專利名稱：變體Hhip1蛋白及其方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明致力于對于診斷和治療哺乳動物中的腫瘤有用的組合物及使用那些組合 物來診斷和治療哺乳動物中的腫瘤的方法。
背景技術(shù)：
分泌型形態(tài)發(fā)生素(secreted morphogen) Hedgehog (Hh)的高度保守同系物 在無脊椎動物和脊椎動物二者的胚胎發(fā)生期間負責(zé)正確的細胞分化(綜述I^gham and McMahon(2001)Genes Dev. 15 :3059-3087)。在哺乳動物中，已經(jīng)鑒定出編碼 Sonic Hedgehog (Shh) > Indian Hedgehog(Ihh)禾口 Desert Hedgehog (Dhh)蛋白的三種 Hedgehog基 因。它們的作用的范圍從左右不對稱、神經(jīng)管樣式形成、肢樣式形成和分支形態(tài)發(fā)生到骨形 成和精子發(fā)生。途徑成分的突變可導(dǎo)致顯著的發(fā)育病癥。雖然Hh信號傳導(dǎo)在成體中多半是 休眠的，但是它涉及多種癌癥，提示抑制此途徑可能具有治療好處(綜述見BeaChy，P. A. et al. (2004)Nature 432 :324-331 ；Pasca di Magliano and Hebrok(2003)Nat. Rev. Cancer 3 :903-911 ；Rubin and de Sauvage(2006)Nat Rev Drug Discov.5(12) :1026-33)。Hedgehog途徑經(jīng)由Hedgehog過表達而發(fā)生的活化是多種癌癥的一個特點。文獻 顯示在多種人腫瘤活檢和不同類型細胞系(包括例如小細胞肺癌(SCLC)、胃和上部胃腸道 癌、胰腺癌、和前列腺癌)中檢測到Hedgehog過表達。負責(zé)正確短程和遠程Shh信號傳導(dǎo)的成熟Hh氨基端結(jié)構(gòu)域(有時稱作Sih-N) 是通過C端內(nèi)蛋白樣結(jié)構(gòu)域的自我蛋白水解切割(Lee，J.J.et al. (1994) Science 266 1528-1537 ；Porter, J.A. et al. (1995)Nature 374 :363-366 ；Porter, J.A. et al. (1996) Cell 86 :21-34),接著在C端添加膽固醇并在N端棕櫚酰化(P印insky et al. (1998) J. Biol. Chem. 273 :14037-14045 ；Porter, J. A. et al. (1996) Science 274 :255-259)而生 成的。鼠Sih的晶體結(jié)構(gòu)揭示一個四面體配位的Si2+陽離子(Hall，Τ. Μ. et al. (1995) Nature 378 :212-216)，總體拓撲學(xué)與包括細菌溶葡萄球菌素(Bochtler, M. et al. (2004) Protein Sci. 13 :854-861)的 MD 族金屬蛋白酶(Rawlings，N. D. et al. (2008)Nucleic Acids Res. 36 :D320_325)和 VanX 二肽酶(Bussiere, D. Ε. et al. (1998)Mol. Cell 2 75-84)的相似。雖然Shh含有一個金屬蛋白酶假活性位點，但是該活性位點中的突變對生 物學(xué)測定法信號傳導(dǎo)活性沒有不利影響，提示Shh作為膜結(jié)合受體的結(jié)合配偶，而非作為 酶活性蛋白酶起作用(Fuse，N. et al. (1999)Proc. Natl. Acad. Sci. USA96 :10992-10999)。在細胞表面，Hh信號由兩種多次跨膜蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)播。12次跨膜蛋白Patched(Ptch) 是該途徑的一種負調(diào)節(jié)物，其在配體缺失下通過遏制7次跨膜蛋白Smoothened(Smo)來阻 止信號傳導(dǎo)(Chen and Struhl (1996) Cell 87 :553-563 ；Marigo, V. et al. (1996)Nature 384 :176-179 ；Stone, D. Μ. et al. (1996)Nature384 :129-134)。Shh 對 Ptch 的結(jié)合解除對Smo的抑制，容許它移位至初級纖毛(Rohatgi and Scott (2007)Nat. Cell Biol. 9 1005-1009)，在那里仍然了解不多的下游信號傳導(dǎo)事件最終導(dǎo)致稱作Gli的一個Zn指轉(zhuǎn)錄 因子家族的活化(Ingham and McMahon (2001)Genes Devel. 15 :3059_3087)。Ptch在細胞表面對Hh信號的調(diào)節(jié)受到多種別的細胞表面分子諸如無脊椎動物 蛋白質(zhì) Ihog (干擾 Hedgehog) (Lum, L. et al. (2003) Science299 :2039_2045 ；Yao, S. et al. (2006)Cell 125 :343_357)和 Boi(Ihog 的兄弟)(Yao, S. et al. (2006)Cell 125 343-357)及其相應(yīng)脊椎動物同系物 Cdon(Kang，J. S. et al. (1997) J. Cell. Biol. 138 203-213 ；Zhang, W. et al. (2006) Dev. Cell 10:657-65)和 Boc (生物區(qū)域性 Cdon 結(jié)合 蛋白)(Kang, J. S. et al. (2002)EMBO J. 21 :114_124 ；Tenzen, T. et al. (2006)Dev. Cell 10 :647-656)的精細調(diào)整。共同受體Ihog/Boi Cdon/Boc、和Gasl (生長停滯特異性1蛋 白)(其在果蠅中沒有已知同系物)是增強信號接收的途徑激動劑(Allen Allen, B. L. et al. (2007) Genes Dev. 21 1244-1257)。像Ptch—樣，Hedgehog相互作用蛋白(Hhipl，也稱作Hip)是該途徑的一種負 調(diào)節(jié)物，而且其轉(zhuǎn)錄響應(yīng)Hh信號傳導(dǎo)而上調(diào)(Chuang, P. T. et al. (2003) Genes Dev. 17 342-347 ；Chuang, P. T. et al. (1999)Nature 397 :617_621)。Shh 對細胞上的 Hhipl 和 Ptch的結(jié)合親和力是相似的，對Hhipl的Kd值為5nM而對Ptch的Kd值為4nM(Chuang and McMahon (1999) Nature 397 :617_621)。已經(jīng)在數(shù)種人腫瘤類型中記錄到降低的Hhipl表達 水平，提示Hhipl在遏制腫瘤發(fā)生中的重要作用(01sen，C. L. et al. (2004)BMC Cancer 4 43)。Hhipl是一種700個殘基的蛋白質(zhì)，具有N端信號肽和以疏水性C端區(qū)段結(jié)束的 大型胞外區(qū)(Chuang and McMahon(1999)Nature 397:617-621)。在主要的膜結(jié)合形式之 外，已經(jīng)在成年嚙齒類動物的成熟腦中檢測到Hhipl的一種可溶性形式(Coulombe，J. et al. (2004)Mol. Cell. Neurosci. 25 :323_333)。除了可能存在兩個表皮生長因子(EGF)結(jié)構(gòu) 域和四個潛在N連接糖基化位點(Chuang and McMahon(1999)Nature 397 :617_621)之外， 關(guān)于Hhipl胞外結(jié)構(gòu)域(EOT)的結(jié)構(gòu)配置一無所知。雖然知道Shh的結(jié)構(gòu)已經(jīng)有段時間，但是與其膜結(jié)合受體的分子相互作用的精確 了解仍然不明。最近，分別與果蠅Hh和脊椎動物Shh復(fù)合的Ihog III型纖連蛋白(FNIII) 結(jié)構(gòu)域1和Cdon的FNIII結(jié)構(gòu)域3的結(jié)構(gòu)比較揭示了完全不同的結(jié)合模式(McLellan， J. S. et al. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA103 17208-17213)。直到現(xiàn)在，Hhipl的晶體結(jié)構(gòu)仍未解析，而且不知道Hhipl如何與Hh相互作用來 發(fā)揮其效果。同樣，Ptch尚未結(jié)晶，所以也不知道Ptch如何與Hh相互作用。如此，為了有效抗擊Hedgehog途徑相關(guān)腫瘤，本領(lǐng)域迫切需要更好地了解Hh與Hh 控制分子諸如Hhipl和Ptch的精確相互作用。對Hedgehog信號傳導(dǎo)途徑成員的結(jié)構(gòu)/功 能相關(guān)性的更加完整的了解，更具體地說，對Ptch和Hhipl與Hh的分子相互作用的更好了 解會為理性設(shè)計Hh的小分子和大分子抑制劑和為Hh相關(guān)癌癥和狀況的療法提供必要信息發(fā)明概述為了更好地了解Hhipl對Shh的調(diào)節(jié)，我們測定了單獨的和與Shh復(fù)合的一種截 短形式的Hhipl胞外域的晶體結(jié)構(gòu)。該復(fù)合物結(jié)構(gòu)揭示Hhipl β -螺旋槳中的環(huán)與Shh假 活性位點的含Zn2+溝之間至關(guān)重要的相互作用。引人注目的是，在Ptch中找到一種相似
5的基序，提示Ptch和Hhipl競爭對Shh假活性位點的結(jié)合。這會解釋由Hhipl進行的負調(diào) 節(jié)，即作為Shh的結(jié)構(gòu)誘餌，阻止Ptch結(jié)合和途徑活化。該數(shù)據(jù)還幫助了解與人類疾病有 聯(lián)系的Hh蛋白中假活性位點之中和附近的突變的影響(Dubourg et al. (2004) ；Gao and He (2004))?？傊摂?shù)據(jù)容許我們提出經(jīng)受體相互作用對Hh活性的調(diào)節(jié)的模型，并提示開 發(fā)Hh信號傳導(dǎo)拮抗劑的新辦法。如此，本說明書描述一種Hedgehog相互作用蛋白(Hhipl)變體，其缺少推定的卷 曲結(jié)構(gòu)域，在本文中稱作"Hhipl012”及其晶體結(jié)構(gòu)。令人驚訝地發(fā)現(xiàn)該Hhipl012蛋白提供 穩(wěn)定性升高同時完全維持Hh抑制性活性的Hhipl012蛋白。如此，已經(jīng)解析Hhipl012的晶體 結(jié)構(gòu)，而且已經(jīng)分析與Hh和其它蛋白質(zhì)諸如Ptch的相互作用。Hhipl012含有與Hh和Ptch 相互作用的關(guān)鍵氨基酸，容許設(shè)計相互作用分子，諸如例如多肽激動劑和拮抗劑、免疫粘附 素、抗體、和小分子抑制劑和激動劑。因而，在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明提供一種分離的核酸分子，其具有編碼 Hhipl012多肽或其生物學(xué)活性片段(統(tǒng)稱"Hhipl012多肽”)的核苷酸序列。在某些方面，該分離的核酸分子包含與編碼(a)全長Hhipl012多肽；(b)具有本 文公開的氨基酸序列的Hhipl012胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)多肽("HhiplM2ECD")(即也缺乏推定 GPI錨信號序列的Hhipl012) ； (c)具有本文公開的氨基酸序列的Hhipl01多肽(即缺乏信號 肽、推定Fz結(jié)構(gòu)域、EGF2結(jié)構(gòu)域、和推定GPI錨信號序列)；(d)具有本文公開的氨基酸序 列的Hhip10多肽(即缺乏信號肽、推定Fz結(jié)構(gòu)域、EGF結(jié)構(gòu)域、和推定GPI錨信號序列)； (e) Hhiplpz0多肽(即缺乏信號肽、EGF結(jié)構(gòu)域、和推定GPI錨信號序列)；(f) Hhiplpz多肽 (即缺乏信號肽、螺旋槳(propeller)結(jié)構(gòu)域、EGFR結(jié)構(gòu)域、和推定GPI錨信號序列)；或本 文公開的全長Hhipl多肽氨基酸序列的任何其它具體限定片段的DNA分子，或任何上述DNA 分子的互補物具有至少約80%核酸序列同一性，或者至少約81 %，82%，83 %，84%，85 %， 86 %，87 %，88 %，89 %，90 %，91 %，92 %，93 %，94 %，95 %，96 %，97 %，98 %，99 % 或 100 % 核酸序列同一性的核苷酸序列。本發(fā)明的另一個方面提供一種分離的核酸分子，其包含編碼推定GPI信號序列或 被刪除或被滅活的Hhipl多肽的核苷酸序列或與此類編碼核苷酸序列互補的核苷酸序列， 其中本文公開了此類多肽的推定GPI信號序列。因此，本文還涵蓋本文中描述的Hhipl多 肽的可溶性胞外結(jié)構(gòu)域。在其它方面，本發(fā)明致力于分離的核酸分子，其與如下的核苷酸序列雜交(a)編 碼具有本文公開的全長氨基酸序列的Hhipl多肽、本文公開的缺乏信號肽的Hhipl多肽氨 基酸序列、本文公開的Hhipl012氨基酸序列、本文公開的Hhipl012多肽胞外結(jié)構(gòu)域或本文 公開的全長Hhipl多肽氨基酸序列的任何其它具體限定片段的核苷酸序列，或(b) (a)的核 苷酸序列的互補物。在這點上，本發(fā)明的一個實施方案致力于全長Hhipl多肽編碼序列的 片段或其互補物，如本文公開的，其可以用作例如雜交探針用作例如診斷探針、PCR引物、反 義寡核苷酸探針、或用于編碼全長Hhipl多肽的片段，該片段可任選編碼包含抗Hip多肽抗 體、Hhipl012結(jié)合寡肽(激動劑或拮抗劑)或結(jié)合Hhipl012多肽的其它有機小分子(激動 劑或拮抗劑)的結(jié)合位點的多肽。此類核酸片段通常長至少約5個核苷酸，或者長至少約 6,7,8,9,10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，35，40， 45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，105，110，115，120，125，130，135，140，145，150，155，160，165，170，175，180，185，190，195，200，210，220，230，240，250，260，270，280，290， 300，310，320，330，340，350，360，370，380，390，400，410，420，430，440，450，460，470，480， 490，500，510，520，530，540，550，560，570，580，590，600，610，620，630，640，650，660，670， 680，690，700，710，720，730，740，750，760，770，780，790，800，810，820，830，840，850，860， 870,880,890,900,910,920,930,940,950,960,970,980,990,或 1000 個核苷酸，其中在此 語境中術(shù)語“約”意味著所述核苷酸序列長度加上或減去該所述長度的10%。此外，此類 核酸片段通常由自Hhipl多肽的全長編碼序列或其互補物衍生的連續(xù)核苷酸構(gòu)成。注意到 Hhipl012多肽編碼核苷酸序列的新片段或其互補物可以以例行方式來確定，即使用多種公 知的序列比對程序之一比對Hhipl012多肽編碼核苷酸序列與其它已知核苷酸序列，并確定 哪些Hhipl012多肽編碼核苷酸序列片段或其互補物是新的。本文涵蓋Hhipl012多肽編碼 核苷酸序列的所有此類新片段或其互補物。還涵蓋由這些核苷酸分子片段編碼的Hhipl多 肽片段，優(yōu)選那些包含抗Hhipl012抗體、Hhipl012結(jié)合寡肽或結(jié)合Hhipl012多肽的其它有 機小分子的結(jié)合位點的Hhipl多肽片段，和結(jié)合Hh的Hhipl012多肽。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供分離的Hhipl多肽，其由上文鑒定的任何分離 的核酸序列編碼。在某一個方面，本發(fā)明關(guān)注一種分離的Hhipl012多肽，其包含與具有本文公開的 全長氨基酸序列的Hhipl012多肽、由本文公開的任何核酸序列編碼的氨基酸序列或本文公 開的全長Hhipl多肽氨基酸序列的任何其它具體限定片段具有至少約80%氨基酸序列同 一'性，或者至少約 81 %，82 %，83 %，84 %，85 %，86 %，87 %，88 %，89 %，90 %，91 %，92 %， 93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在又一個方面，本發(fā)明關(guān)注一種分離的Hhipl多肽，其包含由與如下DNA分子的 互補物雜交的核苷酸序列編碼的氨基酸序列，所述DNA分子編碼(a)具有本文公開的全長 Hhipl012氨基酸序列的Hhipl012多肽，(b)本文公開的Hhipl012多肽蛋白質(zhì)的胞外結(jié)構(gòu)域， (c)由本文公開的任何核酸序列編碼的氨基酸序列或(d)本文公開的全長Hhipl012多肽氨 基酸序列的任何其它具體限定片段。在一個具體的方面，本發(fā)明提供一種分離的Hhipl012多肽、一種分離的 HhiplM2Em、一種分離的Hip01多肽、一種分離的Hip0 (均由編碼本文描述的氨基酸序列 的核苷酸序列編碼)。本文還描述了用于生產(chǎn)該多肽的方法，其中那些方法包括在適合于 Hhipl012多肽表達的條件下培養(yǎng)包含如下載體的宿主細胞，該載體包含適宜的編碼核酸分 子，并自細胞培養(yǎng)物回收Hhipl多肽。本發(fā)明的另一個方面提供一種分離的Hhipl012E⑶多肽。本文還描述了用于生產(chǎn) 該多肽的方法，其中那些方法包括在適合于Hhipl012多肽表達的條件下培養(yǎng)包含如下載體 的宿主細胞，該載體包含適宜的編碼核酸分子，并自細胞培養(yǎng)物回收Hhipl012多肽。在本發(fā)明的其它實施方案中，本發(fā)明提供包含編碼任何本文描述的多肽的DNA的 載體。還提供包含任何此類載體的宿主細胞。舉例而言，該宿主細胞可以是哺乳動物細胞、 CHO細胞、昆蟲細胞、大腸桿菌(E.coli)細胞、或酵母細胞。進一步提供一種用于生產(chǎn)任何 本文描述的多肽的方法，其包括在適合于期望多肽表達的條件下培養(yǎng)宿主細胞并自細胞培 養(yǎng)物回收期望多肽。在其它實施方案中，本發(fā)明提供分離的嵌合多肽，其包含融合至異源(非Hip)多肽的任何本文描述的Hhipl012多肽(包括例如HhiplM2、HipM、Hipe、和HhiplFz0)。此類 嵌合分子的例子包含融合至異源多肽諸如例如表位標(biāo)簽序列或免疫球蛋白Fc區(qū)的任何本 文描述的Hhipl012多肽。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供結(jié)合(優(yōu)選特異性地結(jié)合)任何上文或下文描 述的多肽的抗體。任選的是，該抗體是單克隆抗體、抗體片段、嵌合抗體、人源化抗體、單鏈 抗體或競爭性抑制抗Hhipl012多肽抗體結(jié)合其相應(yīng)抗原性表位的抗體。本發(fā)明的抗體可任 選偶聯(lián)至生長抑制劑或細胞毒劑諸如毒素(例如美登木素生物堿或加利車霉素)、抗生素、 放射性同位素、溶核酶、等等。本發(fā)明的抗體可任選在CHO細胞或細菌細胞中生產(chǎn)，而且優(yōu) 選抑制它們結(jié)合的細胞生長或增殖或誘導(dǎo)它們結(jié)合的細胞死亡。對于診斷目的，本發(fā)明的 抗體可以被可檢測標(biāo)記、附著至固體支持物、或諸如此類。在一些實施方案中，本發(fā)明的抗體干擾Hh與Hhipl或Hh與Ptch之間的相互作用。 在一些實施方案中，該抗體不同于5E1。在其它實施方案中，該抗體刺激Hh信號傳導(dǎo)。在本發(fā)明的其它實施方案中，本發(fā)明提供包含編碼任何本文描述的抗體的DNA的 載體。還提供包含任何此類載體的宿主細胞。舉例而言，該宿主細胞可以是CHO細胞、大腸 桿菌細胞、或酵母細胞。進一步提供一種用于生產(chǎn)任何本文描述的抗體的方法，其包括在適 合于期望抗體表達的條件下培養(yǎng)宿主細胞并自細胞培養(yǎng)物回收期望抗體。在一些實施方案中，該寡肽干擾Hh與Hhip或Ptch之間的相互作用。在其它實施 方案中，該寡肽提供結(jié)合Ptch來刺激Hh信號傳導(dǎo)。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供結(jié)合(優(yōu)選特異性地結(jié)合)任何描述的 Hhipl012多肽的寡肽("Hhipl012結(jié)合寡肽”)。任選的是，本發(fā)明的Hhipl012結(jié)合寡肽可 偶聯(lián)至生長抑制劑或細胞毒劑諸如毒素(例如美登木素生物堿或加利車霉素)、抗生素、放 射性同位素、溶核酶、等等。本發(fā)明的Hhipl012結(jié)合寡肽可任選在CHO細胞或細菌細胞中生 產(chǎn)，而且優(yōu)選抑制它們結(jié)合的細胞生長或增殖或誘導(dǎo)它們結(jié)合的細胞死亡。對于診斷目的， 本發(fā)明的Hhipl012結(jié)合寡肽可以被可檢測標(biāo)記、附著至固體支持物、或諸如此類。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供結(jié)合(優(yōu)選特異性地)結(jié)合Hh多肽的寡肽 ("Hhipl L2環(huán)模擬寡肽”)。任選的是，本發(fā)明的Hhipl L2環(huán)模擬寡肽可偶聯(lián)至生長抑制 劑或細胞毒劑諸如毒素(例如美登木素生物堿或加利車霉素)、抗生素、放射性同位素、溶 核酶、等等。本發(fā)明的Hhipl L2環(huán)模擬寡肽可任選在CHO細胞或細菌細胞中生產(chǎn)，而且優(yōu) 選抑制它們結(jié)合的細胞生長或增殖或誘導(dǎo)它們結(jié)合的細胞死亡。對于診斷目的，本發(fā)明的 Hhipl L2環(huán)模擬寡肽可以被可檢測標(biāo)記、附著至固體支持物、或諸如此類。在本發(fā)明的其它實施方案中，本發(fā)明提供包含編碼任何本文描述的Hhipl012結(jié)合 寡肽和Hhipl L2環(huán)模擬寡肽的DNA的載體。還提供包含此類載體的宿主細胞。舉例而言， 該宿主細胞可以是CHO細胞、大腸桿菌細胞、或酵母細胞。進一步提供一種用于生產(chǎn)任何本 文描述的Hhipl012結(jié)合和HhiplL2環(huán)模擬寡肽的方法，其包括在適合于期望寡肽表達的條 件下培養(yǎng)宿主細胞并自細胞培養(yǎng)物回收期望寡肽。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供結(jié)合(優(yōu)選特異性地結(jié)合)任何上文或下文描 述的Hhipl012多肽的有機小分子(“他丨？1012結(jié)合有機分子”)。任選的是，本發(fā)明的Hhipl012 結(jié)合有機分子可偶聯(lián)至生長抑制劑或細胞毒劑諸如毒素(例如美登木素生物堿或加利車 霉素)、抗生素、放射性同位素、溶核酶、等等。本發(fā)明的Hhipl012結(jié)合有機分子優(yōu)選抑制它們結(jié)合的細胞生長或增殖或誘導(dǎo)它們結(jié)合的細胞死亡。對于診斷目的，本發(fā)明的Hhipl012 結(jié)合有機分子可以被可檢測標(biāo)記、附著至固體支持物、或諸如此類。在一些實施方案中，該有機小分子干擾Hh與Hhip或Ptch之間的相互作用。 在一些實施方案中，該小分子不同于robotnikinin(Stanton et al. (2009)Nat. Chem Biol. 5 (3) 154-156) 0在其它實施方案中，該小分子刺激Hh信號傳導(dǎo)。在又一個實施方案中，本發(fā)明提供結(jié)合(優(yōu)選特異性地)Hh多肽的有機小分子 ("Hhipl L2環(huán)模擬有機分子”)。任選的是，本發(fā)明的Hhipl L2環(huán)模擬有機分子可偶聯(lián)至 生長抑制劑或細胞毒劑諸如毒素(例如美登木素生物堿或加利車霉素)、抗生素、放射性同 位素、溶核酶、等等。本發(fā)明的Hhipl L2環(huán)模擬有機分子優(yōu)選抑制它們結(jié)合的細胞生長或 增殖或誘導(dǎo)它們結(jié)合的細胞死亡。對于診斷目的，本發(fā)明的Hhipl L2環(huán)模擬有機分子可以 被可檢測標(biāo)記、附著至固體支持物、或諸如此類。在又一個實施方案中，本發(fā)明關(guān)注一種組合物，其包含與載體組合的本文描述的 Hhipl012多肽、本文描述的嵌合Hhipl012多肽、本文描述的抗Hhipl012抗體、本文描述的 Hhipl 012結(jié)合寡肽、本文描述的Hhipl L2環(huán)模擬寡肽、本文描述的Hhipl 012結(jié)合有機分子、 或本文描述的Hhipl L2環(huán)模擬有機分子。任選的是，該載體是藥學(xué)可接受載體。在又一個實施方案中，本發(fā)明關(guān)注一種制品，其包含容器和裝在該容器內(nèi)的組合 物，其中該組合物可包含本文描述的Hhipl012S肽或其衍生物、本文描述的嵌合Hhipl012 多肽或其衍生物、本文描述的抗Hhipl012抗體、本文描述的Hhipl012結(jié)合寡肽、或本文描述 的Hhipl012結(jié)合有機分子。該制品可進一步任選包含附著于該容器的標(biāo)簽或與該容器一起 包括的包裝插頁，其指明該組合物用于治療性處理或診斷性檢測腫瘤的用途。本發(fā)明的另一個實施方案致力于本文描述的Hhipl多肽、本文描述的嵌合Hhipl 多肽、本文描述的抗Hhipl多肽抗體、本文描述的Hhipl012結(jié)合寡肽、本文描述的Hhipl L2 環(huán)模擬寡肽、本文描述的Hhipl012結(jié)合有機分子、或本文描述的Hhipl L2環(huán)模擬有機分子 用于制備在治療對Hh信號傳導(dǎo)有響應(yīng)的狀況中有用的藥物的用途。B.另外的實施方案本發(fā)明的另一個實施方案致力于用于抑制表達Hhipl和/或Ptch多肽的細胞生 長的方法，其中該方法包括使所述細胞與結(jié)合所述Hhipl012和/或Ptch多肽的抗體、寡肽 或有機小分子接觸，且其中所述抗體、寡肽或有機小分子與所述Hhipl和/或Ptch多肽的 結(jié)合引起所述表達Hhipl和/或Ptch多肽的細胞的生長抑制。在優(yōu)選的實施方案中，所述 細胞是癌細胞，且所述抗體、寡肽或有機分子與所述Hhipl和/或Ptch多肽的結(jié)合引起表 達所述Hhipl和/或Ptch多肽的所述細胞死亡。任選的是，所述抗體是單克隆抗體、抗體 片段、嵌合抗體、人源化抗體、或單鏈抗體。本發(fā)明方法中所采用的抗體、Hhipl012 L2環(huán)結(jié) 合寡肽和Hhipl012 L2環(huán)結(jié)合有機分子可任選偶聯(lián)生長抑制劑或細胞毒劑諸如毒素包括例 如美登木素生物堿或加利車霉素、抗生素、放射性同位素、溶核酶或諸如此類。本發(fā)明方法 中所采用的抗體和Hhipl012 L2環(huán)結(jié)合寡肽可任選在CHO細胞或細菌細胞中產(chǎn)生。本發(fā)明的又一個實施方案致力于治療性處理具有癌性腫瘤的哺乳動物的方法，所 述癌性腫瘤包含表達Hhipl和/或Ptch多肽的細胞，其中該方法包括給所述哺乳動物施用 治療有效量的結(jié)合所述Hhipl和/或Ptch多肽的抗Hhipl012抗體、Hhipl012 L2環(huán)結(jié)合寡 肽或Hhipl012 L2環(huán)結(jié)合有機小分子拮抗劑，由此所述腫瘤得到有效的治療性處理。任選的是，所述抗體是單克隆抗體、抗體片段、嵌合抗體、人源化抗體或單鏈抗體。本發(fā)明方法中所 采用的抗體、Hhipl e 12 L2環(huán)結(jié)合寡肽和Hhipl e 12結(jié)合有機分子可任選偶聯(lián)生長抑制劑或細 胞毒劑諸如毒素包括例如美登木素生物堿或加利車霉素、抗生素、放射性同位素、溶核酶或 諸如此類。本發(fā)明方法中所采用的抗體和寡肽可任選在CHO細胞或細菌細胞中產(chǎn)生。本發(fā)明的又一個實施方案致力于測定懷疑含有Hhipl和/或Ptch多肽的樣品 中該Hhipl和/或Ptch多肽的存在的方法，其中該方法包括使所述樣品暴露于結(jié)合所述 Hhipl和/或Ptch多肽的抗體、寡肽或有機小分子，并測定所述樣品中所述抗體、寡肽或有 機小分子與所述Hhipl和/或Ptch多肽的結(jié)合，其中此類結(jié)合的存在表明所述樣品中存在 所述Hhipl和/或Ptch多肽。任選的是，所述樣品可包括懷疑表達Hhipl和/或Ptch多肽 的細胞(可以是癌細胞)。本發(fā)明方法中所采用的抗體、Hhipl012 L2環(huán)結(jié)合寡肽或Hhipl012 L2環(huán)結(jié)合有機分子可以任選被可檢測標(biāo)記、附著于固體支持物、或諸如此類。本發(fā)明的又一個實施方案致力于診斷哺乳動物中腫瘤的存在的方法，其中該方法 包括檢測(a)從所述哺乳動物獲得的組織細胞的測試樣品中和(b)相同組織來源或類型的 已知正常非癌性細胞的對照樣品中編碼Hhipl多肽的基因的表達水平，其中所述Hhipl多 肽在測試樣品中的表達水平高于對照樣品表明獲取該測試樣品的哺乳動物中存在腫瘤。用 于此類測定法的探針衍生自Hhipl012編碼核酸。本發(fā)明的又一個實施方案致力于診斷哺乳動物中腫瘤的存在的方法，其中該方法 包括(a)使包含從所述哺乳動物獲得的組織細胞的測試樣品接觸結(jié)合Hhipl和/或Ptch 多肽的抗Hhipl012抗體、Hhipl012 L2環(huán)結(jié)合寡肽或Hhipl M2L2環(huán)結(jié)合有機小分子，并(b) 檢測所述測試樣品中所述抗體、寡肽或有機小分子和所述Hhipl和/或Ptch多肽之間復(fù)合 物的形成，其中所述復(fù)合物的形成表明所述哺乳動物中存在腫瘤。任選的是，所采用的抗 體、Hhipl012 L2環(huán)結(jié)合寡肽、或Hhipl012 L2環(huán)結(jié)合有機分子被可檢測標(biāo)記、附著于固體支 持物、或諸如此類，和/或所述組織細胞的測試樣品是從懷疑具有癌性腫瘤的個體獲得的。本發(fā)明的又一個實施方案致力于治療或預(yù)防與改變的，優(yōu)選提高的Hhipl和/或 Ptch多肽表達或提高的Hhipl和/或Ptch多肽活性有關(guān)的細胞增殖性病癥(病癥)的 方法，該方法包括給需要此類治療的受試者施用有效量的Hhipl和/或Ptch多肽的拮抗 劑。優(yōu)選的是，所述細胞增殖性病癥是癌癥，且所述Hhipl和/或Ptch多肽的拮抗劑是抗 Hhipl012多肽抗體、Hhipl012 L2環(huán)結(jié)合寡肽、Hhipl012 L2環(huán)結(jié)合有機分子或反義寡核苷酸。 細胞增殖性病癥的有效治療或預(yù)防可以是直接殺死表達Hhipl和/或Ptch多肽的細胞或 抑制其生長的結(jié)果，或者通過拮抗Hhipl和/或Ptch多肽的細胞生長促進活性。本發(fā)明的又一個實施方案致力于使抗Hhipl012抗體、Hhipl012 L2環(huán)結(jié)合寡肽或 Hhipl012 L2環(huán)結(jié)合有機小分子與表達Hhipl和/或Ptch多肽的細胞結(jié)合的方法，其中該 方法包括在適于所述抗體、寡肽或有機小分子與所述Hhipl和/或Ptch多肽結(jié)合的條件下 使表達Hhipl和/或Ptch多肽的細胞接觸所述抗體、寡肽或有機小分子，并容許它們之間 的結(jié)合。在優(yōu)選的實施方案中，所述抗體用可定性和/或定量測定所述抗體、寡肽或有機小 分子結(jié)合所述細胞的位置和/或量的分子或化合物標(biāo)記。本發(fā)明的其它實施方案致力于(a)Hhipl012多肽、(b)編碼Hhipl012多肽的核酸 或包含該核酸的載體或宿主細胞、(c)抗Hhipl012多肽抗體、(d)HhiplM2L2環(huán)結(jié)合寡肽、或 (e)Hhipl012 L2環(huán)結(jié)合有機小分子在制備可用于(i)癌癥或腫瘤的治療性處理或診斷性檢測或(ii)細胞增殖性病癥(病癥)的治療性處理或預(yù)防的藥物中的用途。閱讀本說明書后，本發(fā)明的其它實施方案對于熟練技術(shù)人員而言會是顯而易見 的。本發(fā)明的簡要聲明1. 一種分離的核酸，其具有與編碼SEQ ID NO :11，12，13，14，15，16任一氨基酸序 列的DNA分子具有至少80%核酸序列同一性的核苷酸序列或其互補物。2. 一種分離的核酸，其具有編碼SEQ ID NO :11，12，13，14，15，16任一所示氨基酸 序列的核苷酸序列或其互補物。3. 一種表達載體，其包含項1或2的核酸。4.項3的表達載體，其中所述核酸可操作連接至受到經(jīng)該載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞識 別的調(diào)控序列。5. 一種宿主細胞，其包含項3的表達載體。6.項5的宿主細胞，其是CHO細胞、大腸桿菌細胞或酵母細胞。7. 一種用于生產(chǎn)多肽的方法，包括在適合于所述多肽表達的條件下培養(yǎng)項5的宿 主細胞并自該細胞培養(yǎng)物回收所述多肽。8. 一種分離的多肽，其與具有SEQ ID NO :11，12，13，14，15，16任一氨基酸序列的
多肽具有至少80%氨基酸序列同一性。9. 一種分離的多肽，其具有SEQ ID NO :11，12，13，14，15，16任一氨基酸序列。10. 一種嵌合多肽，其包含融合至異源多肽的項8或9的多肽。11.項10的嵌合多肽，其中所述異源多肽是表位標(biāo)簽序列或免疫球蛋白Fc區(qū)。12. 一種分離的寡肽，其結(jié)合具有 SEQ ID NO :7，17，19-25，38，53-55，和 72-82 任
一氨基酸序列的多肽。13.項12的寡肽，其偶聯(lián)至生長抑制劑。14.項12的寡肽，其偶聯(lián)至細胞毒劑。15.項14的寡肽，其中該細胞毒劑選自下組毒素、抗生素、放射性同位素和溶核 酶。16.項14的寡肽，其中該細胞毒劑是毒素。17.項16的寡肽，其中該毒素選自下組美登木素生物堿和加利車霉素。18.項16的寡肽，其中該毒素是美登木素生物堿。
19.項12的寡肽，其誘導(dǎo)與其結(jié)合的細胞死亡。20.項12的寡肽，其被可檢測標(biāo)記。21. 一種Hhipl L2環(huán)模擬寡肽，其包含具有氨基酸序列SEQ ID NO :39且結(jié)合 Hedgehog多肽的肽。22.項21的寡肽，其中所述寡肽包含氨基酸序列SEQ ID NO :56_71。23.項21的寡肽，其偶聯(lián)至生長抑制劑。24.項21的寡肽，其偶聯(lián)至細胞毒劑。25.項24的寡肽，其中該細胞毒劑選自下組毒素、抗生素、放射性同位素和溶核 酶。26.項25的寡肽，其中該細胞毒劑是毒素。
27.項26的寡肽，其中該毒素選自下組美登木素生物堿和加利車霉素。28.項26的寡肽，其中該毒素是美登木素生物堿。29.項21的寡肽，其誘導(dǎo)與其結(jié)合的細胞死亡。30.項21的寡肽，其被可檢測標(biāo)記。31. 一種有機小分子，其包含結(jié)合Hhipl或Ptch蛋白的L2環(huán)的化合物，其中所述 分子抑制Hh多肽結(jié)合Hhipl或Ptch。32.項31的小分子，其中所述小分子不同于robotnikinin。33. 一種有機小分子，其包含模擬Hhipl或Ptch蛋白的L2環(huán)的化合物，其中所述 分子結(jié)合Hh多肽且抑制Hh信號傳導(dǎo)。34. 一種有機小分子，其包含結(jié)合Ptch蛋白的L2環(huán)且激動Hh信號傳導(dǎo)的化合物。35. 一種組合物，其包含與藥學(xué)可接受載體組合的(a)項8的多肽；(b)項9的多肽；(c)項10的嵌合多肽；(f)項12的寡肽；(g)項21的寡肽；(h)項31的有機分子；⑴項32的有機分子；(j)項33的有機分子；或(k)項34的有機分子。36. —種制品，其包含(a)容器；和(b)裝在所述容器內(nèi)的項35的組合物。37.項36的制品，其進一步包含附著于所述容器的標(biāo)簽或與所述容器一起包括的 包裝插頁，其指明所述組合物用于治療性處理或診斷性檢測癌癥的用途。38. 一種抑制表達Hhipl或Ptch的細胞生長的方法，其包括使所述細胞接觸結(jié)合 所述Hhipl或Ptch的寡肽或有機分子，由此所述寡肽或有機分子對所述Hhipl或Ptch的 結(jié)合引起對所述細胞生長的抑制。39.項38的方法，其中所述寡肽或有機分子偶聯(lián)至生長抑制劑。40.項38的方法，其中所述寡肽或有機分子偶聯(lián)至細胞毒劑。41.項40的方法，其中所述細胞毒劑選自下組毒素、抗生素、放射性同位素和溶 核酶。42.項40的方法，其中該細胞毒劑是毒素。43.項42的方法，其中該毒素選自下組美登木素生物堿和加利車霉素。44.項42的方法，其中該毒素是美登木素生物堿。45.項38的方法，其中所述細胞是癌細胞。46.項45的方法，其中使所述癌細胞進一步暴露于放射處理或化療劑。47.項45的方法，其中所述癌細胞選自下組乳腺癌細胞、結(jié)腸直腸癌細胞、肺癌 細胞、卵巢癌細胞、中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌細胞、肝癌細胞、膀胱癌細胞、胰腺癌細胞、宮頸癌細胞、黑素瘤細胞和白血病細胞。48.項45的方法，其中所述癌細胞與相同組織來源的正常細胞相比更大量的表達 所述蛋白質(zhì)。49.項38的方法，其引起所述細胞死亡。50. 一種治療性處理具有癌性腫瘤的哺乳動物的方法，其中所述癌性腫瘤包含 表達Hhipl或Ptch蛋白的細胞，所述方法包括對需要此類處理的受試者施用有效量的 Hhipl012 L2環(huán)結(jié)合抗體、Hhipl012 L2環(huán)抗獨特型抗體、Hhipl012結(jié)合寡肽、Hhipl012結(jié)合 有機分子、Hhipl012 L2環(huán)模擬寡肽、Hhipl012 L2環(huán)模擬有機分子，由此有效處理所述哺乳 動物。51.項50的方法，其中所述抗體、寡肽或有機分子偶聯(lián)至生長抑制劑。52.項50的方法，其中所述抗體、寡肽或有機分子偶聯(lián)至細胞毒劑。53.項52的方法，其中該細胞毒劑選自下組毒素、抗生素、放射性同位素和溶核酶。54.項52的方法，其中該細胞毒劑是毒素。55.項54的方法，其中該毒素選自下組美登木素生物堿和加利車霉素。56.項54的方法，其中該毒素是美登木素生物堿。57.項50的方法，其中使所述腫瘤進一步暴露于放射處理或化療劑。58.項50的方法，其中所述腫瘤是乳腺腫瘤、結(jié)腸直腸腫瘤、肺腫瘤、卵巢腫瘤、中 樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、肝腫瘤、膀胱腫瘤、胰腺腫瘤、或?qū)m頸腫瘤。59.項50的方法，其中所述腫瘤的癌性細胞與相同組織來源的正常細胞相比更大 量的表達所述蛋白質(zhì)。60. 一種用于在表達Hhip 1或Ptch蛋白的細胞中治療或預(yù)防細胞增殖性病癥的方 法，所述方法包括對需要此類處理的受試者施用有效量的Hhipl M2L2環(huán)結(jié)合抗體、Hhipl012 L2環(huán)抗獨特型抗體、Hhipl012結(jié)合寡肽、Hhipl012結(jié)合有機分子、Hhipl012 L2環(huán)模擬寡肽、 Hhipl012 L2環(huán)模擬有機分子，由此有效治療或預(yù)防所述細胞增殖性病癥。61.項60的方法，其中所述細胞增殖性病癥是癌癥。62. 一種抑制細胞生長的方法，其包括對表達Ptch或Hhipl的細胞施用有效量的 Hhipl012 L2環(huán)結(jié)合抗體或Hhipl012 L2環(huán)抗獨特型抗體。63.項62的方法，其中所述抗體是單克隆抗體。64.項62的方法，其中所述抗體是抗體片段。65.項62的方法，其中所述抗體是嵌合或人源化抗體。66.項62的方法，其中所述抗體、寡肽或有機分子偶聯(lián)至生長抑制劑。67.項62的方法，其中所述抗體、寡肽或有機分子偶聯(lián)至細胞毒劑。68.項67的方法，其中所述細胞毒劑選自下組毒素、抗生素、放射性同位素和溶 核酶。69.項67的方法，其中該細胞毒劑是毒素。70.項69的方法，其中該毒素選自下組美登木素生物堿和加利車霉素。71.項69的方法，其中該毒素是美登木素生物堿。72.項62的方法，其中所述抗體在細菌中產(chǎn)生。
73.項62的方法，其中所述抗體在CHO細胞中產(chǎn)生。74.項62的方法，其中所述細胞是癌細胞。75.項74的方法，其中使所述癌細胞進一步暴露于放射處理或化療劑。76.項74的方法，其中所述癌細胞選自下組乳腺癌細胞、結(jié)腸直腸癌細胞、肺癌 細胞、卵巢癌細胞、中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌細胞、肝癌細胞、膀胱癌細胞、胰腺癌細胞、宮頸癌細胞、 黑素瘤細胞和白血病細胞。77.項75的方法，其中所述癌細胞與相同組織來源的正常細胞相比更大量的表達 所述蛋白質(zhì)。78.項62的方法，其引起所述細胞死亡。79.項12-30任一項要求保護的寡肽在制備用于治療性處理癌癥的藥物中的用途。80.項12-30任一項要求保護的寡肽在制備用于治療或預(yù)防細胞增殖性病癥的藥 物中的用途。81. 一種抗 Hip L2 環(huán)抗體。82. 一種抗獨特型Hhipl L2環(huán)抗體。83. 一種抗 Ptch L2 環(huán)抗體。84. 一種抗獨特型Ptch L2環(huán)抗體。85.項81-84任一項要求保護的抗體在制備用于治療性處理癌癥的藥物中的用 途。86.項81-84任一項要求保護的抗體在制備用于處理腫瘤的藥物中的用途。87.項81-84任一項要求保護的抗體在制備用于治療或預(yù)防細胞增殖性病癥的藥 物中的用途。88.項31的Hhipl012結(jié)合有機分子在制備用于治療性處理或診斷性檢測癌癥的 藥物中的用途。89.項31的Hhipl012結(jié)合有機分子在制備用于處理腫瘤的藥物中的用途。90.項31的Hhipl012結(jié)合有機分子在制備用于治療或預(yù)防細胞增殖性病癥的藥 物中的用途。91.項33的Hhipl L2環(huán)模擬有機分子在制備用于治療性處理癌癥的藥物中的用途。92.項33的Hhipl L2環(huán)模擬有機分子在制備用于處理腫瘤的藥物中的用途。93.項33的Hhipl L2環(huán)模擬有機分子在制備用于治療或預(yù)防細胞增殖性病癥的 藥物中的用途。94.項34的組合物在制備用于治療性處理癌癥的藥物中的用途。
95.項34的組合物在制備用于處理腫瘤的藥物中的用途。
96.項35的組合物在制備用于治療或預(yù)防細胞增殖性病癥的藥物中的用途。
97.項36的制品在制備用于治療性處理癌癥的藥物中的用途。
98.項36的制品在制備用于處理腫瘤的藥物中的用途。
99.項36的制品在制備用于治療或預(yù)防細胞增殖性病癥的藥物中的用途。
100.—-種抑制細胞中Hedgehog信號傳導(dǎo)的方法，其包括對Hedgehog生成細胞或
14至少8-15個氨基酸且包含SEQ ID NO 17-44任一氨基酸序 列的寡肽。
0164]101.項100的方法，其中所述寡肽包含SEQ ID NO :39_44任一氨基酸序列。
0165]102.項100的方法，其中所述氨基酸序列在位置X處相對于SEQ ID NO 60在相
同位置的氨基酸包含保守氨基酸替代。
103.項100的方法，其中所述寡肽長度介于8和12個氨基酸之間。
104.項100的方法，其中所述寡肽長度介于8和10個氨基酸之間。
105.—種寡肽，其長度為至少8-15個氨基酸且包含SEQ ID NO 17-44任一氨基
0166]
0167]
0168]
酸序列。
0169]106.項105的寡肽，其中所述寡肽長度介于8和12個氨基酸之間。
0170]107.項105的寡肽，其中所述寡肽長度介于8和10個氨基酸之間。
0171]108.項105的寡肽，其中該寡肽包含SEQ ID NO :39_44任一氨基酸序列。
0172]109.項108的寡肽，其中所述氨基酸序列在位置X處相對于SEQ ID NO 60在相 同位置的氨基酸包含保守氨基酸替代。
0173]110. 一種藥物組合物，其包含長度至少8-15個氨基酸且包含SEQ ID N0:17_44任
-氨基酸序列的寡肽和藥學(xué)可接受載體。
0174]111.項110的藥物組合物，其中所述寡肽長度介于8和12個氨基酸之間。
0175]112.項110的藥物組合物，其中所述寡肽長度介于8和10個氨基酸之間。
0176]113.項110的藥物組合物，其中該寡肽包含SEQ ID NO :39_44任一氨基酸序列。
0177]114.項113的藥物組合物，其中所述氨基酸序列在位置X處相對于SEQ ID NO 60 在相同位置的氨基酸包含保守氨基酸替代。
0178]115.項100的方法，其中所述寡肽是線性的。
0179]116.項100的方法，其中所述寡肽是環(huán)狀的。
0180]117.項105的寡肽，其中所述寡肽是線性的。
0181]118.項105的寡肽，其中所述寡肽是環(huán)狀的。
0182]119.項110的藥物組合物，其中所述寡肽是線性的。
0183]120.項110的藥物組合物，其中所述寡肽是環(huán)狀的。
0184]121. 一種抗體，其特異性結(jié)合包含Hhip L2環(huán)的表位。
0185]122. 一種抗體，其特異性結(jié)合包含Ptch L2環(huán)的表位。
0186]123. 一種抗體，其特異性結(jié)合包含Hh假活性位點的表位。
0187]124.項123的抗體，其中所述抗體不同于5E1。
0188]附圖簡述
0189]圖IA-C 顯示人 Hhipl012 cDNA(SEQ ID NO 1)及推導(dǎo)氨基酸序列(SEQ ID NO 2) 的比對。IB還顯示L2環(huán)(標(biāo)有陰影)，其中重要氨基酸殘基標(biāo)有丨和*。 圖2顯示Hip各區(qū)的推定位置2A顯示Hhipl012的氨基酸序列，顯示前導(dǎo)(SEQ ID NO 3)、推定Fz 結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO 4)、接頭(SEQ ID NO 5)、β _螺旋槳(SEQ ID NO 6)、L2 環(huán)(SEQ ID NO 7)、EGFl 結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO 8)、EGF2 結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO 9)、和推定 GPI 信號序列(SEQ ID NO 10)的推定位置。2B 顯示人 Hhipl012 (SEQ ID NO 7)、人 Ptch (SEQ ID NO 17)、小鼠 Ptch (SEQ ID NO 18)、雞 Ptch (SEQ ID NO 19)、斑馬魚 Ptch (SEQ ID NO:20)、果蠅Ptch (SEQ ID NO :21)、螺蟲Ptch (SEQ ID NO :22)、人Ptch2 (SEQ ID NO :23)、和小 鼠 Ptch2 (SEQ ID NO 24)的 L2 環(huán)區(qū)比對。圖3顯示Hedgehog途徑抑制所需要的HhiplEeD最小區(qū)域的表征。小圖A 根據(jù)生 物信息分析預(yù)測的Hhipl結(jié)構(gòu)域構(gòu)造。顯示限定研究中使用的構(gòu)建物的結(jié)構(gòu)域邊界的殘 基。質(zhì)膜(PM)內(nèi)的線代表GPI錨的脂質(zhì)尾。含有HhipIecd (SEQ ID NO 11)、Hhipl012 (SEQ ID NO 12)、Hip01 (SEQ ID NO 13)、Hip0 (SEQ ID NO 14)和 HhiplFz(SEQ ID NO 16)的構(gòu) 建物分別涵蓋 SEQ ID NO 2 的殘基 20-667、193-667、殘基 193-637 和 193-607 和 20-193 ； 小圖B =Gli-螢光素酶共培養(yǎng)物信號傳導(dǎo)測定法中Hhiplrai的不同結(jié)構(gòu)域?qū)hh信號傳導(dǎo) 的抑制。在此測定法中，將Shh生成HT-29細胞覆蓋在穩(wěn)定表達Gli-螢光素酶S12成纖維 細胞上，接著與Hhipl結(jié)構(gòu)域一起溫育并如實驗規(guī)程中所述測量螢光素酶活性。將結(jié)果作 為三份獨立一式三份的平均值士標(biāo)準(zhǔn)化偏差繪圖；小圖C =Hhipl012結(jié)構(gòu)的整體卡通表象。 HhipIecd含有一個六葉片β -螺旋槳和兩個EGF結(jié)構(gòu)域。顯示N端和C端；小圖D :來自游 離的和Shh結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)的五種Hhipl012模型的重疊，包括三方晶系和正交晶系。箭號 指示兩個EGF結(jié)構(gòu)域之間的柔性區(qū)；小圖E β -螺旋槳和EGFl (橢圓形中的插入物)相互 作用的特寫視圖，突顯C402與C624之間的結(jié)構(gòu)域間二硫鍵。圖4顯示Hhip-Shh復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和功能。小圖A =Hhipl012和Shh (橢圓形中的插 入物)的復(fù)合物的卡通表象。來自Hhipl012、連接Shh的三個環(huán)標(biāo)記為L1-L3。Zn2+和Ca2+ 陽離子以箭號顯示(只顯示一個Ca2+陽離子)。還顯示90°旋轉(zhuǎn)視圖。ShhN和C端以及 Hhip的C端都在復(fù)合物的同一側(cè)，提示這兩種成分能錨定至相同的細胞膜。小圖B顯示與 來自Hhipl012的三個環(huán)接觸的Shh的表面表象；小圖C 連接Shh的Hhip環(huán)中的丙氨酸突 變體。三個Hhip環(huán)中突變成丙氨酸的殘基作為球體顯示，其中消除Shh結(jié)合的以星號(*) 顯示，具有顯著影響的以加號(+)顯示，而具有最小限度后果的以井號(#)顯示。小圖D: 來自Shh和Hhip012的殘基對Zn2+陽離子的配位。Ζη2+(灰色球體)得到來自Shh的殘基 H140、D147和H182及來自Hhip012的D383的配位。小圖E =Shh含Zn2+溝和Ca2+結(jié)合位點 是不同的。Shh和Hhip (正方形中的插入物)，其中顯示HhipL2環(huán)的透明表面。Zn2+和Ca2+ 陽離子以箭頭顯示。在Ihh中在遺傳上與短指/趾Al型有關(guān)的Shh殘基作為棍顯示，而碳 原子依照人Shh序列編號。小圖F =Gli-螢光素酶共培養(yǎng)物測定法中Hhip012突變體對Shh 信號傳導(dǎo)的抑制。如圖3B進行測定法。將結(jié)果作為相對于沒有抑制劑的100%進行標(biāo)準(zhǔn)化 的三份獨立一式三份的平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差繪圖。圖5顯示Ptch中“L2環(huán)”的存在。小圖A =Shh上的Hhipl和Ptch結(jié)合位點及Hh 上的Ihog結(jié)合位點。Shh和Hh的表面表象，其中距Hhipl (左邊)和Ihog (中央)4.5A內(nèi) 的殘基著深灰色。右邊小圖描繪Shh的表面，其中影響Ptch活性的突變殘基組著深灰色，而 沒有影響的著淺灰色；編號方式指鼠Shh(Fuse et al.，1999 ；Pepinsky et al. ,2000) 對 Ptch結(jié)合和信號傳導(dǎo)的影響可忽略的Shh殘基的突變著黃色。小圖B顯示Hhipl和Ptch 在與Hhipl L2環(huán)對應(yīng)的區(qū)域中的序列比對。在下面對L2環(huán)內(nèi)的殘基保守性繪圖。該圖 是根據(jù)15種脊椎動物Hhipl 1型序列(

圖11)和所列Ptch序列的比對而生成的；為了簡 要，只顯示人Hhipl。隨意選擇Hhipl的D383作為位置0。特別重要的殘基以星號標(biāo)示。 使用WebLogo (URL地址為weblogo. berkeley. edu)創(chuàng)建圖。小圖C顯示Hip01結(jié)合Shh的 Hhipl-L2肽競爭ELISA。將數(shù)據(jù)擬合至4參數(shù)方程，自其推導(dǎo)IC5tl ；小圖D顯示Shh單獨的(灰色)和在過量未標(biāo)記Hip-L2肽存在下的(黑色)15N，1H-HSQC譜；小圖E顯示與小圖D 相同，只是使用Ptch_L2肽。圖6顯示導(dǎo)致途徑調(diào)節(jié)的Shh-受體復(fù)合物的模型。當(dāng)Hh途徑有活性時，膜結(jié)合 的Shh與Cdon和Ptch形成多聚體復(fù)合物，解除對Smo的抑制。這導(dǎo)致活性形式的Gli移 位至核，啟動Hh靶基因的轉(zhuǎn)錄。Ptch結(jié)合Shh有可能會涉及Ptch L2等效環(huán)與Shh含Zn2+ 溝之間的相互作用。圖7顯示與圖6相同的途徑，只是當(dāng)Hh信號傳導(dǎo)受到Hhipl抑制時，Hhipl通過 占據(jù)Shh上的含Zn2+溝來作為Ptch的結(jié)構(gòu)誘餌受體起作用。Hhipl、Cdon和Shh形成穩(wěn)定 的三元復(fù)合物，剩下Ptch來遏制Smo和抑制信號傳導(dǎo)。從而，Gli被蛋白酶體加工成轉(zhuǎn)錄 阻抑物，導(dǎo)致對Hh靶基因轉(zhuǎn)錄的抑制。FN和Ig分別代表Cdon的III型纖連蛋白(FNIII) 和Ig樣結(jié)構(gòu)域。圖8顯示HhiplM2與Dhh、Ihh和Shh的競爭結(jié)合ELISA。小圖A 以ELISA格式 顯示生物素化ShhN_Cys與未標(biāo)記的Dhh、Ihh和Shh之間對固定化的Hip012的競爭性結(jié)合， 其中為Dhh(〇)、Ihh( ■)和Shh( )顯示數(shù)據(jù)和曲線擬合，IC50值分別為40nM、53nM和 87nM。所畫的線代表數(shù)據(jù)擬合至4參數(shù)方程，自其推導(dǎo)IC5tl ；小圖B :Shh、Dhh和Ihh的序列 比對。與Hhipl接觸的殘基以星號標(biāo)示。為Ihh還標(biāo)示與Ca2+(A)和Ζη2+(·)陽離子配 位的殘基以及涉及短指/趾Al型的殘基( )。5Ε1表位定位至人Shhli2的Serl77 (·), 而且受到5E1保護免于胰蛋白酶消化的Shh肽標(biāo)有下劃線。虛線延長線指示基于5E1對 Dhh的親和力比Ihh或Shh低而推定的延長表位。圖9顯示β -螺旋槳與EGFl之間的結(jié)合的性質(zhì)。小圖A : β -螺旋槳(作為具有 靜電特性的表面顯示，陽性為淺灰色而陰性為深灰色)與EGFl (卡通表象，以線和帶顯示) 之間的結(jié)合；小圖B:顯示小圖A旋轉(zhuǎn)90°的視圖。圖10顯示通過生物層干擾測定術(shù)測量的在EDTA缺失和存在下Hip01對生物素化 ShhN_Cys的結(jié)合。小圖A 在IOmM EDTA缺失和存在下四種不同濃度的HipM(l. 2、1. 0、0. 8和 0.6 μ Μ)的傳感圖結(jié)合曲線；小圖B :Shh單獨的和在IOmM EDTA存在下的15N, 1H-HSQC譜； 小圖C 顯示來自Hip-Shh復(fù)合物結(jié)構(gòu)的人Shh (淺灰色)，在果蠅Hh (深灰色，PDB登錄號 2IBG，殘基49-196)上重合。Zn2+陽離子只存在于Shh中，而且作為灰色球體顯示。為了清 楚，Ca2+陽離子從Shh結(jié)構(gòu)中省略掉。重疊的rmsd為0.6入;小圖D 顯示人Shh和果蠅Hh 結(jié)構(gòu)的特寫視圖，突顯Shh中的Zn2+配位。顯示果蠅Hh中與Shh Zn2+配位殘基位置等效的 殘基。顏色選擇與小圖C相同。圖11顯示與L2環(huán)對應(yīng)的Hhipl序列的比對，顯示15種脊椎動物物種的1型 Hhipl0突顯的是唯一兩個不相同位置中的殘基。在比對的下面顯示如圖5B中描述的保守 性圖。殘基保守性是用ConSurf (consurf.tau.ac.il)生成的。圖12顯示Hhip-Shh復(fù)合物上的保守表面片小圖A顯示為Hhipl (圖11中的15 種序列)和Shh (Swiss-Prot中的25種序列)測定的表面殘基序列保守性，以深灰色(相 同的殘基)至淺灰色(保守性最低的殘基)的顏色梯度來圖示。虛線橢圓形內(nèi)的區(qū)域指高 度保守的片。小圖B顯示保守表面片含有高度酸性的區(qū)域。以正電荷淺灰色和負電荷深灰 色描繪表面靜電勢。虛線橢圓形內(nèi)的區(qū)域指小圖A中顯示的高度保守片。殘基保守性是用 ConSurf (consurf. tau. ac. il)生成白勺。
圖13顯示Al型短指/趾突變體Ihh T154I在結(jié)合Ptchl和活化Hh信號傳導(dǎo)兩 方面受損。小圖A顯示Ihh T154I是比野生型Shh弱的結(jié)合Ptchl的競爭者。與所示蛋白 質(zhì)一起預(yù)溫育的Shh649 (InM)結(jié)合Ptchl表達細胞，清洗并通過FACS來分析。將兩個獨立稀 釋系列的平均均值Shh649熒光強度(MFI)針對抑制劑濃度繪圖，其中誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。 Ihh和辛基-Ihh相似地抑制(各自的IC50值為1. 1和0. 64nM)，而T154I和辛基-T154I的 抑制作用(IC5tl值分別為140nM和IOnM)受損。小圖B顯示S12 Gli螢光素酶測定法中Hh 信號傳導(dǎo)的活化。使用辛基化Ihh野生型和T154I蛋白進行測定法。將濃度依賴性相對螢 光素酶單位(RLU)作為相對于每塊板上作為100%的最大Ihh WT刺激進行標(biāo)準(zhǔn)化的四個獨 立稀釋系列的平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差繪圖。所畫的曲線代表數(shù)據(jù)擬合至4參數(shù)方程，自其推導(dǎo) Ihh和Ihh T154的EC5tl值分別為16和330nM。數(shù)據(jù)代表三項獨立實驗。圖14顯示單克隆抗體5Ε1與Hhipl012競爭Shh結(jié)合。小圖A顯示Shh上的5Ε1表 位與Hhip和Ptchl結(jié)合位點交疊。Shh的表面表象顯示距Hhip 4,5入內(nèi)的殘基(淺灰色) 和突變改變Ptchl活性的殘基(深灰色)。對于5Ε1結(jié)合至關(guān)重要的殘基，即以星號(*) 標(biāo)示的S177位于Shh與Hhip和Ptchl 二者相互作用的區(qū)域中。編號方式指人Shh (Fuse， N. et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA96 10992-10999 ；Pepinsky R. B. et al. (2000) J. Biol. Chem. 275 10995-11001)。小圖 B 顯示通過 ELISA 獲得的生物素化 ShhN_Cys 與 5E1 之間對固定化Hhipl012的競爭性結(jié)合。所畫的曲線代表數(shù)據(jù)擬合至4參數(shù)方程，自其推導(dǎo) IC5tl為23nM。小圖C顯示高濃度的Hhipl012 (這里顯示520nM)和HhiplM2_Fc (數(shù)據(jù)未顯 示)非特異性地結(jié)合293細胞(淺灰色棒)，以不依賴Ptchl的方式募集Shh649 (15nM)。如 此，Hhipl012比Shh649過量35倍存在。此募集受到520nM 5Ε1的競爭(但是對照mlgGl不 然)，證明5E1與Hhipl012競爭Shh649結(jié)合。黑色棒顯示對Ptchl細胞的結(jié)合，供比較用。 數(shù)據(jù)是相對于在其它蛋白質(zhì)缺失下Shh649對Ptchl細胞的結(jié)合(“對照”)進行標(biāo)準(zhǔn)化的兩 項獨立(一式兩份和一式三份)實驗的平均均值熒光強度和SD，與圖15J方式相同。Shh649 和Hhipl012以比圖15J中分別高45和10倍的濃度存在，以檢測Shh649對Hhipl012的Ptchl 不依賴性結(jié)合。圖15顯示Hhip和Ptchl在Shh假活性位點溝處競爭性結(jié)合。小圖A顯示圖4A 所示Hhip-Shh復(fù)合物的卡通表象。小圖B顯示Cdon第三FNIII結(jié)構(gòu)域與Shh之間的復(fù)合 物的卡通表象(PDB登錄號3D1M)。Shh的取向與小圖A中Hhip-Shh復(fù)合物的相同。顯示 Zn2+和Ca2+陽離子。小圖C顯示Shh上Hhip和Cdon的交疊結(jié)合位點。Shh的表面表象，及 距Hhip(陰影標(biāo)示的灰色)和Cdon(細線表示的區(qū)域)4.5A內(nèi)的殘基。虛線邊界內(nèi)的區(qū) 域指示Cdon足跡的邊界，其與Hhip結(jié)合表面交疊。小圖D顯示Shh假活性位點處的五個 組氨酸殘基接近Hhip L2環(huán)。Shh組氨酸殘基作為棍顯示，而氮原子標(biāo)有深色陰影。在透明 表面中顯示Hhip L2環(huán)，而且顯示Zn2+陽離子。沒有顯示組氨酸35，因為Shh結(jié)構(gòu)的固定 部分從L40開始。小圖E顯示Shh單獨的(灰色)和在IOmM EDTA存在下的(黑色)13C, 1H-HSQC譜。顯示組氨酸側(cè)鏈的光譜區(qū)。小圖F顯示與小圖E相同，只是存在2mM Hhip L2 肽來代替EDTA。小圖G顯示與小圖E相同，只是存在2mM Ptchl L2樣肽來代替EDTA。小 圖H顯示Hhip L2肽自Shh置換Ptchl L2樣肽，指示它們競爭Shh (將2mM Hhip L2肽添 加至含有Shh和2mM Ptchl L2樣肽的樣品(黑色)導(dǎo)致自Shh置換Ptchl L2樣肽，如通 過另一種譜的外觀所顯示的(比較小圖G與小圖H顯示新點的存在)，這指示Hhip L2肽結(jié)合Shh。小圖I顯示Hhip和Ptchl競爭Shh結(jié)合。將InM Shh649與各種蛋白質(zhì)一起預(yù)溫育 后，溫育Ptchl表達細胞，清洗并通過FACS來分析。將兩個獨立稀釋系列的平均均值Shh649 熒光強度(MFI)針對蛋白質(zhì)濃度繪圖，其中誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。對照指帶His-6標(biāo)簽的 HGF^蛋白。小圖J顯示Hhip對Shh結(jié)合Ptchl的競爭是特異性的。將Shh649(0. 33nM) 與56nM(170倍過量)HHipM2野生型或L2突變體蛋白質(zhì)一起預(yù)溫育，然后使5E1或?qū)φ战Y(jié) 合至Ptchl細胞(黑色)或293細胞(灰色)，清洗并通過FACS來分析。在抑制劑缺失下 將Shh649對Ptchl細胞的結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)化為100%，并將數(shù)據(jù)表述成相對于此信號的百分比(兩 份獨立一式兩份的平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差)。對照和對照Fc分別指HGFii和IgGl同種型對照 Trastuzumab。數(shù)據(jù)代表至少三項獨立實驗。發(fā)明詳述I.定義術(shù)語“Hhipl”、“Hhip”和“Hip”在本文中可互換使用。術(shù)語"Hhipl012多肽”和"Hhipl012衍生物”或Hip012指各種自缺少Hhipl的推定 卷曲結(jié)構(gòu)域的全長Hhipl012 (SEQ ID NO 83)衍生的多肽。該術(shù)語涵蓋本文中以SEQ ID NO 和名稱限定的具體鑒定片段，諸如例如HhiplM2ECD (SEQ ID NO 12)、Hip01 (SEQ ID NO 13) 和Hip0 (SEQ ID N0:14)。另外，在該術(shù)語與規(guī)定氨基酸一起出現(xiàn)時(例如Hhipl 14-67)， 這指參照全長Hhipl多肽(SEQ ID NO 2)具體指定的氨基酸。本文中描述的Hhipl M2多 肽可從多種來源分離，諸如人組織類型或其它來源，或者通過重組或合成方法制備。術(shù) 語"Hhipl012S肽”指本文中公開的每一種個別的Hhipl012/數(shù)值多肽。本說明書中涉及 "Hhipl012S肽衍生物”的所有公開內(nèi)容指獨自的以及共同的每一種多肽。例如，關(guān)于多 肽的制備、純化、衍生、針對該多肽的抗體或激動劑的形成、針對該多肽的Hhipl012結(jié)合寡 肽或激動劑的形成、針對該多肽的Hhipl012結(jié)合有機分子或激動劑的形成、施用、含有該 多肽的組合物、用該多肽治療疾病、等等的描述適用于本發(fā)明的具體的每一種多肽。術(shù)語 "Hhipl012多肽變體”指本文中公開的Hhipl012S肽和衍生物的變體，包括。全長Hhipl多 肽的序列在SEQ ID NO 2中提供。全長Hhipl012多肽的序列作為SEQ ID NO 83提供。“天然序列Hhipl多肽”包括與衍生自自然界的相應(yīng)Hhipl多肽具有相同氨基酸 序列的多肽。此類天然序列Hhipl多肽可從自然界分離，或者可通過重組或合成手段生成。 術(shù)語“天然序列Hhipl多肽”明確涵蓋天然存在的截短或分泌形式的特定Hhipl多肽(例 如胞外結(jié)構(gòu)域序列)、該多肽的天然存在變體形式(例如可變剪接形式)和天然存在的等位 變體。Hhipl多肽“胞外結(jié)構(gòu)域”或“E⑶”指基本上不含推定GPI信號序列的Hhipl多肽 形式，該推定GPI信號序列在多肽經(jīng)GPI連接錨定時被除去(在本文中縮寫為"Hhiplrai”)。 可以理解，為本發(fā)明Hhipl多肽鑒定的任何推定GPI信號序列是依照本領(lǐng)域常規(guī)用于鑒定 該種類型結(jié)構(gòu)域的標(biāo)準(zhǔn)鑒定的。GPI信號序列的精確邊界可以變化，但最有可能是本文中最 初鑒定的結(jié)構(gòu)域任一末端不超過約5個氨基酸。在一個具體的例子中，Hhiplrai具有氨基酸 序列SEQ ID NO=Il0因此，任選的是，Hhipl多肽的胞外結(jié)構(gòu)域可含有實施例或說明書中鑒 定的推定GPI信號序列結(jié)構(gòu)域/胞外結(jié)構(gòu)域邊界任一側(cè)的約5個或更少氨基酸，而且本發(fā) 明涵蓋具有或沒有相關(guān)信號肽的此類多肽及編碼它們的核酸。類似地，HhiplM2Em指基本 上不含推定GPI信號序列的Hhipl012多肽(在本文中縮寫為“HhiplM2Em”)。
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本說明書和/或附圖中可能顯示了本文中所公開的各種Hhipl多肽的“信號肽”、 “信號序列”、或“前導(dǎo)序列”(在本文中同義使用)的大致位置。然而，應(yīng)當(dāng)注意，信號肽的 C-末端邊界可以變化，但最有可能的是本文中最初鑒定的信號肽C-末端邊界任一側(cè)不超 過約5個氨基酸，其中信號肽的C-末端邊界可依照本領(lǐng)域常規(guī)用于鑒定該種類型氨基酸序 列元件的標(biāo)準(zhǔn)鑒定(例如 Nielsen et al. , Prot. Eng. 10 1-6 (1997) and von Heinje et al.，Nucl.Acids. Res. 14 =4683-4690 (1986)) 此外，還認識到，在有些情況中，從分泌多肽 上切除信號序列不是完全統(tǒng)一的，導(dǎo)致超過一種分泌種類。本發(fā)明設(shè)想了這些成熟多肽，其 中信號肽在本文中所鑒定的信號肽C-末端邊界任一側(cè)不超過約5個氨基酸內(nèi)切除，及編碼 它們的多核苷酸。"Hhipl012多肽變體”意指與本文中所公開的全長天然序列Hhipl012多肽序列、 Hhipl012多肽的胞外結(jié)構(gòu)域、或本文中所公開的全長Hhipl012多肽序列的任何其它片段 (諸如那些由只呈現(xiàn)全長Hhipl012多肽的完整編碼序列一部分的核酸編碼的片段)具有至 少約80%的氨基酸序列同一性的本文中所定義的Hhipl012多肽，優(yōu)選活性Hhipl012多肽。 此類Hhipl e 12多肽變體包括例如其中全長天然氨基酸序列的N-或C-末端添加或刪除一個 或多個氨基酸殘基的Hhipl012多肽。通常，Hhipl012多肽變體與本文中所公開的全長天然序 列Hhipl012多肽序列、本文中所公開的Hhipl012多肽的胞外結(jié)構(gòu)域或本文中所公開的全長 Hhipl多肽序列的任何其它特別限定片段具有至少約80%的氨基酸序列同一性，或者至少 約 81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%或99%的氨基酸序列同一性。通常，HhiplM2變體多肽的長度為至少約10 個氨基酸，或者長度為至少約 20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、 170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、 360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、 550、560、570、580、590、600個氨基酸或更多。任選的是，Hhipl012變體多肽與天然Hhipl012 多肽序列相比具有不超過一個保守氨基酸替代，或者與天然Hhipl012多肽序列相比具有不 超過2、3、4、5、6、7、8、9或10個保守氨基酸替代。關(guān)于本文中所鑒定的Hhipl多肽序列的“百分比(％ )氨基酸序列同一性”定義 為對比序列并在必要時引入缺口以獲取最大百分比序列同一性后，且不將任何保守替代 視為序列同一性的一部分時，候選序列中與特定Hhipl多肽序列中的氨基酸殘基相同的 氨基酸殘基的百分率。可以本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的多種方式進行測定百分比氨基酸序列同 一性目的的序列對比，例如使用公眾可得到的計算機軟件，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或 Megalign (DNASTAR)軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員可決定測量對比的適宜參數(shù)，包括對所比較序列 全長獲得最大對比所需的任何算法。然而，為了本發(fā)明，％氨基酸序列同一性值是使用序列 比較計算機程序ALIGN-2獲得的。ALIGN-2序列比較計算機程序由Genentech公司編寫，而 且源代碼顯示于美國專利No. 7，361，732且已經(jīng)連同用戶文檔一起提交給美國版權(quán)局(US Copyright Office, Washington D. C.，20559)，并以美國版權(quán)注冊號 TXU510087 注冊。通過 述及將源代碼收入本文。公眾可通過Genentech公司(South San Francisco, California) 得到ALIGN-2程序，或者可從美國專利No. 7，361，732中提供的源代碼編譯。ALIGN2程序應(yīng) 當(dāng)編譯成在UNIX操作系統(tǒng)，優(yōu)選數(shù)碼UNIX V4. OD上使用。所有序列比較參數(shù)由ALIGN-2 程序設(shè)定且不變。
在采用ALIGN-2用于氨基酸序列比較的情況中，給定氨基酸序列A相對于(to)、與 (with)、或針對(against)給定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述為具有 或包含相對于、與、或針對給定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的給定氨基酸序 列A)如下計算分數(shù)X/Y 乘 100其中X是由序列對比程序ALIGN-2在該程序的A和B對比中評分為相同匹配的氨 基酸殘基數(shù)，且其中Y是B中的氨基酸殘基總數(shù)?？梢灶I(lǐng)會，若氨基酸序列A的長度與氨基 酸序列B的長度不相等，則A相對于B的％氨基酸序列同一性將不等于B相對于A的％氨 基酸序列同一性。作為使用這種方法的％氨基酸序列同一性計算的例子，表2和3演示了 如何計算指派為“比較蛋白質(zhì)”的氨基酸序列相對于指派為"Hhipl012”的氨基酸序列的％ 氨基酸序列同一性，其中"Hhipl012”代表感興趣假設(shè)Hhipl012多肽的氨基酸序列，“比較蛋 白質(zhì)”代表感興趣"Hhipl012 ”多肽針對其進行比較的多肽的氨基酸序列，而“X”、“Y”和“Z” 各自代表不同假設(shè)氨基酸殘基。除非另有具體說明，本文中所使用的所有％氨基酸序列同 一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2計算機程序獲得的。"Hhipl012變體多核苷酸”或"Hhipl012變體核酸序列”意指編碼本文中所定義的 Hhipl012多肽，優(yōu)選活性Hhipl012多肽且與編碼本文中所公開的全長天然序列Hhipl012多 肽序列、Hhipl012多肽的胞外結(jié)構(gòu)域、或本文中所公開的全長Hhipl多肽序列的任何其它片 段(諸如那些由只呈現(xiàn)全長Hhipl多肽的完整編碼序列一部分的核酸編碼的片段)的核苷 酸序列具有至少約80%核酸序列同一性的核酸分子。通常，Hhipl012變體多核苷酸與編碼 本文中所公開的全長Hhipl012多肽序列、Hhipl012多肽的胞外結(jié)構(gòu)域、或本文中所公開的 全長Hhipl多肽序列的任何其它片段的核酸序列具有至少約80%的核酸序列同一性，或者 至少約 81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%或99%的核酸序列同一性。此類變體涵蓋HhiplΜ2變體。變體不涵 蓋天然核苷酸序列。通常，Hhipl012變體多核苷酸的長度為至少約5個核苷酸，或者長度為至少約6、 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、 45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、 155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、 300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、 490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、 680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、 870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990 或 1000 個核苷酸，其中在此語 境中，術(shù)語“約”意指所述核苷酸序列長度加上或減去所述長度的10%。關(guān)于本文中所鑒定的Hhipl012編碼核酸序列的“百分比(％ )核酸序列同一性”定 義為對比序列并在必要時引入缺口以獲取最大百分比序列同一性后，候選序列中與感興趣 Hhipl012核酸序列中的核苷酸相同的核苷酸的百分率?？梢员绢I(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的多種方式 進行測定百分比核酸序列同一性目的的序列對比，例如使用公眾可得到的計算機軟件，諸 如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟件。然而，為了本發(fā)明，％核酸序列同 一性值是使用序列比較計算機程序ALIGN-2獲得的，其中ALIGN-2程序的完整源代碼如上所述。在采用ALIGN-2來比較核酸序列的情況中，給定核酸序列C相對于(to)、與 (with)、或針對(against)給定氨基酸序列D的％核酸序列同一性(或者可表述為具有或 包含相對于、與、或針對給定核酸序列D的某一％核酸序列同一性的給定核酸序列C)如下 計算分數(shù)W/Z 乘 100其中W是由序列對比程序ALIGN-2在該程序的C和D對比中評分為相同匹配的核 苷酸數(shù)，且其中Z是D中的核苷酸總數(shù)。可以領(lǐng)會，若核酸序列C的長度與核酸序列D的長 度不相等，則C相對于D的％核酸序列同一性將不等于D相對于C的％核酸序列同一性。 作為％核酸序列同一性計算的例子，表3和4演示了如何計算指派為“比較DNA”的核酸序 列相對于指派為"Hhipl012-DNA”的核酸序列的％核酸序列同一性，其中"Hhipl012-DNA”代 表感興趣假設(shè)Hip編碼核酸序列，“比較DNA”代表感興趣"Hhipl012-DNA”核酸分子針對其 進行比較的核酸分子的核苷酸序列，而“N”、“L”和“V”各自代表不同假設(shè)核苷酸。除非另 有具體說明，本文中所使用的所有％核酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2 計算機程序獲得的。在其它實施方案中，Hhipl012變體多核苷酸是編碼Hhipl012多肽且能夠與編碼本 文中所公開的全長Hhipl多肽的核苷酸序列雜交，優(yōu)選在嚴(yán)格雜交和洗滌條件下雜交的核 酸分子。Hhipl012變體多肽可以是那些由Hhipl012變體多核苷酸編碼的變體多肽。術(shù)語“全長編碼區(qū)”在涉及編碼Hhipl012S肽的核酸使用時指編碼本發(fā)明全長 Hhipl012多肽的核苷酸序列(常常在附圖中起始和終止密碼子(含)之間顯示)?！胺蛛x的”，在用于描述本文中所公開的各種多肽時，意指已經(jīng)鑒定且與/由其天然 環(huán)境的一種成分分開和/或回收的多肽。其天然環(huán)境的污染性成分指通常會干擾該多肽 的診斷或治療用途的物質(zhì)，可包括酶、激素、和其它蛋白質(zhì)性質(zhì)或非蛋白質(zhì)性質(zhì)的溶質(zhì)。在 優(yōu)選的實施方案中，將多肽純化至(1)足以通過使用轉(zhuǎn)杯式測序儀獲得至少15個殘基的 N-末端或內(nèi)部氨基酸序列的程度，或(2)根據(jù)使用考馬斯藍或優(yōu)選銀染色的非還原或還原 條件下的SDS-PAGE，達到同質(zhì)。既然Hhipl012多肽天然環(huán)境的至少一種成分不會存在，那 么分離的多肽包括重組細胞內(nèi)的原位多肽。然而，分離的多肽通常通過至少一個純化步驟 來制備。“分離的"Hhipl012多肽編碼核酸或其它多肽編碼核酸指已經(jīng)鑒定且與該多肽編碼 核酸的天然來源中通常與之相關(guān)的至少一種污染性核酸分子分開的核酸分子。分離的多肽 編碼核酸分子不同于在自然界中發(fā)現(xiàn)它時的形式或背景。分離的多肽編碼核酸分子因此與 存在于天然細胞中時的特定多肽編碼核酸分子有區(qū)別。然而，分離的多肽編碼核酸分子包 括通常表達該多肽的細胞中所包含的多肽編碼核酸分子，例如當(dāng)所述核酸分子在所述細胞 中的染色體定位不同于它在天然細胞中的染色體定位時。術(shù)語“控制序列”指在特定宿主生物體中表達可操作連接的編碼序列所必需的DNA 序列。例如，適于原核生物的控制序列包括啟動子、任選的操縱基因序列、和核糖體結(jié)合位 點。已知真核細胞利用啟動子、多腺苷酸化信號、和增強子。若一條核酸與另一條核酸序列處于功能性相互關(guān)系中，則它是“可操作連接”的。 例如，若前序列(presequence)或分泌前導(dǎo)序列(secretory leader)的DNA表達成參與多肽分泌的前蛋白質(zhì)(preprotein)，則它與多肽的DNA可操作連接；若啟動子或增強子影響 編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則它與該序列可操作連接；或者，若核糖體結(jié)合位點的位置促進翻譯，則 它與編碼序列可操作連接。通常，“可操作連接”意味著相連的DNA序列是相鄰的，而且在分 泌前導(dǎo)的情況中意味著相鄰且處于閱讀狀態(tài)。然而，增強子不必相鄰。連接可通過在方便 的限制性位點處的連接反應(yīng)來實現(xiàn)。如果沒有此類位點，那么依照常規(guī)實踐使用合成的寡 核苷酸銜接頭或接頭。雜交反應(yīng)的“嚴(yán)格性”可以容易的由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員確定，而且通常根據(jù)探針 長度、洗滌溫度、和鹽濃度憑經(jīng)驗計算。通常，較長的探針要求較高的溫度以正確退火，而較 短的探針需要較低的溫度。雜交通常依賴于當(dāng)互補鏈存在于低于其解鏈溫度的環(huán)境中時變 性DNA重新退火的能力。探針和可雜交序列之間的期望同源性程度越高，可使用的相對溫 度也越高。結(jié)果是，推斷出較高相對溫度將趨向于使反應(yīng)條件更為嚴(yán)格，而較低溫度也就較 不嚴(yán)格。關(guān)于雜交反應(yīng)嚴(yán)格性的另外細節(jié)和解釋，參見Ausubel et al. ,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Wiley Interscience Publishers, (1995)?！皣?yán)格條件”或“高嚴(yán)格性條件”，如本文中所定義的，可如下鑒別(1)采用低離 子強度和高溫進行洗滌，例如0. 015M氯化鈉/0. 0015M檸檬酸鈉/0. 十二烷基硫酸鈉， 500C ； (2)在雜交過程中采用變性劑，諸如甲酰胺，例如50% (ν/ν)甲酰胺及0.1%牛血清 清蛋白/0. 1% Ficoll/0. 聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸鈉緩沖液pH 6. 5，含750mM氯化 鈉，75mM檸檬酸鈉，42°C ；或(3)在采用50%甲酰胺，5x SSC(0. 75M NaCl，0. 075M檸檬酸 鈉)，50mM磷酸鈉(pH 6.8)，0. 焦磷酸鈉，5x Denhardt氏溶液，超聲波處理的鮭魚精 DNA(50yg/ml),0. SDSjP 10%硫酸右旋糖苷的溶液中于42°C雜交過夜，以及于42°C在 0. 2x SSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)中洗滌10分鐘，接著在含EDTA的0. Ix SSC中于55°C進行 10分鐘高嚴(yán)格性洗滌。“ 中等嚴(yán)格條件”可以如 Sambrook et al. , Molecular Cloning :A Laboratory Manual, New York : Co Id Spring Harbor Press，1989所述鑒別，包括使用比上文所述較不 嚴(yán)格的洗滌溶液和雜交條件(例如溫度、離子強度和％ SDS)。中等嚴(yán)格條件的一個例子是 于 37°C在含20% 甲酰胺，5x SSC(150mM NaCl，15mM 檸檬酸三鈉)，50mM 磷酸鈉(pH 7.6)， 5x Denhardt氏溶液，10%硫酸右旋糖苷，和20mg/ml變性剪切的鮭魚精DNA的溶液中溫育 過夜，接著在IxSSC中于約37-50°C洗滌濾膜。技術(shù)人員將認識到如何根據(jù)需要調(diào)整溫度、 離子強度等以適應(yīng)諸如探針長度等因素。術(shù)語“表位標(biāo)記的”在用于本文時指包含與“標(biāo)簽多肽”融合的Hhipl012多肽或抗 Hhipl012抗體的嵌合多肽。標(biāo)簽多肽具有足夠殘基以提供表位而可制備針對其的抗體，但 又足夠短使得其不干擾與其融合的多肽的活性。標(biāo)簽多肽優(yōu)選還是相當(dāng)獨特的，使得所述 抗體基本上不與其它表位發(fā)生交叉反應(yīng)。合適的標(biāo)簽多肽通常具有至少6個氨基酸殘基且 通常在約8個到約50個氨基酸殘基之間(優(yōu)選在約10個到約20個氨基酸殘基之間)?！坝谢钚缘摹被颉盎钚浴睘榱吮景l(fā)明指保留天然或天然存在Hhipl的生物學(xué)和/或免 疫學(xué)活性的Hhipl012多肽形式，其中“生物學(xué)”活性指天然或天然存在Hhipl的，誘導(dǎo)針對 天然或天然存在Hhipl所具有的抗原性表位的抗體生成的能力以外的生物學(xué)功能，而“免 疫學(xué)”活性指誘導(dǎo)針對天然或天然存在Hip所具有的抗原性表位的抗體生成的能力。術(shù)語“拮抗劑”以最廣義使用，包括部分或完全阻斷、抑制、或中和本文中所公開的天然Hhipl多肽的生物學(xué)活性的任何分子。類似的，術(shù)語“激動劑”以最廣義使用，包括模 擬本文中所公開的天然Hhipl多肽的生物學(xué)活性的任何分子。合適的激動劑或拮抗劑分子 明確包括激動性或拮抗性抗體或抗體片段、天然Hhipl多肽的片段或氨基酸序列變體、肽、 反義寡核苷酸、有機小分子等。用于鑒定Hhipl多肽的激動劑或拮抗劑分子的方法可包括 使Hhipl多肽接觸候選激動劑或拮抗劑分子并測量通常與Hhipl多肽有關(guān)的一種或多種生 物學(xué)活性的可檢測變化?！疤幚怼被颉爸委煛被颉熬徍汀敝钢委熜蕴幚砑邦A(yù)防性或防范性措施二者，其中目標(biāo) 是預(yù)防或減緩(減輕)所針對的病理學(xué)狀況或病癥。需要治療的受試者包括早就患有病 癥的受試者以及傾向于患上病癥的受試者或要預(yù)防病癥的受試者。例如，如果在依照本發(fā) 明的方法接受治療量的Hhipl012寡肽或Hhipl012免疫粘附素后，患者在如下一項或多項中 顯示出可觀察和/或可測量的降低或消失，那么受試者或哺乳動物成功“治療” 了癌癥癌 細胞數(shù)減少或癌細胞消失；腫瘤體積縮小；癌細胞浸潤到周圍器官中，包括癌傳播到軟組 織和骨中受到抑制(即一定程度的減緩，優(yōu)選停止)；腫瘤轉(zhuǎn)移受到抑制(即一定程度的減 緩，優(yōu)選停止)；腫瘤生長受到一定程度的抑制；Hedgehog信號傳導(dǎo)受到抑制；和/或與特 定癌癥有關(guān)的一種或多種癥狀得到一定程度的減輕；發(fā)病率和死亡率降低；及生命質(zhì)量提 高。就抗Hhipl012抗體或Hhipl012寡肽可預(yù)防癌細胞生長和/或殺死現(xiàn)有癌細胞而言，它 可能是抑制細胞的和/或毒害細胞的。這些體征或癥狀的減輕還可以由患者感受到。用于評估疾病的成功治療和改善的上述參數(shù)可以容易地通過內(nèi)科醫(yī)師所熟悉的 常規(guī)流程來測量。對于癌癥治療，可通過例如評估距疾病進展的時間(time to disease progression, TTP)和/或測定響應(yīng)速率(response rate, RR)來測量功效。轉(zhuǎn)移可通過分 期測試(staging test)來測定，及通過骨掃描及鈣水平和其它酶的測試以測定是否傳播到 骨。還可進行CT掃描以查明是否傳播到骨盆及該區(qū)域中的淋巴結(jié)。分別使用胸腔X射線 和通過已知方法進行的肝酶水平測量來分別查明是否轉(zhuǎn)移到肺和肝。用于監(jiān)測疾病的其它 常規(guī)方法包括經(jīng)直腸超聲檢查(TRUS)和經(jīng)直腸針吸活組織檢查(TRNB)。對于膀胱癌，一種更加局部化的癌癥，測定疾病進展的方法包括通過膀胱鏡檢 術(shù)進行的尿細胞學(xué)評估、監(jiān)測尿液中血的存在情況、通過超聲波檢查術(shù)顯現(xiàn)尿路上皮道 (urothelial tract)或靜脈注射腎盂造影照片(intravenous pyelogram)、計算機斷層攝 影術(shù)(computed tomography) (CT)禾口磁共振成像(magnetic resonance imaging) (MRI)。 遠程轉(zhuǎn)移的存在情況可通過腹部CT、胸腔X射線或骨骼放射性核素成像來評估?！伴L期”施用指以與短期模式相反的連續(xù)模式施用藥劑，從而將初始治療效果(活 性)維持較長的一段時間?！伴g歇”施用指并非連續(xù)不間斷進行的處理，而是本質(zhì)上是循環(huán) 的處理。對于癌癥的治療、減輕癥狀、或診斷而言，“哺乳動物”指歸入哺乳類的任何動物， 包括人、家畜和牲畜，及動物園、運動或?qū)櫸飫游?，諸如犬、貓、牛、馬、綿羊、豬、山羊、兔等。 優(yōu)選的是，哺乳動物指人?！奥?lián)合”一種或多種其它治療劑的施用包括同時(共同)施用和任意次序的連續(xù)施用。“載體”在用于本文時包括藥學(xué)可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑，它們在所采用的 劑量和濃度對暴露于其的細胞或哺乳動物是無毒的。通常，生理學(xué)可接受的載體是PH緩沖水溶液。生理學(xué)可接受載體的來自包括緩沖劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機酸鹽的緩 沖劑；抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量(少于約10個殘基)多肽；蛋白質(zhì)，諸如血清清蛋 白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，諸如甘氨酸、谷氨酰 胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精； 螯合劑，諸如EDTA ；糖醇，諸如甘露醇或山梨醇；成鹽相反離子，諸如鈉；和/或非離子表面 活性劑，諸如TWEEN 、聚乙二醇(PEG)和PLURONICS⑧?！肮滔唷被颉肮腆w支持物”意指本發(fā)明的抗體、Hhipl012寡肽或HhiplM2L2模擬有機 分子可粘著或附著其上的非水性基質(zhì)。本文中所涵蓋的固相的例子包括那些部分或完全由 玻璃(例如可控孔徑玻璃)、多糖(例如瓊脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和聚硅 氧烷(silicone)制成的固相。在某些實施方案中，根據(jù)語境，固相可包括測定板的孔；在其 它實施方案中，它指純化柱(例如親和層析柱)。此術(shù)語還包括離散顆粒的不連續(xù)固相，諸 如美國專利No. 4，275，149中所述?！爸|(zhì)體”指由各種類型脂質(zhì)、磷脂和/或表面活性劑構(gòu)成的，可用于對哺乳動物遞 送藥物(諸如Hhipl012多肽、針對其的抗體或Hhipl012寡肽)的小囊泡。與生物膜的脂質(zhì) 排列相似，脂質(zhì)體的成分通常排列成雙層形式?！靶　狈肿踊蛴袡C“小”分子在本文中定義為分子量小于約500道爾頓。本文中所公開的多肽、抗體、Hhipl012寡肽、Hip模擬有機分子、或其激動劑或拮抗 劑的“有效量”指足以實現(xiàn)明確規(guī)定的目的的量?！坝行Я俊笨蓱{經(jīng)驗且以常規(guī)方式，聯(lián)系所 述的目的來確定。術(shù)語“治療有效量”指在受試者或哺乳動物中有效“治療”疾病或病癥的抗體、多 肽、Hhipl012寡肽、Hhipl012 L2模擬有機分子或其它藥物的量。在癌癥的情況中，藥物的 治療有效量可減少癌細胞數(shù)；縮小腫瘤體積；抑制(即一定程度的減緩，優(yōu)選停止)癌細胞 浸潤到周圍器官中；抑制(即一定程度的減緩，優(yōu)選停止)腫瘤轉(zhuǎn)移；一定程度的抑制腫瘤 生長；Hedgehog信號傳導(dǎo)受到抑制；和/或一定程度的減輕與癌癥有關(guān)的一種或多種癥狀。 參見本文中“治療”的定義。就藥物可預(yù)防現(xiàn)存癌細胞生長和/或殺死現(xiàn)有癌細胞的程度 而言，它可以是抑制細胞的和/或毒害細胞的?？笻hipl012抗體、Hhipl012多肽、Hhipl012寡肽或Hhipl012 L2模擬有機分子的“生 長抑制量”指能夠在體外或在體內(nèi)抑制細胞，尤其是腫瘤，例如癌細胞生長的量?？笻hipl012 抗體、Hhipl多肽、Hhipl結(jié)合寡肽或Hhipl結(jié)合有機分子為了抑制腫瘤性細胞生長的“生 長抑制量”可憑經(jīng)驗且以常規(guī)方式來確定?？笻hipl012抗體、Hhipl012多肽、Hhipl012寡肽或Hhipl012 L2模擬有機分子的“細 胞毒性量”指能夠在體外或在體內(nèi)引起細胞，尤其是腫瘤，例如癌細胞破壞的量?？笻hipl012 抗體、Hhipl012多肽、Hhipl012寡肽或Hhipl012 L2模擬有機分子為了抑制腫瘤性細胞生長 的“細胞毒性量”可憑經(jīng)驗且以常規(guī)方式來確定。術(shù)語“抗體”以最廣義使用，明確覆蓋例如單一抗Hhipl012單克隆抗體(包括激動 性、拮抗性和中和性抗體)、具有多表位特異性的抗Hhipl012抗體組合物、多克隆抗體、單鏈 抗Hhipl e 12抗體、及抗Hhipl e 12抗體的片段(見下文)，只要它們展現(xiàn)出期望生物學(xué)或免疫 學(xué)活性。術(shù)語“免疫球蛋白”(Ig)在本文中與抗體可互換使用?！胺蛛x的”抗體指已經(jīng)鑒定且與/由其天然環(huán)境的一種成分分開和/或回收的抗體。其天然環(huán)境的污染性成分指會干擾該抗體的診斷或治療用途的物質(zhì)，可包括酶、激素、 和其它蛋白質(zhì)性質(zhì)或非蛋白質(zhì)性質(zhì)的溶質(zhì)。在優(yōu)選的實施方案中，將抗體純化至(1)根據(jù) Lowry方法的測定，抗體重量超過95%，最優(yōu)選重量超過99%，(2)足以通過使用轉(zhuǎn)杯式測 序儀獲得至少15個殘基的N-末端或內(nèi)部氨基酸序列的程度，或(3)根據(jù)使用考馬斯藍或 優(yōu)選銀染色的還原性或非還原性條件下的SDS-PAGE，達到同質(zhì)。既然抗體天然環(huán)境的至少 一種成分不會存在，那么分離的抗體包括重組細胞內(nèi)的原位抗體。然而，分離的抗體通常通 過至少一個純化步驟來制備?；镜?鏈抗體單元是由兩條相同的輕鏈(L)和兩條相同的重鏈(H)構(gòu)成的異四 聚體糖蛋白(IgM抗體由5個基本的異四聚體單元及稱作J鏈的另外多肽組成，因此包含10 個抗原結(jié)合位點；而分泌型IgA抗體可聚合形成包含2-5個基本的4鏈單元及J鏈的多價 裝配物)。在IgG的情況中，4鏈單元通常是約150，000道爾頓。每條輕鏈通過一個共價二 硫鍵與重鏈相連，而兩條重鏈通過一個或多個二硫鍵彼此相連，二硫鍵的數(shù)目取決于重鏈 的同種型。每條重鏈和輕鏈還具有間隔規(guī)律的鏈內(nèi)二硫鍵。每條重鏈在N-末端具有一個 可變區(qū)(Vh)，接著是三個(對于α和Y鏈)或四個(對于μ和ε同種型)恒定區(qū)(Ch)。 每條輕鏈在N-末端具有一個可變區(qū)(VJ，接著是其另一端的一個恒定區(qū)(CJ。\與￥11排列 在一起，而Q與重鏈的第一恒定區(qū)(ChI)排列在一起。認為特定的氨基酸殘基在輕鏈和重 鏈可變區(qū)之間形成界面。成對的一個Vh和一個\ 一起形成一個抗原結(jié)合位點。關(guān)于不同 類別抗體的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，參見例如 BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY, 8th edition,Daniel P. Stites, Abba I.Terr and Tristram G. Parslow(eds. ), Appleton&Lange, Norwalk, CT, 1994, page 71 and Chapter 6。來自任何脊椎動物物種的輕鏈，根據(jù)其恒定區(qū)氨基酸序列，可歸入兩種截然不同 類型中的一種，稱作卡帕(κ)和拉姆達(λ)。根據(jù)其重鏈(Ch)恒定區(qū)氨基酸序列，免疫球 蛋白可歸入不同的類別或同種型。有五類免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，分別具有 稱作α、δ、ε、Υ和μ的重鏈。根據(jù)Ch序列和功能的較小差異，、和α類可進一步分 為亞類，例如人類表達下列亞類=IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。術(shù)語“可變的”指可變區(qū)中的某些區(qū)段在抗體序列中差異廣泛的實情。V結(jié)構(gòu)域 介導(dǎo)抗原結(jié)合并限定特定抗體對其特定抗原的特異性。然而，變異性并非均勻分布于可變 區(qū)跨越的110個氨基酸。事實上，V區(qū)由15-30個氨基酸，稱作框架區(qū)(KR)的相對不變異 的區(qū)段及將框架區(qū)分開的每個長度為9-12個氨基酸，稱作“高變區(qū)”的極度變異的較短區(qū) 域構(gòu)成。天然重鏈和輕鏈的可變區(qū)各自包含四個FR，它們大多采取β-折疊構(gòu)象，通過形 成環(huán)狀連接且在有些情況中形成β-折疊結(jié)構(gòu)一部分的三個高變區(qū)連接。每條鏈中的高變 區(qū)通過FR非常接近的保持在一起，并與另一條鏈的高變區(qū)一起促成抗體的抗原結(jié)合位點 的形成(參見 Kabat et al.，SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th Ed. Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD. (1991)) ?！痝 定區(qū)不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但展現(xiàn)出多種效應(yīng)器功能，諸如抗體依賴性細胞介導(dǎo) 的細胞毒性(ADCC)中抗體的參與。術(shù)語“高變區(qū)”在用于本文時指抗體中負責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。高變區(qū)一般包 含來自“互補決定區(qū)”或“CDR”的氨基酸殘基(例如\中的殘基24-34 (Li)、50-56 (L2)和 89-97 (L3)附近及 Vh* 的殘基 31-35B(H1)、50-65(H2)和 95-102 (H3)附近；Kabat et al.，
26SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST,5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))和 / 或那些來自“高變環(huán)”的 殘基(例如 Vl 中的殘基 26-32(Ll)、50-52(L2)和 91-96 (L3)及 Vh 中的殘基 26-32 (Hl)、 53-55 (H2)和 96-101(H3) ；Chothia and Lesk(1987)J. Mol. Biol. 196 :901_917)。術(shù)語“單克隆抗體”在用于本文時指從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體，即構(gòu)成 群體的各個抗體相同，除了可能以極小量存在的可能的天然存在突變外。單克隆抗體是高 度特異的，針對單一抗原性位點。另外，與通常包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的 多克隆抗體制備物不同，每種單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。除了它們的特異性，單 克隆抗體的優(yōu)越性體現(xiàn)在它們在合成時可未受到其它抗體的污染。修飾語“單克隆”不能 解釋為要求通過任何特定方法來生成抗體。例如，可用于本發(fā)明的單克隆抗體可通過最初 由Kohler and Milstein (1975) Nature 256 :495描述的雜交瘤方法來制備，或者可通過重 組DNA方法在細菌、真核動物或植物細胞中制備(參見例如美國專利No. 4，816，567)。“單 克隆抗體”還可使用例如 Clackson et al.，(1991) Nature 352 :624_628 及 Marks et al.， (1991) J. Mol. Biol.，222 =581-597中描述的技術(shù)從噬菌體抗體庫分離。單克隆抗體在本文中包括“嵌合”抗體，以及此類抗體的片段，其中重鏈和/或輕 鏈的一部分與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同 源，而鏈的剩余部分與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相 同或同源，只要它們展現(xiàn)出期望生物學(xué)活性(參見美國專利No. 4，816，567及Morrison et al.，(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :6851_6855)。本文中感興趣的嵌合抗體包括包含 衍生自非人靈長類動物(如舊大陸猴類(Old World Monkey)、猿等)的可變區(qū)抗原結(jié)合序 列和人恒定區(qū)序列的“靈長類化(primatized) ”抗體?！巴暾贵w”指包含抗原結(jié)合位點以及Q和至少重鏈恒定區(qū)CH1、Ch2和Ch3的抗 體。恒定區(qū)可以是天然序列恒定區(qū)(例如人天然序列恒定區(qū))或其氨基酸序列變體。優(yōu)選 的是，完整抗體具有一項或多項效應(yīng)器功能。“抗體片段”包含完整抗體的一部分，優(yōu)選完整抗體的抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w 片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab' )2和Fv片段；雙抗體(diabody)；線性抗體(參見美 國專利 No. 5，641，870，實施例 2 ;Zapata et al. , (1995) Protein Eng. 8(10) 1057-1062)； 單鏈抗體分子；及由抗體片段形成的多特異性抗體。用木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生兩個相同的抗原結(jié)合片段，稱作“Fab”片段，和一個殘 余“Fe”片段，其名稱反映了它易于結(jié)晶的能力。Fab片段由一條完整輕鏈及一條重鏈的可 變區(qū)(Vh)和第一恒定區(qū)(ChI)組成。每個Fab片段對于抗原結(jié)合是單價的，即它具有一個 抗原結(jié)合位點。胃蛋白酶處理抗體產(chǎn)生一個較大F(ab' )2片段，它粗略相當(dāng)于兩個通過二 硫鍵相連的Fab片段，具有二價抗原結(jié)合活性且仍能夠交聯(lián)抗原。Fab’片段因在ChI結(jié)構(gòu) 域的羧基末端增加了少數(shù)殘基而與Fab片段有所不同，包括來自抗體鉸鏈區(qū)的一個或多個 半胱氨酸。Fab’ -SH是本文中對其中恒定區(qū)半胱氨酸殘基攜帶游離硫醇基的Fab’的稱謂。 F(ab' )2抗體片段最初是作為成對Fab’片段生成的，在Fab’片段之間具有鉸鏈半胱氨酸。 還知道抗體片段的其它化學(xué)偶聯(lián)。Fc片段包含通過二硫鍵保持在一起的兩條重鏈的羧基末端部分?？贵w的效應(yīng)器功 能是由Fc區(qū)中的序列決定的，該區(qū)還是受到在某些類型細胞上發(fā)現(xiàn)的Fc受體(FcR)識別的部分。“Fv”是包含完整抗原識別和結(jié)合位點的最小抗體片段。此片段由緊密、非共價結(jié) 合的一個重鏈可變區(qū)和一個輕鏈可變區(qū)的二聚體組成。從這兩個結(jié)構(gòu)域的折疊中散發(fā)出六 個高變環(huán)(重鏈和輕鏈各3個環(huán))，貢獻出抗原結(jié)合的氨基酸殘基并賦予抗體以抗原結(jié)合特 異性。然而，即使是單個可變區(qū)(或只包含對抗原特異的三個CDR的半個Fv)也具有識別 和結(jié)合抗原的能力，盡管親和力低于完整結(jié)合位點。“單鏈Fv”，也可縮寫為“sFv”或“scFv”，是包含連接成一條多肽鏈的抗體Vh和\ 結(jié)構(gòu)域的抗體片段。優(yōu)選的是，sFv多肽在Vh和\結(jié)構(gòu)域之間還包含多肽接頭，使得sFv 形成抗原結(jié)合期望的結(jié)構(gòu)。關(guān)于sFv的綜述參見Pluckthun in THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES, vol. 113，Rosenburg and Moore eds.，Springer-Verlag, New York, pp.269-315(1994) ；Borrebaeck 1995，infra。術(shù)語“雙抗體”指通過在Vh和\結(jié)構(gòu)域之間使用短接頭(約5-10個殘基)構(gòu)建 sFv片段(見上一段)而制備的小型抗體片段，由于接頭短，使得V結(jié)構(gòu)域?qū)嵭墟滈g而非 鏈內(nèi)配對，導(dǎo)致二價片段，即具有兩個抗原結(jié)合位點的片段。雙特異性雙抗體是兩個“交 叉”sFv片段的異二聚體，其中兩種抗體的Vh和\結(jié)構(gòu)域存在于不同多肽鏈上。雙抗體更完 整的描述于例如 EP 404,097 ；W093/11161 ；Hollinger et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 6444-6448(1993)?？躬毺匦涂贵w指結(jié)合受試抗體的抗原結(jié)合區(qū)的抗體。此類抗獨特型抗體可模擬由 受試抗體結(jié)合的表位。例如，特異性結(jié)合Hhipl L2環(huán)的Hhipl012抗體可模擬Hedgehog中 結(jié)合L2的部分。如此，針對此受試抗體生成(且特異性針對抗原結(jié)合區(qū))的抗獨特型抗體 可因此以Hhipl L2部分結(jié)合Hedgehog的方式識別并特異性結(jié)合。非人(例如嚙齒類)抗體的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人抗體的序 列的嵌合抗體。在極大程度上，人源化抗體指人免疫球蛋白(受體抗體)中的高變區(qū)殘基 用具有期望抗體特異性、親和力和能力的非人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠、兔或非人 靈長類的高變區(qū)殘基替換的免疫球蛋白。在有些情況中，將人免疫球蛋白的框架區(qū)(FR)殘 基用相應(yīng)的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中沒有發(fā)現(xiàn)的 殘基。進行這些修飾是為了進一步改進抗體的性能。通常，人源化抗體包含至少一個、通常 兩個基本上整個如下可變區(qū)，其中整個或基本上整個高變環(huán)對應(yīng)于非人免疫球蛋白的高變 環(huán)，且整個或基本上整個FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗體任選還包含至少部分免 疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。更多細節(jié)參見Jones et al. (1986) Nature 321 :522_525 ；Riechmann et al. (1988)Nature 332 :323_329 ；and Presta,(1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593_596?！拔锓N依賴性抗體”，例如哺乳動物抗人IgE抗體，指對來自第一哺乳動物物種的 抗原的結(jié)合親和力強于對來自第二哺乳動物物種的該抗原的同系物的結(jié)合親和力的抗體。 通常，物種依賴性抗體“特異性結(jié)合”人類抗原(即具有不超過約IxlO-7M,優(yōu)選不超過約 1χ10_8Μ，最優(yōu)選不超過約1x10_9M的結(jié)合親和力(Kd))，但是對來自第二非人哺乳動物物種 的該抗原的同系物具有比其對人類抗原的結(jié)合親和力弱至少約50倍，或至少約500倍，或 至少約1000倍的結(jié)合親和力。物種依賴性抗體可以是上文定義的各種類型抗體，但是優(yōu)選 人源化抗體或人抗體。
"Hhipl012寡肽”指結(jié)合，優(yōu)選特異性結(jié)合Hedgehog多肽的寡肽。Hhipl012結(jié)合寡 肽可使用已知寡肽合成方法而化學(xué)合成，或者可使用重組技術(shù)來制備和純化。Hhipl012寡 肽的長度通常是至少約5個氨基酸，或者長度為至少約6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、 42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、 67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、 92、93、94、95、96、97、98、99或100個氨基酸或更多，其中能夠結(jié)合，優(yōu)選特異性結(jié)合本文所 述Hedgehog多肽的此類寡肽。本文中描述了一些Hhipl012寡肽。其它HhiplM2寡肽可使 用眾所周知的技術(shù)無需過多實驗就得以鑒定。在這點上，注意到用于對寡肽庫篩選能夠特 異性結(jié)合多肽靶物的寡肽的技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的(參見例如美國專利No. 5，556，762 ； 5，750，373 ；4，708，871 ；4，833，092 ；5，223，409 ；5，403，484 ；5，571，689 ；5，663，143 ； PCTPublication Nos. WO 84/03506 and W084/03564 ；Geysen et al.，(1984)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 3998-4002 ；Geysen et al. , (1985)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 178-182(1985) ；Geysen et al.，in SYNTHETIC PEPTIDES AS ANTIGENS，130-149 (1986)； Geysen et al. , (1987) J. Immunol. 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Biotechnol. 2 :668)。"Hhipl012 L2環(huán)結(jié)合寡肽”指在Hhipl天然與Hh相互作用的部分(即L2環(huán))和/ 或Ptch的類似部分處結(jié)合，優(yōu)選特異性結(jié)合Hhipl多肽的一種Hhipl012寡肽形式。Hhipl012 L2環(huán)結(jié)合寡肽可使用已知寡肽合成方法而化學(xué)合成，或者可使用重組技術(shù)來制備和純化。 Hhipl012 L2環(huán)結(jié)合寡肽的長度通常是至少約5個氨基酸，或者長度為至少約6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、 36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、 61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、 86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100 個氨基酸或更多，其中能夠結(jié)合，優(yōu) 選特異性結(jié)合本文所述Hhipl和/或Ptch多肽的此類寡肽。"Hhipl012 L2環(huán)結(jié)合有機分子”指不同于本文中所定義的寡肽或抗體，而結(jié)合，優(yōu) 選特異性結(jié)合本文所述蛋白質(zhì)中Hhipl012 L2環(huán)基序(包括Ptch和Ptch2多肽中類似基 序)的有機分子。Hhipl012 L2環(huán)結(jié)合有機分子可使用已知方法來鑒定和化學(xué)合成(參見 例如PCT公開號WO 00/00823和WO 00/39585)。Hhipl012 L2環(huán)結(jié)合有機分子的大小通常 是小于約2000道爾頓，或者大小小于約1500、750、500、250或200道爾頓，其中能夠結(jié)合， 優(yōu)選特異性結(jié)合本文所述Hhipl和/或Ptch多肽的此類有機分子可使用眾所周知的技術(shù) 無需過多實驗就得以鑒定。在這點上，注意到用于對有機分子庫篩選能夠結(jié)合多肽靶物的 分子的技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的(參見例如PCT公開號WO 00/00823和W000/39585)。由 于Hhipl L2和Ptch L2結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)相似性，此類分子對Hhipl和/或Ptch可具有激動 劑或拮抗劑效果。"Hhipl012 L2環(huán)模擬寡肽”指在Hh天然與Hhipl相互作用的部分處結(jié)合，優(yōu)選特異性結(jié)合Hh多肽的肽。Hhipl012 L2環(huán)模擬寡肽可使用已知寡肽合成方法而化學(xué)合成，或者可 使用重組技術(shù)來制備和純化。Hhipl012 L2環(huán)模擬寡肽的長度通常是至少約5個氨基酸，或 者長度為至少約 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、 28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、 53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、 78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 100 個氨基 酸或更多，其中能夠結(jié)合，優(yōu)選特異性結(jié)合本文所述Hh多肽的此類寡肽。"Hhipl012 L2模擬有機分子”指不同于本文中所定義的寡肽或抗體，而結(jié)合，優(yōu)選 特異性結(jié)合本文所述Hedgehog多肽的有機分子。Hhipl012 L2模擬有機分子可使用已知方 法來鑒定和化學(xué)合成(參見例如PCT公開號W000/00823和WO 00/39585)。Hhipl012 L2模 擬有機分子的大小通常是小于約2000道爾頓，或者大小小于約1500、750、500、250或200 道爾頓，其中能夠結(jié)合，優(yōu)選特異性結(jié)合本文所述Hedgehog多肽的此類有機分子可使用眾 所周知的技術(shù)無需過多實驗就得以鑒定。在這點上，注意到用于對有機分子庫篩選能夠結(jié) 合多肽靶物的分子的技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的(參見例如PCT公開號WO 00/00823和WO 00/39585)?！敖Y(jié)合”目的抗原，例如腫瘤相關(guān)多肽抗原靶物的抗體、寡肽或其它有機分子指以 足夠親和力結(jié)合該抗原，使得該抗體、寡肽或其它有機分子可作為診斷劑和/或治療劑用 于靶向表達該抗原的細胞或組織且不顯著與其它蛋白質(zhì)發(fā)生交叉反應(yīng)的分子。在此類實施 方案中，根據(jù)熒光激活細胞分選(FACS)分析或放射免疫沉淀(RIA)的測定，抗體、寡肽或其 它有機分子結(jié)合“非靶物”蛋白質(zhì)的程度將小于該抗體、寡肽或其它有機分子對其特定靶物 蛋白質(zhì)的結(jié)合的約10%。對于抗體、寡肽或其它有機分子對靶分子的結(jié)合，術(shù)語“特異結(jié)合” 或“特異性結(jié)合”特定多肽或特定多肽靶物上的表位或?qū)ζ洹疤禺悺币馕吨蓽y量的不同于 非特異相互作用的結(jié)合。特異結(jié)合可通過例如測定分子的結(jié)合并與對照分子的結(jié)合比較來 測量，所述對照分子通常是結(jié)構(gòu)相似但沒有結(jié)合活性的分子。例如，特異結(jié)合可通過與對照 分子的競爭來測定，所述對照分子與靶物相似，例如過量的未標(biāo)記靶物。在這種情況中，若 經(jīng)標(biāo)記靶物與探針的結(jié)合受到過量未標(biāo)記靶物的競爭性抑制，則指示特異結(jié)合。術(shù)語“特異 結(jié)合”或“特異性結(jié)合”特定多肽或特定多肽靶物上的表位或?qū)ζ洹疤禺悺痹谟糜诒疚臅r可 展現(xiàn)出例如對靶物的Kd為至少約10_4M，或至少約10_5M，或至少約10_6M，或至少約10_7M，或 至少約IO-8M,或至少約IO-9M,或至少約ICTkiM,或至少約IiT11M,或至少約ICT12M或ICT12M以 上。在一個實施方案中，術(shù)語“特異結(jié)合”指這樣的結(jié)合，其中分子結(jié)合特定多肽或特定多 肽上的表位，而基本上不結(jié)合任何其它多肽或多肽表位。Hhipl L2與Ptch L2環(huán)的結(jié)構(gòu)相似性容許靶向L2環(huán)的抗Hhipl012抗體的交叉 反應(yīng)性。如此，在某些實施方案中，結(jié)合Hhipl012 L2環(huán)的抗Hhipl012抗體還可特異性結(jié)合 Ptch L2環(huán)。同樣，設(shè)計成結(jié)合Hhipl012 L2環(huán)或Hedgehog中與Hhipl012 L2環(huán)相互作用的 部分的有機小分子也可結(jié)合Ptch L2的結(jié)構(gòu)類似部分。如本文中使用的，在提及本文所述抗體、寡肽、和有機小分子及使用它們的各種方 法時，“Patched”或“Ptch”包括Ptch和Ptch2多肽二者?！耙种颇[瘤細胞生長”的抗體、寡肽或其它有機分子或“生長抑制性”抗體、寡肽或 其它有機分子指對響應(yīng)Hedgehog刺激的癌細胞導(dǎo)致可測量的生長抑制的分子。與適宜對照相比，優(yōu)選的生長抑制性抗Hhipl012抗體、寡肽或有機分子將Hedgehog響應(yīng)性腫瘤細 胞的生長抑制超過20%，優(yōu)選約20%至約50%，甚至更優(yōu)選超過50% (例如約50%至約 100% )，所述對照通常是未用所測試抗體、寡肽或其它有機分子處理的腫瘤細胞。在一個實 施方案中，可在細胞培養(yǎng)物中在約0. 1至30μ g/ml或約0. 5nM至200nM的抗體濃度測量生 長抑制作用，其中生長抑制作用是在腫瘤細胞暴露于抗體后1-10天測定的。若以約1 μ g/ kg至約100mg/kg體重施用抗Hhipl012抗體導(dǎo)致在距首次施用抗體約5天至3個月內(nèi)，優(yōu) 選約5至30天內(nèi)腫瘤體積縮小或腫瘤細胞增殖降低，則該抗體在體內(nèi)是生長抑制性的。腫瘤細胞通常指對Hedgehog信號傳導(dǎo)有響應(yīng)的。優(yōu)選的是，腫瘤細胞是例如基底 細胞癌、前列腺、乳腺、卵巢、胃、子宮內(nèi)膜、肺、腎、結(jié)腸、膀胱腫瘤細胞。抗體“效應(yīng)器功能”指那些可歸于抗體Fc區(qū)(天然序列Fc區(qū)或氨基酸序列變體 Fc區(qū))的生物學(xué)活性，且隨抗體同種型而變化?？贵w效應(yīng)器功能的例子包括Clq結(jié)合和補 體依賴性細胞毒性；Fc受體結(jié)合；抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細 胞表面受體(例如B細胞受體)的下調(diào)；和B細胞激活?！翱贵w依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性”或“ADCC”指其中結(jié)合到某些細胞毒性細胞 (例如天然殺傷(NK)細胞、嗜中性粒細胞和巨噬細胞)上存在的Fc受體(FcR)上的分泌型 Ig使得這些細胞毒性效應(yīng)細胞能夠特異性結(jié)合攜帶抗原的靶細胞，隨后用細胞毒素殺死靶 細胞的細胞毒性形式。所述抗體“武裝”(arm)細胞毒性細胞，而且是此類殺傷作用絕對必 需的。介導(dǎo)ADCC的主要細胞，NK細胞，只表達Fc y RIII，而單核細胞表達Fc y RI,Fc y RII 禾口 FcyRIII。 Ravetch and Kinet (1991) Annu. Rev. Immunol. 9 :457_492 中第 464 頁表 3 總結(jié)了造血細胞上的FcR表達?？蛇M行體外ADCC測定法，諸如美國專利No. 5，500，362或 5，821，337中所述，以評估感興趣分子的ADCC活性?？捎糜诖祟悳y定法的效應(yīng)細胞包括外 周血單個核細胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細胞?；蛘?另外，可在體內(nèi)評估目的分子的ADCC 活性，例如在動物模型中，諸如 Clynes et al. (1998)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(2) 652-656中所公開的。"Fe受體”或“FcR”描述與抗體Fc區(qū)結(jié)合的受體。優(yōu)選的FcR是天然序列人FcR。 此外，優(yōu)選的FcR是與IgG抗體結(jié)合的FcR( γ受體)，包括Fc γ RI、Fc γ RII和Fc γ RIII亞 類的受體，包括這些受體的等位變體和可變剪接形式。FcyRII受體包括Fc γ RIIA ( “活化 受體”)和FcyRIIB( “抑制受體”)，它們具有相似的氨基酸序列，區(qū)別主要在于其胞質(zhì)結(jié) 構(gòu)域?；罨荏wFc γ RIIA在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含免疫受體基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。 抑制受體Fc y RIIB在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含免疫受體基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(參 見綜述 Dagron, (1997) Annu. Rev. Immunol. 15 :203-234)。FcR 的綜述參見 Ravetch and Kinet (1991)Annu. Rev. Immunol. 9 457-492 ；Capel et al. (1994)Immunomethods 4 25-34;及 de Haas et al. (1995) J. Lab. Clin. Med. 126 :330_341。術(shù)語"FcR，，在本文中涵 蓋其它FcR，包括未來將會鑒定的FcR。該術(shù)語還包括新生兒受體(neonatal receptor), FcRn，它負責(zé)將母體的 IgG轉(zhuǎn)移給胎兒(Guyer et al. (1976) J. Immunol. 117 587 及 Kim et al. (1994) J. Immunol. 24 249)?！叭诵?yīng)細胞”指表達一種或多種FcR并執(zhí)行效應(yīng)器功能的白細胞。優(yōu)選的是，該 細胞至少表達Fc y RIII并執(zhí)行ADCC效應(yīng)器功能。介導(dǎo)ADCC的人白細胞的例子包括外周 血單個核細胞(PBMC)、天然殺傷(NK)細胞、單核細胞、細胞毒性T細胞和嗜中性粒細胞，優(yōu)選PBMC和NK細胞。效應(yīng)細胞可以從天然來源分離，例如血液。“補體依賴性細胞毒性”或“CDC”指存在補體時靶細胞的溶解。經(jīng)典補體途徑的 激活是由補體系統(tǒng)第一組分(Clq)結(jié)合與其關(guān)聯(lián)抗原結(jié)合的(適宜亞型的)抗體起始的。 為了評估補體激活，可進行⑶C測定法，例如Gazzano-Santoro et al.，(1996) J. Immunol. Methods 202 163 中所述。術(shù)語“癌癥”和“癌性”指或描述哺乳動物中特征通常為細胞生長不受調(diào)節(jié)的生 理狀況。癌癥的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤、及白血病或淋巴樣惡性腫 瘤。此類癌癥的更具體例子包括鱗狀細胞癌(例如上皮鱗狀細胞癌)、肺癌包括小細胞肺 癌、非小細胞肺癌、肺的腺癌和肺的鱗狀癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌包括胃腸癌、胰腺癌、成 膠質(zhì)細胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、尿道癌、肝瘤(hepatoma)、乳腺癌、結(jié)腸癌、直腸 癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝的癌、 肛門癌、陰莖癌、黑素瘤、多發(fā)性骨髓瘤和B細胞淋巴瘤、腦癌、以及頭和頸癌、基底細胞癌 (BCC)、胰管腺癌(PDA)，及相關(guān)轉(zhuǎn)移。術(shù)語“細胞增殖性病癥”和“增殖性病癥”指與一定程度的異常細胞增殖有關(guān)的病 癥。在一個實施方案中，所述細胞增殖性病癥指癌癥?！澳[瘤”在用于本文時指所有腫瘤性細胞生長和增殖，無論是惡性的還是良性的， 及所有癌前(pre-cancerous)和癌性細胞和組織?！罢T導(dǎo)細胞死亡”的抗體、寡肽或其它有機分子指引起可存活細胞變得不能存活的 分子。所述細胞指對Hedgehog信號傳導(dǎo)有響應(yīng)的細胞，諸如表達Hhipl和/或Ptch的細 胞，優(yōu)選與同一組織類型的正常細胞相比過表達Ptch多肽的細胞。優(yōu)選的是，所述細胞是 癌細胞，例如基底細胞、胰、乳腺、卵巢、胃、子宮內(nèi)膜、唾液腺、肺、腎、結(jié)腸、甲狀腺、或膀胱 的癌細胞。體外細胞死亡可在不存在補體或免疫效應(yīng)細胞時測定，以區(qū)分由抗體依賴性細 胞介導(dǎo)的細胞毒性(ADCC)或補體依賴性細胞毒性(CDC)誘導(dǎo)的細胞死亡。因此，用于細胞 死亡的測定法可使用熱滅活血清(即不含補體)在不存在免疫效應(yīng)細胞時進行。為了確定 抗體、寡肽或其它有機分子是否能夠誘導(dǎo)細胞死亡，可相對于未處理細胞來評估膜完整性 的喪失，它是通過碘化丙啶(propidium iodide) (PI)、錐蟲藍(參見Moore et al. (1995) Cytotechnology 17 :1_11)或7AAD的攝取來評估的。優(yōu)選的誘導(dǎo)細胞死亡的抗體、寡肽或 其它有機分子是在PI攝取測定法中在BT474細胞中誘導(dǎo)PI攝取的分子?！氨磉_Hhipl012的細胞”指或在細胞表面上或以分泌形式表達內(nèi)源或轉(zhuǎn)染的 Hhipl012多肽的細胞?！癏edgehog響應(yīng)性癌”指包含在細胞表面上存在Hhipl多肽和/或 Ptch多肽的細胞的癌?！癏edgehog響應(yīng)性癌”在其細胞表面上生成足夠水平的Hh受體多 肽，使得抗Hhipl012抗體(例如結(jié)合Hhipl和Ptch的L2環(huán)并抑制Hh結(jié)合的抗體)、寡肽 或其它有機分子可與其結(jié)合并對癌產(chǎn)生治療效果。在用于本文時，術(shù)語“免疫粘附素”指將異源蛋白質(zhì)(“粘附素”)的結(jié)合特異性 與免疫球蛋白恒定區(qū)的效應(yīng)器功能聯(lián)合起來的抗體樣分子。在結(jié)構(gòu)上，免疫粘附素包括不 同于抗體的抗原識別和結(jié)合位點(即是“異源”的)、具有期望結(jié)合特異性的氨基酸序列和 免疫球蛋白恒定區(qū)序列的融合物。免疫粘附素分子的粘附素部分通常是至少包含受體或 配體的結(jié)合位點的連續(xù)(contiguous)氨基酸序列。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定區(qū)序 列可從任何免疫球蛋白獲得，諸如IgG-1、IgG-2、IgG-3或IgG_4亞型、IgA(包括IgA-I和IgA-2)、IgE、IgD 或IgM。詞“標(biāo)記物”在用于本文時指與抗體、寡肽或其它有機分子直接或間接偶聯(lián)從而產(chǎn) 生“經(jīng)標(biāo)記”抗體、寡肽或其它有機分子的可檢測化合物或組合物。標(biāo)記物可以是自身就可 檢測的(例如放射性同位素標(biāo)記物或熒光標(biāo)記物)，或者在酶標(biāo)記物的情況中，可催化可檢 測的底物化合物或組合物的化學(xué)改變。術(shù)語“細胞毒劑”在用于本文時指抑制或防止細胞的功能和/或引起細胞破壞的 物質(zhì)。該術(shù)語意圖包括放射性同位素，例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32 和Lu的放射性同位素；化療劑；酶及其片段，諸如溶核酶；抗生素；和毒素，諸如小分子毒 素或者細菌、真菌、植物或動物起源的酶活毒素，包括其片段和/或變體；及下文披露的各 種抗腫瘤藥或抗癌藥。下文記載了其它細胞毒劑。殺腫瘤藥引起腫瘤細胞的破壞。“化療劑”指可用于治療癌癥的化學(xué)化合物?；焺┑睦影ㄍ榛?劑類(alkylating agents)，諸如塞替派(thiot印a)和CYTOXAN 環(huán)磷酰胺 (cyclophosphamide)；磺酸烷基酯類(alkyl sulfonates)，諸如白消安(busulfan)、 英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶類(aziridines)，諸 如苯佐替派(benzod印a)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturecbpa)和烏瑞替 派(ured印a)；乙撐亞胺類(ethylenimines)和甲基蜜胺類(methylamelamines)， 包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撐蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撐磷酰胺 (triethylenephosphoramide)、三乙撐硫代憐酉先胺(triethylenethiophosphoramide) 和三羥甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝內(nèi)酯類(acetogenins)(尤其 是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone)) ； δ -9-四氫大麻
(tetrahydrocannabinol)(屈大麻 ) (dronabinol)，MARINOL ) ； β _ 拉中白酉昆 (Iapachone)；拉中白醇(Iapachol)；秋水仙素類(colchicines)；白樣月旨酸(betulinic acid)；喜樹堿(camptothecin)(包括合成類似物托泊替康(topotecan) (HYCAMTIN )、 CPT-Il (伊立替康(irinotecan)，CAMPTOSAR )、乙酰喜樹堿、東莨菪亭(scopoletin) 和9-氨基喜樹堿)；苔蘚抑素(bryostatin) ；callystatin ;CC_1065 (包括其阿多來 新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)和比折來新(bizelesin)合成類似物)；鬼 白毒素(podophyllotoxin)；鬼白酸(podophyllinic acid)；替尼泊昔(teniposide)； 隱藻素類(cryptophycins)(特別是隱藻素1和隱藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)； duocarmycin(包括合成類似物，KW-2189 和 CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)； pancratistatin ；sarcodictyin ； 'M W (spongistatin) ； M ^f ^ (nitrogen mustards)，諸如苯丁 酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、膽磷酰胺 (cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)、雙氯乙 基甲胺(mechlorethamine)、鹽酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、 美法侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥膽甾醇(phenesterine)、潑尼莫 司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿啼唆氮芥(uracil mustard)；亞 硝脲類(nitrosoureas),諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、 福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(Iomustine)、尼莫司汀(nimustine)禾口雷莫司 汀(ranimustine)；抗生素類，諸如烯二炔類抗生素(enediyne)(例如加利車霉素 (calicheamicin)，尤其是加利車霉素YlI和加利車霉素ω Il (參見例如Agnew(1994)
33Chem. Intl. Ed. Engl. 33 183-186)；蒽環(huán)類抗生素(dynemicin)，包括 dynemicin A ；埃 斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)發(fā)色團和相關(guān)色蛋白 烯二炔類抗生素發(fā)色團)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放線菌素(actinomycin), M 茴霉素(anthramycin)、偶氮絲氨酸(azaserine)、博來霉素(bleomycin)、放線菌素 C(cactinomycin) > carabicin、洋紅霄素(carminomycin) ^^ ^ΜΜ (carzinophilin) > 色霉素(chromomycin) > 放線菌素 D (dactinomycin)、柔紅霉素(daunorubicin)、 地托比星(detorubicin)、6- 二氮-5-氧-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN 多柔比星 (doxorubicin)(包括嗎啉代多柔比星、氰基嗎啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脫氧 多柔比星)、表柔比星(印irubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、 麻西羅霉素(marcellomycin)、絲裂霉素類(mitomycins)諸如絲裂霉素C、霉酚酸 (mycophenolic ac id)、諾拉霉素(nogalamycin)、橄欖霉素(olivomycin)、培洛霉素 (peplomycin)、potfiromycin、口票呤霉素(puromycin)、三鐵阿霉素(quelamycin)、羅多 比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(str印tonigrin)、鏈佐星(str印tozocin)、殺結(jié)核菌素 (tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、凈司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)； 抗代謝物類，諸如甲氨蝶呤(methotrexate)和5_氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物， 諸如二甲葉酸(denopterin)、甲氛蝶吟(methotrexate)、蝶羅吟(pteropterin)、三 甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉濱(f ludarabine)、6_巰基嘌呤 (mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤(thioguanine)；嘧啶類似物， 諸如安西他濱(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6_氮尿苷(azauridine)、卡 莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙脫氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿 苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素類，諸 如卡魯睪酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇 (印itiostanol)、美雄烷(m印itiostane)、睪內(nèi)酯(testolactone)；抗腎上腺類，諸如氨魯 米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，諸 如亞葉酸(folinic acid)；醋葡醛內(nèi)酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酉先丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿啼唆(eniluracil)；安口丫 唆(amsacrine) ；bestrabucil ；比生群(bisantrene)；依達曲沙(edatraxate)；地磷酉先 月安(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地口丫酉昆(diaziquone) ；elfornithine ； Hc 利醋銨(elliptinium acetate)；埃坡霉素(印othilone)；依托格魯(etoglucid)；硝 酸鎵；羥脲(hydroxyurea)；香菇多糖(Ientinan)；氯尼達明(Ionidamine)；美登木素 生物喊類(maytansinoids),諸如美登素(maytansine)禾口安絲菌素(ansamitocin)； 米it月瓜月宗(mitoguazone)；米托惠酉昆(mitoxantrone)；莫喊達酉享(mopidamol) ； 二月安 硝吖啶(nitracrine)；噴司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星 (pirarubicin)；洛索惠酉昆(Iosoxantrone) ；2-乙基酉先月井(ethylhydrazide)；丙卡巴 胼(procarbazine) ；PSK 多糖復(fù)合物(JHS Natural Products, Eugene, OR)；雷佐生 (razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西佐口南(sizofiran)；螺方寵錯(spirogermanium)；細 交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone) ；2,2 ‘，2〃 -三氯三乙 胺；單端孢菌素類(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、桿孢 菌素(roridin)A 和蛇行菌素(anguidin))；烏拉坦(urethan)；長春地辛(vindesine)(ELDISINE FILDESIN )；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)； 二漠甘露酉享(mitobronitol) ；二漠衛(wèi)矛酉享(mitolactol)；喊泊漠燒(pipobroman)； gacytosine ；阿糖胞苷(arabinoside) ( “Ara-C")；塞替派(thiotepa)；類紫杉醇類 (taxoids)，例如 TAXOL ( 中白利他塞(paclitaxel) (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N. J.)、ABRAXANE 不含克列莫佛(Cremophor)、清蛋白改造納米顆粒劑型帕 利他塞(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois)禾口 TAXOTERE ,⑧ 多西他塞(doxetaxel) ( Rhone -Poulenc Rorer, Antony, France)；苯丁 酸氮芥 (chlorambucil)；吉西他濱(gemcitabine) (GEMZAR ) ；6-硫鳥嘌呤(thioguanine)；巰 基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；鉬類似物，諸如順鉬(cisplatin) 和卡鉬(carboplatin)；長春堿(vinblastine) (VELBAN )；鉬(platinum)；依托泊苷 (etoposide) (VP-16)；異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；長春新堿 (vincristine) (ONCOVIN )；奧沙利鉬(oxaliplatin)；亞葉酸(Ieucovorin)；長春瑞濱 (vinorelbine) (NAVELBINE )；能滅瘤(novantrone)；依達曲沙(edatrexate)；道諾霉 素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；伊本膦酸鹽(ibandronate)；拓撲異構(gòu)酶抑制 劑RFS 2000 ；二氟甲基鳥氨酸(DMFO)；類視黃酸類(retinoids)，諸如視黃酸(retinoic acid)；卡培他濱(capecitabine) (XEL0DA )；任何上述物質(zhì)的藥劑學(xué)可接受的鹽、酸或衍 生物；以及兩種或多種上述物質(zhì)的組合，諸如CHOP(環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和潑尼 松龍聯(lián)合療法的縮寫)和FOLFOX (奧沙利鉬(EL0XATIN )聯(lián)合5-FU和亞葉酸的治療方案 的縮寫)。 該定義還包括起調(diào)節(jié)、降低、阻斷或抑制可促進癌生長的激素效果作用的抗激 素劑，且常常是系統(tǒng)或全身治療的形式。它們自身可以是激素。例子包括抗雌激素類和 選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑類(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX 他莫昔芬)、EVISTA 雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4_羥基他莫昔 芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone) 和FAREST0N 托瑞米芬(toremifene)；抗孕酮類；雌激素受體下調(diào)劑類(ERD)；起抑制 或關(guān)閉卵巢作用的藥劑，例如促黃體生成激素釋放激素(LHRH)激動劑，諸如LUPRON 靡 ELIGARD 醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)、醋酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、 醋酸布舍瑞林(buserelin acetate)和曲普瑞林(triptorelin)；抗雄激素類，諸如氟他 米特(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide)；其它抗雄激素 類，諸如氟他米特(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide)；及 抑制在腎上腺中調(diào)節(jié)雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制劑，諸如例如4(5)-咪唑、氨魯米 特(aminoglutethimide)、MEGASE 醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、AR0MASIN 依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、RIVIS0R 伏氯唑 (vorozole)、FEMARA 來曲唑(Ietrozole)和 ARIMIDEX 阿那曲唑(anastrozole)。另 外，化療劑的這種定義包括二膦酸鹽類(bisphosphonates)，諸如氯膦酸鹽(clodronate) (例如 BONEFOS 或 OSTAC )、DIDROCAL 依替膦酸鹽(etidronate)、NE-58095、 ZOMETA 唑來膦酸 / 唑來膦酸鹽(zoledronic acid/zoledronate)、FOSAMAX 阿倫 膦酸鹽(alendronate)、AREDIA 帕米膦酸鹽(pamidronate)、SKELID 替魯膦酸鹽 (tiludronate)或 ACTONEL 利塞膦酸鹽(risedronate)；以及曲沙他濱(troxacitabine)(1，3-二氧戊環(huán)核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，特別是那些抑制涉及粘著細胞增殖的 信號傳導(dǎo)途經(jīng)中的基因表達的反義寡核苷酸，諸如例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生長因 子受體(EGF-R)；疫苗，諸如THERAT0PE 疫苗和基因療法疫苗，例如ALL0VECTIN 疫苗、 LEUVECTIN 疫苗和 VAXID 疫苗；LURTOTECAN 拓撲異構(gòu)酶 1 抑制劑；ABARELIX rmRH ； lapatinib ditosylate (ErbB-2和EGFR雙重酪氨酸激酶小分子抑制劑，也稱為GW572016)； 及任何上述物質(zhì)的藥劑學(xué)可接受的鹽、酸或衍生物。“生長抑制劑”在用于本文時指在體外或在體內(nèi)抑制細胞，尤其是表達Hip或Ptch 的癌細胞(即Hedgehog響應(yīng)性癌細胞)生長的化合物或組合物。因此，生長抑制劑可以是顯 著降低S期的Hip表達細胞百分比的藥劑。生長抑制劑的例子包括阻斷細胞周期行進(處于 S期以外的位置)的藥劑，諸如誘導(dǎo)Gl停滯和M期停滯的藥劑。經(jīng)典的M期阻斷劑包括長春 藥類(vincas)(長春新堿(vincristine)和長春堿(vinblastine))、紫杉烷類(taxanes)、 和拓撲異構(gòu)酶Π抑制劑諸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(印irubicin)、柔紅霉素 (daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博來霉素(bleomycin)。那些阻滯Gl的藥劑也 溢出進入S期停滯，例如DNA烷化劑類諸如他莫昔芬(tamoxifen)、潑尼松(prednisone)、 達卡巴嗪(dacarbazine)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、順鉬(cisplatin)、甲氨蝶呤 (methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5_f luorouracil)和 ara_C。更多信息可參見 THE MOLECULAR BASIS OF CANCER, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation,oncogenes,and antineoplastic drugs"by Murakami et al. (WB Saunders Philadelphia，1995)，尤其是第13頁。紫杉烷類(帕利他塞(paclitaxel)和多西他賽 (docetaxel))都是衍生自紫杉樹的抗癌藥。衍生自歐洲紫杉的多西他賽(TAXOTERE Rhone-Poulenc Rorer)是帕利他塞(TAXOL· ，Bristol-Myers Squibb)的半合成類似物。 帕利他塞和多西他賽促進由微管蛋白二聚體裝配成微管并通過防止解聚使微管穩(wěn)定，導(dǎo)致 對細胞有絲分裂的抑制?！岸嗳岜刃?Doxorubicin)”是蒽環(huán)類抗生素。多柔比星的完整化學(xué)名是(8S-順 式)-10-[ (3-氨基-2,3,6-三脫氧-α -L-來蘇-吡喃己糖基)氧基]_7，8，9，10-四氫_6， 8，11-三羥基-8-(羥基乙?；?-1-甲氧基-5，12-萘二酮。(8S-cis)-10-[ (3-amino-2, 3， 6-trideoxy-α -L-lyxo-hexapyranosyl)oxy]-7,8,9,10-tetrahydro-6,8,11-trihydroxy -8- (hydroxyacetyl)-l-methoxy-5,12-naphthacenedione術(shù)語“細胞因子”指由一種細胞群釋放的、作為細胞間介質(zhì)作用于另一細胞的蛋白 質(zhì)的通稱。此類細胞因子的例子有淋巴因子、單核因子和傳統(tǒng)的多肽激素。細胞因子中包 括生長激素，諸如人生長激素、N-甲硫氨酰人生長激素和牛生長激素；甲狀旁腺素；甲狀腺 素；胰島素；胰島素原；松馳素；松馳素原；糖蛋白激素類，諸如促卵泡激素(FSH)、促甲狀 腺激素(TSH)和促黃體激素(LH)；肝生長因子；成纖維細胞生長因子；促乳素；胎盤催乳激 素；腫瘤壞死因子-α和-β ；穆勒氏(Mullerian)抑制性物質(zhì)；小鼠促性腺激素相關(guān)肽； 抑制素；激活素；血管內(nèi)皮生長因子；整聯(lián)蛋白；血小板生成素(TPO)；神經(jīng)生長因子，諸如 NGF-β ；血小板衍生生長因子；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)，諸如TGF-α和TGF-β ；胰島素樣生長 因子-I和-II ；促紅細胞生成素(EPO)；骨誘導(dǎo)因子；干擾素，諸如干擾素-α、-β和-Y ； 集落刺激因子(CSF)，諸如巨噬細胞CSF(M-CSF)、粒細胞-巨噬細胞CSF(GM-CSF)和粒細 胞 CSF(G-CSF)；白介素(IL)，諸如 IL-1、IL-la, IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12 ；腫瘤壞死因子，諸如TNF-α或TNF-β ；及其它多肽因子，包括LIF和 kit配體(KL)。在用于本文時，術(shù)語細胞因子包括來自天然來源或來自重組細胞培養(yǎng)物的 蛋白質(zhì)及天然序列細胞因子的生物學(xué)活性等效物。術(shù)語“包裝插頁”用于指通常包括在治療用產(chǎn)品的商品包裝中的說明書，它們包含 有關(guān)涉及此類治療用產(chǎn)品應(yīng)用的適應(yīng)征、用法、劑量、施用、禁忌癥和/或警告的信息。表 1Hhipl012 XXXXXXXXXXXXXXX (長度=I5 個氨基酸)比較蛋白質(zhì) XXXXXYYYYYYY(長度=12個氨基酸)%氨基酸序列同一性=(ALIGN-2測定為兩種多肽序列之間相同匹配的氨基酸殘基數(shù))+ (Hhipl012多肽 的氨基酸殘基總數(shù))=5 + 15 = 33.3%表2Hhipl012 XXXXXXXXXX(長度=10 個氨基酸)比較蛋白質(zhì) XXXXXYYYYYYZZYZ (長度=15個氨基酸)%氨基酸序列同一性=(ALIGN-2測定為兩種多肽序列之間相同匹配的氨基酸殘基數(shù))+ (Hhipl012多肽 的氨基酸殘基總數(shù))=5 + 10 = 50%表3Hhipl012-DNA NNNNNNNNNNNNNN(長度=14 個核苷酸)比較 DNANNNNNNLLLLLLLLLL (長度=16 個核苷酸)%核酸序列同一性=(ALIGN-2測定為兩種核酸序列之間相同匹配的核苷酸數(shù))+ (Hip-DNA核酸序列 的核苷酸總數(shù))=6 + 14 = 42.9%表 4Hhipl012-DNA NNNNNNNNNNNN (長度=12 個核苷酸)比較DNANNNNLLLVV(長度=9個核苷酸)%核酸序列同一性=(ALIGN-2測定為兩種核酸序列之間相同匹配的核苷酸數(shù))+ (Hip-DNA核酸序列 的核苷酸總數(shù))=4+12 = 33.3%II.本發(fā)明的組合物和方法A. HhipIp 多肽在本發(fā)明的一些實施方案中，Hhipl012多肽是分離的多肽，其具有選自SEQ ID NO 83，SEQ ID NO :6，SEQ ID NO :7，SEQ ID NO :8，SEQ ID NO :9，SEQ ID NO :12，SEQ ID NO 13，SEQ ID NO 14, SEQ ID NO: 15 JPSEQ ID NO 16的氨基酸序列。在其它實施方案中，本 發(fā)明提供Hhipl012衍生多肽，諸如具有氨基酸序列SEQ ID NO :3,SEQ ID NO :4,SEQ ID NO:5，SEQ ID NO :6，SEQ ID NO -J, SEQ ID NO :8，SEQ ID NO 9 和 SEQ ID NO 10 的各結(jié)構(gòu)域?？梢詫⒕幋a這些多肽的核酸序列克隆入適宜的表達載體并轉(zhuǎn)染入適宜的宿主細 胞。可以使用本領(lǐng)域知道的和本文中描述的各種方法來分離所表達的多肽。B.抗 HhiDlj^ 抗體在一個實施方案中，本發(fā)明提供了可在本文中用作治療劑和/或診斷劑的抗 Hhipl012抗體。在一些實施方案中，通過用Hhipl012S肽免疫動物來生成抗Hhipl012抗體， 而且此類抗體特異性結(jié)合天然Hhipl上不能經(jīng)由用天然Hhipl蛋白(含有推定Frizzled 結(jié)構(gòu)域)免疫接種來引發(fā)的表位。在一個具體的例子中，抗體包括針對Hhipl L2環(huán)的抗體 及其抗獨特型抗體。例示性的抗體包括多克隆的、單克隆的、人源化的、雙特異性的、抗獨特 型的和異源偶聯(lián)的抗體。1.多克隆抗體多克隆抗體優(yōu)選通過在動物中多次皮下(sc)或腹膜內(nèi)(ip)注射相關(guān)抗原和佐劑 來生成。將相關(guān)抗原(尤其在使用合成肽時)與在待免疫的物種中有免疫原性的蛋白質(zhì)偶 聯(lián)可能是有用的。例如，可使用雙功能或衍生化試劑，例如馬來酰亞胺苯甲酰磺基琥珀酰亞 胺酯(經(jīng)半胱氨酸殘基的偶聯(lián))、N-羥基琥珀酰亞胺(經(jīng)賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐、 SOCl2、或R1N = C = NR，其中R和R1是不同的烴基，將抗原與匙孔 威血藍蛋白(KLH)、血清 清蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑偶聯(lián)。通過將例如100 μ g或5 μ g蛋白質(zhì)或偶聯(lián)物(分別用于兔或小鼠)與3倍體積的 弗氏完全佐劑混和，并將溶液皮內(nèi)注射于多個部位，由此將動物針對抗原、免疫原性偶聯(lián)物 或衍生物進行免疫。一個月后，通過多個部位的皮下注射，用弗氏完全佐劑中肽或偶聯(lián)物初 始量的1/5-1/10對動物進行強化免疫。7-14天后，采集動物的血液，并測定血清的抗體滴 度。對動物進行強化直到滴度達到穩(wěn)定的高水平。偶聯(lián)物還可在重組細胞培養(yǎng)物中作為蛋 白質(zhì)融合物來制備。同樣，適當(dāng)使用凝聚劑諸如明礬來增強免疫應(yīng)答。2.單克隆抗體單克隆抗體可以通過最初由Kohler and Milstein (1975) Nature，256 :495描述的 雜交瘤方法來制備，或者可通過重組DNA方法來制備(美國專利No. 4，816，567)。在雜交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它合適的宿主動物，諸如倉鼠，以引發(fā)生 成或能夠生成如下抗體的淋巴細胞，所述抗體將特異性結(jié)合用于免疫的蛋白質(zhì)?；蛘撸梢?在體外免疫淋巴細胞。免疫后，分離淋巴細胞，然后使用合適的融合劑諸如聚乙二醇將淋巴 細胞與骨髓瘤細胞系融合，形成雜交瘤細胞(Goding，MONOCLONAL ANTIBODIES PRINCIPLES AND PRACTICE, pp.59-103 (Academic Press，1986))。將如此制備的雜交瘤細胞在合適的培養(yǎng)基中接種和培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基優(yōu)選含有抑 制未融合的親本骨髓瘤細胞(也稱作融合配偶)生長或存活的一種或多種物質(zhì)。例如，如果 親本骨髓瘤細胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，則用于雜交瘤的選 擇性培養(yǎng)基通常將含有次黃嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培養(yǎng)基)，這些物質(zhì)阻止缺乏HGPRT 的細胞生長。優(yōu)選的融合配偶骨髓瘤細胞是那些高效融合、支持選擇的抗體生成細胞穩(wěn)定的 高水平生成抗體、并對針對未融合親本細胞進行選擇的選擇性培養(yǎng)基敏感的骨髓瘤細胞。 優(yōu)選的骨髓瘤細胞系是鼠源骨髓瘤系，諸如可從Salk Institute Cell Distribution
38Center (San Diege，California，USA)購得的M0PC-21和MPC-11小鼠腫瘤的細胞系，以及可 從 American Type Culture Collection (ATCC,Manassas, Virginia, USA)購得的 SP—2 及哲 生物，例如X63-Ag8-653細胞。用于生成人單克隆抗體的人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細 胞系也已有描述(Kozbor (1984) J. Immunol. 133 3001) ；and Brodeur et al.，MONOCLONAL ANTIBODY PRODUCTION TECHNIQUES AND APPLICATIONS, pp.51-63(Marcel Dekker, Inc., New York,1987))。可對雜交瘤細胞正在其中生長的培養(yǎng)基測定針對抗原的單克隆抗體的生成。優(yōu)選 的是，通過免疫沉淀或通過體外結(jié)合測定法，諸如放射性免疫測定法(RIA)或酶聯(lián)免疫吸 附測定法(ELISA)，測定由雜交瘤細胞生成的單克隆抗體的結(jié)合特異性。單克隆抗體的結(jié)合親和力可通過例如Munson et al.，(1980) Anal. Biochem. 107 220中記載的Scatchard分析來測定。一旦鑒定得到生成具有所需特異性、親和力和/或活性的抗體的雜交瘤細胞，所 述克隆可通過有限稀釋流程進行亞克隆，并使用標(biāo)準(zhǔn)方法進行培養(yǎng)(Goding，Monoclonal Antibodies PRINCIPLES AND PRACTICE, pp. 59-103 (Academic Press，1986))。適于這一目 的的培養(yǎng)基包括例如D-MEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。另外，雜交瘤細胞可在動物中作為腹水 瘤進行體內(nèi)培養(yǎng)，例如通過將細胞i.P.注射到小鼠中。可通過常規(guī)抗體純化流程，諸如例如親和層析(例如使用蛋白A或蛋白 G-Sepharose)或離子交換層析、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析等，將亞克隆分泌的單克隆 抗體與培養(yǎng)基、腹水或血清適當(dāng)分開。編碼單克隆抗體的DNA易于通過常規(guī)流程分離并測序(例如使用能夠特異性結(jié)合 編碼鼠源抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)。以雜交瘤細胞作為此類DNA的優(yōu)選來 源。一旦分離，可將DNA置于表達載體中，然后將該表達載體轉(zhuǎn)染到不另外產(chǎn)生抗體蛋白質(zhì) 的宿主細胞中，諸如大腸桿菌細胞、猿猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞， 以在重組宿主細胞中獲得單克隆抗體的合成。關(guān)于編碼抗體的DNA在細菌中的重組表達的 綜述性論文包括 Skerra et al.，(1993) Curr. Opinion in Immunol. 5 :256_262 (1993)及 Pluckthun(1992)Immunol. Revs. 130 151—188。在另一個實施方案中，可從使用McCafferty et al. (1990)Nature348 552-554 所述技術(shù)構(gòu)建的噬菌體抗體文庫中分離單克隆抗體或抗體片段。Clackson et al. (1991) Nature 352 :624_628 及 Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222 :581_597 分別描述了使用噬 菌體文庫分離鼠源和人源抗體。后續(xù)出版物描述了通過鏈改組(Marks et al. (1992)Bio/ Technology 10 :779_783)，以及組合感染和體內(nèi)重組作為構(gòu)建非常大的噬菌體文庫的策略 (ffaterhouse et al. (1993) Nuc. Acids. Res. 21 :2265_2266)，生成高親和力(nM 范圍)的人 源抗體。由此，這些技術(shù)是用于分離單克隆抗體的傳統(tǒng)單克隆抗體雜交瘤技術(shù)的可行替換 方法?？梢孕揎椌幋a抗體的DNA以生成嵌合或融合抗體多肽，例如通過用人重鏈和輕 鏈恒定區(qū)(Ch和Cl)序列替代同源鼠源序列(美國專利No. 4，816，567;及Morrison，et al. (1984) Proc. Natl Acad. Sci. USA 81 :6851)，或通過融合免疫球蛋白編碼序列和非免疫 球蛋白多肽(異源多肽)的整個或部分編碼序列。非免疫球蛋白多肽序列可替代抗體的恒 定區(qū)，或者用它們替代抗體的一個抗原結(jié)合位點的可變區(qū)，產(chǎn)生嵌合二價抗體，它包含對一種抗原具有特異性的一個抗原結(jié)合位點以及對不同抗原具有特異性的另一個抗原結(jié)合位
點ο3.人抗體和人源化抗體本發(fā)明的抗Hhipl抗體還可包括人源化抗體或人抗體。非人(例如鼠源)抗體的 人源化形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白 鏈或其片段(諸如Fv、Fab、Fab'、F(ab' )2或抗體的其它抗原結(jié)合子序列)。人源化抗 體包括人免疫球蛋白(受體抗體)中的互補決定區(qū)(CDR)殘基用具有期望特異性、親和力 和能力的非人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠或兔的CDR殘基替換的免疫球蛋白。在有 些情況中，將人免疫球蛋白的Fv框架殘基用相應(yīng)的非人殘基替換。人源化抗體還可包含 在受體抗體或輸入的CDR或框架序列中沒有發(fā)現(xiàn)的殘基。通常，人源化抗體包含至少一個、 通常兩個基本上整個如下可變區(qū)，其中整個或基本上整個CDR區(qū)對應(yīng)于非人免疫球蛋白的 CDR區(qū)，且整個或基本上整個FR區(qū)是人免疫球蛋白共有序列的FR區(qū)。人源化抗體最好還包 含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)(Jones et al. (1986) Nature 321 :522_525 ；Riechmann et al. (1988)Nature 332 :323_329 ；and Presta(1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593_596)。用于將非人抗體人源化的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的。通常，人源化抗體具有 一個或多個從非人來源引入的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基常常稱作“輸入”殘基， 它們通常取自“輸入”可變區(qū)。人源化可基本上依照Winter及其同事的方法進行(Jones et al. (1986)Nature 321 522-525 ；Riechmann et al. (1988)Nature 332:323-329; Verhoeyen et al. (1988) Science239 1534-1536)，通過用嚙齒類CDR序列替代相應(yīng)的人抗 體序列。因此，此類“人源化”抗體是嵌合抗體(美國專利No. 4，816，567)，其中基本上少于 整個人可變區(qū)用來自非人物種的相應(yīng)序列替代。在實踐中，人源化抗體通常是其中一些⑶R 殘基和可能的一些FR殘基用來自嚙齒類抗體中類似位點的殘基替代的人抗體。當(dāng)抗體意圖在于人類治療性用途時，用于制備人源化抗體的人可變區(qū)的選擇，包 括輕鏈和重鏈，對于降低抗原性和HAMA應(yīng)答(人抗小鼠抗體)非常重要。根據(jù)所謂的“最 適(best-fit) ”方法，用嚙齒類抗體可變區(qū)序列對已知的人可變區(qū)序列的整個文庫進行篩 選。鑒定與嚙齒類最接近的人V結(jié)構(gòu)域序列，并接受其中的人框架區(qū)(FR)用于人源化抗體 (Sims et al. (1993) J. Immunol. 151 2296 ；Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196 :901)。 另一種方法使用由輕鏈或重鏈特定亞型的所有人抗體的共有序列衍生的特定框架區(qū)。同一 框架可用于數(shù)種不同的人源化抗體(Carter et al.，(1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 4285 ；Presta et al. (1993)J. Immunol. 151 2623)。更為重要的是，抗體在人源化后保持對抗原的高結(jié)合親和力以及其它有利的生物 學(xué)特性。為了實現(xiàn)這一目的，依照一種優(yōu)選的方法，通過使用親本和人源化序列的三維模型 分析親本序列和各種概念性人源化產(chǎn)物的方法來制備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型通 常是可獲得的，且為本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所熟悉。還可獲得圖解和顯示所選候選免疫球蛋 白序列的可能三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)的計算機程序。檢查這些顯示圖像能夠分析殘基在候選免疫球 蛋白序列行使功能中的可能作用，即分析影響候選免疫球蛋白結(jié)合其抗原的能力的殘基。 這樣，可從受體和輸入序列中選出FR殘基并進行組合，從而獲得所需抗體特征，諸如對靶 抗原的親和力提高。通常，高變區(qū)殘基直接且最實質(zhì)的涉及對抗原結(jié)合的影響。
設(shè)想了人源化抗體的各種形式。例如，人源化抗體可以是抗體片段，諸如Fab，任選 偶聯(lián)有一種或多種細胞毒劑以生成免疫偶聯(lián)物。或者，人源化抗體可以是完整的抗體，諸如 完整的IgGl抗體。作為人源化的替代方法，可生成人抗體。例如，現(xiàn)在有可能生成在缺乏內(nèi)源免疫球 蛋白生成的情況下能夠在免疫后生成人抗體完整全集的轉(zhuǎn)基因動物(例如小鼠)。例如， 已經(jīng)描述了嵌合和種系突變小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(Jh)基因的純合刪除導(dǎo)致內(nèi)源抗體生 成的完全抑制。將人種系免疫球蛋白基因集(array)轉(zhuǎn)移到此類種系突變小鼠中將導(dǎo)致 在抗原攻擊后生成人抗體。參見例如Jakobovits et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :2551 Jakobovits et al. (1993)Nature 362 :255-258 ；Bruggemann et al. (1993)Year in Immuno. 7 :33 ；美國專利 No. 5，545，806，5，569，825，5，591，669 (皆屬于 GenPharm)； 5, 545, 807 ；及 WO 97/17852?；蛘?，噬菌體展示技術(shù)(McCaffertyet al. (1990)Nature 348 :552-553)可用于 在體外從來自未免疫供體的免疫球蛋白可變(V)區(qū)基因全集生成人抗體和抗體片段。根據(jù) 這種技術(shù)，將抗體V區(qū)基因克隆到絲狀噬菌體諸如M13或fd的主要或次要外殼蛋白基因 的讀碼框中，并在噬菌體顆粒表面上展示為功能性抗體片段。因為絲狀顆粒包含噬菌體基 因組的單鏈DNA拷貝，以抗體的功能特性為基礎(chǔ)進行的選擇也導(dǎo)致編碼展示那些特性的抗 體的基因的選擇。由此，噬菌體模擬B細胞的一些特性。噬菌體展示可以多種形式進行， 綜述參見例如 Johnson, K. S. , et al. (1993) Current Opinion in Structural Biology3 564-571。V基因區(qū)段的數(shù)種來源可用于噬菌體展示。Clackson et al. (1991)Nature 352 624-6 從衍生自免疫小鼠脾的小型V基因隨機組合文庫分離得到大量不同的抗D惡唑酮 抗體?？苫旧弦勒?Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222 :581-597, or Griffith et al. (1993) EMBO J. 12 :725-734所述技術(shù)，由未免疫人供體構(gòu)建V基因全集，并分離針對大 量不同抗原(包括自身抗原)的抗體。還可參見美國專利No. 5，565，332和5，573，905。如上所述，還可通過體外激活B細胞(參見美國專利No. 5，567，610和5，229，275) 來生成人抗體。4.抗體片段在某些情況中，使用抗體片段而非完整抗體是有利的。片段的體積較小，容許快速 清除，并且可導(dǎo)致對實體瘤的進入提高。已經(jīng)開發(fā)了用于生成抗體片段的多種技術(shù)。傳統(tǒng)上，通過蛋白水解消化完整抗 體來衍生這些片段(參見例如 Morimoto et al. (1992) J. Biochem. Biophys. Methods 24: 107-117 ；及Brennan et al. (1985) Science 229 81) 然而，現(xiàn)在可直接由重組宿主細胞 生成這些片段。Fab、Fv和scFv抗體片段都可在大腸桿菌中表達和由大腸桿菌分泌，由此 容許容易地生成大量的這些片段。可從上文討論的抗體噬菌體文庫分離抗體片段。或者， 可直接從大腸桿菌回收Fab' -SH片段，并通過化學(xué)方法偶聯(lián)形成F(ab' )2片段(Carter et al. , (1992) Bio/Technology 10:163-167)。依照另一種方法，可直接從重組宿主細胞 培養(yǎng)物分離F(ab' )2片段。包含補救受體結(jié)合表位殘基、具有延長的體內(nèi)半衰期的Fab 和F(ab' )2片段描述于美國專利No. 5，869，046。用于生成抗體片段的其它技術(shù)對熟練 從業(yè)人員是顯而易見的。在其它實施方案中，選擇的抗體是單鏈Fv片段(scFv)。參見WO 93/16185 ；美國專利No. 5，571，894 ；和美國專利No. 5，587，458。Fv和scFv是具有完整結(jié)合位點且缺乏恒定區(qū)的唯一種類；因此，它們適合于在體內(nèi)使用過程中降低非特異性結(jié)合。 可構(gòu)建scFv融合蛋白以生成效應(yīng)物蛋白質(zhì)位于scFv氨基末端或羧基末端的融合(參見 ANTIBODY ENGINEERING, ed. Borrebaeck, supra)?？贵w片段還可以是“線性抗體”，例如美 國專利No. 5，641，870中描述的抗體。此類線性抗體片段可以是單特異性的或雙特異性的。5.雙特異性抗體雙特異性抗體指對至少兩種不同表位具有結(jié)合特異性的抗體。例示性的雙特異性 抗體可結(jié)合本文所述Hhipl012多肽的兩種不同表位。其它此類抗體可將Hhipl012結(jié)合位 點與針對另一種蛋白質(zhì)的結(jié)合位點聯(lián)合起來。或者，可以將靶物特異性臂(例如L2特異性 臂)與結(jié)合白細胞上觸發(fā)分子諸如T細胞受體分子(例如CD3)或IgG的Fc受體(Fe y R) 諸如Fc y RI (CD64) > FcyRII (CD32)和Fc γ RIII (CD16)的臂聯(lián)合起來，從而將細胞防御機 制聚焦和定位于表達Hip或Ptch的細胞。雙特異性抗體還可用于將細胞毒劑定位于表達 Hhip和/或Ptch的細胞。這些抗體擁有Hip或Ptch結(jié)合臂及結(jié)合細胞毒劑(例如肥皂草 毒蛋白(saporin)、抗干擾素-α、長春花生物堿(vinca alkaloid)、蓖麻毒蛋白A鏈、甲氨 蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂?？蓪㈦p特異性抗體制備成全長抗體或抗體片段(例如 F(ab' )2雙特異性抗體)。WO 96/16673描述了雙特異性抗ErbB2/抗Fc γ RIII抗體，美國專利 N0.5，837，2；M公開了雙特異性抗ErbB2/抗FCγRI抗體。雙特異性抗ErbB2/Fc α抗體顯 示于WO 98/02463。美國專利No. 5，821，337教導(dǎo)了雙特異性抗ErbB2/抗CD3抗體。如此， 用于制備雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。全長雙特異性抗體的傳統(tǒng)生成基于兩種免 疫球蛋白重鏈-輕鏈對的共表達，其中兩種鏈具有不同的特異性(Millstein et al. (1983) Nature 305:537-539)。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機分配，這些雜交瘤(四源雜交瘤 (quadroma))生成10種不同抗體分子的潛在混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結(jié) 構(gòu)。通常通過親和層析步驟進行的正確分子的純化相當(dāng)麻煩，且產(chǎn)物產(chǎn)量低。W093/08^9 及 Traunecker et al. (1991)EMBO J. 10 :3655-3659 中公開了類似的流程。根據(jù)一種不同的方法，將具有所需結(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合位點)的抗體可 變區(qū)與免疫球蛋白恒定區(qū)序列融合。優(yōu)選的是，融合使用包含至少部分鉸鏈、Ch2和Ch3區(qū) 的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)。優(yōu)選的是，在至少一種融合物中具有包含輕鏈結(jié)合所必需的位 點的第一重鏈恒定區(qū)(ChI)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物以及，如果需要，免疫球蛋白輕 鏈的DNA插入分開的表達載體，并共轉(zhuǎn)染到合適的宿主細胞中。在用于構(gòu)建的三種多肽鏈 比例不等時提供期望雙特異性抗體的最佳產(chǎn)量的實施方案中，這為調(diào)整三種多肽片段的相 互比例提供了更大的靈活性。然而，在至少兩種多肽鏈以相同比率表達導(dǎo)致高產(chǎn)量時或在 該比率對期望鏈組合的產(chǎn)量沒有顯著影響時，有可能將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列 插入同一個載體。在本方法的一個優(yōu)選實施方案中，雙特異性抗體由一個臂上具有第一結(jié)合特異性 的雜合免疫球蛋白重鏈，和另一個臂上的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結(jié)合特 異性)構(gòu)成。由于免疫球蛋白輕鏈僅在半個雙特異性分子中的存在提供了分離的便利途 徑，因此發(fā)現(xiàn)這種不對稱結(jié)構(gòu)便于將所需雙特異性復(fù)合物(compound)與不想要的免疫球 蛋白鏈組合分開。該方法公開于WO 94/04690。關(guān)于生成雙特異性抗體的其它細節(jié)參見例 如 Suresh et al. (1986)Meth. Enzymol. 121 :210。
根據(jù)美國專利No. 5，731，168中描述的另一種方法，可改造一對抗體分子之間的 界面，將從重組細胞培養(yǎng)物中回收的異二聚體的百分比最大化。優(yōu)選的界面包含至少部分 CH3結(jié)構(gòu)域。在該方法中，將第一抗體分子界面的一個或多個小氨基酸側(cè)鏈用較大側(cè)鏈(例 如酪氨酸或色氨酸)替換。通過用較小氨基酸側(cè)鏈(例如丙氨酸或蘇氨酸)替換大氨基酸 側(cè)鏈，在第二抗體分子的界面上產(chǎn)生針對大側(cè)鏈的相同或相似大小的補償性“空腔”。這提 供了較之其它不想要的終產(chǎn)物諸如同二聚體提高異二聚體產(chǎn)量的機制。雙特異性抗體包括交聯(lián)或“異源偶聯(lián)”抗體。例如，異源偶聯(lián)物中的一種抗體可與 親合素偶聯(lián)，另一種抗體與生物素偶聯(lián)。例如，此類抗體建議用于將免疫系統(tǒng)細胞靶向不想 要的細胞(美國專利No. 4，676，980)，及用于治療HIV感染(W0 91/00360,WO 92/200373和 EP 03089)?？墒褂萌魏伪憷慕宦?lián)方法制備異源偶聯(lián)抗體。合適的交聯(lián)劑是本領(lǐng)域眾所 周知的，并且連同許多交聯(lián)技術(shù)一起公開于美國專利No. 4，676，980。文獻中還描述了由抗體片段生成雙特異性抗體的技術(shù)。例如，可使用化學(xué)連接來 制備雙特異性抗體。Brennan et al. (1985) Science 229 :81描述了通過蛋白水解切割完 整抗體以生成F(ab' )2片段的方法。將這些片段在存在二硫醇絡(luò)合劑亞砷酸鈉的情況下 還原，以穩(wěn)定鄰近的二硫醇并防止分子間二硫鍵的形成。然后將產(chǎn)生的Fab’片段轉(zhuǎn)變?yōu)榱?代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后將Fab' -TNB衍生物之一通過巰基乙胺的還原重新恢 復(fù)成Fab'-硫醇，并與等摩爾量的另一種Fab' -TNB衍生物混合，以形成雙特異性抗體。 產(chǎn)生的雙特異性抗體可用作酶的選擇性固定化試劑。最近的進展使得從大腸桿菌中直接回收Fab' -SH片段變得更加容易，這些片段 可化學(xué)偶聯(lián)以形成雙特異性抗體。Shalaby et al. (1992) J. Exp. Med. 175 :217-225描述了 生成完全人源化的雙特異性抗體F(ab' )2分子。每個Fab'片段由大腸桿菌分開分泌，并 在體外進行定向化學(xué)偶聯(lián)以形成雙特異性抗體。如此形成的雙特異性抗體能夠結(jié)合過表達 ErbB2受體的細胞和正常人T細胞，以及觸發(fā)人細胞毒性淋巴細胞針對人乳腺腫瘤靶的溶 解活性。還描述了從重組細胞培養(yǎng)物直接制備和分離雙特異性抗體片段的多種技術(shù)。例 如，已使用亮氨酸拉鏈生成雙特異性抗體(Kostelny et al. (1992) J. Immunol. 148(5) 1547-1553)。將來自Fos和Jim蛋白的亮氨酸拉鏈肽通過基因融合與兩種不同抗體的Fab ‘ 部分連接?？贵w同二聚體在鉸鏈區(qū)還原而形成單體，然后重新氧化而形成抗體異二聚體。 這種方法也可用于生成抗體同二聚體。由Hollinger et al. (1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :6444-6448描述的“雙抗體(diabody) ”技術(shù)提供了制備雙特異性抗體片段的替代 機制。該片段包含通過接頭相連的Vh和\，所述接頭太短使得同一條鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域之 間不能配對。因此，迫使一個片段上的Vh和\結(jié)構(gòu)域與另一個片段上的互補\和Vh結(jié)構(gòu) 域配對，由此形成兩個抗原結(jié)合位點。還報道了通過使用單鏈Fv(SCFV) 二聚體制備雙特異 性抗體片段的另一種策略。參見 Gruber et al. (1994) J. Immunol. 152 53680設(shè)想了具有超過兩個效價的抗體。例如，可制備三特異性抗體。Tutt et al. (1991) J. Immunol. 147 :60。6.異源偶聯(lián)抗體異源偶聯(lián)抗體也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。異源偶聯(lián)抗體由兩種共價連接的抗體構(gòu) 成。此類抗體建議例如用于將免疫系統(tǒng)細胞靶向不想要的細胞(美國專利No. 4，676，980)及用于治療HIV感染(W0 91/00360 ；WO 92/200373 ；EP03089) 設(shè)想了可在體外使用合成 蛋白質(zhì)化學(xué)的已知方法制備抗體，包括那些涉及交聯(lián)劑的方法。例如，可使用二硫化物交換 反應(yīng)或通過形成硫醚鍵來構(gòu)建免疫毒素。適于此目的的試劑的例子包括亞氨基硫醇酯/鹽 (iminothiolate)禾口 4-基丁亞氛酸甲酉旨(methyl-4-mercaptobutyrimidate)及例如美國 專利No. 4，676，980中所公開的。7.多價抗體多價抗體可以比二價抗體更快地受到表達該抗體所結(jié)合抗原的細胞的內(nèi)化(和/ 或異化)。本發(fā)明的抗體可以是可容易地通過編碼抗體多肽鏈的核酸的重組表達而生成、具 有三個或更多抗原結(jié)合位點的多價抗體(不同于IgM類)(例如四價抗體)。多價抗體可 包含二聚化結(jié)構(gòu)域和三個或更多抗原結(jié)合位點。優(yōu)選的二聚化結(jié)構(gòu)域包含(或由其組成) Fc區(qū)或交聯(lián)區(qū)。在這種情況中，抗體將包含F(xiàn)c區(qū)及Fc區(qū)氨基末端的三個或更多抗原結(jié)合 位點。本文中優(yōu)選的多價抗體包含(或由其組成)三個至約八個，但優(yōu)選四個抗原結(jié)合位 點。多價抗體包含至少一條多肽鏈(且優(yōu)選兩條多肽鏈)，其中所述多肽鏈包含兩個或多個 可變區(qū)。例如，多肽鏈可包含VDl-(Xl)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VDl是第一可變區(qū)，VD2是第二 可變區(qū)，F(xiàn)c是Fc區(qū)的一條多肽鏈，Xl和X2代表氨基酸或多肽，而η是0或1。例如，多肽 鏈可包含VH-CH1-柔性接頭-VH-CHl-Fc區(qū)鏈；或VH-CHI-VH-CHI-Fc區(qū)鏈。本文中的多價 抗體優(yōu)選還包含至少兩條(且優(yōu)選四條)輕鏈可變區(qū)多肽。本文中的多價抗體可包含例如 約兩條至約八條輕鏈可變區(qū)多肽。本文設(shè)想的輕鏈可變區(qū)多肽包含輕鏈可變區(qū)，且任選還 包含CL結(jié)構(gòu)域。8.效應(yīng)器功能的工程改造可能希望在效應(yīng)器功能方面修飾本發(fā)明的抗體，例如為了增強抗體的抗體依賴性 細胞介導(dǎo)的細胞毒性(ADCC)和/或補體依賴性細胞毒性(CDC)。這可通過在抗體Fc區(qū)中 引入一個或多個氨基酸替代來實現(xiàn)。或者/另外，可在Fc區(qū)中引入半胱氨酸殘基，從而使 得在該區(qū)中形成鏈間二硫鍵。如此生成的同二聚體抗體可具有改善的內(nèi)化能力和/或提高 的補體介導(dǎo)的細胞殺傷和抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。參見Caron et al. (1992) J. Exp Med. 176 :1191-1195 and Shopes, B. J. (1992) Immunol. 148 2918-29220 具有增強的抗腫 瘤活性的同二聚體抗體還可使用如Wolff et al. (1993) Cancer Res. 53 :2560-2565中描述 的異雙功能交聯(lián)劑來制備?；蛘?，抗體可改造成具有雙重Fc區(qū)，由此可具有增強的補體溶 解禾口 ADCC 能力。參見 Stevenson et al. (1989)Anti-Cancer Drug Design 3:219—230。為了提高抗體的血清半衰期，可如例如美國專利No. 5，739，277中所述將補救受 體結(jié)合表位摻入抗體(尤其是抗體片段)。在用于本文時，術(shù)語“補救(salvage)受體結(jié)合 表位”指IgG分子(例如IgG1, IgG2, IgG3或IgG4) Fc區(qū)中負責(zé)提高IgG分子體內(nèi)血清半衰 期的表位。9.免疫偶聯(lián)物本發(fā)明還關(guān)于包含偶聯(lián)有細胞毒劑的抗體的免疫偶聯(lián)物，所述細胞毒劑諸如化療 劑、生長抑制劑、毒素(如細菌、真菌、植物或動物起源的酶活性毒素或其片段)或放射性同 位素(即放射偶聯(lián)物)。上文已經(jīng)描述了可用于生成此類免疫偶聯(lián)物的化療劑?？墒褂玫拿富钚远舅丶?其片段包括白喉毒素A鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa)、蓖麻毒蛋白(ricin) A鏈、相思豆毒蛋白(abrin)A鏈、蒴蓮根 毒蛋白(modeccin)A鏈、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石 竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陸(Phytolaca americana)毒蛋白(PAPI、PAPH 和 PAP-S)、 苦瓜(Momordica charantia)抑制物、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂 草(sapaonaria officinalis)抑制物、白樹毒蛋白(gelonin)、絲林霉素(mitogel 1 in)、 局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依諾霉素(enomycin)和單端孢菌素 (trichothecenes)。多種放射性核素可用于生成放射偶聯(lián)抗體。實例包括212Bi、mI、mIn、 9°Y和186Re?？贵w和細胞毒劑的偶聯(lián)物可使用多種雙功能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑來制備，諸如N-琥 珀酰亞氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、亞氨基硫烷(IT)、亞氨酸酯(諸如鹽酸 己二酰亞氨酸二甲酯)、活性酯類(諸如辛二酸二琥珀酰亞氨基酯)、醛類(諸如戊二醛)、 雙疊氮化合物(諸如雙(對-疊氮苯甲?；?己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對-重氮 苯甲?；?乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2，6-二異氰酸酯)、和雙活性氟化合物(諸如 1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的雙功能衍生物。例如，可如Vitetta et al. (1987) Science 238 1098中所述制備蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14標(biāo)記的1_異硫氰酸苯甲基_3_甲基二 亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于將放射性核苷酸與抗體偶聯(lián)的例示性螯合劑。參見WO 94/11026。本文還設(shè)想了抗體與一種或多種小分子毒素諸如加利車霉素(calicheamicin)、 美登木素生物堿類(maytansinoids)、單端孢霉素(trichothecene)和CC1065，及這些毒素 具有毒素活性的衍生物的偶聯(lián)物。i. m^mm^^.mm在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的抗Hhipl012抗體(全長或片段)與一個或多 個美登木素生物堿分子偶聯(lián)。美登木素生物堿類是通過抑制微管蛋白多聚化來發(fā)揮作用的有絲分裂抑制 劑。美登素最初從東非灌木齒葉美登木(Maytenus serrata)分離得到(美國專利 No. 3，896，111)。隨后發(fā)現(xiàn)某些微生物也生成美登木素生物堿類，諸如美登醇和C-3美登 醇酯(美國專利No. 4，151，042)。例如下列美國專利公開了合成美登醇及其衍生物和類 似物4, 137，230 ；4，248，870 ；4，256，746 ；4，260，608 ；4，265，814 ；4，294，757 ；4，307，016 ； 4，308，268 ；4，308，269 ；4，309，428 ；4，313，946 ；4，315，929 ；4，317，821 ；4，322，348 ； 4，331，598 ；4，361，650 ；4，364，866 ；4，424，219 ；4，450，254 ；4，362，663 ；及 4，371，533，明 確將其公開內(nèi)容收入本文作為參考。在改進其治療指數(shù)的嘗試中，已經(jīng)將美登素和美登木素生物堿類與特異結(jié)合腫瘤 細胞抗原的抗體偶聯(lián)。例如下列專利公開了包含美登木素生物堿類的免疫偶聯(lián)物及其治療 用途美國專利No. 5，208，020 ；5, 416，064 ；及歐洲專利EP 0 425 235 Bi,明確將其公開內(nèi) 容收入本文作為參考。Liu et al. (1996)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 :8618-8623 記載了 包含與針對人結(jié)腸直腸癌的單克隆抗體C242連接的稱為DMl的美登木素生物堿的免疫偶 聯(lián)物。發(fā)現(xiàn)該偶聯(lián)物具有針對培養(yǎng)的結(jié)腸癌細胞的高度細胞毒性，而且在體內(nèi)腫瘤生長測 定法中顯示抗腫瘤活性。Chari et al. (1992)Cancer Res. 52 127-131記載了其中美登木 素生物堿經(jīng)二硫化物接頭與結(jié)合人結(jié)腸癌細胞系上抗原的鼠抗體A7或結(jié)合HER-2/neu癌 基因的另一種鼠單克隆抗體TA. 1偶聯(lián)的免疫偶聯(lián)物。在體外在人乳腺癌細胞系SK-BR-3上測試了 ΤΑ. 1-美登木素生物堿偶聯(lián)物的細胞毒性，該細胞系每個細胞表達3x105個HER-2 表面抗原。藥物偶聯(lián)物達到了與游離美登木素生物堿藥物相似程度的細胞毒性，這可通過 增加每個抗體分子偶聯(lián)的美登木素生物堿分子數(shù)目來提高。A7-美登木素生物堿偶聯(lián)物在 小鼠中顯示低系統(tǒng)性細胞毒性?？笻hipl e 12抗體-美登木素生物堿偶聯(lián)物可通過將抗Hhipl e 12抗體與美登木素 生物堿分子化學(xué)連接且不顯著削弱抗體或美登木素生物堿分子的生物學(xué)活性來制備。每個 抗體分子偶聯(lián)平均3-4個美登木素生物堿分子在增強針對靶細胞的細胞毒性中顯示功效， 且對抗體的功能或溶解度沒有負面影響，盡管預(yù)計甚至一個分子的毒素/抗體也將較之裸 抗體的使用增強細胞毒性。美登木素生物堿類在本領(lǐng)域是眾所周知的，而且可通過已知技 術(shù)合成或從天然來源分離。例如美國專利No. 5，208，020和上文提及的其它專利及非專利 發(fā)表物中公開了合適的美登木素生物堿類。優(yōu)選的美登木素生物堿類是美登醇和美登醇分 子的芳香環(huán)或其它位置經(jīng)過修飾的美登醇類似物，諸如各種美登醇酯。本領(lǐng)域知道許多連接基團可用于制備抗體-美登木素生物堿偶聯(lián)物，包括例如 美國專利 No. 5，208，020 或歐洲專利 0 425 235 Bl ；Chari et al. (1992) Cancer Res. 52 127-131 ；及2004年10月8日提交的美國專利申請No. 10/960, 602中所公開的，明確將其 公開內(nèi)容收入本文作為參考。包含接頭成分SMCC的抗體-美登木素生物堿偶聯(lián)物可以如 2004年10月8日提交的美國專利申請No. 10/960, 602中所公開的來制備。連接基團包括 二硫化物基團、硫醚基團、酸不穩(wěn)定基團、光不穩(wěn)定基團、肽酶不穩(wěn)定基團、或酯酶不穩(wěn)定基 團，正如上文所述專利中所公開的，優(yōu)選二硫化物和硫醚基團。本文描述和例示了別的連接 基團?？墒褂枚喾N雙功能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑來制備抗體和美登木素生物堿的偶聯(lián)物，所述偶 聯(lián)劑諸如N-琥珀酰亞氨基-3- (2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亞氨基-4- (N-馬 來酰亞氨基甲基)環(huán)己烷-ι-羧酸酯、亞氨基硫烷(IT)、亞氨酸酯(諸如鹽酸己二酰亞氨酸 二甲酯)、活性酯類(諸如辛二酸二琥珀酰亞氨基酯)、醛類(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物 (諸如雙(對-疊氮苯甲酰基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對-重氮苯甲?；?_乙 二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2，6-二異氰酸酯)、和雙活性氟化合物(諸如1，5-二氟-2， 4-二硝基苯)的雙功能衍生物。特別優(yōu)選的偶聯(lián)劑包括N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶基二 硫代)丙酸酯(SPDP) (Carlsson et al. (1978) Biochem. J. 173 :723-737)和 N-琥珀酰亞氨 基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)，由此提供二硫鍵連接。根據(jù)連接的類型，可將接頭附著于美登木素生物堿分子的多個位置。例如，可使用 常規(guī)偶聯(lián)技術(shù)通過與羥基的反應(yīng)來形成酯鍵。反應(yīng)可發(fā)生在具有羥基的C-3位置、經(jīng)羥甲 基修飾的C-14位置、經(jīng)羥基修飾的C-15位置、和具有羥基的C-20位置。在一個優(yōu)選的實 施方案中，在美登醇或美登醇類似物的C-3位置形成鍵連接。ii. Auristatin 和多拉司他汀在有些實施方案中，免疫偶聯(lián)物包含與多拉司他汀類(dolastatins)或多拉司 他汀肽類似物及衍生物、auristatin類偶聯(lián)的本發(fā)明抗體(美國專利No. 5，635，483 ； 5，780，588)。多拉司他汀類和auristatin類已經(jīng)顯示出干擾微管動力學(xué)、GTP水解、及核 和細胞分裂(Woyke et al (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12) :3580-3584) 且具有抗癌(美國專利No. 5，663，149)和抗真菌活性(Pettit et al. (1998) Antimicrob.Agents Chemother. 42 :29611965)。多拉司他汀或 auristatin 藥物模塊(moiety)可經(jīng)由 肽藥物模塊的N(氨基)末端或C (羧基)末端附著于抗體(W0 02/088172)。例示性的auristatin實施方案包括N-末端連接的單甲基auristatin藥物模 土夬 DE 和 DF (即 MMAE 和 MMAF)，披露于"Senter et al. , Proceedings of the American Association for Cancer Research, Volume 45, Abstract Number 623, presented March 觀，2004，明確將其公開內(nèi)容完整收入本文作為參考。典型的是，基于肽的藥物模塊可通過在兩個或多個氨基酸和/或肽片段之間 形成肽鍵來制備。此類肽鍵可依照例如肽化學(xué)領(lǐng)域眾所周知的液相合成法來制備(參 見 E. Schroder and K. Liibke, THE PEPTIDES, volume 1, pp 76-136,1965, Academic ft~ess)。auristatin/多拉司他汀藥物模塊可依照以下文獻中的方法來制備美國專 利 No. 5，635，483 ；美國專利 No. 5，780，588 ；Pettit et al. (1989) J.Am. Chem. Soc. Ill 5463-5465 ；Pettit et al. (1998)Anti-Cancer Drug Designl3 :243-277 ；Pettit, G. R., et al. (1996) Synthesis 6:719-725 ；Pettit et al (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 15 859-863 ；及 Doronina(2003)Nat. Biotechnol. 21 (7) :778_784。iii.加利車霉素另一種感興趣的免疫偶聯(lián)物包括偶聯(lián)有一個或多個加利車霉素分子的抗 Hhipl012抗體。加利車霉素抗生素家族能夠在亞皮摩爾濃度生成雙鏈DNA斷裂。關(guān)于加利車 霉素家族偶聯(lián)物的制備參見美國專利No. 5，712，374 ；5, 714，586 ；5, 739，116 ；5, 767，285 ； 5，770，701 ；5, 770, 710 ；5, 773,001 ；5，877，296 (都屬于美國 Cyanamid 公司)。可用的加利 車霉素結(jié)構(gòu)類似物包括但不限于Y Λ α2\ α/、N-乙?；?γ J、PSAG禾口 θ \ (Hinman et al. (1993)Cancer Res. 53 :3336-3342 ；Lode et al. (1998)Cancer Res. 58 :2925-2928 ；及 上述授予美國Cyanamid公司的美國專利)?？膳c抗體綴合的另一種抗腫瘤藥物是QFA，它 是一種抗葉酸藥物。加利車霉素和QFA都具有胞內(nèi)作用位點，且不易穿過質(zhì)膜。因此，這些 試劑經(jīng)由抗體介導(dǎo)的內(nèi)化的細胞攝取大大增強了它們的細胞毒效果。iv.其它細胞毒劑可與本發(fā)明的抗Hhipl e 12抗體偶聯(lián)的其它抗腫瘤劑包括BCNU、鏈佐星 (streptozoicin)、長春新堿(vincristine)、5_ 氟尿嘧啶、美國專利 No. 5，053，394、 5，770，710中記載的統(tǒng)稱為LL-E33^8復(fù)合物的試劑家族、及埃斯波霉素類 (esperamicins)(美國專利 No. 5，877，296)?？捎玫拿富钚远舅丶捌淦伟ò缀矶舅谹鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、 外毒素A鏈(來自銅綠假單胞菌I^seudomonas aeruginosa)、蓖麻毒蛋白(ricin)A鏈、 相思豆毒蛋白(abrin)A鏈、蒴蓮根毒蛋白(modeccin) A鏈、α-帚曲霉素(sarcin)、 油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陸(Phytolaca americana)毒蛋白(PAPI、PAPII 和 PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制物、麻瘋 樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、 白樹毒蛋白(gelonin)、絲林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素 (phenomycin)、依諾霉素(enomycin)和單端孢菌素(trichothecenes)。參見例如1993年 10月28日公開的WO 93/21232。本發(fā)明還設(shè)想了抗體和具有核酸降解活性的化合物(如核糖核酸酶或DNA內(nèi)切核酸酶，諸如脫氧核糖核酸酶；DNA酶)之間形成的免疫偶聯(lián)物。為了選擇性破壞腫瘤，抗體可包含高度放射性原子。多種放射性同位素可用于生 成放射偶聯(lián)的抗 Hhipl012 抗體。實例包括 211At、mI、125I、9°Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P、212Pb 和Lu的放射性同位素。在將偶聯(lián)物用于診斷時，可包含放射性原子用于閃爍照相研究，例 如tc99m或123I，或是包含自旋標(biāo)記物用于核磁共振(NMR)成像(也稱為磁共振成像，mri)， 諸如碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。可以已知方式將放射性或其它標(biāo)記物摻入偶聯(lián)物。例如，可生物合成肽，或是通過 化學(xué)氨基酸合成法合成肽，其中使用涉及例如氟-19代替氫的合適氨基酸前體。可經(jīng)肽中 的半胱氨酸殘基來附著標(biāo)記物，諸如tc99m或123I、186Re、188Re和mIn?？梢越?jīng)賴氨酸殘基來 附著釔-90。I0D0GEN 法(Fraker et al. (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80 :49-57) 可用于摻入碘_123。M0N0CL0NAL ANTIBODIES IN IMMUNOSCINTIGRAPHY,Chatal,CRC Press, 1989詳細記載了其它方法?？墒褂枚喾N雙功能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑來制備抗體和細胞毒劑的偶聯(lián)物，所述偶聯(lián)劑諸 如N-琥珀酰亞氨基-3- (2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亞氨基-4- (N-馬來酰亞 氨基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯、亞氨基硫烷(IT)、亞氨酸酯(諸如鹽酸己二酰亞氨酸二甲 酯)、活性酯類(諸如辛二酸二琥珀酰亞氨基酯)、醛類(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸 如雙(對-疊氮苯甲?；?己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對-重氮苯甲?；?_乙二 胺)、二異硫氰酸酯(諸如甲苯2，6-二異氰酸酯)、和雙活性氟化合物(諸如1，5-二氟-2， 4-二硝基苯)的雙功能衍生物。例如，可如Vitetta et al. (1987) Science 238 :1098中 所述制備蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14標(biāo)記的1-異硫氰酸苯甲基-3-甲基二亞乙基三胺 五乙酸(MX-DTPA)是用于將放射性核苷酸與抗體偶聯(lián)的例示性螯合劑。參見W094/ll(^6。 接頭可以是便于在細胞中釋放細胞毒藥物的“可切割接頭”。例如，可使用酸不穩(wěn)定接頭、肽 酶敏感接頭、光不穩(wěn)定接頭、二甲基接頭、或含二硫化物接頭(Chari et al. (1992)Cancer Res. 52 :127-131 ；美國專利 No. 5，208，020)。本發(fā)明的化合物明確涵蓋但不限于用以下交聯(lián)試劑制備的ADC :BMPS、EMCS、GMBS、 HBVS, LC-SMCC, MBS、MPBH、SBAP, SIA、SIAB, SMCC, SMPB, SMPH、sulfo-EMCS、sulfo-GMBS、 suIfo-KMUS, su 1 fo-MBS, sulfo-SIAB、sulfo-SMCC 和 sulfo-SMPB、及 SVSB ( -乙烯基砜) 苯甲酸琥珀酰亞氨基酯，可從例如Pierce Biotechnology公司(Rockford，IL.，U. S. Α)購 買)。2003—2004 Applications Handbook and Catalog H 467—498 胃?；蛘撸赏ㄟ^例如重組技術(shù)或肽合成來制備包含抗Hhipl012抗體和細胞毒劑的融 合蛋白。DNA的長度可包含各自編碼偶聯(lián)物兩個部分的區(qū)域，或是彼此毗鄰或是由編碼接頭 肽的區(qū)域分開，該接頭肽不破壞偶聯(lián)物的期望特性。在又一個實施方案中，可將抗體與“受體”(諸如鏈霉親合素)偶聯(lián)從而用于腫瘤 預(yù)先靶向，其中對患者施用抗體-受體偶聯(lián)物，接著使用清除劑由循環(huán)中清除未結(jié)合的偶 聯(lián)物，然后施用與細胞毒劑(如放射性核苷酸)偶聯(lián)的“配體”(如親合素)。10.免疫脂質(zhì)體本文中所公開的抗Hhipl012抗體還可配制成免疫脂質(zhì)體?！爸|(zhì)體”指由各種類 型脂質(zhì)、磷脂和/或表面活性劑構(gòu)成的，可用于對哺乳動物遞送藥物的小囊泡。與生物膜 的脂質(zhì)排列相似，脂質(zhì)體的成分通常排列成雙層形式。含有抗體的脂質(zhì)體可通過本領(lǐng)域已知方法來制備,諸如 Epstein et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 :3688 ；Hwang et al. (1980)Proc. Natl Acad. Sci. USA 77 :4030 ；美國專利 No. 4，485，045 和 4，544，545 ；及 WO 97/38731，公開于1997年10月23日中所述。循環(huán)時間延長的脂質(zhì)體披露于美國專利 No. 5，013, 556?？捎冒字Ｄ憠A、膽固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂類組合物 通過反相蒸發(fā)法生成特別有用的脂質(zhì)體。將脂質(zhì)體擠過具有設(shè)定孔徑的濾器，產(chǎn)生具有期 望直徑的脂質(zhì)體?？扇鏜artin et al. (1982) J. Biol. Chem. 257 :286-288中所述，將本發(fā)明 抗體的Fab’片段經(jīng)二硫化物交換反應(yīng)與脂質(zhì)體偶聯(lián)。任選在脂質(zhì)體中包含化療劑(參見 Gabizon et al. (1989)J. National Cancer Inst. 81(19) :1484)。B. Hhipl 結(jié)合寡肽本發(fā)明的Hhipl012寡肽指結(jié)合，優(yōu)選特異性結(jié)合本文所述Hhipl多肽的寡肽。 Hhipl結(jié)合寡肽可以使用已知的寡肽合成方法學(xué)化學(xué)合成，或者可使用重組技術(shù)制備和純 化。Hhipl結(jié)合寡肽的長度通常是至少約5個氨基酸，或者長度為至少約6、7、8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、 37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、 62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、 87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100個氨基酸或更長，其中此類寡肽能夠 結(jié)合，優(yōu)選特異性結(jié)合Hhipl多肽。本文中詳細描述了某些Hhipl012寡肽。其它Hhipl012 寡肽無需過多試驗就可使用公知技術(shù)來鑒定。在這點上，注意到用于對寡肽文庫篩選能夠 特異性結(jié)合多肽靶物的寡肽的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的(參見例如美國專利No. 5，556，762， 5，750，373,4, 708，871,4, 833，092,5, 223，409,5, 403，484,5, 571，689,5, 663，143 ；PCT 公 開號 TO84/03506 和 WO 84/03564 ；Geysen et al. (1984)Proc. Natl. Acad. Sci. USA81 3998-4002 ；Geysen et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:178—182 ；Geysen et al.， in SYNTHETIC PEPTIDES AS ANTIGENS, Portland, R. and Whelan J.，Eds.，John Wiley, Chichester,130-149(1986) ；Geysen et al. (1987)J.Immunol. Meth. 102 :259-274 ； Schoofs et al. (1988)J. Immunol. 140 :611-616, Cwirla, S. E. et al. (1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 :6378 ；Lowman, H. B. et al. (1991)Biochemistry 30:10832 ；Clackson, Τ. et al. (1991) Nature 352 624 ；Marks, J. D. et al. (1991) J. Mol. Biol. 222 581 ；Kang, A. S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 :8363 ；and Smith, G. P. (1991) Current Opin.Biotechnol. 2 :668)。在這點上，噬菌體展示是一種可以篩選大型寡肽文庫來鑒定那些文庫中能夠特 異性結(jié)合多肽靶物的成員的公知技術(shù)。噬菌體展示是將變體多肽作為與外殼蛋白的融 合蛋白展示在噬菌體顆粒表面的一種技術(shù)(Scott, J. K. and Smith, G. P. (1990) Science M9 :386)。噬菌體展示的效用在于，可以對選擇性隨機化蛋白質(zhì)變體(或隨機克隆cDNA) 的大型文庫迅速且有效地分選那些以高親和力結(jié)合靶分子的序列。在噬菌體上展示肽 (Cwirla, S. Ε. et al. (1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 :6378)或蛋白質(zhì)(Lowman，H. B. et al. (1991) Biochemistry 30 :10832 ；Clackson, Τ. et al. (1991) Nature, 352 624 ；Marks, J. D. et al. (1991)，J. Mol. Biol. 222 :581 ；Kang, A. S. et al. (1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 :8363)文庫已經(jīng)用于對數(shù)百萬多肽或寡肽篩選具有特異結(jié)合特性的那些多肽或寡
49肽(Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol. 2 :668)。分選隨機突變體的噬菌體文庫 需要構(gòu)建和擴充大量變體的策略，使用靶受體進行親和純化的流程，及評估結(jié)合富集的結(jié) 果的手段。參見美國專利 No. 5，223，409，5，403，484，5，571，689 和 5，663，143。盡管大多數(shù)噬菌體展示方法已經(jīng)使用絲狀噬菌體，λ類(Iambdoid)噬菌體展示 系統(tǒng)(W0 95/34683 ；美國專利 No. 5，627，024)、！"4 噬菌體展示系統(tǒng)(Ren et al. (1998) Gene 215 439 ；Zhu et al. (1998) Cancer Res. 58(15) :3209-3214 Jiang et al. (1997) Inf. Immun. 65(11) :4770-4777 ；Ren et al. (1997)Genel95 (2) :303-311 ；Ren(1996)Protein Sci. 5 :1833 ；Efimov et al. (1995) Virus Genes 10 :173)和 T7 噬菌體展示系統(tǒng)(Smith and Scott (1993)Meth. Enzymo 1. 217 :228-257 ；及美國專利 No. 5，766，905)也是已知的。現(xiàn)在已經(jīng)對基礎(chǔ)噬菌體展示概念開發(fā)了很多其它改進和變通。這些改進增強了 展示系統(tǒng)對肽文庫篩選與選定靶分子的結(jié)合及展示功能性蛋白質(zhì)的能力，所述功能性蛋 白質(zhì)具有對這些蛋白質(zhì)篩選期望特性的潛力。已經(jīng)開發(fā)了用于噬菌體展示反應(yīng)的組合 反應(yīng)裝置(W0 98/14277)，而且噬菌體展示文庫已經(jīng)用于分析和控制生物分子相互作用 (W0 98/20169 ；WO 98/20159)和受約束(constrained)螺旋肽的特性(W0 98/20036)。WO 97/35196描述了分離親和配體的方法，其中使噬菌體展示文庫接觸第一種溶液和第二種溶 液以選擇性分離結(jié)合的配體，在第一種溶液中配體將結(jié)合靶分子，而在第二種溶液中親和 配體將不會結(jié)合靶分子。WO 97/46251描述了這樣一種方法，即用親和純化的抗體生物淘選 隨機噬菌體展示庫，然后分離結(jié)合的噬菌體，隨后使用微量板的孔進行淘選過程以分離高 親和力結(jié)合的噬菌體。已經(jīng)報道了金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus)蛋白A作為 親和標(biāo)簽的使用(Li et al. (1998)Mol. Biotech. 9 :187)off0 97/47314 描述了底物扣除文 庫用于區(qū)別酶特異性的用途，其中使用可以是噬菌體展示庫的組合文庫。WO 97/09446描述 了使用噬菌體展示選擇適用于洗滌劑的酶的方法。美國專利No. 5，498，538，5，432，018和 WO 98/15833中描述了選擇特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)的其它方法。產(chǎn)生肽文庫和篩選這些文庫的方法還公開于美國專利No. 5，723，286, 5，432，018， 5，580，717，5，427，908，5，498，530，5，770，434，5，734，018，5，698，426，5，763，192，和 5，723，323。在某些實施方案中，Hhipl012結(jié)合寡肽結(jié)合Hhipl的L2環(huán)，并因此是Hhipl012 L2 環(huán)結(jié)合寡肽。由于Hhipl的L2環(huán)基序的保守性質(zhì)，這些肽結(jié)合Hhipl和/或Ptch的L2環(huán)。 在一些實施方案中，寡肽干擾Hh結(jié)合Hhipl和/或Ptch并阻止Hh信號傳導(dǎo)。在其它實施 方案中，寡肽自身可結(jié)合Hhipl和/或Ptch并由此通過模擬Hh結(jié)合Ptch來驅(qū)動Hh信號 傳導(dǎo)。C. Hhiplp L2 環(huán)模擬寡肽在某些實施方案中，HhipI012寡肽基于 Hhipl 的 L2 環(huán)(SEQ ID NO :54)。Hhipl012 的L2環(huán)即結(jié)合Hedgehog的部分，其與Ptch結(jié)合Hedgehog的類似部分含有保守的殘基。因 此，本發(fā)明提供基于與Hedgehog相互作用的Hhipl β -螺旋槳結(jié)構(gòu)域L2環(huán)氨基酸序列的寡 肽。這些寡肽可以通過任何本領(lǐng)域已知方法在重組系統(tǒng)中表達或化學(xué)合成。寡肽可以是線 性的或制成環(huán)狀的。寡肽一般長度為至少8個氨基酸。在一些實施方案中，寡肽的長度介 于9-21個氨基酸，包括長度為9，10，11，12 13，14，15，16，17，18，19，20或21個氨基酸的實 施方案。
本發(fā)明的寡肽至少包含下述氨基酸序列 [I/L/V]XXXX[M/L]X[D/E/N]X[D/S/E]G[L/I](SEQ ID NO 39) 其中X可以是任何氨基酸，而且括號中的氨基酸代表該位置的可選氨基酸。優(yōu)選
的是，位置X處的氨基酸與Hhipl L2環(huán)該位置處的氨基酸相同或為其保守替代。一些寡肽
的例子包括IXXXX[M/L]X[D/E/N]X[D/S/E]G[L/I](SEQIDNO:56)
LXXXX[M/L]X[D/E/N]X[D/S/E]G[L/I](SEQIDNO:57)
IXXXXMX[D/E/N]X[D/S/ZE]G[L/I](SEQIDNO:58)
LXXXXLX[D/E/N]X[D/S/xE]G[L/I](SEQIDNO:59)
IXXXXMXEX[D/S/xEJGtL/xI](SEQIDNO:60)
LXXXXLXDX[D/S/xEJGtL/xI](SEQIDNO:61)
IXXXXMXEXDG[L/xI](SEQIDNO:62)
LXXXXLXDXDG[L/xI](SEQIDNO:63)
LXXXXLXDXSG[L/xI](SEQIDNO:64)
LXXXXLXDXEG[L/xI](SEQIDNO:65)
IXXXXMXEXDGL(SEQIDNO:66)
LXXXXLXDXDGL(SEQIDNO:67)
LXXXXLXDXSGL(SEQIDNO:68)
LXXXXLXDXEGL(SEQIDNO:69)
LXXXXLXDXDGI(SEQIDNO:70)
LXXXXLXDXSGI(SEQIDNO:71)
LXXXXLXDXEGI(SEQIDNO:72)
其中，X可以是任何氨基酸，但是優(yōu)選與Hhipl或Ptch L2環(huán)該位置處的氨基酸相
同或為其保守替代。一些寡肽的例子包括
ITLDDMEEMDGL LTKQRLVDADGI LTTRKLVDREGL LLTNRLVNSDGI LTTRKLVDKEGL
(SEQID NO 73)
(SEQID NO 74)
(SEQID NO 75)
(SEQID NO 76)
(SEQID NO 77)
權(quán)利要求
1.分離的核酸，其具有與編碼SEQID NO :11，12，13，14，15，16任一氨基酸序列的DNA 分子具有至少80%核酸序列同一性的核苷酸序列或其互補物。
2.分離的核酸，其具有編碼SEQID NO :11，12，13，14，15，16任一所示氨基酸序列的核 苷酸序列或其互補物。
3.—種表達載體，其包含權(quán)利要求1或2的核酸。
4.一種宿主細胞，其包含權(quán)利要求3的表達載體。
5.一種用于生產(chǎn)多肽的方法，其包括在適合于所述多肽表達的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求4 的宿主細胞并自該細胞培養(yǎng)物回收所述多肽。
6.一種分離的多肽，其與具有SEQ ID NO :11，12，13，14，15，16任一氨基酸序列的多肽 具有至少80%氨基酸序列同一性。
7.一種分離的多肽，其具有SEQ ID NO :11，12，13，14，15，16任一氨基酸序列。
8.一種嵌合多肽，其包含融合至異源多肽的權(quán)利要求6或7的多肽。
9.一種分離的寡肽，其結(jié)合具有SEQ ID NO :7，17，19-25，38，53-55，和72-82任一氨基 酸序列的多肽。
10.一種Hhipl L2環(huán)模擬寡肽，其包含具有氨基酸序列SEQ ID NO :39的肽且結(jié)合 Hedgehog 多肽。
11.一種有機小分子，其包含結(jié)合Hhipl或Ptch蛋白L2環(huán)的化合物，其中所述分子抑 制Hh多肽結(jié)合Hhipl或Ptch。
12.—種有機小分子，其包含模擬Hhipl或Ptch蛋白L2環(huán)的化合物，其中所述分子結(jié) 合Hh多肽且抑制Hh信號傳導(dǎo)。
13.一種有機小分子，其包含結(jié)合Ptch蛋白L2環(huán)且激動Hh信號傳導(dǎo)的化合物。
14.一種組合物，其包含與藥學(xué)可接受載體組合的(a)權(quán)利要求6的多肽；(b)權(quán)利要求7的多肽；(c)權(quán)利要求8的嵌合多肽；(f)權(quán)利要求9的寡肽；(g)權(quán)利要求10的寡肽；(h)權(quán)利要求11的有機分子；或(i)權(quán)利要求12的有機分子。
15.一種制品，其包含(a)容器；和(b)裝在所述容器內(nèi)的權(quán)利要求14的組合物。
16.一種抑制表達Hhipl或Ptch的細胞生長的方法，其包括使所述細胞接觸結(jié)合所述 Hhipl或Ptch的寡肽或有機分子，由此所述寡肽或有機分子對所述Hhipl或Ptch的結(jié)合引 起對所述細胞生長的抑制。
17.一種治療性處理具有癌性腫瘤的哺乳動物的方法，其中所述癌性腫瘤包含表達 Hhipl或Ptch蛋白的細胞，所述方法包括對需要此類治療的受試者施用有效量的Hhipl e 12 L2環(huán)結(jié)合抗體、Hhipl012 L2環(huán)抗獨特型抗體、Hhipl012結(jié)合寡肽、Hhipl012結(jié)合有機分子、 Hhipl012 L2環(huán)模擬寡肽、Hhipl012 L2環(huán)模擬有機分子，由此有效治療所述哺乳動物。
18.一種用于在表達Hhipl或Ptch蛋白的細胞中治療或預(yù)防細胞增殖性病癥的方法， 所述方法包括對需要此類治療的受試者施用有效量的Hhipl M2L2環(huán)結(jié)合抗體、Hhipl012 L2 環(huán)抗獨特型抗體、Hhipl012結(jié)合寡肽、Hhipl012結(jié)合有機分子、Hhipl012 L2環(huán)模擬寡肽、 Hhipl012 L2環(huán)模擬有機分子，由此有效治療或預(yù)防所述細胞增殖性病癥。
19.一種抗Hip L2環(huán)抗體。
20.一種抗獨特型Hhipl L2環(huán)抗體。
21.一種抗Ptch L2環(huán)抗體。
22.—種抗獨特型Ptch L2環(huán)抗體。
23.—種抑制細胞中Hedgehog信號傳導(dǎo)的方法，其包括對Hedgehog生成細胞或 Hedgehog響應(yīng)性組織施用長度至少8-15個氨基酸且包含SEQ ID NO 17-44任一氨基酸序 列的寡肽。
24.權(quán)利要求M的方法，其中所述寡肽包含SEQID NO :39-44任一氨基酸序列。
25.一種藥物組合物，其包含長度至少8-15個氨基酸且包含SEQ ID NO 17-44任一氨 基酸序列的寡肽和藥學(xué)可接受載體。
全文摘要
本發(fā)明致力于Hhip1的衍生物及使用它們來治療和診斷哺乳動物中的癌癥的方法。
文檔編號A61K38/17GK102112612SQ200980130215
公開日2011年6月29日 申請日期2009年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月30日
發(fā)明者亨利·R·莫恩, 伊萬·博薩納克, 溫曉輝, 羅伯特·A·拉扎勒斯, 蘇珊娜·J·斯凱爾斯, 薩拉·G·希莫維茨 申請人:健泰科生物技術(shù)公司, 庫里斯股份有限公司