流感血凝素和神經(jīng)氨酸酶變體的制作方法

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專(zhuān)利名稱(chēng)：流感血凝素和神經(jīng)氨酸酶變體的制作方法
流感血凝素和神經(jīng)氨酸酶變體
背景技術(shù)：
由于每年有許多個(gè)體感染毒株和類(lèi)型不同的流感病毒，因此從公眾健康立場(chǎng)和商業(yè)而言抵御各種正在演化的流感病毒株的疫苗至關(guān)重要。特別是此類(lèi)感染有引起健康護(hù)理不足和免疫力弱嬰兒和老年人死亡的危險(xiǎn)。流感感染問(wèn)題的復(fù)雜性在于其易于演化產(chǎn)生新的流感病毒株并在不同物種之間傳播，因而必需不斷生產(chǎn)新的疫苗。50年來(lái)，已生產(chǎn)了對(duì)不同流感病毒/病毒株能產(chǎn)生特異性保護(hù)性免疫應(yīng)答的許多疫苗，包括全病毒疫苗、裂解病毒疫苗、表面抗原疫苗和減毒病毒活疫苗。然而，雖然任何一種類(lèi)型的這些疫苗的合適制劑均可產(chǎn)生全身性免疫應(yīng)答，但減毒病毒活疫苗的優(yōu)點(diǎn)是還能激發(fā)呼吸道的局部黏膜免疫力。本發(fā)明人和同事為生產(chǎn)這種疫苗已對(duì)流感病毒及其片段的生產(chǎn)作了大量工作；參見(jiàn)例如，2002年10月23日提交的美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?0/420，708 ； 2003年4月25日提交的美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?0/423，828 ；和2004年5月M日提交的美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?60/574，117 ；所有申請(qǐng)的名稱(chēng)均為“制備流感病毒的多質(zhì)粒系統(tǒng)(Multi-Plasmid System for the Production of Influenza Virus)”。因?yàn)椴粩喑霈F(xiàn)(或重現(xiàn))不同的流感病毒株，故不斷需要新的流感疫苗。通常采用新出現(xiàn)的病毒株抗原成分來(lái)生產(chǎn)此類(lèi)疫苗，因此，新的、新出現(xiàn)的或新重現(xiàn)的病毒株的多肽和多核苷酸(特別是抗原的基因序列)甚為理想。此外，位于優(yōu)選載體中的此類(lèi)序列也十分理想。本發(fā)明提供了能用于生產(chǎn)多種類(lèi)型疫苗以及研究、診斷等的、任選位于優(yōu)選載體中的、新的和/或新分離的流感血凝素和神經(jīng)氨酸酶變體。通過(guò)瀏覽下文后將會(huì)明白本發(fā) 明的其他許多益處。發(fā)明概述在本文的一些方面，本發(fā)明包括一種分離或重組的多肽，其選自包含選自SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27的任一核苷酸序列所編碼氨基酸序列的多肽；包含選自 SEQ ID NO 1 的殘基 74-1060、SEQ ID NO 1 的殘基 1061-1723、SEQ ID NO 5 的殘基 81-1058、SEQ ID NO 5 的殘基 1059-1724、SEQ ID NO 9 的殘基 85-1116、SEQ ID NO :9 的殘基 79-1116、SEQ ID NO :9 的殘基 1117-1785、SEQ ID NO 13 的殘基 78-1064、 SEQ ID NO 13 的殘基 1065-1727、SEQ ID NO :17 的殘基 78-1055、SEQ ID NO 17 的殘基 1056-1721、SEQ ID NO 21 的殘基 78-1118、SEQ ID NO 21 的殘基 1119-1787、SEQ ID NO 25的殘基75-1115、或SEQ ID NO 25的殘基1116-1787的任一核苷酸序列所編碼氨基酸序列的多肽；包含選自 SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24J6 或28 的氨基酸序列的多肽；包含選自SEQ ID NO 2的殘基17-345、SEQ ID NO 2的殘基346-566、SEQ ID NO 6 的殘基 18-343、SEQ ID NO 6 的殘基；344_565、SEQ ID NO 10 的殘基 18-361、SEQ ID NO 10 的殘基 16-361、SEQ ID NO 10 的殘基 362-584、SEQ ID NO 14 的殘基 17-345、SEQ ID NO 14 的殘基 346-566、SEQ ID NO 18 的殘基 18-343、SEQ ID NO 18 的殘基 344-565, SEQ ID NO :22 的殘基 16-362、SEQ ID NO :22 的殘基 363_585、SEQ ID NO J6 的殘基 16-362 或SEQ ID NO :26的殘基363-585的氨基酸序列的多肽；在高度嚴(yán)謹(jǐn)性條件下能與所列出序列的多核苷酸序列基本全長(zhǎng)雜交的多核苷酸序列編碼的任何多肽；和以上任一序列的片段，其中所述序列包含血凝素或神經(jīng)氨酸酶多肽，或血凝素或神經(jīng)氨酸酶多肽的片段。在各種實(shí)施方式中，本發(fā)明的分離或重組的多肽與任何上述多肽有約300個(gè)毗連氨基酸殘基基本相同。在還有其它實(shí)施方式中，本發(fā)明包括分離或重組的多肽(包含血凝素或神經(jīng)氨酸酶或血凝素或神經(jīng)氨酸酶的片段)，所述多肽包含的氨基酸序列與SEQ ID N0:2、4、6、8、10、 12、14、16、18、20、22、24、26和28中任何一個(gè)的相毗連的至少約350個(gè)氨基酸；至少約400 個(gè)氨基酸；至少約450個(gè)氨基酸；至少約500個(gè)氨基酸；至少約502個(gè)氨基酸；至少約550 個(gè)氨基酸；至少約559個(gè)氨基酸；至少約565個(gè)氨基酸；或至少約566個(gè)氨基酸基本相同。在還有其它實(shí)施方式中，本發(fā)明包括分離或重組的多肽(例如，包含神經(jīng)氨酸酶、血凝素或神經(jīng)氨酸酶或血凝素的片段)，所述多肽包含的氨基酸序列與SEQ ID N0:2、4、6、8、10、12、 14、16、18、20、22、24、沈和觀(guān)中任何一個(gè)多肽的相毗連的至少約350個(gè)氨基酸；至少約400 個(gè)氨基酸；至少約436個(gè)氨基酸；至少約450個(gè)氨基酸；至少約451個(gè)氨基酸；至少約465 個(gè)氨基酸；至少約466個(gè)氨基酸；至少約469個(gè)氨基酸；或至少約470個(gè)氨基酸基本相同。當(dāng)然，在一些實(shí)施方式中，所述多肽序列(例如，本文序列表所列出的，例如SEQ ID NO 2, 4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26和28)包含不到565,559個(gè)等等的氨基酸序列。在還有其它實(shí)施方式中，本發(fā)明多肽任選包含融合蛋白、含前導(dǎo)序列的蛋白、前體多肽、含分泌信號(hào)或定位信號(hào)(localization signal)的蛋白或含表位標(biāo)簽、E-標(biāo)簽或His表位標(biāo)簽的蛋白，等等。在還有其它實(shí)施方式中，本發(fā)明包括所含的序列與至少一種上面列出的多月太(例如，SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26 和 28，SEQ ID NO :2 的殘基 17-345、SEQ ID NO 2 的殘基 346-566、SEQ ID NO 6 的殘基 18-343、SEQ ID NO 6 的殘基 344-565,SEQ ID NO 10 的殘基 18-361、SEQ ID NO 10 的殘基 16-361、SEQ ID NO 10 的殘基 362-584、SEQ ID NO 14 的殘基 17-345、SEQ ID NO 14 的殘基 346-566、SEQ ID NO 18 的殘基 18-343、SEQ ID NO 18 的殘基 344-565, SEQ ID NO 22 的殘基 16-362、SEQ ID NO 22 的殘基 363-585、SEQ ID NO :26 的殘基 16-362 和 SEQ ID NO J6 的殘基 363-585)有至少 95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少98. 5%、至少99%、至少99. 2%、至少99. 4%, 至少99. 6%、至少99. 8%或至少99. 9%序列相同的多肽。在一些實(shí)施方式中，此類(lèi)多肽是免疫原性多肽。本發(fā)明的HA序列包括含有未修飾的和經(jīng)修飾的多元切割位點(diǎn)的那些序列。在其它方面，本發(fā)明包括含有一種或多種上述多肽或其片段的組合物。本發(fā)明還包括可被多克隆抗血清特異性結(jié)合的多肽或其片段，所述抗血清是用包含至少一條上述氨基酸序列(例如，SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、洸和沘，SEQ ID N0:2 的殘基 17-345、SEQ ID NO 2 的殘基 346-566、SEQ ID NO 6 的殘基 18-343、SEQ ID NO 6 的殘基；344-565、SEQ ID NO 10 的殘基 18-361、SEQ ID NO 10 的殘基 16-361 和 SEQ ID NO 10 的殘基 362-584、SEQ ID NO 14 的殘基 17-345、SEQ ID NO 14 的殘基 346-566、SEQ ID NO 18 的殘基 18-343、SEQ ID NO 18 的殘基；344_565、SEQ ID NO 22 的殘基 16-362、SEQ ID NO 22 的殘基 363-585、SEQ ID NO J6 的殘基 16-362 和 SEQ ID NO J6 的殘基 363-585) 的至少1種抗原產(chǎn)生的多克隆抗血清。上述多肽的此種特異性抗體也是本發(fā)明的特征。本發(fā)明多肽任選具有免疫原性。本發(fā)明還包括含有免疫有效量的一種或多種上述多肽的免疫原性組合物以及激發(fā)個(gè)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生對(duì)流感病毒的保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法，包括給予所述個(gè)體用生理學(xué)上可接受的運(yùn)載體配制的免疫有效量的一種或多種上述多肽(例如，包含以下氨基酸序列的多肽SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26 或 28，SEQ ID NO :2 的殘基 17-345、SEQ ID NO 2 的殘基 346-566、SEQ ID NO 6 的殘基 18-343、SEQ ID NO 6 的殘基 344-565、SEQ ID NO 10 的殘基 18-361、SEQ ID NO 10 的殘基 16-361 和 SEQ ID NO 10 的殘基 362-584、SEQ ID NO :14 的殘基 17_345、SEQ ID NO 14 的殘基 346_566、SEQ ID NO :18 的殘基 18-343、SEQ ID NO 18 的殘基 344-565, SEQ ID NO 22 的殘基 16-362、SEQ ID NO 22 的殘基 363-585、SEQ ID NO 26 的殘基 16-362 或 SEQ ID NO 26 的殘基 363-585)。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的免疫原性組合物是包含3種重配流感病毒株的三價(jià)免疫原性組合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的免疫原性組合物是包含兩種重配甲型流感病毒株和一種重配乙型流感病毒株的三價(jià)免疫原性組合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的免疫原性組合物是包含Hl型重配甲型流感病毒株、H3型重配甲型流感病毒株和重配乙型流感病毒株的三價(jià)免疫原性組合物。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的免疫原性組合物是包含4種重配流感病毒株的四價(jià)免疫原性組合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的免疫原性組合物是包含兩種重配甲型流感病毒株和兩種重配乙型流感病毒株的四價(jià)免疫原性組合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的免疫原性組合物是包含Hl型重配甲型流感病毒株、H3型重配甲型流感病毒株、維多利亞(Victoria)系重配乙型流感病毒株和山形(Yamagata)系重配乙型流感病毒株的四價(jià)免疫原性組合物。除了包含免疫有效量的此類(lèi)重配流感病毒的免疫原性組合物外，本發(fā)明還包括含有編碼上述一種或多種多肽(例如，包含以下氨基酸序列的多肽SEQ ID N0:2、4、6、8、 10、12、14、16、18、20、22、24、26 或 28，SEQ ID NO :2 的殘基 17-345、SEQ ID NO :2 的殘基 346-566、SEQ ID NO 6 的殘基 18-343、SEQ ID NO 6 的殘基；344_565、SEQ ID NO 10 的殘基 18-361、SEQ ID NO 10 的殘基 16-361 和 SEQ ID NO 10 的殘基 362-584、SEQ ID NO 14 的殘基 17-345、SEQ ID NO 14 的殘基 346-566、SEQ ID NO 18 的殘基 18-343、SEQ ID NO 18 的殘基 344-565, SEQ ID NO 22 的殘基 16-362、SEQ ID NO 22 的殘基 363-585、SEQ ID NO J6的殘基16-362或SEQ ID NO J6的殘基363-58 的基因組區(qū)段的重配流感病毒。激發(fā)個(gè)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抵御流感病毒的保護(hù)性免疫應(yīng)答方法也是本發(fā)明的一部分，包括給予用生理學(xué)上可接受的載體配制的免疫有效量的此類(lèi)重配流感病毒。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的重配流感病毒是6 2重配病毒，其包含一種或多種供體病毒(例如，A/AA/6/60、B/ Ann Arbor/1/66,A/Puerto Rico/8/34 (更常稱(chēng)為PR8)、B/Leningrad/14/17/55、B/14/5/l、 B/USSR/60/69、B/Leningrad/179/86、B/Leningrad/14/55 或 B/England/^608/76)的 6 個(gè) 基因組內(nèi)部區(qū)段，還包含2個(gè)基因組區(qū)段(通常優(yōu)選編碼HA和NA或其片段)，這2個(gè)區(qū)段包含具有選自以下的核苷酸序列的多核苷酸=SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、 23、25、27、SEQ ID NO 1 的殘基 74-1060,SEQ ID NO 1 的殘基 1061-1723、SEQ ID NO 5 的殘基 81-1058、SEQ ID NO 5 的殘基 1059-1724、SEQ ID NO :9 的殘基 85-1116、SEQ ID NO: 9 的殘基 79-1116、SEQ ID NO :9 的殘基 1117_1785、SEQ ID NO 13 的殘基 78_1064、SEQ ID NO :13 的殘基 1065-1727、SEQ ID NO 17 的殘基 78_1055、SEQ ID NO :17 的殘基 1056-1721、 SEQ ID NO :21 的殘基 78-1118、SEQ ID NO :21 的殘基 1119-1787、SEQ ID NO :25 的殘基 75-1115和SEQ ID NO :25的殘基1116-1787，或選自如本文定義的類(lèi)似于SEQ ID N0:l、3、 5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27的核苷酸序列。包含此類(lèi)重配(重組)病毒的免疫
14原性組合物也是本發(fā)明的特征。在其它方面，本發(fā)明包括選自以下的分離或重組多核苷酸包含選自SEQ ID NO 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27的核苷酸序列的多核苷酸或它們的互補(bǔ)序列；包含選自以下的核苷酸序列的多核苷酸SEQ ID NO 1的殘基74-1060、SEQ ID NO 1的殘基 1061-1723、SEQ ID NO :5 的殘基 81-1058、SEQ ID NO 5 的殘基 1059-1724、SEQ ID NO: 9 的殘基 85-1116、SEQ ID NO 9 的殘基 79-1116、SEQ ID NO 9 的殘基 1117-1785、SEQ ID NO 13 的殘基 78-1064、SEQ ID NO 13 的殘基 1065-1727、SEQ ID NO 17 的殘基 78-1055、 SEQ ID NO 17 的殘基 1056-1721、SEQ ID NO 21 的殘基 78-1118、SEQ ID NO 21 的殘基 1119-1787,SEQ ID NO :25 的殘基 75-1115 和 SEQ ID NO :25 的殘基 1116-1787 的核苷酸序列或它們的互補(bǔ)序列；編碼包含選自以下的氨基酸序列的多肽的多核苷酸SEQ ID NO 2, 4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26和 28、SEQ ID NO :2 的殘基 17_345、SEQ ID N0:2 的殘基 346-566、SEQ ID NO 6 的殘基 18-343、SEQ ID NO 6 的殘基；344_565、SEQ ID NO 10 的殘基 18-361、SEQ ID NO 10 的殘基 16-361 和 SEQ ID NO 10 的殘基 362-584、SEQ ID NO 14 的殘基 17-345、SEQ ID NO 14 的殘基 346-566、SEQ ID NO 18 的殘基 18-343、SEQ ID NO 18 的殘基；344-565、SEQ ID NO 22 的殘基 16-362、SEQ ID NO 22 的殘基 363-585、SEQ ID NO 26的殘基16-362或SEQ ID NO 26的殘基363-585或它們的互補(bǔ)核苷酸序列；在高度嚴(yán)謹(jǐn)性條件下能與任何以上多核苷酸序列基本上全長(zhǎng)雜交的多核苷酸序列、和包含任何以上多核苷酸序列的全部或片段的多核苷酸序列，其中所述序列編碼血凝素或神經(jīng)氨酸酶多肽或一個(gè)或多個(gè)HA或NA片段。此類(lèi)多核苷酸可以是DNA、RNA、cRNA、DNA:RNA雜交體、單鏈多核苷酸、雙鏈多核苷酸等。本發(fā)明還包括編碼血凝素或神經(jīng)氨酸酶多肽或血凝素或神經(jīng)氨酸酶片段的任何一種上述多核苷酸。本發(fā)明的其它方面包括編碼多肽(任選血凝素或神經(jīng)氨酸酶多肽)的分離或重組的多核苷酸，所述多肽的序列與上述多肽的至少一種有至少95%相同、至少96%相同、至少97%相同、至少98%相同、至少98. 5%相同、至少99% 相同、至少99. 2%相同、至少99. 4%相同、至少99. 6%相同、至少99. 8%相同或至少99. 9% 序列相同。本發(fā)明還包括編碼通過(guò)突變或重組一種或多種上述多核苷酸序列所產(chǎn)生的血凝素或神經(jīng)氨酸酶多肽的分離或重組的多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸序列可任選包含，例如前導(dǎo)序列、前體序列或表位標(biāo)簽序列等的一種或多種，任選可編碼融合蛋白(例如，含一種或多種額外的核苷酸序列)。本發(fā)明的此類(lèi)多核苷酸可任選編碼免疫原性多肽。在還有其它實(shí)施方式中，本發(fā)明包括含有兩種或多種上述多核苷酸或其片段物質(zhì) 的組合物(例如，包含至少約2、5、10、50或更多種多核苷酸的文庫(kù))?？扇芜x通過(guò)切割一種或多種上述多核苷酸(例如，機(jī)械、化學(xué)、用限制性?xún)?nèi)切酶/RNA酶/DNA酶的酶學(xué)方法等) 來(lái)產(chǎn)生此類(lèi)組合物。本發(fā)明的其它組合物包括，例如在脫氧核糖核苷酸三磷酸和熱穩(wěn)定聚合酶存在下溫育一種或多種上述多核苷酸所產(chǎn)生的組合物。含有免疫有效量的任何一種上述多核苷酸的免疫原性組合物也屬于本發(fā)明。本發(fā)明還包括含有任何上述多核苷酸的重配流感病毒。在一個(gè)實(shí)施方式中，此類(lèi) 重配病毒是6 2重配病毒，其包含一種或多種供體病毒(例如，Α/ΑΑ/6/60、Β/ΑΑ/1/66(本文有時(shí)稱(chēng)為 B/Ann Arbor/1/66)、B/Leningrad/14/17/55、B/14/5/1、B/USSR/60/69、B/ Leningrad/179/86>B/Leningrad/14/55B/England/2608/76A/Puerto Rico/8/34)的 6個(gè)基因組內(nèi)部區(qū)段和包含具有選自以下的核苷酸序列的多核苷酸的2個(gè)基因組區(qū)段SEQID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、SEQ ID NO 1 的殘基 74-1060、SEQ ID NO :1 的殘基 1061-1723、SEQ ID NO :5 的殘基81_1058、SEQ ID NO :5 的殘基 1059_1724、SEQ ID NO 9 的殘基 85-1116、SEQ ID NO 9 的殘基 79-1116、SEQ ID NO 9 的殘基 1117-1785、 SEQ ID NO 13 的殘基 78-1064、SEQ ID NO 13 的殘基 1065-1727、SEQ IDNO :17 的殘基 78-1055、SEQ ID NO :17 的殘基 1056-1721、SEQ ID NO :21 的殘基 78-1118、SEQ ID NO 21 的殘基 1119-1787、SEQ ID NO :25 的殘基 75-1115 和 SEQ ID NO :25 的殘基 1116-1787。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述兩個(gè)基因組區(qū)段編碼血凝素和/或神經(jīng)氨酸酶。包含免疫有效量的此類(lèi)重配/重組流感病毒的免疫原性組合物也屬于本發(fā)明范圍。含有選自以下核苷酸序列的一種或多種多核苷酸或其片段的載體也屬于本發(fā)明范圍SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、SEQ ID NO :1 的殘基74-1060、 SEQ ID NO :1 的殘基 1061-1723、SEQ ID NO :5 的殘基 81-1058、SEQ ID N0:5 的殘基 1059-1724、SEQ ID NO 9 的殘基 85-1116、SEQ ID NO 9 的殘基 79-1116、SEQ ID NO 9 的殘基 1117-1785、SEQ ID NO 13 的殘基 78-1064、SEQ ID NO: 13 的殘基 1065-1727、SEQ ID NO 17 的殘基 78-1055、SEQ ID NO 17 的殘基 1056-1721、SEQ ID NO 21 的殘基 78-1118、 SEQ ID NO 21 的殘基 1119-1787、SEQ ID NO 25 的殘基 75-1115 和 SEQ ID NO 25 的殘基 1116-1787。此類(lèi)載體(例如，表達(dá)載體)任選可以是質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、病毒、病毒片段等。特別優(yōu)選的實(shí)施方式包括用于質(zhì)粒拯救方法以產(chǎn)生病毒(例如，通常是用于疫苗的重配/ 重組病毒)的質(zhì)粒載體。此類(lèi)質(zhì)粒系統(tǒng)的例子公開(kāi)于，例如2002年10月23日提交的美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?0/420，708，2003年4月25日提交的美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?0/423，擬8和2004年5月M日提交的美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?0/574，117，名稱(chēng)均是“用于產(chǎn)生流感病毒的多質(zhì)粒系統(tǒng)(Multi-Plasmid System for the Production of Influenza Virus)” ；Hoffmann, E. ，2000， PNAS,97(11) 6108-6113 ；Hoffmann的美國(guó)公布專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?0020164770 ；和2003年4月8日授予Palese 等的美國(guó)專(zhuān)利6，544, 785。包含此類(lèi)載體的細(xì)胞以及用此類(lèi)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染等的細(xì)胞也屬于本發(fā)明范圍。本發(fā)明還包括含有至少一種上述多核苷酸或其切割或擴(kuò)增片段或產(chǎn)物的細(xì)胞。此類(lèi)細(xì)胞可任選表達(dá)此類(lèi)多核苷酸編碼的多肽。本發(fā)明的其它實(shí)施方式包括含有任何一種上述多核苷酸的載體(例如，質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、病毒、病毒片段等)。在一個(gè)實(shí)施方式中，此類(lèi)載體是表達(dá)載體。本發(fā)明還包括含有一種或多種上述多核苷酸(例如，包含選自以下核苷酸序列的多核苷酸SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、SEQ ID N0:1 的殘基 74-1060,SEQ ID NO 1 的殘基 1061_1723、SEQ ID NO :5 的殘基81_1058、SEQ ID NO :5 的殘基 1059-1724、SEQ ID NO :9 的殘基85_1116、SEQ ID NO :9 的殘基 79_1116、SEQ ID NO :9 的殘基 1117-1785、SEQ ID NO 13 的殘基 78-1064、SEQ ID NO 13 的殘基 1065-1727、SEQ ID NO 17 的殘基 78-1055、SEQ ID NO 17 的殘基 1056-1721、SEQ ID NO 21 的殘基 78-1118、 SEQ ID NO 21 的殘基 1119-1787、SEQ ID NO 25 的殘基 75-1115 和 SEQ ID NO 25 的殘基 1116-1787，和任選編碼血凝素和/或神經(jīng)氨酸酶)或其一個(gè)或多個(gè)片段的病毒(例如，流感病毒)。在一個(gè)實(shí)施方式中，此類(lèi)病毒是重配/重組病毒。包含本發(fā)明重配/重組病毒的免疫原性組合物也是本發(fā)明的一部分。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的重配病毒是6 2 重配病毒，其包含一種或多種供體病毒(例如，主供體病毒或骨架病毒，如A/AA/6/60、B/AA/1/66、A/Puerto Rico/8/34、B/Leningrad/14/17/55、B/14/5/1、B/USSR/60/69、B/ Leningrad/179/86、B/Leningrad/14/55 或 B/England/^608/76 等)的 6 個(gè)基因組內(nèi)部區(qū) 段和包含具有選自以下的核苷酸序列的多核苷酸的2個(gè)基因組區(qū)段SEQ ID NO :1,3,5, 7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、SEQ ID NO 1 的殘基 74-1060、SEQ ID NO :1 的殘基 1061-1723,SEQ ID NO :5 的殘基 81_1058、SEQ ID NO :5 的殘基 1059_1724、SEQ ID NO :9 的殘基85-1116、SEQ ID NO :9 的殘基 79_1116、SEQ ID NO :9 的殘基 1117_1785、SEQ ID NO :13 的殘基 78-1064、SEQ ID NO 13 的殘基 1065-1727、SEQ ID NO 17 的殘基 78-1055、SEQ ID NO :17 的殘基 1056-1721、SEQ ID NO :21 的殘基 78_1118、SEQ ID NO :21 的殘基 1119-1787、 SEQ ID NO :25的殘基75-1115和SEQ ID NO :25的殘基1116-1787。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的重配病毒是7 1重配病毒，其包含一種或多種供體病毒(例如，主供體病毒或骨架病毒，如 A/AA/6/60、B/AA/1/66、A/Puerto Rico/8/34、B/Leningrad/14/17/55、Β/14/5/1、 B/USSR/60/69、B/Leningrad/179/86、B/Leningrad/14/55 或 B/England/^608/76 等)的 6 個(gè)基因組內(nèi)部區(qū)段和1個(gè)血凝素或神經(jīng)氨酸酶編碼基因組區(qū)段，另外還包含1個(gè)基因組區(qū) 段，該區(qū)段包含具有選自以下的核苷酸序列的多核苷酸SEQ ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15、 17、19、21、23、25、27、SEQ ID NO : 1 的殘基 74_1060、SEQ ID NO : 1 的殘基 1061_1723、SEQ ID NO 5 的殘基 81-1058、SEQ ID NO :5 的殘基 1059-1724、SEQ ID NO :9 的殘基 85-1116、SEQ ID NO :9 的殘基 79-1116、SEQ ID NO :9 的殘基 1117_1785、SEQ ID NO : 13 的殘基 78-1064、 SEQ ID NO 13 的殘基 1065-1727、SEQ ID NO :17 的殘基 78-1055、SEQ ID NO :17 的殘基 1056-1721、SEQ ID NO :21 的殘基 78-1118、SEQ ID NO :21 的殘基 1119-1787、SEQ ID NO 25的殘基75-1115和SEQ ID NO :25的殘基1116-1787。本發(fā)明的重配病毒(任選活病毒) 可包含供體病毒，所述供體病毒是一種或多種，例如溫度敏感的(ts)、冷適應(yīng)的(ca)或減毒的(att)病毒。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的重配病毒株包括A/Arm Arbor/6/60、B/Arm Arbor/1/66、A/Puerto Rico/8/34、B/Leningrad/14/17/55、B/14/5/1、B/USSR/60/69、B/ Leningrad/179/86、B/Leningrad/14/55 或 B/England/2608/76 中的任何一種的至少一個(gè)、至少兩個(gè)、至少三個(gè)、至少四個(gè)、至少五個(gè)或六個(gè)基因組內(nèi)部區(qū)段。在許多實(shí)施方式中，產(chǎn)生的病毒是活病毒(例如，用于疫苗中，等等)。其它實(shí)施方式包括死病毒或滅活病毒(例如，也能用于疫苗中，等等)。包含本發(fā)明病毒的細(xì)胞也是本發(fā)明的產(chǎn)品。還考慮了通過(guò)培養(yǎng)包含本發(fā)明多核苷酸的宿主細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生重配/重組流感病毒的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明方法包括可將多個(gè)包含對(duì)應(yīng)于流感病毒基因組的多核苷酸的載體引入宿主細(xì)胞群中，所述多個(gè)載體包含第一流感病毒株(例如，A/AA/6/60、B/AA/1/66、A/PR/8/34、B/ Leningrad/14/17/55、B/14/5/1、B/USSR/60/69、B/Leningrad/179/86、B/Leningrad/14/55 或B/England/^608/76)的至少6個(gè)基因組內(nèi)部區(qū)段和包含具有選自以下的核苷酸序列的多核苷酸的至少一個(gè)基因組區(qū)段:SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、 27、SEQ ID NO 1 的殘基 74-1060、SEQ ID NO 1 的殘基 1061-1723、SEQ ID NO 5 的殘基 81-1058、SEQ ID NO 5 的殘基 1059-1724、SEQ ID NO 9 的殘基 85-1116、SEQ ID NO 9 的殘基 79-1116、SEQ ID NO :9 的殘基 1117_1785、SEQ ID NO :13 的殘基 78_1064、SEQ ID NO: 13 的殘基 1065-1727、SEQ ID NO 17 的殘基 78_1055、SEQ ID NO :17 的殘基 1056_1721、SEQ ID NO :21 的殘基 78-1118、SEQ ID NO :21 的殘基 1119_1787、SEQ ID NO :25 的殘基 75-1115和SEQ ID NO 25的殘基1116-1787，其中所述宿主細(xì)胞群能支持流感病毒復(fù)制；培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞群；和回收多個(gè)流感病毒。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述第一流感病毒株是冷適應(yīng)和/或溫度敏感和/或減毒病毒株。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明方法產(chǎn)生的病毒適合作為鼻內(nèi)疫苗制劑的一部分給予。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明方法產(chǎn)生的病毒適合作為死疫苗或滅活疫苗制劑、活疫苗/減毒非鼻部疫苗制劑等給予。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明方法產(chǎn)生的病毒是甲型流感病毒。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明方法產(chǎn)生的病毒是乙型流感病毒。用于此類(lèi)方法的宿主細(xì)胞可任選包括，例如Vero細(xì)胞、PerC6細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、293T細(xì)胞、COS細(xì)胞等。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明方法不包括采用輔助病毒。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述多個(gè)載體是八個(gè)質(zhì)粒載體。在本文的其它實(shí)施方式中，本發(fā)明包括含有免疫有效量的一種或多種上述重配流感病毒(例如，活病毒)的免疫原性組合物。其它實(shí)施方式包括激發(fā)個(gè)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抵御流感病毒的保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法，包括給予該個(gè)體免疫有效量的一種或多種上述重配流感病毒(任選用生理學(xué)上有效的運(yùn)載體配制)。本發(fā)明的其它方面包括產(chǎn)生包含選自以下的氨基酸序列的分離或重組多肽的方法SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、SEQ ID NO :2 的殘基 17-345、 SEQ ID NO 2 的殘基 346-566、SEQID NO 6 的殘基 18-343、SEQ ID NO 6 的殘基；344_565、 SEQ ID NO :10 的殘基 18-361、SEQ ID NO :10 的殘基 16-361 和 SEQ ID NO :10 的殘基 362-584、SEQ ID NO 14 的殘基 17-345、SEQ ID NO 14 的殘基 346-566、SEQ ID NO 18 的殘基 18-343、SEQ ID NO 18 的殘基 344-565、SEQ ID NO 22 的殘基 16-362、SEQ ID NO 22 的殘基363-585、SEQ ID NO :26的殘基16-362或SEQ ID NO J6的殘基363-585，所述方法包括在允許重組多肽表達(dá)的條件下，用合適的培養(yǎng)基培養(yǎng)包含上述多核苷酸的宿主細(xì)胞，和分離一個(gè)或多個(gè)宿主細(xì)胞所產(chǎn)生的或其生長(zhǎng)培養(yǎng)液中的所述多肽。免疫原性組合物也是本發(fā)明的特征。例如，包含一種或多種本發(fā)明多肽(例如，包含選自以下的氨基酸序列的多肽:SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、洸、28、 SEQ ID NO 2 的殘基 17-345、SEQID NO 2 的殘基 346-566、SEQ ID NO 6 的殘基 18-343、 SEQ ID NO 6 的殘基 344-565,SEQ ID NO 10 的殘基 18-36USEQ ID NO 10 的殘基 16-361 和 SEQ ID NO 10 的殘基 362-584、SEQ ID NO 14 的殘基 17-345、SEQ ID NO 14 的殘基 346-566,SEQ ID NO 18 的殘基 18_343、SEQ ID NO 18 的殘基 344_565、SEQ ID NO :22 的殘基 16-362、SEQ ID NO 22 的殘基 363-585、SEQ ID NO 26 的殘基 16-362 和 SEQ ID NO 26 的殘基363-585)和/或多核苷酸(例如，包含選自以下的核苷酸序列的多核苷酸SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、SEQ ID NO 1 的殘基 74-1060、SEQ ID NO 1 的殘基 1061-1723、SEQ ID NO 5 的殘基 81-1058、SEQ ID NO 5 的殘基 1059-1724、SEQ ID NO 9 的殘基 85-1116、SEQ ID NO 9 的殘基 79-1116、SEQ ID NO 9 的殘基 1117-1785、 SEQ ID NO 13 的殘基 78-1064、SEQ ID NO 13 的殘基 1065-1727、SEQ ID NO 17 的殘基 78-1055、SEQ ID NO :17 的殘基 1056-1721、SEQ ID NO :21 的殘基 78-1118、SEQ ID NO 21 的殘基 1119-1787,SEQ ID NO 25 的殘基 75-1115 和 SEQ ID NO 25 的殘基 1116-1787)及任選的賦形劑，例如藥學(xué)上可接受的賦形劑或一種或多種藥學(xué)上可接受的給藥組分的免疫原性組合物。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的免疫原性組合物包含本發(fā)明的重配病毒。
本發(fā)明還包括生產(chǎn)流感病毒疫苗的方法。例如，本發(fā)明包括將多個(gè)包含對(duì)應(yīng)于流感病毒(例如，甲型或乙型流感)基因組多核苷酸的載體(例如，質(zhì)粒載體)引入能支持此類(lèi)病毒復(fù)制的宿主細(xì)胞群中，培養(yǎng)該細(xì)胞，回收多個(gè)流感病毒并將一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑與此類(lèi)病毒一起提供給個(gè)體(例如，需要此種治療的個(gè)體)。此類(lèi)病毒可任選是冷適應(yīng)和/或溫度敏感的病毒，優(yōu)選以適合鼻內(nèi)疫苗接種的制劑給予。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述多個(gè)載體包含對(duì)應(yīng)于第一流感病毒株(例如，A/AA/6/60、B/AA/1/66、A/PR/8/34、B/ Leningrad/14/17/55、B/14/5/1、B/USSR/60/69、B/Leningrad/179/86、B/Leningrad/14/55 或B/England/^608/76)的6個(gè)基因組內(nèi)部區(qū)段的多核苷酸和包含具有選自以下的核苷酸序列的多核苷酸的一個(gè)或兩個(gè)基因組區(qū)段SEQ ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、 23、25、27、SEQ ID NO :1 的殘基 74-1060,SEQ ID NO :1 的殘基 1061-1723、SEQ ID NO :5 的殘基 81-1058、SEQ ID NO :5 的殘基 1059-1724、SEQ ID NO :9 的殘基 85-1116、SEQ ID NO: 9 的殘基 79-1116、SEQ ID NO :9 的殘基 1117_1785、SEQ ID NO :13 的殘基 78_1064、SEQ ID NO :13 的殘基 1065-1727、SEQ ID NO : 17 的殘基 78_1055、SEQ ID NO :17 的殘基 1056-1721、 SEQ ID NO :21 的殘基 78-1118、SEQ ID NO :21 的殘基 1119-1787、SEQ ID NO :25 的殘基 75-1115和SEQ ID NO :25的殘基1116-1787，其中所述一個(gè)或兩個(gè)基因組區(qū)段任選編碼第二流感病毒株的免疫原性流感表面抗原。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明方法包括將多個(gè)包含對(duì)應(yīng)于流感病毒基因組的多核苷酸的載體引入宿主細(xì)胞群中，所述多個(gè)載體包含第一流感病毒株(例如，A/AA/6/60、B/AA/1/66、A/PR/8/34、B/Leningrad/14/17/55、Β/14/5/1、 B/USSR/60/69、B/Leningrad/179/86、B/Leningrad/14/55 或 B/England/^608/76)的至少 6個(gè)基因組內(nèi)部區(qū)段和包含具有選自以下的核苷酸序列的多核苷酸的至少一個(gè)基因組區(qū) 段SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、SEQ ID NO 1 的殘基 74-1060、 SEQ ID NO :1 的殘基 1061-1723、SEQ ID NO :5 的殘基 81-1058、SEQ ID N0:5 的殘基 1059-1724、SEQ ID NO 9 的殘基 85-1116、SEQ ID NO 9 的殘基 79-1116、SEQ ID NO 9 的殘基 1117-1785、SEQ ID NO 13 的殘基 78-1064、SEQ ID NO 13 的殘基 1065-1727、SEQ ID NO 17 的殘基 78-1055、SEQ ID NO 17 的殘基 1056-1721、SEQ ID NO 21 的殘基 78-1118、 SEQ ID NO 21 的殘基 1119-1787、SEQ ID NO 25 的殘基 75-1115 和 SEQ ID NO 25 的殘基 1116-1787，所述宿主細(xì)胞群能支持流感病毒復(fù)制；培養(yǎng)該宿主細(xì)胞群；和回收多個(gè)流感病本發(fā)明還包括在對(duì)象中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，包括將有效量的任何一種上述病毒給予對(duì)象。此外，預(yù)防性或治療性治療對(duì)象的病毒感染(例如，病毒性流感)的方法也是本發(fā)明的一部分，包括給予產(chǎn)生抵御病毒性流感的免疫原性應(yīng)答有效量的一種或多種上述病毒。此類(lèi)處理的對(duì)象可包括哺乳動(dòng)物(例如，人)。此類(lèi)方法也包括體內(nèi)給予該對(duì)象以及體外或離體給予該對(duì)象的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞。此外，此類(lèi)方法還包括將預(yù)防性或治療性治療病毒感染有效量的病毒和藥學(xué)上可接受的賦形劑的組合物給予對(duì)象。本發(fā)明還包括具有選自以下的一個(gè)或多個(gè)序列和選擇的主供體病毒的物質(zhì)組合物SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、SEQ ID NO 1 的殘基 74-1060、 SEQ ID NO :1 的殘基 1061-1723、SEQ ID NO :5 的殘基 81-1058、SEQ ID N0:5 的殘基 1059-1724、SEQ ID NO 9 的殘基 85-1116、SEQ ID NO 9 的殘基 79-1116、SEQ ID NO 9 的殘基 1117-1785、SEQ ID NO 13 的殘基 78-1064、SEQ ID NO 13 的殘基 1065-1727、SEQ IDNO 17 的殘基 78-1055、SEQ ID NO 17 的殘基 1056-1721、SEQ ID NO 21 的殘基 78-1118、 SEQ ID NO 21 的殘基 1119-1787、SEQ ID NO 25 的殘基 75-1115 和 SEQ ID NO 25 的殘基 1116-1787，其中所選的序列和主供體病毒通常包含6 2重配病毒，S卩，此處HA和NA與供體病毒的其它6種流感基因重配。此類(lèi)供體病毒通常是Ca、att、tS流感病毒株。例如，供體病毒株通?？砂?，例如 A/Ann Arbor/6/60、B/Ann Arbor/1/66、A/Puerto Rico/8/34、B/ Leningrad/14/17/55、B/14/5/1、B/USSR/60/69、B/Leningrad/179/86、B/Leningrad/14/55 或B/England/^608/76及其變體。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道供體病毒株通常隨重配株與重配株而不同。因此，那些改變也包括在本發(fā)明中。本發(fā)明的另一元素包括構(gòu)成此類(lèi)組合物的一種或多種減毒流感活疫苗，例如含有與所選主供體病毒6 2方式重配的本文序列的那些。本發(fā)明的其它方面包括含有與一種或多種主供體病毒(通常仍是Ca、att、tS流感病毒)重配的血凝素多核苷酸和/或神經(jīng)氨酸酶多核苷酸的組合物，其中所述多核苷酸構(gòu) 成與以下所示一種或多種病毒株相同的病毒株SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、 21、23、25、27、SEQ ID NO 1 的殘基 74-1060、SEQ ID NO 1 的殘基 1061-1723、SEQ ID NO 5 的殘基 81-1058、SEQ ID NO 5 的殘基 1059-1724、SEQ ID NO 9 的殘基 85-1116、SEQ ID NO :9 的殘基 79-1116、SEQ ID NO :9 的殘基 1117-1785、SEQ ID NO 13 的殘基 78-1064、 SEQ ID NO :13 的殘基 1065-1727、SEQ ID NO 17 的殘基 78-1055、SEQ ID N0:17 的殘基 1056-1721、SEQ ID NO 21 的殘基 78-1118、SEQ ID NO 21 的殘基 1119-1787、SEQ ID NO 25的殘基75-1115和SEQ ID NO :25的殘基1116-1787。當(dāng)用血凝素抑制試驗(yàn)檢測(cè)到含血凝素和/或神經(jīng)氨酸酶多核苷酸病毒產(chǎn)生的滴度為另一病毒(例如，具有本文所列出序列的病毒)的4-倍范圍內(nèi)時(shí)，通常認(rèn)定含此類(lèi)血凝素和/或神經(jīng)氨酸酶多核苷酸的病毒屬于“同一病毒株”。然而，如下所述，也可采用其它常規(guī)試驗(yàn)來(lái)測(cè)定多核苷酸(即包含其的病毒)是否屬于同一病毒株。閱讀以下詳述后，結(jié)合附圖和權(quán)利要求，可更完全地了解本發(fā)明的這些和其它目的及特征。附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示本發(fā)明的變體血凝素和神經(jīng)氨酸酶多核苷酸和多肽的序列表。圖2顯示圖1所述變體血凝素和神經(jīng)氨酸酶序列的另一種組成。發(fā)明詳述本發(fā)明包括流感血凝素和神經(jīng)氨酸酶的多肽和多核苷酸序列以及包含此類(lèi)序列的載體、病毒、疫苗、組合物等和它們的使用方法。本文中更詳細(xì)描述了本發(fā)明的其它特征。定義除非另有定義，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)的含義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的相同。以下定義是對(duì)本領(lǐng)域這些定義的補(bǔ)充，涉及本申請(qǐng)而不必然歸咎于任何相關(guān)或無(wú)關(guān)的案例，例如不歸咎于任何共同擁有的專(zhuān)利或申請(qǐng)。雖然可采用與本文所述方法相似或相等的任何方法和材料實(shí)施或檢驗(yàn)本發(fā)明，但本文所述的是優(yōu)選的材料和方法。因此，本文所用術(shù)語(yǔ)目的僅是描述具體的實(shí)施方式，而非限制性的。其它術(shù)語(yǔ)在全文中作了定義和描述。除非另有明確指定，本說(shuō)明書(shū)和隨附的權(quán)利要求書(shū)中所用的單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“該種”包括其復(fù)數(shù)形式。因此，例如述及“一種病毒”包括多個(gè)病毒，述及“宿主細(xì)胞”包括宿主細(xì)胞的混合物，等等。術(shù)語(yǔ)“核酸”、“多核苷酸”、“多核苷酸序列”和“核酸序列”根據(jù)本文中的具體段落況指單鏈或雙鏈脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物、它們的嵌合體或類(lèi)似物、或其字符串代表。本文所用的該術(shù)語(yǔ)任選包括天然產(chǎn)生核苷酸類(lèi)似物的聚合物(例如，肽核酸)，其具有天然核苷酸的基本性質(zhì)，即，它們能以天然產(chǎn)生核苷酸的類(lèi)似方式與單鏈核酸雜交。除非另有表述，除明確表述的序列外，本發(fā)明的具體核酸序列任選包括互補(bǔ)序列?？蓮娜魏尉?體的多核苷酸序列，確定其給定的核酸或互補(bǔ)多核苷酸序列(例如，互補(bǔ)核酸)。術(shù)語(yǔ)“核酸”或“多核苷酸”也包括與核苷酸串相對(duì)應(yīng)的任何單體單位的物理字符串，包括核苷酸聚合物(如，典型的DNA或RNA聚合物)、PNA、修飾的寡核苷酸(如，含有對(duì) 于生物學(xué)RNA或DNA非典型的堿基的寡核苷酸，如2’ -0-甲基化的寡核苷酸)等。核酸可以是，例如單鏈或雙鏈?！白有蛄小笔钦麠l序列中的任何一部分，最多可包含整條序列。子序列通常短于全長(zhǎng)序列。“獨(dú)特子序列”是在早先測(cè)定的任何流感多核苷酸或多肽序列中未曾發(fā)現(xiàn)的子序列。就兩條核酸或多肽(例如，編碼HA或NA分子的DNA，或HA或NA分子的氨基酸序列) 而言，短語(yǔ)“基本上相同”指，當(dāng)用序列比較算法或通過(guò)目測(cè)觀(guān)察，比較和比對(duì)最大相應(yīng)性時(shí)，兩條或更多條序列或子序列有至少約90 %、優(yōu)選91 %、最優(yōu)選92 %、93 %、94%、95 %、 96%,97%,98%,98. 5%,99%,99. 1 %,99. 2 % ,99. 3 %,99. 4%,99. 5 %,99. 6 %,99. 7 %, 99. 8%,99. 9%或更多核苷酸或氨基酸殘基本相同。對(duì)于多肽，術(shù)語(yǔ)“變體”指與參比序列相比，有一個(gè)或多個(gè)氨基酸改變的氨基酸序列。變體可具有“保守性”改變，其中用于取代的氨基酸具有相似結(jié)構(gòu)或化學(xué)特性，如用異亮氨酸替換亮氨酸。或者，變體可具有“非保守性”改變，如，用色氨酸替換甘氨酸。類(lèi)似的小變化也包括氨基酸缺失或插入或二者均有?？刹捎帽绢I(lǐng)域熟知的計(jì)算機(jī)程序，例如，DNASTAR 軟件來(lái)指導(dǎo)，確定哪些氨基酸殘基可被取代、插入或缺失而不破壞生物學(xué)或免疫學(xué)活性。本文也描述了保守性取代的例子。術(shù)語(yǔ)“基因”廣泛用于指與生物學(xué)功能相關(guān)的任何核酸。因此，基因包括編碼序列和/或其表達(dá)所需的調(diào)節(jié)序列。術(shù)語(yǔ)“基因”適用于特定的基因組序列，以及該基因組序列編碼的cDNA或mRNA。本發(fā)明的“神經(jīng)氨酸酶”多肽顯示與流感病毒的一種或多種已知的神經(jīng)氨酸酶分子有免疫學(xué)交叉反應(yīng)性。參考文獻(xiàn)中有許多此類(lèi)已知神經(jīng)氨酸酶的例子(例如，在 GenBank5CDC的出版物中，等等)。類(lèi)似地，本發(fā)明的“血凝素”多肽與流感病毒的一種或多種已知血凝素分子顯示有免疫學(xué)交叉反應(yīng)性。參考文獻(xiàn)中也有此類(lèi)已知血凝素的例子?；蜻€包括非表達(dá)的核酸區(qū)段，例如，形成其它蛋白質(zhì)識(shí)別序列的區(qū)段。非表達(dá)的調(diào)節(jié)序列包括“啟動(dòng)子”和“增強(qiáng)子”，它們能調(diào)節(jié)蛋白如轉(zhuǎn)錄因子與其結(jié)合導(dǎo)致毗鄰或相近序列的轉(zhuǎn)錄?！敖M織特異性”啟動(dòng)子或增強(qiáng)子是調(diào)節(jié)一種或多種特定組織類(lèi)型或細(xì)胞類(lèi)型中轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子。如本文所示，“基因表達(dá)”或“核酸表達(dá)”通常表示DNA轉(zhuǎn)錄為RNA (任選包括RNA 的修飾，如剪接)、RNA轉(zhuǎn)錄為mRNA、RNA翻譯成多肽(可能包括多肽的后續(xù)修飾，如翻譯后修飾)，或轉(zhuǎn)錄和翻譯二者。“開(kāi)放讀框”或“0RF”是DNA或RNA(如基因)的可能翻譯讀框，它能被翻譯成多肽。即，該讀框不會(huì)被終止密碼子打斷。然而，應(yīng)該注意術(shù)語(yǔ)ORF不一定表示該多核苷酸實(shí) 際上已被翻譯為多肽。術(shù)語(yǔ)“載體”指核酸增殖和/或在生物體、細(xì)胞或細(xì)胞組分之間轉(zhuǎn)移所憑借的工具。載體包括質(zhì)粒、病毒、噬菌體、前病毒、噬菌粒、轉(zhuǎn)座子、人造染色體等，它們能自我復(fù)制或整合入宿主細(xì)胞的染色體中。載體也可以是裸RNA多核苷酸、裸DNA多核苷酸、在同一鏈內(nèi)由DNA和RNA構(gòu)成的多核苷酸、多聚賴(lài)氨酸偶聯(lián)的DNA或RNA、肽偶聯(lián)的DNA或RNAJg 質(zhì)體偶聯(lián)的DNA等，它們不自主復(fù)制。在許多但非全部的一般實(shí)施方式中，本發(fā)明載體是質(zhì) 粒?！氨磉_(dá)載體”是能促進(jìn)摻入其中的核酸表達(dá)及復(fù)制的載體，如質(zhì)粒。待表達(dá)核酸通 ?！安僮餍赃B接于”啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子，并受啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控?！半p向表達(dá)載體”的特征是兩個(gè)備選啟動(dòng)子的取向與位于該兩個(gè)啟動(dòng)子之間的核酸的方向相反，因此可從兩個(gè)方向啟動(dòng)表達(dá)，導(dǎo)致例如正(+)或有義鏈和負(fù)(_)或反義鏈 RNA的轉(zhuǎn)錄。根據(jù)本文中的具體段落，“氨基酸序列”是氨基酸殘基的聚合物(蛋白質(zhì)、多肽等) 或氨基酸聚合物的字符串代表?！岸嚯摹笔呛袃蓚€(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基的聚合物(如肽或蛋白)。該聚合物任選包含修飾，如糖基化等。多肽的氨基酸殘基可以是天然或非天然的，可以是未取代、未修飾、取代或修飾的。就本發(fā)明而言，術(shù)語(yǔ)“分離的”指生物學(xué)材料，如病毒、核酸或蛋白基本上不含在天然環(huán)境中與其正常相伴或相互作用的組分。分離的生物學(xué)材料任選包含在其天然環(huán)境中未發(fā)現(xiàn)與該生物學(xué)材料相伴的其它材料，如細(xì)胞或野生型病毒。例如，如果所述材料存在于其天然環(huán)境，如細(xì)胞中，該材料可能曾經(jīng)位于對(duì)該環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的此類(lèi)材料而言非天然的細(xì)胞位置(如基因組或遺傳元件)。例如，如果通過(guò)非天然方法將天然產(chǎn)生的核酸引入該核酸非天然的基因組的基因座(例如載體，如質(zhì)?；虿《据d體，或擴(kuò)增子)處，該天然產(chǎn)生的核酸 (如編碼序列、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等)就成為分離的核酸。此類(lèi)核酸也稱(chēng)為“異源”核酸。例如，分離的病毒處于不同于野生型病毒的天然環(huán)境(如受感染個(gè)體的鼻咽腔)的環(huán)境(例如，細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)或從細(xì)胞培養(yǎng)物純化)中。當(dāng)術(shù)語(yǔ)“嵌合”或“嵌合體”指病毒時(shí)，表示該病毒包含有來(lái)自一種以上親代病毒株或來(lái)源的遺傳組分和/或多肽組分。同樣，術(shù)語(yǔ)“嵌合”或“嵌合體”指病毒蛋白時(shí)，表示該蛋白包含來(lái)自一種以上親代病毒株或來(lái)源的多肽組分(即氨基酸子序列)。從本文可以明白，此類(lèi)嵌合病毒通常是重配/重組病毒株。因此，在一些實(shí)施方式中，嵌合體可任選包含，例如置于由乙型流感病毒(例如，B/AA/1/66等)構(gòu)成、構(gòu)建/衍生自乙型流感病毒的骨架中的甲型流感病毒序列(例如，HA和/或NA的)，或置于甲型流感病毒骨架(S卩，供體病毒)，例如A/AA/6/60等中的乙型流感病毒序列。術(shù)語(yǔ)“重組體”表示該材料(如核酸或蛋白)是由人類(lèi)介入而人工或合成(非天然)改變的材料?？稍谠摬牧系奶烊画h(huán)境或狀態(tài)中，或?qū)⑵鋸闹幸瞥鰧?duì)其進(jìn)行改變。具體地說(shuō)，例如，當(dāng)通過(guò)重組核酸的表達(dá)產(chǎn)生流感病毒時(shí)，該流感病毒是重組的。例如，“重組核酸”是通過(guò)，例如克隆、DNA重排或其它過(guò)程，或通過(guò)化學(xué)或其它誘變進(jìn)行核酸重組而產(chǎn)生； “重組多肽”或“重組蛋白質(zhì)”是通過(guò)表達(dá)重組核酸而產(chǎn)生；“重組病毒”，如重組流感病毒是通過(guò)表達(dá)重組核酸而產(chǎn)生。當(dāng)術(shù)語(yǔ)“重配病毒”指病毒時(shí)(本文通常指流感病毒)，表示該病毒包含源自一種以上親代病毒株或來(lái)源的遺傳組分和/或多肽組分。例如，7 1重配病毒包含源于第一親代病毒的7個(gè)病毒基因組區(qū)段(或基因區(qū)段)和一個(gè)補(bǔ)充性病毒基因組區(qū)段，如編碼血凝素或神經(jīng)氨酸酶的基因區(qū)段，例如本文序列表所列出的那些區(qū)段(例如，SEQ ID NO :1-28)。 6 2重配病毒包含6個(gè)基因組區(qū)段，最常見(jiàn)的是第一親代病毒的6個(gè)內(nèi)部基因組區(qū)段和兩個(gè)補(bǔ)充性區(qū)段，例如，一種或多種不同親代病毒的血凝素和神經(jīng)氨酸酶基因座區(qū)段。根據(jù)本文中的具體段落，重配病毒也稱(chēng)為“嵌合體”和/或“重組體”。當(dāng)術(shù)語(yǔ)“引入”指異源或分離的核酸時(shí)，指將該核酸摻入真核或原核細(xì)胞中，所述核酸可摻入細(xì)胞的基因組中(如染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線(xiàn)粒體DNA)轉(zhuǎn)化為自主復(fù)制子，或者瞬時(shí)表達(dá)(如轉(zhuǎn)染的mRNA)。該術(shù)語(yǔ)包括例如“感染”、“轉(zhuǎn)染”、“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)導(dǎo)”等方法。就本發(fā)明而言，可采用多種方法將核酸引入細(xì)胞中，包括電穿孔、磷酸鈣沉淀、脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(脂質(zhì)轉(zhuǎn)染)等。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”表示含有異源核酸，如載體或病毒，并能支持該核酸復(fù)制和/或表達(dá)的細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞如大腸桿菌(E.coli)，或真核細(xì)胞如酵母菌、昆蟲(chóng)、兩棲類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括人細(xì)胞。示范性的宿主細(xì)胞包括例如Vero (非洲綠猴腎)細(xì)胞、BHK(乳倉(cāng)鼠腎)細(xì)胞、原代雞腎(PCK)細(xì)胞、馬-達(dá)二氏(Madin-Darby)狗腎 (MDCK)細(xì)胞、馬-達(dá)二氏牛腎(MDBK)細(xì)胞、293細(xì)胞(如293T細(xì)胞)和COS細(xì)胞(如C0S1、 C0S7細(xì)胞)等。在其它實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞可任選包括卵(例如，雞蛋、雞胚蛋等)。流感病毒的“免疫有效量”是足以提高個(gè)體(如人)對(duì)隨后接觸流感病毒的自身免疫應(yīng)答的用量。可監(jiān)測(cè)誘導(dǎo)的免疫水平，如通過(guò)檢測(cè)中和性分泌抗體和/或血清抗體的量，如通過(guò)噬斑中和、補(bǔ)體固定、酶聯(lián)免疫吸附或微量中和試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)。抵御流感病毒的“保護(hù)性免疫應(yīng)答”指?jìng)€(gè)體隨后接觸和/或感染野生型流感病毒時(shí)，該個(gè)體(如人)表現(xiàn)出的抵御該疾病的保護(hù)性免疫應(yīng)答。在一些例子中，野生型(如天然流行的)流感病毒仍能引起感染，但不能引起嚴(yán)重或危及生命的感染。保護(hù)性免疫應(yīng)答通常導(dǎo)致宿主產(chǎn)生可檢測(cè)水平的血清和分泌抗體，它們能在體外和體內(nèi)中和同一病毒株和 /或亞組的病毒(也可能中和不同的、非疫苗株和/或亞組的病毒)。本文所用的“抗體”是包含基本上或部分由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段編碼的一個(gè)或多個(gè)多肽的蛋白。已知的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、Υ、δ、ε和μ 恒定區(qū)基因，以及無(wú)數(shù)的免疫球蛋白可變區(qū)基因。輕鏈分類(lèi)為κ或λ。重鏈分類(lèi)為Y、μ、 α、δ或ε，進(jìn)而分別定義了免疫球蛋白類(lèi)型IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。典型的免疫球蛋白(抗體)結(jié)構(gòu)單元包含四聚體。四聚體各由兩對(duì)相同的多肽鏈組成，每對(duì)有一條“輕”鏈 (約25kD)和一條“重”鏈(約50-70kD)。各鏈的N末端限定了約100-110個(gè)或更多個(gè)氨基酸的可變區(qū)，主要負(fù)責(zé)抗原識(shí)別。術(shù)語(yǔ)輕鏈可變區(qū)(VL)和重鏈可變區(qū)(VH)分別指輕鏈和重鏈的這些區(qū)域。存在的抗體或是完整的免疫球蛋白，或是經(jīng)各種肽酶消化產(chǎn)生的數(shù)個(gè)良好表征的一些片段。因此，例如，胃蛋白酶能在絞鏈區(qū)二硫鍵下方消化抗體產(chǎn)生Fab的二聚體F(ab)' 2，F(xiàn)ab本身是通過(guò)二硫鍵與VH-CHl連接的輕鏈。在溫和條件下還原F (ab) ‘ 2 打斷絞鏈區(qū)二硫鍵可將(Fab' )2 二聚體轉(zhuǎn)變成!^ab'單體。Fab'單體實(shí)質(zhì)上是含部分絞鏈區(qū)的Fab (其它抗體片段的更詳細(xì)描述參見(jiàn)《基礎(chǔ)免疫學(xué)》(Fundamental Immunology)，W. E. Paul編，紐約雷文出版社(Raven Press) (1999))。雖然通過(guò)消化完整抗體可產(chǎn)生各種抗體片段，但技術(shù)人員知道可通過(guò)化學(xué)或重組DNA方法從頭合成此類(lèi)Fab'片段。因此，本文所用術(shù)語(yǔ)“抗體”包括通過(guò)修飾完整抗體或用重組DNA方法從頭合成產(chǎn)生的抗體或片段。抗體包括，例如多克隆抗體、單克隆抗體、多鏈或單鏈抗體，包括單鏈Fv(sFv或scFv)抗體， Fv中重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)連接在一起(直接或通過(guò)肽接頭)形成連續(xù)多肽，以及人源化或嵌合抗體。流感病毒本發(fā)明的多肽和多核苷酸是流感HA和NA序列的變體。參見(jiàn)，例如以下圖1和2 中的序列表。流感病毒通常由含區(qū)段化單鏈RNA基因組的內(nèi)部核蛋白核心以及由基質(zhì)蛋白襯里的外部脂蛋白包膜組成。流感病毒基因組由編碼免疫原性血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶 (NA)蛋白的8個(gè)線(xiàn)性(-)鏈核糖核酸(RNA)區(qū)段和6個(gè)內(nèi)部核心多肽組成，內(nèi)部核心多肽是核衣殼核蛋白(NP)；基質(zhì)蛋白(M)；非結(jié)構(gòu)蛋白(NS)；和3個(gè)RNA聚合酶(PA、PB1、PB2) 蛋白。復(fù)制過(guò)程中，基因組病毒RNA在宿主細(xì)胞核中轉(zhuǎn)錄成(+)鏈信使RNA和(-)鏈基因組cRNA。8個(gè)基因組區(qū)段各自被包裝入核糖核蛋白復(fù)合體中，其中除了 RNA外還含有NP和聚合酶復(fù)合體(PB1、PB2和PA)。血凝素分子由表面糖蛋白構(gòu)成，其作用是結(jié)合宿主細(xì)胞表面受體上的N-乙酰神經(jīng)氨酸(NeuNAc)，也稱(chēng)為唾液酸。在本文的一些實(shí)施方式中，無(wú)論在體外或體內(nèi)，本發(fā)明多肽(和本發(fā)明多核苷酸編碼的多肽)均可結(jié)合NeuNAc。在一些實(shí)施方式中，還可通過(guò)保留了血凝素活性的血凝素片段實(shí)現(xiàn)此結(jié)合作用。血凝素由兩個(gè)亞基HAl 和HA2組成，完整的結(jié)構(gòu)長(zhǎng)約550個(gè)氨基酸，約220kD。神經(jīng)氨酸酶分子能切割流感病毒細(xì) 胞表面受體的末端唾液酸殘基，從而使被感染的細(xì)胞釋放病毒粒子。神經(jīng)氨酸酶還能除去新產(chǎn)生的血凝素和神經(jīng)氨酸酶分子的唾液酸。在本文的一些實(shí)施方式中，無(wú)論在體外或體內(nèi)，本發(fā)明的多肽(和本發(fā)明多核苷酸編碼的多肽)作用是切割唾液酸殘基。在一些實(shí)施方式中，也可通過(guò)保留了神經(jīng)氨酸酶活性的神經(jīng)氨酸酶片段實(shí)現(xiàn)此切割作用。本發(fā)明的神經(jīng) 氨酸酶多肽顯示與流感病毒的一種或多種已知的神經(jīng)氨酸酶分子有免疫交叉反應(yīng)性。參考文獻(xiàn)中有大量此類(lèi)已知神經(jīng)氨酸酶的例子(例如，在GenBank，在CDC的出版物中，等等)。類(lèi)似地，本發(fā)明的血凝素多肽顯示與流感病毒的一種或多種已知的血凝素分子有免疫交叉反應(yīng)性。參考文獻(xiàn)中也有大量此類(lèi)已知血凝素分子的例子。流感通常分類(lèi)為甲型流感和乙型流感，以及通常不大重要的丙型流感。甲型流感和乙型流感病毒各自包含8個(gè)負(fù)極性單鏈RNA區(qū)段。甲型流感基因組編碼11種多肽。區(qū) 段1-3編碼3種多肽，它們構(gòu)成RNA-依賴(lài)的RNA聚合酶。區(qū)段1編碼聚合酶復(fù)合體蛋白 PB2，其余的聚合酶蛋白PB 1和PA分別由區(qū)段2和區(qū)段3編碼。此外，某些流感病毒株的區(qū)段1編碼小蛋白PB1-F2，其由PBl編碼區(qū)內(nèi)的另一讀框產(chǎn)生。區(qū)段4編碼感染過(guò)程中參與細(xì)胞粘附和進(jìn)入的血凝素(HA)表面糖蛋白。區(qū)段5編碼與病毒RNA締合的主要結(jié)構(gòu)組分-核衣殼核蛋白(NP)多肽。區(qū)段6編碼神經(jīng)氨酸酶(NA)包膜糖蛋白。區(qū)段7編碼兩種基質(zhì)蛋白Ml和M2，它們由差異剪接的mRNA翻譯產(chǎn)生。區(qū)段8編碼兩個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白NSl和 NS2，它們由旁路剪接的mRNA變體翻譯產(chǎn)生。乙型流感的8個(gè)基因組區(qū)段編碼11種蛋白。三個(gè)最大的基因編碼RNA聚合酶的諸組分PB1、PB2和PA。區(qū)段4編碼HA蛋白。區(qū)段5編碼NP。區(qū)段6編碼NA蛋白和NB蛋白。蛋白質(zhì)NB和NA均由雙順?lè)醋觤RNA的重疊讀框翻譯產(chǎn)生。乙型流感的區(qū)段7也編碼兩種蛋白Ml和BM2。最小區(qū)段編碼兩種產(chǎn)物NSl翻譯自全長(zhǎng)RNA，而NS2翻譯自剪接的mRNA變體。甲型和乙型流感通常與人群的流感爆發(fā)相關(guān)。然而，甲型流感也能感染其它物種，例如鳥(niǎo)、豬和其它動(dòng)物。根據(jù)血凝素和神經(jīng)氨酸酶表面糖蛋白抗原內(nèi)的差異可將甲型病毒分成亞型。甲型病毒血凝素有16種已知的亞型，神經(jīng)氨酸酶有9種已知的亞型。對(duì) 于人類(lèi)，目前僅知道大約有4種不同的血凝素和2種不同的神經(jīng)氨酸酶亞型，例如HI、H2、 H3、H5、Nl和N2。具體地說(shuō)，甲型流感的兩種主要亞型，即Hmi和H3N2對(duì)人類(lèi)有活性。然而，近年來(lái)H1N2受到關(guān)注。乙型流感病毒未按血凝素和神經(jīng)氨酸酶蛋白分成各亞型。應(yīng) 該知道，圖1序列表中包括的序列包含多種不同的流感亞型。因此，在該序列表中，例如 A-H3m 病毒株是 ca A/Uruguay/716/07 和 ca A/Wisconsin/67/05。A-Hmi 毒株顯示為 ca A/South Dakota/6/07 禾口 ca A/Solomon Islands/3/06,M ca B/Florida/6/04、ca B/ Malaysia/2506/04 和 ca B/Brisbane/60/2008_DET 代表 B-HANA 病毒株?？筛鶕?jù)，例如流感(病毒)凝集紅細(xì)胞(RBC或紅血球)的能力分類(lèi)不同的流感病毒株。特定流感病毒株的特異性抗體可結(jié)合該病毒，因此能阻止此種凝集。根據(jù)此種抑制作用測(cè)定病毒株類(lèi)型的試驗(yàn)通常稱(chēng)為血凝素抑制試驗(yàn)(HI試驗(yàn)或HAI試驗(yàn))，它們是本領(lǐng)域表征流感病毒株的標(biāo)準(zhǔn)和熟知的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員當(dāng)然熟悉表征流感病毒株的其它試驗(yàn)，例如ELISA、間接熒光抗體試驗(yàn)、免疫組化方法、蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)等等，HI試驗(yàn)的應(yīng)用和本文的討論不應(yīng)理解為限制性的。簡(jiǎn)言之，在典型HI試驗(yàn)中，將用于分型或分類(lèi)的血清(常用雪貂產(chǎn)生)加入各種稀釋度(例如2-倍稀釋等)的紅細(xì)胞樣品中，然后進(jìn)行光學(xué)測(cè)定，看紅細(xì)胞是否凝結(jié)成塊 (即凝集)或懸浮(即不凝集)。如果細(xì)胞不結(jié)塊，因血清中該流感(病毒)的特異性抗體抑制而不發(fā)生凝集，因此可將該流感類(lèi)型認(rèn)定為屬于同一病毒株。在一些情況中，可將一種病毒株描述為“類(lèi)似于”另一種，例如病毒株χ是“y_樣”病毒株等等。例如，如果HI試驗(yàn) 檢測(cè)到兩份樣品彼此的滴度在4-倍內(nèi)，可認(rèn)為它們屬于同一病毒株(例如均屬于“新喀里多尼亞(New Caledonia)，，病毒株或均屬于“莫斯科_樣(Moscow-like)，，病毒株等)。換言之，通常根據(jù)免疫學(xué)或抗原性特征分類(lèi)病毒株。HAI滴度通常定義為完全抑制血細(xì)胞凝集的最高血清稀釋度。參見(jiàn)，例如khild等，Bull. Wld Hlth Org.，1973,48 :269-278等。本領(lǐng)域技術(shù)人員也非常熟悉將流感(病毒)分類(lèi)成病毒株和實(shí)施分類(lèi)的方法。從上文可知本發(fā)明不僅包括本文所列出的具體序列，而且包括在各種載體(例如，用于質(zhì)粒重配和拯救的載體，見(jiàn)下文)中的此類(lèi)序列以及與本文所列出序列相同病毒株中的血凝素和神經(jīng)氨酸酶序列。還包括各種載體中的此類(lèi)相同毒株(例如，通常是用于質(zhì)粒重配和拯救的載體，例如A/Ann Arbor/6/60或B/Ann Arbor/1/66, A/Puerto Rico/8/34、B/Leningrad/14/17/55、B/14/5/1、B/USSR/60/69、B/Leningrad/179/86、B/ Leningrad/14/55 或 B/England/^608/76 等)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“相似的病毒株”應(yīng)理解為表示第一流感病毒是第二流感病毒的相同或相關(guān)的病毒株。在典型的實(shí)施方式中，通常用HAI試驗(yàn)確定此種關(guān)系。因此，在HAI 試驗(yàn)中彼此的滴度在4-倍范圍內(nèi)的流感病毒是“相似的病毒株”。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉測(cè)定相似病毒株的其它試驗(yàn)，例如FRID、中和試驗(yàn)等。本發(fā)明還包括在本文所述的各種質(zhì)粒、載體、病毒、方法等中的此類(lèi)相似病毒株(即，與本文序列表提供的序列相似的病毒株)。因此，除非另有明確指出，本文對(duì)特定序列(例如，序列表中的那些)或其片段的描述也應(yīng)理解成包括與那些病毒株相似的病毒株(即，含有本文所述那些質(zhì)粒、載體、病毒等中的序列的那些病毒株的相似病毒株)的序列。因此，還應(yīng)知道，在“相似病毒株”之間作比較時(shí)，此類(lèi)相似病毒株的NA和HA多肽是“相似的多肽”。流感病毒疫苗本文的序列、組合物和方法主要但并非只涉及產(chǎn)生流感病毒疫苗。歷史上，主要依據(jù)相關(guān)病毒株的經(jīng)驗(yàn)預(yù)測(cè)來(lái)選擇所用的病毒株在雞胚蛋中生產(chǎn)流感病毒疫苗。近年來(lái)生產(chǎn) 的重配病毒株將所選的血凝素和/或神經(jīng)氨酸酶抗原摻入到已批準(zhǔn)的減毒、溫度敏感型主病毒株中。用雞蛋培養(yǎng)病毒通過(guò)多次傳代后，回收流感病毒并任選滅活，例如用甲醛和/或 β-丙內(nèi)酯滅活(或用于減毒活疫苗)。因此，應(yīng)知道HA和NA序列(如本發(fā)明的)非常適用于構(gòu)建流感疫苗。由于一些批準(zhǔn)用于疫苗生產(chǎn)的病毒株不能在標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng)條件下有效生長(zhǎng)，因而用細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)重組和重配疫苗的嘗試受阻。然而，發(fā)明人和同事先前的工作提供了通過(guò)培養(yǎng)產(chǎn)生重組和重配病毒的載體系統(tǒng)和方法，因此使得能夠快速生產(chǎn)一種或多種所選抗原性病毒株，例如甲型或乙型病毒株、各種亞型或亞株等(例如含有本文HA和/或NA序列)的相應(yīng)疫苗。參見(jiàn)，2002年10月23日提交的美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?0/420，708，2003年4月25 日提交的美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?0/423，828，以及2004年5月M日提交的美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?0/574，117，這些申請(qǐng)的名稱(chēng)均為“用于生產(chǎn)流感病毒的多質(zhì)粒系統(tǒng)(Multi-Plasmid System for the production of Influenza virus)”。通常，在受控的濕度和CO2下，采用溫度調(diào)節(jié)器的恒溫下(例如采用恒溫器確保溫度不超過(guò)35°C)，在某系統(tǒng)，如細(xì)胞培養(yǎng)箱中維持培養(yǎng)。通過(guò) 引入主流感病毒基因組區(qū)段的相應(yīng)載體子簇(subset)聯(lián)合衍生自感興趣病毒株的互補(bǔ)區(qū) 段(如，本文的HA和/或NA抗原性變體)不難獲得重配的流感病毒。通常，依據(jù)與給予疫苗相關(guān)的所需特性來(lái)選擇主病毒株。例如，對(duì)于疫苗生產(chǎn)，如減毒活疫苗的生產(chǎn)，可選擇具有減毒表型、冷適應(yīng)和/或溫度敏感型的主供體病毒株。如本文它處及美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?10/423, 828等解釋的那樣，本發(fā)明的各種實(shí)施方式采用A/Arm Arbor (AA)/6/60或B/Arm Arbor/1/66 或 A/Puerto Rico/8/34 或 B/Leningrad/14/17/55、B/14/5/1、B/USSR/60/69、 B/Leningrad/179/86、B/Leningrad/14/55 或 B/England/^608/76 流感株作為“骨架，，，在其基礎(chǔ)上加入HA和/或NA基因(如本文所列出的那些序列等)來(lái)產(chǎn)生所需的重配病毒。因此，例如，在6 2重配病毒中，2個(gè)基因(即NA和HA)來(lái)自期望對(duì)之產(chǎn)生免疫反應(yīng)的流感病毒株，而其它6個(gè)基因來(lái)自ArmArbor病毒株，或其它骨架病毒株等等。Arm Arbor病毒的冷適應(yīng)性、減毒和溫度敏感屬性很有用。當(dāng)然，應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到本文的HA和NA序列能與許多其它病毒基因或病毒類(lèi)型(如多種不同“骨架”，如A/Puerto Rico/8/34等，其包含存在于重配的其它流感基因，即非HA和非NA基因)重配。近年美國(guó)批準(zhǔn)了抵御人流感病毒的甲型流感病毒減毒活疫苗。參見(jiàn)上文。此類(lèi)疫苗是重配的Hmi和H1N2病毒，其中A/Arm Arbor (AA)/6/60 (H2N2)冷適應(yīng)性(ca)病毒的內(nèi)部蛋白基因賦予了該重配病毒AA ca病毒的冷適應(yīng)、減毒和溫度敏感表型(即，含有非Arm Arbor病毒株的血凝素和神經(jīng)氨酸酶基因的那些表型)。在本文的一些實(shí)施方式中，重配病毒還包含7 1重配病毒。換言之，只有HA 或NA不是來(lái)自骨架或MDV病毒株。早先的工作曾報(bào)道過(guò)任選屬于本發(fā)明各種實(shí)施方式的合適骨架供體病毒株。參見(jiàn)，例如2002年10月23日提交的美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?0/420，708，2003年4 月25日提交的美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?0/423，擬8和2004年5月25日提交的美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?0/574，117，這些申請(qǐng)的名稱(chēng)均為“用于生產(chǎn)流感病毒的多質(zhì)粒系統(tǒng)”;Maassab等.，J. Infect. Dis.， 1982，146 :780-790 ；Cox 等·，Virology, 1988，167 :554-567 ；Wareing 等·，Vaccine, 2001， 19 :3320-3330 ；Clements 等·，J Infect Dis.，1990，161 (5) :869-77,等等。在一些實(shí)施方式中，任選除去本文所述序列(核酸序列和/或氨基酸序列中)中的特定區(qū)域。例如，對(duì)于含有多元切割位點(diǎn)的那些分子，可任選除去這些位點(diǎn)。在本文的一些實(shí)施方式中，與衍生此類(lèi)序列的野生型序列相比，此類(lèi)切割位點(diǎn)在其序列中已經(jīng)過(guò)修飾或改變(例如該處不能切割或減少切割等)。因?yàn)槠鹗夹蛄兄星懈钗稽c(diǎn)的序列不同，不同病毒株或序列中的此類(lèi)修飾/改變也可能不同。例如，一些HA序列中通常除去了 4個(gè)多元 (聚堿性)殘基(RRKK)(與wt相比)。在各種實(shí)施方式中，可通過(guò)多種方法修飾此類(lèi)多元切割位點(diǎn)(這些均包括在本發(fā)明范圍內(nèi))。例如，一次可除去該多元切割位點(diǎn)中的一個(gè)氨基酸(如，除去一個(gè)R，除去兩個(gè)R，除去RRK，或除去RRKK)。此外，也可除去或改變?cè)撉懈钗?點(diǎn)直接上游的氨基酸殘基(如，將R變?yōu)門(mén)等)；也可修飾編碼該切割位點(diǎn)直接下游的氨基酸的核苷酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉除去此類(lèi)特定區(qū)域的各種方法。得到的縮短序列也屬于本發(fā)明。參見(jiàn)，例如 Li 等·，J. Infectious Diseases, 179 :1132-8,1999。本領(lǐng)域熟知適用于任選包含本發(fā)明序列的病毒(通常用于疫苗或疫苗生產(chǎn))的術(shù)語(yǔ)“溫度敏感型”、“冷適應(yīng)性”和“減毒的”。例如，對(duì)于甲型流感病毒株，術(shù)語(yǔ)“溫度敏感型”(ts)表示該病毒在39°C時(shí)顯示的滴度比33°C降低了 100倍甚至更多；或者乙型流感病毒株在37°C時(shí)顯示的滴度比33°C降低了 100倍甚至更多。術(shù)語(yǔ)“冷適應(yīng)性”(ca)表示該病毒在25°C時(shí)生長(zhǎng)為33°C時(shí)生長(zhǎng)的100倍，而術(shù)語(yǔ)“減毒”(att)表示該病毒能在雪貂上呼吸道內(nèi)復(fù)制但在雪貂肺組織中沒(méi)檢測(cè)到，不會(huì)引起雪貂流感樣疾病。應(yīng)理解，具有中間表型的病毒，即39°C (甲型病毒株)或37°C (乙型病毒株)顯示的滴度降低不到100倍，或25°C 時(shí)顯示的生長(zhǎng)比33°C時(shí)的生長(zhǎng)高100倍以上(如200倍內(nèi)、500倍內(nèi)、1000倍、少于10，000 倍)，和/或在雪貂肺中的生長(zhǎng)顯示比上呼吸道中的生長(zhǎng)低(即部分減毒)和/或?qū)е卵?流感樣疾病減弱的病毒，也是有用的病毒，可與本文的HA和NA序列聯(lián)用。因此，本發(fā)明可利用相對(duì)于疫苗生產(chǎn)，體外在培養(yǎng)細(xì)胞中具有所需特性(例如，減毒病原性或表型、冷適應(yīng)性、溫度敏感性，等等)的病毒株(甲型和乙型流感病毒株)在，例如合適培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)情況。可將摻入了克隆的病毒基因組區(qū)段的多個(gè)載體引入宿主細(xì) 胞中，在不超過(guò)35°C的溫度下培養(yǎng)該細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)流感病毒。當(dāng)轉(zhuǎn)染了包含流感病毒基因組的載體時(shí)，可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)純化方法回收適合用作疫苗的重組病毒。采用本發(fā)明的載體系統(tǒng)和方法，可經(jīng)組織培養(yǎng)快速有效地產(chǎn)生重配病毒，所述重配病毒摻入了具有疫苗生產(chǎn)所需特性的所選病毒株的6個(gè)內(nèi)部基因區(qū)段，和選自例如病原性毒株，如本文序列表所列的那些病毒株的免疫原性HA和NA基因區(qū)段。因此，本文所述系統(tǒng)和方法可用于細(xì)胞培養(yǎng)快速產(chǎn) 生重組和重配甲型和乙型流感病毒，包括適合用作疫苗的病毒，包括減毒的活疫苗，例如適合鼻內(nèi)給藥的疫苗。在此類(lèi)實(shí)施方式中，通常為甲型和乙型病毒亞型各選擇一種主供體病毒(MDV) 株。以減毒活疫苗為例，對(duì)于疫苗生產(chǎn)，通常所選的主供體病毒株應(yīng)具有溫度敏感、冷適應(yīng) 和/或減毒的有利特性。例如，示范性的主供體病毒株分別包括A/Arm Arbor/6/60和B/ Ann Arbor/1/66的此類(lèi)溫度敏感、減毒和冷適應(yīng)性病毒株以及本文中述及的其它病毒株。例如，可從構(gòu)成病毒基因組的多個(gè)克隆的病毒cDNA產(chǎn)生所選的主供體甲型病毒(MDV-A)或乙型主供體病毒(MDV-B)。實(shí)施方式包括從8個(gè)克隆的病毒cDNA產(chǎn)生重組病毒。任選將代表PB2、PBl、ΡΑ、ΝΡ、ΗΑ、ΝΑ、M和NS的所選MDV-A或MDV-B序列的8個(gè)病毒cDNA 克隆入雙向表達(dá)載體，例如質(zhì)粒(如PAD3000)中，從而一條鏈的RNA聚合酶I(poll)啟動(dòng) 子可轉(zhuǎn)錄該病毒基因組RNA，另一條鏈的RNA聚合酶II (pol II)啟動(dòng)子可合成病毒mRNA。可任選修飾任何基因區(qū)段，包括HA區(qū)段(例如，除去多元切割位點(diǎn))。
將攜帶8個(gè)病毒cDNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入合適宿主細(xì)胞，例如Vero細(xì)胞、共-培養(yǎng)的 MDCK/293T或MDCK/C0S7細(xì)胞后，可回收感染性的重組MDV-A或MDV-B病毒。采用本文所述的質(zhì)粒和方法，例如2002年10月23日提交的美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?0/420,708，2003年4月25 日提交的美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?0/423，擬8和2004年5月M日提交的美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?0/574，117，這些申請(qǐng)的名稱(chēng)均為“用于生產(chǎn)流感病毒的多質(zhì)粒系統(tǒng)”;Hoffmann，Ε.，2000，PNAS，97(11) 6108-6113 ；授于Hoffmann的美國(guó)公布專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?0020164770 ；和2003年4月8日授予I3aIese等的美國(guó)專(zhuān)利6，M4，785，本發(fā)明可用于，例如通過(guò)共同轉(zhuǎn)染所選病毒(例如， MDV-A, MDV-B)的6個(gè)內(nèi)部基因(PBU PB2、PA、ΝΡ、M和NS)和衍生自不同相應(yīng)類(lèi)型(甲型或乙型)流感病毒的HA和NA(例如本文序列表中所示)產(chǎn)生6 2重配流感疫苗。例如， HA區(qū)段最好選自致病性相關(guān)的H1、H3或B病毒株，因?yàn)樗沁M(jìn)行疫苗生產(chǎn)的常規(guī)選擇。類(lèi) 似地，HA區(qū)段可選自與致病性病毒株，例如本文序列表中那些相關(guān)的病毒株。也可生產(chǎn)摻入了 MDV的7個(gè)基因組區(qū)段和所選病毒株的HA或NA基因的重配病毒(7 1重配病毒)。應(yīng)該知道如本文所詳述的那樣，可任選將本發(fā)明的分子組合成任何所需的組合。例如，可將本文的HA和/或NA序列置入，例如重配病毒骨架，如A/AA/6/60、B/AA/1/66、A/Puerto Rico/8/34(即，PR8)等中，置入6 2重配病毒或7 1重配病毒等中。因此，如下文更完全解釋的那樣，而含有供體病毒的6個(gè)基因組內(nèi)部區(qū)段(例如，仍是A/AA/6/60等)和第二病毒株(例如，野生型病毒株，而非供體病毒)的2個(gè)基因組區(qū)段。所述2個(gè)基因組區(qū)段優(yōu)選HA和NA基因。7 1重配病毒的情況相似，然而，其中7個(gè)基因組區(qū)段來(lái)自供體病毒，另1個(gè)基因組區(qū)段(HA或NA)來(lái)自不同病毒(通常是野生型或要針對(duì)其產(chǎn)生免疫應(yīng) 答的病毒)。還應(yīng)知道可采用本文不同實(shí)施方式中的許多方式組合本文的序列(例如，圖 1序列表中的那些序列等)。因此，本文的任何序列可單獨(dú)存在于7 1重配病毒中(即，本發(fā)明序列與7個(gè)供體病毒基因組區(qū)段一起存在)和/或可與本發(fā)明的另一序列一起存在于6 2重配病毒中。在此類(lèi)6 2重配病毒中，本發(fā)明的任何序列可任選與本發(fā)明的任何其它序列一起存在。然而，典型和優(yōu)選的實(shí)施方式包括同一原始野生型病毒株(或修飾的野生型病毒株，例如具有修飾的多元切割位點(diǎn)的那些病毒)的HA和NA。例如，典型的實(shí) 施方式可包括含有供體病毒，例如A/AA/6/60的6個(gè)基因組內(nèi)部區(qū)段及同一病毒株，例如 ca A/Uruguay/716/07>ca A/South Dakota/6/07、ca A/Wisconsin/67/05或ca A/Solomon Islands/3/06的HA和NA基因組區(qū)段的6 2重配病毒。在另一實(shí)施方式中，本文所述 6 2重配病毒可包含供體病毒，例如B/Arm Arbor/1/66的6個(gè)基因組內(nèi)部區(qū)段及同一病毒株，例如 ca B/Florida/6/04、ca B/Malaysia/2506/04 或 ca B/Brisbane/60/2008_DET 的HA和NA基因組區(qū)段。當(dāng)然還應(yīng)知道，本發(fā)明還包括其中HA和NA基因組區(qū)段來(lái)自相似病毒株(即，與具有以下序列的流感毒株相似的毒株SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、 19、21、23、25、27、SEQ ID NO 1 的殘基 74-1060、SEQ ID NO 1 的殘基 1061-1723、SEQ ID NO 5 的殘基 81-1058、SEQ ID NO 5 的殘基 1059-1724、SEQ ID NO 9 的殘基 85-1116、SEQID NO :9 的殘基 79-1116、SEQ ID NO :9 的殘基 1117_1785、SEQ ID NO :13 的殘基 78-1064、 SEQ ID NO 13 的殘基 1065-1727、SEQ ID NO 17 的殘基 78-1055、SEQ ID N0:17 的殘基 1056-1721、SEQ ID NO 21 的殘基 78-1118、SEQ ID NO 21 的殘基 1119-1787、SEQ ID NO 25的殘基75-1115和SEQ ID NO :25的殘基1116-1787)的此類(lèi)重配病毒。以上參考文獻(xiàn) 出于所有目的通過(guò)專(zhuān)門(mén)引用全文納入本文，例如特別是它們所述的有關(guān)質(zhì)粒、病毒(流感病毒)的質(zhì)粒拯救、病毒拯救/產(chǎn)生的多質(zhì)粒系統(tǒng)等。再有，本發(fā)明的HA和NA序列任選用于此類(lèi)質(zhì)粒重配疫苗(和/或其它ts、Cs、Ca 和/或att病毒和疫苗)中。然而，應(yīng)該注意本發(fā)明的HA和NA序列等不限于具體的疫苗組合物或制備方法，因此可用于采用病毒株特異性HA和NA抗原(例如，本發(fā)明序列)的基本上任何類(lèi)型的疫苗或疫苗制備方法中。FluMi st 如前文所述，流感疫苗現(xiàn)有許多實(shí)例和類(lèi)型。示范性流感疫苗是加利福尼亞州山景市米迪繆尼疫苗公司(Medlmmune Vaccines Inc. , Mt. View, CA)的 FluMist ，它是一種保護(hù)兒童和成人免患流感疾病的減毒活疫苗(Belshe等，(1998)減毒、冷適應(yīng)性、三價(jià)、鼻 1^^^^1 ^ ^(The efficacy of live attenuated, cold-adapted, trivalent, intranasal influenza virus vaccine in children)N EnRl J Med 338 1405-12 ；Nichol等(1999)減毒、鼻內(nèi)流感病毒活疫苗在健康的工作成年人中的效果隨機(jī) Χ^Μ ^Λ (Effectiveness of live, attenuated intranasal influenza virus vaccine in healthy, working adults -.a randomized controlled trial) JAMA 282:137—44)。在典型和優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法和組合物優(yōu)選適應(yīng)/用于FluMist 疫苗的生產(chǎn)。然而，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員知道本文的序列、方法、組合物等也適合于生產(chǎn)相似或者甚至不同的病毒疫苗。FluMist 疫苗病毒株包含，例如衍生自該疫苗所針對(duì)(或者，在一些情況中是相關(guān)的病毒株)的野生型病毒株的HA和NA基因區(qū)段和共同主供體病毒(MDV)的六個(gè)基因區(qū) 段PBl、PB2、PA、NP、M和NS。因此本文的HA和NA序列任選是各種FluMist 制劑的一部分。FluMist 的甲型流感病毒株MDV (MDV-A)是在持續(xù)低溫下培養(yǎng)原代雞腎組織連續(xù)傳代野生型A/Ann Arbor/6/60 (A/AA/6/60)病毒株而產(chǎn)生的(Maassab (1967)。該流感病毒具有適應(yīng)25°C的生長(zhǎng)特性(Adaptation and growth characteristics of influenza virus at 25 degrees C)Nature 213:612-4)。MDV-A 在 25°C能有效復(fù)制(ca，冷適應(yīng)性)，但在 38°C和39°C下生長(zhǎng)受限(ts，溫度敏感)。此外，該病毒在感染雪貂的肺部不復(fù)制(att，減毒)。據(jù)認(rèn)為ts表型通過(guò)限制除呼吸道最冷區(qū)域外的病毒復(fù)制而使疫苗減毒。已在動(dòng) 物模型及臨床試驗(yàn)中證明了該性質(zhì)的穩(wěn)定性。與化學(xué)誘變產(chǎn)生的流感病毒株的ts表型相反，MDV-A的此種ts特性在通過(guò)感染倉(cāng)鼠傳代后或兒童的流涕分泌物不會(huì)回復(fù)其原有特性(最近的綜述參見(jiàn)Murphy和Coelingh ^00 開(kāi)發(fā)和使用減毒的冷適應(yīng)性甲型流感禾口乙型、流感病毒活疫苗的原理(Principles underlying the development and use of live attenuatedcold-adapted influenza A and B virus vaccine)Virus Immunol 15 295-323)。涉及12種不同6 2重配病毒的超過(guò)20，000名成人和兒童的臨床研究表明這些疫苗是減毒、安全和有效的(Belshe等(1998)減毒、冷適應(yīng)性、三價(jià)、鼻內(nèi)流感病毒活1 JLiiS中白勺雙胃(The efficacy of live attenuated, cold-adapted, trivalent, intrenasal influenza vaccine in children)N EnRl J Med 3381405-12 ；Boyce 等 (2000)鼻內(nèi)給予健康成年人含佐劑和不含佐劑的亞單位流感疫苗的安全性和免疫原性 (Safety and immunogenicity of adjuvanted and unadjuvanted subunit influenza vaccine administered intranasally to healthy adults)Vaccine 19 :217-26 ；Edwards 等(1994)用于預(yù)防甲型流感的冷適應(yīng)性和滅活疫苗的隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)(A randomized controlled trial of cold-adapted and inactivated vaccine for the prevention of influenza A disease) T Infect Dis 169 :68-76 ；Nichol 等(1999)減毒、鼻內(nèi)流感病毒活疫苗在健康的工作成年人中的效果隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)(Effectiveness of live, attenuated intranasal influenza vaccine in healthy,working adults -.a randomized controlled trial) TAMA 282 :137-44)。攜帶MDV-A的6個(gè)內(nèi)部基因和野生型病毒的兩個(gè)HA和NA基因區(qū) 段的重配病毒(即，6 2重配病毒)能持續(xù)維持ca、ts和att表型(Maassab等(1982)在雪貂中評(píng)價(jià)冷適應(yīng)性重組流感病毒疫苗(Evaluation of a cold-recombinant influenza vaccine in ferrets)J. Infect. Pis. 146 :780-900)。用乙型流感病毒株生產(chǎn)此類(lèi)重配病毒更為困難，然而，近年的工作(參見(jiàn)例如， 2002年10月23日提交的美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?0/420，708，2003年4月25日提交的美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?10/423, 828以及2004年5月M日提交的美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?0/574，117，名稱(chēng)均是“生產(chǎn)流感病毒的多質(zhì)粒系統(tǒng)”)顯示了一種八種質(zhì)粒系統(tǒng)可完全以其克隆的cDNA產(chǎn)生乙型流感病毒。還顯示了產(chǎn)生適合于疫苗制劑的減毒甲型和乙型流感活病毒的方法，如用于鼻內(nèi)給藥的活病毒疫苗制劑。前述系統(tǒng)和方法可用于細(xì)胞培養(yǎng)快速生產(chǎn)重組和重配甲型和乙型流感病毒，包括生產(chǎn)適合用作疫苗，包括減毒活疫苗，如適合鼻內(nèi)給藥的疫苗的病毒。本發(fā)明的序列、方法等任選與涉及，例如疫苗生產(chǎn)的重配流感病毒的早先工作聯(lián)用或組合以供生產(chǎn)疫苗用病預(yù)防性給予疫苗的方法和組合物如上所述，除了用于生產(chǎn)FluMist 疫苗外，本發(fā)明可用于其它疫苗制劑。本發(fā)明的重組和重配病毒(例如，包含以下多核苷酸的那些SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、 17、19、21、23、25、27、SEQ ID NO :1 的殘基 74_1060、SEQ ID NO 1 的殘基 1061_1723、SEQ ID NO 5 的殘基 81-1058、SEQ ID NO 5 的殘基 1059-1724、SEQ ID NO 9 的殘基 85-1116、SEQ ID NO :9 的殘基 79-1116、SEQ ID NO :9 的殘基 1117_1785、SEQ ID NO 13 的殘基 78-1064、 SEQ ID NO 13 的殘基 1065-1727、SEQ ID NO 17 的殘基 78-1055、SEQ ID NO 17 的殘基 1056-1721、SEQ ID NO 21 的殘基 78-1118、SEQ ID NO 21 的殘基 1119-1787、SEQ ID NO 25的殘基75-1115和SEQ ID NO :25的殘基1116-1787，或以下所示多肽SEQ ID NO :2、4、 6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28，SEQ ID NO :2 的殘基 17-345、SEQ ID NO 2 的殘基 346-566、SEQ ID NO 6 的殘基 18-343、SEQ ID NO 6 的殘基；344_565、SEQ ID NO 10 的殘基 18-361、SEQ ID NO 10 的殘基 16-361、SEQ ID NO 10 的殘基 362-584、SEQ ID NO 14 的殘基 17-345、SEQ ID NO 14 的殘基 346-566、SEQ ID NO 18 的殘基 18-343、SEQ ID NO 18 的殘基；344-565、SEQ ID NO 22 的殘基 16-362、SEQ ID NO 22 的殘基 363-585、SEQ ID NO 26的殘基16-362和SEQ ID NO 26的殘基363-585，或SEQ ID NO :1_28中病毒序列的類(lèi)似毒株，或以上任何的片段)，通?？梢悦庖哂行Я坎⒃诤线m運(yùn)載體或賦形劑中預(yù)防性給予以激發(fā)對(duì)一種或多種流感病毒株的特異性免疫應(yīng)答，這些流感病毒株由其HA和/或NA 序列所確定。所述運(yùn)載體或賦形劑通常是藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體或賦形劑，如滅菌水、鹽水溶液、緩沖鹽水溶液、右旋糖水溶液、甘油水溶液、乙醇、未感染雞蛋的尿囊液(即正常尿囊液或NAF)或它們的組合。按照本領(lǐng)域已有方法制備此類(lèi)溶液確保其無(wú)菌、pH、等滲和穩(wěn)定性。通常所選擇的運(yùn)載體或賦形劑應(yīng)能最大程度減少過(guò)敏和其它不良反應(yīng)，并適合于具體的給藥途徑，如皮下、肌肉內(nèi)、鼻內(nèi)等。本發(fā)明的一相關(guān)方面提供了激發(fā)個(gè)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抵御流感病毒的保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法。在該方法中，將用生理上可接受的運(yùn)載體配制的免疫有效量的重組流感病毒 (如，本發(fā)明的HA和/或NA分子)、免疫有效量的本發(fā)明多肽和/或免疫有效量的本發(fā)明核酸給予個(gè)體。本發(fā)明流感病毒的給予量通常足以激發(fā)針對(duì)一種或多種流感病毒株(即針對(duì)本發(fā)明HA和/或NA病毒株)的特異性免疫應(yīng)答。優(yōu)選給予流感病毒以誘導(dǎo)針對(duì)此類(lèi)病毒株的保護(hù)性免疫應(yīng)答。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道誘導(dǎo)針對(duì)一種或多種流感病毒株的保護(hù)性免疫應(yīng)答的劑量和方法。參見(jiàn)例如，美國(guó)專(zhuān)利5，922，326 Jright等，Infect. Immun. 37 397-400(1982) ；Kim 等，Pediatrics 52 :56-63(1973)；和 Wright 等，T. Pediatr. 88 931-936(1976)。例如，提供流感病毒的劑量范圍約為1-1000 HID5tl(人感染劑量)，即每劑量給予約IO5-Kfpfu(空斑形成單位)的病毒。通常根據(jù)例如年齡、身體狀況、體重、性別、飲食、給藥時(shí)間和其它臨床因素在該范圍內(nèi)調(diào)整給予劑量。全身給予預(yù)防性疫苗制劑，例如，用針頭和注射器或無(wú)針頭注射裝置作皮下或肌肉內(nèi)注射?；蛘?，通過(guò)滴入、大顆粒氣溶膠(大于約10微米)，或噴入上呼吸道鼻內(nèi)給予該疫苗制劑。雖然上述任何遞送途徑均能導(dǎo)致保護(hù)性全身免疫應(yīng)答，但鼻內(nèi)給藥的額外優(yōu)點(diǎn)是能誘導(dǎo)流感病毒進(jìn)入部位的黏膜免疫力。對(duì)于鼻內(nèi)給藥，常優(yōu)選減毒活病毒疫苗，例如減毒、冷適應(yīng)和/或溫度敏感型重組或重配流感病毒。參見(jiàn)上文。雖然優(yōu)選單次劑量即能激發(fā)保護(hù)性免疫應(yīng)答，但也可通過(guò)相同或不同途徑給予加強(qiáng)劑量以達(dá)到所需的預(yù)防效果。通常使用于疫苗的本發(fā)明減毒重組流感(病毒)充分減毒，從而使大多數(shù)用減毒流感病毒免疫的(或其它方式感染的)個(gè)體不會(huì)發(fā)生感染癥狀，或至少不發(fā)生嚴(yán)重的感染癥狀。在一些例子中，減毒流感病毒仍能產(chǎn)生輕度疾病癥狀(如輕度上呼吸疾病)和/或傳播給未接種疫苗的個(gè)體。然而，其毒力已充分消失，不會(huì)導(dǎo)致疫苗接種的或偶爾的宿主發(fā) 生嚴(yán)重的下呼吸道感染?；蛘撸捎煤斜疚男蛄械牧鞲胁《倦x體或體內(nèi)靶向樹(shù)突細(xì)胞來(lái)激發(fā)免疫應(yīng)答。例如，讓增殖的樹(shù)突細(xì)胞接觸足夠量病毒足夠長(zhǎng)時(shí)間使樹(shù)突細(xì)胞捕獲流感抗原。然后用標(biāo) 準(zhǔn)的靜脈內(nèi)移植方法將該樹(shù)突細(xì)胞回輸給疫苗接種對(duì)象。雖然優(yōu)選以單次劑量激發(fā)保護(hù)性免疫應(yīng)答，但也可通過(guò)相同或不同途徑給予加強(qiáng) 劑量以達(dá)到所需的預(yù)防效果。例如新生兒和嬰兒，可能需要多次給藥以引發(fā)足夠水平的免疫力。如必須維持足夠水平的保護(hù)作用以抵御野生型流感感染，可在整個(gè)兒童期不斷地間隔給予。同樣，對(duì)反復(fù)或嚴(yán)重流感感染特別易感的成人，例如，衛(wèi)生保健工作者、護(hù)工、幼年兒童的家庭成員、老年人以及心肺功能受損的個(gè)體可能需要多次免疫以建立和/或維持保護(hù)性免疫應(yīng)答。可監(jiān)測(cè)誘導(dǎo)的免疫水平，如通過(guò)測(cè)定中和性分泌抗體和血清抗體的含量，根據(jù)需要調(diào)整劑量和重復(fù)疫苗接種以引發(fā)和維持所需水平的保護(hù)力。預(yù)防性給予流感病毒的制劑也任選含有一種或多種佐劑，以提高對(duì)流感抗原的免疫應(yīng)答。合適的佐劑包括完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑、皂苷、礦物凝膠如氫氧化鋁、表面活性物質(zhì)如溶血卵磷脂、復(fù)合多元醇、聚陰離子、肽、油或烴乳劑、卡介苗(BCG)，短小棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)和合成佐劑 QS-21 和 MF59。如果需要，可將預(yù)防性流感病毒疫苗與一種或多種免疫刺激分子聯(lián)合給予。免疫刺激分子包括具有免疫刺激活性、免疫增效活性和促炎活性的各種細(xì)胞因子、淋巴因子和趨化因子，例如白介素(如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-12、IL-13)；生長(zhǎng)因子(如粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞(GM)-集落刺激因子(CSF))；和其它免疫刺激分子，如巨噬細(xì)胞炎癥因子、Flt3配體、B7. 1、B7.2等。免疫刺激分子可與流感病毒可在同一制劑中給予，或者分別給予?？山o 予蛋白(如本發(fā)明的HA和/或NA多肽)或編碼該蛋白的表達(dá)載體以產(chǎn)生免疫刺激效應(yīng)。上述方法通過(guò)將含有編碼治療或預(yù)防有效量的HA和/或NA多肽(或肽)或HA 和/或NA的RNA(如反義RNA或核酶)的異源多核苷酸的本發(fā)明載體體外、離體或體內(nèi)引入靶細(xì)胞群，可用于治療性和/或預(yù)防性處理疾病或病癥，通常是流感。如本文所述，編碼感興趣多肽(或肽)或RNA的多核苷酸通常操作性連接于合適的調(diào)節(jié)序列。任選將一種以上的異源編碼序列插入一個(gè)載體或病毒中。例如，除了編碼治療或預(yù)防活性的HA和/或 NA多肽或RNA的多核苷酸外，該載體還可包含其它治療性或預(yù)防性多肽，如抗原、共刺激分子、細(xì)胞因子、抗體等和/或標(biāo)記物等。雖然用某特定亞組的特定病毒株的減毒流感病毒疫苗接種個(gè)體能誘導(dǎo)針對(duì)不同病毒株和/或亞組的交叉保護(hù)作用，但如果需要可用含至少兩種、至少三種或至少四種流感病毒株或亞株的減毒流感病毒(例如代表不同亞組的至少兩種)疫苗接種個(gè)體。例如，用減毒流感病毒的至少四種毒株或亞株接種個(gè)體可包括用甲型流感病毒的至少兩種病毒株或亞株和乙型流感病毒的至少兩種病毒株或亞株接種該個(gè)體。用減毒流感病毒的至少4 種毒株或亞株接種個(gè)體包括用甲型流感病毒的至少三株病毒株或亞株和乙型流感病毒的至少一種病毒株或亞株接種該個(gè)體。用至少四種流感病毒株或亞株疫苗接種個(gè)體可能需要給予包含全部的至少四種減毒流感病毒株或亞株的一種四價(jià)疫苗。疫苗接種還可能需要給予各自包含一種、兩種或三種減毒的流感病毒株或亞株的多價(jià)疫苗。此外，疫苗組合可任選包括大流行疫苗與非大流行病毒株的混合物。疫苗混合物(或多價(jià)疫苗)可包含人病毒株和/或非人(如禽類(lèi)和人類(lèi)等)流感病毒株的組分。同樣，本發(fā)明的減毒流感病毒疫苗可任選與能誘導(dǎo)抵御其它感染因子的保護(hù)性免疫應(yīng)答的疫苗聯(lián)用。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā) 明疫苗是包含三種重配流感病毒的三價(jià)疫苗。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明疫苗是包含兩種重配甲型流感病毒和一種重配乙型流感病毒的三價(jià)疫苗。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明疫苗是包含Hl型重配甲型流感病毒、H3型重配甲型流感病毒和重配乙型流感病毒的三價(jià)疫苗。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明疫苗是包含四種重配流感病毒的四價(jià)疫苗。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明疫苗是包含兩種重配甲型流感病毒和二種重配乙型流感病毒的四價(jià)疫苗。在一個(gè)實(shí) 施方式中，本發(fā)明疫苗是包含Hl型重配甲型流感病毒、H3型重配甲型流感病毒、Victoria 系重配乙型流感病毒和山形系重配乙型流感病毒的四價(jià)疫苗。本發(fā)明多核苷酸探針
除用于上述疫苗外，本發(fā)明的HA和NA多核苷酸，例如本文序列所示，如SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、SEQ ID NO 1 的殘基 74_1060、SEQ ID NO 1 的殘基 1061-1723、SEQ ID NO :5 的殘基 81-1058、SEQ ID NO :5 的殘基 1059-1724、SEQ ID NO 9 的殘基 85-1116、SEQ ID NO 9 的殘基 79-1116、SEQ ID NO 9 的殘基 1117-1785、SEQ ID NO :13 的殘基 78-1064、SEQ ID NO 13 的殘基 1065_1727、SEQ IDNO 17 的殘基 78-1055、 SEQ ID NO :17 的殘基 1056-1721、SEQ ID NO :21 的殘基 78-1118、SEQ ID NO :21 的殘基 1119-1787、SEQ ID NO 25 的殘基 75-1115 和 SEQ ID NO 25 的殘基 1116-1787 及其片段，可任選用于許多性能不同的備選方法。本文所述的其它示范性用途目的只是說(shuō)明而非限制實(shí)際的應(yīng)用范圍。本文也描述了構(gòu)建、純化和特征鑒定本發(fā)明核苷酸序列的不同方法。在一些實(shí)施方式中，含有本發(fā)明一種或多種多核苷酸序列的核酸適合用作檢測(cè)各種環(huán)境中相應(yīng)或相關(guān)核酸的探針，例如在核酸雜交實(shí)驗(yàn)中，如用于尋找和/或表征感染其它物種或在不同流感爆發(fā)中的同源流感變體(如與本文序列同源等)的探針。這種探針可以是DNA或RNA分子，如基因組的限制性片段或克隆的DNA、cDNA、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、轉(zhuǎn)錄物和寡核苷酸，長(zhǎng)度可從短至約10個(gè)核苷酸的寡核苷酸到超過(guò)11Λ甚至更長(zhǎng)的全長(zhǎng)序列或 cDNA。例如，在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的探針包括選自以下的多核苷酸序列或子序列SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、SEQ ID NO 1 的殘基 74-1060、SEQ ID NO :1 的殘基 1061-1723、SEQ ID NO :5 的殘基81_1058、SEQ ID NO :5 的殘基 1059_1724、SEQ ID NO 9 的殘基 85-1116、SEQ ID NO 9 的殘基 79-1116、SEQ ID NO 9 的殘基 1117-1785、 SEQ ID NO 13 的殘基 78-1064、SEQ ID NO 13 的殘基 1065-1727、SEQ ID NO 17 的殘基 78-1055、SEQ ID NO :17 的殘基 1056-1721、SEQ ID NO :21 的殘基 78-1118、SEQ ID NO 21 的殘基 1119-1787、SEQ ID NO :25 的殘基 75-1115 和 SEQ ID NO :25 的殘基 1116-1787 或其互補(bǔ)序列?；蛘?，采用上述指定序列之一的變體的多核苷酸序列作為探針。此類(lèi)變體常包含一個(gè)或少數(shù)保守性核苷酸改變。例如，可選擇數(shù)對(duì)(或數(shù)套)寡核苷酸，其中兩個(gè)(或更多)多核苷酸序列彼此為保守性變異，一個(gè)多核苷酸序列完全對(duì)應(yīng)第一個(gè)變體或，且其它多核苷酸序列完全對(duì)應(yīng)其余變體。此類(lèi)成對(duì)寡核苷酸探針尤其可用于，例如特異性雜交實(shí) 驗(yàn)來(lái)檢測(cè)核苷酸多態(tài)性或檢測(cè)同源性流感HA和NA變體，如與本發(fā)明HA和NA序列同源的、感染其它物種或在不同流感爆發(fā)(時(shí)間和/或地理上不同)時(shí)出現(xiàn)的變體。在其它應(yīng)用中，所選的探針更分散，即選擇至少約91 % (或約92 %、約93 %、約94 %、約95 %、約96 %、約 97%、約 98%、約 98. 5%、約 98. 7%、約 99%、約 99. 1%、約 99. 2%、約 99. 3%、約 99. 4%, 約99. 5%或約99. 6%或多于約99. 7%、約99. 8%、約99. 9%或更高)相同的探針。按照本領(lǐng)域的常規(guī)方法，也可用本發(fā)明的探針，例如衍生自本文序列的序列來(lái)鑒定其它有用的多核苷酸序列。在一套實(shí)施方式中，如上面所述，用一個(gè)或多個(gè)探針篩選表達(dá)產(chǎn)物文庫(kù)或染色體區(qū)段文庫(kù)(如表達(dá)文庫(kù)或基因組文庫(kù))來(lái)鑒定包含與以下序列的一個(gè)或多個(gè)探針相同或具有顯著序列相似性的序列的克隆，即變體、同源物等SEQ ID NO=U 3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、SEQ ID NO :1 的殘基 74-1060、SEQ ID NO :1 的殘基 1061-1723、SEQ ID NO :5 的殘基 81-1058、SEQ ID NO :5 的殘基 1059-1724、SEQ ID NO: 9 的殘基 85-1116、SEQ ID NO 9 的殘基 79-1116、SEQ ID NO 9 的殘基 1117-1785、SEQ ID NO 13 的殘基 78-1064、SEQ ID NO 13 的殘基 1065-1727、SEQ ID NO 17 的殘基 78-1055、 SEQ ID NO 17 的殘基 1056-1721、SEQ ID NO 21 的殘基 78-1118、SEQ ID NO 21 的殘基1119-1787,SEQ ID NO 25 的殘基 75-1115 和 SEQ ID NO 25 的殘基 1116-1787。應(yīng)該理解除了例如文庫(kù)篩選等物理方法外，也可采用計(jì)算機(jī)輔助的生物信息學(xué)方法，如BLAST和其它序列同源性檢索算法等，來(lái)鑒定相關(guān)的多核苷酸序列。以此方式鑒定到的多核苷酸序列也是本發(fā)明的特征。任選通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各種方法產(chǎn)生寡核苷酸探針。最典型的是利用熟知的合成方法，眾口 Beaucage 禾口 Caruthers (1981) Tetrahedron Letts 22(20) :1859-1862 所述的固相亞磷酰胺三酯方法，如采用自動(dòng)合成儀或按Needham-Van Devanter等(1984) Nucl Acids Res, 12 :6159-6168所述。也可定制寡核苷酸或從技術(shù)人員已知的各種商品來(lái)源訂購(gòu)。需要時(shí)，一般通過(guò)天然丙烯酰胺凝膠電泳或陰離子交換HPLC，按Pearson和 Regnier (1983) T Chrom 255 137-149 所述純化寡核苷酸?？刹捎?Maxam 和 Gilbert (1980) 在Grossman和Moldave (編)紐約科學(xué)出版社，《酶學(xué)方法》(Methods in Enzymology) 65 499-560中所述的化學(xué)降解方法來(lái)驗(yàn)證合成寡核苷酸的序列。也不難從技術(shù)人員已知的商業(yè)來(lái)源訂購(gòu)定制的寡核苷酸。在其它情況下，如涉及表達(dá)本發(fā)明多核苷酸和多肽的細(xì)胞或生物體(如含本發(fā)明序列的那些攜帶病毒)時(shí)，優(yōu)選采用多肽、肽或抗體探針。例如，優(yōu)選采用衍生自本發(fā)明任何氨基酸序列的和/或由本發(fā)明多核苷酸序列，如選自以下的編碼的分離或重組多肽、多肽片段和肽來(lái)鑒定和分離噬菌體展示文庫(kù)、組合文庫(kù)、多克隆血清等中的抗體SEQ ID N0 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、SEQ ID NO :1 的殘基74-1060、SEQ ID NO :1 的殘基 1061-1723、SEQ ID NO :5 的殘基 81-1058、SEQ ID NO :5 的殘基 1059-1724、SEQ ID NO: 9 的殘基 85-1116、SEQ ID NO :9 的殘基 79-1116、SEQ ID NO :9 的殘基 1117-1785、SEQ ID NO 13 的殘基 78-1064、SEQ ID NO :13 的殘基 1065-1727、SEQ ID NO :17 的殘基 78-1055、 SEQ ID NO :17 的殘基 1056-1721、SEQ ID NO :21 的殘基 78-1118、SEQ ID NO :21 的殘基 1119-1787、SEQ ID NO :25 的殘基 75-1115 和 SEQ ID NO :25 的殘基 1116-1787。任何多肽序列或子序列，如SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、 26,28, SEQ ID NO 2 的殘基 17-345、SEQ ID NO 2 的殘基 346-566、SEQ ID NO 6 的殘基 18-343,SEQ ID NO :6 的殘基 344_565、SEQ ID NO :10 的殘基 18_361、SEQ ID NO :10 的殘基 16-361、SEQ ID NO 10 的殘基 362-584、SEQ ID NO 14 的殘基 17-345、SEQ ID NO 14 的殘基 346-566、SEQ ID NO 18 的殘基 18-343、SEQ ID NO 18 的殘基 344-565、SEQ ID N0:22 的殘基 16-362、SEQ ID NO 22 的殘基 363-585、SEQ ID NO 26 的殘基 16-362 或 SEQ ID NO 26的殘基363-585所示，和/或本發(fā)明多核苷酸序列，如SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、 17、19、21、23、25、27、SEQ ID NO 1 的殘基 74_1060、SEQ ID NO 1 的殘基 1061_1723、SEQ ID NO 5 的殘基 81-1058、SEQ ID NO 5 的殘基 1059-1724、SEQ ID NO 9 的殘基 85-1116、SEQ ID NO :9 的殘基 79-1116、SEQ ID NO :9 的殘基 1117_1785、SEQ ID NO 13 的殘基 78-1064、 SEQ ID NO 13 的殘基 1065-1727、SEQ ID NO 17 的殘基 78-1055、SEQ ID N0:17 的殘基 1056-1721、SEQ ID NO 21 的殘基 78-1118、SEQ ID NO 21 的殘基 1119-1787、SEQ ID NO 25的殘基75-1115或SEQ ID NO 25的殘基1116-1787編碼的多肽序列或子序列的特異性抗體同樣具有作為探針以便評(píng)價(jià)，例如細(xì)胞或組織的表達(dá)產(chǎn)物的價(jià)值。此外，抗體尤其適用于在組織陣列，細(xì)胞、組織或生物體中，如被未鑒定流感病毒等感染的生物體中，原位評(píng)價(jià) 含有氨基酸子序列的蛋白質(zhì)(如本文給出的那些蛋白質(zhì))或由本發(fā)明多核苷酸序列(如選自本文所示的那些)所編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)。用可檢測(cè)試劑直接標(biāo)記抗體，或用特定抗體重鏈恒定區(qū)(即同種型)的特異性二抗標(biāo)記進(jìn)行間接檢測(cè)。也可用針對(duì)本文所述特定氨基酸序列(例如，SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28，SEQ ID NO :2 的殘基 17-345、SEQ ID NO 2 的殘基 346-566、SEQ ID NO 6 的殘基 18-343、SEQ ID NO 6 的殘基 344-565、SEQ ID NO :10 的殘基 18_361、SEQ ID NO :10 的殘基 16_361、SEQ ID NO :10 的殘基 362-584、SEQ ID NO 14 的殘基 17_345、SEQ ID NO 14 的殘基 346_566、SEQ ID NO :18 的殘基 18-343、SEQ ID NO 18 的殘基 344-565, SEQ ID NO 22 的殘基 16-362、SEQ ID NO 22 的殘基 363-585、SEQ ID NO 26 的殘基 16-362 或 SEQ ID NO 26 的殘基 363-585)的抗體來(lái)測(cè)定其它流感病毒是否為與本發(fā)明序列相同的病毒株(例如，通過(guò)HI試驗(yàn)等)。關(guān)于產(chǎn)生特異性抗體的其它細(xì)節(jié)見(jiàn)下文。診斷試驗(yàn)本發(fā)明的核酸序列可用于診斷試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)樣品中的流感(病毒)(和/或血凝素和/或神經(jīng)氨酸酶)、檢測(cè)血凝素樣和/或神經(jīng)氨酸酶樣序列、和用化學(xué)合成或重組的多核苷酸片段(如選自本文序列)檢測(cè)流感臨床分離物中的病毒株差異。例如，可將含有至少 10-20個(gè)核苷酸的血凝素和/或神經(jīng)氨酸酶序列的片段用作引物，采用本領(lǐng)域熟知的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)(如逆轉(zhuǎn)錄-PCR)方法擴(kuò)增核酸，和在核酸雜交實(shí)驗(yàn)中用作探針來(lái)檢測(cè)臨床標(biāo)本中的目標(biāo)遺傳物質(zhì)，如流感RNA。也可按照本領(lǐng)域的常規(guī)方法，用本發(fā)明的探針，如選自以下的獨(dú)特子序列也能用于鑒定其它有用的多核苷酸序列(如表征其它流感毒株)=SEQ ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、 15、17、19、21、23、25、27、SEQ ID NO 1 的殘基 74_1060、SEQ ID NO : 1 的殘基 1061_1723、SEQ ID NO :5 的殘基81-1058、SEQ ID NO :5 的殘基 1059_1724、SEQ ID NO :9 的殘基85_1116、SEQ ID NO :9 的殘基 79-1116、SEQ ID NO :9 的殘基 1117_1785、SEQ ID NO : 13 的殘基 78-1064、 SEQ ID NO 13 的殘基 1065-1727、SEQ ID NO :17 的殘基 78-1055、SEQ ID NO :17 的殘基 1056-1721、SEQ ID NO :21 的殘基 78-1118、SEQ ID NO :21 的殘基 1119-1787、SEQ ID NO 25的殘基75-1115或SEQ ID NO :25的殘基1116-1787。在一套優(yōu)選實(shí)施方式中，采用上述的一個(gè)或多個(gè)探針來(lái)篩選表達(dá)產(chǎn)物文庫(kù)和克隆的病毒核酸文庫(kù)(即，表達(dá)文庫(kù)或基因組文庫(kù))以鑒定包含的序列與本文序列相同或具有顯著序列相同性的克隆。進(jìn)而可用這些鑒定的序列各自制造探針，包括上述成對(duì)或成套的變體探針。應(yīng)該知道除了例如文庫(kù)篩選等物理方法外，也可采用計(jì)算機(jī)輔助的生物信息學(xué)方法，如BLAST和其它序列同源性檢索算法等，來(lái)鑒定相關(guān)的多核苷酸序列。本發(fā)明的探針尤其可用于檢測(cè)細(xì)胞、組織或其它生物樣品(如鼻腔洗液或支氣管灌洗液)中是否存在流感病毒核酸或測(cè)定其身份。例如，優(yōu)選用本發(fā)明探針測(cè)定生物樣品，如對(duì)象(如人對(duì)象)或模型系統(tǒng)(如培養(yǎng)的細(xì)胞樣品)是否已接觸過(guò)流感病毒或已被流感病毒或特定的流感病毒株感染。檢測(cè)到所選探針與源于(或分離自)生物樣品或模型系統(tǒng) 的核酸發(fā)生雜交，表明已接觸過(guò)含有所選探針針對(duì)的多核苷酸的病毒(或相關(guān)病毒)或已被該病毒感染。應(yīng)該知道探針的設(shè)計(jì)受所需應(yīng)用的影響。例如，要在一次實(shí)驗(yàn)，如用一張DNA芯片檢測(cè)幾種等位基因的特異性探針-靶標(biāo)相互作用時(shí)，所有探針宜有相似的解鏈溫度。因此，調(diào)整探針的長(zhǎng)度使陣列上所有探針的解鏈溫度接近相似(應(yīng)當(dāng)知道當(dāng)不同探針的GC含量不同時(shí)，不同探針需要不同長(zhǎng)度以達(dá)到特定的Tm)。雖然解鏈溫度是探針設(shè)計(jì)中的主要考慮，但可任選利用其它因素進(jìn)一步調(diào)整探針的結(jié)構(gòu)，如對(duì)引物自身互補(bǔ)性作選擇等。載體，啟動(dòng)子和表達(dá)系統(tǒng)本發(fā)明包括摻入了一個(gè)或多個(gè)本文所述核酸序列的重組構(gòu)建物。此類(lèi)構(gòu)建物任選包括載體，例如質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、病毒、人工細(xì)菌染色體(BAC)、人工酵母染色體(YAC) 等，其中以正向或反向插入了一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的多核苷酸序列，例如包含以下任何一個(gè) 或其子序列等SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、SEQ ID NO :1 的殘基 74-1060,SEQ ID NO : 1 的殘基 1061_1723、SEQ ID NO :5 的殘基81_1058、SEQ ID NO :5 的殘基 1059-1724、SEQ ID NO :9 的殘基85_1116、SEQ ID NO :9 的殘基 79_1116、SEQ ID NO :9 的殘基 1117-1785、SEQ ID NO : 13 的殘基 78-1064、SEQ ID NO : 13 的殘基 1065-1727、SEQ ID NO 17 的殘基 78-1055、SEQ ID NO :17 的殘基 1056-1721、SEQ ID NO :21 的殘基 78-1118、 SEQ ID NO 21 的殘基 1119-1787、SEQ ID NO :25 的殘基 75-1115 或 SEQ ID NO :25 的殘基 1116-1787。例如，插入的核酸可包含含有至少一個(gè)本發(fā)明多核苷酸序列的全部或一部分的病毒染色體序列或cDNA。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述構(gòu)建物還包含與該序列操作性相連的調(diào) 節(jié)序列，例如啟動(dòng)子。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道大量的合適載體和啟動(dòng)子可從商業(yè)上購(gòu)得。本發(fā)明的多核苷酸可包含在各種適合產(chǎn)生正義或反義RNA，以及任選的多肽(或肽)表達(dá)產(chǎn)物(如，本發(fā)明的血凝素和/或神經(jīng)氨酸酶分子或血凝素或神經(jīng)氨酸酶片段) 的任何一種載體中。此類(lèi)載體包括染色體、非染色體和合成的DNA序列，如SV40衍生物；細(xì) 菌質(zhì)粒；噬菌體DNA ；桿狀病毒；酵母質(zhì)粒；衍生自質(zhì)粒和噬菌體DNA組合的載體，病毒DNA 如牛痘、腺病毒、禽痘病毒、狂犬病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等(如pCDL)?？刹?用能夠?qū)⑦z傳物質(zhì)引入細(xì)胞并且能在相關(guān)宿主中復(fù)制(如果需要的話(huà))的任何載體。在表達(dá)載體中，感興趣的HA和/或NA多核苷酸序列在物理上相鄰排布朝向合適的轉(zhuǎn)錄控制序列(如啟動(dòng)子，任選地一個(gè)或多個(gè)增強(qiáng)子)以指導(dǎo)mRNA合成。S卩，感興趣的多核苷酸序列操作性連接于合適的轉(zhuǎn)錄控制序列。此類(lèi)啟動(dòng)子的例子包括LTR或SV40啟動(dòng)子、大腸桿菌Iac或trp啟動(dòng)子、噬菌體λ Pl啟動(dòng)子及其它知道的能控制原核或真核細(xì) 胞或其它病毒中基因表達(dá)的啟動(dòng)子。適用于表達(dá)載體中的各種啟動(dòng)子可調(diào)節(jié)流感病毒基因組區(qū)段的轉(zhuǎn)錄。在某些實(shí)施方式中，采用巨細(xì)胞病毒(CMV) DNA依賴(lài)性RNA聚合酶II (Pol II)啟動(dòng)子。如果需要，例如在可控制條件表達(dá)，可換用可在特定條件下、或在特定組織和細(xì)胞中誘導(dǎo)DNA轉(zhuǎn)錄的其它啟動(dòng)子?？少?gòu)得多種病毒和哺乳動(dòng)物，如人的啟動(dòng)子，或按照所考慮的特定應(yīng)用分離。例如，獲自動(dòng)物和人病毒基因組的備選啟動(dòng)子包括例如腺病毒(如腺病毒幻、乳頭瘤病毒、乙肝病毒、多瘤病毒以及猿病毒40 (SV40)和各種逆轉(zhuǎn)錄病毒的啟動(dòng)子。許多其它啟動(dòng)子中，哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子包括肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、免疫球蛋白啟動(dòng)子、熱激啟動(dòng)子等。本發(fā)明的各種實(shí)施方式可包括許多不同的載體構(gòu)建物。此類(lèi)構(gòu)建物通常優(yōu)選用于質(zhì)粒拯救系統(tǒng)以產(chǎn)生用于疫苗(例如，減毒活疫苗、殺傷或滅活疫苗等)的病毒。因此，本發(fā)明包括含有轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的重組DNA分子，該元件結(jié)合DNA-指導(dǎo)性RNA聚合酶并操作性連接于編碼RNA分子的DNA序列，其中所述RNA分子包含負(fù)鏈RNA病毒的RNA指導(dǎo)性RNA 聚合酶的特異性結(jié)合位點(diǎn)，操作性連接于包含負(fù)鏈RNA病毒的mRNA編碼序列的反向互補(bǔ)序列的RNA序列。本發(fā)明還包括轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生包含RNA序列的RNA模板的重組DNA分子，所述RNA序列包含負(fù)鏈RNA病毒的mRNA編碼序列的反向互補(bǔ)序列和vRNA末端序列。本發(fā)明還包括轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生可復(fù)制RNA模板的重組DNA分子，所述RNA模板包含負(fù)鏈RNA病毒的mRNA 編碼序列的反向互補(bǔ)序列。以上重組DNA分子通常包括，其中所述負(fù)鏈RNA病毒是流感病毒(例如甲型或乙型流感病毒等)。此類(lèi)實(shí)施方式中的RNA分子通常也是流感(病毒)基因組區(qū)段，所述RNA模板通常是流感(病毒)基因組區(qū)段。該重組DNA分子通常包括，其中所述RNA模板是可復(fù)制模板，所述負(fù)鏈RNA病毒是流感病毒，所述RNA模板是流感(病毒) 基因組區(qū)段。因此，所述流感(病毒)核酸區(qū)段通常包含HA和/或NA基因(其相應(yīng)的核酸見(jiàn)圖1，或者與含有圖1所示核酸相似的病毒株)。本發(fā)明還包括制備RNA分子的方法，包括用DNA-指導(dǎo)性RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄重組DNA 分子，其中所述DNA分子包含結(jié)合DNA指導(dǎo)性RNA聚合酶并操作性連接于編碼RNA分子的 DNA序列的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，其中所述RNA分子包含負(fù)鏈RNA病毒的RNA指導(dǎo)性RNA聚合酶的特異性結(jié)合位點(diǎn)，操作性連接于包含負(fù)鏈RNA病毒的mRNA編碼序列的反向互補(bǔ)序列的RNA 序列。本發(fā)明還包括制備RNA分子的方法，包括用DNA-指導(dǎo)性RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄重組DNA分子，其中所述重組DNA分子在轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生含有RNA序列的RNA分子，所述RNA序列包含負(fù)鏈 RNA病毒的mRNA編碼序列的反向互補(bǔ)序列和vRNA末端序列。此外，本發(fā)明包括制備RNA分子的方法，包括用DNA-指導(dǎo)性RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄重組DNA分子，其中所述重組DNA分子在轉(zhuǎn) 錄后產(chǎn)生包含負(fù)鏈RNA病毒的mRNA編碼序列的反向互補(bǔ)序列的可復(fù)制RNA分子。此類(lèi)方法通常包括，其中所述負(fù)鏈RNA病毒是流感(病毒)，所述RNA分子是流感(病毒)基因組區(qū)段。此類(lèi)方法優(yōu)選包括，其中所述DNA指導(dǎo)性RNA聚合酶是pol I.pol II、T7聚合酶、 T3聚合酶或Sp6聚合酶。因此，所述流感(病毒)核酸區(qū)段通常包含本文所述的HA和/或 NA基因。本發(fā)明的其它方法包括構(gòu)建含有轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列的DNA分子的方法，所述調(diào)控序列結(jié)合DNA-指導(dǎo)性RNA聚合酶并操作性連接于編碼RNA分子的DNA序列，其中所述RNA分子包含流感病毒的RNA指導(dǎo)性RNA聚合酶的特異性結(jié)合位點(diǎn)，操作性連接于包含流感病毒的 mRNA編碼序列的反向互補(bǔ)序列的RNA序列，其中所述DNA序列包含對(duì)應(yīng)于以下一種或多種或它們的片段的核酸或相似毒株(例如，具有圖1所示序列的毒株的相似毒株)的一條或多條核酸序列SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、SEQ ID NO :1 的殘基 74-1060,SEQ ID NO : 1 的殘基 1061_1723、SEQ ID NO :5 的殘基81_1058、SEQ ID NO :5 的殘基 1059-1724、SEQ ID NO :9 的殘基85_1116、SEQ ID NO :9 的殘基 79_1116、SEQ ID NO :9 的殘基 1117-1785、SEQ ID NO : 13 的殘基 78-1064、SEQ ID NO : 13 的殘基 1065-1727、SEQ ID NO 17 的殘基 78-1055、SEQ ID NO :17 的殘基 1056-1721、SEQ ID NO :21 的殘基 78-1118、 SEQ ID NO 21 的殘基 1119-1787、SEQ ID NO :25 的殘基 75-1115 或 SEQ ID NO :25 的殘基 1116-1787。本發(fā)明還包括構(gòu)建DNA分子的方法，所述DNA分子包含轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生含有RNA序列的RNA模板的DNA序列，所述RNA序列包含流感病毒的mRNA編碼序列的反向互補(bǔ)序列和 vRNA末端序列，其中所述DNA序列包含對(duì)應(yīng)于以下一種或多種或它們的片段的核酸或相似毒株(例如，具有圖1所示序列的毒株的相似毒株)的一條或多條核酸序列SEQ ID NO :1、 3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、SEQ ID NO :1 的殘基 74-1060、SEQ ID NO :1 的殘基 1061-1723、SEQ ID NO :5 的殘基 81-1058、SEQ ID NO :5 的殘基 1059-1724、SEQ ID N0: 9 的殘基 85-1116、SEQ ID NO 9 的殘基 79-1116、SEQ ID NO 9 的殘基 1117-1785、SEQ IDNO 13 的殘基 78-1064、SEQ ID NO 13 的殘基 1065-1727、SEQ ID NO 17 的殘基 78-1055、 SEQ ID NO :17 的殘基 1056-1721、SEQ ID NO :21 的殘基 78-1118、SEQ IDNO :21 的殘基 1119-1787,SEQ ID NO :25 的殘基 75-1115 或 SEQ ID NO :25 的殘基 1116-1787。此類(lèi)方法還包括，其中所述RNA模板是可復(fù)制的。本發(fā)明的其它方法包括構(gòu)建包含DNA序列的DNA 分子的那些方法，所述DNA序列在轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生包含流感病毒的mRNA編碼序列的反向互補(bǔ)序列的可復(fù)制RNA模板。本發(fā)明的這些方法通常包括，其中所述RNA分子是流感病毒基因組區(qū)段，所述DNA-指導(dǎo)性RNA聚合酶是pol I.pol II、T7聚合酶、T3聚合酶或Sp6聚合酶。任選通過(guò)包含增強(qiáng)子序列來(lái)增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄。增強(qiáng)子通常較短，如，10_500bp，它是與啟動(dòng)子協(xié)同提高轉(zhuǎn)錄的順式作用DNA原件。從哺乳動(dòng)物基因(血紅蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰島素)和真核細(xì)胞病毒中分離得到了許多增強(qiáng)子序列。可將增強(qiáng)子剪接到載體中異源編碼序列的5'或3'位置，但通常插入啟動(dòng)子的5'位。通常選擇啟動(dòng)子和其它轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)序列(若需要)以?xún)?yōu)化在引入了該異源DNA的宿主細(xì)胞中的表達(dá)(Scharf 等(1994)熱激啟動(dòng)子禾口轉(zhuǎn)錄因子(Heat stress prompter and transcription factors) Results Probl Cell Differ 20 :125-62 ;Kriegler 等(1990)組裝增強(qiáng)子、啟動(dòng)子和剪接信號(hào)以調(diào)控轉(zhuǎn)移基因的表達(dá)(Assembly of enhancers,promoter,and splice signals to control expression of transferred gene)Methods in Enzymol 185:512-27)。擴(kuò)增子也任選包含核糖體結(jié)合位點(diǎn)或內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IREQ以啟動(dòng)翻譯。本發(fā)明的載體也優(yōu)選包含終止轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定mRNA所需的序列，例如聚腺苷酸化位點(diǎn)或終止序列。此類(lèi)序列一般獲自真核或病毒DNA或cDNA非翻譯區(qū)的5'末端，偶爾位于 3'末端。在一個(gè)實(shí)施方式中，SV40聚腺苷酸化信號(hào)序列能提供雙向聚腺苷酸化位點(diǎn)，將 (+)鏈mRNA分子的轉(zhuǎn)錄與Poll啟動(dòng)子啟動(dòng)的(-)鏈病毒基因組復(fù)制相隔離。此外，如上所述，所述表達(dá)載體任選包含一個(gè)或多個(gè)可選擇性標(biāo)記基因以提供用于篩選轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的表型性狀，除了以前列出的基因外，例如二氫葉酸還原酶或新霉素抗性等標(biāo)記適合于選擇真核細(xì)胞培養(yǎng)物。可用含有上述合適核酸序列以及合適的啟動(dòng)子或調(diào)控序列的載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞使之表達(dá)所述蛋白。雖然本發(fā)明的載體可在細(xì)菌細(xì)胞中復(fù)制，但最常需將它們引入哺乳動(dòng) 物細(xì)胞，如Vero細(xì)胞、BHK細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、293細(xì)胞、COS細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。如本文它處所述，在各種實(shí)施方式中，本文所述的HA和NA序列可包含于參與質(zhì) 粒拯救重配的質(zhì)粒中。參見(jiàn)例如，2002年10月23日提交的美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?0/420，708 ；2003 年4月25日提交的美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?0/423，擬8以及2004年5月M日提交的美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?60/574，117，名稱(chēng)均是“生產(chǎn)流感病毒的多質(zhì)粒系統(tǒng)”;Hoffmann，Ε.，2000，PNAS，97(11) 6108-6113 ；授予Hoffmann的美國(guó)公布專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?0020164770 ；和2003年4月8日授予 Palese等的美國(guó)專(zhuān)利6，544, 785。產(chǎn)生的重配病毒包含排列在一起的HA和NA基因與A/ Ann Arbor/6/60供體病毒株、B/Ann Arbor/1/66供體病毒株(和/或其衍生物及修飾形式)、A/Puerto Rico/8/34供體病毒株的6個(gè)其它流感(病毒)基因等。其它表達(dá)元件編碼流感病毒HA和/或NA蛋白的基因組區(qū)段最常包含其表達(dá)、包括翻譯成功能性病毒蛋白質(zhì)所需的任何其它序列。在其它情況下，可采用編碼病毒蛋白，如HA和/或NA 蛋白的小基因或其它人造構(gòu)建物。在此類(lèi)情況下，仍常常需要包含有助于異源編碼序列有效翻譯的特定起始信號(hào)。這些信號(hào)可能包括，例如ATG起始密碼子和毗鄰序列。為了保證插入子的整體翻譯，應(yīng)將起始密碼子插入到相對(duì)于該病毒蛋白的正確讀框中。外源性轉(zhuǎn)錄原件和起始密碼子可以是不同來(lái)源，天然和合成均可。包含合適的增強(qiáng)子可提高所用細(xì)胞系統(tǒng)的表達(dá)效率。如果需要，可將編碼其它表達(dá)原件如信號(hào)序列、分泌或定位序列等的多核苷酸序列摻入載體中，通常與感興趣的多核苷酸序列同框，以(例如)使目的多肽表達(dá)于所需細(xì)胞腔室、細(xì)胞膜或細(xì)胞器，或指導(dǎo)多肽分泌至周質(zhì)空間或細(xì)胞培養(yǎng)基中。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道此類(lèi)序列，包括分泌前導(dǎo)肽、細(xì)胞器靶向序列(如核定位序列、ER駐留信號(hào)、線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)運(yùn)序列)，膜定位/錨定序列(如終止轉(zhuǎn)運(yùn)序列、GPI錨定序列)等。當(dāng)需要翻譯本發(fā)明核酸序列編碼的多肽時(shí)，加入翻譯特異性起始信號(hào)可提高翻譯效率。這些信號(hào)可包括，例如ATG起始密碼子和毗鄰序列、IRES區(qū)等。在一些情況下，例如，可將包含摻入了本發(fā)明多核苷酸序列(如本文所述序列)、翻譯起始密碼子和相關(guān)序列元件的編碼序列的全長(zhǎng)cDNA分子或染色體區(qū)段，與感興趣多核苷酸序列同時(shí)插入合適的表達(dá)載體中。在這些情況下，通常不需要添加翻譯控制信號(hào)。然而，當(dāng)僅插入多肽編碼序列或其一部分時(shí)，常提供外源性翻譯控制信號(hào)，包括例如ATG起始密碼子以使相關(guān)序列表達(dá)。將起始密碼子置于正確讀框中以保證感興趣多核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄。外源性轉(zhuǎn)錄元件和起始密碼子的來(lái)源可以不同，天然和合成的均可。通過(guò)加入對(duì)所用細(xì)胞體系合適的增強(qiáng)子可提高表達(dá)效率(參見(jiàn)例如，Scharf D.等(1994)Results Probl Cell Differ 20 :125-62 ； Bittner 等(1987)Methods in Enzymol 153 :516-544) 重組病毒的產(chǎn)生采用重組反向遺傳學(xué)方法可遺傳工程改造并回收負(fù)鏈RNA病毒O^lese等的美國(guó)專(zhuān)利5，166，057)。此類(lèi)方法最初用于工程改造流感病毒基因組(Luytjes等(1989) Cell 59 :1107-1113 ;Enami 等(1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:11563-11567)已成功地用于各種區(qū)段化和非區(qū)段化負(fù)鏈RNA病毒，如狂犬病病毒(Schnell等(1994)EMBO J. 13 :4195-4203) ；VSV (Lawson 等(1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:4477-4481)；麻疹病毒(Radecke 等(1995)EMBO J. 14 :5773-5784)；牛瘟病毒(Baron 和 Barrett (1997) J. Virol. 71 :1265-1271)；人副流感病毒(Hoffman 和 Banerjee(1997)J. Virol. 71 3272-3277 ；Dubin 等(1997)Virology 235 :323-332) ；SV5(He 等(1997)Virology 237 249-260)；犬瘟病毒(Gassen 等(2000) J. Virol. 74 :10737-44)；和仙臺(tái)(Sendai)病毒 (Park 等(1991)Proc. Natl. Acad. ki. USA 88 :5537-5541 ；Kato 等(1996)Genes to Cells 1 :569-579)。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉制備含本發(fā)明HA和NA序列的流感病毒的這些方法及類(lèi) 似方法。根據(jù)此類(lèi)方法制備的重組流感病毒像含有一種或多種本發(fā)明核酸和/或多肽的重組流感病毒一樣，也是本發(fā)明的特征。本領(lǐng)域技術(shù)人員當(dāng)然知曉流感病毒(以及本發(fā)明的那些病毒)通常是負(fù)鏈RNA病毒。因此，當(dāng)描述的本發(fā)明流感病毒包含，例如圖1所示序列時(shí)，應(yīng)理解這通常指這些序列的相應(yīng)負(fù)鏈RNA形式。圖1中的核苷酸序列包含所述基因(與核苷酸序列中的一些非翻譯區(qū))的DNA形式(例如，編碼有義鏈等)。本領(lǐng)域技術(shù)人員不難在RNA和DNA序列之間(例如，將U轉(zhuǎn)變成T等等)和在互補(bǔ)核苷酸序列(無(wú)論RNA或 DNA)之間進(jìn)行轉(zhuǎn)換。因此，例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員不難將核苷酸序列(例如圖1中給出的，如SEQ ID NO 1)轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的氨基酸序列或相應(yīng)的互補(bǔ)序列(無(wú)論DNA或RNA)等等。當(dāng)描述的此類(lèi)HA和/或NA序列位于DNA載體(例如質(zhì)粒等)內(nèi)時(shí)，通常應(yīng)理解為該序列的相應(yīng)DNA形式。本發(fā)明的核酸也包括在本文序列表中明確說(shuō)明的序列、以及此類(lèi)序列的互補(bǔ) 序列(RNA和DNA)、序列表中序列的雙鏈形式、序列表中所述序列的相應(yīng)RNA形式(序列表中明確說(shuō)明序列的互補(bǔ)RNA或序列表中所述序列的RNA形式，例如同一有義序列，但由RNA 構(gòu)成，U替代了 T，等等)。因此，按照本文所述，本發(fā)明核酸序列可包含以下的RNA形式SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、SEQ ID NO 1 的殘基 74-1060、SEQ ID NO :1 的殘基 1061-1723、SEQ ID NO :5 的殘基81_1058、SEQ ID NO :5 的殘基 1059_1724、SEQ ID NO 9 的殘基 85-1116、SEQ ID NO 9 的殘基 79-1116、SEQ ID NO 9 的殘基 1117-1785、 SEQ ID NO 13 的殘基 78-1064、SEQ ID NO 13 的殘基 1065-1727、SEQ ID NO 17 的殘基 78-1055、SEQ ID NO :17 的殘基 1056-1721、SEQ ID NO :21 的殘基 78-1118、SEQ ID NO 21 的殘基 1119-1787、SEQ ID NO :25 的殘基 75-1115 或 SEQ ID NO :25 的殘基 1116-1787 (在正鏈有義鏈或負(fù)鏈有義鏈中)。細(xì)胞培養(yǎng)和表達(dá)宿主本發(fā)明也涉及引入(轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染)了本發(fā)明載體的宿主細(xì)胞和用重組技術(shù)產(chǎn)生的本發(fā)明多肽。可用本發(fā)明的載體，如表達(dá)載體基因工程改造宿主細(xì)胞(即轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染)。如上所述，載體可以是質(zhì)粒、病毒顆粒、噬菌體等形式。合適的表達(dá)宿主的例子包括細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌(E. coli)、鏈霉菌(Sti^ptomyces)和鼠傷寒沙門(mén)氏菌 (Salmonella typhimurium)；真菌細(xì)胞，如酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),巴其Jf 德畢赤酵母(Pichia pastoris)和粗糙鏈孢霉(Neurospora crassa)；或昆蟲(chóng)細(xì)胞如果蠅 (Drosophila)禾口草地I夜娥(Spodoptera frugiperda)。最常用哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)本發(fā)明的HA和NA分子。流感病毒(例如，含本文的HA 和/或NA序列)復(fù)制的合適宿主細(xì)胞包括，如Vero細(xì)胞、BHK細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、293細(xì)胞和 COS細(xì)胞，包括細(xì)胞、C0S7細(xì)胞等。通常采用(例如)1 1比例的兩種上述細(xì)胞系的共培養(yǎng)物，如MDCK細(xì)胞和或COS細(xì)胞，以提高復(fù)制效率。常用標(biāo)準(zhǔn)的商品化培養(yǎng)基，如添加了血清(如10%胎牛血清)的Dulbecco改良的fegle培養(yǎng)基，或用無(wú)血清培養(yǎng)基，在適合維持中性緩沖PH(如pH 7.0-7.2)的受控濕度和CO2濃度下培養(yǎng)細(xì)胞。任選所述培養(yǎng)基包含防止細(xì)菌生長(zhǎng)的抗生素，如青霉素、鏈霉素等，和/或額外的營(yíng)養(yǎng)物，如L-谷胺酰胺、丙酮酸鈉、非必需氨基酸，能改善生長(zhǎng)特性的添加補(bǔ)充劑，如胰蛋白酶、β -巰基乙醇等?？捎眠m合激活啟動(dòng)子、選擇轉(zhuǎn)化子或擴(kuò)增插入的多核苷酸序列的改良常規(guī)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)經(jīng)工程改造的宿主細(xì)胞，例如在產(chǎn)生病毒的整個(gè)過(guò)程中。培養(yǎng)條件，例如溫度、PH 等通常是先前為特定宿主細(xì)胞選擇用于表達(dá)的那些條件，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道這些條件而且在本文引用的參考文獻(xiàn)中有所描述，包括如，F(xiàn)reshney(1994)《動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)，基本技術(shù) 手冊(cè)》(Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique)，第 3 版，紐約韋利-李斯出版社(Wiley-Liss)及其引用文獻(xiàn)。其它有用的參考文獻(xiàn)包括，如，Paul (1975)《細(xì)胞和組織培養(yǎng)》(Cell and Tissue Culture)，第5版，愛(ài)丁堡利文斯頓出版社(Livingston， Edinburgh) ；Adams (1980)《生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)-生化學(xué)家細(xì)胞培養(yǎng)》 (Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Cell Culture for Biochemists)，Work和Burdon編，阿姆斯特丹埃斯威爾出版社(Elsevier，Amsterdam)。關(guān) 于體外產(chǎn)生流感病毒的尤其感興趣的組織培養(yǎng)方法的其它細(xì)節(jié)包括，如Merten等(1996)《通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)流感病毒制備疫苗》(Production of Influenza virus in cell cultures for vaccine pr印aration) Cohen禾口 Shafferman編《設(shè)計(jì)禾口生產(chǎn)疫苗的新策略》 (Novel Strategies in Design and Production of Vaccine),出于所有目的通過(guò)弓|用全文納入本文。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知不難通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定如何對(duì)此類(lèi)方法作出改變使之適合本發(fā)明?？捎煤寤驘o(wú)血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)流感病毒(如具有本發(fā)明HA和 /或NA序列)。在一些情況下，例如為制備純化的病毒，通常需要在無(wú)血清條件下培養(yǎng)細(xì) 胞?？尚∫?guī)模培養(yǎng)細(xì)胞，例如用少于25ml的培養(yǎng)基、培養(yǎng)管或培養(yǎng)瓶；或用大瓶震蕩培養(yǎng)，用滾瓶培養(yǎng)，或采用裝有微載體珠(如，DEAE-右旋糖苷微載體珠，如灰鶴和朗更公司的多瑪薩爾(Dormacel 1, Pfeifer and Langen)；弗洛實(shí)驗(yàn)室公司的超級(jí)珠(Superbead, Flow Laboratories)；苯乙烯共聚三甲胺珠，如希爾萊克斯、所咯希爾、安阿伯(Hillex， SoloHill,Ann Arbor))的培養(yǎng)瓶、燒瓶或反應(yīng)器培養(yǎng)細(xì)胞。微載體珠是為每體積貼壁細(xì)胞培養(yǎng)物提供更大表面積的小球(直徑范圍為100-200微米)。例如一升培養(yǎng)基裝了 2千萬(wàn)個(gè) 微載體珠，提供了超過(guò)8000平方厘米的生長(zhǎng)表面。商品化生產(chǎn)病毒，例如疫苗產(chǎn)品，常需要用生物反應(yīng)器或發(fā)酵罐培養(yǎng)細(xì)胞。現(xiàn)有的生物反應(yīng)器容積為1升至100升以上，如，Cyto3生物反應(yīng)器(奧斯莫里卡公司，明尼蘇達(dá)州明內(nèi)通卡市(Osmonics，MirmetonkhMN)) ；NBS生物反應(yīng)器(新不倫瑞克科學(xué)公司，新澤西州埃迪遜市(New Brunswick Scientific,Edison, NJ))；來(lái)自布朗生物技術(shù)國(guó)際公司(布朗生物技術(shù)公司，德國(guó)邁爾蘇金(B. Braim Biotech, Melsungen, Germany))的實(shí)驗(yàn)室和商業(yè)規(guī)模的生物反應(yīng)器。無(wú)論培養(yǎng)體積如何，在本發(fā)明的許多理想方面中保持培養(yǎng)物于合適溫度以確保采用溫度依賴(lài)的該多質(zhì)粒系統(tǒng)(參見(jiàn)例如，2002年10月23日提交的美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?0/420，708， 2003年4月25日提交的美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?0/423，828以及2004年5月M日提交的美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?60/574，117，名稱(chēng)均為“用于生產(chǎn)流感病毒的多質(zhì)粒系統(tǒng)”)能有效回收重組和/或重配流感病毒，加熱病毒溶液進(jìn)行過(guò)濾等至關(guān)重要。通常采用調(diào)節(jié)器，如恒溫裝置或其它能傳感和維持細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)和/或其它溶液溫度的設(shè)備，以確保在相應(yīng)期間(如病毒復(fù)制等)的溫度處于正確水平。在本文的一些實(shí)施方式中(如從載體區(qū)段產(chǎn)生重配病毒)，按照本領(lǐng)域熟知的方法將含有流感基因組區(qū)段的載體引入(如轉(zhuǎn)染)宿主細(xì)胞從而將異源核酸引入真核細(xì)胞，方法包括例如，磷酸鈣共沉淀、電穿孔、顯微注射、脂轉(zhuǎn)染和采用聚胺轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染。例如，可將載體，如質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞，如COS細(xì)胞、293T細(xì)胞或C0S，或細(xì)胞和MDCK細(xì)胞的混合物，可按照制造商說(shuō)明書(shū)用聚胺轉(zhuǎn)染試劑TransIT-LTl (密如斯公司(Mirus))產(chǎn)生重配病毒等。因此，在一個(gè)實(shí)例中，將約1 μ g各載體與用160 μ 1培養(yǎng)基(優(yōu)選無(wú)血清培養(yǎng) 基)稀釋的約2 μ 1 TransIT-LTl引入宿主細(xì)胞群，總體積200 μ 1。室溫培育DNA :轉(zhuǎn)染試劑混合物45分鐘后加入800 μ 1培養(yǎng)液。將轉(zhuǎn)染混合物加入宿主細(xì)胞，通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它方法培養(yǎng)細(xì)胞。因此，為通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)重組或重配病毒，將各自摻入了 8 個(gè)基因組區(qū)段(如本發(fā)明ΡΒ2、PBl、PA、NP、M、NS、HA和NA)的載體與約20 μ ITransIT-LTl 混合后轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞中。任選在轉(zhuǎn)染前用無(wú)血清培養(yǎng)基如Opti-MEM I替換含血清培養(yǎng) 基，培育4-6小時(shí)?；蛘撸刹捎秒姶┛讓⒋祟?lèi)摻入了流感基因組區(qū)段的載體引入宿主細(xì)胞中。例如，按照下述步驟用電穿孔優(yōu)選將摻入了甲型流感或乙型流感病毒(基因組區(qū)段)的質(zhì)粒載體引入Vero細(xì)胞中。簡(jiǎn)言之，將用含10%胎牛血清(FBS)的改良fegle培養(yǎng)基(MEM))培養(yǎng) 的約^clO6Vero細(xì)胞重懸于0.細(xì)1 OptiMEM中，置于電穿孔杯中。將體積25 μ 1含20微克 DNA加入杯中的細(xì)胞，然后輕拍溫和混勻。按照廠(chǎng)商說(shuō)明書(shū)進(jìn)行電穿孔(如連接有電容延長(zhǎng)器(Capacitance Extender Plus)的伯樂(lè)基因脈沖儀II)，300伏，950微法拉，時(shí)間常數(shù) 28-33毫秒。輕拍混勻細(xì)胞電穿孔后約1-2分鐘直接在杯中加入含10% FBS的0. 7ml MEM。然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含anl MEM，10% FBS的標(biāo)準(zhǔn)6孔組織培養(yǎng)板的兩個(gè)孔中。洗滌小杯回收殘留細(xì)胞，將洗滌懸液分置于兩孔，終體積約3. 5mL。然后在允許病毒生長(zhǎng)的條件下，如對(duì)于冷適應(yīng)性病毒株在33°C下溫育細(xì)胞。在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中，可采用多種表達(dá)系統(tǒng)，如基于病毒的系統(tǒng)。當(dāng)用腺病毒作為表達(dá)載體時(shí)，任選將編碼序列連接于由晚期啟動(dòng)子和三重前導(dǎo)序列構(gòu)成的腺病毒轉(zhuǎn)錄/ 翻譯復(fù)合體。插入病毒基因組的非必需El和E3區(qū)將產(chǎn)生能在感染宿主細(xì)胞中表達(dá)感興趣多肽的活病毒(Logan 和 Shenk(1984)Proc Natl Acad Sci 81 :3655-3659)。此外，可采用轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，如勞氏肉瘤病毒(RSV)增強(qiáng)子來(lái)提高哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的表達(dá)。任選選擇能調(diào)節(jié)插入的序列表達(dá)或以所需方式加工表達(dá)蛋白的宿主細(xì)胞株。蛋白的此類(lèi)修飾包括但不限于；乙?；?、羧基化、糖基化、磷酸化、脂化和?；?。將蛋白的前體形式切割為成熟形式的蛋白質(zhì)翻譯后加工有時(shí)對(duì)于正確插入、折疊和/或功能至關(guān)重要。此外，在宿主細(xì)胞中表達(dá)的位置(如在細(xì)胞表面)是否合適也很重要。不同的宿主細(xì)胞，如 C0S、CH0、BHK、MDCK、293、293T、C0S7等，對(duì)于這種翻譯后活性具有特定的細(xì)胞機(jī)制和特征機(jī) 制，可選擇細(xì)胞以保證當(dāng)前引入的外來(lái)蛋白的正確修飾和加工。為長(zhǎng)時(shí)間高產(chǎn)率產(chǎn)生本發(fā)明多核苷酸編碼的或其子序列編碼的重組蛋白，任選采用穩(wěn)定的表達(dá)系統(tǒng)。例如，用含病毒來(lái)源的復(fù)制元件或內(nèi)源表達(dá)元件和選擇性標(biāo)記基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)本發(fā)明多肽的細(xì)胞系。例如，引入載體后，用富集培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞 1-2天，然后轉(zhuǎn)移至選擇培養(yǎng)基?？蛇x擇標(biāo)記的目的是賦予抗性以便選擇，抗性的存在使得成功表達(dá)所引入序列的細(xì)胞得以生長(zhǎng)和回收。因此，可采用適合該細(xì)胞類(lèi)型的組織培養(yǎng)技術(shù)使例如，衍生自單一細(xì)胞類(lèi)型的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細(xì)胞增殖成抗性細(xì)胞團(tuán)塊?？扇芜x在適合表達(dá)和從培養(yǎng)細(xì)胞回收編碼蛋白質(zhì)的條件下，培養(yǎng)用編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。分選、分離和/或純化表達(dá)所述蛋白質(zhì)的細(xì)胞。取決于所用的序列(例如，取決于編碼膜滯留信號(hào)等的融合蛋白)和/或載體，重組細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白或其片段可以是分泌的、膜結(jié)合的或胞內(nèi)滯留的蛋白或其片段。也能用非動(dòng)物細(xì)胞，如植物、酵母菌、真菌、細(xì)菌等產(chǎn)生本發(fā)明核酸的相應(yīng)表達(dá)產(chǎn) 物。除了 Sambrook，Berger和Ausubel (均參見(jiàn)下文)以外，關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)節(jié)可參見(jiàn) Payne等(1992)《用液體系統(tǒng)培養(yǎng)植物細(xì)胞和組織》(Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems)約翰韋利森出版公司(John Wiley & Sons, Inc.)，紐約；Gamborg 和 fillips編(19%)《植物細(xì)胞、組織和器官培養(yǎng)；施普林格實(shí)驗(yàn)室基本方法手冊(cè)》(Plant Cell, Tissue and Organ Culture ；Fundamental Methods Springer Lab Manual),施普林格弗萊格公司(Springer-Verlag)(紐約柏林海德?tīng)柋?和Atlas和Parks編《微生物培養(yǎng) 基手冊(cè)》(The Handbook ofMicrobiological Media) (1993) CRC出版社，佛羅里達(dá)州伯克萊屯(Boca Raton, FL)。
在細(xì)菌系統(tǒng)中，可根據(jù)表達(dá)產(chǎn)物的所需用途選擇多種表達(dá)載體。例如，當(dāng)生產(chǎn)抗體需要大量多肽或其片段時(shí)，優(yōu)選采用能導(dǎo)致易純化的融合蛋白高水平表達(dá)的載體。此類(lèi) 載體包括但不限于多功能大腸桿菌克隆和表達(dá)載體，如BLUESCRIPT(斯特拉塔基因公司 (Stratagene))，可將感興趣的編碼序列，如含有本文那些序列的編碼序列等連接入此載體中，與β -半乳糖苷酶的氨基末端翻譯起始甲硫氨酸和后續(xù)7個(gè)殘基的序列同框，從而產(chǎn) 生有催化活性的β半乳糖苷酶融合蛋白；PlN載體(Van Heeke和Schuster (1989) T Biol Chem264 :5503-5509) ；pET載體(威斯康星麥迪遜的諾華基公司(Novagen，Madison WI)) 等。同樣，在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌中，可采用含組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng) 子如α因子、醇氧化酶和PGH的多種載體來(lái)產(chǎn)生所需表達(dá)產(chǎn)物?？蓞⒁?jiàn)Ausubel，同上，和 Grant 等，(1987)；《酶學(xué)方法》(Methods in Enzymology) 153 :516-544 的綜述。核酸雜交可采用比較雜交法鑒定本發(fā)明的核酸，包括本發(fā)明核酸的保守性變體。比較雜交法是區(qū)別本發(fā)明核酸的優(yōu)選方法。此外，在高、超高和超超高嚴(yán)謹(jǐn)性條件下，能與例如以下所示核酸雜交的靶核酸是本發(fā)明的特征=SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、 25、27、SEQ ID NO 1 的殘基 74-1060、SEQ ID NO 1 的殘基 1061-1723、SEQ ID NO 5 的殘基 81-1058、SEQ ID NO 5 的殘基 1059-1724、SEQ ID NO 9 的殘基 85-1116、SEQ ID NO 9 的殘基 79-1116、SEQ ID NO 9 的殘基 1117-1785、SEQ ID NO 13 的殘基 78-1064、SEQ ID NO :13 的殘基 1065-1727、SEQ ID NO 17 的殘基 78_1055、SEQ ID NO :17 的殘基 1056-1721、 SEQ ID NO :21 的殘基 78-1118、SEQ ID NO :21 的殘基 1119-1787、SEQ ID NO :25 的殘基 75-1115或SEQ ID NO :25的殘基1116-1787。此類(lèi)核酸的例子包括與給定核酸序列相比，含有一個(gè)或幾個(gè)沉默或保守性核酸取代的核酸。當(dāng)某測(cè)試靶核酸與探針雜交的程度至少為完美匹配互補(bǔ)靶核酸的一半時(shí)，則稱(chēng)此測(cè)試靶核酸與探針核酸特異性雜交，即，在完美匹配探針與完美匹配互補(bǔ)靶核酸雜交(前者)的條件下，探針與靶核酸雜交的信噪比至少有一半高，前者的信噪比至少為不匹配靶核酸雜交觀(guān)察到的信噪比的約5倍-10倍。通常在溶液中核酸結(jié)合發(fā)生“雜交”。各種熟知的物理化學(xué)作用力，如氫鍵、溶劑排斥力、堿基堆積力等可導(dǎo)致核酸雜交。本領(lǐng)域熟知使核酸雜交的多種方法。核酸雜交的詳盡指南參見(jiàn)Tijssen (1993)《生物化學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)-核酸探針雜交》(Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Acid Probes)第一部分第二章，“雜交原理概述與核酸探針實(shí)驗(yàn)策略”(“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays,，，( 斯威爾出版社，紐約)，以及Ausubel，Sambrook和Berger和Kimmel (下文)。Hames和 Higgins (1995)《基因探針1》(Gene Probes 1)牛津大學(xué)出版社IRL出版社，牛津，英格蘭 (Hames 和 Higgins 1)以及 Hames 和 Higgins (1995)《基因探針 2》(Gene Probes 2)牛津大學(xué)出版社IRL出版社，牛津，英格蘭(Hames和Higgins 2)提供了合成、標(biāo)記、檢測(cè)和定量測(cè)定包括寡核苷酸在內(nèi)的DNA和RNA的細(xì)節(jié)。在Southern或Northern印跡中，濾膜上有多于100個(gè)互補(bǔ)殘基的互補(bǔ)核酸雜交的嚴(yán)謹(jǐn)性雜交條件的例子是42°C，用含Img肝素的50%福爾馬林雜交過(guò)夜。嚴(yán)謹(jǐn)性洗滌條件的例子包括用0. 2x SSC、65°C洗滌15分鐘(SSC緩沖液參見(jiàn)Sambrook，下文)。通常在高嚴(yán)謹(jǐn)性洗滌之前進(jìn)行低嚴(yán)謹(jǐn)性洗滌以去除背景探針信號(hào)。低嚴(yán)謹(jǐn)性洗滌的例子是用 SSC，40°C洗滌15分鐘。通常在特定雜交實(shí)驗(yàn)中觀(guān)察到信噪比較無(wú)關(guān)探針信噪比高5倍(甚至更高)時(shí)，表明檢測(cè)到特異性雜交。雜交后，用一系列洗滌去除未雜交核酸，可根據(jù)所需結(jié)果調(diào)整其嚴(yán)謹(jǐn)性。低嚴(yán)謹(jǐn) 性條件(例如采用高鹽和低溫)可提高靈敏度，但會(huì)產(chǎn)生非特異性雜交信號(hào)和高背景信號(hào)。高嚴(yán)謹(jǐn)性條件(例如采用低鹽和接近Tm的高溫)能降低背景信號(hào)，通常主要是留下特異性信號(hào)。也可參見(jiàn)Rapley，R.和Walker，J. Μ.編，《分子生物學(xué)方法手冊(cè)》(Molecular Biomethods Handbook)(休瑪娜出版公司(Humana，Inc.)，1998)。對(duì)于核酸雜交實(shí)驗(yàn)，如Southern和northern雜交，“嚴(yán)謹(jǐn)雜交洗滌條件”取決于序列，不同環(huán)境參數(shù)的條件有所不同。核酸雜交的詳盡指南可參見(jiàn)TijSSen(1993)，同上，以及 Hames和Higginsl和2?？筛鶕?jù)經(jīng)驗(yàn)不難確定測(cè)試核酸的嚴(yán)謹(jǐn)雜交和洗滌條件。例如，要確定高嚴(yán)謹(jǐn)雜交和洗滌條件時(shí)，應(yīng)逐漸提高雜交和洗滌條件(例如，提高雜交或洗滌溫度、降低鹽濃度、提高去污劑濃度和/或提高有機(jī)溶劑，如福爾馬林的濃度)直至符合所選的標(biāo) 準(zhǔn)。例如，逐漸提高雜交和洗滌條件直至探針與完美匹配的互補(bǔ)靶核酸結(jié)合的信噪比至少比探針與不匹配靶核酸雜交觀(guān)察到的信噪比高5倍。通常在特定雜交實(shí)驗(yàn)中，信噪比是觀(guān)察到無(wú)關(guān)探針的至少2倍(或更高，例如至少 5倍、10倍、20倍、50倍、100倍或更高)，表明檢測(cè)到特異性雜交。就本發(fā)明而言，檢測(cè)到兩個(gè)序列之間至少發(fā)生嚴(yán)謹(jǐn)雜交，表明與本文序列表提供的本發(fā)明核酸在結(jié)構(gòu)上有較強(qiáng)的相似性。選擇的“非常嚴(yán)謹(jǐn)”條件等于具體探針的熱解鏈點(diǎn)(Tm)。Tm是50%測(cè)試序列與完美匹配探針雜交時(shí)的溫度(在確定的離子強(qiáng)度和PH下)。對(duì)于本發(fā)明的目的，在確定的離子強(qiáng)度和PH下，通常選擇比該具體序列的TJS 5°C的“高嚴(yán)謹(jǐn)”雜交和洗滌條件(如下文注明，高嚴(yán)謹(jǐn)條件也是比較性的術(shù)語(yǔ))。可用嚴(yán)謹(jǐn)或高嚴(yán)謹(jǐn)條件鑒定與感興趣核苷酸序列 (如“探針”)密切相關(guān)或相同的靶序列。低嚴(yán)謹(jǐn)性條件適合互補(bǔ)性較差的序列。“超高嚴(yán)謹(jǐn)性”雜交和洗滌條件是提高雜交和洗滌條件的嚴(yán)謹(jǐn)性直至探針與完美匹配互補(bǔ)靶核酸結(jié)合的信噪比，較探針與不匹配靶核酸雜交觀(guān)察到的信噪比至少高10倍的條件。在此條件下，當(dāng)靶核酸與探針雜交的信噪比是完美匹配互補(bǔ)靶核酸的至少一半時(shí)，則稱(chēng)該靶核酸能在超高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與探針結(jié)合。在測(cè)定嚴(yán)謹(jǐn)或高嚴(yán)謹(jǐn)雜交(或甚至更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s交)和洗滌條件時(shí)，逐漸提高雜交和洗滌條件(例如，提高雜交或洗滌溫度、降低鹽濃度、提高去污劑濃度和/或提高有機(jī)溶劑如甲酰胺的濃度)直至符合所選的標(biāo)準(zhǔn)。例如，如需要，逐漸提高雜交和洗滌條件直至含有一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明多核苷酸序列(例如選自本文給予的序列或獨(dú)特子序列和/或互補(bǔ)多核苷酸序列)的探針與完美匹配互補(bǔ)靶核酸(仍是含有選自本文給予的一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明核酸序列或子序列和/或其互補(bǔ)多核苷酸序列的核酸)結(jié)合的信噪比，較觀(guān)察到的非匹配靶核酸(例如，包含選自本文提交時(shí)公共數(shù)據(jù)庫(kù)(如Genbank)中提供的已知流感序列的一個(gè)或多個(gè)序列或子序列的多核苷酸序列，和/或其互補(bǔ)多核苷酸序列)雜交的信噪比至少高2倍(任選高5倍、10倍或100倍或更高)。利用本發(fā)明的多核苷酸或其子序列可獲得新型靶核酸；此類(lèi)靶核酸也是本發(fā)明的特征。例如，此類(lèi)靶核酸包含能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與對(duì)應(yīng)于本發(fā)明任一多核苷酸的獨(dú)特寡核苷酸探針雜交的序列。同樣，通過(guò)逐漸提高相關(guān)雜交試驗(yàn)的雜交和/或洗滌條件可確定甚至更高水平的嚴(yán)謹(jǐn)性。例如，提高雜交和洗滌條件的嚴(yán)謹(jǐn)性直至探針與完美匹配互補(bǔ)靶核酸結(jié)合的信噪比，較與任何非匹配靶核酸雜交觀(guān)察到的至少高10倍、20倍、50倍、100倍或500倍或更高。具體信號(hào)取決于相關(guān)實(shí)驗(yàn)中所用的標(biāo)記，如熒光標(biāo)記、比色標(biāo)記、放射性標(biāo)記等。在此種條件下，當(dāng)靶核酸與探針雜交的信噪比是完美匹配互補(bǔ)靶核酸的至少一半時(shí)，則稱(chēng)該靶核酸能在超超高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與探針結(jié)合。如果核酸編碼的多肽基本相同，在嚴(yán)謹(jǐn)條件下彼此不雜交的核酸仍可能基本相同。例如當(dāng)采用遺傳密碼允許的最大密碼子簡(jiǎn)并性產(chǎn)生核酸拷貝時(shí)，這種情況可能發(fā)生。感興趣生物分子的克隆、誘變和表達(dá)描述適用于本發(fā)明的分子生物學(xué)技術(shù)，如克隆、突變、細(xì)胞培養(yǎng)等的通用教材包括Berger和Kimmel，《分子克隆技術(shù)指南，酶學(xué)方法》(Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods in Enzymology)第152卷科學(xué)出版社公司，加州圣地亞哥(Berger)； Sambrook 等，《分子克隆-實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Molecular Cloning-Α Laboratory Manual)(第三版)，第1-3卷，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約2000( “Sambrook")和《新編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 方案》(Current Protocols in Molecular Biology), F. Μ· Ausubel 等編，格林聯(lián)合出版公司(Greene Publishing Associates, Inc)和約翰韋利森出版公司(John Wiley & Sons, Inc.)合資公司的最新實(shí)驗(yàn)方案(2002年增補(bǔ))("Ausubel")) 0這些教材描述了誘變、載體、啟動(dòng)子的應(yīng)用和許多其它相關(guān)話(huà)題，例如HA和/或NA分子的產(chǎn)生等等。本發(fā)明任選采用各種類(lèi)型的誘變，例如生產(chǎn)和/或分離本發(fā)明的新型或新分離的 HA和/或NA分子和/或進(jìn)一步修飾/誘變所述多肽(如，HA和NA分子)。它們包括但不限于定點(diǎn)誘變、隨機(jī)點(diǎn)突變、同源重組(DNA重排)、利用含尿嘧啶的模板進(jìn)行誘變、寡核苷酸定向誘變、硫代磷酸酯修飾的DNA誘變、采用缺口雙鏈體DNA的誘變等。其它合適的方法包括點(diǎn)錯(cuò)配修復(fù)、采用修復(fù)缺陷宿主病毒株的誘變、限制性選擇和限制性純化、缺失誘變、全基因合成誘變、雙鏈斷裂的修復(fù)等。本發(fā)明也包括誘變，例如涉及嵌合構(gòu)建物的誘變。在一個(gè)實(shí)施方式中，可利用已知的天然產(chǎn)生分子，或改變或突變的天然產(chǎn)生分子的信息，例如序列、序列比較、物理性質(zhì)、晶體結(jié)構(gòu)等指導(dǎo)誘變。上述教材和本文的例子以及下列出版物(及其引用的文獻(xiàn))都描述了這些方法Sieber 等，Nature Biotechnology，19 :456-460 (2001) ;Ling 等，"DNA 誘變方法綜述，，(Approaches to DNA Mutagenesis :an overview), Anal Biochem 254 (2) :157-178 (1997) ；Dale等，“用硫代磷酸酯方法進(jìn)行寡核苷酸定向隨機(jī)誘變，，(Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method), Methods Mol Biol 57:369-374(1996) ；I.A.Lorimer, I.Pastan, Nucleic Acids Res 23,3067-8(1995) ；W. P. C. Stemmer, Nature 370,389-91 (1994) ；Arnold，“非常態(tài)環(huán)境的蛋白質(zhì)工禾呈，，(Protein engineering for unusual environments), Current Opinion in Biotechnology 4:450-455(1993) ；Bass 等，“具有新 DNA 結(jié)合特異性的突變型 Trp 阻抑物，，(Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities), Science 242 =240-245(1988) ；Fritz等，“突變的寡核苷酸定向構(gòu)建無(wú)須體外酶反應(yīng) 的缺口雙鏈體 DNA 方法，，(Oligonucleotide-directed construction of mutation
45a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro), Nucl Acids Res 16:6987-6999(1988) ；Kramer等，“在缺口雙鏈體DNA方法中用于寡核苷酸定向構(gòu)建突變的改良的酶促體夕卜反應(yīng)，，(Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutation)，Nucl Acids Res 16 :7207 (1988) ；Sakamar 和 Khorana，“牛桿體外節(jié)鳥(niǎo)嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白(轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白)α亞基的基因全合成和表達(dá)”(Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein(transducin))，Nucl Acids Res 14 :6361-6372 (1988)； Myers等，“Y-T核酸外切酶在基于硫代磷酸酯的寡核苷酸定向誘變中的應(yīng)用”(Y_T Exonucleases in phosphorothioate-based oligonulcleotide-directed mutagenesis), Nucl Acids Res 16:791-802(1988) ；&iyers等，“在溴乙錠存在時(shí)通過(guò)限制性核酸內(nèi) 切酶反應(yīng)對(duì)含硫代磷酸酯的DNA進(jìn)行鏈特異性切割”(Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide), (1988) Nucl Acids Res 16 :803-814 ；Carter, "^lJ 用 M13 載體改進(jìn)寡核苷酸定向誘變，，(Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vector) ,Methods in Enzymol 154:382—403(1987) ；Kramer禾口Fritz“通過(guò)缺口雙鏈體DNA進(jìn)行突變的寡核苷酸定向構(gòu)建”(Oligonucleotide-directed construction of mutation via gapped duplex DNA), Methods in Enzymol 154 :350-367(1987) ；Kunke1, 《核酸和分子生物學(xué)》(Nucleic Acids and Molecular Biology)中的“寡核苷酸定向誘變的效率”(The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis) (Eckstein,F.禾口 Lilley, D.M.J.編，施普林格弗萊格公司，柏林)(1987) ；Kunkel等，“無(wú)須表型選擇的快速有效定點(diǎn)誘變”(Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection) ,Methods in Enzymol 154,367-382(1987) Joller和Smith，“寡核苷酸定向誘變采用兩種寡核苷酸引物和一種單鏈DNA模板的簡(jiǎn)單方法” (Oligonucleotide-directed mutagenesis -.a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template), Methods in Enzymol 154:329-350(1987) ；Carter, (Site-directed mutagenesis), Biochem J 237 :1-7(1986) ；Eghtedarzadeh 和 Henikoff，“用寡核苷酸產(chǎn)生大缺失”(Use of oligonucleotides to generate large deletions)，Nucl Acids Res 14:5115(1986) ；Mandecki，“大腸桿菌質(zhì)粒中寡核苷酸定向的雙鏈斷裂修復(fù)一種定點(diǎn)誘變方法”(oligonucleotide-directed double-strand break repair in ρlasmids of Escherichia coli -.a method for site-specific mutagenesis), Proc Natl Acad Sci USA，83 :7177-7181 (1986) ；Nakamaye 和 Eckstein，“通過(guò)硫代磷酸酯基團(tuán)抑制核酸內(nèi)切酶NciI切割及其在寡核苷酸定向誘變中的應(yīng)用”(Inhibition of endonuclease NciI cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis)，Nucl Acids Res 14:9679-9698(1986) ；Wells 等，“氫鍵形成對(duì)穩(wěn)定枯草桿菌蛋白酶過(guò)渡態(tài)至關(guān)重要”(Importence of Hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin)， Phil Trans R Soc Lond A 317:415-423(1986) ；Botstein 和 Shortle，“體外誘變的方案和應(yīng)用”Strategies and applications of in vitro mutagenesis)，Science 229:1193-1201 (1985) ；Carter等，“利用M13載體改進(jìn)寡核苷酸定向誘變” (Improved oligonucleotide site-specific mutagenesis using M13 Vector), Nucl Acids Res 13:4431—4443(1985) ； Grundstrom 等，“通過(guò)小規(guī)?！B(niǎo)槍’基因合成進(jìn)行寡核苷酸定向誘變”(oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale ‘ shot-gun ‘ gene synthesis)， Nucl Acids Res 13: 3305-3316(1985) ；Kunkel，“無(wú)須表型選擇的快速有效定點(diǎn)誘變”(Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection)， Proc Natl Acad Sci USA 82 :488-492(1985) ；Smith，“體夕卜誘變” (In vitro mutagenesis)，Ann Rev Genet 19 :423-462(1985) Jaylor等，“在限制性酶反應(yīng)中釆用硫代磷酸酯修飾的DNA制備帶切口的 DNA，，(The use of phosphorothioat-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA)，Nucl Acids Res 13:8749-8764(1985) ；Taylor 等，“采用硫代磷酸酯修飾的DNA快速高頻率產(chǎn)生寡核苷酸定向突變”(The rapid generation of oligonucIeotide-directed mutaiton at high frequency using phosphorothioate-modified DNA)，Nucl Acids Res 13:8765-8787(1985) ；Wells 等， “基因盒誘變一種在確定位點(diǎn)產(chǎn)生多個(gè)突變的有效方法”(Cassette mutagenesis :an efficient method for generation of multiple mutation at defined sites), Gene 34 :315-323(1985) ；Kramer等，“寡核苷酸定向突變構(gòu)建的缺口雙鏈體DNA方法，，(The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction), Nucl Acids Res 12:9441-9456(1984) ；Kramer 等，“點(diǎn)錯(cuò)配的修復(fù)”(Point Mismatch Repair), Cell 38:879-887(1984) ；Nambiar等，“核糖核酸酶S蛋白編碼基因的全合成禾口克隆，，(Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease Sprotein), Science 223 :1299-1301(1984) Joller 和 Smith，“通過(guò)寡核苷酸定向誘變將 DNAM13 ^^^"(oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragment
cloned into M13 vector), Methods in Enzymol 100 :468-500 (1983)；以及 Zoller 禾口 Smith, “采用M13衍生載體進(jìn)行寡核苷酸定向誘變?cè)谌魏蜠NA片段中產(chǎn)生點(diǎn)突變的有效禾口通用方法，，(oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vector :an efficient and general procedure for the production of point mutation in any DNA fragment), Nucl Acids Res 10:6487-6500(1982)。上述許多方法的更多細(xì)節(jié)可在《酶學(xué) 方法》(Methods in Enzymol)第1 卷中找到，該文也描述了控制各種誘變、基因分離、表達(dá)和其它方法的故障檢查的有用控制方法。例如，用于本發(fā)明誘變(例如突變或改變本發(fā)明HA和/或NA分子文庫(kù))的寡核苷酸通常按照 Beaucage 和 CaruthersJetrahedron Letts 22(20) :1859-1862, (1981)所述的固相亞磷酰胺三酯方法，例如采用自動(dòng)合成儀，按Needham-VanDevanter等，Nucleic Acids Res，12 :6159-6168(1984)所述化學(xué)合成。此外，可通過(guò)各種商業(yè)來(lái)源定制或標(biāo)準(zhǔn)訂購(gòu)基本上任何一種核酸，如中部認(rèn)證試劑公司(The Midland Certified Reagent Company) (mcrcOoligos. com)、大美國(guó)基因公司(The Great American Gene Company) (www. genco. com)、快速基因公司(ExpressGen Inc. ) (www. expressgen. com)、歐普龍技術(shù)公司(Operon Technologies Inc.)(力口州阿拉米達(dá)(Alameda，CA))及其它來(lái)源。同樣，也可從各種來(lái)源定制肽和抗體，如(派普肽金尼克公司)(P印tidoGenic) (pkimiccnet. com)、HTI 生物產(chǎn)品公司(HTI Bio-products, Inc.)(www. htibio. com)、BMA生物醫(yī)學(xué)有限公司(BMA Biomedicals Ltd.)(英國(guó))、生物合成公司(Bio. Synthesis, Inc.)及許多其它公司。本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明HA和/或NA分子或其它多肽和/或核酸的宿主細(xì)胞和生物體，或者存在于各種載體(例如6 2重配流感病毒、質(zhì)粒拯救系統(tǒng)中的質(zhì)粒等)中的此類(lèi)HA和/或NA或其它序列?？捎帽景l(fā)明載體經(jīng)遺傳工程改造宿主細(xì)胞(如轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo) 或轉(zhuǎn)染)，所述載體可以是(例如)克隆載體或表達(dá)載體。載體可以是，例如質(zhì)粒、細(xì)菌、病毒、裸多核苷酸或偶聯(lián)多核苷酸形式?？捎靡韵聵?biāo)準(zhǔn)方法將載體引入細(xì)胞或微生物電穿孔 (參見(jiàn)，F(xiàn)rom等，Proc Natl Acad Sci USA 82，5824 (1985)、病毒載體感染、用小珠或顆?；?質(zhì)內(nèi)或表面含有核酸的小顆粒高速?gòu)椡柁Z擊穿透(Klein等，Nature 327，70-73 (1987))。 Berger，Sambrook和Ausubel提供了各種合適的轉(zhuǎn)化方法。參見(jiàn)上文。現(xiàn)有的幾種將靶核酸引入細(xì)菌細(xì)胞中的熟知方法，它們均可用于本發(fā)明。這些方法包括使受體細(xì)胞與含DNA的細(xì)菌原生質(zhì)體融合、電穿孔、微粒轟擊、用病毒載體感染等。可利用細(xì)菌細(xì)胞擴(kuò)增含本發(fā)明DNA構(gòu)建物的質(zhì)粒數(shù)量。當(dāng)細(xì)菌生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)用本領(lǐng)域已知的各種方法分離細(xì)菌中的質(zhì)粒(參見(jiàn)例如Sambrook)。此外，可用各種市售試劑盒純化細(xì)菌質(zhì)粒(參見(jiàn)例如，法瑪西亞生物技術(shù)公司的fesyft·印，F(xiàn)lexiPrep ；斯特拉塔基因公司的StrataClean ;以及凱杰公司^jiagen)的QIApMp )。然后進(jìn)一步操作經(jīng)分離和純化的質(zhì)粒產(chǎn)生其它質(zhì)粒，用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞或摻入相關(guān)載體以感染生物。典型的載體包含轉(zhuǎn)錄、翻譯終止子和轉(zhuǎn)錄、翻譯起始序列，以及用于調(diào)節(jié)特定靶核酸表達(dá)的啟動(dòng)子。載體任選包含通用的表達(dá)盒，表達(dá)盒含有至少一個(gè)獨(dú)立終止序列，允許表達(dá)盒在真核、原核或兩者中(如穿梭載體)復(fù)制的序列以及原核和真核系統(tǒng)的選擇標(biāo)記。載體適應(yīng)在原核、真核或優(yōu)選在兩者中復(fù)制和整合。參見(jiàn),GiIiman 和 Smith，Gene 8:81(1979) ；Roberts，等，Nature，328 731 (1987) ；Schneider, B.等，Protein Expr Purif 6435 :10(1995) ；Ausubel, Sambrook, Berger (所有同上)。用于克隆的細(xì)菌和噬菌體目錄由ATCC提供，如，《ATCC細(xì)菌和噬菌體目錄》(The ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage) (1992)Gherna等(編)ATCC 出版。其它測(cè)序、克隆及分子生物學(xué)其它方面的基礎(chǔ)步驟以及其理論探討也可參見(jiàn)Watson 等(1992)《重組DNA》(Recombinant DNA)第二版(科學(xué)美國(guó)人圖書(shū)公司)Scientific American Books)，紐約。如上所述。多肽產(chǎn)生和回收在一些實(shí)施方式中，在轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞系或細(xì)胞株并培養(yǎng)至合適細(xì)胞密度后，可用合適方式誘導(dǎo)(如，改變溫度或化學(xué)誘導(dǎo))所選啟動(dòng)子，再培養(yǎng)細(xì)胞一段時(shí)間。在一些實(shí)施方式中，然后回收培養(yǎng)基中分泌的多肽產(chǎn)物，如分泌性融合蛋白形式的HA和/或 NA多肽。在其它實(shí)施方式中，細(xì)胞產(chǎn)生含一種或多種本發(fā)明HA和/或NA多肽的病毒顆粒。或者，可離心收集細(xì)胞，用物理或化學(xué)方法破碎細(xì)胞保留所得粗提物供進(jìn)一步純化?？捎帽?領(lǐng)域技術(shù)人熟知的任何方便方法破碎用于表達(dá)蛋白的真核或微生物細(xì)胞，包括反復(fù)凍融、超聲處理、機(jī)械破碎或用細(xì)胞裂解試劑或其它方法。此外，可采用表達(dá)本發(fā)明HA和/或NA 多肽產(chǎn)物的細(xì)胞而不用分離多肽與細(xì)胞。在此種情況下，本發(fā)明多肽任選表達(dá)于細(xì)胞表面，因此可用細(xì)胞表面結(jié)合抗體等檢測(cè)(例如含HA和/或NA分子或其片段，如含融合蛋白等的細(xì)胞)。此類(lèi)細(xì)胞也是本發(fā)明的特征?？捎帽绢I(lǐng)域熟知的任何方法回收重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收并純化表達(dá)的多肽，包括
48硫酸銨或或乙醇沉淀、酸抽提、陰離子或陽(yáng)離子交換色譜、磷酸纖維素色譜、疏水相互作用色譜、親和色譜(如采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何標(biāo)簽系統(tǒng))、羥基磷灰石色譜和凝集素色譜?？梢曅枰\(yùn)用蛋白質(zhì)重折疊步驟以完善成熟蛋白構(gòu)型。也可以在最終純化步驟中使用高效液相色譜(HPLC)。除了本文注明的參考文獻(xiàn)外，本領(lǐng)域熟知各種純化方法，包括以下文獻(xiàn)列出的那些Sandana(1997)《蛋白的生物分離》(Bios印aration of proteins)，科學(xué) 出版公司(Academic Press, Inc.)和 Bollag 等(1996)《蛋白方法》(Protein Methods)，第二版，韋利李斯公司，紐約(ffiley-Liss,NY) ；Walker(1996)《蛋白實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》(The Protein Protocols Handbook)休瑪娜出版公司，紐約，Harris和Angal (1990)《蛋白純化應(yīng)用實(shí) 踐方法》(Protein purification application :A practical approach)牛津 IRL 出版公司，牛津，英格蘭(Press at Oxford, Oxford, England) ；Harris 禾口 Angal《蛋白純化方法實(shí)踐方法》(Protein Purification Methods :A Practical Approach)牛津 IRL 出版公司，牛津，英格蘭(Press at Oxford, Oxford, England) ；Scopes (1993)《蛋白純化原理和實(shí) 踐》(Protein Purification principles and Practice)第三版，施普林格佛萊格公司，紐約(Springer Verlag,NY) Janson和Ryden(1998)《蛋白純化原理、高分辨率方法及其應(yīng) 用》(Protein Purification :Principles,High Resolution Methods and Applications), 第二版，韋利-VCH公司，紐約(ffiley-VCH, NY)；和Walker (1998)《蛋白實(shí)驗(yàn)方法(CD-ROM 版)》(Protein Protocols on CD-ROM)休瑪娜出版公司，紐約。用病毒表達(dá)產(chǎn)生本發(fā)明多肽時(shí)，通常從感染(轉(zhuǎn)染)細(xì)胞的培養(yǎng)基中回收病毒。通常先澄清粗培養(yǎng)液再濃縮流感病毒。常用方法包括超濾、硫酸鋇吸附和洗脫以及離心。例如，先離心澄清感染細(xì)胞的粗培養(yǎng)液，如1000-2000X g離心足夠長(zhǎng)的時(shí)間以去除細(xì)胞碎片和其它大顆粒物質(zhì)，如離心10-30分鐘。然后任選離心澄清的培養(yǎng)上清液沉淀流感病毒，如 15，OOOx g離心約3-5小時(shí)。將病毒沉淀重懸于合適的緩沖液，如STE(0. OlM Tris-HCl ； 0. 15M NaCl ；0. 0001M EDTA)或磷酸緩沖鹽水(PBS)pH 7. 4 中，以蔗糖(60% -12% )或酒石酸鉀(50% -10% )密度梯度離心病毒。連續(xù)梯度或步進(jìn)梯度，如12% -60%蔗糖梯度，4 層12%梯度均適合。以一定速度梯度離心足夠時(shí)間使病毒濃縮形成可見(jiàn)條帶以便回收。或者，大多數(shù)規(guī)?；唐飞a(chǎn)采用連續(xù)操作模式，用區(qū)帶離心轉(zhuǎn)子進(jìn)行密度梯度離心淘選病毒。全面指導(dǎo)技術(shù)人員通過(guò)組織培養(yǎng)制備流感病毒的進(jìn)一步細(xì)節(jié)參見(jiàn)Nicholson等(編) 《流感教材》(Textbook of Influenza)第3M-332頁(yè)的Furminger.《疫苗生產(chǎn)》(Vaccine Production) ；Cohen和Shafferman (編)《設(shè)計(jì)和生產(chǎn)疫苗的新策略》(Novel Strategies in Design and Production of Vaccine)第 141-151 頁(yè)Merten 等(1996)《細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)用于制備疫苗的流感病毒〉〉(Production of influenza virus incellcultures for vaccine preparation)，以及美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，690，937。如果需要可將回收的病毒置于穩(wěn)定劑蔗糖-磷酸谷氨酸(SPG)中-80°C保存。或者，可利用無(wú)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)來(lái)產(chǎn)生包含例如以下的氨基酸序列或子序列，或由本發(fā)明多核苷酸序列編碼的氨基酸序列或子序列的多肽SEQ ID NO :2、4、6、8、10、 12、14、16、18、20、22、24、26、28，SEQ ID NO :2 的殘基 17_345、SEQ ID NO :2 的殘基346-566、 SEQ ID NO 6 的殘基 18-343、SEQ ID NO 6 的殘基;M4_565、SEQ ID NO :10 的殘基 18-361、 SEQ ID NO 10 的殘基 16-361、SEQ ID NO 10 的殘基 362-584、SEQ ID N0:14 的殘基 17-345、SEQ ID NO 14 的殘基 346-566、SEQ ID NO 18 的殘基 18-343、SEQ ID NO 18 的殘基 344-565、SEQ ID NO 22 的殘基 16-362、SEQ ID NO 22 的殘基 363-585、SEQ ID NO 26 的殘基16-362或SEQ ID NO 26的殘基363-585?？少?gòu)得多種合適的體外轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)。體外轉(zhuǎn)錄和翻譯方案的通用指南參見(jiàn)Tymms (1995)《體外轉(zhuǎn)錄和翻譯實(shí)驗(yàn)方案分子生物學(xué)方法》(In vitro Transcription and Translation Protocols -Methods in Molecular Biology)第 37 卷，加蘭出版公司，紐約(Garland Publishing，NY)。此外，多肽或其子序列，如含抗原性肽的子序列，可通過(guò)手工或利用自動(dòng)系統(tǒng)產(chǎn)生，如利用固相技術(shù)直接進(jìn)行肽合成(參見(jiàn)，Mewart等(1969)《固相肽合成》 (Solide-Phase Peptide Synthesis)，WH 佛理茫公司，舊金山(WH Freeman Co, San Francisco) ；Merrifield J(1963)J Am Chem Soc 85:2149-2154)。示例性的自動(dòng)化系統(tǒng) 包括應(yīng)用生物系統(tǒng)(Applied BiOSyStemS)431A肽合成儀(珀金愛(ài)爾默公司，加州福斯特城 (Perkin Elmer, Foster City，CA)。如果需要，可以分別化學(xué)合成子序列，再用化學(xué)方法組合產(chǎn)生全長(zhǎng)多肽。修飾的氨基酸本發(fā)明的表達(dá)多肽可含一個(gè)或多個(gè)修飾的氨基酸。存在修飾的氨基酸有利于，例如，(a)提高多肽血清半衰期，(b)降低/提高多肽的抗原性，(c)提高多肽的存儲(chǔ)穩(wěn)定性等。例如，重組產(chǎn)生期間，可在翻譯時(shí)或翻譯后(如，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)期間N-X-S/T基序的N糖基化連接)或通過(guò)合成方法(如，通過(guò)PEG化)修飾氨基酸。修飾氨基酸的非限制性例子包括糖基化的氨基酸、硫酸化氨基酸、異戊烯基化 (如法尼基化、櫳牛兒基牛兒基化)氨基酸、乙?；被?、?；被帷EG化氨基酸、生物素化氨基酸、羧化氨基酸、磷酸化氨基酸等，以及與脂分子或其它有機(jī)衍生物質(zhì)偶聯(lián) 的氨基酸修飾。有許多足以指導(dǎo)技術(shù)人員進(jìn)行氨基酸修飾的參考文獻(xiàn)。示例性方案參見(jiàn) Walker (1998)《蛋白實(shí)驗(yàn)方案(CD-ROM 版)》(Protein Protocols on CD-ROM)，休瑪娜出版社，新澤西州托瓦它(ToWata，NJ)。融合蛋白本發(fā)明也提供融合蛋白，該融合蛋白為含有本發(fā)明序列(例如，編碼HA和/或NA 多肽的)或其片段與(例如)免疫球蛋白(或其部分)、編碼GFP(綠色熒光蛋白)或其它類(lèi)似標(biāo)記物序列的融合物。編碼此類(lèi)融合蛋白的核苷酸序列是本發(fā)明另一方面內(nèi)容。本發(fā) 明的融合蛋白任選可用于(例如)與本發(fā)明非融合蛋白類(lèi)似的應(yīng)用(包括，例如本文所述的治療、預(yù)防、診斷、實(shí)驗(yàn)等應(yīng)用)。除了與免疫球蛋白序列和標(biāo)記序列融合外，本發(fā)明蛋白還任選與(例如)用于分選融合蛋白和/或使融合蛋白靶向特定細(xì)胞類(lèi)型、區(qū)域等的序列融合?？贵w本發(fā)明的多肽可用于產(chǎn)生本文所給定多肽和/或本發(fā)明多核苷酸編碼的多肽(如本文所示那些多肽及其保守性變體)的特異性抗體。以上述及多肽的特異性抗體可用于，例如診斷和治療目的，如涉及靶多肽的活性、分布和表達(dá)。例如，此類(lèi)抗體可任選用于測(cè)定含有與本文相同HA/NA序列病毒株的其它病毒。可通過(guò)本領(lǐng)域熟知方法產(chǎn)生本發(fā)明多肽的特異性抗體。此類(lèi)抗體包括但不限于多克隆、單克隆、嵌合、人源化、單鏈、Fab片段和Fab表達(dá)文庫(kù)產(chǎn)生的各種片段。對(duì)于產(chǎn)生抗體，無(wú)需多肽具有生物學(xué)活性(例如，無(wú)需全長(zhǎng)的功能性血凝素或神經(jīng)氨酸酶)。然而，所述多肽或寡肽必須具有抗原性。用于誘導(dǎo)特異性抗體的肽通常含有至少約4個(gè)氨基酸的序列，常至少5或10個(gè)氨基酸?？蓪⒍嚯牡亩萄由於闻c另一蛋白，如匙孔血藍(lán)蛋白融合以產(chǎn)生抗該嵌合分子的抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道有許多制備多克隆和單克隆抗體的方法，這些方法適合生產(chǎn) 本發(fā)明多肽和/或本發(fā)明多核苷酸序列編碼多肽的特異性抗體。參見(jiàn)例如，Coligan (1991) 《新編免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)方案》(Current Protocols in Immunology)紐約韋利/格林公司 (ffiley/Greene, NY) ；Paul (編)(1998)《基礎(chǔ)免疫學(xué)》(Fundamental Immunology)，第四版， Lippincott-Raven, Lippincott WiIliams 禾口 WiIkins ；Harlow禾口 Lane (1989)《抗體實(shí)驗(yàn)室￥》(Antibody :A Laboratory Manual),(Cold Spring Harbor Press, NY) ；Stites ^ (編)《基礎(chǔ)和臨床免疫學(xué)(Basic and Clinical Immunology)》第四版，蘭格醫(yī)學(xué)出版公司，加州洛斯阿爾托斯(Lange Medical Publications, Los Altos, CA)及其引用文獻(xiàn)；Goding(1986)《單克隆抗體原理和實(shí)踐(Monoclonal antibody principles and Practice)》第二版科學(xué)出版社，紐約(Academic Press, New York, NY) ；Kohler 和 Milstein(1975)Nature 256:495-497。其它合適的抗體制備技術(shù)包括噬菌體或類(lèi)似載體重組抗體文庫(kù)的篩選。參見(jiàn)，Huse 等(1989) Science 246 :1275-1281 ；和 Ward 等(1989) Nature 341:544-546。特異性單克隆和多克隆抗體及抗血清結(jié)合的Kd值通常需要，例如至少約0. 1 μ M，至少約0. 01 μ M或更好，通常至少約0. 001 μ M或更好。對(duì)于某種治療性應(yīng)用，需要人源化抗體。制備嵌合(人源化)抗體的方法參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5，482，856。人源化抗體和其它抗體產(chǎn)品和工程改造技術(shù)的其它細(xì)節(jié)參見(jiàn) Borrebaeck(編)(1995)《抗體工程》(Antibody Engineering)第二版，佛理茫和公司，紐約(Borrebaeck) (Freeman and Company, NY) ；McCafferty 等(1996)《抗體工程，實(shí)踐方法》(Engineering，A Practical Approach), IRL 牛津出版社，牛津，英格蘭(McCafferty) (IRL at Oxford Press, Oxford, England) L^lPaul (1995) IiKWX^TjM)) (Engineering Protocols)休瑪娜出版社，新澤西州托瓦它(Paul)。關(guān)于特定方法的其它細(xì)節(jié)可參見(jiàn) Ostberg 等(198 ，Hybridoma 2 :361_367，Ostberg 的美國(guó)專(zhuān)利 4，634，664，和 Engelman 等的美國(guó)專(zhuān)利4，634，666。通過(guò)免疫反應(yīng)性確定多肽由于本發(fā)明多肽提供了各種新的多肽序列(如含有HA和NA分子)，因此這些多肽也提供了可用(例如)免疫學(xué)試驗(yàn)識(shí)別的新結(jié)構(gòu)特征。產(chǎn)生能特異性結(jié)合本發(fā)明多肽的抗血清以及此類(lèi)抗血清所結(jié)合的多肽也是本發(fā)明的特征。例如，本發(fā)明包括能特異性結(jié)合用某免疫原產(chǎn)生的抗體或抗血清或與之發(fā)生特異免疫反應(yīng)性的多肽(如，HA和NA分子)，其中所述免疫原包含選自一個(gè)或多個(gè)本文給定序列的氨基酸序列，例如 SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24J6、28，SEQ ID NO: 2 的殘基 17-345,SEQ ID NO 2 的殘基 346_566、SEQ ID NO 6 的殘基 18-343,SEQ ID NO 6 的殘基 344-565, SEQ ID NO 10 的殘基 18-361、SEQ ID NO 10 的殘基 16-361、SEQ ID NO 10 的殘基 362-584、SEQ ID NO 14 的殘基 17-345、SEQ ID NO 14 的殘基 346-566、SEQ ID NO 18 的殘基 18-343、SEQ ID NO 18 的殘基 344-565, SEQ ID NO 22 的殘基 16-362、SEQ ID NO 22 的殘基 363-585,SEQ ID NO 26 的殘基 16-362 和 SEQ ID NO 26 的殘基 363-585 等。為了消除與其它同源物的交叉反應(yīng)性，可用本文提交時(shí)公共數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的HA和/或NA分子(如“對(duì)照”多肽)吸附刪除這種抗體或抗血清。如果其它對(duì)照序列對(duì)應(yīng)于某核酸，則產(chǎn)生該核酸編碼的多肽用于刪除抗體/抗血清目的。在一個(gè)典型方式中，免疫試驗(yàn)采用包含一個(gè)或多個(gè)對(duì)應(yīng)于本文序列等或其實(shí)質(zhì)性子序列(即全長(zhǎng)序列的至少約30%)的一種或多種多肽產(chǎn)生的多克隆抗血清。衍生自本發(fā) 明序列的一套多肽免疫原下文統(tǒng)稱(chēng)為“免疫原性多肽”。任選所得抗血清對(duì)血凝素和/或神經(jīng)氨酸酶同源對(duì)照的交叉反應(yīng)性低，可在多克隆抗血清用于免疫測(cè)定之前用一種或多種血凝素和神經(jīng)氨酸酶同源對(duì)照進(jìn)行免疫吸附，刪除多克隆抗血清的這種交叉反應(yīng)性。為產(chǎn)生抗血清以便用于免疫測(cè)定，如本文所述需產(chǎn)生一種或多種免疫原性多肽并純化。例如，可用重組細(xì)胞產(chǎn)生重組蛋白。按照標(biāo)準(zhǔn)的小鼠免疫方案(對(duì)于可用于測(cè) 定特異性免疫反應(yīng)性的抗體產(chǎn)生、免疫測(cè)定形式及條件的標(biāo)準(zhǔn)描述可參見(jiàn)例如，Harlow和 Lane (1988)《抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Antibody，A Laboratory Manual)，冷泉港出版公司(Cold Spring Harbor Publications)，紐約)，用免疫原性蛋白和標(biāo)準(zhǔn)佐劑，如弗氏佐劑免疫純品系小鼠(用于本試驗(yàn)是因?yàn)樵撔∈筮z傳背景基本相同導(dǎo)致結(jié)果更具重現(xiàn)性)?？贵w的其它參考資料和討論也見(jiàn)本文，可通過(guò)免疫反應(yīng)性確定(所需)多肽?；蛘?，將衍生自本文公開(kāi) 序列的一種或多種合成或重組的多肽與載體蛋白偶聯(lián)用作免疫原。收集多克隆血清，并在免疫測(cè)定中用免疫原性多肽滴定，例如，使用固定在固體支持物上的一種或多種免疫原性蛋白的固相免疫測(cè)定。選擇滴度為IO6或更高的多克隆抗血清，合并，用對(duì)照血凝素和/或神經(jīng)氨酸酶多肽吸附去除以產(chǎn)生經(jīng)刪除、合并和滴定的多克隆抗血清?？捎帽容^性免疫測(cè)定檢測(cè)這種經(jīng)刪除、合并和滴定的多克隆抗血清對(duì)于對(duì)照同源多肽的交叉反應(yīng)性。在比較性試驗(yàn)中，測(cè)定經(jīng)刪除和滴定的多克隆抗血清的結(jié)合狀況差異，與結(jié)合同源對(duì)照多肽相比，經(jīng)刪除和滴定的抗血清與免疫原性多肽結(jié)合的信噪比至少高 5-10倍。即，通過(guò)加入非特異性競(jìng)爭(zhēng)物如清蛋白或脫脂奶粉和/或調(diào)節(jié)鹽條件、溫度和/或其它來(lái)節(jié)整結(jié)合反應(yīng)的嚴(yán)謹(jǐn)性。在隨后的試驗(yàn)中利用這些結(jié)合狀況以確定測(cè)試多肽(與免疫原性多肽和/或?qū)φ斩嚯南啾鹊亩嚯?是否能特異性結(jié)合經(jīng)刪除的合并多克隆抗血清。具體地說(shuō)，如果結(jié)合狀況的差異，測(cè)試多肽的信噪比顯示比對(duì)照同源受體至少高2-5倍，為免疫原性多肽信噪比的至少約1/2，相當(dāng)于已知受體，則該測(cè)試多肽的結(jié)構(gòu)與免疫原性多肽具有實(shí)質(zhì)相似性，因此是本發(fā)明的多肽。在另一個(gè)實(shí)例中，采用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合形式的免疫測(cè)定檢測(cè)受試多肽。例如，利用對(duì)照多肽進(jìn)行免疫吸附去除合并的抗血清混合物中的交叉反應(yīng)抗體。然后將免疫原性多肽固定在固體支持物上，使之接觸經(jīng)刪除的合并抗血清。將測(cè)試蛋白加入該試驗(yàn)以競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合經(jīng)合并和扣除的抗血清。將與固定蛋白相比，測(cè)試蛋白競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合經(jīng)合并和扣除的抗血清的能力與加入該試驗(yàn)的免疫原性多肽競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的能力(免疫原性多肽與固定的免疫原性多肽有效競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合合并的抗血清)作比較。采用標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算方法計(jì)算測(cè)試蛋白的交叉反應(yīng)性百分比。在平行實(shí)驗(yàn)中，與免疫原性多肽競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗血清的能力相比，任選測(cè)定對(duì)照蛋白競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合經(jīng)合并和扣除的抗血清的能力。也用標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算方法計(jì)算對(duì)照蛋白的交叉反應(yīng)性百分比。如果測(cè)試多肽的交叉反應(yīng)性百分比高于對(duì)照多肽至少5-10倍，或者測(cè)試多肽的結(jié)合大致在免疫原性多肽結(jié)合范圍內(nèi)，則該測(cè)試多肽稱(chēng)為能特異性結(jié)合經(jīng)刪除的合并抗血清。經(jīng)免疫吸附和合并的抗血清通?？捎糜诒疚乃龅母?jìng)爭(zhēng)結(jié)合免疫試驗(yàn)以對(duì)任何測(cè)試多肽與免疫原性和/或?qū)φ斩嚯淖鞅容^。為進(jìn)行這種比較，取寬濃度范圍的各免疫原性、測(cè)試和對(duì)照多肽進(jìn)行試驗(yàn)，采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測(cè)定抑制50%經(jīng)減除抗血清結(jié)合(例如)固定的對(duì)照、測(cè)試或免疫原性蛋白所需的各多肽用量。如果競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)中結(jié)合所需的測(cè)試多肽的用量小于所需免疫原性多肽用量的兩倍，則稱(chēng)該測(cè)試多肽能特異性結(jié)合該免疫原性蛋白的抗體，只要該用量至少高于對(duì)照多肽約5-10倍。作為特異性的另一種測(cè)定方法，任選用免疫原性多肽(而非對(duì)照多肽)完全免疫吸附合并的抗血清，直至很少檢測(cè)到或不能檢測(cè)到經(jīng)所得免疫原性多肽刪除的合并抗血清與免疫吸附中所用的免疫原性多肽結(jié)合。然后檢測(cè)該完全免疫吸附的抗血清與測(cè)試多肽的反應(yīng)性。若觀(guān)察到反應(yīng)性很少或沒(méi)有(即不超過(guò)觀(guān)察到的完全免疫吸附抗血清與免疫原性多肽結(jié)合的信噪比2倍)，則稱(chēng)該測(cè)試多肽能特異性結(jié)合該免疫原性蛋白引發(fā)的抗血清。核酸和多肽序列的變體如本文所述，本發(fā)明提供核酸的多核苷酸序列和多肽的氨基酸序列，如血凝素和神經(jīng)氨酸酶的序列，以及包含所述序列的組合物和方法。本文公開(kāi)了所述序列的例子。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知道本發(fā)明不限于本文公開(kāi)的這些序列，本發(fā)明也提供許多具有本文所述功能的相關(guān)和不相關(guān)的序列，如編碼HA和/或NA分子的序列。技術(shù)人員還應(yīng)知道本發(fā)明包括所公開(kāi)序列的許多變體。例如，本發(fā)明包括所公開(kāi) 序列的保守性變體，它們可產(chǎn)生功能相同的序列。如果核酸的多核苷酸序列變體能與至少一條公開(kāi)序列雜交，那么該變體也包括在本發(fā)明中。本發(fā)明還包括通過(guò)(例如)標(biāo)準(zhǔn)序列比較技術(shù)確定的本文公開(kāi)序列的獨(dú)特子序列。沉默變異由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，任選產(chǎn)生編碼本發(fā)明多肽和/或病毒的各種核酸序列，其中一些可能與本文HA和NA核酸及多肽序列具有較低水平的序列相同性。以下提供了說(shuō) 明遺傳密碼的典型密碼子表，可在許多生物學(xué)和生化教材中找到。表1密碼子表
權(quán)利要求
1.一種分離或重組的多肽，該多肽選自下組a)包含選自下組的核苷酸序列編碼的氨基酸序列的多肽SEQID N0:l、3、5、7、9、ll、 13、15、17、19、21、23、25 和 27 ；b)包含選自下組的核苷酸序列編碼的氨基酸序列的多肽SEQID N0:1的殘基 74-1060,SEQ ID NO 1 的殘基 1061_1723、SEQ ID NO :5 的殘基 81_1058、SEQ ID NO :5 的殘基 1059-1724、SEQ ID NO :9 的殘基85_1116、SEQ ID NO :9 的殘基 79_1116、SEQ ID NO :9 的殘基 1117-1785、SEQ ID NO 13 的殘基 78-1064、SEQ ID NO 13 的殘基 1065-1727、SEQ ID NO 17 的殘基 78-1055、SEQ ID NO 17 的殘基 1056-1721、SEQ ID NO 21 的殘基 78-1118、 SEQ ID NO 21 的殘基 1119-1787、SEQ ID NO 25 的殘基 75-1115 和 SEQ ID NO 25 的殘基 1116-1787 ；c)包含選自以下的氨基酸序列的多肽SEQID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、 24、26 和 28 ；d)包含選自以下的氨基酸序列的多肽SEQID N0:2的殘基17-345、SEQ ID NO :2的殘基 346-566、SEQ ID NO :6 的殘基 18-343、SEQ ID NO :6 的殘基；344_565、SEQ ID NO :10 的殘基 18-361、SEQ ID NO :10 的殘基 16_361、SEQ ID NO :10 的殘基 362-584、SEQ ID NO :14 的殘基 17-345、SEQ ID NO :14 的殘基 346-566、SEQ ID NO :18 的殘基 18-343、SEQ ID NO 18 的殘基 344-565, SEQ ID NO :22 的殘基 16-362、SEQ ID NO :22 的殘基 363-585、SEQ ID NO 26 的殘基 16-362 和 SEQ ID NO :26 的殘基 363-585 ；禾口e)包含選自以下的氨基酸序列的多肽SEQID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、 24,26,28, SEQ ID NO 2 的殘基 17-345、SEQ ID NO 2 的殘基 346-566、SEQ ID NO 6 的殘基 18-343、SEQ ID NO 6 的殘基；344_565、SEQ ID NO 10 的殘基 18-361、SEQ ID NO 10 的殘基 16-361、SEQ ID NO 10 的殘基 362-584、SEQ ID NO 14 的殘基 17-345、SEQ ID NO 14 的殘基 346-566、SEQ ID NO 18 的殘基 18-;343、SEQ ID NO :18 的殘基;M4_565、SEQ ID NO:22的殘基 16-362,SEQ ID NO :22 的殘基 363-585,SEQ ID NO 26 的殘基 16-362 或 SEQ ID NO 26 的殘基 363-585，其中 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14 或 15 個(gè)氨基酸殘基被取代、插入或刪除。
2.一種包含血凝素或其片段的分離或重組的多肽，所述多肽包含的氨基酸序列與選自下組的一種或多種多肽在毗連的至少約350個(gè)氨基酸；至少約400個(gè)氨基酸；至少約450個(gè) 氨基酸；至少約500個(gè)氨基酸；至少約502個(gè)氨基酸；至少約550個(gè)氨基酸；至少約559個(gè) 氨基酸；至少約565個(gè)氨基酸；或至少約566個(gè)氨基酸上基本相同a)包含選自下組的核苷酸序列編碼的氨基酸序列的多肽SEQID N0:l、5、9、13、17、21 和25 ；和b)包含選自下組的氨基酸序列的多肽SEQID NO :2、6、10、14、18、22和沈。
3.一種包含神經(jīng)氨酸酶或其片段的分離或重組的多肽，所述多肽包含的氨基酸序列與選自下組的一種或多種多肽在毗連的至少約350個(gè)氨基酸；至少約400個(gè)氨基酸；至少約 436個(gè)氨基酸；至少約450個(gè)氨基酸；至少約451個(gè)氨基酸；至少約465個(gè)氨基酸；至少約 466個(gè)氨基酸；至少約469個(gè)氨基酸；或至少約470個(gè)氨基酸上基本相同a)包含選自下組的核苷酸序列編碼的氨基酸序列的多肽SEQ ID N0:3、7、ll、15、19、23和 27 ；和b)包含選自下組的氨基酸序列的多肽SEQ ID NO :4、8、12、16、20、對(duì)和觀(guān)。
4.一種多肽，其包含的序列與選自以下的至少一種多肽具有至少98%、至少98. 5%、至少99 %、至少99. 2 %、至少99. 4 %、至少99. 6 %、至少99. 8 %或至少99. 9 %序列相同性a)包含選自下組的核苷酸序列編碼的氨基酸序列的多肽SEQID N0:l、3、5、7、9、ll、 13、15、17、19、21、23、25 和 27 ；b)包含選自下組的核苷酸序列編碼的氨基酸序列的多肽SEQID N0:1的殘基 74-1060,SEQ ID NO 1 的殘基 1061_1723、SEQ ID NO :5 的殘基 81_1058、SEQ ID NO :5 的殘基 1059-1724、SEQ ID NO :9 的殘基85_1116、SEQ ID NO :9 的殘基 79_1116、SEQ ID NO :9 的殘基 1117-1785、SEQ ID NO 13 的殘基 78-1064、SEQ ID NO 13 的殘基 1065-1727、SEQ ID NO 17 的殘基 78-1055、SEQ ID NO 17 的殘基 1056-1721、SEQ ID NO 21 的殘基 78-1118、 SEQ ID NO 21 的殘基 1119-1787、SEQ ID NO 25 的殘基 75-1115 和 SEQ ID NO 25 的殘基 1116-1787 ；c)包含選自以下的氨基酸序列的多肽SEQID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、 24、26 和 28 ；和d)包含選自以下的氨基酸序列的多肽SEQID N0:2的殘基17-345、SEQ ID NO :2的殘基 346-566、SEQ ID NO :6 的殘基 18-343、SEQ ID NO :6 的殘基；344_565、SEQ ID NO :10 的殘基 18-361、SEQ ID NO :10 的殘基 16-361、SEQ ID NO :10 的殘基 362-584、SEQ ID NO :14 的殘基 17-345、SEQ ID NO :14 的殘基 346-566、SEQ ID NO :18 的殘基 18-343、SEQ ID NO 18 的殘基 344-565, SEQ ID NO :22 的殘基 16-362、SEQ ID NO :22 的殘基 363-585、SEQ ID NO 26 的殘基 16-362 和 SEQ ID NO :26 的殘基 363-585。
5.一種多肽，其包含的序列與選自以下的至少一種多肽具有至少95%序列相同性a)包含選自下組的核苷酸序列編碼的氨基酸序列的多肽SEQID N0:l、3、5、7、9、ll、 13、15、17、19、21、23、25 和 27 ；b)包含選自下組的核苷酸序列編碼的氨基酸序列的多肽SEQID N0:1的殘基 74-1060,SEQ ID NO 1 的殘基 1061_1723、SEQ ID NO :5 的殘基81_1058、SEQ ID NO :5 的殘基 1059-1724、SEQ ID NO :9 的殘基85_1116、SEQ ID NO :9 的殘基 79_1116、SEQ ID NO :9 的殘基 1117-1785、SEQ ID NO 13 的殘基 78-1064、SEQ ID NO 13 的殘基 1065-1727、SEQ ID NO 17 的殘基 78-1055、SEQ ID NO 17 的殘基 1056-1721、SEQ ID NO 21 的殘基 78-1118、 SEQ ID NO 21 的殘基 1119-1787、SEQ ID NO 25 的殘基 75-1115 和 SEQ ID NO 25 的殘基 1116-1787 ；c)包含選自以下的氨基酸序列的多肽SEQID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、 24、26 和 28 ；和d)包含選自以下的氨基酸序列的多肽SEQID NO :2的殘基17-345、SEQ ID N0:2的殘基 346-566、SEQ ID NO 6 的殘基 18-343、SEQ ID NO 6 的殘基；344_565、SEQ ID NO 10 的殘基 18-361、SEQ ID NO 10 的殘基 16-361、SEQ ID NO 10 的殘基 362-584、SEQ ID NO 14 的殘基 17-345、SEQ ID NO 14 的殘基 346-566、SEQ ID NO 18 的殘基 18-343、SEQ ID NO 18 的殘基；344-565、SEQ ID NO 22 的殘基 16-362、SEQ ID NO 22 的殘基 363-585、SEQ ID NO 26 的殘基 16-362 和 SEQ ID NO 26 的殘基 363-585。
6.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽具有免疫原性。
7.一種組合物，其包含權(quán)利要求1所述的一種或多種多肽或它們的片段。
8.一種多肽，所述多肽與用至少一種抗原產(chǎn)生的多克隆抗血清特異性結(jié)合，所述抗原包含權(quán)利要求1所述的至少一條氨基酸序列或其片段。
9.權(quán)利要求1所述多肽的一種特異性抗體。
10.一種免疫原性組合物，其包含免疫有效量的權(quán)利要求1所述的多肽。
11.一種重配流感病毒，其包含編碼權(quán)利要求1所述多肽的多核苷酸。
12.如權(quán)利要求11所述的病毒，其特征在于，所述病毒是6 2重配病毒，其包含一種或多種供體病毒的6個(gè)基因組內(nèi)部區(qū)段和編碼流感病毒表面抗原的2個(gè)基因組區(qū)段，其中所述2個(gè)基因組區(qū)段中的至少一個(gè)包含選自以下的核苷酸序列或它們的片段SEQ ID NO 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、SEQ ID NO :1 的殘基74_1060、SEQ ID NO :1 的殘基 1061-1723、SEQ ID NO :5 的殘基 81-1058、SEQ ID NO :5 的殘基 1059-1724、SEQ ID NO: 9 的殘基 85-1116、SEQ ID NO :9 的殘基 79-1116、SEQ ID NO :9 的殘基 1117-1785、SEQ ID NO 13 的殘基 78-1064、SEQ ID NO :13 的殘基 1065-1727、SEQ ID NO :17 的殘基 78-1055、 SEQ ID NO 17 的殘基 1056-1721、SEQ ID NO :21 的殘基 78-1118、SEQ ID NO :21 的殘基 1119-1787、SEQ ID NO :25 的殘基 75-1115 和 SEQ ID NO :25 的殘基 1116-1787。
13.如權(quán)利要求12所述的病毒，其特征在于，所述供體病毒是A/ArmArbOr/6/60、B/Ann Arbor/1/66 或 A/Puerto Rico/8/34。
14.一種免疫原性組合物，其包含免疫有效量的權(quán)利要求13所述的重配流感病毒。
15.一種分離或重組的多核苷酸，該多核苷酸選自下組a)包含選自以下之一的核苷酸序列的多核苷酸SEQID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、 19、21、23、25和27，或其互補(bǔ)序列；b)包含選自以下之一的核苷酸序列的多核苷酸SEQID N0:1的殘基74-1060、SEQ ID NO :1 的殘基 1061-1723、SEQ ID NO :5 的殘基 81_1058、SEQ ID NO :5 的殘基 1059_1724、SEQ ID NO 9 的殘基 85-1116、SEQ ID NO 9 的殘基 79-1116、SEQ ID NO 9 的殘基 1117-1785、 SEQ ID NO 13 的殘基 78-1064、SEQ ID NO 13 的殘基 1065-1727、SEQ ID N0:17 的殘基 78-1055、SEQ ID NO :17 的殘基 1056-1721、SEQ ID NO :21 的殘基 78-1118、SEQ ID NO 21 的殘基 1119-1787、SEQ ID NO 25 的殘基 75-1115 和 SEQ ID NO 25 的殘基 1116-1787 ；c)編碼包含選自以下任一的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列SEQID N0:2、4、6、8、 10、12、14、16、18、20、22、24、26和28，或其互補(bǔ)多核苷酸序列；d)編碼包含選自以下任一的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列SEQID NO 2的殘基 17-345、SEQ ID NO 2 的殘基 346-566、SEQ ID NO 6 的殘基 18-343、SEQ ID NO 6 的殘基 344-565,SEQ ID NO 10 的殘基 18-361、SEQ ID NO 10 的殘基 16-361、SEQ ID NO 10 的殘基 362-584、SEQ ID NO 14 的殘基 17-345、SEQ ID NO 14 的殘基 346-566、SEQ ID NO 18 的殘基 18-343、SEQ ID NO 18 的殘基 344-565, SEQ ID NO 22 的殘基 16-362、SEQ ID NO 22 的殘基 363-585、SEQ ID NO 26 的殘基 16-362 和 SEQ ID NO 26 的殘基 363-585 ；和e)包含選自以下之一的核苷酸序列的多核苷酸SEQID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、 19、21、23、25、27、SEQ ID NO 1 的殘基 74-1060、SEQ ID NO 1 的殘基 1061-1723、SEQ ID NO 5 的殘基 81-1058、SEQ ID NO 5 的殘基 1059-1724、SEQ ID NO 9 的殘基 85-1116、SEQ ID NO :9 的殘基 79-1116、SEQ ID NO :9 的殘基 1117_1785、SEQ ID NO 13 的殘基 78-1064、SEQ ID NO :13 的殘基 1065-1727、SEQ ID NO 17 的殘基 78-1055、SEQ ID N0:17 的殘基 1056-1721、SEQ ID NO 21 的殘基 78-1118、SEQ ID NO 21 的殘基 1119-1787、SEQ ID NO 25 的殘基 75-1115 和 SEQ ID NO 25 的殘基 1116-1787，其中有 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14或15個(gè)核苷酸殘基被取代、插入或刪除，或其互補(bǔ)序列。
16.如權(quán)利要求15所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸是DNA。
17.如權(quán)利要求15所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸是RNA。
18.一種分離或重組的多核苷酸，其編碼權(quán)利要求2所述的多肽。
19.一種分離或重組的多核苷酸，其編碼權(quán)利要求3所述的多肽。
20.一種分離或重組的多核苷酸，其包含編碼血凝素多肽或神經(jīng)氨酸酶多肽的核苷酸序列，該核苷酸序列與選自以下的至少一種多核苷酸具有至少98%、至少98. 5%、至少 99%、至少99. 2%、至少99. 4%、至少99. 6%、至少99. 8%或至少99. 9%序列相同性a)包含選自以下之一的核苷酸序列的多核苷酸SEQID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、 19、21、23、25和27，或其互補(bǔ)序列；b)包含選自以下之一的核苷酸序列的多核苷酸SEQID N0:1的殘基74-1060、SEQ ID NO :1 的殘基 1061-1723、SEQ ID NO :5 的殘基81_1058、SEQ ID NO :5 的殘基 1059_1724、SEQ ID NO 9 的殘基 85-1116、SEQ ID NO 9 的殘基 79-1116、SEQ ID NO 9 的殘基 1117-1785、 SEQ ID NO 13 的殘基 78-1064、SEQ ID NO 13 的殘基 1065-1727、SEQ ID NO 17 的殘基 78-1055、SEQ ID NO :17 的殘基 1056-1721、SEQ ID NO :21 的殘基 78-1118、SEQ ID NO 21 的殘基 1119-1787、SEQ ID NO 25 的殘基 75-1115 和 SEQ ID NO 25 的殘基 1116-1787 ；c)編碼包含選自以下任一的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列SEQID N0:2、4、6、8、 10、12、14、16、18、20、22、24、26和28，或其互補(bǔ)多核苷酸序列；和d)編碼包含選自以下任一的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列SEQID NO 2的殘基 17-345、SEQ ID NO 2 的殘基 346-566、SEQ ID NO 6 的殘基 18-343、SEQ ID NO 6 的殘基 344-565,SEQ ID NO 10 的殘基 18-361、SEQ ID NO 10 的殘基 16-361、SEQ ID NO 10 的殘基 362-584、SEQ ID NO 14 的殘基 17-345、SEQ ID NO 14 的殘基 346-566、SEQ ID NO 18 的殘基 18-343、SEQ ID NO 18 的殘基 344-565, SEQ ID NO 22 的殘基 16-362、SEQ ID NO 22 的殘基 363-585、SEQ ID NO 26 的殘基 16-362 和 SEQ ID NO 26 的殘基 363-585。
21.一種分離或重組的多核苷酸，其包含的核苷酸序列與選自以下的至少一種多核苷酸具有至少95%序列相同性a)包含選自以下之一的核苷酸序列的多核苷酸SEQID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、 19、21、23、25和27，或其互補(bǔ)序列；b)包含選自以下之一的核苷酸序列的多核苷酸SEQID NO 1的殘基74_1060、SEQ ID NO :1 的殘基 1061-1723、SEQ ID NO :5 的殘基81_1058、SEQ ID NO :5 的殘基 1059_1724、SEQ ID NO 9 的殘基 85-1116、SEQ ID NO 9 的殘基 79-1116、SEQ ID NO 9 的殘基 1117-1785、 SEQ ID NO 13 的殘基 78-1064、SEQ ID NO 13 的殘基 1065-1727、SEQ ID NO 17 的殘基 78-1055、SEQ ID NO :17 的殘基 1056-1721、SEQ ID NO :21 的殘基 78-1118、SEQ ID NO 21 的殘基 1119-1787、SEQ ID NO 25 的殘基 75-1115 和 SEQ ID NO 25 的殘基 1116-1787 ；c)編碼包含選自以下任一的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列SEQID N0:2、4、6、8、 10、12、14、16、18、20、22、24、26和28，或其互補(bǔ)多核苷酸序列；和d)編碼包含選自以下任一的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列SEQ ID NO 2的殘基 17-345、SEQ ID NO 2 的殘基 346-566、SEQ ID NO 6 的殘基 18-343、SEQ ID NO 6 的殘基 344-565,SEQ ID NO 10 的殘基 18-361、SEQ ID NO 10 的殘基 16-361、SEQ ID NO 10 的殘基 362-584、SEQ ID NO 14 的殘基 17-345、SEQ ID NO 14 的殘基 346-566、SEQ ID NO 18 的殘基 18-343、SEQ ID NO 18 的殘基 344-565, SEQ ID NO 22 的殘基 16-362、SEQ ID NO 22 的殘基 363-585、SEQ ID NO 26 的殘基 16-362 和 SEQ ID NO 26 的殘基 363-585。
22.—種分離或重組的多核苷酸，其包含編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽包含通過(guò) 突變或重組權(quán)利要求15所述的一種或多種多核苷酸而產(chǎn)生的血凝素多肽或神經(jīng)氨酸酶多肽。
23.如權(quán)利要求15所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸編碼免疫原性多肽。
24.一種組合物，其包含權(quán)利要求15所述的一種或多種多核苷酸或其片段。
25.一種免疫原性組合物，其包含免疫有效量的權(quán)利要求15所述的多核苷酸。
26.一種重配流感病毒，其包含權(quán)利要求15所述的多核苷酸。
27.如權(quán)利要求沈所述的病毒，其特征在于，所述病毒是6 2重配病毒，其包含一種或多種供體病毒的6個(gè)基因組內(nèi)部區(qū)段和編碼流感病毒表面抗原的2個(gè)基因組區(qū)段，其中所述2個(gè)基因組區(qū)段中的至少一個(gè)包含選自以下的核苷酸序列或它們的片段SEQ ID NO 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、SEQ ID NO :1 的殘基74-1060、SEQ ID NO :1 的殘基 1061-1723、SEQ ID NO :5 的殘基 81-1058、SEQ ID NO :5 的殘基 1059-1724、SEQ ID NO: 9 的殘基 85-1116、SEQ ID NO :9 的殘基 79-1116、SEQ ID NO :9 的殘基 1117-1785、SEQ ID NO 13 的殘基 78-1064、SEQ ID NO :13 的殘基 1065-1727、SEQ ID NO :17 的殘基 78-1055、 SEQ ID NO 17 的殘基 1056-1721、SEQ ID NO :21 的殘基 78-1118、SEQ ID NO :21 的殘基 1119-1787、SEQ ID NO :25 的殘基 75-1115 和 SEQ ID NO :25 的殘基 1116-1787。
28.如權(quán)利要求27所述的病毒，其特征在于，所述供體病毒是A/ArmArbor/6/60, B/ Ann Arbor/1/66 或 A/Puerto Rico/8/34。
29.一種免疫原性組合物，其包含免疫有效量的權(quán)利要求27所述的重組流感病毒。
30.一種載體，其包含具有選自以下的核苷酸序列的多核苷酸SEQ ID NO :1,3,5, 7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、SEQ ID NO 1 的殘基 74-1060、SEQ ID NO :1 的殘基 1061-1723、SEQ ID NO 5 的殘基 81-1058、SEQ ID NO 5 的殘基 1059-1724、SEQ ID NO 9 的殘基 85-1116、SEQ ID NO 9 的殘基 79-1116、SEQ ID NO 9 的殘基 1117-1785、SEQ ID NO 13 的殘基 78-1064、SEQ ID NO 13 的殘基 1065-1727、SEQ ID NO 17 的殘基 78-1055、 SEQ ID NO 17 的殘基 1056-1721、SEQ ID NO 21 的殘基 78-1118、SEQ ID NO 21 的殘基 1119-1787,SEQ ID NO :25 的殘基 75-1115 和 SEQ ID NO :25 的殘基 1116-1787，或其片段。
31.如權(quán)利要求30所述的載體，其特征在于，所述載體是質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、病毒或病毒的片段。
32.如權(quán)利要求30所述的載體，其特征在于，所述載體是表達(dá)載體。
33.如權(quán)利要求30所述的載體，其特征在于，所述載體是多質(zhì)粒拯救方法的組分用以產(chǎn)生一種或多種重配病毒。
34.用權(quán)利要求30所述的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。
35.一種病毒，其包含含有選自以下的核苷酸序列的多核苷酸SEQ ID NO :1,3,5,.7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、SEQ ID NO :1 的殘基 74-1060、SEQ ID N0:1 的殘基 1061-1723、SEQ ID NO 5 的殘基 81-1058、SEQ ID NO 5 的殘基 1059-1724、SEQ ID NO 9 的殘基 85-1116、SEQ ID NO :9 的殘基 79-1116、SEQ ID NO :9 的殘基 1117-1785、SEQ ID NO 13 的殘基 78-1064、SEQ ID NO 13 的殘基 1065-1727、SEQ ID NO 17 的殘基 78-1055、 SEQ ID NO 17 的殘基 1056-1721、SEQ ID NO 21 的殘基 78-1118、SEQ ID NO 21 的殘基 1119-1787,SEQ ID NO :25 的殘基 75-1115 和 SEQ ID NO :25 的殘基 1116-1787，或其片段。
36.如權(quán)利要求35所述的病毒，其特征在于，所述病毒是流感病毒。
37.如權(quán)利要求36所述的病毒，其特征在于，所述多核苷酸包含編碼血凝素和/或神經(jīng) 氨酸酶或其片段的核苷酸序列。
38.如權(quán)利要求36所述的病毒，其特征在于，所述病毒是重配病毒。
39.如權(quán)利要求36所述的病毒，其特征在于，所述病毒是6 2重配病毒，其包含一種或多種供體病毒的6個(gè)基因組內(nèi)部區(qū)段和編碼流感病毒表面抗原的2個(gè)基因組區(qū)段，其中所述2個(gè)基因組區(qū)段中的至少一個(gè)包含選自以下的核苷酸序列或它們的片段SEQ ID NO 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、SEQ ID NO :1 的殘基74_1060、SEQ ID NO :1 的殘基 1061-1723、SEQ ID NO :5 的殘基 81-1058、SEQ ID NO :5 的殘基 1059-1724、SEQ ID NO: 9 的殘基 85-1116、SEQ ID NO :9 的殘基 79-1116、SEQ ID NO :9 的殘基 1117-1785、SEQ ID NO 13 的殘基 78-1064、SEQ ID NO :13 的殘基 1065-1727、SEQ ID NO :17 的殘基 78-1055、 SEQ ID NO 17 的殘基 1056-1721、SEQ ID NO :21 的殘基 78-1118、SEQ ID NO :21 的殘基 1119-1787、SEQ ID NO :25 的殘基 75-1115 和 SEQ ID NO :25 的殘基 1116-1787。
40.如權(quán)利要求39所述的病毒，其特征在于，所述2個(gè)基因組區(qū)段中的至少一個(gè)編碼血凝素或神經(jīng)氨酸酶或其片段。
41.如權(quán)利要求36所述的病毒，其特征在于，所述病毒是7 1重配病毒，包含一種或多種供體病毒的6個(gè)基因組內(nèi)部區(qū)段和編碼流感病毒第一表面抗原的第一基因組區(qū)段及編碼流感病毒第二表面抗原的第二基因組區(qū)段，所述第二基因組區(qū)段包含選自以下的核苷酸序列SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、SEQ ID NO :1 的殘基 74-1060,SEQ ID NO 1 的殘基 1061_1723、SEQ ID NO :5 的殘基 81_1058、SEQ ID NO :5 的殘基 1059-1724、SEQ ID NO :9 的殘基 85_1116、SEQ ID NO :9 的殘基 79_1116、SEQ ID NO :9 的殘基 1117-1785、SEQ ID NO 13 的殘基 78-1064、SEQ ID N0:13 的殘基 1065-1727、SEQ ID NO 17 的殘基 78-1055、SEQ ID NO 17 的殘基 1056-1721、SEQ ID NO 21 的殘基 78-1118、 SEQ ID NO 21 的殘基 1119-1787、SEQ ID NO 25 的殘基 75-1115 和 SEQ ID NO 25 的殘基 1116-1787，或其片段。
42.如權(quán)利要求41所述的病毒，其特征在于，所述第二基因組區(qū)段編碼血凝素或神經(jīng) 氨酸酶或其片段。
43.如權(quán)利要求39所述的病毒，其特征在于，所述供體病毒是溫度敏感型病毒、冷適應(yīng) 性病毒或減毒病毒。
44.如權(quán)利要求39或41所述的病毒，其特征在于，所述供體病毒包括A/Arm Arbor/6/60、B/Ann Arbor/1/66 或 A/Puerto Rico/8/34。
45.如權(quán)利要求39或41所述的病毒，其特征在于，所述病毒是活病毒。
46.包含如權(quán)利要求45所述病毒的細(xì)胞。
47.一種在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生重配流感病毒的方法，該方法包括將多個(gè)包含對(duì)應(yīng)于流感病毒基因組的多核苷酸的載體引入宿主細(xì)胞群體，所述多個(gè) 載體包含第一流感病毒株的至少6個(gè)基因組內(nèi)部區(qū)段和第二流感病毒株的至少一個(gè)基因組區(qū)段，其中所述第二流感病毒株的至少一個(gè)基因組區(qū)段包含含有選自以下的核苷酸序列的多核苷酸SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、SEQ ID NO :1 的殘基 74-1060,SEQ ID NO 1 的殘基 1061_1723、SEQ ID NO :5 的殘基 81_1058、SEQ ID NO :5 的殘基 1059-1724、SEQ ID NO :9 的殘基 85_1116、SEQ ID NO :9 的殘基 79_1116、SEQ ID NO :9 的殘基 1117-1785、SEQ ID NO :13 的殘基 78-1064、SEQ ID NO 13 的殘基 1065-1727、SEQ ID NO 17 的殘基 78-1055、SEQ ID NO 17 的殘基 1056-1721、SEQ ID NO 21 的殘基 78-1118、 SEQ ID NO 21 的殘基 1119-1787、SEQ ID NO 25 的殘基 75-1115 和 SEQ ID NO 25 的殘基 1116-1787，或其片段，所述宿主細(xì)胞群體能支持流感病毒復(fù)制；培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞群體；和回收多個(gè)流感病毒。
48.如權(quán)利要求47所述的方法，其特征在于，所述第一流感病毒株是減毒的流感病毒株、冷適應(yīng)性流感病毒株或溫度敏感型流感病毒株。
49.如權(quán)利要求47所述的方法，其特征在于，所述流感病毒適合用鼻內(nèi)疫苗制劑給予。
50.如權(quán)利要求47所述的方法，其特征在于，所述流感病毒基因組是乙型流感病毒基因組。
51.如權(quán)利要求47所述的方法，其特征在于，所述流感病毒基因組是甲型流感病毒基因組。
52.如權(quán)利要求47所述的方法，其特征在于，所述第一流感病毒株是A/Arm Arbor/6/60、B/Ann Arbor/1/66 或 A/Puerto Rico/8/34。
53.如權(quán)利要求47所述的方法，其特征在于，所述多個(gè)載體是多個(gè)質(zhì)粒載體。
54.如權(quán)利要求47所述的方法，其特征在于，所述宿主細(xì)胞群體包含以下一種或多種 Vero細(xì)胞、PerC6細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、293T細(xì)胞和COS細(xì)胞。
55.如權(quán)利要求47所述的方法，其特征在于，包括回收重配流感病毒。
56.如權(quán)利要求47所述的方法，其特征在于，所述方法不包括利用輔助病毒。
57.如權(quán)利要求47所述的方法，其特征在于，所述多個(gè)載體是8個(gè)載體。
58.如權(quán)利要求47所述的方法，其特征在于，所述至少一個(gè)基因組區(qū)段編碼所述第二流感病毒株的免疫原性流感表面抗原。
59.一種免疫原性組合物，其包含含有選自以下的氨基酸序列的多肽SEQ ID NO 2, 4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、SEQ ID NO :2 的殘基 17-345、SEQ ID NO :2 的殘基 346-566、SEQ ID NO 6 的殘基 18-343、SEQ ID NO 6 的殘基；344_565、SEQ ID NO 10 的殘基 18-361、SEQ ID NO 10 的殘基 16-361、SEQ ID NO 10 的殘基 362-584、SEQ ID NO 14 的殘基 17-345、SEQ ID NO 14 的殘基 346-566、SEQ ID NO 18 的殘基 18-343、SEQ ID NO 18 的殘基 344-565, SEQ ID NO 22 的殘基 16-362、SEQ ID NO 22 的殘基 363-585、SEQ ID NO 26 的殘基 16-362 和 SEQ ID NO 26 的殘基 363-585。
60.一種免疫原性組合物，其包含含有選自以下的核苷酸序列的多核苷酸SEQ ID NO 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、SEQ ID NO :1 的殘基74-1060、SEQ ID NO :1 的殘基 1061-1723、SEQ ID NO :5 的殘基 81-1058、SEQ ID NO :5 的殘基 1059-1724、SEQ ID NO: 9 的殘基 85-1116、SEQ ID NO 9 的殘基 79-1116、SEQ ID NO 9 的殘基 1117-1785、SEQ ID NO 13 的殘基 78-1064、SEQ ID NO 13 的殘基 1065-1727、SEQ ID NO 17 的殘基 78-1055、 SEQ ID NO 17 的殘基 1056-1721、SEQ ID NO 21 的殘基 78-1118、SEQ ID NO 21 的殘基 1119-1787、SEQ ID NO :25 的殘基 75-1115 和 SEQ ID NO :25 的殘基 1116-1787。
61.如權(quán)利要求59或60所述的組合物，其特征在于，還包含賦形劑。
62.如權(quán)利要求61所述的組合物，其特征在于，所述賦形劑是藥學(xué)上可接受的賦形劑。
63.一種含重配病毒的免疫原性組合物，所述重配株病毒包含具有選自以下的核苷酸序列的多核苷酸SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、SEQ ID NO :1 的殘基 74-1060、SEQ ID NO :1 的殘基 1061-1723、SEQ ID NO :5 的殘基 81-1058、SEQ ID NO: 5 的殘基 1059-1724、SEQ ID NO 9 的殘基 85-1116、SEQ ID NO 9 的殘基 79-1116、SEQ ID NO 9 的殘基 1117-1785,SEQ ID NO 13 的殘基 78_1064、SEQ ID NO :13 的殘基 1065-1727、 SEQ ID NO 17 的殘基 78-1055、SEQ ID NO 17 的殘基 1056-1721、SEQ ID NO 21 的殘基 78-1118、SEQ ID NO 21 的殘基 1119-1787、SEQ ID NO 25 的殘基 75-1115 和 SEQ ID NO 25 的殘基 1116-1787。
64.如權(quán)利要求63所述的組合物，其特征在于，所述重配病毒是6 2重配株病毒，該病毒包含一種或多種供體病毒的6個(gè)基因組內(nèi)部區(qū)段和編碼流感病毒表面抗原的2個(gè)基因組區(qū)段，其中所述2個(gè)基因組區(qū)段中的至少一個(gè)包含選自以下的核苷酸序列SEQ ID NO 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、SEQ ID NO :1 的殘基 74_1060、SEQ ID NO :1 的殘基 1061-1723、SEQ ID NO :5 的殘基 81-1058、SEQ ID NO :5 的殘基 1059-1724、SEQ ID NO: 9 的殘基 85-1116、SEQ ID NO :9 的殘基 79-1116、SEQ ID NO :9 的殘基 1117-1785、SEQ ID NO 13 的殘基 78-1064、SEQ ID NO :13 的殘基 1065-1727、SEQ ID NO :17 的殘基 78-1055、 SEQ ID NO 17 的殘基 1056-1721、SEQ ID NO :21 的殘基 78-1118、SEQ ID NO :21 的殘基 1119-1787、SEQ ID NO :25 的殘基 75-1115 和 SEQ ID NO :25 的殘基 1116-1787。
65.如權(quán)利要求64所述的組合物，其特征在于，所述流感供體病毒株是冷適應(yīng)、減毒和 /或溫度敏感型流感病毒株。
66.如權(quán)利要求65所述的組合物，其特征在于，所述流感供體病毒株是A/Arm Arbor/6/60、B/Ann Arbor/1/66 或 A/Puerto Rico/8/34。
67.一種減毒的流感活疫苗，其包含權(quán)利要求63所述的免疫原性組合物。
68.如權(quán)利要求63所述的組合物，其特征在于，還包含一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑。
69.一種制備流感病毒疫苗的方法，該方法包括將多個(gè)包含對(duì)應(yīng)于流感病毒基因組的多核苷酸的載體引入宿主細(xì)胞群體，所述多個(gè) 載體包含第一流感病毒株的至少6個(gè)基因組內(nèi)部區(qū)段和第二流感病毒株的至少一個(gè)基因組區(qū)段，其中所述第二流感病毒株的至少一個(gè)基因組區(qū)段包含含有選自以下的核苷酸序列的多核苷酸SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、SEQ ID NO :1 的殘基 74-1060,SEQ ID NO 1 的殘基 1061_1723、SEQ ID NO :5 的殘基 81_1058、SEQ ID NO :5 的殘基 1059-1724、SEQ ID NO :9 的殘基 85_1116、SEQ ID NO :9 的殘基 79_1116、SEQ ID NO :9 的殘基 1117-1785、SEQ ID NO 13 的殘基 78-1064、SEQ ID N0:13 的殘基 1065-1727、SEQ IDNO 17 的殘基 78-1055、SEQ ID NO 17 的殘基 1056-1721、SEQ ID NO 21 的殘基 78-1118、 SEQ ID NO 21 的殘基 1119-1787、SEQ ID NO 25 的殘基 75-1115 和 SEQ ID NO 25 的殘基 1116-1787或其片段，所述宿主細(xì)胞群體能支持流感病毒復(fù)制；培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞群體；回收多個(gè)流感病毒；和提供一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑。
70.如權(quán)利要求69所述的方法，其特征在于，所述第一流感病毒株是減毒流感病毒、冷適應(yīng)流感病毒或溫度敏感型流感病毒。
71.如權(quán)利要求69所述的方法，其特征在于，產(chǎn)生的病毒適合用鼻內(nèi)疫苗制劑給予。
72.如權(quán)利要求69所述的方法，其特征在于，所述流感病毒基因組是乙型流感病毒基因組或甲型流感病毒基因組。
73.如權(quán)利要求69所述的方法，其特征在于，所述至少一個(gè)基因組區(qū)段編碼所述第二流感病毒株的免疫原性流感表面抗原。
74.一種預(yù)防性或治療性治療對(duì)象的病毒感染的方法，該方法包括給予該對(duì)象有效量的重配病毒以產(chǎn)生抵御病毒感染的免疫應(yīng)答，所述重配病毒包含含有選自以下的核苷酸序列的多核苷酸SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、SEQ ID NO :1 的殘基 74-1060、SEQ ID NO 1 的殘基 1061-1723、SEQ ID NO :5 的殘基 81-1058、SEQ ID NO: 5 的殘基 1059-1724、SEQ ID NO 9 的殘基 85-1116、SEQ ID NO 9 的殘基 79-1116、SEQ ID NO 9 的殘基 1117-1785,SEQ ID NO 13 的殘基 78-1064,SEQ ID NO 13 的殘基 1065-1727、 SEQ ID NO :17 的殘基 78-1055、SEQ ID NO :17 的殘基 1056-1721、SEQ ID NO :21 的殘基 78-1118、SEQ ID NO 21 的殘基 1119-1787、SEQ ID NO 25 的殘基 75-1115 和 SEQ ID NO 25的殘基1116-1787或其片段。
75.如權(quán)利要求74所述的方法，其特征在于，所述對(duì)象是哺乳動(dòng)物。
76.如權(quán)利要求74所述的方法，其特征在于，所述哺乳動(dòng)物是人。
77.如權(quán)利要求74所述的方法，其特征在于，所述病毒感染包括流感病毒感染。
78.如權(quán)利要求74所述的方法，其特征在于，將所述病毒體內(nèi)給予所述對(duì)象或體外或離體給予所述對(duì)象的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞。
79.如權(quán)利要求74所述的方法，其特征在于，將預(yù)防性或治療性治療病毒感染有效量的包含重配株病毒和藥學(xué)上可接受的賦形劑的組合物給予所述對(duì)象。
80.一種包含轉(zhuǎn)錄控制元件的DNA分子，所述元件結(jié)合DNA-指導(dǎo)性RNA聚合酶并操作性連接于編碼RNA分子的DNA序列，其中所述RNA分子包含流感病毒的RNA-指導(dǎo)性RNA 聚合酶的特異性結(jié)合位點(diǎn)，操作性連接于包含流感病毒的mRNA編碼序列的反向互補(bǔ)序列的RNA序列，其中所述DNA序列包含對(duì)應(yīng)于以下一種或多種的核酸SEQ ID NO :1、3、5、 7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、SEQ ID NO :1 的殘基 74-1060、SEQ ID N0:1 的殘基 1061-1723、SEQ ID NO 5 的殘基 81-1058、SEQ ID NO 5 的殘基 1059-1724、SEQ ID NO 9 的殘基 85-1116、SEQ ID NO :9 的殘基 79-1116、SEQ ID NO :9 的殘基 1117-1785、SEQ ID NO 13 的殘基 78-1064、SEQ ID NO 13 的殘基 1065-1727、SEQ ID NO 17 的殘基 78-1055、 SEQ ID NO :17 的殘基 1056-1721、SEQ ID NO :21 的殘基 78-1118、SEQ ID NO :21 的殘基 1119-1787、SEQ ID NO 25 的殘基 75—1115 和 SEQ ID NO 25 的殘基 1116-1787 或其片段。
81.—種DNA分子，其包含轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生含有RNA序列的RNA模板的核苷酸序列，所述RNA 序列包含流感病毒的mRNA編碼序列的反向互補(bǔ)序列和vRNA末端序列，其中所述核苷酸序列包含對(duì)應(yīng)于以下一種或多種的核酸:SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、 27、SEQ ID NO 1 的殘基 74-1060、SEQ ID NO 1 的殘基 1061-1723、SEQ ID NO 5 的殘基 81-1058、SEQ ID NO 5 的殘基 1059-1724、SEQ ID NO 9 的殘基 85-1116、SEQ ID NO 9 的殘基 79-1116、SEQ ID NO :9 的殘基 1117_1785、SEQ ID NO 13 的殘基 78_1064、SEQ ID NO: 13 的殘基 1065-1727、SEQ ID NO :17 的殘基 78_1055、SEQ ID NO :17 的殘基 1056_1721、SEQ ID NO :21 的殘基 78-1118、SEQ ID NO :21 的殘基 1119_1787、SEQ ID NO :25 的殘基 75-1115 和SEQ ID NO 25的殘基1116-1787或其片段。
82.如權(quán)利要求81所述的DNA分子，其特征在于，所述RNA模板是可復(fù)制的。
全文摘要
本發(fā)明提供包含流感血凝素和神經(jīng)氨酸酶變體的多肽、多核苷酸、方法、組合物和疫苗。
文檔編號(hào)A61K39/145GK102149405SQ200980135949
公開(kāi)日2011年8月10日申請(qǐng)日期2009年7月9日優(yōu)先權(quán)日2008年7月11日
發(fā)明者C-F·楊, G·坎保申請(qǐng)人:米迪繆尼股份有限公司

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