專(zhuān)利名稱(chēng)：用于治療丙型肝炎的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及患有丙型肝炎傳染或處于患有丙型肝炎傳染的風(fēng)險(xiǎn)的受試者 的治療。更具體地，本發(fā)明涉及使用重組編碼和表達(dá)這種抗原的細(xì)菌來(lái)遞送一種或多種丙 型肝炎病毒(HCV)抗原的組合物和方法。
背景技術(shù)：
本發(fā)明的背景技術(shù)的下面討論僅提供以輔助讀者理解本發(fā)明，并且不許可描述或 構(gòu)成本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。丙型肝炎是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率的主要原因。估計(jì)世界上170百萬(wàn)個(gè)人感 染HCV，在美國(guó)接近4百萬(wàn)人慢性感染，并且在歐洲最多9百萬(wàn)人慢性感染。急性疾病可導(dǎo) 致恢復(fù)、暴發(fā)型肝炎、復(fù)發(fā)性肝炎干涉正常肝功能的期間，不明顯的慢性傳染，慢性活動(dòng)性 肝炎和肝硬化。在接觸HCV的這些人中，80%變成慢性感染，并且至少30%的攜帶者發(fā)展成 慢性肝病，包括肝硬化和肝細(xì)胞癌。在發(fā)達(dá)國(guó)家中對(duì)于患有慢性HCV傳染的患者，干擾素-α (IFN- α )和病毒唑的治 療的目前標(biāo)準(zhǔn)在最流行的HCV基因型1-3中已經(jīng)證實(shí)不同的效果。盡管在具有HCV基因 型2和3的患者中有效率為約80%，但是慢性感染HCV基因型1的患者中只有約50%在用 IFN- α /病毒唑治療后顯示出持續(xù)的病毒應(yīng)答。在美國(guó)慢性HCV傳染的70-80%為基因型 1。另外，IFN-α和病毒唑的毒性和耐受性特性限制它們?cè)贖CV治療中的應(yīng)用。盡管在臨床開(kāi)發(fā)中有許多研究試劑，包括疫苗基治療和小分子靶向，但是特異 性HCV基因的功能制備例如病毒蛋白酶(NS3)和病毒聚合酶(NS5B)。例如，IC41是合成 肽疫苗，含有7個(gè)相關(guān)丙型肝炎病毒(HCV)T細(xì)胞抗原表位和T協(xié)助細(xì)胞(Th) 1/Tcl佐劑 聚-L-精氨酸。IC41報(bào)道在健康志愿者中誘導(dǎo)HCV-特異性干擾素(IFN)-γ-分泌⑶4+和 ⑶8+T細(xì)胞。重組HCV NS3和NS5B蛋白與佐劑混合物(包含M-ISA720和CpG 二核苷酸) 一起也報(bào)道誘導(dǎo)⑶4(+)和⑶8(+) T細(xì)胞應(yīng)答。然而這些方案中沒(méi)有一種建立比在慢性HCV 背景中的治療的目前標(biāo)準(zhǔn)更優(yōu)異的效果和耐受性。發(fā)明概述本發(fā)明提供使用重組編碼和表達(dá)這種抗原的細(xì)菌來(lái)遞送一種或多種丙型肝炎病 毒(HCV)抗原的組合物和方法。在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明涉及在受試者中誘導(dǎo)針對(duì)丙型肝炎病毒(HCV)的T 細(xì)胞應(yīng)答的方法。這些方法包括向所述受試者施用組合物，所述組合物包含表達(dá)一種或多 種免疫原性HCV抗原多肽的細(xì)菌，其氨基酸序列包含⑴選自由核心、El、E2、p7、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a 和 NS5b 構(gòu)成的組中的一種或多種全長(zhǎng)HCV蛋白；(ii)衍生自來(lái)自(i)的一種或多種全長(zhǎng)HCV蛋白的一種或多種免疫原性氨基酸序 列；或(i)的一種或多種全長(zhǎng)HCV蛋白和(ii)的一種或多種氨基酸序列的組合。如本文中所述的，這些方法可在所述受試者中刺激針對(duì)重組表達(dá)的免疫原性HCV 抗原多肽的抗原-特異性τ細(xì)胞(CD4+和/或CD5+)應(yīng)答。優(yōu)選地，當(dāng)遞送至所述受試者 時(shí)，本發(fā)明的組合物在所述遞送后M小時(shí)誘導(dǎo)選自由IL-12p70、IFN- y , IL_6、TNF α和 MCP-I構(gòu)成的組的一種或多種、優(yōu)選各種蛋白的血清濃度增加；以及誘導(dǎo)針對(duì)由細(xì)菌表達(dá) 的所述免疫原性HCV抗原多肽的一種或多種的CD4+和/或CD8+抗原-特異性T細(xì)胞應(yīng)答。在本發(fā)明的相關(guān)方面中，本發(fā)明涉及用于在受試者中誘導(dǎo)針對(duì)丙型肝炎病毒 (HCV)的T細(xì)胞應(yīng)答的組合物。這些組合物包含含有核酸分子的細(xì)菌，其序列編碼一種或多 種免疫原性HCV抗原多肽，其氨基酸序列包含⑴選自由核心、El、Ε2、p7、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a 和 NS5b 構(gòu)成的組中的一 種或多種全長(zhǎng)HCV蛋白；(ii)衍生自來(lái)自(i)的一種或多種全長(zhǎng)HCV蛋白的一種或多種免疫原性氨基酸序 列；或(i)的一種或多種全長(zhǎng)HCV蛋白和(ii)的一種或多種氨基酸序列的組合。并且在另一相關(guān)方面，本發(fā)明涉及分離的核酸分子，其序列編碼一種或多種免疫 原性HCV抗原多肽，其氨基酸序列包含⑴選自由核心、El、E2、p7、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a 和 NS5b 構(gòu)成的組中的一 種或多種全長(zhǎng)HCV蛋白；(ii)衍生自來(lái)自(i)的一種或多種全長(zhǎng)HCV蛋白的一種或多種免疫原性氨基酸序 列；或(i)的一種或多種全長(zhǎng)HCV蛋白和(ii)的一種或多種氨基酸序列的組合。下文中詳細(xì)描述用于選擇合適的免疫原性HCV抗原多肽序列的方法，并且提供示 例性免疫原性HCV抗原多肽序列。選擇方法可包括選擇一種或多種鄰接的HCV氨基酸序 列，其不具有超過(guò)李斯特菌ActA-NlOO的峰值疏水性的疏水性區(qū)域；選擇預(yù)計(jì)編碼一種或 多種MHC I類(lèi)抗原表位的一種或多種鄰接的HCV氨基酸序列；和/或選擇預(yù)計(jì)編碼一種或 多種MHC I類(lèi)抗原表位的一種或多種鄰接的HCV氨基酸序列。這些多肽產(chǎn)生⑶4+和/或 CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的能力可通過(guò)本文中詳細(xì)描述的多種方法來(lái)證實(shí)，這是本領(lǐng)域熟知的。在某些實(shí)施方案中，免疫原性HCV抗原多肽包含一種或多種氨基酸序列，其獨(dú)立 地選自由全長(zhǎng)核心、El、E2、p7、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b構(gòu)成的組；與這種全長(zhǎng) HCV抗原具有至少90%序列同一性的氨基酸序列；全長(zhǎng)核心、El、E2、p7、NS2、NS3、NS4a、 NS4b,NS5a和NS^3的片段；和與這種片段具有至少90%序列同一性的氨基酸序列。在優(yōu)選實(shí)施方案中，免疫原性HCV抗原多肽包含一種或多種氨基酸序列，其選自 由全長(zhǎng)NS3、全長(zhǎng)NS^3、衍生自NS3的氨基酸序列和衍生自NS^3的氨基酸序列構(gòu)成的組。在 某些實(shí)施方案中，衍生的氨基酸序列可獨(dú)立地選自由下列構(gòu)成的組包含來(lái)自NS3的至少 100個(gè)鄰接殘基的氨基酸序列；包含來(lái)自NS^D的至少100個(gè)鄰接殘基的氨基酸序列；與來(lái) 自NS3的至少100個(gè)鄰接殘基具有至少90%序列同一性的氨基酸序列、和與來(lái)自NS^3的至少100個(gè)鄰接殘基具有至少90%序列同一性的氨基酸序列。本領(lǐng)域中已知多種HCV分離物，其可起到用于上述氨基酸序列的源材料的作用。 在優(yōu)選實(shí)施方案中，核心工^2、？7、賂2、賂3、賂乜、賂413、賂^1和/或NS5b氨基酸序列是 共有序列，優(yōu)選來(lái)自基因型IHCV共有序列，最優(yōu)選來(lái)自基因型Ia或Ib共有序列。下文提 供示例性共有序列。蛋白序列可通過(guò)一種或多種插入、缺失和/或置換來(lái)修飾。特別優(yōu)選的HCV抗原多肽包含選自由下列構(gòu)成的組的一種或多種、優(yōu)選各種氨基 酸序列=SEQ ID NO :1、2、3、4、5、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、 58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82 和 83。多種細(xì)菌種類(lèi)被開(kāi)發(fā)用作疫苗，并且可在本發(fā)明中用作疫苗平臺(tái)，包括但不限于 弗氏志賀氏菌、大腸桿菌、單核細(xì)胞增生性李斯特菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、鼠傷寒沙門(mén) 氏菌、傷寒沙門(mén)氏菌或分枝桿菌種類(lèi)。該列表不意在是限制性的。本發(fā)明涵蓋使用減弱、共 棲、和/或被殺死但代謝性活性細(xì)菌菌株作為疫苗平臺(tái)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)菌是單核細(xì) 胞增生性李斯特菌，包含編碼用于通過(guò)細(xì)菌表達(dá)的編碼本發(fā)明的一種或多種免疫原性HCV 抗原多肽的核酸序列。該核酸最優(yōu)選整合到細(xì)菌的基因組中。減弱和被殺死但代謝性活 性形式的單核細(xì)胞增生性李斯特菌是特別優(yōu)選的，并且在下文優(yōu)選實(shí)施方案中描述在actA 和/或inlB中包埋減弱突變的單核細(xì)胞增生性李斯特菌。本文中所述的疫苗組合物可單獨(dú)或聯(lián)合藥學(xué)上可接受的賦形劑施用至宿主，其量 足以誘導(dǎo)針對(duì)HCV傳染的合適的免疫應(yīng)答。選擇以在所述受試者中誘導(dǎo)所述T細(xì)胞應(yīng)答的 優(yōu)選條件包括靜脈內(nèi)施用疫苗平臺(tái)至受試者；然而，施用可以是口服、靜脈內(nèi)、皮下、皮膚、 皮內(nèi)、肌內(nèi)、粘膜、腸胃外、器官內(nèi)、病灶內(nèi)、鼻內(nèi)、吸入、眼內(nèi)、血管內(nèi)、節(jié)點(diǎn)內(nèi)、通過(guò)劃痕、直 腸、腹膜內(nèi)、或多種熟知施用途徑的任意一種或組合。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，在受試者施用有效劑量的含有免疫原性HCV抗原多肽的 疫苗以初免免疫應(yīng)答后，施用第二疫苗。這在本領(lǐng)域中稱(chēng)為“初免-加強(qiáng)”方案。在這種方 案中，本發(fā)明的組合物和方法可用作“初免”遞送、“加強(qiáng)”遞送、或“初免”和“加強(qiáng)”。這些 方案的例子在下文中有所描述。在本發(fā)明中使用的優(yōu)選單核細(xì)胞增生性李斯特菌包含prfA基因中的突變，這將 表達(dá)的prfA轉(zhuǎn)錄因子鎖入組成性活性狀態(tài)。例如I^fA*突變體(G155S)已示出在靜脈內(nèi) 或肌內(nèi)初免-加強(qiáng)免疫方案后增強(qiáng)功能細(xì)胞免疫。在某些實(shí)施方案中，免疫原性HCV抗原多肽表達(dá)為一種或多種融合蛋白，所述融 合蛋白包含框內(nèi)分泌信號(hào)序列，從而通過(guò)細(xì)菌導(dǎo)致分泌可溶性HCV抗原多肽。多種示例性 信號(hào)序列在本領(lǐng)域中已知用在細(xì)菌表達(dá)體系中。在細(xì)菌是單核細(xì)胞增生性李斯特菌的情 況下，優(yōu)選分泌信號(hào)序列是單核細(xì)胞增生性李斯特菌信號(hào)序列，最優(yōu)選ActA信號(hào)序列。另 外ActA或其他接頭氨基酸也可被表達(dá)融合至免疫原性HCV抗原多肽。在優(yōu)選實(shí)施方案中， 一種或多種免疫原性HCV抗原多肽表達(dá)為融合蛋白，所述融合蛋白包含選自由SEQ ID NO 37,SEQ ID NO 38,SEQ ID NO 39、SEQ ID NO :40 構(gòu)成的組的框內(nèi) ActA-NlOO 序列、或與所 述ActA-NlOO序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列。在優(yōu)選實(shí)施方案中，疫苗組合物包含表達(dá)融合蛋白的單核細(xì)胞增生性李斯特菌， 包含
(a)選自由 SEQ ID NO :37、SEQ ID NO :38、SEQ ID NO :39、SEQ ID NO 40 構(gòu)成的 組的ActA-NlOO序列、或與所述ActA-NlOO序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列；(b)包含來(lái)自NS3的至少100個(gè)鄰接殘基的氨基酸序列、或與所述包含來(lái)自NS3的 至少100個(gè)鄰接殘基的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列；以及(c)包含來(lái)自NS^3的至少100個(gè)鄰接殘基的氨基酸序列、或與所述包含來(lái)自NS^3 的至少100個(gè)鄰接殘基的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列；其中所述融合蛋白表達(dá)自可操作地連接單核細(xì)胞增生性李斯特菌ActA啟動(dòng)子的 核酸序列。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，(c)的氨基酸序列包含NS^3的氨基酸1-342(優(yōu)選 包含SEQ ID N0:18或SEQ ID NO 19的氨基酸1-34 或其突變衍生物，其中所述突變使 NS5b的RNA聚合酶活性失活(優(yōu)選SEQ ID NO 22或SE Q ID NO 23中所示的突變)；并 且(b)的氨基酸序列包含NS3的氨基酸172-484(優(yōu)選包含SEQ ID NO 13或SEQ ID NO 14的氨基酸172-484)或其突變衍生物，其中所述突變使NS3的解旋酶活性失活(優(yōu)選SEQ ID NO 20或SEQ ID NO 21中所示的突變)。在表達(dá)自單核細(xì)胞增生性李斯特菌細(xì)菌的情況下，在某些實(shí)施方案中編碼HCV抗 原多肽的核酸序列是優(yōu)化用于通過(guò)單核細(xì)胞增生性李斯特菌表達(dá)的密碼子。如下文所述， 不同有機(jī)體通常展示“密碼子偏倚”；即，編碼特定氨基酸的給定密碼子在遺傳密碼中出現(xiàn) 的程度在有機(jī)體之間顯著改變。通常，基因含有的密碼子越罕用，在該特異性宿主體系內(nèi)在 合理水平表達(dá)異源蛋白的可能性越小。如果罕用密碼子出現(xiàn)在蛋白的簇集中或N-末端部 分中，這些水平甚至變得更低。在不修飾氨基酸序列的情況下使用更緊密地反映宿主體系 的密碼子偏倚的其他密碼子代替罕用密碼子可增加功能蛋白表達(dá)的水平。用于密碼子優(yōu)化 的方法在下文有所描述。本發(fā)明的方法和組合物可發(fā)現(xiàn)作為預(yù)防或治療性HCV疫苗的用途。在優(yōu)選實(shí)施方 案中，受試者被選擇以基于之前診斷的慢性HCV傳染來(lái)接收本發(fā)明的組合物。應(yīng)理解，本發(fā)明在其申請(qǐng)中不限于在下列描述闡述的或在附圖中示出的構(gòu)建細(xì)節(jié) 和組分布置。本發(fā)明能夠以除了那些描述的方式來(lái)實(shí)施和能夠以多種方式實(shí)施與操作。此 外，應(yīng)理解本文中使用的措辭和術(shù)語(yǔ)、以及摘要用于描述的目的，并且不應(yīng)該被認(rèn)為是限制 性的。這樣，本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識(shí)到，該公開(kāi)基于的概念可容易地被用作用于設(shè)計(jì)其 他結(jié)構(gòu)、方法和體系的基礎(chǔ)，以實(shí)施本發(fā)明的數(shù)個(gè)目的。因此重要的是，權(quán)利要求被認(rèn)為包 括這些等價(jià)構(gòu)造，只要它們不偏離本發(fā)明的精神和范圍。附圖簡(jiǎn)述本發(fā)明及其各種特征和有利細(xì)節(jié)參照附圖中示出的和下列說(shuō)明中詳述的非限制 性實(shí)施方案來(lái)更充分地解釋。應(yīng)該注意，附圖中示出的特征不須按比例繪制。忽略熟知組 分和加工技術(shù)的描述，以不會(huì)徒然地模糊本發(fā)明。本文中使用的例子僅旨在促進(jìn)方式的理 解，以該方式本發(fā)明可實(shí)施并且進(jìn)一步能夠使本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)實(shí)施本發(fā)明。因此，例子不 應(yīng)該認(rèn)為限制本發(fā)明的范圍。在附圖中，在多個(gè)視圖全文中類(lèi)似的附圖標(biāo)記表示相應(yīng)的部 分。

圖1示出L. monocytogenes疫苗菌株ANZ-521的衍生圖。圖2示出在單核細(xì)胞增生性李斯特菌ANZ 100的inlB基因座插入的HCVNS5B-NS3抗原表達(dá)盒的圖。圖3示出在單核細(xì)胞增生性李斯特菌ANZ-521的構(gòu)建中使用的各種構(gòu)建體。圖4示出用于映射HCVNS5A和NS3的免疫原性抗原表位的肽。圖5示出用于映射HCVNS5A和NS3的免疫原性抗原表位的肽。圖6示出小鼠中NS3-和NS5b_特異性CD4+和CD8+T細(xì)胞免疫。圖7示出基于基因型1共有序列融合HCV核心、NS3和NS^3抗原的ActA-NlOO的 Kyte-Doolittle 親水性圖。圖8示出通過(guò)ActA-NlOOHCV抗原融合蛋白的李斯特菌的抗原表達(dá)。組A在泳 道3、4和5示出核心序列1-190、1-180和1-177。組B在泳道3-10示出NS3序列1-631、 1-484、22-631、22-484、22-280、172-484、172-631 和 416-631。組 C 在泳道 3-7 示出 NS5 序 列1-574、1-342、320-591和320-574。各組中的泳道1和2是陰性和陽(yáng)性對(duì)照，其示出沒(méi)有 抗原插入和通過(guò)單核細(xì)胞增生性李斯特菌CRS-207的間皮素表達(dá)。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及使用編碼和表達(dá)一種或多種丙型肝炎病毒(HCV)抗原的細(xì)菌來(lái)遞送 主動(dòng)免疫療法的組合物和方法。應(yīng)理解，本發(fā)明在其申請(qǐng)中不限于在下列描述闡述的或在附圖中示出的構(gòu)建細(xì)節(jié) 和組分布置。本發(fā)明能夠以除了那些描述的方式來(lái)實(shí)施和能夠以多種方式實(shí)施與操作。此 外，應(yīng)理解本文中使用的措辭和術(shù)語(yǔ)、以及摘要用于描述的目的，并且不應(yīng)該被認(rèn)為是限制 性的。這樣，本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識(shí)到，該公開(kāi)基于的概念可容易地被用作用于設(shè)計(jì)其 他結(jié)構(gòu)、方法和體系的基礎(chǔ)，以實(shí)施本發(fā)明的數(shù)個(gè)目的。因此重要的是，權(quán)利要求被認(rèn)為包 括這些等價(jià)構(gòu)造，只要它們不偏離本發(fā)明的精神和范圍。1.定義用于表示基因中突變或包含基因的細(xì)菌中突變的縮寫(xiě)如下所示。通過(guò)例子的方 式，縮寫(xiě)“L. monocytogenes Δ ActA”是指部分或全部ActA基因缺失。Delta符號(hào)(Δ)是 指缺失。包括上標(biāo)減號(hào)的縮寫(xiě)(李斯特菌ActA—)是指ActA基因突變，例如通過(guò)缺失、點(diǎn)突 變、或移碼突變的方式進(jìn)行，但不限于這些類(lèi)型的突變。在應(yīng)用于人、哺乳動(dòng)物、哺乳動(dòng)物受試者、動(dòng)物、獸醫(yī)受試者、安慰劑受試者、研究 受試者、試驗(yàn)受試者、細(xì)胞、組織、器官或生物流體時(shí)，“施用”非限制性意指使外源配體、試 劑、安慰劑、小分子、藥劑、治療劑、診斷劑或組合物接觸受試者、細(xì)胞、組織、器官或生物流 體等?！笆┯谩笨衫缡侵钢委煛⑺幬飫?dòng)力學(xué)、診斷、研究、安慰劑和試驗(yàn)方法。細(xì)胞的處理包 括使試劑接觸細(xì)胞，以及使試劑接觸流體，其中流體接觸細(xì)胞?！笆┯?還包括通過(guò)試劑、 診斷、結(jié)合組合物或通過(guò)另一細(xì)胞的細(xì)胞的(例如)體外和離體處理。在涉及配體和受體時(shí)，“激動(dòng)劑”包含刺激受體的分子、分子聯(lián)合、絡(luò)合物或試劑聯(lián) 合。例如，粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)的激動(dòng)劑可包括GM-CSF、GM-CSF的突變蛋 白或衍生物、GM-CSF的肽模擬物、模擬GM-CSF的生物功能的小分子、或刺激GM-CSF受體的 抗體。在涉及配體和受體時(shí)，“拮抗劑”包含抑制、抵消、下調(diào)和/或脫敏受體的分子、分子 聯(lián)合、或絡(luò)合物?！稗卓箘卑ㄒ种剖荏w的組成性活性的任何試劑。組成性活性是在不存在配體/受體相互作用的情況下明顯的那種?！稗卓箘边€包括抑制或防止受體的刺激(或 調(diào)節(jié))活性的任何試劑。通過(guò)例子的方式，GM-CSF受體的拮抗劑包括但不限于結(jié)合配體 (GM-CSF)并防止其結(jié)合受體的抗體、或結(jié)合受體并防止配體結(jié)合受體的抗體、或其中以失 活構(gòu)象抗體鎖住受體。如本文中使用的，參照肽、多肽或蛋白的“類(lèi)似物”是指具有和初始肽、多肽或蛋 白類(lèi)似或相同功能的另一肽、多肽或蛋白，但其不必包含初始肽、多肽或蛋白的類(lèi)似或相同 氨基酸序列或結(jié)構(gòu)。類(lèi)似物優(yōu)選滿(mǎn)足下列中的至少一種(a)具有與初始氨基酸序列至少 30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少 70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%同一性的氨基酸 序列的蛋白質(zhì)劑；(b)由核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)劑，所述核苷酸序列在嚴(yán)格條件下雜交 編碼初始氨基酸序列的核苷酸序列；和(c)由核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)劑，所述核苷酸序 列與編碼初始氨基酸序列的核苷酸序列具有至少30 %、至少35 %、至少40 %、至少45 %、至 少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少 90%、至少95%或至少99%同一性?！翱乖f呈細(xì)胞”(APC)是用于遞呈抗原至T細(xì)胞的免疫體系的細(xì)胞。APC包括樹(shù) 突細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、邊緣區(qū)KupfTer細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、朗氏細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞。 樹(shù)突細(xì)胞產(chǎn)生在至少兩個(gè)譜系中。第一譜系包括前體-DC1、骨髓DCl和成熟DC1。第二譜 系包括 CD:34++CD45Ryr 早期祖多能細(xì)胞、CD;34++CD45RA+ 細(xì)胞、CD;34++CD45RA++CD4+ IL-3R α ++ 促-DC2細(xì)胞、⑶4+⑶llc_類(lèi)漿細(xì)胞前體-DC2細(xì)胞、淋巴人DC2類(lèi)漿細(xì)胞-衍生的DC2、和成 熟 DC2?！皽p弱”和“減弱的”包括被修飾以減少對(duì)于宿主毒性的細(xì)菌、病毒、寄生物、傳染 有機(jī)體、朊病毒、腫瘤細(xì)胞、傳染有機(jī)體中的基因等。宿主可以是人或動(dòng)物宿主、或器官、組 織或細(xì)胞。為了給出非限制性例子，細(xì)菌可被減弱以減少與宿主細(xì)胞的結(jié)合、減小從一種宿 主細(xì)胞至另一宿主細(xì)胞的傳播、減小細(xì)胞外生長(zhǎng)、或減小在宿主細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)。減 弱可通過(guò)測(cè)量例如毒性indicum或指標(biāo)、LD5tl、從器官的清除率、或競(jìng)爭(zhēng)力指數(shù)(例如參見(jiàn) Auerbuch, et al. (2001) Infect. Immunity 69 :5953-5957)來(lái)評(píng)價(jià)。通常，減弱導(dǎo)致 LD5tl 增 加和/或清除率增加至少25% ；更通常增加至少50% ；最通常增加至少100% (2-倍)；正 常增加至少5-倍；更正常增加至少10-倍；最正常增加至少50-倍；經(jīng)常增加至少100-倍； 更經(jīng)常增加至少500-倍；和最經(jīng)常增加至少1000-倍；常增加至少5000-倍；更常增加至 少10，000-倍；和最常增加至少50，000-倍；以及最經(jīng)常增加至少100，000-倍?！皽p弱基因”包括調(diào)節(jié)對(duì)于宿主的毒性、病理或毒力、在宿主內(nèi)生長(zhǎng)、或在宿主內(nèi)存 活的基因，其中所述基因以減輕、降低或消除毒性、病理或毒力的方式突變。降低或消除可 通過(guò)比較由突變基因調(diào)節(jié)的毒力或毒性與由非突變(或母體)基因調(diào)節(jié)的毒力或毒性來(lái)評(píng) 價(jià)?！巴蛔兓颉卑ɑ虻恼{(diào)節(jié)區(qū)、基因的編碼區(qū)、基因的非編碼區(qū)、或其任意組合中的缺 失、點(diǎn)突變和移碼突變?！氨Ｊ匦揎椀淖凅w”適用于氨基酸和核酸序列。對(duì)于特定核酸序列，保守修飾 的變體是指編碼相同氨基酸序列、或具有一個(gè)或多個(gè)保守置換的氨基酸序列的核酸。保 守置換的例子是將下列組的一個(gè)中的氨基酸交換為相同組中的另一氨基酸(美國(guó)專(zhuān)利 No. 5，767，063，授于 Lee，et al. ；Kyte and Doolittle (1982) J. Mol. Biol. 157 :105-132)。
15
(1)疏水性正亮氨酸，lie, Val, Leu, Phe, Cys, Met ；(2)中等親水性Cys，Ser, Thr ；(3)酸性=Asp, Glu ；(4)堿性:Asn, Gln，His, Lys，Arg ；(5)影響鏈取向的殘基Gly，Pro ；(6)芳族=Trp, Tyr, Phe ；以及(7)小氨基酸:Gly, Ala, Ser0“有效量”包括但不限于可改善、反轉(zhuǎn)、減輕、預(yù)防或診斷醫(yī)學(xué)病癥或紊亂的癥狀或 跡象的量。除非另外清晰地或根據(jù)上下文說(shuō)明，“有效量”不限于足以改善病癥的最小量?！凹?xì)胞外液”包括例如血清、血漿、血液、間質(zhì)液、腦脊髓液、分泌液、淋巴液、膽汁、 汗液、糞便物和尿?！凹?xì)胞外液”可包括膠體或混懸液，例如全血或凝固血液。包括肽或多肽的多肽上下文中的術(shù)語(yǔ)“片段”包含下列氨基酸序列較大多肽的氨 基酸序列的至少5個(gè)鄰接的氨基酸殘基、至少10個(gè)鄰接的氨基酸殘基、至少15個(gè)鄰接的氨 基酸殘基、至少20個(gè)鄰接的氨基酸殘基、至少25個(gè)鄰接的氨基酸殘基、至少40個(gè)鄰接的氨 基酸殘基、至少50個(gè)鄰接的氨基酸殘基、至少60個(gè)鄰接的氨基酸殘基、至少70個(gè)鄰接的氨 基酸殘基、至少80個(gè)鄰接的氨基酸殘基、至少90個(gè)鄰接的氨基酸殘基、至少100個(gè)鄰接的 氨基酸殘基、至少125個(gè)鄰接的氨基酸殘基、至少150個(gè)鄰接的氨基酸殘基、至少175個(gè)鄰 接的氨基酸殘基、至少200個(gè)鄰接的氨基酸殘基或至少250個(gè)鄰接的氨基酸殘基?！盎颉笔侵妇幋a寡肽或多肽的核酸序列。寡肽或多肽可以是生物活性的、抗原活 性的、生物失活的或抗原失活的等。術(shù)語(yǔ)基因包括例如編碼特異性寡肽或多肽的開(kāi)放閱讀 框(ORF)的總和；ORF加編碼內(nèi)含子的核酸的總和；ORF和可操作地連接的啟動(dòng)子的總和； ORF和可操作地連接的啟動(dòng)子與任意內(nèi)含子的總和；ORF和可操作地連接的啟動(dòng)子、內(nèi)含子 和啟動(dòng)子與其他調(diào)節(jié)元件例如增強(qiáng)子的總和。在某些實(shí)施方案中，“基因”包括用于順式調(diào) 節(jié)基因表達(dá)的要求的任何序列。術(shù)語(yǔ)基因還可是指編碼這樣的肽的核酸，所述肽包括肽、寡 肽、多肽或蛋白的抗原或抗原活性的片段。術(shù)語(yǔ)基因不必意指編碼的肽或蛋白具有任何生 物活性，或甚至肽或蛋白是抗原活性的。編碼非可表達(dá)的序列的核酸序列通常被認(rèn)為是假 基因。術(shù)語(yǔ)基因還包括編碼核糖核酸例如rRNA、tRNA或核酶的核酸序列。細(xì)菌例如李斯特菌的“生長(zhǎng)”包括但不限于涉及定居、復(fù)制、蛋白含量增加和/或 脂質(zhì)含量增加的細(xì)菌生理學(xué)和基因的功能。除非另外清晰地或根據(jù)上下文說(shuō)明，李斯特菌 的生長(zhǎng)包括細(xì)菌在宿主細(xì)胞外部的生長(zhǎng)，還包括在宿主細(xì)胞內(nèi)部的生長(zhǎng)。生長(zhǎng)相關(guān)基因包 括但不限于下列那些調(diào)節(jié)能量產(chǎn)生(例如糖酵解、三羧酸循環(huán)、細(xì)胞色素)、氨基酸、糖、脂 質(zhì)、礦物質(zhì)、嘌呤和嘧啶的合成代謝和/或分解代謝、營(yíng)養(yǎng)物運(yùn)輸、轉(zhuǎn)錄、翻譯和/或復(fù)制。 在一些實(shí)施方案中，李斯特菌細(xì)菌的“生長(zhǎng)”是指李斯特菌細(xì)菌的細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)，即，在宿主細(xì) 胞例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)部生長(zhǎng)。盡管李斯特菌細(xì)菌的細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)可通過(guò)光學(xué)顯微學(xué)或集落 形成單元(CFU)測(cè)試來(lái)測(cè)量，但是生長(zhǎng)不限于任何技術(shù)或測(cè)量。生物化學(xué)參數(shù)例如李斯特 菌抗原、李斯特菌核酸序列、或李斯特菌細(xì)菌特異性脂質(zhì)的量可用于測(cè)試生長(zhǎng)。在一些實(shí)施 方案中，調(diào)節(jié)生長(zhǎng)的基因是特異性調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)的那種。在一些實(shí)施方案中，特異性調(diào)節(jié) 細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)的基因包括但不限于下列基因基因的失活減小細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)速率但沒(méi)有可檢測(cè) 地、實(shí)質(zhì)上地或可察覺(jué)地減小細(xì)胞外生長(zhǎng)(例如發(fā)酵生長(zhǎng))速率；或基因的失活減小細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)速率至比其減小細(xì)胞外生長(zhǎng)速率更大的程度。為了提供非限制性例子，在一些實(shí)施方 案中，其中失活減小細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)速率至比其減小細(xì)胞外生長(zhǎng)更大的程度的基因包括這樣的 情況，其中失活減小細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)至小于正?；蜃畲笾档?0%，但是僅減小細(xì)胞外生長(zhǎng)至最 大值的l-5%、5-10%或10-15%。在某些方面，本發(fā)明包括在細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)減弱但在細(xì)胞外 生長(zhǎng)不減弱的李斯特菌、在細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)不減弱和在細(xì)胞外生長(zhǎng)不減弱的李斯特菌、以及在 細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)不減弱但在細(xì)胞外生長(zhǎng)減弱的李斯特菌?！笆人苑治觥笔侵竿ㄟ^(guò)Kyte和Doolittle法來(lái)分析多肽序列“A Simple Method for Displaying the Hydropathic Character of a Protein " . J. Mol. Biol. 157 (1982) 105-132。在該方法中，各氨基酸給出的疏水性評(píng)分在4. 6和-4. 6之間。4. 6 的評(píng)分是最具疏水性和-4. 6的評(píng)分是最具親水性。然后設(shè)定窗口大小。窗口大小是這樣 的氨基酸的數(shù)量，該氨基酸的疏水性評(píng)分將平均化并在所述窗口中分配給第一氨基酸。計(jì) 算開(kāi)始于氨基酸的第一窗口，并且計(jì)算該窗口中所有疏水性評(píng)分的平均值。然后窗口向下 移動(dòng)一種氨基酸并計(jì)算第二窗口中所有疏水性評(píng)分的平均值。該圖案繼續(xù)至蛋白末端，計(jì) 算各窗口的平均評(píng)分并分配至窗口中的第一氨基酸。然后將平均值繪制成圖。y軸表示疏 水性評(píng)分并且χ軸表示窗口號(hào)。下列疏水性評(píng)分用于20種常見(jiàn)氨基酸。
權(quán)利要求
1.一種在受試者中誘導(dǎo)針對(duì)丙型肝炎病毒(HCV)的T細(xì)胞應(yīng)答的方法，所述方法包括在選擇以在所述受試者中誘導(dǎo)所述T細(xì)胞應(yīng)答的條件下，向所述受試者施用組合物， 所述組合物包含表達(dá)一種或多種免疫原性HCV抗原多肽的細(xì)菌，其氨基酸序列包含⑴選自由核心、El、E2、p7、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b構(gòu)成的組中的一種或 多種全長(zhǎng)HCV蛋白；( )衍生自來(lái)自(i)的一種或多種全長(zhǎng)HCV蛋白的一種或多種免疫原性氨基酸序列；或(i)的一種或多種全長(zhǎng)HCV蛋白和(ii)的一種或多種氨基酸序列的組合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述免疫原性HCV抗原多肽包含選自由下列構(gòu)成 的組的一種或多種氨基酸序列全長(zhǎng)NS3、全長(zhǎng)NS^3、衍生自NS3的氨基酸序列、和衍生自 NS5b的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述免疫原性HCV抗原多肽包含選自由下列構(gòu)成 的組的一種或多種氨基酸序列包含來(lái)自NS3的至少100個(gè)鄰接殘基的氨基酸序列、和包含 來(lái)自NS^3的至少100個(gè)鄰接殘基的氨基酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述免疫原性HCV抗原多肽包含選自由下列構(gòu)成 的組的一種或多種氨基酸序列與來(lái)自NS3的至少100個(gè)鄰接殘基具有至少90%序列同一 性的氨基酸序列、和與來(lái)自NS^3的至少100個(gè)鄰接殘基具有至少90%序列同一性的氨基酸 序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述免疫原性HCV抗原多肽包含選自由下列構(gòu)成 的組的一種或多種氨基酸序列:SEQ ID NO :1、2、3、4、5、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、 52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、 77、78、79、80、81、82 和 83。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)菌是單核細(xì)胞增生性李斯特 菌，其包含編碼整合到所述細(xì)菌的基因組的所述一種或多種免疫原性HCV抗原多肽的核酸 序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述細(xì)菌是actA缺失突變體或actA插入突變體、 inlB缺失突變體或inlB插入突變體、或者包含actA缺失或actA插入和inlB缺失或inlB 插入的Δ actA/AinlB突變體。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中編碼所述一種或多種免疫原性HCV抗原多肽的多 核苷酸整合到所述細(xì)菌的致病基因中，并且所述多核苷酸的整合干擾所述致病基因的表達(dá) 或干擾所述致病基因的編碼序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述致病基因是actA或inlB。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述細(xì)菌是減弱單核細(xì)胞增生性李斯特菌。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述細(xì)菌是LmAactA/AinlB。
12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述細(xì)菌還包含減弱所述細(xì)菌修復(fù)核酸的能力 的基因突變。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述基因突變?cè)谶x自phrB、uvrA、uvrB、uvrC、 uvrD和recA的一種或多種基因中。
14.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述細(xì)菌是單核細(xì)胞增生性李斯特菌prfA突變 體，其基因組編碼組成性活性prfA蛋白。
15.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述細(xì)菌是被殺死但代謝性活性單核細(xì)胞增生 性李斯特菌。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述細(xì)菌是單核細(xì)胞增生性李斯特菌prfA突變 體，其基因組編碼組成性活性prfA蛋白。
17.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述核酸序列是優(yōu)化用于通過(guò)單核細(xì)胞增生性 李斯特菌表達(dá)的密碼子。
18.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述在選擇以在所述受試者中誘導(dǎo)所述T細(xì)胞應(yīng) 答的條件包括通過(guò)選自由下列構(gòu)成的組的一種或多種施用途徑向所述受試者施用所述單 核細(xì)胞增生性李斯特菌口服、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)和皮下。
19.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述免疫原性HCV抗原多肽表達(dá)為包 含分泌信號(hào)序列的融合蛋白。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述分泌信號(hào)序列是單核細(xì)胞增生性李斯特菌 ActA信號(hào)序列。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述免疫原性HCV抗原多肽表達(dá)為融合蛋白，所 述融合蛋白包含選自由 SEQ ID NO 37, SEQ ID NO 38, SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 40 構(gòu)成 的組的框內(nèi)ActA-NlOO序列、或與所述ActA-NlOO序列具有至少90%序列同一性的氨基酸 序列。
22.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述方法包括施用表達(dá)融合蛋白的單核細(xì)胞增 生性李斯特菌，其包含(a)選自由SEQ ID NO :37、SEQ ID NO :38、SEQ ID NO :39、SEQ ID NO 40 構(gòu)成的組的 ActA-NlOO序列、或與所述ActA-NlOO序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列；(b)包含來(lái)自NS3的至少100個(gè)鄰接殘基的氨基酸序列、或與所述包含來(lái)自NS3的至少 100個(gè)鄰接殘基的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列；以及(c)包含來(lái)自NS^3的至少100個(gè)鄰接殘基的氨基酸序列、或與所述包含來(lái)自NS^3的至 少100個(gè)鄰接殘基的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列；其中所述融合蛋白表達(dá)自可操作地連接單核細(xì)胞增生性李斯特菌ActA啟動(dòng)子的核酸 序列。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述單核細(xì)胞增生性李斯特菌表達(dá)融合蛋白， 所述融合蛋白包含具有SEQ ID NO 18或SEQ ID NO 19的序列的NS^3的氨基酸1-342、 或其突變衍生物，其中所述突變使NS^3的RNA聚合酶活性失活；和具有SEQ ID NO :13或 SEQ ID NO 14的序列的NS3的氨基酸172-484、或其突變衍生物，其中所述突變使NS3的解 旋酶活性失活。
24.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述免疫原性HCV抗原多肽包含(a)選自由具有HCV共有序列中列舉的序列的核心、El、E2、p7、NS2、NS3、NS4a、NS4b、 NS5a和NS^3構(gòu)成的組的一種或多種全長(zhǎng)HCV蛋白，所述HCV共有序列選自由SEQ ID NO 7-23構(gòu)成的組；(b)衍生自(a)的一種或多種全長(zhǎng)HCV蛋白的一種或多種氨基酸序列；或(a)的一種或多種全長(zhǎng)HCV蛋白和(b)的一種或多種氨基酸序列的組合。
25.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述免疫原性HCV抗原多肽包含一種或多種鄰接 的HCV氨基酸序列，其不具有超過(guò)李斯特菌ActA-NlOO的峰值疏水性的疏水性區(qū)域。
26.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述免疫原性HCV抗原多肽包含來(lái)自預(yù)計(jì)編碼一 種或多種MHC I類(lèi)抗原表位的核心、El、E2、p7、NS2、NS3、NS^、NS4b、NSfe和NS^3的一種 或多種的共有序列的一種或多種鄰接的HCV氨基酸序列。
27.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述免疫原性HCV抗原多肽包含來(lái)自預(yù)計(jì)編碼一 種或多種MHC II類(lèi)抗原表位的核心、El、E2、p7、NS2、NS3、NS^、NS4b、NSfe和NS^3的一種 或多種的共有序列的一種或多種鄰接的HCV氨基酸序列。
28.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述免疫原性HCV抗原多肽包含來(lái)自預(yù)計(jì)編碼 一種或多種MHC I類(lèi)抗原表位的核心、El、E2、p7、NS2、NS3、NS^、NS4b、NSfe和NS^3的一 種或多種的共有序列的一種或多種鄰接的HCV氨基酸序列；以及來(lái)自預(yù)計(jì)編碼一種或多種 MHC II類(lèi)抗原表位的核心、El、E2、p7、NS2、NS3、NS^、NS4b、NSfe和NS^3的一種或多種的 共有序列的一種或多種鄰接的HCV氨基酸序列。
29.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述受試者患有慢性HCV傳染。
30.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中當(dāng)遞送至所述受試者時(shí)，所述組合物在所述遞送 后24小時(shí)誘導(dǎo)選自由IL-12p70、IFN- y、IL-6、TNF α和MCP-I構(gòu)成的組的一種或多種蛋 白的血清濃度增加；以及誘導(dǎo)針對(duì)所述免疫原性HCV抗原多肽的一種或多種的CD4+和/或 ⑶8+抗原-特異性T細(xì)胞應(yīng)答。
31.一種組合物，包含包含序列編碼一種或多種免疫原性HCV抗原多肽的核酸分子的細(xì)菌，其氨基酸序列包含⑴選自由核心、El、Ε2、p7、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b構(gòu)成的組中的一種或 多種全長(zhǎng)HCV蛋白；( )衍生自來(lái)自(i)的一種或多種全長(zhǎng)HCV蛋白的一種或多種免疫原性氨基酸序列；或(i)的一種或多種全長(zhǎng)HCV蛋白和(ii)的一種或多種氨基酸序列的組合。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的組合物，其中所述免疫原性HCV抗原多肽包含選自由下列 構(gòu)成的組的一種或多種氨基酸序列全長(zhǎng)NS3、全長(zhǎng)NS^3、衍生自NS3的氨基酸序列、和衍生 自NS^3的氨基酸序列。
33.根據(jù)權(quán)利要求31所述的組合物，其中所述免疫原性HCV抗原多肽包含選自由下列 構(gòu)成的組的一種或多種氨基酸序列包含來(lái)自NS3的至少100個(gè)鄰接殘基的氨基酸序列、和 包含來(lái)自NS^3的至少100個(gè)鄰接殘基的氨基酸序列。
34.根據(jù)權(quán)利要求31所述的組合物，其中所述免疫原性HCV抗原多肽包含選自由下列 構(gòu)成的組的一種或多種氨基酸序列與來(lái)自NS3的至少100個(gè)鄰接殘基具有至少90%序列 同一性的氨基酸序列、和與來(lái)自NS^3的至少100個(gè)鄰接殘基具有至少90%序列同一性的氨 基酸序列。
35.根據(jù)權(quán)利要求31所述的組合物，其中所述免疫原性HCV抗原多肽包含選自由下 列構(gòu)成的組的一種或多種氨基酸序列:SEQ ID NO :1、2、3、4、5、42、43、44、45、46、47、48、49、.50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、 75、76、77、78、79、80、81、82 和 83。
36.根據(jù)權(quán)利要求31-35中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述細(xì)菌是單核細(xì)胞增生性李 斯特菌，其包含整合到所述細(xì)菌的所述基因組中的所述核酸序列。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的組合物，其中所述細(xì)菌是actA缺失突變體或actA插入突 變體、inlB缺失突變體或inlB插入突變體、或者包含actA缺失或actA插入和inlB缺失 或inlB插入的Δ actA/AinlB突變體。
38.根據(jù)權(quán)利要求36所述的組合物，其中編碼所述一種或多種免疫原性HCV抗原多肽 的多核苷酸整合到所述細(xì)菌的致病基因中，并且所述多核苷酸的整合干擾所述致病基因的 表達(dá)或干擾所述致病基因的編碼序列。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的組合物，其中所述致病基因是actA或inlB。
40.根據(jù)權(quán)利要求36所述的組合物，其中所述細(xì)菌是減弱單核細(xì)胞增生性李斯特菌。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的組合物，其中所述細(xì)菌是LmAactA/AinlB。
42.根據(jù)權(quán)利要求38所述的組合物，其中所述細(xì)菌還包含減弱所述細(xì)菌修復(fù)核酸的能 力的基因突變。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的組合物，其中所述基因突變?cè)谶x自phrB、uvrA、uVrB、uVrC、 uvrD和recA的一種或多種基因中。
44.根據(jù)權(quán)利要求40所述的組合物，其中所述細(xì)菌是單核細(xì)胞增生性李斯特菌prfA突 變體，其基因組編碼組成性活性PrfA蛋白。
45.根據(jù)權(quán)利要求36所述的組合物，其中所述細(xì)菌是被殺死但代謝性活性單核細(xì)胞增 生性李斯特菌。
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的組合物，其中所述細(xì)菌是單核細(xì)胞增生性李斯特菌prfA突 變體，其基因組編碼組成性活性PrfA蛋白。
47.根據(jù)權(quán)利要求36所述的組合物，其中所述核酸序列是優(yōu)化用于通過(guò)單核細(xì)胞增生 性李斯特菌表達(dá)的密碼子。
48.根據(jù)權(quán)利要求31所述的組合物，其中所述組合物還包含藥學(xué)上可接受的賦形劑。
49.根據(jù)權(quán)利要求31-35中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述核酸分子將所述免疫原性 HCV抗原多肽編碼為包含分泌信號(hào)序列的融合蛋白。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的組合物，其中所述分泌信號(hào)序列是單核細(xì)胞增生性李斯特 菌ActA信號(hào)序列。
51.根據(jù)權(quán)利要求49所述的組合物，其中所述核酸分子將所述免疫原性HCV抗原多肽 編碼為融合蛋白，所述融合蛋白包含選自由SEQ ID NO 37,SEQ ID NO 38,SEQ ID NO :39、 SEQ ID NO :40構(gòu)成的組的框內(nèi)ActA-mOO序列、或與所述ActA-mOO序列具有至少90%序 列同一性的氨基酸序列。
52.根據(jù)權(quán)利要求31所述的組合物，其中所述組合物包含含有核酸分子的單核細(xì)胞增 生性李斯特菌，其序列編碼融合蛋白，包含(a)選自由SEQ ID NO :37、SEQ ID NO :38、SEQ ID NO :39、SEQ ID NO 40 構(gòu)成的組的 ActA-NlOO序列、或與所述ActA-NlOO序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列；(b)包含來(lái)自NS3的至少100個(gè)鄰接殘基的氨基酸序列、或與所述包含來(lái)自NS3的至少100個(gè)鄰接殘基的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列；以及(c)包含來(lái)自NS^3的至少100個(gè)鄰接殘基的氨基酸序列、或與所述包含來(lái)自NS^3的至 少100個(gè)鄰接殘基的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列；其中編碼所述融合蛋白的所述核酸分子可操作地連接單核細(xì)胞增生性李斯特菌ActA 啟動(dòng)子。
53.根據(jù)權(quán)利要求52所述的組合物，其中所述單核細(xì)胞增生性李斯特菌包含核酸分 子，其序列編碼融合蛋白，所述融合蛋白包含具有SEQ ID N0:18或SEQ ID NO 19的序列 的NS^3的氨基酸1-342、或其突變衍生物，其中所述突變使NS^3的RNA聚合酶活性失活； 和具有SEQ ID N0:13或SEQ ID NO :14的序列的NS3的氨基酸172-484、或其突變衍生物， 其中所述突變使NS3的解旋酶活性失活。
54.根據(jù)權(quán)利要求31所述的組合物，其中所述免疫原性HCV抗原多肽包含(a)選自由具有HCV共有序列中列舉的序列的核心、El、E2、p7、NS2、NS3、NS4a、NS4b、 NS5a和NS^3構(gòu)成的組的一種或多種全長(zhǎng)HCV蛋白，所述HCV共有序列選自由SEQ ID NO 7-23構(gòu)成的組；(b)衍生自(a)的一種或多種全長(zhǎng)HCV蛋白的一種或多種氨基酸序列；或(a)的一種或多種全長(zhǎng)HCV蛋白和(b)的一種或多種氨基酸序列的組合。
55.根據(jù)權(quán)利要求31所述的組合物，其中所述免疫原性HCV抗原多肽包含一種或多種 鄰接的HCV氨基酸序列，其不具有超過(guò)李斯特菌ActA-NlOO的峰值疏水性的疏水性區(qū)域。
56.根據(jù)權(quán)利要求31所述的組合物，其中所述免疫原性HCV抗原多肽包含來(lái)自預(yù)計(jì)編 碼一種或多種MHC I類(lèi)抗原表位的核心3132、？7、賂2、賂3、賂乜、賂413、賂^1和賂5匕的 一種或多種的共有序列的一種或多種鄰接的HCV氨基酸序列。
57.根據(jù)權(quán)利要求31所述的組合物，其中所述免疫原性HCV抗原多肽包含來(lái)自預(yù)計(jì)編 碼一種或多種MHC II類(lèi)抗原表位的核心、El、E2、p7、NS2、NS3、NS^、NS4b、NSfe和NS5b的 一種或多種的共有序列的一種或多種鄰接的HCV氨基酸序列。
58.根據(jù)權(quán)利要求31所述的組合物，其中所述免疫原性HCV抗原多肽包含來(lái)自預(yù)計(jì) 編碼一種或多種MHC I類(lèi)抗原表位的核心、El、E2、p7、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b 的一種或多種的共有序列的一種或多種鄰接的HCV氨基酸序列；以及來(lái)自預(yù)計(jì)編碼一種或 多種MHC II類(lèi)抗原表位的核心、El、E2、p7、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NSfe和NS5b的一種或多 種的共有序列的一種或多種鄰接的HCV氨基酸序列。
59.一種在受試者中HCV預(yù)防或治療慢性HCV傳染的方法，所述方法包括在選擇以在所述受試者中誘導(dǎo)所述T細(xì)胞應(yīng)答的條件下，向所述受試者施用組合物， 所述組合物包含表達(dá)一種或多種免疫原性HCV抗原多肽的細(xì)菌，其氨基酸序列包含⑴選自由核心、El、E2、p7、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b構(gòu)成的組中的一種或 多種全長(zhǎng)HCV蛋白；( )衍生自來(lái)自(i)的一種或多種全長(zhǎng)HCV蛋白的一種或多種免疫原性氨基酸序列；或(i)的一種或多種全長(zhǎng)HCV蛋白和(ii)的一種或多種氨基酸序列的組合。
60.根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，其中所述免疫原性HCV抗原多肽包含選自由下列構(gòu) 成的組的一種或多種氨基酸序列全長(zhǎng)NS3、全長(zhǎng)NS^3、衍生自NS3的氨基酸序列、和衍生自NS5b的氨基酸序列。
61.根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，其中所述免疫原性HCV抗原多肽包含選自由下列構(gòu) 成的組的一種或多種氨基酸序列包含來(lái)自NS3的至少100個(gè)鄰接殘基的氨基酸序列、和包 含來(lái)自NS^3的至少100個(gè)鄰接殘基的氨基酸序列。
62.根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，其中所述免疫原性HCV抗原多肽包含選自由下列構(gòu) 成的組的一種或多種氨基酸序列與來(lái)自NS3的至少100個(gè)鄰接殘基具有至少90%序列同 一性的氨基酸序列、和與來(lái)自NS^3的至少100個(gè)鄰接殘基具有至少90%序列同一性的氨基 酸序列。
63.根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，其中所述免疫原性HCV抗原多肽包含選自由下列構(gòu) 成的組的一種或多種氨基酸序列:SEQ ID NO :1、2、3、4、5、42、43、44、45、46、47、48、49、50、 51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、 76、77、78、79、80、81、82 和 83。
64.根據(jù)權(quán)利要求59-63中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)菌是單核細(xì)胞增生性李斯 特菌，其包含編碼整合到所述細(xì)菌的基因組的所述一種或多種免疫原性HCV抗原多肽的核 酸序列。
65.根據(jù)權(quán)利要求64所述的方法，其中所述細(xì)菌是actA缺失突變體或actA插入突變 體、inlB缺失突變體或inlB插入突變體、或者包含actA缺失或actA插入和inlB缺失或 inlB插入的AactA/Δ inlB突變體。
66.根據(jù)權(quán)利要求64所述的方法，其中編碼所述一種或多種免疫原性HCV抗原多肽的 多核苷酸整合到所述細(xì)菌的致病基因中，并且所述多核苷酸的整合干擾所述致病基因的表 達(dá)或干擾所述致病基因的編碼序列。
67.根據(jù)權(quán)利要求66所述的方法，其中所述致病基因是actA或inlB。
68.根據(jù)權(quán)利要求64所述的方法，其中所述細(xì)菌是減弱單核細(xì)胞增生性李斯特菌。
69.根據(jù)權(quán)利要求68所述的方法，其中所述細(xì)菌是LmAactA/AinlB。
70.根據(jù)權(quán)利要求66所述的方法，其中所述細(xì)菌還包含減弱所述細(xì)菌修復(fù)核酸的能力 的基因突變。
71.根據(jù)權(quán)利要求70所述的方法，其中所述基因突變?cè)谶x自phrB、uvrA、uvrB、uvrC、 uvrD和recA的一種或多種基因中。
72.根據(jù)權(quán)利要求68所述的方法，其中所述細(xì)菌是單核細(xì)胞增生性李斯特菌prfA突變 體，其基因組編碼組成性活性prfA蛋白。
73.根據(jù)權(quán)利要求64所述的方法，其中所述細(xì)菌是被殺死但代謝性活性單核細(xì)胞增生 性李斯特菌。
74.根據(jù)權(quán)利要求73所述的方法，其中所述細(xì)菌是單核細(xì)胞增生性李斯特菌prfA突變 體，其基因組編碼組成性活性prfA蛋白。
75.根據(jù)權(quán)利要求64所述的方法，其中所述核酸序列是優(yōu)化用于通過(guò)單核細(xì)胞增生性 李斯特菌表達(dá)的密碼子。
76.根據(jù)權(quán)利要求64所述的方法，其中所述在選擇以在所述受試者中誘導(dǎo)所述T細(xì)胞 應(yīng)答的條件包括通過(guò)選自由下列構(gòu)成的組的一種或多種施用途徑向所述受試者施用所述 單核細(xì)胞增生性李斯特菌口服、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)和皮下。
77.根據(jù)權(quán)利要求59-63中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述免疫原性HCV抗原多肽表達(dá)為 包含分泌信號(hào)序列的融合蛋白。
78.根據(jù)權(quán)利要求77所述的方法，其中所述分泌信號(hào)序列是單核細(xì)胞增生性李斯特菌 ActA信號(hào)序列。
79.根據(jù)權(quán)利要求78所述的方法，其中所述免疫原性HCV抗原多肽表達(dá)為融合蛋白，所 述融合蛋白包含選自由 SEQ ID NO 37, SEQ ID NO 38, SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 40 構(gòu)成 的組的框內(nèi)ActA-NlOO序列、或與所述ActA-NlOO序列具有至少90%序列同一性的氨基酸 序列。
80.根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，其中所述方法包括施用表達(dá)融合蛋白的單核細(xì)胞增 生性李斯特菌，其包含(a)選自由SEQ ID NO :37、SEQ ID NO :38、SEQ ID NO :39、SEQ ID NO 40 構(gòu)成的組的 ActA-NlOO序列、或與所述ActA-NlOO序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列；(b)包含來(lái)自NS3的至少100個(gè)鄰接殘基的氨基酸序列、或與所述包含來(lái)自NS3的至少 100個(gè)鄰接殘基的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列；以及(c)包含來(lái)自NS^3的至少100個(gè)鄰接殘基的氨基酸序列、或與所述包含來(lái)自NS^3的至 少100個(gè)鄰接殘基的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列；其中所述融合蛋白表達(dá)自可操作地連接單核細(xì)胞增生性李斯特菌ActA啟動(dòng)子的核酸 序列。
81.根據(jù)權(quán)利要求80所述的方法，其中所述單核細(xì)胞增生性李斯特菌表達(dá)融合蛋白， 所述融合蛋白包含具有SEQ ID NO 18或SEQ ID NO 19的序列的NS^3的氨基酸1-342、 或其突變衍生物，其中所述突變使NS^3的RNA聚合酶活性失活；和具有SEQ ID NO :13或 SEQ ID NO 14的序列的NS3的氨基酸172-484、或其突變衍生物，其中所述突變使NS3的解 旋酶活性失活。
82.根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，其中所述免疫原性HCV抗原多肽包含(a)選自由具有HCV共有序列中列舉的序列的核心、El、E2、p7、NS2、NS3、NS4a、NS4b、 NS5a和NS^3構(gòu)成的組的一種或多種全長(zhǎng)HCV蛋白，所述HCV共有序列選自由SEQ ID NO 7-23構(gòu)成的組；(b)衍生自(a)的一種或多種全長(zhǎng)HCV蛋白的一種或多種氨基酸序列；或(a)的一種或多種全長(zhǎng)HCV蛋白和(b)的一種或多種氨基酸序列的組合。
83.根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，其中所述免疫原性HCV抗原多肽包含一種或多種鄰 接的HCV氨基酸序列，其不具有超過(guò)李斯特菌ActA-NlOO的峰值疏水性的疏水性區(qū)域。
84.根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，其中所述免疫原性HCV抗原多肽包含來(lái)自預(yù)計(jì)編碼 一種或多種MHC I類(lèi)抗原表位的核心、El、E2、p7、NS2、NS3、NS^、NS4b、NSfe和NS^3的一 種或多種的共有序列的一種或多種鄰接的HCV氨基酸序列。
85.根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，其中所述免疫原性HCV抗原多肽包含來(lái)自預(yù)計(jì)編碼 一種或多種MHC II類(lèi)抗原表位的核心、El、E2、p7、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS 和NS5b的一 種或多種的共有序列的一種或多種鄰接的HCV氨基酸序列。
86.根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，其中所述免疫原性HCV抗原多肽包含來(lái)自預(yù)計(jì)編 碼一種或多種MHC I類(lèi)抗原表位的核心、El、E2、p7、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b的一種或多種的共有序列的一種或多種鄰接的HCV氨基酸序列；以及來(lái)自預(yù)計(jì)編碼一種或多 種MHC II類(lèi)抗原表位的核心3^2、？7、賂2、賂3、賂乜、賂413、賂^1和NS^3的一種或多種 的共有序列的一種或多種鄰接的HCV氨基酸序列。
87.根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，其中所述方法是治療受試者中的慢性HCV傳染的方法。
88.根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，其中當(dāng)遞送至所述受試者時(shí)，所述組合物在所述遞 送后24小時(shí)誘導(dǎo)選自由IL-12p70、IFN- y、IL-6、TNF α和MCP-I構(gòu)成的組的一種或多種 蛋白的血清濃度增加；以及誘導(dǎo)針對(duì)所述免疫原性HCV抗原多肽的一種或多種的CD4+和/ 或⑶8+抗原-特異性T細(xì)胞應(yīng)答。
89.根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，其中所述方法是在未患有慢性HCV傳染的受試者中 HCV預(yù)防的方法。
90.一種藥物組合物，包含權(quán)利要求31-58中任一項(xiàng)所述的組合物；和 藥學(xué)上可接受的賦形劑.
91.根據(jù)權(quán)利要求14或16所述的方法，其中所述細(xì)菌是單核細(xì)胞增生性李斯特菌 PrfA突變體，所述突變體是prfA*突變體。
92.根據(jù)權(quán)利要求44或46所述的組合物，其中所述細(xì)菌是單核細(xì)胞增生性李斯特菌 PrfA突變體，所述突變體是prfA*突變體。
93.根據(jù)權(quán)利要求72或74所述的方法，其中所述細(xì)菌是單核細(xì)胞增生性李斯特菌 PrfA突變體，所述突變體是prfA*突變體。
全文摘要
本發(fā)明提供使用重組編碼和表達(dá)這種抗原的細(xì)菌來(lái)遞送一種或多種丙型肝炎病毒(HCV)抗原的組合物和方法。在某些實(shí)施方案中，細(xì)菌平臺(tái)包括使用減弱和被殺死但代謝性活性形式的單核細(xì)胞增生性李斯特菌。
文檔編號(hào)A61K39/29GK102149406SQ200980135580
公開(kāi)日2011年8月10日 申請(qǐng)日期2009年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月24日
發(fā)明者P·M·勞爾, T·W·小杜本斯蓋 申請(qǐng)人:艾杜羅生物科技公司