū)域。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的基質(zhì)，其特征在于，所述圓柱體的底部直徑為10mm，高度為 5mm,并具有直徑為500 μ m士60 μ m的64個(gè)圓柱形大孔，相對(duì)于自所述圓柱體邊緣朝向其中心的0. 5mm的周邊區(qū)域——此區(qū)域無(wú)大孔，所述大孔彼此均勻地間隔0. 5mm士60 μ m,并縱向穿過(guò)所述基質(zhì)。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的基質(zhì)，其特征在于，所述圓柱體的底部直徑為10mm，高度為 3mm,并具有直徑為500 μ m士60 μ m的64個(gè)圓柱形大孔，相對(duì)于自所述圓柱體邊緣朝向其中 心的0. 5mm的周邊區(qū)域——此區(qū)域無(wú)大孔，所述大孔彼此均勻地間隔0. 5mm士60 μ m,并縱 向穿過(guò)所述基質(zhì)。
19.根據(jù)權(quán)利要求16所述的基質(zhì)，其特征在于，所述圓柱體的底部直徑為8mm，高度為 5mm,并具有直徑為500 μ m士60 μ m的39個(gè)圓柱形大孔，相對(duì)于自所述圓柱體邊緣朝向其中 心的0. 5mm的周邊區(qū)域——此區(qū)域無(wú)大孔，所述大孔彼此均勻地間隔0. 5mm士60 μ m,并縱 向穿過(guò)所述基質(zhì)。
20.根據(jù)權(quán)利要求16所述的基質(zhì)，其特征在于，所述圓柱體的底部直徑為8mm，高度為 3mm,并具有直徑為500 μ m士60 μ m的39個(gè)圓柱形大孔，相對(duì)于自所述圓柱體邊緣朝向其中 心的0. 5mm的周邊區(qū)域——此區(qū)域無(wú)大孔，所述大孔彼此均勻地間隔0. 5mm士60 μ m,并縱 向穿過(guò)所述基質(zhì)。
21.根據(jù)權(quán)利要求16所述的基質(zhì)，其特征在于，所述圓柱體的底部直徑為7mm，高度為 5mm,并具有直徑為500 μ m士60 μ m的28個(gè)圓柱形大孔，相對(duì)于自所述圓柱體邊緣朝向其中 心的0. 5mm的周邊區(qū)域——此區(qū)域無(wú)大孔，所述大孔彼此均勻地間隔0. 5mm士60 μ m,并縱 向穿過(guò)所述基質(zhì)。
22.根據(jù)權(quán)利要求16所述的基質(zhì)，其特征在于，所述圓柱體的底部直徑為7mm，高度為 3mm,并具有直徑為500 μ m士60 μ m的28個(gè)圓柱形大孔，相對(duì)于自所述圓柱體邊緣朝向其中 心的0. 5mm的周邊區(qū)域——此區(qū)域無(wú)大孔，所述大孔彼此均勻地間隔0. 5mm士60 μ m,并縱 向穿過(guò)所述基質(zhì)。
23.根據(jù)權(quán)利要求16所述的基質(zhì)，其特征在于，所述圓柱體的底部直徑為5mm，高度為 3mm,并具有直徑為500 μ m士60 μ m的12個(gè)圓柱形大孔，相對(duì)于自所述圓柱體邊緣朝向其中 心的0. 5mm的周邊區(qū)域——此區(qū)域無(wú)大孔，所述大孔彼此均勻地間隔0. 5mm士60 μ m,并縱 向穿過(guò)所述基質(zhì)。
24.用于制備如權(quán)利要求1至23任一項(xiàng)所述的三維基質(zhì)的模，其特征在于，其具有均勻 分布的、直徑為350 μ m-650 μ m的沖孔，所述沖孔彼此均勻地間隔0. 4mm_0. 6mm。
25.根據(jù)權(quán)利要求M所述的模，其特征在于，所述模由硅酮、金屬、耐受性塑料或任何 其他材料形成。
26.根據(jù)權(quán)利要求M至25所述的模，其特征在于，所述模能夠采用修復(fù)特定骨或組織 缺損所需的任何類型的形狀。
27.根據(jù)權(quán)利要求沈所述的模，其特征在于，所述模為圓柱體形狀，所述圓柱體的底部 直徑在2mm與50mm之間，高度在Imm與50mm之間。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的模，其特征在于，所述模為圓柱體形狀，所述圓柱體的底部 直徑在2mm與15mm之間，高度在Imm與5mm之間。
29.根據(jù)權(quán)利要求觀所述的模，其特征在于，所述圓柱體直徑為10mm，高度為5mm，并具 有底部直徑為500 μ m士60 μ m的64個(gè)圓柱形沖孔，相對(duì)于不具有沖孔的0. 5mm寬的周邊區(qū) 域——自圓柱體邊緣向其中心量取，所述沖孔彼此間隔0. 5mm士60 μ m均勻地分布。
30.根據(jù)權(quán)利要求觀所述的模，其特征在于，所述圓柱體直徑為10mm，高度為3mm，并具 有底部直徑為500 μ m士60 μ m的64個(gè)圓柱形沖孔，相對(duì)于不具有沖孔的0. 5mm寬的周邊區(qū) 域——自圓柱體邊緣向其中心量取，所述沖孔彼此間隔0. 5mm士60 μ m均勻地分布。
31.根據(jù)權(quán)利要求觀所述的模，其特征在于，所述圓柱體直徑為8mm，高度為5mm，并具 有底部直徑為500 μ m士60 μ m的39個(gè)圓柱形沖孔，相對(duì)于不具有沖孔的0. 5mm寬的周邊區(qū) 域——自圓柱體邊緣向其中心量取，所述沖孔彼此間隔0. 5mm士60 μ m均勻地分布。
32.根據(jù)權(quán)利要求觀所述的模，其特征在于，所述圓柱體直徑為8mm，高度為3mm，并具 有底部直徑為500 μ m士60 μ m的39個(gè)圓柱形沖孔，相對(duì)于不具有沖孔的0. 5mm寬的周邊區(qū) 域——自圓柱體邊緣向其中心量取，所述沖孔彼此間隔0. 5mm士60 μ m均勻地分布。
33.根據(jù)權(quán)利要求觀所述的模，其特征在于，所述圓柱體直徑為7mm，高度為5mm，并具 有底部直徑為500 μ m士60 μ m的28個(gè)圓柱形沖孔，相對(duì)于不具有沖孔的0. 5mm寬的周邊區(qū) 域——自圓柱體邊緣向其中心量取，所述沖孔彼此間隔0. 5mm士60 μ m均勻地分布。
34.根據(jù)權(quán)利要求觀所述的模，其特征在于，所述圓柱體直徑為7mm，高度為3mm，并具 有底部直徑為500 μ m士60 μ m的28個(gè)圓柱形沖孔，相對(duì)于不具有沖孔的0. 5mm寬的周邊區(qū) 域——自圓柱體邊緣向其中心量取，所述沖孔彼此間隔0. 5mm士60 μ m均勻地分布。
35.根據(jù)權(quán)利要求觀所述的模，其特征在于，所述圓柱體直徑為5mm，高度為3mm，并具 有底部直徑為500 μ m士60 μ m的12個(gè)圓柱形沖孔，相對(duì)于不具有沖孔的0. 5mm寬的周邊區(qū) 域——自圓柱體邊緣向其中心量取，所述沖孔彼此間隔0. 5mm士60 μ m均勻地分布。
36.具有結(jié)構(gòu)化孔隙的三斜磷鈣石的三維基質(zhì)的合成方法，其特征在于，包括下述步驟1)混合由堿性磷酸鈣、酸性磷酸鈣、孔誘導(dǎo)劑和緩凝劑形成的固相，所述固相通過(guò)添加 蒸餾水產(chǎn)生液相而進(jìn)行固化；2)在所述固化期間在粘漿中應(yīng)用至少一種模，以產(chǎn)生直徑在350μ m與650 μ m之間的 垂直的圓柱形大孔，所述大孔彼此均勻地間隔0. 4mm-0. 6mm ；3)使所形成的前體材料滅菌并使其熱轉(zhuǎn)化成三斜磷鈣石。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的合成方法，其特征在于，在步驟1中，所述堿性磷酸鹽/ 酸性磷酸鹽的摩爾比是1. 6-1. 8，所述孔誘導(dǎo)劑的濃度是l-20wt%，所述緩凝劑的濃度在 0. 4-0. 6wt%之間，并且粉末/液體的比例為3。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的合成方法，其特征在于，在步驟1中，所述堿性磷酸鹽/ 酸性磷酸鹽的摩爾比是1.785，所述孔誘導(dǎo)劑的濃度是3-10wt%，所述緩凝劑的濃度是 0. 54wt%。
39.根據(jù)權(quán)利要求36-38所述的合成方法，其特征在于，在步驟1中，所述酸性磷酸鈣是 磷酸一鈣，所述堿性磷酸鈣是β -磷酸三鈣，所述孔誘導(dǎo)劑是碳酸鈣，以及所述緩凝劑是焦 磷酸鈉。
40.根據(jù)權(quán)利要求36至39所述的合成方法，其特征在于，階段1的產(chǎn)物的透鈣磷石。
41.根據(jù)權(quán)利要求36至40所述的合成方法，其特征在于，在步驟3中加熱滅菌通過(guò)高 壓滅菌進(jìn)行。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的合成方法，其特征在于，所述高壓滅菌在120°C-13(TC下進(jìn) 行M-25分鐘。
43.根據(jù)權(quán)利要求36至42所述的方法，其特征在于，在步驟2中，所使用的模由根據(jù)權(quán) 利要求M至35所述的模構(gòu)成。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其特征在于，在使用根據(jù)權(quán)利要求M至35的模之 前，使用硅酮模，其為圓柱體形式，所述圓柱體的底部直徑在2mm與50mm之間，高度在Imm 與50mm之間。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，所述硅酮模為圓柱體形式，所述圓柱體 的底部直徑在2mm與15mm之間，高度在Imm與5mm之間。
46.根據(jù)權(quán)利要求43至45任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述模是由根據(jù)權(quán)利要求 四所述的模構(gòu)成。
47.根據(jù)權(quán)利要求43至45任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述模是由根據(jù)權(quán)利要求 30所述的模構(gòu)成。
48.根據(jù)權(quán)利要求43至45任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述模是由根據(jù)權(quán)利要求 31所述的模構(gòu)成。
49.根據(jù)權(quán)利要求43至45任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述模是由根據(jù)權(quán)利要求 32所述的模構(gòu)成。
50.根據(jù)權(quán)利要求43至45任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述模是由根據(jù)權(quán)利要求 33所述的模構(gòu)成。
51.根據(jù)權(quán)利要求43至45任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述模是由根據(jù)權(quán)利要求 34所述的模構(gòu)成。
52.根據(jù)權(quán)利要求43至45任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述模是由根據(jù)權(quán)利要求 35所述的模構(gòu)成。
53.根據(jù)權(quán)利要求M至35所述的模用于獲得采用其形狀的磷酸鈣的用途。
54.根據(jù)權(quán)利要求53所述的模的用途，其特征在于，所述磷酸鈣由三斜磷鈣石構(gòu)成。
55.根據(jù)權(quán)利要求1至23任一項(xiàng)所述的具有結(jié)構(gòu)化孔隙的三斜磷鈣石的三維基質(zhì)，其 特征在于，其另外包含細(xì)胞。
56.根據(jù)權(quán)利要求55所述的具有結(jié)構(gòu)化孔隙的三斜磷鈣石的三維基質(zhì)，其特征在于， 所述細(xì)胞是間充質(zhì)細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞或其組合。
57.根據(jù)權(quán)利要求1至23、55和56任一項(xiàng)所述的具有結(jié)構(gòu)化孔隙的三斜磷鈣石的三維 基質(zhì)用來(lái)制備用于骨結(jié)構(gòu)再生的治療劑的用途。
58.根據(jù)權(quán)利要求57所述的三維基質(zhì)的用途，其特征在于，所述骨結(jié)構(gòu)再生的實(shí)施用 來(lái)消除骨質(zhì)疏松癥。
全文摘要
本發(fā)明涉及組織工程領(lǐng)域，且具體而言涉及骨再生領(lǐng)域。本發(fā)明涉及三斜磷鈣石的多孔三維基質(zhì)，所述基質(zhì)是生物形容的、具有預(yù)定義的結(jié)構(gòu)化孔隙，及可再吸收的，還涉及能夠生產(chǎn)所述材料的合成方法及所述材料的應(yīng)用。這些基質(zhì)是用于細(xì)胞定居和增殖的完美基底，由于其具有生物相容性、再吸收性、骨誘導(dǎo)性、血管再形成等有利性質(zhì)，使得其能夠應(yīng)用于組織工程和骨再生中。
文檔編號(hào)A61F2/02GK102089238SQ200980126930
公開日2011年6月8日 申請(qǐng)日期2009年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月8日
發(fā)明者卡門·魯埃達(dá)·羅德里格斯, 德爾·奧爾莫·巴斯特里夏, 恩里克·洛佩斯·卡巴科斯, 法萊·塔米米·馬力諾, 瑪麗亞·德洛麗絲·加西亞·瓦茲奎茲, 瑪麗亞·畢格納·卡斯特羅·費(fèi)奧, 穆罕默德·哈姆丹·阿利·阿爾卡萊斯特, 胡里奧·方特·佩雷斯, 豪爾赫·盧比奧·雷塔馬 申請(qǐng)人:海斯特賽爾有限公司