專利名稱：Iqgap3表位肽及包含它的疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物科學(xué)領(lǐng)域，更具體的說是癌癥治療領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及作 為癌癥疫苗非常有效的新肽，及用于治療和預(yù)防腫瘤的藥物。
背景技術(shù)：
已經(jīng)證明了⑶8陽性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)可識別主要組織相容性復(fù)合物 (MHC) I類分子上發(fā)現(xiàn)的由腫瘤相關(guān)抗原(TAA)所衍生的表位肽，然后殺死腫瘤細(xì)胞。自第 一例TAA——黑素瘤抗原(MAGE)家族發(fā)現(xiàn)以來，人們主要借助免疫學(xué)方法已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多 其它 TAA(Boon Τ, Int J Cancer 1993May 8,54(2) :177-80 ；Boon T & van der Bruggen P，J Exp Med 1996 Mar 1,183(3) :725-9)。這些TAA中的一些當(dāng)前正在作為免疫治療靶接 受臨床開發(fā)。能夠誘導(dǎo)強且特異性的抗腫瘤免疫應(yīng)答的新TAA的鑒定保證了針對各種類型癌 癥的肽疫苗接種策略的進一步開發(fā)和臨床應(yīng)用(Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16,88(20) :1442-55 ；Butterfield LH et al.，Cancer Res 1999Jul 1,59(13) :3134-42; Vissers JL et al. ,Cancer Res 1999 Nov 1,59(21) :5554-9 ；van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1,156(9) :3308-14 ；Tanaka F et al.，Cancer Res 1997 Oct 15， 57(20) :4465-8 ；Fujie T et al.，Int J Cancer 1999 Jan 18,80(2) :169-72 ；Kikuchi M et al.，Int J Cancer 1999 May 5,81(3) :459-66 ；Oiso M et al.，Int J Cancer 1999 May 5,81(3) :387-94)。迄今為止，已經(jīng)有數(shù)項使用這些腫瘤相關(guān)抗原衍生的肽的臨床試 驗報告。不幸的是，迄今為止在這些癌癥疫苗試驗中只觀察到了較低的客觀應(yīng)答率(Belli F et al.，J Clin Oncol 20020ct 15,20(20) :4169-80 ；Coulie PG et al.，Immunol Rev 2002 Oct, 188 :33-42 ；Rosenberg SA et al.，Nat Med 2004 Sep,10(9) :909-15).對癌細(xì)胞增殖和存活而言不可缺少的TAA是免疫療法的理想靶標(biāo)，這是因為人們 熟知治療驅(qū)動的免疫選擇(therapeutically driven immune selection)會導(dǎo)致TAA的刪 除、突變或下調(diào)，進而導(dǎo)致癌細(xì)胞免疫逃逸，使用這樣的TAA可以將由此發(fā)生的癌細(xì)胞免疫 逃逸的風(fēng)險降至最低。已經(jīng)知道，IQGAP,即含IQ基序的GTP酶活化蛋白(IQ motif containing GTPase activating proteins)，可通過與Cdc42、I ac和RhoA相互作用而調(diào)節(jié)多種基于肌動蛋白 細(xì)胞骨架的活動(actin cytoskeleton-based activities)。所有IGGAP家族的蛋白都 含有保守的結(jié)構(gòu)域，包括RasGAP相關(guān)域、IQ基序、和calponin同源域。已經(jīng)知道IQGAP 是活化的Racl和Cdc42的效應(yīng)物，而且其與肌動蛋白絲直接相互作用。最近一項對1號 染色體中與IQGAPl同源的序列的研究鑒定了 IQGAP家族的一個新成員IQGAP3 (GenBankSEQ ID NO :153，編碼 SEQ ID NO :154) (Wang S et al.，J Cell Sci2007 Feb 15，120:567_77)。另外，通過使用含有23，040種基因的全基因組cDNA微 陣列進行的基因表達譜分析，還確定了 IQGAP是在這數(shù)種癌癥中上調(diào)的新分子(Jinawath N et al. , AACR 2006)。事實上，已經(jīng)證明IQGAP3在數(shù)種癌細(xì)胞中上調(diào)，包括例如膀胱癌 (W02006/085684)、腎細(xì)胞癌(W02007/0i;3575)、肺癌(W02004/031413 和 W02007/013665)、 食道癌(W02007/013671)、胰腺癌(W02004/031412)和乳腺癌，上述文獻的公開內(nèi)容通過提 述引入本文。從人正常組織中的表達分析看，IQGAP3轉(zhuǎn)錄物在睪丸、小腸和結(jié)腸中稍有檢 出。因而認(rèn)為IQGAP3是癌癥免疫療法的合適靶標(biāo)，而且從它衍生的表位肽可望成為多種癌 癥類型的治療中有效的癌癥免疫治療劑。發(fā)明概述本發(fā)明部分地基于這樣的發(fā)現(xiàn)，即IQGAP3是免疫治療的良好靶標(biāo)。由于TAA — 般被免疫系統(tǒng)識別為“自身”，因而往往沒有天然免疫原性，合適的靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)具有極大 的重要性。認(rèn)識到IQGAP3已被發(fā)現(xiàn)在膀胱、腎、肺、食道、胃、乳腺和胰腺等癌癥組織中上 調(diào)，本發(fā)明以這種細(xì)胞分裂周期相關(guān)I(CDAl)蛋白(IQGAP3) (SEQ ID NO 154，由GenBank Accession No. NM 178229 (SEQ ID NO :153)基因編碼)為靶標(biāo)進行了進一步分析。具體 而言，選擇了含有如下表位肽的IQGAP3基因產(chǎn)物，所述表位肽可引發(fā)對相應(yīng)分子特異性的 CTL0使用IQGAP3衍生的HLA-AM4和HLA_A*02結(jié)合候選肽刺激從健康供體獲得的外周血 單個核細(xì)胞(PBMC)。建立了特異性識別用相應(yīng)候選肽沖激的HLA-AM或HLA-A02陽性靶細(xì) 胞的CTL，并鑒定了能誘導(dǎo)針對在腫瘤血管細(xì)胞表面上表達的IQGAP3的強而特異性的免疫 應(yīng)答的HLA-AM或HLA-A02限制性表位肽。這些結(jié)果證明了 IQGAP3具有強免疫原性，而且 它的表位是腫瘤免疫療法的有效靶物。因而，本發(fā)明的一個目的是提供具有CTL誘導(dǎo)能力并具有選自2，4，7，21，25，29， 32，35，37，40，49，53，55，56，57，62，63，67，75，85，99，101，111，114，121，125，130，139，140， 141，142，143，145，148和150的氨基酸序列的肽。此外，本發(fā)明涵蓋經(jīng)過修飾的肽，它們具 有氨基酸序列 2，4，7，21，25，29，32，35，37，40，49，53，55，56，57，62，63，67，75，85，99，101， 111，114，121，125，130，139，140，141，142，143，145，148 和 150 中替代、插入、刪除或添加一 個、兩個或更多個氨基酸而得到的氨基酸序列，只要經(jīng)過修飾的肽保留原來的CTL誘導(dǎo)能 力。當(dāng)對受試者施用時，本發(fā)明的肽呈遞在抗原呈遞細(xì)胞或外來體的表面上，然后誘 導(dǎo)靶向相應(yīng)肽的CTL。因此，本發(fā)明的一個目的是提供呈遞任何本發(fā)明肽的抗原呈遞細(xì)胞和 外來體，以及用于誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞的方法。通過施用本發(fā)明的IQGAP3多肽或編碼所述多肽的多核苷酸以及呈遞IQGAP3多肽 的外來體和抗原呈遞細(xì)胞可誘導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答。因此，本發(fā)明的一個目的是提供含有本 發(fā)明多肽或編碼它們的多核苷酸，以及含有它們的外來體和抗原呈遞細(xì)胞作為活性組分的 藥物制劑。本發(fā)明的藥物制劑具體可用作疫苗。本發(fā)明的另一個目的是提供治療和/或預(yù)防(即防范)癌癥(腫瘤)，和/或預(yù)防 其手術(shù)后復(fù)發(fā)的方法，以及用于誘導(dǎo)CTL的方法、用于誘導(dǎo)抗腫瘤相關(guān)內(nèi)皮的免疫應(yīng)答以 及抗腫瘤免疫的方法，這些方法包括施用本發(fā)明的IQGAP3多肽、編碼IQGAP3多肽的多核苷 酸、呈遞IQGAP3多肽的外來體或抗原呈遞細(xì)胞或藥物制劑的步驟。另外，本發(fā)明的CTL也可用作針對癌癥的疫苗。本發(fā)明可以適用于任何涉及IQGAP3過表達的疾病，如癌癥，包括但不限于膀胱 癌、腎癌、肺癌、食道癌、乳腺癌、胰腺癌和胃癌。優(yōu)選的目標(biāo)癌癥包括但不限于胃、肺、乳腺、 膀胱和胰腺的癌癥。除了上文所述的，在閱讀了下面的詳細(xì)描述連同附圖和實施例后，本發(fā)明的其它 目的和特征會變得更加顯而易見。然而應(yīng)當(dāng)理解，上面的發(fā)明概述和下面的詳細(xì)描述都是 例示性的實施方案，而非限制本發(fā)明或本發(fā)明的其它備選實施方案。具體而言，雖然本文中 參照多個具體實施方案描述了本發(fā)明，但是應(yīng)理解所述描述是例示本發(fā)明而不構(gòu)成本發(fā)明 的限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員可想到各種修改和應(yīng)用，而不偏離如所附權(quán)利要求描述的本發(fā)明 精神和范圍。類似地，根據(jù)此概述和下文描述的某些實施方案很容易想到本發(fā)明的其它目 的、特征、好處和優(yōu)點，它們對于本領(lǐng)域技術(shù)人員會是顯而易見的。根據(jù)上文連同所附實施 例、數(shù)據(jù)、圖及自它們得出的所有合理推論，單獨地或與并入本文的參考文獻一起考慮，容 易想到這樣的目的、特征、好處和優(yōu)點。附圖簡述在考慮本發(fā)明的附圖簡述和后面的詳細(xì)描述及優(yōu)選實施方案后，本發(fā)明的各方面 和應(yīng)用對于熟練技術(shù)人員會變得顯而易見。[

圖1A]圖IA和B包括一系列照片，(a)至(s)，顯示對用IQGAP3衍生的肽誘導(dǎo)的 CTL進行的 IFN- y ELISP0T測定的結(jié)果。用 IQGAP3-AM-9-955 (SEQ ID NO 2)刺激的 3_6 號 孔(a)、用 IQGAP3-AM-9-1167 (SEQ ID NO 4)刺激的 5 號孔(b)、用 IQGAP3-AM-9-779 (SEQ ID NO 7)刺激的 7 號孔(C)、用 IQGAP3-AM-9-74(SEQ ID NO :21)刺激的 2 號孔(d)、 用 IQGAP3-A24-9-26 (SEQ ID NO 25)刺激的 8 號孔(e)、用 IQGAP3-A24-9-137 (SEQ ID NO 29)刺激的 4 號孔(f)、用 IQGAP3-A24-9-63 (SEQ ID NO 32)刺激的 8 號孔(g)、用 IQGAP3-A24-10-1600 (SEQ ID NO 35)刺激的 8 號孔(h)、用 IQGAP3-A24-10-1507 (SEQ ID NO 37)刺激的 2 號孔⑴、用 IQGAP3-A24-10-139(SEQ ID NO :40)刺激的 2 號孔(j)、用 IQGAP3-A24-10-1097 (SEQ ID NO :49)刺激的 5 號孔(k)、用 IQGAP3-A24-10-345 (SEQ ID NO 53)刺激的 7 號孔(1)、用 IQGAP3-A24-10-1614(SEQ ID NO :55)刺激的 1 號孔(m)、 用 IQGAP3-A24-10-191(SEQ ID NO 56)刺激的 3 號孔(η)、用 IQGAP3-A24-10-314 (SEQ ID NO 57)刺激的 5 號孔(ο)、用 IQGAP3-A24-10-1363(SEQ ID NO :62)刺激的 5 號孔(ρ)、用 IQGAP3-A24-10-1114(SEQ ID NO :63)刺激的 7 號孔(q)、和用 IQGAP3-A24-10-1207 (SEQ ID NO 67)刺激的2號孔(r)中的CTL分別顯示與對照相比強的IFN-γ生成能力。相反，對 用IQGAP3-AM-9-417(SEQ ID NO 6)刺激的CTL沒有檢測到針對經(jīng)肽沖激的靶細(xì)胞的特異 性IFN-Y生成(S)。擴增用矩形框標(biāo)示的孔中的細(xì)胞以建立CTL系。在圖中，“+"指示 針對用適宜的肽沖激過的靶細(xì)胞的IFN-Y生成，而"-"指示針對未經(jīng)任何肽沖激的靶細(xì) 胞的IFN-Y生成。在圖中，“+"表示孔中的細(xì)胞用合適的肽沖激過，而"-"表示細(xì)胞 沒有用肽沖激過。[圖1B]圖IB是圖IA的繼續(xù)。[圖2A]圖2A、B、C包括一系列線圖。(a)至(S)，呈現(xiàn)對在上文中用各種IQGAP3 月太，即 SEQ ID NO :2(a) ,SEQ ID N0:4(b)，SEQ ID NO :7 (c)，SEQ ID NO :21 (d)，SEQ ID NO: 25(e)，SEQ ID NO :29 (f)，SEQ ID NO 32(g), SEQ ID NO 35(h), SEQ ID NO :37 (i)，SEQ IDNO :40(j) ,SEQ ID NO :49 (k)，SEQ ID NO :53(1) ,SEQ ID NO :55 (m)，SEQ ID NO :56 (n)，SEQ ID NO :57(o)，SEQ ID NO :62 (p)，SEQ ID NO :63 (q)以及 SEQ ID NO :67(r)刺激而建立 CTL 系的IFN-YELISA測定。結(jié)果證明通過用每種肽刺激而建立的CTL系均顯示與對照相比強 的IFN-γ生成。相反，對用SEQ ID NO :6建立的CTL系沒有檢測到針對經(jīng)肽沖激的靶細(xì)胞 的特異性IFN-Y生成(S)。在圖中，“+"指示針對用適宜肽沖激過的靶細(xì)胞的IFN-Y 生成，而"-"指示針對未經(jīng)任何肽沖激的靶細(xì)胞的IFN-Y生成。[圖2B]圖2B是圖2A的繼續(xù)。[圖2C]圖2C是圖2B的繼續(xù)。[圖3]是描繪針對外源表達IQGAP3和HLA_AM402的靶細(xì)胞的特異性CTL 活性的線圖。使用經(jīng)HLA-AM402或全長IQGAP3基因轉(zhuǎn)染的C0S7細(xì)胞作為對照。用 IQGAP3-A24-9-779 (SEQ ID NO 7)建立的 CTL 系顯示針對用 IQGAP3 和 HLA_A*2402 二 者轉(zhuǎn)染的C0S7細(xì)胞的特異性CTL活性(黑菱形)。相反，沒有檢測到顯著的針對表達 HLA-A*2402 (三角形)或IQGAP3 (圓形)的靶細(xì)胞的特異性CTL活性。[圖4A]圖4A和B包括一系列照片，(a)至(r)，顯示對用IQGAP3衍生的肽 誘導(dǎo)的 CTL 進行的 IFN- y ELISP0T 測定的結(jié)果。用 IQGAP3-A02-9-146 (SEQ ID NO 75)刺激的 6 號孔(a)、用 IQGAP3-A02-9-553 (SEQ ID NO 85)刺激的 8 號孔(b)、用 IQGAP3-A02-9-756 (SEQ ID NO :101)刺激的 1 號孔(c)、用 IQGAP3-A02-10-961 (SEQ ID NO 111)刺激的7號孔⑷、用IQGAP3-A02-10-70 (SEQ ID NO :114)刺激的7號和6號孔(e)、用 IQGAP3-A02-10-1174(SEQ ID NO :121)刺激的 5 號孔(f)、用 IQGAP3-A02-10-548 (SEQ ID NO 125)刺激的 8 號孔(g)、用 IQGAP3-A02-10-903 (SEQ ID NO :130)刺激的 1 號孔(h)、用 IQGAP3-A02-10-953 (SEQ ID NO :139)刺激的 2 號孔(i)、用 IQGAP3-A02-10-1590 (SEQ ID NO 140)刺激的 2 號孔(j)、用 IQGAP3-A02-10-1424(SEQ ID NO :141)刺激的 2 號孔(k)、用 IQGAP3-A02-10-416(SEQ ID NO :142)刺激的 2 號孔(1)、用 IQGAP3-A02-10-67 (SEQ ID NO 143)刺激的 4 號孔(m)、用 IQGAP3-A02-10-1461 (SEQ ID NO :145)刺激的 6 號孔(η)、 用 IQGAP3-A02-10-842 (SEQ ID NO :148)刺激的 5 號孔(ο)、用 IQGAP3-A02-10-897 (SEQ ID NO 150)刺激的 3 號孑L (P)、和用 IQGAP3-A02-9-1234(SEQ ID NO :99)刺激的 5 號孔(q) 中的CTL分別顯示與對照相比強的IFN-Y生成能力。相反，對用IQGAP3-A02-10-868 (SEQ ID NO 113)刺激的CTL沒有檢測到針對經(jīng)肽沖激的靶細(xì)胞的特異性IFN-γ生成(r)。擴 增用矩形框標(biāo)示的孔中的細(xì)胞以建立CTL系。在圖中，“+"指示針對用適宜的肽沖激過 的靶細(xì)胞的IFN-γ生成，而"-"指示針對未經(jīng)任何肽沖激的靶細(xì)胞的IFN-γ生成。在圖 中，“+"表示孔中的細(xì)胞用合適的肽沖激過，而"表示細(xì)胞沒有用肽沖激過。[圖4B]圖4B是圖4A的繼續(xù)。[圖5A]圖5A和B包括一系列線圖。(a)至(q)，呈現(xiàn)對在上文中用各種 IQGAP3 肽，IQGAP3-A02-9-146(SEQ ID NO 75) (a), IQGAP3-A02-9-553(SEQ ID NO: 85) (b)，IQGAP3-A02-9-756(SEQ ID NO : 101) (c)，IQGAP3-A02-10-961 (SEQ ID NO :111) (d)，IQGAP3-A02-10-70(SEQ ID NO : 114) (e)，IQGAP3-A02-10-1174 (SEQ ID NO :121) (f), IQGAP3-A02-10-548(SEQ ID NO : 125) (g)，IQGAP3-A02-10-903(SEQ IDNO : 130) Qi)， IQGAP3-A02-10-953(SEQ ID NO : 139) (i)，IQGAP3-A02-10-1590(SEQ ID NO :140) (j)， IQGAP3-A02-10-1424(SEQ ID NO : 141) (k)，IQGAP3-A02-10—416(SEQ ID NO :142)(1),IQGAP3-A02-10-67(SEQ ID NO :143)(m)，IQGAP3-A02-10-1461 (SEQ ID NO :145) (η)， IQGAP3-A02-10-842(SEQ ID NO 148) (ο)，IQGAP3-A02-10-897(SEQ ID NO :150) (ρ)和 IQGAP3-A02-9-1234(SEQ ID NO :99) (q)刺激的 CTL 系的 IFN-γ 生成，通過 IFN-γ ELISA測 定法檢測。結(jié)果證明通過用每種肽刺激而建立的CTL系均顯示與對照相比強的IFN-Y生 成。在圖中，“+"指示針對用適宜肽沖激過的靶細(xì)胞的IFN-Y生成，而"指示針對 未經(jīng)任何肽沖激的靶細(xì)胞的IFN-Y生成。[圖5Β]圖5Β是圖5Α的繼續(xù)。[圖5C]圖5C是圖5Β的繼續(xù)。[圖6]圖6包括一系列線圖。(a)至(f)，呈現(xiàn)對在上文中用各種IQGAP3 肽，即 IQGAP3-A02-9-146(SEQ IDNO :75) (a)，IQGAP3-A02-9-553(SEQ ID NO 85) (b), IQGAP3-A02-10-1174(SEQID NO 121) (c)，IQGAP3-A02-10-903(SEQ ID NO 130) (d), IQGAP3-A02-10-67(SEQ ID NO :143) (e)禾口 IQGAP3-A02-10-1461 (SEQ ID NO :145) (f)刺激的CTL系通過有限稀釋而建立的CTL克隆的IFN-Y生成。結(jié)果證明通過 用 IQGAP3-A02-9-146(SEQ ID NO :75) (a)，IQGAP3-A02-9-553 (SEQ ID NO :85) (b)， IQGAP3-A02-10-1174(SEQ ID NO : 121) (c)，IQGAP3-A02-10-903(SEQ ID NO :130) (d)， IQGAP3-A02-10-67(SEQ ID NO :143) (e)禾口 IQGAP3-A02-10-1461 (SEQ ID NO :145) (f)刺激而建立的CTL系均顯示與對照相比強的IFN-Y生成。在圖中，“+"指示針 對用 IQGAP3-A02-9-146(SEQ ID NO :75) (a)，IQGAP3-A02-9-553(SEQ ID NO 85) (b), IQGAP3-A02-10-1174(SEQ ID NO 121) (c)，IQGAP3-A02-10-903(SEQ ID NO :130) (d)， IQGAP3-A02-10-67 (SEQ ID NO :143) (e)和 IQGAP3-A02-10-1461 (SEQ ID NO :145) (f)沖激 過的靶細(xì)胞的IFN-Y生成，而"-"指示針對未經(jīng)任何肽沖激的靶細(xì)胞的IFN-Y生成。[圖7]圖7是描繪針對外源表達IQGAP3和HLA_A*0201的靶細(xì)胞的特異性CTL 活性的線圖。使用經(jīng)HLA-A*0201或全長IQGAP3基因轉(zhuǎn)染的C0S7細(xì)胞作為對照。用 IQGAP3-A02-9-553 (SEQ ID NO 85) (a)和 IQGAP3-A02-9-1234 (SEQ ID NO 99) (b)建立的 CTL系顯示針對用IQGAP3和HLA_A*0201 二者轉(zhuǎn)染的C0S7細(xì)胞的高特異性CTL活性(黑菱 形)。另一方面，沒有檢測到顯著的針對表達HLA-A*0201(三角形)或IQGAP3(圓形)的靶 細(xì)胞的特異性CTL活性。實施方案的描述下文描述優(yōu)選的方法、裝置、和材料，但在實施或檢驗本發(fā)明的實施方案時可使用 與本文中描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料。然而，在描述本發(fā)明材料和方 法之前要理解，本發(fā)明不限于特定大小、性狀、尺度、材料、方法、方案等，因為它們可依照例 行實驗和優(yōu)化而變化。還要理解，所述描述中使用的術(shù)語只是出于描述特定樣式或?qū)嵤┓?案的目的，而非意圖限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍只會由本文所附的權(quán)利要求來限定。通過述及明確將本說明書中提到的每一篇出版物、專利或?qū)＠暾埖墓_文本完 整收入本文。然而，本文中無一處可解釋為承認(rèn)本發(fā)明沒有資格憑借發(fā)明在先而早于此類 公開文本。I.定義除非另有定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技 術(shù)人員的普遍理解相同的含義。然而，如果有沖突，以本說明書(包括定義)為準(zhǔn)。
如本文中使用的，詞語“一個/種”、“該”、和“所述”意味著“至少一個/種”，除非
另有明確說明。術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用，指氨基酸殘基的聚合物。該 術(shù)語適用于天然存在的氨基酸聚合物，也適用于這樣的氨基酸聚合物，其中一個或多個氨 基酸殘基是經(jīng)過修飾的殘基或非天然存在的殘基諸如相應(yīng)天然存在氨基酸的人工化學(xué)模 擬物。如本文中使用的，術(shù)語“氨基酸”指天然存在型和合成的氨基酸，以及與發(fā)揮天然 存在型氨基酸相似功能的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在型氨基酸指由遺傳密 碼編碼的氨基酸，以及在細(xì)胞中在翻譯后經(jīng)過修飾的氨基酸(例如羥脯氨酸、Y -羧基谷氨 酸、和0-磷酸絲氨酸)。短語“氨基酸類似物”指與天然存在型氨基酸具有相同的基礎(chǔ)化學(xué) 結(jié)構(gòu)(結(jié)合有氫、羧基、氨基、和R基團的α碳)但具有經(jīng)過修飾的R基團或經(jīng)過修飾的主 鏈的化合物(例如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸、亞砜、甲硫氨酸甲基锍)。短語“氨基酸 模擬物”指具有與一般氨基酸不同的結(jié)構(gòu)但發(fā)揮相似功能的化學(xué)化合物。氨基酸在本文中可以用它們公知的三字母符號或IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員 會推薦的單字母符號來指稱。術(shù)語“基因”、“多核苷酸”、“核苷酸”和“核酸”在本文中可互換使用，而且，除非另 有明確說明，通過它們公認(rèn)的單字母代碼來指稱。除非另有定義，術(shù)語“癌癥”指過表達IQGAP3基因的癌癥，其實例包括但不限于膀 胱癌、腎癌、肺癌、食道癌、胃癌、乳腺癌、和胰腺癌。除非另有定義，術(shù)語“細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞”、“細(xì)胞毒性T細(xì)胞”和“CTL”在本文 中可互換使用，而且除非另有明確說明，指能夠識別非自身細(xì)胞(例如腫瘤細(xì)胞、病毒感染 細(xì)胞)并誘導(dǎo)此類細(xì)胞死亡的T淋巴細(xì)胞亞群。II.肽為了證明IQGAP3衍生的肽發(fā)揮被細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)識別的抗原的功 能，對IQGAP3(SEQ ID NO 154)衍生的肽進行分析以確定它們是否為受常見的HLA等位基 因 HLA-A24 或 HLA-A02 限制的抗原表位(Date Y et al.，Tissue Antigens 47:93-101， 1996 ；Kondo A et al.，J Immunol 155 :4307-12,1995 ；Kubo RT et al.，J Immunol 152 3913-24，1994)。基于它們對HLA-A24或HLA-A02的結(jié)合親和力來鑒定IQGAP3衍生的 HLA-AM或HLA-A02結(jié)合肽的候選者。用負(fù)載有這些肽的樹突細(xì)胞(DC)體外刺激T細(xì)胞 后，使用每一種下面的肽成功建立了 CTL IQGAP3-A24-9-955(SEQ ID NO 2),IQGAP3-A24-9-1167(SEQ ID NO 4),IQGAP3-A24-9-779(SEQ ID NO 7),IQGAP3-A24-9-74(SEQ ID NO :21)，IQGAP3-A24-9-26(SEQ ID NO 25),IQGAP3-A24-9-137(SEQ ID NO :29)，IQGAP3-A24-9-63(SEQ ID NO 32),IQGAP3-A24-10-1600(SEQ ID NO 35),IQGAP3-A24-10-1507(SEQ ID NO 37),
IQGAP3-A24-10-139(SEQ ID NO :40)，
IQGAP3-A24-10-1097(SEQ ID NO :49)，
IQGAP3-A24-10-345(SEQ ID NO :53)，
IQGAP3-A24-10-1614(SEQ ID NO :55)，
IQGAP3-A24-10-191(SEQ ID NO :56)，
IQGAP3-A24-10-314(SEQ ID NO :57)，
IQGAP3-A24-10-1363(SEQ ID NO :62)，
IQGAP3-A24-10-1114(SEQ ID NO :63)，
IQGAP3-A24-10-1207(SEQ ID NO :67)，
IQGAP3-A02-9-146(SEQ ID NO :75)，
IQGAP3-A02-9-553(SEQ ID NO :85)，
IQGAP3-A02-9-1234(SEQ ID NO :99)，
IQGAP3-A02-9-756(SEQ ID NO :101)，
IQGAP3-A02-10-961(SEQ ID NO :111)，
IQGAP3-A02-10-70(SEQ ID NO :114)，
IQGAP3-A02-10-1174(SEQ ID NO :121),
IQGAP3-A02-10-548(SEQ ID NO :125)，
IQGAP3-A02-10-903(SEQ ID NO :130)，
IQGAP3-A02-10-953(SEQ ID NO :139)，
IQGAP3-A02-10-1590(SEQ ID NO :140)，
IQGAP3-A02-10-1424(SEQ ID NO :141)，
IQGAP3-A02-10-416(SEQ ID NO :142)，
IQGAP3-A02-10-67(SEQ ID NO :143)，
IQGAP3-A02-10-1461(SEQ ID NO :145)，
IQGAP3-A02-10-842(SEQ ID NO: 148)，和
IQGAP3-A02-10-897(SEQ ID NO :150).
這些建立的CTL針對經(jīng)相應(yīng)肽沖激的靶細(xì)胞顯示強的特異性CTL活性。本文中
的這些結(jié)果證明IQGAP3是被CTL識別的抗原，而且這些肽可能是IQGAP3的受HLA-AM或 HLA-A02限制的表位肽。由于IQGAP3基因在大多數(shù)癌組織，如胃、腎、食道、肺、乳腺、膀胱、和胰腺的癌癥 中過表達，它是免疫療法的良好靶標(biāo)。因此，本發(fā)明提供與IQGAP3的CTL識別表位對應(yīng)的 九肽(由九個氨基酸殘基組成的肽)和十肽(由十個氨基酸殘基組成的肽)。本發(fā)明的 九肽和十肽的特別優(yōu)選例子包括那些由選自SEQ ID NO :2，4，7，21，25，29，32，35，37，40， 49，53，55，56，57，62，63，67，75，85，99，101，111，114，121，125，130，139，140，141，142，143， 145，148和150中的氨基酸序列組成的肽。一般而言，可使用互聯(lián)網(wǎng)上現(xiàn)有可用的軟件程序，諸如Parker KC et al. , J Immunol 1994 Jan 1,152(1) 163-75中記載的軟件程序，在計算機上(in silico)計算各 種肽與HLA抗原之間的結(jié)合親和力。可以如例如Parker KC et al. ,J Immunol 1994 Jan 1,152(1) :163-75 ；及 Kuzushima K et al.，Blood 2001,98(6) :1872-81 中所述來測量與HLA 抗原的結(jié)合親和力。例如 Journal of Immunological Methods，1995，185 181-190 和 Protein kience，2000，9 1838-1846中記載了用于測定結(jié)合親和力的方法。因此，本發(fā)明 涵蓋使用此類已知程序鑒定的結(jié)合的HLA抗原的IQGAP3肽。本發(fā)明的九肽和十肽的側(cè)翼可以任選有額外的氨基酸殘基，只要該肽保留其CTL 誘導(dǎo)能力。此類具有CTL誘導(dǎo)能力的肽通常小于約40個氨基酸，常常小于約20個氨基酸， 通常小于約15個氨基酸。本發(fā)明的九肽和十肽(例如由選自2，4，7，21，25，29，32，35，37， 40，49，53，55，56，57，62，63，67，75，85，99，101，111，114，121，125，130，139，140，141，142， 143，145，148或150的氨基酸序列組成的肽)的側(cè)翼的具體氨基酸序列不受限制，可以由任 何種類的氨基酸組成，只要它不妨礙原始肽的CTL誘導(dǎo)能力。因此，本發(fā)明還提供具有CTL 誘導(dǎo)能力和選自 2，4，7，21，25，29，32，35，37，40，49，53，55，56，57，62，63，67，75，85，99， 101，111，114，121，125，130，139，140，141，142，143，145，148 或 150 中的氨基酸序列的肽。一般而言，蛋白質(zhì)中一個或更多個氨基酸的修飾不會影響蛋白質(zhì)的功能，在有 些情況下甚至?xí)鰪娫嫉鞍踪|(zhì)的期望功能。事實上，已知有經(jīng)過修飾的肽(即由與原 始參照序列相比其中修飾(即替代、添加、刪除或插入)一個、兩個或數(shù)個氨基酸殘基而 成的氨基酸序列構(gòu)成的肽)保留原始肽的生物學(xué)活性(Mark et al. , Proc Natl Acad Sci USA 1984,81:5662-6 ；Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 1982，10 :6487-500 ; Dalbadie-McFarland et al. , Proc Natl Acad Sci USA 1982，79:6409_13)。因
個實施方案中，本發(fā)明的肽可以既具有CTL誘導(dǎo)能力，又具有在選自SEQ ID NO =2,4,7,21, 25，29，32，35，37，40，49，53，55，56，57，62，63，67，75，85，99，101，111，114，121，125，130， 139，140，141，142，143，145，148和150的氨基酸序列中插入、添加、刪除和/或替代一個、兩 個或甚至更多個氨基酸而得到的氨基酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)可，對氨基酸序列進行個別的添加或替代而改變單個氨基酸或 小比例的氨基酸，往往會導(dǎo)致原始氨基酸側(cè)鏈的特性的保留。因此，它們常常稱作“保守替 代”或“保守修飾”，其中對蛋白質(zhì)的改變的結(jié)果是獲得與原始蛋白質(zhì)功能相似的修飾蛋白 質(zhì)。提供功能相似的氨基酸的保守替代表是本領(lǐng)域公知的。值得保守的氨基酸側(cè)鏈特性的 例子包括例如疏水性氨基酸(A, I，L，M，F(xiàn)，P，W，Y，V)、親水性氨基酸(R，D，N, C，E，Q，G，H， K，S, T)、和具有下面的共同官能團或特征的側(cè)鏈脂肪族側(cè)鏈(G，A，V，L，I，P)；含羥基側(cè) 鏈(S，T，Y)；含硫原子側(cè)鏈(C，M)；含羧酸和酰胺側(cè)鏈(D，N, E，Q)；含堿側(cè)鏈(R，K，H)；和 含芳香族側(cè)鏈(H，F(xiàn)，Y，W)。另外，下面的八組分別包括含本領(lǐng)域公認(rèn)的互為保守替代的氨 基酸1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，賴氨酸(K)；5)異亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，纈氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸⑴，色氨酸(W)；7)絲氨酸(S)，蘇氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)(參見例如 Creighton, Proteins 1984)。此類保守修飾肽也被視為本發(fā)明的肽。然而，本發(fā)明的肽不限于此，還可包括非保守修飾，只要經(jīng)過修飾的肽保留原始肽的CTL誘導(dǎo)能力。另外，經(jīng)過修飾的肽不應(yīng)排除 IQGAP3的多態(tài)變體、種間同源物、和等位基因中的CTL可誘導(dǎo)肽。為了保留所需的CTL誘導(dǎo)能力，可修飾(插入、添加和/或替代)少數(shù)(例如1個、 2個或數(shù)個)或小百分比的氨基酸。在本文中，術(shù)語“數(shù)個”意味著5個或更少的氨基酸，例 如4個或3個或更少。要修飾的氨基酸的百分比優(yōu)選20%或更少，更優(yōu)選15%或更少，甚 至更優(yōu)選10%或更少或者1至5%。對本發(fā)明的優(yōu)選肽IQGAP3-A24-9-955(SEQ ID NO :2)，IQGAP3-A24-9-1167 (SEQ
ID NO 4)，IQGAP3-A24-9--779(SEQ IDNO 7), IQGAP3-A24-9-74(SEQ ID NO:21)，IQGAP3-A24-9-26 (SEQ ID NO :25)，IQGAP3-A24-9-137 (SEQIDNO29)，IQGAP3-A24-9-■63 (SEQ ID NO :32)，IQGAP3-A24-10-1600 (SEQIDNO35)，IQGAP3--A24--10-1507 (SEQIDNO:37)，IQGAP3-A24-10-139 (SEQIDNO40)，IQGAP3--A24--10-1097 (SEQIDNO:49)，IQGAP3-A24-10-345 (SEQIDNO53)，IQGAP3--A24--10-1614 (SEQIDNO:55)，IQGAP3-A24-10-191 (SEQIDNO56)，IQGAP3--A24--10--314 (SEQIDNO 57)，IQGAP3-A24-10-1363 (SEQIDNO62)，IQGAP3--A24-10--1114(SEQIDNO63)，IQGAP3-A24-10-1207(SEQIDNO67)，IQGAP3-A02-9--146(SEQIDNO75)，IQGAP3-A02-9-553(SEQIDNO85)，IQGAP3-A02--9-1234 (SEQIDNO99)，IQGAP3-A02-9-756(SEQIDNO 101)，IQGAP3-A02--10-961(SEQIDNO :111)，IQGAP3-A02-10-70 (SEQIDNO 114)，IQGAP3--A02--10--1174(SEQIDNO:121)，IQGAP3-A02-10-548(SEQIDNO 125)，IQGAP3--A02--10--903 (SEQIDNO 130)，IQGAP3-A02-10-953 (SEQIDNO 139)，IQGAP3--A02-10-■1590 (SEQIDNO 140)，IQGAP3-A02-10-1424(SEQIDNO 141)，IQGAP3--A02--10-416 (SEQIDNO 142)，IQGAP3-A02-10-67(SEQIDNO 143)，IQGAP3--A02-10-1461 (SEQIDNO 145)，IQGAP3-A02-10-842 (SEQ ID NO :148)禾口
IQGAP3-A02-10-897 (SEQ ID NO :150)的同源性分析確認(rèn)了這些肽與任何其它已知人基因 產(chǎn)物衍生的肽不具有顯著的同源性。因此，這些肽在用于免疫療法時產(chǎn)生未知的或不期望 的免疫應(yīng)答的可能性顯著降低。因而，預(yù)期這些肽對于在腫瘤患者中引發(fā)針對癌細(xì)胞(例 如腎癌、食道癌、胃癌、乳腺癌、膀胱癌和胰腺癌)上的IQGAP3的免疫力是非常有用的。
當(dāng)在免疫療法的語境中使用時，本發(fā)明的肽應(yīng)呈遞在細(xì)胞或外來體的表面上， 優(yōu)選作為與HLA抗原的復(fù)合物。因此，優(yōu)選選擇這樣的肽，其不僅可誘導(dǎo)CTL，而且擁有 對HLA抗原的高結(jié)合親和力。為此目的，可通過替代、插入、刪除和/或添加氨基酸殘基 來對肽進行修飾，以產(chǎn)生具有改良的結(jié)合親和力的修飾肽。在天然被展示的肽之外，由 于通過結(jié)合HLA抗原而被展示的肽的序列的規(guī)律是已知的(J Immunol 1994,152:3913; Immunogeneticsl995,41 :178 ;J Immunol 1994，155 :4307)，可將基于該規(guī)律的修飾引入 本發(fā)明的免疫原性肽。例如，可以用苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、或色氨酸替代從N端起 第二個氨基酸，和/或用苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸、或甲硫氨酸替代C端氨基 酸，以增加HLA-AM結(jié)合。因此，本發(fā)明涵蓋這樣的肽，其具有SEQ ID NO :2，4，7，21，25， 29，32，35，37，40，49，53，55，56，57，62，6367 的氨基酸序列，其中所述 SEQ ID NO 的氨基酸 序列的N端起的第二個氨基酸被苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、或色氨酸替代，和/或其中 所述SEQ ID NO的氨基酸序列的C端氨基酸被苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸、或甲硫氨酸替代。另一方面，具備高HLA-A02結(jié)合親和力的肽的從N端起的第二個氨基酸被替 代為亮氨酸或甲硫氨酸，和C端氨基酸被替代為纈氨酸或亮氨酸的肽。因此，本發(fā)明涵蓋 這樣的肽，其具有 SEQ ID NOs :75,85,99,101，111，114，121，125，130，139，140，141，142， 143，145，148或150的氨基酸序列，其中所述SEQ ID NO的氨基酸序列的N端起的第二個 氨基酸被亮氨酸或甲硫氨酸替代，和肽，和/或其中所述SEQ ID NO的氨基酸序列的C端被 纈氨酸或亮氨酸替代。不僅可以在肽的末端氨基酸處引入替代，而且可以在可能的TCR識 別位置處引入替代。數(shù)項研究證明了肽中的氨基酸替代可等同或好于原來的，例如CAP1、 p53(264_272)、Her-2/neu(369_377)或 gplOOte09_217) (Zaremba et al. Cancer Res. 57,4570-4577, 1997, Τ. K. Hoffmann et al. J Immunol. (2002) Feb 1 ; 168 (3) : 1338-47.，S. 0. Dionne et al. Cancer Immunol immunother. (2003)52 199-206 及 S.0.Dionne et al.Cancer Immunology, Immunotherapy(2004)53,307-314)。本發(fā)明還涵蓋對描述的肽的N和/或C端添加一個至兩個氨基酸。本發(fā)明也包括 這樣的具有高HLA抗原結(jié)合親和力且保留CTL誘導(dǎo)能力的修飾肽。然而，當(dāng)肽序列與具有不同功能的內(nèi)源或外源蛋白質(zhì)的氨基酸序列一部分相同 時，可能誘發(fā)副作用，如針對特定物質(zhì)的自身免疫性病癥和/或變應(yīng)性癥狀。因此，優(yōu)選首 先使用可得數(shù)據(jù)庫實施同源性搜索以避免肽的序列與另一種蛋白質(zhì)的氨基酸序列匹配的 情況。當(dāng)根據(jù)同源性搜索了解到甚至不存在與目標(biāo)肽相比有1個或2個氨基酸差異的肽時， 可以修飾目標(biāo)肽以提高其與HLA抗原的結(jié)合親和力，和/或提高其CTL誘導(dǎo)能力，而沒有任 何此類副作用的危險。雖然預(yù)期如上所述對HLA抗原具有高結(jié)合親和力的肽是高度有效的，但是對以高 結(jié)合親和力的存在作為指標(biāo)而選擇得到的候選肽進一步檢查CTL誘導(dǎo)能力的存在。在本文 中，短語“CTL誘導(dǎo)能力”指肽被呈遞在抗原呈遞細(xì)胞上時誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL) 的能力。另外，“CTL誘導(dǎo)能力”包括肽誘導(dǎo)CTL活化、CTL增殖、促進CTL溶解靶細(xì)胞、和提 高CTL IFN-Y生成的能力。CTL誘導(dǎo)能力的確認(rèn)如下來實現(xiàn)誘導(dǎo)攜帶人MHC抗原的抗原呈遞細(xì)胞(例如 B-淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、和樹突細(xì)胞(DC))，或更具體的說是人外周血單個核白細(xì)胞衍生的 DC，用肽刺激后，與CD8陽性細(xì)胞混合，然后測量由CTL針對靶細(xì)胞生成和釋放的IFN-γ。 作為反應(yīng)系統(tǒng)，可使用已經(jīng)生成的表達人HLA抗原的轉(zhuǎn)基因動物(例如BenMohamed L， Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 2000Aug, 61(8) :764-79, Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice :dependence on HLA class II restricted T (H)response中記載的那些)。例如，可以用51Cr等放射性標(biāo)記靶 細(xì)胞，并且可以根據(jù)從靶細(xì)胞釋放的放射性計算細(xì)胞毒性活性?；蛘撸赏ㄟ^測量在攜帶固 定化肽的抗原呈遞細(xì)胞(APC)存在下由CTL生成和釋放的IFN-Y (IFN-gamma)，并使用抗 IFN- γ單克隆抗體顯現(xiàn)培養(yǎng)基上的抑制區(qū)，來評估CTL誘導(dǎo)能力。作為如上所述檢查肽的CTL誘導(dǎo)能力的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)那些對HLA抗原具有高結(jié)合親 和力的并非必然具有高CTL誘導(dǎo)能力。然而，在那些被鑒定和評估的肽中，發(fā)現(xiàn)具有SEQ ID NO :2，4，7，21，25，29，32，35，37，40，49，53，55，56，57，62，63，67，75，85，99，101，111，114， 121，125，130，139，140，141，142，143，145，148和150的氨基酸序列的九肽或十肽不但展現(xiàn)對HLA抗原的高結(jié)合親和力，還展現(xiàn)特別高的CTL誘導(dǎo)能力。因此，例示這些肽作為本發(fā)明 的優(yōu)選實施方案。在上文所述修飾之外，還可將本發(fā)明的肽連接至其它物質(zhì)，只要所得的連接肽保 留原始肽的所需的CTL誘導(dǎo)能力。合適物質(zhì)的例子包括，但不限于肽、脂質(zhì)、糖和糖鏈、乙 ?；?、天然的和合成的聚合物、等。肽可含有修飾，諸如糖基化、側(cè)鏈氧化、或磷酸化等，前提 是該修飾不破壞原始肽的生物學(xué)活性?？蓪嵤┻@些種類的修飾以賦予額外的功能(例如靶 定功能和投遞功能)或使多肽穩(wěn)定化。例如，為了提高多肽的體內(nèi)穩(wěn)定性，本領(lǐng)域已知引入D-氨基酸、氨基酸模擬物或 非天然氨基酸；此構(gòu)思也可適用于本發(fā)明多肽。可以以多種方式測定多肽的穩(wěn)定性。例如， 可使用肽酶和各種生物學(xué)介質(zhì)(諸如人血漿和血清)來測試穩(wěn)定性(參見例如Verhoefet al. , Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986,11 :291-302) 在本文中，本發(fā)明的肽也可以描述為“ IQGAP3肽”或“ IQGAP3多肽”。本發(fā)明的肽作為與HLA抗原結(jié)合的復(fù)合物被呈遞在細(xì)胞(例如抗原呈遞細(xì)胞)或 外來體的表面上，然后誘導(dǎo)CTL。因此，本發(fā)明還包括在細(xì)胞或外來體的表面上與HLA抗原 形成復(fù)合物的肽。此類外來體可例如使用日本專利申請公表平11-510507和W099/03499 中詳述的方法來制備，而且可使用從治療和/或預(yù)防的對象患者獲得的APC來制備。呈遞 本發(fā)明肽的外來體或細(xì)胞可作為疫苗用于接種。上文復(fù)合物中包含的HLA抗原的類型必須與需要治療和/或預(yù)防的受試者的HLA 抗原類型匹配。例如，HLA-AM和HLA-A02在日本人群中占優(yōu)勢，因此對于日本人患者的治 療是適宜的。使用在日本人和白種人中高度表達的AM和A02型有利于獲得有效結(jié)果，也 可使用亞型。通常，在臨床上，預(yù)先調(diào)查需要治療的患者的HLA抗原類型，這樣就能夠恰當(dāng) 選擇對特定抗原具有高水平結(jié)合親和力，或具有通過抗原呈遞的CTL誘導(dǎo)能力的肽。當(dāng)將A24型和A02型HLA抗原用于外來體或細(xì)胞時，優(yōu)選使用具有選自SEQ ID NO 2，4，7，21，25，29，32，35，37，40，49，53，55，56，57，62，63，67，75，85，99，101，111，114，121， 125，130，139，140，141，142，143，145，148 和 150 的氨基酸序列的肽。III. I0GAP3 肽的制備本發(fā)明的肽可使用公知技術(shù)來制備。例如，肽可以通過合成、使用重組DNA技術(shù)或 化學(xué)合成來制備。本發(fā)明的肽可個別地合成，或作為更長的、由兩個或更多個肽構(gòu)成的多肽 來合成。然后可以對肽進行分離，即純化，從而使其基本上不含其它天然存在的宿主細(xì)胞蛋 白質(zhì)及其片段或任何其它化學(xué)物質(zhì)。本發(fā)明的肽可基于選定的氨基酸序列通過化學(xué)合成來獲得?？蛇m用于合成的常規(guī) 肽合成法的例子包括(i)Peptide Synthesis，Interscience，New York，1966 ；(ii)The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York，1976 ;(iii)Peptide Synthesis (日文)，Maruzen Co. , 1975 ；(iv)Basics and Experiment of Peptide Synthesis (日文)，Maruzen Co.， 1985 ；(ν) Development of Pharmaceuticals (第二卷)(日文)，Vol. 14 (peptide synthesis)，Hirokawa,1991 ；
(vi)W099/67^8 ；禾口(vii)Barany G & Merrifield R. B. ,Peptides Vol. 2, “ Solid Phase Peptide Synthesis" , Academic Press, New York，1980，100—118?；蛘?，可通過適用任何已知的遺傳工程肽生產(chǎn)方法來獲得本發(fā)明的肽(例如 Morrison J, J Bacteriology 1977,132 :349-51 ；Clark-Curtiss & Curtiss，Methods in Enzymology (eds. Wu et al.) 1983，101 :347-62)。例如，首先，制備以可表達形式(例如在 與啟動子序列對應(yīng)的調(diào)節(jié)序列下游)包含編碼目標(biāo)肽的多核苷酸的合適載體，并轉(zhuǎn)化入合 適的宿主細(xì)胞。然后培養(yǎng)宿主細(xì)胞以生成感興趣的肽。也可以采用體外翻譯系統(tǒng)在體外生 產(chǎn)肽。IV.多核苷酸本發(fā)明還提供編碼任何上述本發(fā)明肽的多核苷酸。這些包括天然存在型IQGAP3 基因(GenBank登錄號NM_1782 (SEQ ID NO 153))衍生的多核苷酸以及具有它們經(jīng)過保 守修飾的核苷酸序列的多核苷酸。在本文中，短語“經(jīng)過保守修飾的核苷酸序列”指編碼相 同或本質(zhì)上相同的氨基酸序列的序列。由于遺傳密碼的簡并性，任何給定蛋白質(zhì)都有很多 種功能上相同的核酸來編碼。例如，密碼子GCA、GCC、GCG、和GCU都編碼氨基酸丙氨酸。因 此，在任何由密碼子規(guī)定為丙氨酸的位置，該密碼子可改變成任何所述的對應(yīng)密碼子，而不 改變所編碼的多肽。此類核酸變異是“沉默變異”，是保守修飾變異的一種。本文中編碼肽 的每一種核酸序列也涵蓋該核酸的每一種可能的沉默變異。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會認(rèn)識到 核酸中的每一個密碼子(AUG和TGG除外，AUG在正常情況下是甲硫氨酸的唯一密碼子，而 TGG在正常情況下是色氨酸的唯一密碼子)都可進行修飾以產(chǎn)生功能上相同的分子。因而， 每一種公開的序列隱含涵蓋了編碼肽的核酸的每一種沉默變異。本發(fā)明的多核苷酸可以由DNA、RNA、及其衍生物構(gòu)成。DNA由A、T、C、和G等堿基 合適地構(gòu)成，而T在RNA中被U替換。本發(fā)明的多核苷酸可編碼多個本發(fā)明肽，它們之間有或無居間氨基酸序列。例如， 居間氨基酸序列可提供多核苷酸或所翻譯的肽的切割位點(例如酶識別序列)。另外，在 編碼本發(fā)明肽的編碼序列以外，多核苷酸還可包括任何額外的序列。例如，多核苷酸可以是 包括表達肽所需要的調(diào)節(jié)序列的重組多核苷酸，或者可以是具有標(biāo)志基因等等的表達載體 (質(zhì)粒)。一般而言，此類重組多核苷酸可通過使用例如聚合酶和內(nèi)切核酸酶經(jīng)由常規(guī)重組 技術(shù)操作多核苷酸來制備。重組和化學(xué)合成技術(shù)都可用來生成本發(fā)明的多核苷酸。例如，可以通過插入在轉(zhuǎn) 染入感受態(tài)細(xì)胞后能表達的適宜載體來生成多核苷酸?；蛘?，可使用PCR技術(shù)或合適宿主 中的表達來擴增多核苷酸(參見例如Sambrook et al. ,Molecular Cloning :A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York，1989)。或者，可使用固相技術(shù)來合成 多核苷酸，如Beaucage SL & Iyer RP,Tetrahedron 1992,48 :2223-311 ；Matthes et al.， EMBO J 1984,3 :801-5 中記載的。V.抗原呈遞細(xì)胞(APC)本發(fā)明還提供在其表面上呈遞HLA抗原與本發(fā)明肽之間形成的復(fù)合物的抗原呈 遞細(xì)胞(APC)。通過接觸本發(fā)明的肽、或通過以可表達形式導(dǎo)入編碼本發(fā)明肽的核苷酸而獲 得的APC可衍生自接受治療和/或預(yù)防的患者，而且可作為疫苗以它們自身或與其它藥物(包括本發(fā)明的肽、外來體、或細(xì)胞毒性T細(xì)胞)組合來施用。APC不限于特定種類的細(xì)胞，包括樹突細(xì)胞(DC)、Langerhans細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B細(xì) 胞、和活化的T細(xì)胞，已知它們在它們的細(xì)胞表面上呈遞蛋白質(zhì)性質(zhì)的抗原，從而被淋巴細(xì) 胞所識別。由于DC是APC中具有最強CTL誘導(dǎo)作用的代表性APC，可以使用DC作為本發(fā)明 的 APC。例如，可通過自外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)DC，然后以體外、離體或體內(nèi)方式用本發(fā)明的 肽接觸(刺激)它們來獲得APC。當(dāng)對受試者施用本發(fā)明的肽時，受試者的體內(nèi)誘導(dǎo)出呈 遞本發(fā)明肽的APC。短語“誘導(dǎo)APC”包括用本發(fā)明的肽或編碼本發(fā)明肽的核苷酸接觸(刺 激)細(xì)胞，以在細(xì)胞的表面上呈遞HLA抗原與本發(fā)明肽之間形成的復(fù)合物?；蛘?，在將本發(fā) 明的肽提供給APC以容許APC呈遞肽后，可以把這些APC作為疫苗施用于受試者。例如，離 體施用可包括下述步驟a 自第一受試者收集APC ；b 使步驟a的APC接觸肽；并c 對第二受試者施用負(fù)載有肽的APC。第一受試者和第二受試者可以是同一個體，或者可以是不同個體?；蛘撸勒毡景l(fā) 明，提供本發(fā)明的肽在制備用于誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞的藥物組合物中的用途。另外，本發(fā)明提 供一種制備用于誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞的藥物組合物的方法或工藝。另外，本發(fā)明還提供用于 誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞的本發(fā)明肽。通過步驟(b)獲得的APC可作為疫苗施用于受試者。依照本發(fā)明的一個方面，APC具有高水平的CTL誘導(dǎo)能力。在術(shù)語“高水平的 CTL誘導(dǎo)能力”中，高水平是相對于不與肽接觸或與不能誘導(dǎo)CTL的肽接觸的APC的該水 平而言的。這樣的具有高水平CTL誘導(dǎo)能力的APC可通過下述方法來制備，該方法包括 在體外將含有編碼本發(fā)明肽的多核苷酸的基因轉(zhuǎn)移至APC的步驟。所導(dǎo)入的基因可以是 DNA或RNA的形式。用于進行導(dǎo)入的方法的例子包括但不限于此領(lǐng)域中常規(guī)實施的各種 方法，諸如可使用脂轉(zhuǎn)染、電穿孔、和磷酸鈣法。更具體的說，可以如Cancer Res 1996， 56 :5672-7 ;J Immunol 1998，161 :5607-13 ;J Exp Med 1996，184 :465-72 ；國際公開文本 No. 2000-509281的已
公開日文翻譯中所述來實施。通過將基因轉(zhuǎn)移入APC，基因在細(xì)胞中 經(jīng)歷轉(zhuǎn)錄、翻譯、等等，然后得到的蛋白質(zhì)被MHC I類或II類加工，并經(jīng)由呈遞途徑以呈遞 本發(fā)明的肽。VI.細(xì)胞毒性T細(xì)胞被誘導(dǎo)的針對任何本發(fā)明肽的細(xì)胞毒性T細(xì)胞在體內(nèi)加強靶向腫瘤相關(guān)內(nèi)皮的 免疫應(yīng)答，并因此可以以與肽本身相似的方式用作疫苗。因此，本發(fā)明還提供通過任何本發(fā) 明肽特異性誘導(dǎo)或活化的分離的細(xì)胞毒性T細(xì)胞。此類細(xì)胞毒性T細(xì)胞可通過下述步驟來獲得(1)對受試者施用或( 在體外使 本發(fā)明的肽接觸(刺激)受試者衍生的APCjP CD8陽性細(xì)胞、或外周血單個核白細(xì)胞?？梢詮闹委熀?或預(yù)防的對象患者獲得用呈遞本發(fā)明肽的APC刺激而誘導(dǎo)的細(xì)胞 毒性T細(xì)胞，而且，可以使用它們本身，或者將它們與其它藥物(包括本發(fā)明的肽或外來體) 組合來施用以獲得調(diào)節(jié)效果。得到的細(xì)胞毒性T細(xì)胞特異性針對呈遞本發(fā)明的肽或者例如 與用于誘導(dǎo)的肽相同的肽的靶細(xì)胞起作用。靶細(xì)胞可以是內(nèi)源表達IQGAP3的細(xì)胞，或者是 經(jīng)IQGAP3基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；而且因本發(fā)明肽的刺激而在細(xì)胞表面上呈遞該肽的細(xì)胞也可充當(dāng)活化CTL攻擊的靶標(biāo)。VIL T 細(xì)胞警體(TCR)本發(fā)明還提供含有編碼能夠形成T細(xì)胞受體(TCR)亞基的多肽的核酸的組合物， 及使用該組合物的方法。所述TCR亞基具有形成賦予T細(xì)胞針對呈遞IQGAP3的腫瘤細(xì)胞 的特異性TCR的能力。通過使用本領(lǐng)域已知方法，可鑒定用一種或多種本發(fā)明肽誘導(dǎo)的 CTL 的 TCR 亞基即 α 和 β 鏈的核酸(W02007/032255 及 Morgan et al.，J Immunol, 171, 3288 (2003) ) 0衍生的TCR能在體內(nèi)和在體外以高親合力結(jié)合展示IQGAP3肽的靶細(xì)胞，且 任選介導(dǎo)對呈遞IQGAP3肽的靶細(xì)胞的有效殺傷?？蓪⒕幋aTCR亞基的核酸摻入合適載體，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。這些載體是本領(lǐng) 域公知的。有用的是，可將核酸或含有它們的載體轉(zhuǎn)移入T細(xì)胞，例如來自患者的T細(xì)胞。 有利的是，本發(fā)明提供一種即用型(off-the-shelf)組合物，其容許快速修飾患者自己的T 細(xì)胞(或其他哺乳動物的T細(xì)胞)以快速且容易地生成具有卓越的癌細(xì)胞殺傷特性的經(jīng)過 修飾的T細(xì)胞。還有，本發(fā)明提供這樣的CTL，它是通過用核酸轉(zhuǎn)導(dǎo)而制備的，所述核酸編碼在 HLA-A24 或 HLA-A02 背景下結(jié)合 IQGAP3 肽(例如 SEQ ID NOs :2，4，7，21，25，29，32，35， 37，40，49，53，55，56，57，62，63，67，75，85，99，101，111，114，121，125，130，139，140，141， 142，143，145，148和150)的TCR亞基多肽。經(jīng)過轉(zhuǎn)導(dǎo)的CTL能夠在體內(nèi)歸巢至癌細(xì)胞， 而且能在體外通過公知的培養(yǎng)方法來擴增(例如Kawakami et al.，J Immunol.，142， 3452-3461 (1989))。本發(fā)明的T細(xì)胞可用于形成在需要治療或防護的患者中治療或預(yù)防癌 癥方面有用的免疫原性組合物(W02006/031221)。預(yù)防和防范包括降低源自疾病的死亡率或發(fā)病率負(fù)擔(dān)的任何活動。預(yù)防和防范可 發(fā)生于“一級、二級和三級預(yù)防水平”。一級預(yù)防和防范避免疾病的發(fā)生，而二級和三級預(yù)防 和防范水平涵蓋旨在預(yù)防和防范疾病的進展與癥狀的出現(xiàn)、以及通過恢復(fù)功能和減輕疾病 相關(guān)并發(fā)癥來降低已建立的疾病的負(fù)面影響的活動。或者，預(yù)防和防范包括旨在減輕特定 病癥的嚴(yán)重性(例如降低腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移，降低血管發(fā)生等)的廣泛的預(yù)防性療法。治療和/或預(yù)防癌癥，和/或預(yù)防其手術(shù)后復(fù)發(fā)包括任何下述步驟，諸如手術(shù)去除 癌細(xì)胞、抑制癌性細(xì)胞生長、腫瘤衰退或消退、誘導(dǎo)癌癥減退和遏制癌癥發(fā)生、腫瘤消退、及 降低或抑制轉(zhuǎn)移。癌癥的有效治療和/或預(yù)防可降低患癌個體死亡率及改善其預(yù)后，降低 其血液中腫瘤標(biāo)志物的水平，及減輕其伴隨癌癥的可檢測癥狀。例如，癥狀的減輕或改善構(gòu) 成有效治療和/或預(yù)防，包括10 %、20 %、30 %或更多降低，或病情穩(wěn)定。VIII.藥物制劑或藥物組合物由于IQGAP3表達在胃癌中與正常組織相比特異性升高(Jinawath N et al.，AACR 2006)，本發(fā)明的肽或編碼所述肽的多核苷酸可用于治療和/或預(yù)防癌癥，和/或預(yù)防它們 的手術(shù)后復(fù)發(fā)。因此，本發(fā)明提供用于治療和/或預(yù)防癌癥或腫瘤，和/或預(yù)防它們的手術(shù) 后復(fù)發(fā)的藥物制劑或藥物組合物，其包含一種或多種本發(fā)明的肽或編碼所述肽的多核苷酸 作為活性組分?；蛘?，可以在任何上述外來體或細(xì)胞(諸如APC)的表面上表達本發(fā)明的肽， 用它作為藥物制劑或藥物組合物。另外，上述靶向任何本發(fā)明的細(xì)胞毒性T細(xì)胞也可用作 本發(fā)明的藥物制劑或藥物組合物的活性組分。在另一個實施方案中，本發(fā)明還提供選自下組的活性組分在制備用于治療癌癥的藥物組合物或藥物制劑中的用途(a)本發(fā)明的肽，(b)可表達形式的編碼本文中公開的肽的核酸，(C)本發(fā)明的 APCJP(d)本發(fā)明的細(xì)胞毒性T細(xì)胞?；蛘?，本發(fā)明進一步提供用于治療癌癥的選自下組的活性組分(a)本發(fā)明的肽，(b)可表達形式的編碼本文中公開的肽的核酸，(C)本發(fā)明的 APCJP(d)本發(fā)明的細(xì)胞毒性T細(xì)胞。或者，本發(fā)明進一步提供一種制備用于治療癌癥的藥物組合物或制劑的方法或工 藝，其中該方法或工藝包括配制藥學(xué)或生理學(xué)可接受載體與作為活性成分的選自下組的活 性組分的步驟(a)本發(fā)明的肽，(b)可表達形式的編碼本文中公開的肽的核酸，(C)本發(fā)明的 APCJP(d)本發(fā)明的細(xì)胞毒性T細(xì)胞。在另一個實施方案中，本發(fā)明還提供一種制備用于治療癌癥的藥物組合物或制劑 的方法或工藝，其中該方法或工藝包括混合活性組分與藥學(xué)或生理學(xué)可接受載體的步驟， 其中所述活性組分選自下組(a)本發(fā)明的肽，(b)可表達形式的編碼本文中公開的肽的核酸，(C)本發(fā)明的 APCJP(d)本發(fā)明的細(xì)胞毒性T細(xì)胞?；蛘?，本發(fā)明的藥物組合物或制劑可用于預(yù)防癌癥和/或預(yù)防其手術(shù)后復(fù)發(fā)。本發(fā)明的藥物制劑或藥物組合物可用作疫苗。在本發(fā)明的語境中，短語“疫苗”(也 稱作“免疫原性組合物”)指具有在接種入動物后誘導(dǎo)抗腫瘤免疫力的功能的物質(zhì)。本發(fā)明的藥物制劑或藥物組合物可用于在受試者或患者(包括人和任何其它哺 乳動物，包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、貓、犬、綿羊、山羊、豬、牛、馬、猴、狒狒、和黑 猩猩，特別是商業(yè)上重要的動物或馴養(yǎng)的動物)中治療和/或預(yù)防癌癥或腫瘤，和/或預(yù)防 其手術(shù)后復(fù)發(fā)。依照本發(fā)明，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有選自SEQ ID NO :2，4，7，21，25，29，32，35，37，40，49， 53，55，56，57，62，63和67的氨基酸序列的多肽或者具有選自SEQ ID NOs :75，85，99，101， 111，114，121，125，130，139，140，141，142，143，145，148 和 150 的氨基酸序列的多肽是能 誘導(dǎo)強且特異性的免疫應(yīng)答的HLA-AM或HLA-A02限制表位肽或候選者。因此，包括任何 這些具有氨基酸序列 2，4，7，21，25，29，32，35，37，40，49，53，55，56，57，62，63 和 67 的多肽 的本發(fā)明藥物制劑特別適合于對其HLA抗原為HLA-AM的受試者施用。另一方面，本發(fā)明 的含有任何具有氨基酸序列 SEQ ID NOs :75，85，99，101，111，114，121，125，130，139，140， 141，142，143，145，148和150的多肽的藥物制劑或組合物特別適合于施用給HLA抗原為HLA-A02的受試者。這同樣適用于含有編碼任何這些多肽的多核苷酸的藥物制劑或藥物組 合物。要用本發(fā)明的藥物制劑或藥物組合物治療的癌癥或腫瘤不受限制，包括其中涉及 IQGAP3的所有種類的癌癥或腫瘤，包括例如腎癌、食道癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、膀胱癌和胰 腺癌。除了上述活性組分之外，本發(fā)明的藥物制劑或藥物組合物還可含有其它具有誘導(dǎo) 針對癌性細(xì)胞的CTL的能力的肽、編碼所述其它肽的其它多核苷酸、呈遞所述其它肽的其 它細(xì)胞、等等。在本文中，其它具有誘導(dǎo)針對癌性細(xì)胞的CTL的能力的肽以癌癥特異性抗原 (例如已鑒定的TAA)為例，但是不限于此。如果需要，本發(fā)明的藥物制劑或藥物組合物可任選包括其它治療性物質(zhì)作為活性 組分，只要該物質(zhì)不抑制活性組分(例如任何本發(fā)明的肽)的抗腫瘤效果。例如，制劑可包 括抗炎劑或組合物、鎮(zhèn)痛劑、化療劑、諸如此類。本發(fā)明的藥物除了在藥物自身中包括其它 治療性物質(zhì)之外，還可以與一種或多種其它藥理學(xué)作用劑或組合物順序或同時施用。藥物 和藥理學(xué)作用劑或組合物的量取決于例如所使用的藥理學(xué)作用劑或組合物的類型、所治療 的疾病、及施用的時序安排和路徑。應(yīng)當(dāng)理解，除了本文中具體提及的組分之外，本發(fā)明的藥物制劑或藥物組合物還 可包括與所討論的制劑類型相關(guān)的本領(lǐng)域常規(guī)的其它作用劑。在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的藥物制劑或藥物組合物可包括在制品和試 劑盒中，該制品和試劑盒含有可用于治療要治療的疾病(例如癌癥)的病理狀況的材料。制 品可包括任何本發(fā)明藥物制劑或藥物組合物的容器及標(biāo)簽。合適的容器包括瓶、管形瓶、和 試管。容器可以是用多種材料制成的，諸如玻璃或塑料。容器上的標(biāo)簽應(yīng)指明該制劑或組 合物用于治療或預(yù)防疾病的一種或多種狀況。標(biāo)簽還可指明關(guān)于施用的指導(dǎo)等等。在上文描述的容器之外，包括本發(fā)明藥物制劑或藥物組合物的試劑盒可任選進一 步包括第二容器，其中裝有藥學(xué)可接受的稀釋劑。它可進一步包括從商業(yè)和用戶立場看可 取的其它材料，包括其它緩沖液、稀釋劑、濾器、針頭、注射器、和印有使用說明書的包裝插 頁。如果期望的話，藥物組合物可存在于藥包或分配器裝置中，該藥包或分配器裝置 可裝有一個或多個含有活性組分的單位劑量形式。例如，藥包可包括金屬或塑料箔，諸如泡 罩包。藥包或分配器裝置可附有施用說明書。(1)含有肽作為活性組分的藥物制劑或藥物組合物本發(fā)明的肽可以直接作為藥物制劑或藥物組合物施用，或者如果必要，通過常規(guī) 配制方法加以配制。在后一種情況中，在本發(fā)明的肽之外，還可以視需要包括通常用于藥物 的載體、賦形劑等等，沒有特別限制。此類載體的例子有滅菌水、生理鹽水、磷酸鹽緩沖液、 培養(yǎng)液等等。另外，藥物制劑或藥物組合物可在必要時含有穩(wěn)定劑、懸浮劑、防腐劑、表面活 性劑等等。本發(fā)明的藥物制劑或藥物組合物可用于抗癌目的。本發(fā)明的肽可制備成由兩種或更多種本發(fā)明肽構(gòu)成的組合，以在體內(nèi)誘導(dǎo)CTL。肽 組合可采取雞尾酒的形式，或者可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)彼此綴合。例如，可以將各個肽化學(xué)連接起 來，或者表達成單一融合多肽序列。組合中的各個肽可以是相同的或不同的。通過施用本 發(fā)明的肽，肽被HLA抗原以高密度展示在APC上，然后誘導(dǎo)出與所展示的肽與HLA抗原之間形成的復(fù)合物特異性起反應(yīng)的CTL?；蛘?，從受試者取出APC (例如DC)，用本發(fā)明的肽刺激 而獲得在其表面上呈遞任何本發(fā)明的肽的APC，將這些APC (例如DC)再次施用給所述受試 者而在受試者體內(nèi)誘導(dǎo)出CTL，結(jié)果可提高針對癌細(xì)胞的攻擊性。包括本發(fā)明的肽作為活性組分、用于治療和/或預(yù)防癌癥的藥物制劑或藥物組合 物還可包括已知可有效建立細(xì)胞免疫的佐劑?；蛘撸幬镏苿┗蛩幬锝M合物可以與其它活 性組分一起施用，或者可以通過配制成顆粒來施用。佐劑指在與具有免疫學(xué)活性的蛋白質(zhì) 一起(或順序)施用時可增強針對該蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答的化合物。本文中涵蓋的佐劑包括 文獻中記載的(Clin Microbiol Rev 1994，7 :277-89)。合適佐劑的例子包括但不限于磷 酸鋁、氫氧化鋁、明礬、霍亂毒素、沙門氏菌毒素、等等。另外，可方便地使用脂質(zhì)體制劑；其中肽結(jié)合于數(shù)微米直徑的珠子的顆粒制劑； 和其中脂質(zhì)結(jié)合于肽的制劑。在一些實施方案中，本發(fā)明的藥物制劑或藥物組合物可進一步包括引發(fā)(prime) CTL的成分。脂質(zhì)已經(jīng)被鑒定為能夠在體內(nèi)引發(fā)針對病毒抗原的CTL的作用劑或組合物。 例如，可將棕櫚酸殘基連接至賴氨酸殘基的ε_和氨基，然后連接至本發(fā)明的肽。然后 可以將該脂化肽在膠束或顆粒中直接施用，摻入脂質(zhì)體，或在佐劑中乳化后施用。作為引發(fā) CTL應(yīng)答的脂質(zhì)的另一個例子，大腸桿菌(E. coli)脂蛋白，諸如三棕櫚?；?S-甘油基半 胱氨酰絲氨酰-絲氨酸(P3CSQ，當(dāng)共價連接至適宜肽時，可用來引發(fā)CTL (參見例如Deres et al.，Nature 1989,342 :561-4)。施用的方法可以是口服、皮內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)注射等等，及系統(tǒng)施用或局部施用至 靶位點附近。施用可以通過單次施用來實施，或者通過多次施用來強化。本發(fā)明肽的劑量 可以依據(jù)要治療的疾病、患者的年齡、重量、施用的方法等等恰當(dāng)調(diào)整，通常是0. OOlmg至 lOOOmg，例如0. OOlmg至lOOOmg，例如0. Img至10mg，而且可以每幾天施用一次至每幾個月 施用一次。本領(lǐng)域技術(shù)人員能恰當(dāng)選擇合適的劑量。(2)含有多核苷酸作為活性組分的藥物制劑或藥物組合物本發(fā)明的藥物制劑或藥物組合物也可含有可表達形式的編碼本文中公開的肽的 核酸。在本文中，短語“可表達形式的”意味著多核苷酸在導(dǎo)入細(xì)胞時會在體內(nèi)表達成可誘 導(dǎo)抗腫瘤免疫力的多肽。在一個例示性的實施方案中，感興趣的多核苷酸的核酸序列包括 多核苷酸表達所必需的調(diào)節(jié)元件?？膳鋫涠嗪塑账?，以實現(xiàn)穩(wěn)定插入靶細(xì)胞的基因組(關(guān) 于同源重組盒載體的描述參見例如Thomas KR & Capecchi MR, Cell 1987,51:503-12)。 參見例如 Wolff et al. ,Science 1990，247 :1465-8 ；美國專利 No. 5，580，859 ;5，589，466 ； 5, 804, 566 ；5, 739, 118 ；5，736，524 ；5，679，647 ；及 WO 98/04720?；?DNA 的投遞技術(shù)的例 子包括“裸DNA”、易化(布比卡因、聚合物、肽介導(dǎo)的)投遞、陽離子脂質(zhì)復(fù)合物、和顆粒介 導(dǎo)的(“基因槍”)或壓力介導(dǎo)的投遞(參見例如美國專利No. 5，922，687)。本發(fā)明的肽還可用病毒或細(xì)菌載體來表達。表達載體的例子包括減毒病毒宿主， 諸如痘苗或禽痘。這種辦法涉及使用例如痘苗病毒作為載體來表達編碼肽的核苷酸序列。 在導(dǎo)入宿主后，重組痘苗病毒表達表達免疫原性肽，由此引發(fā)免疫應(yīng)答?？捎糜诿庖呓臃N 方案的痘苗載體和方法記載于例如美國專利No. 4，722，848。另一種載體是卡介苗(BC G， Bacille Calmette Guerin)。BCG 載體記載于 Stover et al. , Nature 1991,351:456-60。 其它多種可用于治療性施用或免疫接種的載體是顯而易見的，例如腺病毒和腺伴隨病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)載體、去毒炭疽毒素載體、諸如此 類。參見例如 Shata et al.，Mol Med Today 2000,6 :66-71 ；Shedlock et al.，JLeukoc Biol 2000,68 :793-806 ；Hipp et al.，In Vivo 2000，14 :571_85。將多核苷酸投遞入受試者可以是直接地，其中使受試者直接暴露于攜帶多核苷酸 的載體，或者是間接地，其中首先在體外用感興趣的多核苷酸轉(zhuǎn)化細(xì)胞，然后將細(xì)胞移植入 受試者。這兩種辦法分別稱作體內(nèi)和離體基因療法。關(guān)于基因療法的方法的一般綜述參見Goldspiel et al.，Clinical Pharmacyl993,12 :488-505 ；Wu and Wu，Biotherapy 1991,3 :87-95 ；Tolstoshev, Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993,33 :573-96 ；Mulligan, Science 1993,260 :926-32 ；Morgan & Anderson, Ann Rev Biochem 1993,62 :191-217 ；Trends in Biotechnology 1993,11(5) 155-215。Ausubel 等人編著的 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY,1993 及 Krieger, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990中記載的重組DNA技術(shù)領(lǐng)域公知的方法也可以用于本發(fā)明。施用的方法可以是口服、皮內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)注射等等，而且可使用系統(tǒng)施用或局 部施用至靶位點附近。施用可以通過單次施用來實施，或者通過多次施用來強化。多核苷酸 在合適的載體中或經(jīng)編碼本發(fā)明肽的多核苷酸轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中的劑量可以依據(jù)要治療的疾 病、患者的年齡、重量、施用的方法等等恰當(dāng)調(diào)整，通常是0. OOlmg至lOOOmg，例如0. OOlmg 至lOOOmg，例如0. Img至10mg，而且可以每幾天施用一次至每幾月施用一次。本領(lǐng)域技術(shù) 人員能恰當(dāng)選擇合適的劑量。IX.使用肽、外來體、APC和CTL的方法本發(fā)明的肽和編碼此類肽的多核苷酸可用于誘導(dǎo)APC和CTL。本發(fā)明的外來體和 APC也可用于誘導(dǎo)CTL。肽、多核苷酸、外來體和APC可以與任何其它化合物組合使用，只要 該化合物不抑制它們的CTL誘導(dǎo)能力。因此，上述任何本發(fā)明藥物制劑或藥物組合物均可 用于誘導(dǎo)CTL，而且在它們之外，那些包括肽和多核苷酸的也可用于誘導(dǎo)APC，如下文討論 的。(1)誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞(APC)的方法本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的肽或編碼所述肽的多核苷酸來誘導(dǎo)APC的方法。APC 的誘導(dǎo)可以如上文“VI.抗原呈遞細(xì)胞”部分所述來實施。本發(fā)明還提供了用于誘導(dǎo)具有高 水平CTL誘導(dǎo)能力的APC的方法，上文“VI.抗原呈遞細(xì)胞”項目下也提到了這種誘導(dǎo)。(2)誘導(dǎo)CTL的方法另外，本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的肽、編碼所述肽的多核苷酸、呈遞所述肽的外來 體或APC來誘導(dǎo)CTL的方法。本發(fā)明還提供使用編碼如下所述的多肽的多核苷酸來誘導(dǎo)CTL的方法，所述多肽 能夠形成可識別本發(fā)明的肽與HLA抗原的復(fù)合物的T細(xì)胞受體(TCR)亞基。優(yōu)選的是，用 于誘導(dǎo)CTL的方法包括至少一個選自下組的步驟a 使⑶8陽性T細(xì)胞接觸在其表面上呈遞HLA抗原與本發(fā)明肽的復(fù)合物的抗原呈 遞細(xì)胞和/或外來體，和b:將編碼能夠形成可識別本發(fā)明的肽與HLA抗原的復(fù)合物的TCR亞基的多肽的多 核苷酸導(dǎo)入⑶8陽性T細(xì)胞。
當(dāng)對受試者施用本發(fā)明的肽時，在受試者的身體中誘導(dǎo)出CTL，而且靶向腫瘤相關(guān) 內(nèi)皮的免疫應(yīng)答的強度增大?；蛘撸暮途幋a肽的多核苷酸可用于離體治療方法，其中在體 外使本發(fā)明的肽接觸(刺激)受試者衍生的APC和CD8陽性細(xì)胞或外周血單個核白細(xì)胞， 并在誘導(dǎo)出CTL后，將活化的CTL細(xì)胞返還給受試者。例如，該方法可包括下述步驟a:自受試者收集APC;b 使肽接觸步驟a的APC ；c 將步驟b的APC與OT8+T細(xì)胞混合，并共培養(yǎng)以誘導(dǎo)CTL ；并d 自步驟c的共培養(yǎng)物收集OT8+T細(xì)胞?；蛘?，依照本發(fā)明，提供了本發(fā)明的肽在制備用于誘導(dǎo)CTL的藥物組合物中的用 途。另外，本發(fā)明還提供了用于誘導(dǎo)CTL的本發(fā)明的肽。通過步驟d獲得的具有細(xì)胞毒性活性的OT8+T細(xì)胞可作為疫苗施用于受試者。上 文步驟c中用來與OT8+T細(xì)胞混合的APC也可通過將編碼本發(fā)明肽的基因轉(zhuǎn)移入APC來制 備，如上文“VI.抗原呈遞細(xì)胞”部分中詳述的；但是不限于此。因而，任何可將本發(fā)明的肽 有效地呈遞給T細(xì)胞的APC或外來體均可用于本發(fā)明的方法。提供下面的實施例來例示本發(fā)明及幫助本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來制備和使用本發(fā) 明。實施例并非意圖以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
實施例材料和方法細(xì)胞系通過將Epstein-Bar病毒轉(zhuǎn)化入HLA-AM陽性人B淋巴細(xì)胞，建立了 AM淋巴母細(xì) 胞樣細(xì)胞系(AMLCL)細(xì)胞。T2 (HLA-A2)人B-淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞系和C0S7細(xì)胞購自ATCC。自IQGAP3衍生的肽的候選者的選擇使用結(jié)合預(yù)測軟件〃BIMAS" (http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bi nd)預(yù)測了 IQGAP3衍生的結(jié)合HLA_AM402和HLA_A*0201的9聚物和10聚物肽，該算法 i己載于 Parker KC et al. J Immunol 1994,152(1) :163-75 及 Kuzu shima K et al. Blood 2001,98(6) :1872-81.由Sigma(日本札幌)依照標(biāo)準(zhǔn)固相合成法合成了這些肽，并通過反 相高效液相層析(HPLC)進行了純化。分別通過分析性HPLC和質(zhì)譜術(shù)分析測定了肽的純度 (> 90% )和身份。將肽以20mg/ml在二甲亞砜(DMSO)中溶解，并保存于_80°C。體外CTL誘導(dǎo)使用單核細(xì)胞衍生的樹突細(xì)胞(DC)作為抗原呈遞細(xì)胞(APC)來誘導(dǎo)針對人白 細(xì)胞抗原(HLA)上呈遞的肽的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答。如別處所述(Nakahara S et al.，Cancer Res 2003 Jul 15，63 (14) :4112-8)在體外生成 DC。具體而言，將用 Ficoll-Plaque (Pharmacia)溶液自正常志愿者(HLA_A*M02 或 HLA_A*0201 陽性)分離的 外周血單個核細(xì)胞(PBMC)通過塑料組織培養(yǎng)皿粘附(Becton Dickinson)來加以分離，以 富集它們的單核細(xì)胞級分。將富集了單核細(xì)胞的群體在含有2%熱滅活自體血清(AS)的 AIM-V培養(yǎng)基(Invitrogen)中、于1000U/ml粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF) (R&D System)和1000 U/ml白介素(IL)_4(R&D System)存在下培養(yǎng)。培養(yǎng)7天后，將經(jīng)細(xì)胞因 子誘導(dǎo)的DC在AIM-V培養(yǎng)基中在3微克/ml β 2-微球蛋白存在下用20微克/ml每一種合成肽于37°C沖激3小時。所生成的細(xì)胞表現(xiàn)出在它們的細(xì)胞表面上表達DC相關(guān)分子， 如⑶80、⑶83、⑶86和II類HLA(數(shù)據(jù)未顯示)。然后將這些經(jīng)肽沖激的DC用絲裂霉素 C OMC)滅活(30微克/ml，30min)，并以1 20比例與自體⑶8+T細(xì)胞混合；自體⑶8+T細(xì) 胞是用⑶8陽性分離試劑盒(Dynal)通過正選擇獲得的。在48孔板(Corning)中設(shè)立這 些培養(yǎng)物；每個孔在0. 5ml AIM-V/2% AS培養(yǎng)基中含有1. 5xl04個經(jīng)肽沖激的DC、3xl05個 CD8+T細(xì)胞和10ng/ml IL-7 (R&D System)。3天后，給這些培養(yǎng)物補充IL-2 (CHIRON)至終 濃度20IU/ml。在第7天和第14天，將T細(xì)胞用經(jīng)肽沖激的自體DC進一步刺激。每次的DC 均通過與上文所述相同的方式來制備。在第21天在第三輪肽刺激后測試針對經(jīng)肽沖激的 A24LCL 細(xì)胞的 CTL(Tanaka H et al. ,Br J Cancer 2001 Jan 5,84(1) :94-9 ；Umano Y et al.,Br J Cancer 2001 Apr 20,84(8) :1052-7 ；Uchida N et al.，Clin Cancer Res 2004 Dec 15,10(24) :8577-86 ；Suda T et al.，Cancer Sci 2006 May,97(5) :411-9 ；Watanabe T et al. , Cancer Sci2005 Aug,96(8) :498-506)。CTL擴增稈序使用與Riddell 等人(Walter EA et al.，N Engl J Med 1995 Oct 19,333(16) 1038-44 ；Riddell SR et al. ,Nat Med 1996 Feb, 2 (2) :216-23)記載的方法相似的方法在 培養(yǎng)物中擴增CTL。在40ng/ml抗CD3單克隆抗體(Pharmingen)存在下，將總共切IO4個CTL 與兩種經(jīng)MMC滅活的人B-淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞系一起懸浮在25ml AIM-V/5% AS培養(yǎng)基中。 啟動培養(yǎng)后一天，向培養(yǎng)物添加120IU/ml IL-2。在第5天、第8天和第11天給培養(yǎng)物補加 新鮮的含有30 IU/ml IL-2 的AIM-V/5% AS培養(yǎng)基(Tanaka H et al. ,Br J Cancer 2001 Jan 5,84(1) :94-9 ；Umano Y et al.，Br J Cancer 2001 Apr 20,84(8) :1052-7 ；Uchida N et al.，Clin Cancer Res 2004 Dec 15,10(24) :8577-86 ；Suda T et al.，Cancer Sci 2006 May,97(5) :411-9 ；Watanabe T et al. , Cancer Sci 2005 Aug,96(8) :498-506)。CTL克隆的建立在96孔圓底微量滴定板(Nalge Nunc hternational)中進行稀釋以獲得0. 3、 1、和3個CTL/孔。在總共150 μ 1/孔含有5% AS的AIM-V培養(yǎng)基中將CTL與IxlO4個細(xì) 胞/孔的兩種人B-淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞系、30ng/ml的抗⑶3抗體、和125U/ml IL-2 一起溫 育。10天后向培養(yǎng)基添加50 μ 1/孔IL-2，以達到終濃度125U/ml IL-2。在第14天測試 CTL活性，并使用與上文所述相同的方法來擴增CTL克隆(Uchida N et al.，Clin Cancer Res 2004 Dec 15,10(24) :8577-86 ；SudaT et al.，Cancer Sci 2006 May,97(5) :411-9; Watanabe T et al. , Cancer Sci 2005Aug,96(8) :498-506)。特異性CTL活性為了檢查特異性CTL活性，實施干擾素(IFN)-Y酶聯(lián)免疫斑點(ELISP0T)測定 和IFNi酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)。具體而言，制備經(jīng)肽沖激的AM或T2 LCL (IxlO4/ 孔)作為刺激細(xì)胞。使用48孔中培養(yǎng)的細(xì)胞作為應(yīng)答細(xì)胞。依照制造商的規(guī)程實施 IFN- y ELISP0T 測定和 IFN- y ELISA 測定。強迫表達靶基因和/或HLA-A24的細(xì)胞的建立通過PCR來擴增編碼靶基因或HLA-AM的可讀框的cDNA。將PCR擴增產(chǎn)物克隆 入pCAGGS載體。使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)依照制造商推薦的規(guī)程將質(zhì)粒轉(zhuǎn) 染入C0S7，一種無靶基因和HLA-AM的細(xì)胞系。自轉(zhuǎn)染起2天后，用Versene (Invitrogen)收獲經(jīng)過轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，并用作CTL活性測定的靶細(xì)胞(5xl04個細(xì)胞/孔)。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染通過PCR來擴增編碼靶基因或HLA_A*0201的可讀框的cDNA。將PCR擴增產(chǎn) 物克隆入PCAGGS載體。使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)依照制造商推薦的規(guī) 程將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入C0S7，一種靶基因和HLA-A*0201-陰性的細(xì)胞系。自轉(zhuǎn)染起2天后，用 versene (Invitrogen)收獲經(jīng)過轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，并用作CTL活性測定的靶細(xì)胞(5xl04個細(xì)胞 /孔)。MM自IQGAP3衍牛的HLA-A24結(jié)合肽的預(yù)測表1依最高結(jié)合親和力的次序顯示IQGAP3的HLA_AM402結(jié)合肽。表Ia顯示衍 生自IQGAP3的9聚體肽，表Ib顯示衍生自IQGAP3的10聚體肽。選擇并檢查了總共68種 具有潛在HLA-AM結(jié)合能力的肽以確定表位肽。[表 la]表Ia 自IQGAP3衍生的HLA-AM結(jié)合性9聚體肽
權(quán)利要求
1.一種具有細(xì)胞毒性T細(xì)胞誘導(dǎo)能力的分離的九肽或十肽，其中所述九肽或十肽包含 選自氨基酸序列SEQ ID NO :巧4的氨基酸序列。
2.權(quán)利要求1的九肽或十肽，其中所述肽包含選自下組的氨基酸序列SEQID NO 2, 4，7，21，25，29，32，35，37，40，49，53，55，56，57，62，63，67，75，85，99，101，11 1，114，121， 125，130，139，140，141，142，143，145，148 和 150。
3.一種具有細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)誘導(dǎo)能力的肽，其中所述肽包含選自下組的氨 基酸序列(a)SEQ ID NO :2，4，7，21，25，29，32，35，37，40，49，53，55，56，57，62，63，67，75，85，99， 101，11 1，114，121，125，130，139，140，141，142，143，145，148 和 150 ；或(b)SEQID NO :2，4，7，21，25，29，32，35，37，40，49，53，55，56，57，62，63，67，75，85，99， 101，111，114，121，125，130，139，140，141，142，143，145，148 和 150，其中替代、插入、缺失或添加1個、2個或幾個氨基酸。
4.權(quán)利要求3 的肽，其中包含選自 SEQ ID NO :2，4，7，21，25，29，32，35，37，40，49，53， 55，56，57，62，63和67中的氨基酸序列的肽具有下述一項或兩項特征(a)所述SEQID NO的氨基酸序列的從N端起第二個氨基酸是選自下組的氨基酸或被 修飾成選自下組的氨基酸苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸和色氨酸，和(b)所述SEQID NO的氨基酸序列的C端氨基酸是選自下組的氨基酸或被修飾成選自 下組的氨基酸苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。
5.權(quán)利要求3的肽，其中所述包含選自SEQID NOs :75，85，99，101，111，114，121，125， 130，139，140，141，142，143，145，148和150中的氨基酸序列的肽具有下述一項或兩項特 征(a)所述SEQID NO的氨基酸序列的從N端起第二個氨基酸是選自亮氨酸或甲硫氨酸 的氨基酸或被修飾成選自亮氨酸或甲硫氨酸的氨基酸，和(b)所述SEQID NO的氨基酸序列的C端氨基酸是選自纈氨酸或亮氨酸的氨基酸或被 修飾成選自纈氨酸或亮氨酸的氨基酸。
6.一種藥物組合物，其包含與藥理學(xué)可接受的載體組合的一種或多種權(quán)利要求1-5的 肽或編碼所述肽的多核苷酸，配制為用于選自下組的目的(i)治療腫瘤； ( )預(yù)防腫瘤；(iii)防止腫瘤的手術(shù)后復(fù)發(fā)；和(iv)它們的組合。
7.權(quán)利要求6的藥物組合物，其配制為供施用給HLA抗原為HLA-AM或HLA-A02的受試者。
8.權(quán)利要求7的藥物組合物，其配制為用于治療癌癥。
9.權(quán)利要求8的藥物組合物，其中所述組合物包括疫苗。
10.一種外來體，該外來體在其表面上呈遞包含與HLA抗原組合的如權(quán)利要求1-5中任 一項所述的肽的復(fù)合物。
11.權(quán)利要求10的外來體，其中所述HLA抗原是HLA-AM。
12.權(quán)利要求10的外來體，其中所述HLA抗原是HLA-AM02。
13.權(quán)利要求10的外來體，其中所述HLA抗原是HLA-A02。
14.權(quán)利要求10的外來體，其中所述HLA抗原是HLA-A0201。
15.一種用于誘導(dǎo)具有高CTL誘導(dǎo)能力的抗原呈遞細(xì)胞的方法，其通過使用權(quán)利要求 1-5中任一項所述的肽進行。
16.一種誘導(dǎo)CTL的方法，其通過使用權(quán)利要求1-5中任一項所述的肽進行。
17.權(quán)利要求15的用于誘導(dǎo)具有高CTL誘導(dǎo)能力的抗原呈遞細(xì)胞的方法，其中所述方 法包括將包含編碼權(quán)利要求1-5中任一項所述的肽的多核苷酸的基因?qū)肟乖蔬f細(xì)胞 的步驟。
18.一種分離的細(xì)胞毒性T細(xì)胞，其靶向任何權(quán)利要求1-5所述的肽。
19.一種分離的細(xì)胞毒性T細(xì)胞，其是使用如權(quán)利要求1-5中任一項所述的肽而誘導(dǎo)的。
20.一種分離的抗原呈遞細(xì)胞，該細(xì)胞在其表面上呈遞HAL抗原與權(quán)利要求1-5中任一 項所述的肽的復(fù)合物。
21.權(quán)利要求20的抗原呈遞細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是通過權(quán)利要求15或17的方法誘導(dǎo)的。
22.—種誘導(dǎo)受試者中針對癌癥的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括對所述受試者施用 疫苗的步驟，所述疫苗包含如權(quán)利要求1-5中任一項所述的肽、其免疫學(xué)活性片段、或編碼 所述肽或片段的多核苷酸。
全文摘要
本文中公開了針對癌癥的肽疫苗。具體而言，本發(fā)明描述了IQGAP3衍生的可引發(fā)CTL的表位肽。本發(fā)明還提供特異性識別經(jīng)所述肽沖激的HLA-A24或HLA-A02陽性靶細(xì)胞的建成的CTL。還提供了呈遞任何所述肽的抗原呈遞細(xì)胞和外來體以及用于誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞的方法。本發(fā)明進一步提供含有IQGAP3多肽或編碼它們的多核苷酸以及外來體和抗原呈遞細(xì)胞作為活性組分的藥物制劑。另外，本發(fā)明提供了用于治療和/或預(yù)防(即防范)癌癥(腫瘤)，和/或預(yù)防它們的手術(shù)后復(fù)發(fā)的方法，以及用于誘導(dǎo)CTL的方法、用于誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的方法，這些方法使用本發(fā)明的IQGAP3多肽、編碼所述多肽的多核苷酸、呈遞所述多肽的外來體或抗原呈遞細(xì)胞、或藥物制劑。要治療的癌癥包括但不限于腎癌、食道癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、膀胱癌和胰腺癌。
文檔編號A61P35/00GK102119169SQ20098013121
公開日2011年7月6日 申請日期2009年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月11日
發(fā)明者吉村祥子, 大澤龍司, 渡邊朝久, 角田卓也 申請人:腫瘤療法科學(xué)股份有限公司