專利名稱：用于治療口腔疾病的來自藍(lán)細(xì)菌的糖脂級(jí)分的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于口腔衛(wèi)生和口腔疾病治療的輔佐劑領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
牙周炎是由某些革蘭氏陰性菌物種引起的口腔疾病。它是一種慢性口腔組織 炎性疾病，特征是引起支撐牙齒的組織不可逆損壞的慢性細(xì)菌感染。這是一種極為常 見的疾病，它以不同的嚴(yán)重程度影響著約3/4的成年人群(1)。齦下組織的特征是存在 許多細(xì)菌物種，但是它們中僅有少數(shù)是牙周炎開始和進(jìn)展的原因。這些細(xì)菌是作為兼 性厭氧菌或?qū)Ｐ詤捬蹙?種革蘭氏陰性菌物種(伴放線放線桿菌(Actinobacillum actinomycetemconcomitans)、牙銀紅掠色單胞菌(Porphyromonas gingivalis)、福塞思 坦納菌(Tannerella forsythia)、齒垢密螺旋體(Ti^ponema denticola))，它們產(chǎn)生容許 它們定殖在齦下區(qū)域的大量因子以抵抗宿主免疫系統(tǒng)并引起組織損壞0-4)。然而，在這 些細(xì)菌中，牙齦紅棕色單胞菌(P. gingivalis)是最常與晚期牙周炎相關(guān)的細(xì)菌。牙周疾 病的發(fā)病率和進(jìn)展程度涉及牙周致病菌(periodontopatic bacteria)和宿主免疫系統(tǒng) 之間的復(fù)雜的相互作用。已顯示這些細(xì)菌和它們的產(chǎn)物對宿主免疫細(xì)胞的激活導(dǎo)致諸如 細(xì)胞因子和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的大量促炎性介質(zhì)的分泌，所述促炎性介質(zhì)調(diào)控牙周 組織的損壞并且還誘導(dǎo)破骨細(xì)胞發(fā)生O)。在革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁上所存在的脂多糖 (lypopolisaccharide,LPS)是可以觸發(fā)免疫細(xì)胞釋放促炎性介質(zhì)的主要因子，所述免疫細(xì) 胞位于口腔粘膜中或在感染過程期間被募集，例如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、多形核白細(xì)胞、樹 突細(xì)胞G-6)。牙周炎的專業(yè)治療是通過使用口腔衛(wèi)生輔助用品如牙膏和漱口劑維持的，口 腔衛(wèi)生輔助用品優(yōu)選含有消毒劑或廣譜抗菌劑，例如三氯生、氯己定或者在某些情況下是 抗體。然而，根據(jù)最近的研究，這種消毒劑和/或抗菌劑的使用由于若干原因而不是完全可 取的，首要原因當(dāng)然是諸如三氯生的某些化合物的明顯的細(xì)胞毒性。這是它們的使用甚至 在歐共體的一些國家被禁止的一個(gè)原因，并且第二大原因是主要的促炎性刺激物L(fēng)PS(或 與LPS類似的分子)不會(huì)被漱口劑和/或牙膏中所通常存在的殺菌活性滅活；然后LPS作 為促炎性刺激物的影響甚至維持到細(xì)菌感染根除之后。第三大原因是廣譜抗微生物活性具 有還會(huì)除去“有用，，或“有益”菌叢的不良副作用。因此，重要的是即便使用正常的口腔衛(wèi) 生保護(hù)劑也不特異性地消除促炎活性。因此，在牙科領(lǐng)域中高度期望的是開發(fā)除了消除細(xì) 菌病原體外還促進(jìn)特異性地抑制相關(guān)的促炎性刺激物的口腔衛(wèi)生制劑。發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于治療和/或預(yù)防細(xì)菌性齦疾病的來自O(shè)scillatoria Planktothrix sp.的糖脂級(jí)分，其中蛋白污染低于2%并且核酸污染低于5%。齦疾病的 病因優(yōu)選是由于選自包括下列的組的厭氧菌所引起的感染伴放線放線桿菌、牙齦紅棕色 單胞菌、福塞思坦納菌、齒垢密螺旋體和更優(yōu)選牙齦紅棕色單胞菌。齦疾病優(yōu)選為齦炎和牙 周炎(膿溢)。本發(fā)明的又一目的是包含上述糖脂級(jí)分的牙科組合物，所述糖脂級(jí)分優(yōu)選 以在0. 1至ΙΟΟμ g/ml之間的范圍內(nèi)的量，所述組合物包含作為成分和/或稀釋劑和/或穩(wěn)定劑和/或添加劑的適于口服施用的化合物和任選的一種或多種不同的活性成分。優(yōu)選 地，活性級(jí)分的濃度包括1至50 μ g/ml，對于糊劑或凝膠優(yōu)選為4-20μ g/ml并且對于漱口 劑優(yōu)選為1-5 μ g/ml0本發(fā)明的另一目的是用于由Oscillatoria Planktothrix sp.制備 適于口服使用的糖脂級(jí)分的方法。附圖簡述

圖1.在來自牙齦紅棕色單胞菌的LPS之后30、60、120、240分鐘同時(shí)添加的藍(lán)細(xì) 菌提取物(CE) (20 μ g/ml)存在下對促炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生的抑制。部分A:TNF-ci ；部分B: IL-6 ；部分 C JL-8 ；部分 C =IL-I β。發(fā)明詳述最近，據(jù)顯示由藍(lán)細(xì)菌Oscillatoria Planktothrix FPl制備的糖脂提取物能夠 在人樹突細(xì)胞中拮抗TLR4受體LPS激動(dòng)劑如來自大腸桿菌(E. coli)和馬流產(chǎn)沙門氏菌 (S. abortus equi)的LPS所觸發(fā)的促炎作用(10)。本發(fā)明是源于如下的進(jìn)一步觀察所 述提取物還拮抗來自牙齦紅棕色單胞菌(P.gingivalis)的LPS的促炎作用。牙齦紅棕色 單胞菌是與牙周炎或慢性牙周炎相關(guān)的最常見細(xì)菌，已顯示它是牙周炎或慢性牙周炎的主 要病原體。具體地，促炎反應(yīng)與如(9)中所述純化的其組分LPS和Fiml的存在相關(guān)。目前 認(rèn)為這些組分是與牙齦紅棕色單胞菌感染相關(guān)的牙周組織損壞的主要起因，牙齦紅棕色單 胞菌感染通常伴有破骨細(xì)胞發(fā)生(造成骨組織損傷的破骨細(xì)胞數(shù)目增加)和慢性感染。由 于之前顯示的對大腸桿菌和馬流產(chǎn)沙門氏菌LPS的活性，本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)尤其令人驚訝，這 是因?yàn)閬碜匝例l紅棕色單胞菌的LPS通過與TLR2受體的相互作用發(fā)揮其活性(7-9)，而許 多細(xì)菌LPS則通過與屬于Toll樣受體家族(TLR)的TLR4膜受體的相互作用激活先天性免 疫細(xì)胞。因此，根據(jù)第一方面，本發(fā)明涉及用于預(yù)防和/或治療齦疾病和細(xì)菌性牙周炎的 Oscillatoria Planktothrix sp.糖脂級(jí)分，其分離和生長條件描述于(12)中。對人單核細(xì)胞系的體外研究已顯示來自O(shè)scillator Planktothrix sp.的糖脂 級(jí)分能夠主要拮抗牙齦紅棕色單胞菌的LPS所誘導(dǎo)的促炎作用(即，細(xì)胞因子和促炎性趨 化因子的產(chǎn)生)。因此，這代表了抵抗以下病癥的良好候選物齒齦炎癥(齦炎)和輕度與 重度牙槽炎癥病癥(牙周炎或膿溢)、與慢性感染相關(guān)的牙周組織的損壞和在這些感染中 常見的最嚴(yán)重的破骨細(xì)胞發(fā)生現(xiàn)象。體外研究還顯示如在細(xì)胞系以及從人血分離的PBMC 中的細(xì)胞毒性測定所估計(jì)的，根據(jù)本發(fā)明制備的藍(lán)細(xì)菌提取物對于哺乳動(dòng)物細(xì)胞沒有細(xì)胞 毒性，所述藍(lán)細(xì)菌提取物顯示出低于2%的蛋白污染水平和低于5%的核酸污染水平。因 此，可以要求保護(hù)它們以如下兩種形式用于口腔治療的用途用于專業(yè)治療齒齦疾病尤其 齦炎、膿溢和牙周炎的組合物形式和用作口腔衛(wèi)生輔劑的組合物形式，例如漱口劑、凝膠、 糊劑或可以在口中咀嚼或溶解的裝置，例如口香糖或糖果。已經(jīng)體外在細(xì)胞系統(tǒng)中在最多 比最小有效濃度高100倍的濃度(100 μ g/ml)下測試出本發(fā)明的提取物缺乏細(xì)胞毒性。如 下所述制備的本發(fā)明的提取物是無嗅、無色和無味的因此如果與具有相同特征的其他成 分或組分組合，其還可能用于可在口腔中咀嚼或溶解的食物制劑中，例如以糖衣丸劑、口香 糖、糖果或丸劑(還與如木糖醇的其他活性物質(zhì)組合)形式。因此，含有提取物的組合物具 有在所描述的條件下缺乏細(xì)胞毒性和感官品質(zhì)令人滿意的有利特性。然而，為了改善后者， 組合物可以包含少量的芳香劑或著色劑和增甜劑。提取物以適于口腔施用的組合物形式方便地制備，并且可以作為保護(hù)制劑以更高或更低的濃縮形式制備，以便專業(yè)用于牙科清潔和用于預(yù)防和治療膿溢、更嚴(yán)重的齦炎和 一般的牙周炎，或者僅用作口腔衛(wèi)生的輔劑。根據(jù)本發(fā)明的組合物包含來自O(shè)scillator Planktothrix sp.的糖脂提取物，對于專業(yè)牙科治療制劑通常優(yōu)選為包括0. 1至100 μ g/ ml之間的量，更優(yōu)選為包括1至50 μ g/ml之間或甚至更優(yōu)選包括4至20 μ g/ml之間的量， 并且對于口腔衛(wèi)生的保護(hù)制劑在1至5 μ g/ml的范圍內(nèi)。此外，在一個(gè)優(yōu)選的方面，這些 組合物包含適用于口腔的賦形劑、稀釋劑和/或其他活性成分，諸如抑菌劑或殺菌劑，例 如季銨衍生物(例如西吡氯銨或氯己定、或表面活性劑、去垢劑、三氯生和類似化合物，如 DDDE 0，2，-二羥基-5. 5 二溴二苯醚)和穩(wěn)定劑。對于抗菌劑，還可以使用抗生素，諸如青 霉素、紅霉素或四環(huán)素或具有抗菌活性的其他藥物。本發(fā)明的組合物還可以包含已知的口 腔衛(wèi)生輔劑，例如，防齒垢化合物如多磷酸鹽、防蛀劑如氟化鹽(例如一氟磷酸鹽)、抗斑化 合物(例如，尿素、乳酸鈣或類似物)、鉀鹽如脫敏劑(例如，檸檬酸鉀或類似物)。糖脂提取物可以稀釋于水和諸如DMSO的非質(zhì)子溶劑中并且即便在其與例如氯己 定混合時(shí)在水溶液中也是穩(wěn)定的，此外，它還是熱穩(wěn)定的。在諸如漱口劑的制劑中，藍(lán)細(xì)菌 提取物在水溶液中或可以稀釋于水中，當(dāng)為固體組合物(牙膏、凝膠等糖果或口香糖)時(shí)， 它可以含有增稠劑或膠凝劑，如天然的或合成的多糖(例如，角叉膠、羧甲基纖維素、羥甲 基纖維素、葡聚糖、淀粉、植物甘油)；無定形二氧化硅或二氧化鈦；天然的或合成的橡膠 (例如，阿拉伯膠)聚乙烯吡咯酮、聚乙二醇或本領(lǐng)域的專家所熟知的能夠賦予類似特征的 化合物。根據(jù)又一方面，本發(fā)明涉及如Yi等人(11)所描述的由Oscillator Planktothrix sp.培養(yǎng)物制備糖脂級(jí)分的方法在18°C至30°C之間的室溫下處理樣品，持續(xù)至少5分鐘， 優(yōu)選至少10分鐘的短的孵育時(shí)間；所述方法包括另外的純化步驟，例如在用基于下列的試 劑提取之后在乙酸鈉和丙酮的存在下沉淀至少糖脂級(jí)分有機(jī)溶劑，優(yōu)選苯酚；離液劑(例 如硫氰酸胍)如Trireagent (Sigma目錄號(hào)T3934)或諸如Trizol⑧(Invitrogen)的 類似試劑以及諸如氯仿的第二有機(jī)溶劑；隨后用70%乙醇洗滌并通過用蛋白酶如蛋白酶 K消化而去除蛋白污染物。這些另外的處理容許達(dá)到更佳的比活性，因?yàn)樗鼈儗?dǎo)致諸如磷 脂和異源蛋白的污染物的去除，所述污染物可能對于促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生有刺激作用， 從而會(huì)使得提取物不太有效。污染物濃度的降低容許在口腔中使用更低濃度的粗提取物。 此外，用鹽(例如乙酸鈉)和諸如丙酮的有機(jī)溶劑進(jìn)行的沉淀以及用經(jīng)水稀釋的乙醇對沉 淀的進(jìn)一步洗滌容許消除殘留痕量的提取這種類型的細(xì)胞組分所需的毒性溶劑。根據(jù)優(yōu) 選的實(shí)施方案，用于Oscillator Planktothrix sp.提取物制備的方法提供了已經(jīng)在諸如 BGlKSigma-Aldrich目錄號(hào)C3061)的培養(yǎng)基中達(dá)到靜止生長期的藍(lán)細(xì)菌培養(yǎng)物的離心， 如在Pomati等人(12)中描述的。在提取過程之前可以冷凍如此獲得的沉淀，提取過程包 括在解凍之后，a)稀釋沉淀，優(yōu)選用等體積的水或含水溶劑進(jìn)行，b)與適當(dāng)體積的(1 中所描述的提取溶液(變性劑)混合，所述提取溶液優(yōu) 選由下列組成基于極性質(zhì)子有機(jī)溶劑的試劑，優(yōu)選苯酚；和離液劑(例如硫氰酸胍)如 Trireagent (Sigma 目錄號(hào) T3934)或類似試劑如 iTrizol (Invitrogen)；和有機(jī)非質(zhì) 子溶劑如氯仿，混合比例為約1體積藍(lán)細(xì)菌的含水懸浮液、2-4體積優(yōu)選約3體積的提取溶 液、和約0. 5-1體積的氯仿；c)在室溫下孵育混合物至少5分鐘，更優(yōu)選至少10分鐘；
d)離心，優(yōu)選在約2000 Xg下進(jìn)行并收集含有糖脂級(jí)分的上清液(水相)，糖脂級(jí) 分可以通過生物化學(xué)測定測量，例如通過電泳和銀染、或通過在LPS存在下的細(xì)胞毒性抑 制測定?？梢匀芜x通過再添加水或含水緩沖液(以約等于移除的量的量)并再離心樣品來 將在d)中所獲得的藍(lán)細(xì)菌裂解物(其是通過離心所獲得的沉淀)再抽提以獲得糖脂級(jí)分。 將第二上清液與第一上清液匯合并然后進(jìn)行如下的進(jìn)一步步驟e)通過添加諸如乙酸鈉(5_20mM終濃度)的鹽和等于約2體積的量的有機(jī)溶劑， 優(yōu)選丙酮進(jìn)行沉淀，隨后在與上述相同的條件下離心；f)用經(jīng)水稀釋的乙醇如70%乙醇洗滌通過離心所獲得的沉淀至少一次，優(yōu)選兩 次，并在水溶液中重懸所述沉淀，所述水溶液優(yōu)選為緩沖的水溶液，例如TRIS 50mM ；g)用核酸內(nèi)切酶和核酸外切酶(例如DNA酶和RNA酶)酶促處理核酸污染物并 隨后用優(yōu)選等于100yg/ml的量的蛋白酶如蛋白酶K處理蛋白污染物一段足夠的時(shí)間(在 37°C下至少1小時(shí))。在酶促消化之后，再次離心樣品，回收上清液并通過添加鹽(例如，乙 酸鈉，大約IOmM終濃度)和適當(dāng)體積(優(yōu)選2體積)的丙酮或其他有機(jī)溶劑而進(jìn)一步沉淀。 再次離心樣品，并在水中或水溶液中重懸沉淀，并通過使用30千道爾頓截留的濾器(或其 他合適的裝置)進(jìn)行分子篩分，從而導(dǎo)致通過濾器的每種成分被排除并使得保留的脂質(zhì)級(jí) 分連同水或緩沖的水溶液一起被回收。如下測量如此獲得的糖脂級(jí)分的活性通過基于在產(chǎn)生諸如IL-6、IL-8 TNF-α 和/或IL-Ιβ的細(xì)胞因子的細(xì)胞(諸如ΤΗΡ1)中LPS(來自牙齦紅棕色單胞菌或大腸桿 菌)誘導(dǎo)的促炎活性的抑制的生物測試；和/或通過生物化學(xué)測定，例如電泳。應(yīng)理解本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對上述過程進(jìn)行調(diào)整，在例如終濃度和/或體積和 /或離心條件方面具有小改動(dòng)，而不改變終產(chǎn)物的活性。根據(jù)又一方面，本發(fā)明涉及用于純化10)中所描述的糖脂級(jí)分的方法，該方法僅 包括上述步驟g)。移除痕量的有機(jī)溶劑如苯酚的步驟和去除大部分蛋白污染物的步驟對于應(yīng)用于 口腔是很重要的。事實(shí)上，如上所述獲得的糖脂提取物顯示出小于2%的蛋白污染和小于5%的核 酸污染，對于蛋白污染，根據(jù)通過用于蛋白測定的Bradford法進(jìn)行的測量，并且對于核酸 污染是根據(jù)通過用于核酸測定的260nm分光光度讀數(shù)的測量。根據(jù)優(yōu)選的方面，本發(fā)明涉及用于在受齦疾病影響的患者中預(yù)防和治療齦疾病的 方法，所述齦疾病的范圍以它們所有的不同階段從較輕的形式，如齦炎到最嚴(yán)重的形式，如 牙周炎(膿溢)，并且還包括慢性形式。該方法包括通過將糊劑或凝膠施用到感染部位或通 過連續(xù)使用根據(jù)本發(fā)明的口腔衛(wèi)生保護(hù)措施而用本發(fā)明的組合物之一治療口腔。此外，如上文所提到的，由于本發(fā)明組合物的抗促炎活性在細(xì)菌病原體根除之后 將繼續(xù)，所以我們認(rèn)為本發(fā)明用于治療和預(yù)防二者，因?yàn)樵谧顕?yán)重形式的膿溢中齒齦或齒 槽的炎癥在牙齒部位水平上的后果主要在于牙周袋的形成，這繼而會(huì)促進(jìn)細(xì)菌定殖、感染 復(fù)發(fā)和疾病的長期化。此外，如由所呈現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)而明顯的，粗提取物不僅在與促炎性刺激物(在LPS 來自牙齦紅棕色單胞菌的具體情況下存在)一起施用時(shí)拮抗促炎性刺激物，而且在促炎性刺激物之前或之后施用(多達(dá)至少4小時(shí)之后)時(shí)也可以。對于治療和/或預(yù)防，其意味 著牙醫(yī)的專業(yè)治療，例如通過使用如下的本發(fā)明裝置清除牙周袋，和維持較好的口腔衛(wèi)生 具有本發(fā)明的任何組合物和裝置的牙膏、凝膠、漱口劑、糖果或口香糖。本發(fā)明還包括所述組合物在輕度齦炎情況下用于治療齒齦發(fā)紅的美容用途。實(shí)驗(yàn)部分實(shí)施例1.從Oscillatoria Planktothrix FPl培養(yǎng)物制備提取物.通過對用于脂多糖(LPS)冷提取的方法適應(yīng)當(dāng)前需要的修改從藍(lán)細(xì)菌 Oscillatoria Planktothrix FPl (12)制備提取物，該方法目前僅用于革蘭氏陰性菌的LPS 提取，如Yi等人所描述的。詳細(xì)地，將藍(lán)細(xì)菌(CCAP 2第1459/45號(hào)，2008年7月9日， Scotland UK) 1 1稀釋于水中，與3體積(其中體積單位是稀釋于水中的藍(lán)細(xì)菌的總體 積)的Tri試劑(Sigma-Aldrich目錄號(hào)T3934)和1體積的氯仿混合，并在室溫下孵育10 分鐘。在孵育結(jié)束時(shí)，以2000Xg進(jìn)行離心15分鐘并收集含有活性級(jí)分的上清液(水 相)，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳，隨后銀染，進(jìn)行評(píng)定。這之后，通過再添加水(以等于移除 的量的量)從藍(lán)細(xì)菌進(jìn)一步提取，并再次離心樣品。用乙酸鈉(IOmM終濃度)、2體積丙酮沉 淀如此收集的上清液并離心。在離心結(jié)束時(shí)，移除上清液并用70%乙醇進(jìn)一步洗滌沉淀兩 次。隨后移除洗滌步驟的上清液并將沉淀溶解于50mm TRIS溶液中用于RNA酶和DNA酶消 化，然后在37°C下過夜孵育期間用蛋白酶K(100yg/ml)消化。第二天，將樣品以2000Xg 離心15分鐘，回收上清液并用乙酸鈉(IOmM終濃度)和2體積丙酮沉淀。將如此獲得的沉 淀重懸于水中并使其通過30KD截留的濾器，從而消除具有較低分子量的所有組分。將存留物再稀釋于合適體積的水中以便獲得用于后續(xù)生物測試的至少lmg/ml濃 度的糖脂級(jí)分。如此獲得的提取物顯示出小于2%的蛋白污染和小于5%的核酸污染。實(shí)施例2.牙齦紅棕色單胞菌LPS誘導(dǎo)的促炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生的抑制.使用如前述實(shí)施例中所述制備的來自O(shè)scillatoria Planktothrix FPl的糖脂級(jí) 分來在人單核細(xì)胞系(THPl)中體外研究對促炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生的作用。使單核細(xì)胞達(dá)到 0.5X106個(gè)細(xì)胞/ml的濃度，將其接種于M孔板(lml/孔)中并在不存在或存在各種濃度 (1-20μ g/ml)的藍(lán)細(xì)菌提取物的條件下用1 μ g/ml濃度的來自牙齦紅棕色單胞菌的LPS孵 育。還在僅存在濃度為10 μ g/ml的藍(lán)細(xì)菌提取物的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。將培養(yǎng)物在37°C下 具有5% C02的加濕的培養(yǎng)箱中孵育18-20小時(shí)。孵育后，收集上清液并通過使用夾心的 Diaclone ELISA 試劑盒(人 TNF-α ELISA 試劑盒目錄號(hào) 950. 090. 096、人 IL-6 ELISA 試劑 盒目錄號(hào) 950. 030. 096、人 IL-8 ELISA 試劑盒目錄號(hào) 850. 050. 096、人 ILl-β ELISA 試劑 盒目錄號(hào)850. 006. 096)定量促炎性細(xì)胞因子(5)。結(jié)果顯示藍(lán)細(xì)菌提取物不能夠在THP-I細(xì)胞中誘導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生。在存在刺激單核細(xì)胞系中細(xì)胞因子產(chǎn)生的1 μ g/ml超純的來自牙齦紅棕色單 胞菌的LPS anvivogen LPS-PG)的條件下，同時(shí)添加到細(xì)菌LPS的提取物以劑量/反 應(yīng)依賴性方式顯著地抑制腫瘤壞死因子a (TNF-a)、白細(xì)胞介素6(IL_6)、白細(xì)胞介素 1 β (IL-1 β )、白細(xì)胞介素8 (IL-8)的產(chǎn)生。將牙齦紅棕色單胞菌LPS誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生作為100%，濃度為Iyg/ ml的粗提物被證明能夠?qū)NF-α的產(chǎn)生抑制90% 士 10，將IL-6的產(chǎn)生抑制92% 士5，將IL-8的產(chǎn)生抑制75 士 10%，將IL-I β的產(chǎn)生抑制62 士8% (百分比代表三次重復(fù)的數(shù)據(jù)的 平均值)。證明在20μ g/ml的濃度下，提取物能夠強(qiáng)烈的抑制所測試的促炎性細(xì)胞因子的 產(chǎn)生，區(qū)間在95%至100%之間(圖1)。證明在20 μ g/ml的濃度下，提取物即使在牙齦紅 棕色單胞菌的LPS之后幾小時(shí)添加時(shí)也能夠施加其抑制作用(圖1，1-4部分，多達(dá)4小時(shí) 之后)。實(shí)施例3.在復(fù)合的混合物中藍(lán)細(xì)菌提取物的毒性、穩(wěn)定性和溶解性的評(píng)定.毒性在包括1至100 μ g/ml之間的濃度下，在不同的細(xì)胞系(THP1、RAW264. 7、 SKMEL-28.HEY4.SHSY-5Y)中和在自外周血獲得的單核細(xì)胞(PBMC，外周血單核細(xì)胞)中均 測試了 Oscillatoria Planktothrix FPl提取物，并且證明其即使在最高濃度(100 μ g/ml) 下使用時(shí)也是無毒的。溶液中的穩(wěn)定性將如實(shí)施例1中所述制備的Oscillatoria Planktothrix FPl提取物與葡萄糖酸 氯己定在室溫下在水中混合30分鐘；隨后，純化以去除氯己定，再次測試其對單核細(xì)胞培 養(yǎng)物的作用。結(jié)果顯示如通過抑制來自牙齦紅棕色單胞菌的LPS誘導(dǎo)的TNF-α產(chǎn)生的能 力所測量的，糖脂提取物保留其活性。通過與在不存在氯己定的條件下所觀察到的那些抑 制相類比，在存在濃度為l、2、4yg/ml的提取物的情況下抑制分別為95%、96%和99%。 在孵育時(shí)間結(jié)束時(shí)檢查相同培養(yǎng)物中的細(xì)胞成活力，證明細(xì)胞成活力在所有培養(yǎng)物中均為 100%。固體基質(zhì)中的穩(wěn)定性將Oscillatoria Planktothrix FPl提取物包埋在羥乙基纖維素基質(zhì)中，并且在 一個(gè)月后測試生物活性。同樣在這種情況下，結(jié)果顯示糖脂提取物保留其生物活性，在1、2、 4 μ g/ml的濃度下的抑制程度分別等于90%、93%和96%，且不影響細(xì)胞成活力。熱穩(wěn)定性將如實(shí)施例1中所述制備并且溶解在水中的Oscillatoria Planktothrix FPl提 取物升至100°C持續(xù)5分鐘，并隨后測試生物活性。即使在這種情況下，結(jié)果顯示糖脂提取 物保留對牙齦紅棕色單胞菌LPS誘導(dǎo)的TNF-α產(chǎn)生的抑制活性而不影響細(xì)胞成活力。溶解性將在實(shí)施例1中制備的Oscillatoria Planktothrix FPl提取物以最多比實(shí)施例 2中所描述的實(shí)驗(yàn)中測試的最佳濃度高100倍的不同濃度溶解于水中。表1呈現(xiàn)了在水和二甲基亞砜(DMSO)中的溶解性的數(shù)據(jù)。表1 糖脂提取物的溶解性
權(quán)利要求
1.來自O(shè)scillatoriaPlanktothrix sp.的糖脂級(jí)分，所述糖脂級(jí)分用于治療和/或 預(yù)防具有細(xì)菌病原學(xué)的齒齦病變，所述級(jí)分具有低于或等于2%的蛋白污染程度和低于或 等于5%的核酸污染程度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的級(jí)分，其中病原體選自以下組成的組伴放線放線桿菌 (Actinobacillum act inomycetemconcomi tans)、牙銀紅掠色單胞菌(Porphyromonas gingivalis)、福塞思坦納菌(Tannerella forsythia)、齒垢密螺旋體(Treponema denticola)0
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的級(jí)分，其中所述病原體是牙齦紅棕色單胞菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的級(jí)分，其中所述齒齦病變選自由下列組成的組齦 炎和牙周炎(膿溢)。
5.一種牙科組合物，包含根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的級(jí)分，還包含作為賦形劑和/ 或稀釋劑、穩(wěn)定劑和/或添加劑的適于口服施用的化合物和任選的一種或多種不同的活性 成分。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合物，其中所述級(jí)分的量包括0.1至ΙΟΟμ g/ml、優(yōu)選1至 50 μ g/ml，更優(yōu)選 4 至 20 μ g/ml，或更優(yōu)選 1-5 μ g/ml。
7.根據(jù)權(quán)利要求5-6所述的組合物，作為漱口劑、凝膠、牙科糊劑或牙膏。
8.根據(jù)權(quán)利要求5-6所述的組合物，作為糖果、片劑、口香糖、丸劑。
9.用于制備根據(jù)權(quán)利要求1-4所述的糖脂級(jí)分的方法，所述方法包括下列步驟a)用水溶液以優(yōu)選包括1 1至1 2的體積比懸浮Oscillatoria Planktothrix sp.藍(lán)細(xì)菌小團(tuán)；b)將藍(lán)細(xì)菌懸浮液與變性溶液以包括1 2至1 4，優(yōu)選1 3的體積比混合，所述 變性溶液包含離液劑、質(zhì)子有機(jī)溶劑和非質(zhì)子有機(jī)溶劑，所述質(zhì)子有機(jī)溶劑優(yōu)選由苯酚組 成，所述非質(zhì)子溶劑優(yōu)選由氯仿組成；c)孵育低于60分鐘的一段時(shí)間；d)離心并收集上清液；e)通過添加下列物質(zhì)沉淀所述糖脂級(jí)分鹽和有機(jī)溶劑，優(yōu)選丙酮；用經(jīng)水稀釋的乙 醇洗滌沉淀；f)在水溶液，優(yōu)選緩沖的水溶液中重懸所述沉淀；g)用核酸酶，優(yōu)選核酸內(nèi)切酶和/或核酸外切酶處理溶液；用蛋白酶，優(yōu)選蛋白酶K處 理溶液；h)通過添加下列物質(zhì)進(jìn)一步沉淀所述糖脂級(jí)分鹽和有機(jī)溶劑，優(yōu)選丙酮；i)任選地，按步驟f)洗滌沉淀；又將其重懸在水溶液，優(yōu)選緩沖的水溶液中；j)用30k道爾頓截留裝置分子分離重懸的溶液；k)用水溶液，優(yōu)選緩沖的水溶液回收保留的糖脂級(jí)分并評(píng)定蛋白和核酸污染程度。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的糖脂級(jí)分用于制備治療和/或預(yù)防具有細(xì)菌病原 學(xué)的齒齦病變的口腔組合物的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及來自O(shè)scillatoria Planktothrix sp.的糖脂級(jí)分的制備和用途，所述糖脂級(jí)分用于治療和/或預(yù)防主要由下列細(xì)菌引起的細(xì)菌性齦疾病伴放線放線桿菌、牙齦紅棕色單胞菌、福塞思坦納菌、齒垢密螺旋體并且甚至更優(yōu)選由牙齦紅棕色單胞菌引起。所述齦疾病，尤其是齦炎和牙周炎(膿溢)主要由導(dǎo)致牙周組織的破壞的對牙齦紅棕色單胞菌組分的促炎性反應(yīng)引起，并且常伴有破骨細(xì)胞發(fā)生(造成骨組織損傷的破骨細(xì)胞數(shù)目增加)和慢性感染。
文檔編號(hào)A61K35/74GK102105158SQ200980128982
公開日2011年6月22日 申請日期2009年7月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月25日
發(fā)明者莫妮卡·莫爾泰尼 申請人:布魯格林生物技術(shù)有限責(zé)任公司