專利名稱：血液與雙相磷酸鈣陶瓷顆粒的組合的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的主題是含有凝結(jié)的血液或凝結(jié)的骨髓抽取物以及雙相磷酸鈣陶瓷顆粒 的新穎的生物材料，以及其制備方法和其在制造允許骨組織再生的植入物中的用途。
背景技術(shù)：
主要源于外傷以及較少地源于腫瘤的骨物質(zhì)損失的重建是整形外科醫(yī)生遇到的 巨大困難之一。對(duì)于小尺寸缺損，從“窄的”假關(guān)節(jié)(骨折愈合的缺陷，此處的骨物質(zhì)損失 是存在的)到5-6cm的骨損失，是從髂嵴除去海綿狀或皮質(zhì)海綿狀骨組織的自體移植的最 常見的主題(黃金標(biāo)準(zhǔn))。對(duì)于大尺寸缺陷O 6cm)，則需要復(fù)雜得多的操作、血管化的骨 轉(zhuǎn)移或Masquelet技術(shù)。然而，可用的自體骨骼的質(zhì)量有限，骨骼愈合仍然不確定，并且這 些不同的技術(shù)主要導(dǎo)致在移除移植物的位置出現(xiàn)手術(shù)后并發(fā)癥。臨床實(shí)踐中可用的各種生物材料理論上可以避開自體移植的缺點(diǎn)。不幸的是，它 們均不能與骨移植的結(jié)果競(jìng)爭(zhēng)，并且它們均不能允許大尺寸物質(zhì)損失的重建。目前研究的大部分骨替代物將生物材料與經(jīng)過數(shù)周的篩選和體外細(xì)胞培養(yǎng)后由 骨髓獲得的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞組合。該方法既復(fù)雜又昂貴，這限制了臨床的益處。L. Okazaki et al. , Clin. Oral Impl. Res.，16，2005，236-243 描述了含有去礦 物質(zhì)骨粉末或凝結(jié)的血液的植入物。若干作者已研究了血液與合成生物材料的組合 J. Schmid et al.，Clin. Oral Impl. Res. 1997 :8 :75-8 描述了含有去礦物質(zhì)牛骨粉末和血 液的植入物。A. Chevrier et al. , Osteoarthritis and Cartilage (骨關(guān)節(jié)炎禾口軟骨) (2007)，15,316-327描述了含有含殼聚糖的聚合物在磷酸甘油酯緩沖液中的溶液以及原位 凝結(jié)的血液的植入物。B. Wallkamm et al. ,Clin. Oral Imp. Res.，14，2003，7；34_742描述了 含有血液和聚乳酸衍生物(Polyfibre 或Polyfoam )的植入物。Yilderim M. et al.， Clin. Oral Impl. Res.，2000，11，217-219描述了含有牛磷灰石和靜脈血的植入物。文獻(xiàn)US 2008/0014279描述了由涂敷有聚合物凝膠的顆粒狀物質(zhì)組成的生物材料，其可以與任何種 類的液體、尤其是血液混合，以形成糊，使用抹刀(spatula)或注射器將其施用在必須填充 骨缺損之處。文獻(xiàn)WO 02/068010描述了含有骨髓的復(fù)合材料，該材料包含生物可相容的多 孔可植入基質(zhì)以及凝結(jié)的物質(zhì)，如骨髓、血液、血漿的凝結(jié)物。然而，現(xiàn)有技術(shù)中描述的這些可植入材料均有缺點(diǎn)在與支持物(去礦物質(zhì)骨或合成聚合物等)結(jié)合之前需要培養(yǎng)骨髓細(xì)胞的材料需 要很長(zhǎng)時(shí)間來使用并且需要在與植入物匹配之前數(shù)周從待治療的個(gè)體采集骨髓，這使得操 作和與之相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)倍增。與支持物和非凝結(jié)的血液組合的生物材料不允許構(gòu)建植入物。盡管已提出了某些支持材料與凝結(jié)的血液的組合，得到的結(jié)果并不總是令人滿意 的，尤其是因?yàn)樵摲椒ú荒苤圃斐鼍|(zhì)的生物材料。到目前為止，源自支持物與凝結(jié)的或非凝結(jié)的血液的組合的這種材料已被用于骨 愈合問題不太嚴(yán)重的上頌面外科手術(shù)中，但它們幾乎沒有或者根本沒有被用于骨干骨骼的修復(fù)中。在WO 02/068010中，所教導(dǎo)的方法在于使用由最小尺寸為至少Imm的顆粒形式的 多孔去礦物質(zhì)骨組成的支持材料，其與至少5mm的去礦物質(zhì)皮質(zhì)骨纖維組合，并與優(yōu)選源 自骨髓的凝結(jié)的物質(zhì)組合。提出的所有實(shí)例包含骨髓細(xì)胞。本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，尤其使能夠由合成支持物(因此可以很容易地被 制備成具有恒定的和均一的性質(zhì))以及凝結(jié)的血液獲得可植入生物材料，而不需使用培養(yǎng) 步驟，該材料具有優(yōu)異的生物相容性，允許快速重建骨組織。本發(fā)明還允許制備在硬度和血 管化方面具有優(yōu)異性能的骨骼。此外，用于制備該生物材料的方法簡(jiǎn)單，容易進(jìn)行，不需要 對(duì)待治療的個(gè)體進(jìn)行多步操作，比現(xiàn)有技術(shù)的方法更廉價(jià)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的生物材料為糊狀，其至少包含顆粒形式的且與凝結(jié)的血液基本均勻地混 合的雙相磷酸鈣。雙相磷酸鈣BCP被用于多種醫(yī)療和牙科應(yīng)用中。雙相磷酸鈣首先被Nery EB et al.，J. Periodontol. 1992 Sept. ,63(9) :729-35 描述為骨修復(fù)材料。BCP 由羥磷灰石(HA) Caltl (PO4)6 (OH) 2與β-磷酸三鈣(Qi3(PO4)2) ( β-TCP)的混合物組成。其生物活性及其生物 可再吸收性可以通過其組分羥磷灰石和β-TCP的比例來控制。與其它合成生物材料相比，含有BCP的生物材料具有促進(jìn)骨生成的優(yōu)點(diǎn)。BCP 已經(jīng)是很多研究的主題Fellah B. H. et al. , J. Mater. Sci. =Mater. Med. (2007),18,287-294已經(jīng)顯示選擇小于20 μ m的粒徑能夠促進(jìn)組織的免疫響應(yīng)，這可以解 釋該粒徑對(duì)骨生成尤其有利的事實(shí)，如Malard 0. et al.，J. Biomed. Mater. Res. ,46(1), 1999，103所觀察到的那樣。與之相反，Mankani M. H. et al. , Biotechnology and Bioengineering, 72 (1), 2001,96-107已經(jīng)顯示粒徑為100至250μπι的校準(zhǔn)(calibrated) BCP顆粒當(dāng)與培養(yǎng)過的骨 髓細(xì)胞組合時(shí)引起最多的骨重建，而在小于44 μ m時(shí)未觀察到骨形成，且粒徑高至2mm的顆 粒獲得良好的結(jié)果。Trojani C. et al.，Biomaterials，27，2006，3256—3264 已經(jīng)顯示，通過植入加入 了培養(yǎng)過的骨髓細(xì)胞的Si-羥丙基甲基纖維素復(fù)合材料的BCP/水凝膠可以獲得良好的成 骨誘導(dǎo)性，其中校準(zhǔn)BCP顆粒為40至80 μ m。然而，后兩種方法需要采集骨髓細(xì)胞并對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)的步驟。本發(fā)明是基于下列事實(shí)-本發(fā)明人觀察到BCP具有抗凝結(jié)性質(zhì)，-相同的發(fā)明人觀察到，與凝結(jié)的血液或者凝結(jié)的骨髓抽取物組合的具有所選粒 徑的BCP使能夠借助比現(xiàn)有技術(shù)的方法更簡(jiǎn)單的方法，獲得非常好的骨生成并導(dǎo)致具有令 人非常滿意的性質(zhì)的骨組織。因此，本發(fā)明的第一主題是下文定義的具體BCP與凝結(jié)的血液或者與凝結(jié)的骨髓 抽取物的組合。有利地，該組合是可延展的、均質(zhì)的糊狀?？梢蕴幚碓摵蛊溥m應(yīng)待填充的缺損的尺寸和形狀，同時(shí)注意不要對(duì)其施加過 大的壓力，這會(huì)損壞或破壞其三維結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明所用的BCP的粒徑為40至500 μ m,優(yōu)選為40至400 μ m,更優(yōu)選為40至 300 μ m,并且有利地為80至200 μ m。本發(fā)明所用的BCP由被研磨并通過例如篩分而校準(zhǔn)的具有所選直徑的顆粒形式 的高溫?zé)Y(jié)物組成。有利地，本發(fā)明所用的BCP包含羥磷灰石和β-磷酸三鈣，其中HA/ β -TCP重量比為5/95至95/5，優(yōu)選為30/70至80/20，有利地為40/60至60/40。有利地，其為多孔性BCP，孔徑為50nm至150 μ m,優(yōu)選為1 μ m至50 μ m?？梢园凑?Bouler et al.，J Biomed Mater Res, 1996, 32,603-609 ；Bouler et al.，J Biomed Mater Res,2000, 51,680-684 ；Obadia et al.，J Biomed Mater Res,2006， 80 (B)，32-42所描述的方法獲得磷酸三鈣和羥磷灰石的顆粒或粉末。它們可商購(gòu)自GRAFTYS SARL公司。如果將現(xiàn)有技術(shù)方法應(yīng)用于BCP顆粒，也就是說，如果將BCP與例如血液樣品混 合，則不能獲得血液凝結(jié)，因?yàn)锽CP具有抗凝結(jié)性質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的方法，將BCP與血液樣 品混合，該血液樣品是在使用抗凝結(jié)劑的情況下預(yù)先采集的，或者是在不使用抗凝結(jié)劑的 情況下采集并且使其在與生物材料接受者相容的供體中立即與BCP接觸的，然后在攪拌 下向混合物中加入至少一種凝結(jié)劑。優(yōu)選地，凝結(jié)劑是鈣衍生物。有利地，從諸如CaCl2、 Ca(NO3)2、Ca(AcOEt)2、CaSO4的生物相容性鈣鹽中選擇基于鈣的凝結(jié)劑。在能夠用于實(shí)施本發(fā)明的其它凝結(jié)劑中，可以提及凝血酶。在整個(gè)凝結(jié)步驟中， BCP、血液或骨髓抽取物和凝結(jié)劑的混合持續(xù)進(jìn)行，并且其強(qiáng)度適于允許形成BCP顆?；蛭?粒與凝結(jié)的血液或者凝結(jié)的骨髓的均質(zhì)混合物，尤其是保持BCP顆粒懸浮。如果該攪拌過 度或者不夠劇烈，則其不允許形成均質(zhì)的混合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠可視地控制均質(zhì)混 合物的形成。除了 BCP之外，生物材料的組成可以包含任選的添加劑，例如聚合物、陶瓷顆粒、 藥物分子，使用這些物質(zhì)的條件為它們的生物相容性，對(duì)生物材料的凝結(jié)反應(yīng)(setting reaction)不存在負(fù)面影響。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的這樣的添加劑旨在調(diào)節(jié)生物材料的流 變學(xué)、其體內(nèi)行為(硬度、再吸收、骨生成)或者作用于感染或炎癥現(xiàn)象的出現(xiàn)(抗生素、抗 感染藥、抗炎劑)。還可以設(shè)想向本發(fā)明的生物材料中引入活性成分，例如治療性分子，例如旨在預(yù) 防或治療選自例如癌癥、骨質(zhì)疏松的病癥的分子。還可以向本發(fā)明的生物材料中引入天然或合成的生長(zhǎng)因子。還可以設(shè)想生物標(biāo)記 物或造影劑的存在，其通過醫(yī)學(xué)顯影來促進(jìn)生物材料的再吸收以及其在身體內(nèi)的結(jié)局的可 視化?？梢栽O(shè)想向本發(fā)明的生物材料中引入采集自待施用該生物材料的患者的脂肪組 織或任何其它組織制品或細(xì)胞制品，該組織或該制劑被預(yù)先懸浮在血液或血漿或生理鹽水 中。在組織制品和細(xì)胞制品中，可以提及脂肪組織、血小板、骨髓細(xì)胞。還可以設(shè)想存在不同粒徑的BCP，但優(yōu)選其以很小的量存在，有利地為BCP總重量 的<5重量％，因?yàn)橐延^察到，控制粒徑允許更好地形成骨組織(更快、更好的質(zhì)量)以及 很好的再吸收。根據(jù)本發(fā)明的方法，將BCP置于封閉和無菌的容器的空腔中，例如注射器的內(nèi)腔 中。將預(yù)先采集自與接受者相容的供體的血液或骨髓抽取物引入到該容器中。
如果采集的血液或骨髓抽取物必須被保存超過數(shù)秒(5至10秒)的時(shí)間，則在其 采集后立即將其與抗凝結(jié)劑混合，以避免其早期凝結(jié)(pre-mature coagulation) 0來自供 體的血液可以例如直接采集在含有適當(dāng)量的抗凝結(jié)劑的管中?？鼓Y(jié)劑可以是鈣離子的螯合劑，例如檸檬酸鈉，以及例如肝素。以下列優(yōu)選的比例制備BCP與血液或骨髓的混合物相對(duì)于血液(或骨髓)體積，10%至90%重量的BCP，優(yōu)選為50%至90%，并且更 優(yōu)選為60%至80%，以g/ml表示。有利地，從接受者本身采集血液，從而盡量確保植入物的生物相容性。根據(jù)本發(fā)明 的一個(gè)變型，用衍生自血液的產(chǎn)品，例如血漿，來代替血液。優(yōu)選地，使用全血。在包括權(quán) 利要求在內(nèi)的整個(gè)申請(qǐng)中，當(dāng)使用血液的措辭時(shí)，其定義中包括衍生自血液的產(chǎn)品，例如血 漿。優(yōu)選地，在本發(fā)明的實(shí)施方式中，使用的血液或血漿為其采集不需要外科手術(shù)操 作的血液或血漿。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)變型，可以借助注射器采集血液，在注射器體內(nèi)預(yù)先放置有BCP 和任選的添加劑。在BCP與血液的第一次混合之后，將凝結(jié)劑添加到混合物中，例如若使用注射器， 則通過借助注射器的抽吸進(jìn)行添加。立即對(duì)含有BCP、血液和凝結(jié)劑的封閉容器進(jìn)行攪拌，以形成均質(zhì)的物質(zhì)。例如，如 果在管中或在注射器體內(nèi)制備混合物，則將容器置于旋轉(zhuǎn)振蕩器中，根據(jù)BCP的粒徑設(shè)定 旋轉(zhuǎn)振蕩器的速度，使得在發(fā)生凝結(jié)的同時(shí)，BCP顆粒保持懸浮。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)變型， 可以通過與磁力攪拌器組合的磁珠來產(chǎn)生攪拌。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選變型，在血液凝結(jié)階段，將含有BCP、血液和凝結(jié)劑的混合物的 封閉容器靜置，以允許BCP沉淀，并形成經(jīng)BCP飽和的植入物。該步驟結(jié)束時(shí)，混合物是均質(zhì)的、可延展的糊形式，其含有纖維蛋白的三維網(wǎng)絡(luò)， 該網(wǎng)絡(luò)俘獲有血液顆粒、血漿和被引入到組合物中的其它分子。根據(jù)用于制備本發(fā)明的生物材料的裝置的類型，隨后可以借助最適于待填充的骨 缺損位置的方式來施用本發(fā)明的生物材料借助于諸如抹刀的工具，而不擾亂植入物的三維組織，或者借助于注射器或其它 圓柱狀裝置，該圓柱狀裝置的端口被預(yù)先切割以形成適應(yīng)于本發(fā)明的生物材料的流變學(xué)的 開口。因此，本發(fā)明的另一主題是用于制備生物材料的方法，該方法至少包含下列步 驟(i)將粒徑為40至500 μ m的顆粒形式的BCP與血液或與骨髓抽取物混合，其比例 為每體積的血液或骨髓為10%至90%重量的BCP，(ii)向步驟⑴的混合物中加入其量足以引起(血液或骨髓的)凝結(jié)的至少一種 凝結(jié)劑，(iii)在促進(jìn)BCP的均質(zhì)化并同時(shí)發(fā)生凝結(jié)的條件下進(jìn)行混合。如上面所描述的，在本發(fā)明的方法中，步驟⑴至(iii)可以在注射器的內(nèi)腔或者 在端口封閉的管內(nèi)進(jìn)行。凝結(jié)劑可以選自鈣衍生物，例如上文列出的那些，或者選自其它凝結(jié)劑，例如凝血酶。本發(fā)明的另一主題是填充骨缺損的方法，該方法包含上文列出的步驟，且另外還 包含在觀察到骨缺損的空間中施用步驟(iii)中獲得的生物材料的步驟。該方法還可以另 外包含組織切開和縫合的步驟。取決于骨缺損的大小和形狀，通過本發(fā)明的生物材料進(jìn)行的填充可以與骨縫合術(shù) (或接骨術(shù))結(jié)合，這樣能夠在本發(fā)明的生物材料的植入位置進(jìn)行骨重建的同時(shí)，賦予受影 響的組織所需的機(jī)械強(qiáng)度。本發(fā)明人觀察到，植入本發(fā)明的生物材料使能夠在短時(shí)期(數(shù)周)內(nèi)誘導(dǎo)骨組織 的形成，該骨組織被相當(dāng)充分地血管化。與之相反，觀察到使用粒徑小于40 μ m的BCP,通過相同方法獲得的生物材料的植 入不能在令人滿意的時(shí)間段內(nèi)形成質(zhì)量足夠高的骨組織。使用粒徑大于500 μ m的BCP，通 過相同方法獲得的生物材料的植入會(huì)降低植入物的再吸收性。本發(fā)明的另一主題是實(shí)施本發(fā)明的方法的試劑盒，該試劑盒包含BCP與至少一 種凝結(jié)劑的組合，所述BCP的粒徑為40至500 μ m,優(yōu)選為40至400 μ m,有利地為40至 300 μ m,并且更優(yōu)選為80至200 μ m。優(yōu)選地，凝結(jié)劑衍生自鈣。有利地，凝結(jié)劑是CaCl2。計(jì)算凝結(jié)劑的量，以補(bǔ)償BCP以及任選地與所采集的血液組合的抗凝結(jié)劑的抗凝
結(jié)作用。 凝結(jié)劑在血液和BCP的混合物中的濃度應(yīng)當(dāng)優(yōu)選為1至50mM，更優(yōu)選為3至35mM， 尤其是在凝結(jié)劑是基于鈣的情況下。凝結(jié)劑應(yīng)當(dāng)優(yōu)選地以水溶液的形式加入，使相對(duì)于BCP 的重量(以ml/g表示)不超過2倍體積的凝結(jié)劑溶液。為了遵守這兩個(gè)限制，并且當(dāng)優(yōu)選地使用濃度低于120mM的凝結(jié)劑溶液時(shí)，尤其 是當(dāng)凝結(jié)劑是鈣鹽時(shí)，凝結(jié)劑溶液的濃度可以變化。如果是在使用抗凝結(jié)劑的情況下采集血液，抗凝結(jié)劑的作用和生物材料的作用應(yīng) 當(dāng)被補(bǔ)償。例如，對(duì)于在常規(guī)條件下(商標(biāo)為Vacuette ，得自Greiner Bio-One公司，或者 商標(biāo)為Vacutainer ,得自Becton Dickinson公司)使用檸檬酸鈉并且以50mg的BCP和 100 μ 1的血液的比例采集的血液，向其加入為最終體積五分之一(即20 μ 1)的80mM的鈣 溶液(最終濃度為13. 3mM)。溶液的濃度可以高至120mM。上面所述的，可以存在過量的鈣， 其同樣地抑制凝結(jié)。如果血液不是在使用抗凝結(jié)劑的情況下采集的，則直接使用生物材料采集血液并 且隨后加入鈣。在這種情況下，可以加入血液體積五分之一的濃度為約12mM至60mM的鈣 鹽水溶液。這樣的組合可以是無菌試劑盒的形式，其包含(a)包含無菌內(nèi)腔的裝置，在該無菌內(nèi)腔中放置有BCP，(b)含有凝結(jié)劑的無菌儲(chǔ)庫(kù)(reservoir)。儲(chǔ)庫(kù)(b)可以是裝置(a)的一部分，或者可以是單獨(dú)的個(gè)體，例如管或瓶，可以從 其中移走凝結(jié)劑并將其轉(zhuǎn)移至裝置(a)的內(nèi)腔，或者是注射器，其允許將凝結(jié)劑注射入放 置有BCP的內(nèi)腔中。有利地，裝置(a)包含允許將血液引入到內(nèi)腔中的工具(means)例如允許直接從個(gè)體或者從儲(chǔ)庫(kù)采集血液樣品的工具，或者允許將血液樣品注射入內(nèi)腔從而允許其與BCP 混合的工具?？梢栽O(shè)想將所采集的血液直接引入到包含BCP的空腔中，或者將其采集在放 置有抗凝結(jié)劑的儲(chǔ)庫(kù)中然后整體轉(zhuǎn)移到存在BCP的空腔中。在使用骨髓抽取物的情況下， 提供了用于抽吸骨髓的工具。裝置(a)的內(nèi)腔的大小為允許在其中引入所需用于制備本發(fā)明的生物材料的血 液或骨髓的量，以及諸如凝結(jié)劑、活性成分、組織制品或細(xì)胞制品的其它混合物組分。另外，有利地，裝置(a)包含允許在觀察到骨缺損的區(qū)域施用生物材料的工具。這樣的裝置可以由諸如管或注射器的圓柱狀裝置組成，如實(shí)驗(yàn)部分所例示的。還可以設(shè)想使用如WO 02/068010中所述的包含管的裝置，在該管中儲(chǔ)存有BCP， 向其中注入血液和凝結(jié)劑，并且可以在其上安裝活塞，使一旦形成生物材料能夠?qū)⑵溽尫?。還可以設(shè)想使用Vacutainer 類型的裝置，即安裝有注射器的真空下的管，它可 以采集預(yù)定量的血液，將這些管用其內(nèi)腔中的BCP預(yù)處理(preconditioned)。本發(fā)明的另一主題是可植入的生物材料，其包含基本均勻地分散在血液蛋白的三 維網(wǎng)絡(luò)中或者骨髓蛋白的網(wǎng)絡(luò)中的尺寸如上文所定義的顆粒形式的BCP。有利地，該生物材料包含如上文所定義的BCP以及血液(或骨髓)蛋白的凝結(jié)物， 且該生物材料的形式為基本均質(zhì)的混合物，其外觀為可延展的糊。措辭可延展的糊理解為意指如下描述的物質(zhì)其本身不像液體般流動(dòng)，但其機(jī)械 強(qiáng)度足夠低，以至于在由個(gè)體手動(dòng)施加的壓力作用下，尤其是在借助于諸如抹刀或者注射 器活塞的器具的情況下，其能夠被模塑(molded)。這樣的生物材料可以被用于制備骨植入物，無論這涉及填充骨折、源自外傷或腫 瘤的骨物質(zhì)損失、外科手術(shù)操作后的缺損，或是利于匹配假肢。如實(shí)施例中所例示的，可以通過外科手術(shù)操作將生物材料引入到需要填充骨缺損 的區(qū)域。切開后，將生物材料植入并將切口再次閉合。本發(fā)明的生物材料可以與具有更高機(jī)械強(qiáng)度的骨縫合術(shù)組合，從而在等待骨組織 在缺損區(qū)域定殖(colonization)的同時(shí)使組合體(assembly)具有穩(wěn)定性?？梢栽O(shè)想將其與假肢組合。用本發(fā)明的生物材料涂覆假肢可以促進(jìn)假肢中或假肢 附近活體骨組織的植入。本發(fā)明的生物材料還可以在體外(in vitro)或離體(ex vivo)用作生成骨組織 的支持物實(shí)際上，在該生物材料周圍培養(yǎng)骨細(xì)胞能夠使制備隨后被植入的骨組織。本發(fā)明的另一主題是上文所述的生物材料在體外或離體用于制備骨植入物的用 途。根據(jù)本發(fā)明，可以在具有期望制造的植入物的形狀的模具中在本發(fā)明的生物材料 上培養(yǎng)骨細(xì)胞。在這些條件下培養(yǎng)細(xì)胞可以獲得具有適當(dāng)形狀和尺寸的生物相容性的植入 物。實(shí)驗(yàn)部分附圖Sl 通過凝結(jié)的血液植入物在BCP顆粒周圍形成骨組織。在皮下位點(diǎn)(A和C)以及肌肉內(nèi)位點(diǎn)(B和D)植入4周后用HES染色的植入物的
9橫截面。比例尺A 禾口 B :500 μ mC 禾口 D :50 μ m白色箭頭成骨細(xì)胞黑色箭頭骨細(xì)胞黑色箭尖血管白色箭尖破骨細(xì)胞圖2 棺入4周后血液/BCP棺入物段。(A)與免疫血清的雜交，顯示細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中骨鈣素(osteocalcin)的棕色(白 色箭頭)(B)與非免疫血清的雜交-比例尺10 μ m(C) =Goldner 染色-比例尺50 μ m黑色箭頭血管和骨細(xì)胞。M3 4周齡血液/BCP植入物的掃描電子顯微鏡檢查(A)顆粒間空間的膠原蛋白基質(zhì)(collagen matrix) -比例尺10 μ m(B) (A)的放大圖-比例尺1 μ m(C)與顆粒連接的具有2至3個(gè)可見的細(xì)胞核的兩個(gè)破骨細(xì)胞-比例尺10 μ m(D)功能性毛細(xì)血管-比例尺10 μ mMi 植入物的掃描電子顯微鏡檢查(A)BCP/凝結(jié)的血液(B)BCP/凝結(jié)的血漿比例尺1μπιSl 植入4周后從BCP/血漿植入物形成骨組織皮下位點(diǎn)(Α、C)肌肉內(nèi)位點(diǎn)(B、D)比例尺500 μ m (A、B)50ym(C、D)M6 從與BCP微粒(40-80 μ m)組合的C57BL/6小鼠的血液(A、B)和人血(C、D) 制備的生物材料，在裸型免疫抑制小鼠中進(jìn)行皮下植入后，其成骨性質(zhì)的比較。在低放大倍 率(A、C)和高放大倍率(B、D)下觀察。比例尺100 μ m。Ml =BCP微粒的粒徑在小鼠進(jìn)行皮下植入后對(duì)骨形成的影響。從與BCP組合的 C57BL/6小鼠的血液制備植入物，BCP的形式為㈧尺寸為小于40 μ m且與80-200 μ m的顆 ?；旌系拇罅课⒓?xì)粉塵；(B) 40-80 μ m的顆粒；(C、D) 80-200 μ m的顆粒；(E、F) 200-500 μ m 的顆粒。圖D和F分別對(duì)應(yīng)于植入物C和E的更高放大倍率視圖。比例尺100 μ m。圖8 從100 μ 1的C57BL/6小鼠血液和其量如下增加的40-80 μ m的BCP微粒制 備的植入物(A)10mg，(B) 30mg, (C) 50mg 和(D)70mg。比例尺100 μ m。_ :犬的X光片-從校準(zhǔn)BCP微粒(80-200 μ m)周圍的凝結(jié)的全血制備的植入 物(A)比率為50%的BCP/血液，微粒在凝結(jié)階段保持懸浮在血液中(方法1) ； (B)血液中最大濃度下的BCP，微粒在凝結(jié)過程中沉淀(方法2)。白色箭頭指示骨干末端(diaphyseal ends)和植入物之間X射線可透線(radiotransparentline)的存在。在小獵犬(BEAGLE dogs)中進(jìn)行植入。手術(shù)后χ光片。(A)左側(cè)，植入物僅 由BCP組成。(B)右側(cè)，其由根據(jù)制備植入物的方法2的具有最大BCP比率的BCP/血液混 合物組成。1.原理這是即時(shí)操作，在操作室中進(jìn)行。其包括在聚丙烯注射器的體內(nèi)將BCP顆粒和在 使用抗凝結(jié)劑的情況下采集的自體全血(50%W/v)混合，所述抗凝結(jié)劑是鈣離子的螯合 劑。CaCl2W加入可以引發(fā)凝結(jié)。然后于室溫下將注射器置于旋轉(zhuǎn)混合器上10分鐘，這可 以使BCP顆粒在凝結(jié)期間保持懸浮在血液中。這樣能夠使顆粒在凝結(jié)的血液中均勻分布。 然后切除注射器的端口并且借助活塞將植入物推出注射器并置于植入位點(diǎn)。在動(dòng)物中獲得的結(jié)果(C57BL/6小鼠)生物材料在異位位點(diǎn)(皮下和肌肉內(nèi))的植入證明了其成骨誘導(dǎo)性質(zhì)，其中4周 后植入物通過血管化極其充分的礦物化的未成熟骨組織完全定殖。2.材料和方法2. 1.雙相磷酸鈣顆粒雙相磷酸鈣(BCP)生物材料由60 %羥磷灰石(HA ；Ca10 (PO4) 6 (OH) 2)和40 %磷 酸三鈣(TCP ；Ca3 (PO4) 2)組成。80至200微米的校準(zhǔn)BCP顆粒由GRAFTYS SARL公司 (Aix-en-Provence, France)提供。通過在180°C下加熱2小時(shí)使顆粒滅菌。2. 2.植入物的制備和外科手術(shù)操作-在小鼠中的皮下植入依照獸醫(yī)服務(wù)管理局(Directiondes Services Veterinaires)的規(guī)程 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并通過區(qū)域動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)(Comit6R6gional d ‘ Ethique pour 1' Experimentation Animale(CREEA))批準(zhǔn)。使用檸檬酸鈉(抗凝結(jié)劑)，通過心臟內(nèi)穿 刺術(shù)從麻醉的十周齡C57BL/6小鼠采集全血。對(duì)于某些實(shí)驗(yàn)，在ISOOg下離心15分鐘從全 血制備血漿。方法1 通過在Iml注射器中將100 μ 1全血(或血漿)與50mg的BCP顆?；旌现?備植入物。然后通過加入20 μ 1的1 % CaCl2溶液激活凝結(jié)。在凝結(jié)期間(5至10分鐘)， 將注射器置于New Brunswick組織培養(yǎng)滾動(dòng)式滾筒(型號(hào)TC-7M1053_40(^)上。這允許注 射器自身的旋轉(zhuǎn)移動(dòng)并保持BCP顆粒懸浮在凝塊中。切除注射器端口后，通過活塞將植入 物推出注射器并經(jīng)皮下(SC)或肌肉內(nèi)(IM)植入到C57BL/6小鼠中。方法2 用最大濃度的顆粒，因而最大的BCP/血液比率來制備植入物。為此，在凝 結(jié)期間BCP/血液/鈣混合物被保持在固定的位置使微粒能夠在血液中自然沉淀。認(rèn)為這 樣能夠獲得微粒在凝結(jié)的血液中的最大濃度。將皮下植入物置于背部位置的皮下，并且將肌肉內(nèi)植入物置于每一大腿中的切開 后的肌肉塊之間。在每一位點(diǎn)(SC和IM)，檢查在植入期間沒有誘發(fā)流血。在每一植入實(shí)驗(yàn)中，通過吸入4%異氟烷將C57BL/6小鼠麻醉。對(duì)每一小鼠放置兩 個(gè)SC植入物和兩個(gè)IM植入物。在某些實(shí)驗(yàn)中，每一小鼠在每一位點(diǎn)接受血液/BCP植入物 和血漿/BCP植入物。4至8周后，通過吸入(X)2將動(dòng)物處死并將植入物取出進(jìn)行分析。
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-在大鼠的骨位點(diǎn)進(jìn)行植入施用于大鼠的方案得到區(qū)域動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(NCA/2007/12-06)。在尼 斯醫(yī)學(xué)院的中心動(dòng)物屋(Animalerie Centrale)進(jìn)行這些初步實(shí)驗(yàn)。發(fā)明人使用其實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的模型，即股骨干的中斷性的、分段性的嚴(yán)重大小(6mm) 的骨物質(zhì)損失與鋼板-螺釘骨縫合術(shù)組合的模型。在每一大鼠的單一股骨上操作，用本發(fā) 明的生物材料、自體全血/BCP (80-200 μ m)填充骨物質(zhì)損失。對(duì)大鼠進(jìn)行臨床監(jiān)測(cè)(無痛、 輕運(yùn)動(dòng)、通常條件)并且在第0、7、15、30、45、60和90天通過照相進(jìn)行放射學(xué)監(jiān)測(cè)。在第三 個(gè)月結(jié)束時(shí)，將動(dòng)物處死，采集股骨并且在切除骨縫合術(shù)材料后將骨骼固定在福爾馬林中， 然后包埋在甲基丙烯酸甲酯樹脂中并進(jìn)行組織性研究。在第一次操作中，將植入物制成骨缺損的尺寸，其顆粒比例為50%重量/體積，即 相對(duì)于每150 μ 1手術(shù)前采集自動(dòng)物的全血為75mg的BCP。通過加入15 μ 1的2% CaCl2來 引發(fā)凝結(jié)，并且通過持續(xù)旋轉(zhuǎn)直至獲得凝結(jié)來產(chǎn)生均質(zhì)化，從而使BCP顆粒保持懸浮在血 液中，并確保生物材料的均質(zhì)性。-在小獵犬的骨位點(diǎn)進(jìn)行植入這是在小獵犬品種的成年犬上產(chǎn)生的在側(cè)股骨骨節(jié)區(qū)域中的嚴(yán)重大小的校準(zhǔn)圓 柱形空腔骨物質(zhì)損失的模型。對(duì)于每一犬，處理(tackled) 2個(gè)股骨骨節(jié)。在操作開始時(shí)通 過在動(dòng)物的頸靜脈區(qū)域進(jìn)行穿刺來采集全血(3. 5ml)，并將其用于制備生物材料。在每一外 側(cè)股骨骨節(jié)區(qū)域中產(chǎn)生SXlOmm的圓柱形骨損失，并且通過用生理鹽水洗滌并抽吸而小心 除去壞骨片。每一動(dòng)物接受兩個(gè)組成不同的植入物，該植入物被制備成完全填充所產(chǎn)生的缺損 的植入物，也就是說一方面，待測(cè)試的生物材料由比例為50%重量/體積的BCP (80-200 μ m)和血液的 混合物或者330mg的BCP和660 μ 1的全血的混合物組成。通過用于制備混合物的注射器 的旋轉(zhuǎn)使BCP顆粒在凝結(jié)期間保持懸浮。另一方面，植入單獨(dú)的BCP，用生理鹽水潤(rùn)濕，其為660mg，與對(duì)側(cè)的植入物 (controlateral implant) [jEft匿同的 本IR。實(shí)驗(yàn)持續(xù)8周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)立即于ENVN照手術(shù)后X光。2.3.組織學(xué)分析將切開的植入物在10%緩沖的福爾馬林溶液中固定M小時(shí)。然后將每一植入物 切成三片，將其在10% (w/v)亞乙基二胺四乙酸(EDTA)溶液中室溫脫鈣M小時(shí)或不進(jìn)行 脫鈣，然后包埋在石蠟中。制備4μπι的段，脫蠟，潤(rùn)濕并用蘇木精、赤蘚紅、藏紅花(HES)染 色。使用kiss Axioskop顯微鏡通過光學(xué)顯微法檢查這些段。用AxioCam HRc彩色照相 機(jī)(Zeiss，LePecq，F(xiàn)rance)拍攝照片。一方面為了量化纖維狀骨所占的表面積，另一方面 為了量化BCP顆粒所占的表面積，將植入物的每一圖像沿植入物的中軸細(xì)分成表面積等于 0. 6mm2的三個(gè)區(qū)域。在這三個(gè)區(qū)域的每一個(gè)中，使用AxioVision Rel. 4. 6軟件測(cè)量纖維狀 骨組織所占的面積。對(duì)三個(gè)SC植入物和三個(gè)IM植入物進(jìn)行該分析。通過由兩個(gè)不同的觀 察者在光學(xué)顯微鏡(100X)下分別計(jì)數(shù)毛細(xì)血管和多核巨細(xì)胞來求取這些相同區(qū)域中的血 管和破骨細(xì)胞的數(shù)目。破骨細(xì)胞和血管的密度以每mm2表示，其形式為平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差。所用的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)是Mudent' s T檢驗(yàn)。顯著性被定義為ρ值低于0.05。2. 4. Goldner 染色:用Goldner三色法將厚度為7μπι的未脫鈣的植入物段染色，這可以評(píng)價(jià)骨組織 的礦物化并區(qū)分礦物化組織(以藍(lán)色/綠色表示)與未礦物化骨樣組織(以紅色表示)。 簡(jiǎn)單地說，將脫蠟的段再水化，然后在Weigert蘇木精的存在下溫育(incubated) 20分鐘， 用流動(dòng)的水沖洗并在酸醇的存在下進(jìn)行區(qū)分，用流動(dòng)的水洗滌5分鐘然后用蒸餾水沖 洗。然后通過在麗春紅/酸性品紅/偶氮焰紅染料/乙酸的溶液中溫育5分鐘而將這些段 染色，用乙酸沖洗，在磷鉬酸/橙黃G的存在下溫育20分鐘，用乙酸沖洗，在淡綠/ 乙酸的存在下染色5分鐘，用乙酸洗滌5分鐘，干燥并封裝在Entellan封片劑(Merck， Darmstadt, Germany)中。2. 5鼠骨鈣素的免疫組織化學(xué)本發(fā)明使用小鼠骨鈣素的免疫純化的多克隆抗體，對(duì)抗對(duì)應(yīng)于蛋白質(zhì)N末端的氨 基酸 1-20 的合成肽(Alexis Biochemicals, Lausanne, Switzerland)。簡(jiǎn)單地說，將石蠟 中的7 μ m段脫蠟，在乙醇中再水化，在PBS中洗滌，并在0. 3% H2O2的PBS溶液的存在下溫 育30分鐘。在PBS中洗滌兩次后，將載玻片在1.5%山羊血清(封閉緩沖液)的存在下溫 育30分鐘。在PBS中洗滌后，在生物素標(biāo)記的兔免疫球蛋白的抗體存在下溫育并使用ABC 標(biāo)記試劑盒(sc-2118,Santa Cruz,CA,USA)用過氧化物酶進(jìn)行可視化操作。然后將段在過 氧化物酶基質(zhì)的存在下溫育10分鐘并用蘇木精將細(xì)胞核染色3分鐘。脫水后，在Entellan 封片液(Merck)中進(jìn)行封裝。通過將載玻片在封閉緩沖液的存在下溫育而產(chǎn)生對(duì)照。2. 6掃描電子顯微鏡檢查由凝結(jié)的血液/BCP或凝結(jié)的血漿/BCP組成的植入物在植入之前和植入四周后于 4°C下在緩沖的戊二醛溶液中固定12小時(shí)。然后將樣品洗滌并在30%甘油的存在下溫育 lh，然后在液氮中冷凍并使其斷裂。在濃度漸增的乙醇存在下脫水后，將其浸漬在六甲基二 硅氮烷(Sigma-Aldrich，L' isle d' Abeau Chesnes，F(xiàn)rance)中 5 分鐘，然后在室溫下 干燥。然后將其固定在鋁支持物上，然后涂以一金-鈀(Polaron E5100，UK)層。然后使用 JEOL 6700F型掃描電子顯微鏡(Japan)進(jìn)行檢查。3.結(jié)果3. 1.凝結(jié)的血液/BCP皮下和肌肉內(nèi)植入物的宏觀和微觀分析。在沒有BCP顆粒存在下植入凝結(jié)的血液不會(huì)形成骨組織。4周后，在植入位點(diǎn)僅觀 察到少量的纖維組織。4周和8周后對(duì)BCP顆粒周圍的凝結(jié)的血液植入物的解剖和宏觀檢查可以觀察它 們的牢固堅(jiān)實(shí)度(firm consistency)以及在它們表面處大量小血管的存在。沒有觀察到 宿主組織的炎癥。植入4周后對(duì)血液/BCP植入物的石蠟段的組織學(xué)分析對(duì)于SC (

圖1A)和IM(圖 1B)植入物均顯示整個(gè)顆粒間空間被與BCP緊密接觸的未成熟骨組織完全地和可重現(xiàn)地定 殖。在更高放大倍率下的檢查表明，膠原蛋白基質(zhì)在IM位點(diǎn)(圖1D)比在SC位點(diǎn)(圖1C) 更加成熟。為了評(píng)價(jià)顆粒間空間中形成的纖維狀骨的量，如材料和方法部分所述計(jì)算了骨 組織所占表面積與BCP所占表面積之間的比率。這可以顯示SC和IM位點(diǎn)之間的顯著性差 異，其中在IM植入物中，骨組織為49. 63士5. 08%，并且在SC植入物中為42士8. 33% (n =9，ρ = 0. 035)。所有這些結(jié)果顯示，顆粒間空間在SC和IM位點(diǎn)均被完全定殖，但在IM植 入物中形成的組織的量要大得多。在每一位點(diǎn)觀察到均勻分布在所有植入物中的膠原蛋白基質(zhì)內(nèi)存在大量血管 (圖1C、D，黑色箭尖)。對(duì)它們的計(jì)數(shù)顯示IM和SC植入物之間的顯著性差異，其平均值分 別為 61. 4士 10. 2 血管/mm2 和 51. 10士 10/mm2(n = 9 ;p = 0. 045)。還觀察到與 BCP 顆粒連 接的大量多核巨細(xì)胞(白色箭尖)。這些細(xì)胞與發(fā)明人先前工作中識(shí)別為破骨細(xì)胞的那些 細(xì)胞相同(Trojani C. et al. , Biomaterials, 27, 2006, 3256-3264) 對(duì)它們的計(jì)數(shù)顯示， IM植入物中的平均值為88. 51 士 14. 60破骨細(xì)胞/mm2以及SC植入物中的93. 13 士 14. 40/ mm2，此差異不是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。通過微粒和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)碎片晶體的存在，通過某些BCP顆粒外 形的不規(guī)則性，以及其具有更低和不均勻密度的降解結(jié)構(gòu)(degradation texture)，強(qiáng)烈地 表明這些細(xì)胞具有高再吸收能力。最后，我們觀察到排列在BCP顆粒表面的立方形成骨細(xì) 胞(圖IC和插入圖，圖5C，白色箭頭)和包埋在膠原蛋白基質(zhì)中的大量骨細(xì)胞型細(xì)胞(圖 1D、2B、3A，B，黑色箭頭)的存在。通過骨鈣素的細(xì)胞質(zhì)間免疫組織學(xué)檢測(cè)證明了這些細(xì)胞 的成熟的成骨細(xì)胞顯型(圖2A)。此外，植入4周后經(jīng)Goldner染色后，所有植入物均為陽(yáng) 性，表明該新生組織是礦物化的(圖2C)。通過掃描電子顯微鏡對(duì)4周IM植入物進(jìn)行分析，可以觀察到(圖;3)BCP顆粒的多 微孔性、填充顆粒間空間的膠原蛋白基質(zhì)、含有紅細(xì)胞的功能性毛細(xì)血管的存在(圖3A、D， 白色箭頭)以及與BCP顆粒連接的破骨細(xì)胞(圖3C，黑色箭頭)。此外，它證實(shí)了骨細(xì)胞型 星形細(xì)胞的存在，其具有大量向所有方向放射的延伸，包埋在膠原蛋白基質(zhì)中，并且被骨母 細(xì)胞型的細(xì)胞周空間包圍(圖3A插入圖，3B)。植入8周后獲得的結(jié)果未顯示與4周植入物的任何顯著性差異。所有SC和IM植 入物均被顯示相同組織學(xué)特征的未成熟骨完全定殖。3. 2.凝結(jié)的血漿/BCP的SC和IM植入物的宏觀和微觀分析為了分析血漿和血液細(xì)胞各自在骨新生作用中的作用，對(duì)于每一小鼠和在每一位 點(diǎn)(SC和IM)，平行植入了凝結(jié)的血液/BCP的植入物和凝結(jié)的血漿/BCP的植入物。通過掃描電子顯微鏡檢查分析了凝結(jié)的血液/BCP和凝結(jié)的血漿/BCP這兩類植入 物的纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)。這顯示了用凝結(jié)的血液獲得的纖維蛋白網(wǎng)孔(fibrin mesh)比 用凝結(jié)的血漿所觀察到的更大(圖4A、B)。如同所預(yù)期的，紅血細(xì)胞和血小板是凝結(jié)的血 液/BCP的植入物中所觀察到的主要細(xì)胞。它們的形狀和結(jié)構(gòu)的保持證明了好的存活能力 (圖4A)，這表明血液和BCP顆粒的混合物對(duì)血細(xì)胞沒有有害作用。4周和8周后對(duì)凝結(jié)的血漿/BCP的植入物的解剖和宏觀檢查顯示其具有與凝結(jié) 的血液/BCP的植入物類似的特征，即牢固堅(jiān)實(shí)度和大量可見的表面血管(結(jié)果未示出)。 4周后的組織學(xué)分析顯示，SC植入物總共約80%被新生骨定殖(圖5A)。IM植入物的分析 顯示，被完全定殖(圖5B)的情況有75%，而存在更纖維狀和松散的組織的小中心區(qū)域(結(jié) 果未示出)的情況有25%。在每一位點(diǎn)，新生纖維狀骨組織顯示出與凝結(jié)的血液/BCP的植 入物中獲得的組織相同的特征(圖5C、5D)。綜上所述，這些結(jié)果證明使用全血可以獲得植 入物在兩個(gè)位點(diǎn)的完全定殖。凝結(jié)的血漿與BCP顆粒的組合產(chǎn)生不完全的定殖。3. 3在免疫抑制小鼠中皮下植入后，由凝結(jié)的人血和40-80 μ m BCP顆粒組成的植 入物的宏觀和微觀分析。
對(duì)由圍繞40-80 μ m BCP顆粒的凝結(jié)的人血制備的生物材料植入在裸型免疫抑制 小鼠中之后誘導(dǎo)的骨形成進(jìn)行了分析。平行地，在相同動(dòng)物中植入了由來自C57BL/6小鼠 的血液制備的生物材料，從而比較在相同的接受者動(dòng)物中由小鼠血液誘導(dǎo)的骨形成和由人 血產(chǎn)生的骨形成。植入6周后，采集植入物，將其固定，并如前文所述對(duì)其進(jìn)行組織學(xué)分析。甚至在組織學(xué)研究之前，我們觀察到由人血制備的植入物的相當(dāng)異常的硬度，而 小鼠血液的植入物則具有更有彈性的堅(jiān)實(shí)度。鼠植入物的組織學(xué)分析顯示未成熟骨組織與在同系體系(在C57BL/6小鼠中植入 C57BL/6小鼠血液)中進(jìn)行的在先實(shí)驗(yàn)中所觀察到的具有相同質(zhì)量。還觀察到高度血管化 的膠原纖維狀組織，能夠從中識(shí)別骨骼細(xì)胞、成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞(圖6A、6B)。人植入物的組織學(xué)分析對(duì)于被成熟骨組織定殖給出的結(jié)果非常不同。骨骼細(xì)胞更 少，主要為骨細(xì)胞。支持組織顯示組成具有更好的結(jié)構(gòu)、排列和更致密的膠原蛋白纖維，其 內(nèi)具有造血板(hematopoiesis plates)，其特征是諸如成血紅細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的未成熟造 血細(xì)胞的存在(圖6C、6D)。這些植入物于切割時(shí)呈現(xiàn)的硬度表明該組織是高度礦物化的。 因此我們獲得了成熟的板狀骨組織。植入人血和鼠血后獲得的骨組織的成熟度差異可歸因于這兩個(gè)物種的血液性質(zhì) 不同，與細(xì)胞組成和/或蛋白質(zhì)組成、生長(zhǎng)因子、可溶性因子以及纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)相關(guān)的性質(zhì) 不同。將進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以試圖理解所涉及的機(jī)理。將本發(fā)明的結(jié)果與文獻(xiàn)的結(jié)果相比較，顯示本發(fā)明從人血所獲得的成熟骨組織非 常類似于數(shù)個(gè)小組所描述的，其中植入所選的人間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞(MSC)，并在離體擴(kuò)充和分 化為成骨細(xì)胞，然后與BCP粉末組合并皮下植入到免疫抑制小鼠中。因此，所有這些對(duì)于臨床應(yīng)用是很有前途的。3. 4 BCP的粒徑對(duì)骨形成的影響對(duì)4種類型的BCP進(jìn)行了測(cè)試，分別校準(zhǔn)為40至80 μ m、80至200 μ m和200至 500 μ m的三種微粒類型，以及80-200 μ m的顆粒與尺寸遠(yuǎn)小于40 μ m的微細(xì)粉塵的混合物， 微細(xì)粉塵的比例為相對(duì)于混合物總重量的40重量％。在已描述的條件下從C57BL/6小鼠 血液和每一種這些類型的BCP制備植入物。皮下植入8周后在同系C57BL/6小鼠中分析骨 形成。圖7的結(jié)果例示了由80-200 μ m微粒組成的植入物通過具有已描述特征的未成熟 骨組織以非常高的可重現(xiàn)性產(chǎn)生最佳定殖(圖7C、7D)。與80-200 μ mBCP微?；旌系腂CP 粉塵(尺寸小于40μπι)的存在對(duì)骨形成極其有害，如圖7Α所示。實(shí)際上，觀察到植入物的 定殖，其通常保持嚴(yán)格限制在外周冠。由40-80μπι顆粒組成的植入物產(chǎn)生良好的定殖，但 其可重現(xiàn)性比80-200 μ m植入物的差。實(shí)際上，難以理解，有時(shí)會(huì)觀察到中心定殖缺陷，如 圖7B所示。最后，由200-500 μ m顆粒組成的植入物通常被定殖，但其是被質(zhì)量稍不太令人 滿意的更纖維狀的和松散的組織定殖(圖7E、7F)。這些結(jié)果證明了在我們的生物材料中80-200 μ m顆粒度對(duì)于異位位點(diǎn)的骨形成
更有利。3. 5確定骨重建的最佳BCP/血液比率可以向本發(fā)明的生物材料中并入相同體積的血液而不同量的BCP微粒。確定理想 比率是其開發(fā)中的重要步驟。在小鼠的皮下位點(diǎn)進(jìn)行植入的數(shù)個(gè)實(shí)驗(yàn)以及在Wistar大鼠和小獵犬的骨位點(diǎn)進(jìn)行的初步實(shí)驗(yàn)使能夠確定最佳的BCP/血液比率。3. 5. 1.在小鼠的皮下異位位點(diǎn)進(jìn)行植入制備了由如下物質(zhì)組成的植入物固定量的血液(100 μ 1)、固定量的 CaCl2 (10 μ 1)和增加量的 40-80 μ m BCP 微粒10mg、30mg、50mg 和 70mg,即 BCP/ 血液比率 為10^^30^^50%和70%重量/體積。通過在滾筒上旋轉(zhuǎn)而使BCP顆粒在凝結(jié)過程中保 持懸浮在血液中(方法1)。這些植入物在植入時(shí)具有等同的尺寸，各自的體積為112、116、 120 和 124 μ 1。如圖8所示，植入4周后，觀察到植入物的最終大小與所并入的BCP的初始重量成 比例，并且所有的植入物具有相同的顆粒密度。此外，通過未成熟骨組織進(jìn)行的定殖是相同 的，與BCP/血液比率無關(guān)。這些結(jié)果顯示，凝結(jié)期間通過注射器的旋轉(zhuǎn)獲得顆粒在初始植入物中的均勻分散 不隨時(shí)間保持。相反，發(fā)生顆粒聚集的現(xiàn)象，這可能與纖維蛋白凝膠在體內(nèi)的自然降解有 關(guān)。由于該聚集對(duì)于給定的體積給出相同的顆粒濃度，而與初始比率無關(guān)，則具有相同成骨 誘導(dǎo)現(xiàn)象似乎是合乎邏輯的。隨后在骨位點(diǎn)進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這些結(jié)果。3. 5. 2.在大鼠骨位點(diǎn)進(jìn)行植入在每一大鼠的單一股骨上操作，用本發(fā)明的生物材料、自體全血/BCP (80-200 μ m) 填充骨物質(zhì)損失。對(duì)大鼠進(jìn)行臨床監(jiān)測(cè)(無痛、輕運(yùn)動(dòng)、通常條件)并且在第0、7、15、30、 45、60和90天通過照相進(jìn)行放射學(xué)監(jiān)測(cè)。在第三個(gè)月結(jié)束時(shí)，將動(dòng)物處死，采集股骨并且在 切除骨縫合術(shù)材料后將骨骼固定在福爾馬林中，然后包埋在甲基丙烯酸甲酯樹脂中并進(jìn)行 組織性研究。在第一次操作中，將植入物制成骨缺損的尺寸，其顆粒比例為50%重量/體積，即 相對(duì)于每150μ 1手術(shù)前采集自動(dòng)物的全血為75mg的BCP。通過加入15 μ 1的2% CaCl2來 引發(fā)凝結(jié)，并且通過持續(xù)旋轉(zhuǎn)直至獲得凝結(jié)來產(chǎn)生均質(zhì)化，從而使BCP顆粒保持懸浮在血 液中，并確保生物材料的均質(zhì)性。觀察到可重現(xiàn)性非常高，其中從第7天的第一張χ光片中觀察到骨表面與植入物 之間出現(xiàn)X射線可透線(圖9Α)，這表明在生物材料和骨干段之間不存在粘連。當(dāng)BCP在血 液中為最大濃度時(shí)，微粒在凝結(jié)期間沉淀(方法幻，在生物材料和骨干段之間觀察到令人 滿意的粘連(圖9Β)。3. 5. 3.用兩種制備植入物的方法獲得的結(jié)果的比較在大鼠(圖9Β)和犬(圖IOA和10Β)的骨位點(diǎn)處，χ射線分析顯示，用這種新方 案，在正面的X射線檢查中不存在植入物的收縮并且在側(cè)面的X射線檢查中不存在線。在 小鼠的異位位點(diǎn)處，沒有觀察到骨形成結(jié)果的差異。3. 5. 4.討論在沉淀的生物材料的骨植入的情況中(方法2)，能夠從對(duì)大鼠和犬的χ光片中觀 察到植入物尺寸沒有減小，并且如果將其正確匹配，與骨緊密接觸，其以最佳的方式受益于 成骨傳導(dǎo)和成骨誘導(dǎo)現(xiàn)象。
1權(quán)利要求
1.制備生物材料的方法，所述方法至少包含下列步驟(i)將粒徑為40至500 μ m的顆粒形式的雙相磷酸鈣即BCP與血液或與骨髓抽取物混 合，比例為每體積的血液或骨髓為10%至90%重量的BCP，以g/ml表示，( )向步驟(i)的混合物中加入其量足以引起血液或骨髓凝結(jié)的至少一種凝結(jié)劑，(iii)在促進(jìn)BCP均質(zhì)化并同時(shí)發(fā)生凝結(jié)的條件下進(jìn)行混合。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中基于鈣的所述凝結(jié)劑選自生物相容性鈣鹽并優(yōu)選為 CaCl2 ο
3.如前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述血液預(yù)先采集自與待使用所述生物材料 的接受者相容的供體。
4.如前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述血液預(yù)先采集自待使用所述生物材料的 接受者。
5.如前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中含有所述BCP、所述血液和所述凝結(jié)劑的所 述混合物在血液凝結(jié)階段被靜置，從而使所述BCP沉淀并形成經(jīng)BCP飽和的植入物。
6.如前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中步驟(i)至(iii)在注射器的內(nèi)腔或者在端 口封閉的管內(nèi)進(jìn)行。
7.如前述任一權(quán)利要求所述的方法，其包括混合相對(duì)于血液體積50%至90%重量的 BCP，優(yōu)選為60%至80%，以g/ml表示。
8.通過權(quán)利要求1至7中任一權(quán)利要求所述的方法獲得的生物材料，其包含粒徑為40 至500 μ m的顆粒形式的BCP以及凝結(jié)的血液或凝結(jié)的骨髓。
9.如權(quán)利要求8所述的生物材料，其為可延展的、均質(zhì)的糊狀。
10.如權(quán)利要求8或9所述的生物材料，其中所述BCP顆粒的粒徑為80至200μ m。
11.如權(quán)利要求8至10中任一權(quán)利要求所述的生物材料，其中所述BCP含有羥磷灰石 (HA)和β -磷酸三鈣(β -TCP)，且HA/ β -TCP的重量比為5/95至95/5。
12.如權(quán)利要求8至11中任一權(quán)利要求所述的生物材料，其進(jìn)一步包含至少一種添加 劑，所述添加劑選自聚合物、陶瓷顆粒、藥物分子、天然或合成的生長(zhǎng)因子、生物標(biāo)記物、造 影劑、組織制品或細(xì)胞制品。
13.如權(quán)利要求8至12中任一權(quán)利要求所述的生物材料，其在填充骨缺損的方法中用 作植入物。
14.權(quán)利要求8至13中任一權(quán)利要求所述的生物材料與骨縫合術(shù)的組合。
15.用于進(jìn)行權(quán)利要求1至7中任一權(quán)利要求所述的方法的試劑盒，該試劑盒包含粒徑 為40至500 μ m的BCP與衍生自鈣的凝結(jié)劑的組合。
16.如權(quán)利要求15所述的試劑盒，其中所述凝結(jié)劑是CaCl2。
17.如權(quán)利要求15或16所述的試劑盒，其包含(a)包含無菌內(nèi)腔的裝置，在該無菌內(nèi)腔中放置有所述BCP，(b)含有所述凝結(jié)劑的無菌儲(chǔ)庫(kù)。
18.如權(quán)利要求15至17中任一權(quán)利要求所述的試劑盒，其中所述裝置(a)包含使血液 引入到所述內(nèi)腔中的工具。
19.如權(quán)利要求15至18中任一權(quán)利要求所述的試劑盒，其中所述裝置(a)包含在觀察 到骨缺損的區(qū)域施用所述生物材料的工具。
20.如權(quán)利要求15至19中任一權(quán)利要求所述的試劑盒，其中所述裝置(a)由注射器組成。
21.權(quán)利要求8至14中任一權(quán)利要求所述的生物材料在體外或離體用作生成骨組織的 支持物的用途。
22.權(quán)利要求8至14中任一權(quán)利要求所述的生物材料在體外或離體用于制備骨植入物 的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生物材料，其含有凝結(jié)的血液或凝結(jié)的骨髓抽取物以及雙相磷酸鈣陶瓷顆粒，還涉及該生物材料的制備方法及其用于制備能夠使骨組織再生的植入物的用途。
文檔編號(hào)A61L27/36GK102123740SQ200980132380
公開日2011年7月13日 申請(qǐng)日期2009年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月23日
發(fā)明者喬治·卡爾, 克里斯托弗·特羅亞尼, 弗洛里安·布凱什比, 納塔莉·羅歇, 蒂埃里·巴拉格爾 申請(qǐng)人:國(guó)家科學(xué)研究中心, 尼斯大學(xué)醫(yī)學(xué)中心