專(zhuān)利名稱(chēng)：同時(shí)誘導(dǎo)CTL和γδT細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在癌治療中同時(shí)且有效地培養(yǎng)抗原特異的CTL和γ δτ細(xì)胞的技術(shù)。 更具體地，本發(fā)明涉及使用該培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)的細(xì)胞的醫(yī)藥用途。
背景技術(shù)：
近來(lái)，免疫細(xì)胞療法作為包括癌癥在內(nèi)的難治性疾病的新療法而受到關(guān)注。免疫 細(xì)胞療法是收集并活化患者自身的免疫細(xì)胞，特別是白細(xì)胞，然后再將它們返回患者體內(nèi) 來(lái)人工地增強(qiáng)免疫力。與常規(guī)的抗癌劑治療等比較，這種療法具有減少的副作用的優(yōu)點(diǎn)。作為免疫細(xì)胞療法，活化自體淋巴細(xì)胞的療法已經(jīng)普及，所述療法涉及體外用淋 巴因子實(shí)施抗原非特異地活化淋巴細(xì)胞，然后將它們返回身體；但是，需要獲得利用細(xì)胞毒 性T淋巴細(xì)胞(下文中稱(chēng)為CTL)的療法，其中所述細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞具有更強(qiáng)的細(xì)胞毒 活性并特異地識(shí)別和破壞病變。這里，作為當(dāng)前嘗試的利用CTL的治療法，例如采用直接將癌抗原肽等施與患者 的方法；但是，在這種情況下，由于患者通常具有低下的免疫力，其誘導(dǎo)CTL的能力需要提 高。因此，有樹(shù)狀細(xì)胞疫苗療法等，所述療法涉及將抗原與抗原呈遞細(xì)胞如樹(shù)狀細(xì)胞(下文 中也稱(chēng)為DC)等接觸，并因此強(qiáng)烈地引起細(xì)胞呈遞抗原，由DC在體內(nèi)誘導(dǎo)疾病抗原特異的 CTL。下面顯示的是一些目前誘導(dǎo)疾病抗原特異的CTL的典型方法。例如，在非專(zhuān)利文獻(xiàn)1和2中，將9-mer肽如特定疾病抗原的表位添加至外周血單 核細(xì)胞來(lái)嘗試由其誘導(dǎo)CTL。此外，在非專(zhuān)利文獻(xiàn)3和4中，從外周血單核細(xì)胞獲得DC并向 其添加抗原肽，來(lái)賦予抗原呈遞功能；將自外周血淋巴細(xì)胞分離的CD8陽(yáng)性T細(xì)胞與所獲得 的DC —同培養(yǎng)來(lái)誘導(dǎo)疾病抗原特異的CTL。進(jìn)一步地，在非專(zhuān)利文獻(xiàn)5中，使用獲自造血前體細(xì)胞的DC和抗原肽進(jìn)行DC接 種，然后將向其添加了抗原的單核細(xì)胞來(lái)源的DC與分離自外周血單核細(xì)胞的CD8陽(yáng)性T細(xì) 胞共培養(yǎng)以誘導(dǎo)抗原特異的CTL。從上述例子中它們的用途可以獲知，在其它抗原呈遞細(xì)胞中，樹(shù)狀細(xì)胞具有高的 抗原呈遞能力并且能夠誘導(dǎo)疾病抗原特異的CTL，因此，正在進(jìn)行獲得它們的技術(shù)開(kāi)發(fā)。但是，為了獲得用于樹(shù)狀細(xì)胞接種的樹(shù)狀細(xì)胞，通常需要收集人外周血，從外周血 分離稱(chēng)為單核細(xì)胞的細(xì)胞，并在添加IL-4、GM-CSF等后培養(yǎng)它們。該方法繁瑣并且目前存 在這樣的問(wèn)題，取決于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)人員的水平，所培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)量和功能是變化的。Y δ T細(xì)胞是非肽抗原活化的細(xì)胞，是負(fù)責(zé)天然免疫的細(xì)胞；近來(lái)發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞 對(duì)癌細(xì)胞具有MHC非限制性細(xì)胞毒活性(非特異的活性)。因此，研究了使用這些Y δΤ細(xì) 胞的強(qiáng)抗癌活性的免疫療法。由于Y δ T細(xì)胞通過(guò)識(shí)別非肽抗原而活化，它們可以被例如烷基胺或二膦酸作為 非肽抗原刺激，從而活化和/或增殖；已經(jīng)在體外引起分離自外周血的Y ST細(xì)胞識(shí)別非肽 抗原來(lái)研究其活化和/或增殖(例如，非專(zhuān)利文獻(xiàn)6)。
但是，問(wèn)題是γ δ T細(xì)胞通常在外周血中以?xún)H1至5%的量存在，收集少量的血液 然后從其活化和/或增殖Y ST細(xì)胞不能確保Y δT細(xì)胞的純度和數(shù)量足夠用于治療。增 加自患者收集的血液量來(lái)確保Y ST細(xì)胞的純度和數(shù)量足夠用于治療也有對(duì)患者是一個(gè) 很大的負(fù)擔(dān)的問(wèn)題。專(zhuān)利文獻(xiàn)1也公開(kāi)了通過(guò)添加二膦酸至外周血單核細(xì)胞來(lái)活化和/或增殖Y δ T 細(xì)胞的方法。因此更有效的細(xì)胞培養(yǎng)和利用對(duì)免疫細(xì)胞療法是重要的；現(xiàn)在正在進(jìn)行多種多樣 的方法和技術(shù)的研發(fā)。此外，在免疫細(xì)胞療法中現(xiàn)在是主要培養(yǎng)一種類(lèi)型的細(xì)胞并用于治療；但是，考慮 到如上所述的例如疾病抗原特異的CTL以MHC限制性方式，例如，特異地針對(duì)MHC I類(lèi)呈遞 的抗原，攻擊目標(biāo)細(xì)胞或組織；和、S T細(xì)胞以MHC非限制性方式攻擊細(xì)胞或組織，可以混 合多種細(xì)胞并用于治療。但是，在實(shí)踐中，對(duì)于培養(yǎng)多種類(lèi)型的免疫細(xì)胞用于治療，不得不對(duì)多種細(xì)胞類(lèi)型 同時(shí)平行地實(shí)施培養(yǎng)步驟。適用于每一類(lèi)型細(xì)胞的培養(yǎng)條件相互間不相同；如果使用常規(guī) 的適用于一種類(lèi)型細(xì)胞的培養(yǎng)方法，它將非常難于例如同時(shí)且有效地培養(yǎng)足夠數(shù)量的疾病 抗原特異的CTL和γ δ T細(xì)胞來(lái)發(fā)揮治療效果；目前還沒(méi)有這樣的有效培養(yǎng)方法和誘導(dǎo)方 法?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn)1 :W0 2006/006720非專(zhuān)利文獻(xiàn)非專(zhuān)利文獻(xiàn) 1 =Sugiyama H.等人，Cancer Immunol. Immunother.，2002 年 12 月； 51(11-12) :614-20. Epub，2002 年 10 月 18 日。非專(zhuān)利文獻(xiàn)2 =Appella E.等人，J. Immunol.，1995 年 3 月 1 日；154(5) :2257-65非專(zhuān)利文獻(xiàn)3 =Fujita S.等人，Blood，2000 年 1 月 1 日；95(1) :286_93。非專(zhuān)利文獻(xiàn)4 =Yasukawa M.等人，Clin. Cancer Res.，2002 年 8 月；8(8) 2626-31。非專(zhuān)利文獻(xiàn)5 =Palucka AK.等人，J. Exp. Med.，2004 年 6 月 7 日；199 (11) 1503-11，Epub，2004 年 6 月 1 日.非專(zhuān)利文獻(xiàn) 6:Fumi Miyagawa 等人，The Journal of Immunology, 2001 ； 166 (9) 5508-5514。發(fā)明概述技術(shù)問(wèn)題鑒于上述情形，本發(fā)明的課題是在一步培養(yǎng)中同時(shí)且有效地誘導(dǎo)和培養(yǎng)足夠數(shù)量 的疾病抗原特異的CTL和γ δ T細(xì)胞用于發(fā)揮治療效果。解決問(wèn)題的手段本發(fā)明人為了解決這些問(wèn)題進(jìn)行了多種研究，并發(fā)明了本發(fā)明。本發(fā)明如下。(1)同時(shí)誘導(dǎo)疾病抗原特異的CTL和Y δ T細(xì)胞的方法，特征在于，包括以下步驟 添加疾病抗原和氨基二膦酸至外周血并培養(yǎng)所得到的外周血；( 根據(jù)項(xiàng)(1)的同時(shí)誘導(dǎo)
4疾病抗原特異的CTL和γ δ T細(xì)胞的方法，其中添加疾病抗原和氨基二膦酸的步驟在培養(yǎng) 開(kāi)始第1日實(shí)施；(3)根據(jù)項(xiàng)(1)或(2)的同時(shí)誘導(dǎo)疾病抗原特異的CTL和γ δ T細(xì)胞的方 法，其中氨基二膦酸是帕米膦酸(pamidronic acid)、阿侖膦酸(alendronic acid)、唑來(lái)膦 酸(zoledronic acid)、禾丨J塞膦酸(risedronic acid)、伊班膦酸(ibandronic acid)、英卡 膦酸(incadronic acid)、其鹽和/或其水合物；(4)根據(jù)項(xiàng)(1)至( 任一項(xiàng)的同時(shí)誘導(dǎo) 疾病抗原特異的CTL和γ δ T細(xì)胞的方法，其中疾病抗原是癌抗原；(5)根據(jù)項(xiàng)(1)至(4) 任一項(xiàng)的同時(shí)誘導(dǎo)疾病抗原特異的CTL和γ δ T細(xì)胞的方法，其中同時(shí)添加疾病抗原和氨 基二膦酸；(6)醫(yī)藥品，其包含通過(guò)項(xiàng)⑴至(5)任一項(xiàng)的方法獲得的疾病抗原特異的CTL 和Y δΤ細(xì)胞；和(7)治療/預(yù)防方法，其包括施與通過(guò)項(xiàng)(1)至( 任一項(xiàng)的方法獲得的 疾病抗原特異的CTL和γ δ T細(xì)胞。作為研究結(jié)果，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在外周血中通過(guò)氨基二膦酸活化的Y δ T細(xì)胞增殖 并且這些活化和增殖的Y S T細(xì)胞顯示發(fā)揮APC(抗原呈遞細(xì)胞)的功能，其呈遞疾病抗原 并也促進(jìn)疾病抗原特異的CTL的誘導(dǎo)，從而完成了本發(fā)明。發(fā)明的效果在用于疾病抗原特異的CTL和Y δ T細(xì)胞的培養(yǎng)和誘導(dǎo)的常規(guī)方法中，通過(guò)多個(gè) 步驟獲得所希望的細(xì)胞和然后開(kāi)始培養(yǎng)；但是，本發(fā)明在一步培養(yǎng)中能夠同時(shí)且有效地提 供疾病抗原特異的CTL和γ δ T細(xì)胞，無(wú)需自外周血分離細(xì)胞；并且甚至能夠獲得含有大量 治療效果極好的細(xì)胞的細(xì)胞群體。通過(guò)這種誘導(dǎo)方法獲得的疾病抗原特異的CTL和γ δ T 細(xì)胞的混合細(xì)胞群體能夠提供較施與單一種免疫細(xì)胞作為醫(yī)藥品的常規(guī)治療而言更高效 的治療。特別地，至今為止CTL的誘導(dǎo)需要以下步驟(1)從血液分離單核細(xì)胞；(2)添加 細(xì)胞因子來(lái)誘導(dǎo)樹(shù)狀細(xì)胞；(3)用抗原脈沖樹(shù)狀細(xì)胞；和(4)共培養(yǎng)抗原脈沖的樹(shù)狀細(xì)胞和 淋巴細(xì)胞來(lái)誘導(dǎo)CTL。但是，使用本發(fā)明能夠省略誘導(dǎo)樹(shù)狀細(xì)胞的步驟，這能減輕工作量，也 能減少污染風(fēng)險(xiǎn)，并能進(jìn)一步地將樹(shù)狀細(xì)胞誘導(dǎo)期間(約7天)縮短。實(shí)施發(fā)明的最佳方案以下對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行說(shuō)明。<第一實(shí)施方案本發(fā)明的同時(shí)誘導(dǎo)疾病抗原特異的CTL和Y δ T細(xì)胞的方法>本發(fā)明的同時(shí)誘導(dǎo)疾病抗原特異的CTL和Y δ T細(xì)胞的方法(下文中也簡(jiǎn)稱(chēng)為 “本發(fā)明的誘導(dǎo)方法”)的特征在于包括以下步驟，添加疾病抗原和氨基二膦酸至外周血并 培養(yǎng)所得到的外周血。雖然一直以來(lái)在相同培養(yǎng)步驟中獲得治療有效量的疾病抗原特異的CTL和Y δ T 細(xì)胞是非常困難的，但是本發(fā)明的誘導(dǎo)方法使得這些類(lèi)型的細(xì)胞通過(guò)上述步驟簡(jiǎn)單高效地獲得。根據(jù)本發(fā)明的誘導(dǎo)方法，將外周血中的Y δ T細(xì)胞用氨基二膦酸活化和增殖，并 且這些活化且增殖的Y S T細(xì)胞也顯示發(fā)揮APC的功能，其呈遞疾病抗原并誘導(dǎo)疾病抗原 特異的CTL。此外，具有APC功能的γ δ T細(xì)胞不僅只是作為APC發(fā)揮作用，而且甚至在疾 病抗原特異的CTL增殖后γ δ T細(xì)胞仍繼續(xù)增殖，從而使得能獲得發(fā)揮治療效果的足夠量 的這兩種類(lèi)型的細(xì)胞。以下描述本發(fā)明的誘導(dǎo)方法的具體操作。
1)收集血液來(lái)提供外周血。所需要的量是15至25mL。這個(gè)量使得能夠合適地培 養(yǎng)血液。但是，不將培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)的外周血的足夠量限制在此范圍，并且由于較大量的血液收 集增加了收集的疾病抗原特異的CTL和γ δ T細(xì)胞的數(shù)量，優(yōu)選地收集較大量的血液，條件 是對(duì)所收集血液的供體的負(fù)擔(dān)小。2)通過(guò)例如密度梯度離心獲得外周血單核細(xì)胞。能夠獲得的外周血單核細(xì)胞數(shù)量 是從15至25mL外周血獲得約1至2X IO7個(gè)外周血單核細(xì)胞。3)將2)中獲得的外周血單核細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)基AIM-V(Invitrogen)中。本文中 將懸浮了外周血單核細(xì)胞的溶液稱(chēng)為細(xì)胞懸液。除了上述培養(yǎng)基之外，也可以使用市售的 用于細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基如RPMI-1640培養(yǎng)基(Invitrogen) ,Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基 (Invitrogen ；下文中稱(chēng)為DMEM)、或Iscove培養(yǎng)基(Invitrogen ；下文中稱(chēng)為IMEM)。4)將幻中獲得的細(xì)胞懸液接種在燒瓶、袋或板中。5)將氨基二膦酸以濃度0. 05至100 μ Μ,優(yōu)選地0. 1至30 μ M添加至接種在燒瓶、 袋或板中的外周血單核細(xì)胞。本文中，二膦酸是焦磷酸的類(lèi)似物，并且是焦磷酸骨架P-O-P的0(氧原子)被 C(碳原子)替換后的化合物(P-C-P)。二膦酸通常用作骨質(zhì)疏松的治療藥。氨基二膦酸是 指二膦酸中具有N(氮原子)的化合物。例如，不特別限制在本發(fā)明中使用的氨基二膦酸； 可以使用在WO 2006/006720和W02007/(^9689中公開(kāi)的氨基二膦酸等。其具體例子包括 帕米膦酸、其鹽和/或它們的水合物；阿侖膦酸、其鹽和/或它們的水合物；和唑來(lái)膦酸、其 鹽和/或它們的水合物。氨基二膦酸的濃度，對(duì)帕米膦酸、其鹽和/或它們的水合物優(yōu)選地 是1至30 μ M，對(duì)阿侖膦酸、其鹽和/或它們的水合物優(yōu)選地是1至30 μ Μ，和對(duì)唑來(lái)膦酸、 其鹽和/或它們的水合物優(yōu)選地是0. 1至10 μ Μ。在本文中，以添加5 μ M唑來(lái)膦酸作為例 子。6)在添加幻中的氨基二膦酸時(shí)，一同添加疾病抗原。在本文中，“疾病”是例如癌 癥或感染癥。不特別地限制癌癥，包括任意癌癥；例如難治性癌癥。感染癥的例子包括病毒 感染癥如AIDS或者乙型或丙型肝炎、細(xì)胞感染、細(xì)菌感染、真菌感染或原蟲(chóng)感染。作為抗原的形式，根據(jù)需要可以使用肽、蛋白質(zhì)等。也可以使用癌細(xì)胞或感染細(xì)胞 的細(xì)胞裂解物、凋亡細(xì)胞、壞死細(xì)胞和它們的熱處理產(chǎn)物等?？乖梢允莵?lái)自患者(例如，通過(guò)外科手術(shù)從患者分離出的腫瘤組織等)的、或者 是合成的。與使用自患者自身癌組織等收獲癌抗原相比較，使用合成肽能夠減輕患者的負(fù) 擔(dān)。添加的量，如果是肽的話，添加0. 02 M 2 μ g/ml左右。例如，添加2μ g/ml。不特別地限制氨基二膦酸和疾病抗原的添加順序，它們可以同時(shí)添加，或者先添 加任一者；但是，優(yōu)選同時(shí)添加。6)此外，向上述培養(yǎng)基中添加IL-2至濃度為50至2000U/mL，更優(yōu)選地400至 1000U/mL。7)添加IL-2后，在；34至38°C，更優(yōu)選地在37°C，在2至10%，更優(yōu)選地5% CO2 存在下培養(yǎng)。此時(shí)，根據(jù)所培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)量，適當(dāng)?shù)靥砑优囵B(yǎng)基。此外，隨著培養(yǎng)基的增加， 適當(dāng)?shù)靥砑覫L-2至濃度為50至2000U/mL，更優(yōu)選地400至1000U/mL。8)進(jìn)一步地，向上述培養(yǎng)液添加0. 1至20%量的血清。作為血清，可以使用例如胎牛血清(下文中稱(chēng)為FCQ、AB血清或者自體血漿。以這種方式，當(dāng)培養(yǎng)期間是7天或7天以上時(shí)，能夠以高純度獲得包含疾病抗原特 異的CTL和γ δ T細(xì)胞的細(xì)胞群體；但是，培養(yǎng)優(yōu)選地進(jìn)行約14天，以進(jìn)一步地增加細(xì)胞數(shù)。在上述培養(yǎng)步驟期間優(yōu)選地將血漿添加至培養(yǎng)液。添加時(shí)間大概是在培養(yǎng)開(kāi)始后 0至100小時(shí)，使得能夠滿(mǎn)意地進(jìn)行培養(yǎng)。<第二實(shí)施方案包含疾病抗原特異的CTL和Y δ T細(xì)胞的醫(yī)藥品>本發(fā)明的醫(yī)藥品是包含疾病抗原特異的CTL和γ δ T細(xì)胞的醫(yī)藥品，是在培養(yǎng)開(kāi) 始時(shí)通過(guò)添加疾病抗原和氨基二膦酸至外周血而進(jìn)行培養(yǎng)獲得的醫(yī)藥品?，F(xiàn)有的免疫細(xì)胞療法使用單一類(lèi)型的細(xì)胞，或者通過(guò)在施用時(shí)混合分別培養(yǎng)的細(xì) 胞后或同時(shí)地添加分別培養(yǎng)的細(xì)胞而使用多種類(lèi)型的細(xì)胞。相反，本發(fā)明的醫(yī)藥品是通過(guò)本發(fā)明的誘導(dǎo)方法同時(shí)培養(yǎng)疾病抗原特異的CTL和
YS T細(xì)胞，這使得能夠非常簡(jiǎn)單地獲得較多的細(xì)胞數(shù)。使用此類(lèi)醫(yī)藥品具有這樣的優(yōu)點(diǎn)， 它比常規(guī)使用的單一類(lèi)型的免疫細(xì)胞具有更高的治療功效，因?yàn)榧膊】乖禺惖腃TL和
YST細(xì)胞之間的協(xié)同作用。下面具體描述本發(fā)明的醫(yī)藥品。1)通過(guò)本發(fā)明的培養(yǎng)方法獲得的細(xì)胞通過(guò)離心法等回收。2)將回收的細(xì)胞用洗凈液洗凈。洗凈液優(yōu)選地是與細(xì)胞滲透壓相等的等滲液，并 且更優(yōu)選地是能夠用于醫(yī)藥品的液體。在本文中，考慮到它施用至患者，優(yōu)選使用例如生理 鹽水或PBS (磷酸鹽緩沖的生理鹽水)。3)洗凈后獲得的主要含有疾病抗原特異的CTL和γ δ T細(xì)胞的淋巴細(xì)胞群體通過(guò) 離心法等回收，并懸浮于用作醫(yī)藥品的液體例如生理鹽水中，以制備本發(fā)明的醫(yī)藥品。在本 文中，用于懸浮的液體的用量根據(jù)施用的細(xì)胞數(shù)和施用方法進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。本發(fā)明的醫(yī)藥品中所使用的主要含有疾病抗原特異的CTL和Y δ T細(xì)胞的淋巴細(xì) 胞群體的細(xì)胞數(shù)根據(jù)施用方法、疾病的類(lèi)型、患者的癥狀等合適地選擇；但是，它通常優(yōu)選 地是IO8至IO12個(gè)/人，更優(yōu)選地IO9個(gè)/人或以上。4)隨后，將它們懸浮在生理鹽水中以提供本發(fā)明的醫(yī)藥品。本發(fā)明的醫(yī)藥品能夠 用作癌癥或感染癥的治療劑/預(yù)防劑。此處，在用作癌癥的治療劑/預(yù)防劑的情形，也可以將本發(fā)明的醫(yī)藥品與細(xì)胞因 子如IL-2或IL-12組合。另外，在作為病毒感染癥的治療劑/預(yù)防劑的情形，也可以將本發(fā)明的醫(yī)藥品與 干擾素-Y (IFN-y)等組合。5)施用方法可以是例如靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下等的注射；直接注射入病變部位；或者 通過(guò)點(diǎn)滴而全身施用。此外，也可以通過(guò)病變部位附近的動(dòng)脈注入。<第三實(shí)施方案施與疾病抗原特異的CTL和Y δ T細(xì)胞的治療/預(yù)防方法>本發(fā)明的治療/預(yù)防方法是涉及施與疾病抗原特異的CTL和Y δ T細(xì)胞的治療/ 預(yù)防方法，其中所述疾病抗原特異的CTL和γ δ T細(xì)胞是通過(guò)在培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)添加疾病抗原 和氨基二膦酸至外周血來(lái)培養(yǎng)而獲得的。本發(fā)明的治療/預(yù)防方法具體說(shuō)明如下。
1)通過(guò)本發(fā)明的培養(yǎng)方法獲得的細(xì)胞通過(guò)離心法等收集。2)用洗凈液洗收集的細(xì)胞。洗凈液優(yōu)選地是與細(xì)胞滲透壓相等的等滲液，并且更 優(yōu)選地是能夠用于醫(yī)藥品的液體。在本文中，考慮到它施用至患者，優(yōu)選使用例如生理鹽水 或PBS (磷酸鹽緩沖的生理鹽水)。3)洗凈后獲得的主要含有疾病抗原特異的CTL和γ δ T細(xì)胞的淋巴細(xì)胞群體通 過(guò)離心法等回收，并懸浮于用作醫(yī)藥品的液體例如生理鹽水中，以制備用于本發(fā)明的治療/ 預(yù)防方法中的細(xì)胞懸液。此時(shí)，用于懸浮的液體的用量根據(jù)施用的細(xì)胞數(shù)和施用方法進(jìn)行 適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。用于本發(fā)明的治療/預(yù)防方法中的主要含有疾病抗原特異的CTL和、δΤ細(xì)胞的 淋巴細(xì)胞群體的細(xì)胞數(shù)根據(jù)施用方法、疾病的類(lèi)型、患者的癥狀等合適地選擇；但是，它通 常優(yōu)選地是IO8至IO12個(gè)/人，更優(yōu)選地IO9個(gè)/人或以上。4)隨后，將它們懸浮在生理鹽水中以提供細(xì)胞懸液。此處，在用于治療或預(yù)防癌癥的情形，也可以將本發(fā)明的醫(yī)藥品與細(xì)胞因子如 IL-2 或 IL-12 組合。另外，在用于治療或預(yù)防病毒感染癥的情形，也可以將本發(fā)明的醫(yī)藥品與干擾 素1 (IFN-y)等組合。5)施用方法可以是例如靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下等的注射；直接注射入病變部位；或者 通過(guò)點(diǎn)滴而全身施用。此外，也可以通過(guò)病變部位附近的動(dòng)脈注入。以下參考實(shí)施例詳細(xì)地描述本發(fā)明。但是，應(yīng)理解本發(fā)明并不限于此。實(shí)施例1本發(fā)明的培養(yǎng)/誘導(dǎo)方法1)自健康人供體收集外周血Gani)并使用用于血細(xì)胞分離的密度梯度溶液從其 分離外周血單核細(xì)胞。2)將所得的外周血單核細(xì)胞懸浮在AIM-V中。3)將這些外周血單核細(xì)胞(8Χ IO6個(gè)/4mL)接種在6孔板(SUMIL0N)中。向其添加 1000U/mL IL-2，再向其添加 5μΜ 唑來(lái)膦酸(Ζ0ΜΕΤΑ(商標(biāo)名))禾Π 2 μ g/ml Mart-I (A27L, 序列ELAGIGILTV)作為肽，然后在37°C和5% CO2濃度條件下開(kāi)始培養(yǎng)。4)進(jìn)一步地，在培養(yǎng)開(kāi)始后添加10%量的AB血清。5)根據(jù)細(xì)胞的增殖，添加含有1000U/mL IL-2的AIM-V和AB血清，然后培養(yǎng)14天。6)如上所述培養(yǎng)7天或14天后獲得的細(xì)胞群體中，疾病抗原特異的CD8陽(yáng)性T細(xì) 胞的百分?jǐn)?shù)和表達(dá)TCRV γ 9的細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)使用抗CD8抗體(BD Pharmingen)、T-Select HLA-A * (^OlMart-IjTetramerELAGIGILTV(MBL)、抗 TCRV γ 9 抗體(Beckman Coulter)和抗 CD3抗體(Beckman Coulter)通過(guò)熒光活化的細(xì)胞分選儀(下文中稱(chēng)為FACS ；EpicsXL-MCL ADC, Beckman Coulter)測(cè)定。通過(guò)測(cè)定獲得的值如下所示。[表 1]培養(yǎng)第7天和第14天時(shí)單核細(xì)胞中含有的疾病抗原特異的CD8陽(yáng)性T細(xì)胞的百
分?jǐn)?shù)(％ )
權(quán)利要求
1.同時(shí)誘導(dǎo)疾病抗原特異的CTL和γδ τ細(xì)胞的方法，其中所述方法包括以下步驟 添加疾病抗原和氨基二膦酸至外周血和培養(yǎng)所得到的外周血。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的同時(shí)誘導(dǎo)疾病抗原特異的CTL和γδ T細(xì)胞的方法，其中添加疾 病抗原和氨基二膦酸的步驟在培養(yǎng)的第1日實(shí)施。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的同時(shí)誘導(dǎo)疾病抗原特異的CTL和γδΤ細(xì)胞的方法，其中氨 基二膦酸是帕米膦酸、阿侖膦酸、唑來(lái)膦酸、利塞膦酸、伊班膦酸、英卡膦酸、其鹽和/或其 水合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)的同時(shí)誘導(dǎo)疾病抗原特異的CTL和γδ T細(xì)胞的方法， 其中疾病抗原是癌抗原。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)的同時(shí)誘導(dǎo)疾病抗原特異的CTL和γδ T細(xì)胞的方法， 其中同時(shí)添加疾病抗原和氨基二膦酸。
6.醫(yī)藥品，其包含通過(guò)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)的方法獲得的疾病抗原特異的CTL和 Y δ T細(xì)胞。
7.治療/預(yù)防方法，其包括施與通過(guò)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)的方法獲得的疾病抗原特 異的CTL和γ δ T細(xì)胞。
全文摘要
本申請(qǐng)公開(kāi)了簡(jiǎn)便且有效地在一個(gè)培養(yǎng)步驟中培養(yǎng)疾病抗原特異的CTL和γδT細(xì)胞的方法；以及使用通過(guò)所述方法產(chǎn)生的細(xì)胞的醫(yī)藥品和治療/預(yù)防方法。收集血液并且自該血液分離外周血單核細(xì)胞。在培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)向外周血單核細(xì)胞添加氨基二膦酸和疾病抗原，通過(guò)進(jìn)行預(yù)定期間的細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)同時(shí)增殖/誘導(dǎo)疾病抗原特異的CTL和γδT細(xì)胞直至細(xì)胞數(shù)達(dá)到對(duì)于疾病治療有效的值。由此產(chǎn)生的CTL和γδT細(xì)胞用于治療。
文檔編號(hào)A61K35/14GK102137925SQ20098013342
公開(kāi)日2011年7月27日 申請(qǐng)日期2009年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月1日
發(fā)明者富山舞, 武藤真人, 贄田美江 申請(qǐng)人:邁世耐特股份公司