專(zhuān)利名稱(chēng)：用于鼓膜或外耳道再生的試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鼓膜或耳道再生試劑，其包括明膠海棉和被覆材料的組合，所述明膠 海棉載有堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)。
背景技術(shù)：
鼓膜穿孔是造成諸如鼓膜中破裂和穿孔的缺陷的癥狀；其存在多種原因，在鼓室 中肉眼可見(jiàn)干燥而無(wú)活動(dòng)性炎癥的情況下，似乎可期望盡可能早地閉合穿孔。鼓膜閉合的 最大優(yōu)點(diǎn)是聽(tīng)力的提高。只要內(nèi)耳沒(méi)有失調(diào)且中耳不存在特別的病變，則在所有情況下，在 鼓膜閉合之后通常都實(shí)現(xiàn)了聽(tīng)力的改善，這顯著地有助于患者QOL的提高。鼓膜中存在穿孔時(shí)，不僅鼓膜不能夠捕捉足夠的聲音，而且聽(tīng)覺(jué)(聽(tīng)單詞)也會(huì)由 于消除效應(yīng)而被進(jìn)一步干擾，其中直接進(jìn)入鼓室的聲音會(huì)穿過(guò)圓窗進(jìn)入耳蝸，并與經(jīng)由正 常路線進(jìn)入耳蝸的聲音沖突。另外，中耳直接暴露于耳道側(cè)，結(jié)果這導(dǎo)致對(duì)感染耐受性減弱 并可能造成中耳炎。長(zhǎng)期持續(xù)的感染狀態(tài)會(huì)由于內(nèi)耳機(jī)能減退而造成感覺(jué)神經(jīng)的聽(tīng)覺(jué)損失 和受損的迷路功能。由于這些原因，優(yōu)選盡量閉合鼓膜。對(duì)于鼓膜閉合，多種治療根據(jù)穿孔的尺寸進(jìn)行，目前可利用的大部分療法基本上 是基于外科手術(shù)的。通常，進(jìn)行鼓膜成形術(shù)和鼓室成形術(shù)。在前者中，耳后部的皮膚切口與 自體組織的收集/移植是必要的；在后者中，除這些程序之外，耳道磨損也是必要的。當(dāng)鼓 膜的穿孔尺寸增加時(shí)，作為鼓膜替代品的自體組織(顳筋膜)的移植作為外科技術(shù)變得更 難進(jìn)行。因此，甚至在進(jìn)行了外科手術(shù)的情況下，聽(tīng)力并不總是得到改善?？赡艹霈F(xiàn)許多后 遺癥，如術(shù)后鼓膜再穿孔、耳周部異感以及耳鳴。此外，在術(shù)后，鼓膜由于潛伏化作用、肥大 等而與完整鼓膜相距甚遠(yuǎn)，并且聽(tīng)力降低。這些手術(shù)通常伴隨住院護(hù)理約一天至幾個(gè)星期， 而造成缺點(diǎn)，如患者的心理、生理和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)的增加。同樣地，對(duì)于伴隨骨露出的耳道軟組織缺陷，外科手術(shù)治療已經(jīng)成為唯一常規(guī)療 法；處置如耳后部外切開(kāi)和自體組織采集已必不可少。近年來(lái)，提出了使用載有生長(zhǎng)因子的生物相容性支架材料的再生醫(yī)學(xué)性鼓膜再生 方法(例如，參見(jiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn)1)。特別地，已報(bào)道了一些治療案例，其中堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng) 因子(bFGF)用作生長(zhǎng)因子，片狀薄膜如膠原蛋白膜或幾丁質(zhì)膜用作支架材料(非專(zhuān)利文獻(xiàn) 1-3)。此外，還記載了由含bFGF的膠原蛋白的圓柱狀元件制成的用于耳道重建的成型品 (專(zhuān)利文獻(xiàn)2)。作為另一個(gè)不依賴(lài)于外科手術(shù)的鼓膜再生方法，已報(bào)道了下述方法，其中鼓膜的 穿孔部分用羊膜被覆并與纖維蛋白膠粘合(非專(zhuān)利文獻(xiàn)2)。然而，常規(guī)再生醫(yī)學(xué)性療法的效力限于相對(duì)小的鼓膜穿孔與耳道缺陷；這些療法 不適于大于一定尺寸的鼓膜缺陷，以及耳小骨相關(guān)的缺陷，因?yàn)椴荒苄迯?fù)。同時(shí)，明膠海綿在耳病的治療中用作外科手術(shù)止血?jiǎng)?，并且還用作藥物的持續(xù)釋 放載體(專(zhuān)利文獻(xiàn)3)。[現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)][專(zhuān)利文獻(xiàn)]
專(zhuān)利文獻(xiàn)1:國(guó)際專(zhuān)利公開(kāi)No. 2006/007417的小冊(cè)子 專(zhuān)利文獻(xiàn) 2: JP-A-2007-125252
專(zhuān)利文獻(xiàn)3:美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)No. 2007/0160648的說(shuō)明書(shū) [非專(zhuān)利文獻(xiàn)]
非專(zhuān)利文獻(xiàn) 1: Hakuba et al. , Journal of Otolaryngology of Japan, Vol. 110, No. 4，p. 261，2007
非專(zhuān)利文獻(xiàn) 2: Hakuba et al. , Head and Neck Surgery, Vol. 16, No. 1, p. 9-13,
2006
非專(zhuān)利文獻(xiàn) 3: Futai et al. , Journal of Otolaryngology of Japan, Vol. 110, No. 4, p. 299, 2007。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的問(wèn)題
對(duì)于基于再生醫(yī)療技術(shù)的鼓膜和耳道再生方法的開(kāi)發(fā)存在強(qiáng)烈需求，其甚至能夠修復(fù) 傳統(tǒng)上不可避免地依賴(lài)于外科手術(shù)的大的鼓膜穿孔與耳道軟組織缺陷。因此，本發(fā)明的目 的是提供不管缺陷部分的尺寸與位置如何均能夠修復(fù)缺陷的新型鼓膜/耳道再生試劑。解決問(wèn)題的手段
本發(fā)明人進(jìn)行了廣泛的研究以完成上述的目的，并注意到下述事實(shí)，即全部傳統(tǒng)方法 都意圖通過(guò)允許周?chē)M織沿著結(jié)合至鼓膜穿孔或耳道軟組織缺陷的板狀支架材料的基底 延伸來(lái)修復(fù)缺陷部分。因?yàn)橹荚诒举|(zhì)上再生膜組織，所以使用片狀材料作為支架的想法似 乎顯得合理。然而，只有鼓膜穿孔或耳道軟組織缺陷僅位于平坦的部分，修復(fù)才會(huì)是可能 的；然而，鼓膜在形狀上復(fù)雜并具有附著其上的小骨，因此隨著鼓膜缺陷尺寸的增加，將愈 加難于用平坦的片狀材料被覆整個(gè)表面。不能完全被覆缺陷部分將無(wú)法修復(fù)鼓膜，或者將 導(dǎo)致與周?chē)M織粘連，留下后遺癥。耳道軟組織的情況也如此。基于以上原因，本發(fā)明人改變了使用片狀材料的常規(guī)想法，隨著集中于使用能夠 立體地被覆整個(gè)缺陷部分的材料，而采用明膠海綿作為支架材料。具體地，以海綿被覆鼓膜 或耳道的缺陷部分的方式留置浸漬了 bFGF溶液的明膠海綿。因?yàn)槊髂z海綿是通過(guò)分解膠 原蛋白獲得的材料，與膠原蛋白相比具有更大數(shù)目的間隙與更高的自由度，因此它的特征 在于，盡管作為細(xì)胞生長(zhǎng)用支架發(fā)揮作用，但它不會(huì)妨礙細(xì)胞延伸的方向。因此，明膠海綿 旨在使再生組織進(jìn)入明膠海綿并在其中延伸，而不是如常規(guī)那樣使再生組織沿片狀材料的 基底延伸。此外，在該操作中，纖維蛋白膠或海藻酸或它們的鹽被施加于海綿表面，且將該海 綿被覆并固定在缺陷部分上。盡管已知使用生物粘附材料將組織再生用基材固定于周?chē)M 織的技術(shù)，但是本發(fā)明人用被覆材料被覆海綿表面，不僅是作為粘合劑，還是為了使再生部 分與外部隔絕以形成適于體內(nèi)培養(yǎng)環(huán)境的目的。出于相同觀點(diǎn)，當(dāng)鼓膜穿孔與耳道軟組織 缺陷的邊緣老舊時(shí)，則使用手術(shù)刀或蛋白質(zhì)變性劑等使其新鮮化。其結(jié)果，即使是常規(guī)方法不適用的、缺陷涉及大于膜的2/3的鼓膜穿孔和傷口直 徑超過(guò)2 cm的耳道軟組織缺陷，在所有病例中也都觀察到缺陷的閉合與聽(tīng)力的改善，而沒(méi)有觀察到后遺癥。由上可知，本發(fā)明人證實(shí)通過(guò)組合使用載有bFGF的明膠海綿與被覆材料，即使是 對(duì)于常規(guī)不可避免地依賴(lài)于外科手術(shù)的、具有嚴(yán)重鼓膜穿孔或耳道軟組織缺陷的患者，也 可以廉價(jià)、便利且安全地再生鼓膜與耳道，從而開(kāi)發(fā)了本發(fā)明。因此，本發(fā)明如下所述鼓膜或耳道再生試劑，其包括明膠海棉和被覆材料的組合，其中所述明膠海棉載 有堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子。[2] [1]所述的試劑，其中所述被覆材料是纖維蛋白膠或者水溶性高分子多糖或 它們的衍生物。[3] [2]所述的試劑，其中所述水溶性高分子多糖是幾丁質(zhì)、殼聚糖或海藻酸或它 們的鹽。[4] [1]-[3]中任一項(xiàng)所述的試劑，其中鼓膜穿孔和耳道軟組織缺陷的邊緣已被 新鮮化。[5]鼓膜或耳道的再生方法，其包括將載有治療有效量的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因 子的明膠海綿留置在患有鼓膜穿孔或耳道軟組織缺陷的患者的鼓膜穿孔或耳道軟組織缺 陷部分中，并用被覆材料被覆所述海綿。[6] [5]所述的再生方法，其中所述被覆材料是纖維蛋白膠或者水溶性高分子多 糖或它們的衍生物。[7] [6]所述的再生方法，其中所述水溶性高分子多糖是幾丁質(zhì)、殼聚糖或海藻酸 或它們的鹽。[8] [5]- [7]中任一項(xiàng)所述的再生方法，其中所述鼓膜穿孔和耳道軟組織缺陷的 邊緣被預(yù)先新鮮化。[9]被覆材料和明膠海綿所載有的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子用于制備鼓膜或耳 道再生試劑的用途。[10] [9]所述的用途，其中所述被覆材料是纖維蛋白膠或者水溶性高分子多糖或 它們的衍生物。[11] [10]所述的用途，其中所述水溶性高分子多糖是幾丁質(zhì)、殼聚糖或海藻酸或 它們的鹽。[12] [9]-[11]中任一項(xiàng)所述的用途，其中鼓膜穿孔和耳道軟組織缺陷的邊緣已 被新鮮化。發(fā)明效果
通過(guò)使用明膠海綿作為支架材料，可以立體地被覆鼓膜或耳道的整個(gè)缺陷部分以實(shí)現(xiàn) 缺陷部分的完全被覆。另外，鼓膜組織在明膠海綿中前進(jìn)的同時(shí)再生其本身。因此，根據(jù)本 發(fā)明，鼓膜或耳道的修復(fù)即使在大的或者復(fù)雜缺陷的情況下也是可能的。用被覆材料被覆明膠海綿表面防止干燥與感染，使得可以形成與外部隔離的良好 培養(yǎng)環(huán)境。此外，明膠海綿在1個(gè)月內(nèi)在體內(nèi)經(jīng)歷水解并消失，有利于鼓膜與耳道軟組織的再生。
附圖簡(jiǎn)述顯示使用本發(fā)明鼓膜再生試劑的鼓膜再生治療的實(shí)例的圖。A.指出了涉及鼓膜 的約2/3的大穿孔。B.使用鼓膜切開(kāi)刀擦傷鼓膜穿孔的邊緣以在周?chē)纬尚迈r傷口。C.將 載有bFGF的明膠海綿留置在穿孔部分中并用纖維蛋白膠固定。D.在治療后3周，鼓膜穿孔 被上皮完全閉合。E.在治療后6周，該上皮稍微變薄，變得更像鼓膜。F.在治療后12周， 該上皮變得進(jìn)一步像正常的鼓膜。[圖2]顯示使用本發(fā)明耳道再生試劑的耳道再生治療的實(shí)例的圖。A.指出除去了 膽脂瘤的傷口中的軟組織缺陷與骨露出。B.將明膠海綿物質(zhì)浸漬bFGF，并留置bFGF明膠 海綿以使該傷口被完全被覆。C.用海藻酸或其鹽(或纖維蛋白膠)固定該海綿物質(zhì)。D.在 治療后2周，除去殘留于表面的海藻酸或其鹽等；證實(shí)傷口已完全閉合，且以幾乎與正常組 織相同的狀態(tài)實(shí)現(xiàn)了再生。
具體實(shí)施例方式用于本發(fā)明鼓膜/耳道再生試劑中的生長(zhǎng)因子bFGF對(duì)細(xì)胞具有直接增殖作用和 新血管形成能力。鼓膜具有三層結(jié)構(gòu)；為了保證充分發(fā)揮基本的聲音傳導(dǎo)功能，重要的是維 持該三層結(jié)構(gòu)。然而，鼓膜破損和自發(fā)修復(fù)的情形經(jīng)常發(fā)生，其中，鼓膜薄且只有上皮層再 生而三層結(jié)構(gòu)未被維持。對(duì)于其再生，作為支架的成纖維細(xì)胞增殖與維持足以支持三層結(jié)構(gòu)的血流都是必 不可少的。從該觀點(diǎn)出發(fā)，bFGF具有理想的特性。具體地，如其命名所示，bFGF具有刺激 成纖維細(xì)胞增殖的直接作用，并且還具有誘導(dǎo)血管并供應(yīng)營(yíng)養(yǎng)物至周?chē)M織的作用。作為本發(fā)明中的bFGF，可以使用其同源物。本發(fā)明中的bFGF和/或其同源物是作 為天然產(chǎn)品，或者通過(guò)使用微生物或培養(yǎng)細(xì)胞通過(guò)基因重組技術(shù)分離和純化的，或通過(guò)對(duì) 其進(jìn)行化學(xué)修飾或者生物修飾獲得的。作為本發(fā)明中使用的bFGF，特別優(yōu)選人bFGF或其同 源物。bFGF的同源物是指以下多肽[I]或[II]。[I]由與哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生的bFGF基本相同的氨基酸序列構(gòu)成的多肽。這里"基本 相同的氨基酸序列“是指1-6個(gè)氨基酸被其它種類(lèi)的氨基酸置換，并且具有bFGF的生物活 性的氨基酸序列。[II]其中附加氨基酸片斷被附加至哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生的bFGF的N-末端和 /或C-末端，或附加至上述多肽[I]的N-末端和/或C-末端的多肽。附加氨基酸片斷是 指由1- 12個(gè)氨基酸構(gòu)成，且不影響bFGF的生物活性或上述多肽[I]的生物活性的片斷。人bFGF是146個(gè)氨基酸的多肽；在本發(fā)明的制備中，作為人bFGF的同源物(上述 同源物[I])，例如，可以使用日本特表平2-504468中記載的146個(gè)氨基酸的多肽。該多肽 中，構(gòu)成人bFGF的氨基酸序列的69位半胱氨酸(Cys)和87位半胱氨酸(Cys)被絲氨酸( Ser)置換。作為上述同源物[II]，例如可以使用日本特表昭63-500843中公開(kāi)的155個(gè)的多 肽。該多肽中，9個(gè)氨基酸的片斷被添加至人bFGF的N-末端。同時(shí)，可以使用日本特表昭63 - 501953中公開(kāi)的Met-被添加至N-末端的147個(gè) 氨基酸的多肽，以及11個(gè)氨基酸構(gòu)成的片斷被添加至N-末端的157個(gè)氨基酸的多肽。特別優(yōu)選的bFGF是曲弗明(基因重組)。
在本發(fā)明的制備中，可以單獨(dú)使用一種bFGF，或者可以組合使用多種。此外，如上 所述，存在多種bFGF的同源物，并且這些同源物可以單獨(dú)使用或者組合使用。因?yàn)樵诨钌矬w內(nèi)bFGF的豐度非常低，因此為了商業(yè)上穩(wěn)定供應(yīng)本發(fā)明的制劑， 特別優(yōu)選使用通過(guò)基因重組技術(shù)、利用微生物如大腸桿菌或培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生的bFGF或其同 源物。當(dāng)用于產(chǎn)生bFGF或其同源物的基因(在該情況下，通常為上述多肽(I))被插入到微 生物或培養(yǎng)細(xì)胞中，由該微生物或培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生的產(chǎn)品通常為具有添加至bFGF的N-末端 和/或C-末端、或者添加至上述多肽[I]的N-末端和/或C-末端的附加氨基酸片斷的， 即上述多肽[II]。用作本發(fā)明中明膠海綿的原材料的明膠的選擇不受特別限制；可以使用任何通常 可使用的。例如，可以提及通過(guò)用酸或堿處理牛、豬、雞、鮭魚(yú)等的骨、韌帶、腱或皮膚，用水 加熱萃取獲得的粗膠原蛋白等。不僅可以使用一種明膠，還可以以適當(dāng)?shù)墓不煳锸褂镁哂?不同材料和不同物理性質(zhì)如溶解性、分子量和等電點(diǎn)的明膠。用于本發(fā)明中的明膠海綿可被交聯(lián)以提高其耐水性，以便使之用作支架用于再生 組織以足以閉合鼓膜或耳道中的缺陷的時(shí)期，只要其不喪失能夠完全被覆形狀復(fù)雜的鼓膜 穿孔邊緣和耳道缺陷的邊緣的柔軟性。交聯(lián)的方法不受特別限制；實(shí)例包括涉及使用交聯(lián) 劑、真空熱脫水、干燥加熱、Y -射線輻照、紫外線輻照、電子射線輻照、X射線輻照等的方法。本發(fā)明的明膠海綿具有許多細(xì)孔，并且提供比膠原蛋白更高的自由度。通過(guò)具有 大量細(xì)孔，當(dāng)用作支架材料時(shí)，明膠海綿使得周?chē)?xì)胞容易進(jìn)入海綿，使得可以以良好的方 式再生鼓膜和耳道。這與使用片狀支架材料制備的常規(guī)再生試劑明顯不同。具體地，對(duì)于 如片狀膠原蛋白膜的支架，組織不會(huì)在支架中前進(jìn)時(shí)將自身再生，而是會(huì)向上或向下地將 自身再生。這不能完全被覆大于一定尺寸的鼓膜缺陷的缺陷部分，因此不能修復(fù)鼓膜，或出 現(xiàn)與周?chē)M織的粘連并留下后遺癥?？紤]到細(xì)胞容易進(jìn)入海綿而確保良好的細(xì)胞粘附的事實(shí)，優(yōu)選本發(fā)明的明膠海綿 的細(xì)孔平均孔徑為大約10微米或更大，為防止低細(xì)胞密度所致的鼓膜或耳道再生速率的 降低，優(yōu)選平均直徑為約500微米或更小。更優(yōu)選的范圍為約100 -約400微米。本發(fā)明的明膠海綿可以含有其他生物可吸收高分子材料，只要其功能不受負(fù)面影 響。這類(lèi)生物可吸收高分子材料例如包括合成高分子，如聚乳酸、聚乙醇酸、聚-ε -己內(nèi) 酯、乳酸-乙醇酸共聚物、乙醇酸-ε -己內(nèi)酯共聚物、乳酸-ε -己內(nèi)酯共聚物、聚檸檬酸、 聚蘋(píng)果酸、聚-α-氰基丙烯酸酯、聚-β-羥基酸、聚乙二酸三亞甲基酯、聚乙二酸四亞甲基 酯、聚-鄰-酯、聚-鄰-碳酸酯、聚碳酸亞乙酯、聚-Y-苯甲基-L-谷氨酸酯、聚-Y -甲 基-L-谷氨酸酯和聚L-丙氨酸；天然高分子，如多糖比如淀粉、海藻酸、透明質(zhì)酸、幾丁質(zhì)、 果膠酸和它們的衍生物；以及蛋白質(zhì)比如明膠、膠原、白蛋白、和纖維蛋白等。本發(fā)明的明膠海綿可以通過(guò)例如下列制備利用均化器以大約3000-大約 IOOOOrpm的轉(zhuǎn)速將明膠水溶液攪拌并起泡大約10秒至大約5分鐘，然后將明膠水溶液澆 注至適當(dāng)大小的模具中，并在大約-40至大約-80°C下冷凍大約30-大約120分鐘，之后，在 例如大約0. 1托的條件下冷凍干燥該冷凍物質(zhì)。如果明膠水溶液的濃度過(guò)高，則獲得的明 膠海綿的柔軟度降低，因此優(yōu)選將濃度調(diào)節(jié)至例如大約3w/w%或更少。如果需要進(jìn)一步交 聯(lián)，則可以酌情施行交聯(lián)。作為本發(fā)明的明膠海綿，可以使用市售的止血?jiǎng)?例如Spongel (注冊(cè)商標(biāo))(Astellas Pharma )、Gelfoam (注冊(cè)商標(biāo))(Pharmacia & Upjohn )等)。本發(fā)明的明膠海綿的形狀和大小不受特別限制，只要足夠大至被覆病人鼓膜或者 耳道的缺陷部分。使這樣制備的明膠海綿載有bFGF的方法不受特別限定，例如可以將bFGF的水 溶液逐滴添加至明膠海綿，或者可以通過(guò)添加bFGF的水溶液使明膠海綿膨脹。明膠海綿載有bFGF的量不受特別限定，只要它的量足以再生鼓膜或者耳道，例如 其可以是每個(gè)給藥位置大約0.1-大約lOOOPg，優(yōu)選大約1-大約lOOPg。這樣獲得的載有bFGF的明膠海綿制品還可以被冷凍干燥。如果需要，可以通過(guò)例 如在液氮中冷凍制品30分鐘或更久，或者在-80°C下冷凍制品1小時(shí)或更久，然后利用冷凍 干燥設(shè)備干燥所述制品1-3天來(lái)進(jìn)行冷凍干燥。本發(fā)明的鼓膜/耳道再生試劑適用于所有情況，只要病人的鼓膜穿孔或者耳道缺 陷不伴隨中耳/外耳的活動(dòng)性感染/炎癥。例如，鼓膜穿孔的情形包括慢性中耳炎，鼓膜閉 合外科手術(shù)或者鼓室成形術(shù)之后再穿孔，陳舊外傷鼓膜穿孔，滲出性中耳炎的鼓膜切開(kāi)或 鼓膜管留置后的穿孔殘留等。耳道軟組織缺陷的癥例包括在耳道膽脂瘤切除、鼓室成形術(shù) 或者耳道腫瘤切除之后具有耳道軟組織缺陷和耳道骨露出的那些。本發(fā)明的鼓膜/耳道再生試劑可特別優(yōu)選用于利用常規(guī)再生醫(yī)學(xué)技術(shù)的療法不 適用的、患有大的鼓膜穿孔或耳道軟組織缺陷的患者。特別地，對(duì)于鼓膜的大于1/3特別 是大于2/3是缺陷的患有鼓膜穿孔的患者，鼓膜修復(fù)是可能的。對(duì)于患有最大直徑為Icm 或更大、特別是2cm或更大的耳道軟組織缺陷的患者，耳道修復(fù)是可能的。將載有bFGF的明膠海綿調(diào)節(jié)至比鼓膜或耳道缺陷部分大的尺寸，并以被覆整個(gè) 缺陷部分的方式留置。這里，在缺陷部分的老舊邊緣情形中，期望該邊緣被新鮮化以促進(jìn)組 織再生。新鮮化的方法包括，例如，通過(guò)利用手術(shù)刀等磨傷邊緣，或通過(guò)利用具有蛋白質(zhì)變 性效果的藥物如乙酸鋁或高濃度局部麻醉劑的處理來(lái)除去邊緣的上皮的方法。該基于藥物的方法在耳道形狀狹窄造成鼓膜穿孔的邊緣難以新鮮化的情形中特 別有效；首先，將含有乙酸鋁的明膠海綿留置于缺陷部分，并在大約30分鐘后將其除去。之 后，用4%鹽酸利多卡因進(jìn)行麻醉，之后將邊緣的變性組織(變色為白色)最大可能程度地除 去，由此實(shí)現(xiàn)新鮮化。本發(fā)明的進(jìn)一步特征在于下列事實(shí)將留置于缺陷中的載有bFGF的明膠海綿的 表面用被覆材料被覆。作為本發(fā)明中使用的被覆材料，可以使用任何生物相容性材料，只 要其具有足以將載有bFGF的明膠海綿保持固定在鼓膜或者耳道的缺陷部分上的粘性， 并且能夠通過(guò)與外部環(huán)境隔離而為該海綿的表面和內(nèi)部提供適于再生組織的細(xì)胞的培 養(yǎng)環(huán)境；實(shí)例包括纖維蛋白膠(血液纖維蛋白原和凝血酶提取物；可作為Bolheal (注 冊(cè)商標(biāo))(AstellasPharma)、TISSEEL (注冊(cè)商標(biāo))(Baxter)或者 Beriplast (注冊(cè)商標(biāo)) (CSLBehring)而商業(yè)地獲得)、海藻酸或其鹽(例如海藻酸鈣、海藻酸鈉)和水溶性高分子 多糖如幾丁質(zhì)和殼聚糖。作為制備海藻酸鹽(海藻酸鈣)并將其形成為膜狀的方法，例如，將3.3ml的洲海 藻酸鈉水溶液均勻地澆鑄，以使IOml容量的皮氏培養(yǎng)皿的整個(gè)底面與該水溶液接觸。之 后，將5ml的3%氯化鈣水溶液均勻地鋪展在同一皮式培養(yǎng)皿以使海藻酸鈉的水溶液和氯化 鈣的水溶液彼此充分接觸，之后等待數(shù)分鐘。在除去剩余的液體后，用蒸餾水清洗培養(yǎng)皿并使之自然干燥，由此制備出海藻酸鈣膜。干燥后將膜剝離，形成適當(dāng)尺寸，并用EO氣體滅 菌，由此海藻酸鹽可被制備為被覆材料。當(dāng)被覆材料是液體時(shí)，可以通過(guò)將數(shù)滴被覆材料滴在留置于缺陷部分中的載有 bFGF的明膠海綿的表面上，或者通過(guò)利用本來(lái)已知的噴霧器噴霧被覆材料來(lái)進(jìn)行給予。當(dāng) 被覆材料是片狀物質(zhì)時(shí)，可以將其以被覆留置于缺陷部分中的載有bFGF的明膠海綿的表 面的方式放置。以下，借助下述實(shí)施例更具體地說(shuō)明本發(fā)明，但并不以任何方式限制本發(fā)明。 實(shí)施例實(shí)施例1鼓膜的再生 1)患者選擇
研究對(duì)象包括各種被證實(shí)患有鼓膜穿孔且在中耳/外耳中沒(méi)有活動(dòng)性感染或炎癥的 患者，包括慢性中耳炎癥例(n=9)，鼓膜閉合外科手術(shù)或鼓室成形術(shù)后再穿孔癥例(n=7)， 陳舊外傷性鼓膜穿孔癥例(n=5)，滲出性中耳炎的鼓膜切開(kāi)或鼓膜管留置后殘留穿孔癥例 (H=IO)等。鼓膜穿孔尺寸不重要。根據(jù)鼓膜穿孔的尺寸將患者分成三組。具體地，涉及整個(gè)鼓膜的小于1/3、1/3-2/3 以及大于2/3的鼓膜穿孔患者分別分類(lèi)為I級(jí)、II級(jí)和III級(jí)。2)治療方法和跟進(jìn)檢查
在證實(shí)存在鼓膜穿孔和沒(méi)有活動(dòng)性感染和炎癥之后，將浸有4%鹽酸利多卡因的棉花 插入耳道中，以使之與鼓膜的穿孔部分接觸。大約15分鐘后，在顯微鏡下，使用鼓膜切開(kāi) 刀等磨傷鼓膜穿孔邊緣，并除去周?chē)┛走吘壍纳掀?

圖1B)。隨后，將大于鼓膜穿孔的明 膠海綿(Spongel (注冊(cè)商標(biāo))=Astellas )塊浸漬bFGF (Fiblast (注冊(cè)商標(biāo))=Kaken Pharmaceutical )，并將載有bFGF的明膠海綿留置，以使鼓膜的穿孔部分被完全被覆(圖 1C)。此后，用數(shù)滴纖維蛋白膠periplast注冊(cè)商標(biāo))CSL Behring )將其固定。在治療后，指導(dǎo)患者不要進(jìn)行任何對(duì)他們的耳朵施加壓力的事情，如劇烈吸鼻子 和鼻子呼氣，并且不可在洗頭和洗澡時(shí)讓水進(jìn)入他們的耳朵。三周后的檢查顯示殘留于表面的被覆材料和明膠海綿的牢固粘附；當(dāng)使用Rosen 探針等將其小心除去時(shí)，在其下觀察到了再生的鼓膜(圖1D)。通過(guò)單次治療不能閉合穿孔 時(shí)，重復(fù)相同的治療。此時(shí)，再生的鼓膜作為厚的、富含血管的組織出現(xiàn)，但它們會(huì)隨著時(shí)間經(jīng)過(guò)而變薄 (圖1E)，并在2個(gè)月后變得與正常鼓膜難以分辨(圖1F)。3)結(jié)果
對(duì)于沈個(gè)對(duì)象的31只耳朵通過(guò)該方法進(jìn)行鼓膜再生治療。結(jié)果示于表1。將結(jié)果按 照完成閉合所需的治療次數(shù)、閉合率、聽(tīng)力改善程度、除去麻醉時(shí)間的治療時(shí)間和后遺癥的 有無(wú)，通過(guò)穿孔尺寸(I級(jí)-III級(jí))進(jìn)行總結(jié)。將僅浸漬生理鹽水而未使用bFGF的明膠海 綿留置于鼓膜穿孔部分的5個(gè)患者的結(jié)果示于表2。
權(quán)利要求
1.鼓膜或耳道再生試劑，其包括明膠海棉和被覆材料的組合，所述明膠海棉載有堿性 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑，其中，所述被覆材料是纖維蛋白膠或水溶性高分子多糖或 其衍生物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的試劑，其中，所述水溶性高分子多糖是幾丁質(zhì)、殼聚糖或海藻酸或其鹽。
4.4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的試劑，其中鼓膜穿孔和耳道軟組織缺陷的邊緣已被 新鮮化。
5.鼓膜或耳道的再生方法，其包括將載有治療有效量堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的明膠 海綿留置于患有鼓膜穿孔或耳道軟組織缺陷的患者的鼓膜穿孔或耳道軟組織缺陷部分中， 并用被覆材料被覆所述海綿。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的再生方法，其中，所述被覆材料是纖維蛋白膠或水溶性高分子多 糖或其衍生物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的再生方法，其中，所述水溶性高分子多糖是幾丁質(zhì)、殼聚糖或海藻 酸或其鹽。
8.根據(jù)權(quán)利要求5-7中任一項(xiàng)的再生方法，其中，所述鼓膜穿孔和耳道軟組織缺陷的 邊緣被預(yù)先新鮮化。
9.被覆材料和由明膠海綿所載有的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子用于制備鼓膜或耳道再 生試劑的用途。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的用途，其中，所述被覆材料是纖維蛋白膠或者水溶性高分子多糖 或其衍生物。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的用途，其中，所述水溶性高分子多糖是幾丁質(zhì)、殼聚糖或海藻酸 或其鹽。
12.根據(jù)權(quán)利要求9-11中任一項(xiàng)的用途，其中，鼓膜穿孔和耳道軟組織缺陷的邊緣已 被新鮮化。
全文摘要
提供鼓膜或耳道再生試劑，其包括明膠海綿和被覆材料的組合，所述明膠海綿載有堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)。被覆材料不僅用于將所述明膠海綿固定至患處，而且用于防止干燥和感染的目的，以提供與外部隔離的適于再生組織的培養(yǎng)環(huán)境。為促進(jìn)組織再生，鼓膜或耳道缺陷的邊緣優(yōu)選被預(yù)先新鮮化。
文檔編號(hào)A61K47/36GK102131478SQ200980133310
公開(kāi)日2011年7月20日 申請(qǐng)日期2009年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月26日
發(fā)明者金丸真一 申請(qǐng)人:科研制藥株式會(huì)社, 金丸真一