專利名稱：組蛋白脫乙酰酶抑制劑在治療費(fèi)城-陰性骨髓增生綜合征中的用途的制作方法
組蛋白脫乙酰酶抑制劑在治療費(fèi)城-陰性骨髓增生綜合征
中的用途描述骨髓增生綜合征是腫瘤型障礙，其通常源于骨髓多能性干細(xì)胞，也就是說(shuō)，所述的細(xì)胞通過(guò)分化可以形成多種類型的血細(xì)胞。骨髓增生綜合征分為4種類型慢性粒細(xì)胞白血病(CML)、真性紅細(xì)胞增多癥 (PV)、原發(fā)性(essential)血小板增多(ET)和特發(fā)性骨髓纖維化(IM)。慢性粒細(xì)胞白血病的分子基礎(chǔ)很久以前即為已知的，并且存在于費(fèi)城染色體的形成或9 ；22易位，以及BCR-ABL融合基因的產(chǎn)生；在這些情況中，稱為費(fèi)城-陽(yáng)性骨髓增生綜合征，特異性ABL酪氨酸激酶抑制劑(例如伊馬替尼(imitinib)或達(dá)沙替尼(desatinib)) 的應(yīng)用可能選擇性干擾細(xì)胞病理學(xué)響應(yīng)，限制非特異性細(xì)胞毒性對(duì)健康細(xì)胞損傷的可能結(jié)^ ο對(duì)于其它3種病理學(xué)，歸為費(fèi)城-陰性骨髓增生綜合征，最近已經(jīng)確定了分子基礎(chǔ)[參見(jiàn)，例如Robert Kralovics 等人，The New England Journal of Medicine 352， 1779-1790(2005) ；Chlo6James 等人，Nature 434，1144-1148 Q005)]，并且似乎與基因突變影響的JAK2酪氨酸激酶相關(guān)。對(duì)于這些綜合征，目前的治療還提供了應(yīng)用具有非特異性作用的細(xì)胞抑制藥，主要是羥基脲，一段治療期后，該藥物存在誘導(dǎo)發(fā)展成脊髓發(fā)育不良狀態(tài)和形成白血病的病理學(xué)風(fēng)險(xiǎn)。在歐洲，費(fèi)城-陰性骨髓增生綜合征的發(fā)病率約為每年每100，000名居民中有5例。因此，需要開(kāi)發(fā)新的藥物，甚至對(duì)于費(fèi)城-陰性骨髓增生綜合征(PV、ET和IM)該藥物以更選擇性的方式和在無(wú)毒劑量下發(fā)揮作用。組蛋白脫乙酰酶(HDAC)是能夠除去與組蛋白或其它蛋白質(zhì)的N-端部分的賴氨酸殘基結(jié)合的乙?；拿?。基于結(jié)構(gòu)同源性，HDAC可以分為4個(gè)類型。I類HDAC(HDAC 1、2、3和8)類似于 RPD3酵母蛋白質(zhì)，并且位于細(xì)胞核內(nèi)。II類HDAC(HDAC 4、5、6、7、9和10)類似于HDAl酵母蛋白質(zhì)，并且位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。III類HDAC在結(jié)構(gòu)上不同于與SIR2酵母蛋白質(zhì)相關(guān)的NAD-依賴性酶的形式。IV類(HDAC 11)是由具有特殊結(jié)構(gòu)特征的單一酶組成。I、II 和IV類的HDAC是鋅酶，并且可以被多種類型的分子抑制異羥肟酸衍生物、環(huán)四肽、短鏈脂肪酸、氨基苯甲酰胺、親電子酮的衍生物等。III類HDAC不被異羥肟酸抑制，并且它們的抑制劑具有不同于其它類型的抑制劑的結(jié)構(gòu)特征。本發(fā)明相關(guān)的表述“組蛋白脫乙酰酶抑制劑”應(yīng)當(dāng)被理解為表示能夠抑制被分類為I類、II類或IV類的組蛋白脫乙酰酶中至少一種酶的活性的天然、重組或合成來(lái)源的任何分子。組蛋白脫乙酰酶抑制劑是一類具有抗腫瘤和抗炎活性的分子。在腫瘤細(xì)胞中，組蛋白脫乙酰酶抑制劑抑制細(xì)胞增殖并且誘導(dǎo)細(xì)胞死亡和分化[Gaofeng Bi禾口Guosheng Jiang,Cellular & Molecular Immunology 3,285-290(2006)]。組蛋白脫乙酰酶抑制劑還能調(diào)節(jié)免疫活性細(xì)胞部分的細(xì)胞因子和其它促炎因子的產(chǎn)生，并且在體內(nèi)已經(jīng)證實(shí)具有抗炎特性[Fr6d6ric Blanchard和C6line Chipoy,Drug Discovery Today 10,197-204(2005) ；IM Adcock, British Journal of Pharmacology 150,829-831(2007)]ο目前，對(duì)于腫瘤病理學(xué)和炎性病理學(xué)的多種臨床研究正在進(jìn)行中，并且應(yīng)用多種抑制劑取得了不同階段的進(jìn)步[Marielle Paris 等人，Journal of Medicinal Chemistry 51，1505-1529(2008)]ο最近，批準(zhǔn)了組蛋白脫乙酰酶抑制劑(hlinza，伏立諾他(vorinostat))用于治療皮膚T細(xì)胞淋巴瘤。在以下專利中，描述了目前處于臨床研究階段的某些組蛋白脫乙酰酶抑制劑及其其它類似物W0 2004/092115、WO 2005/019174、WO 2003/076422、WO 1997/043251、WO 2006/010750、WO 2006/003068、WO 2002/030879、WO 2002/022577、WO 1993/007148、WO 2008/033747、WO 2004/069823、EP 0847992 和 WO 2004/071400，將其全部?jī)?nèi)容并入本文作
為參考。WO 97/43251(無(wú)水形式)和WO 2004/065355 (—水合物晶體形式)中描述的二乙
基-[6-(4-羥基氨基甲酰基-苯基氨基甲?；趸谆?_萘-2-基甲基]-氯化銨是具有良好抗炎活性的HDAC抑制劑，將其并入本文作為參考；該活性物質(zhì)還稱為ITF2357和/或 Givinostat0在脂多糖(LPS)-刺激的培養(yǎng)的人外周血單核細(xì)胞(PBMC)中，10至22nM的 ITF2357降低了 50%腫瘤壞死因子α (TNF α )的釋放，12nM的ITF2357降低了 50%細(xì)胞內(nèi)白介素(IL)-Ia的釋放，12.5至25碰的幾 2357降低了50%11^-13的分泌，并且25nM的 ITF2357降低了 50%干擾素-γ (IFNy)的產(chǎn)生。小鼠口服施用1. 0至10mg/kg ITF2357降低超過(guò) 50% 的 LPS-誘導(dǎo)的血清 TNFa 和 IFNy [Flavio Leoni 等人，Molecular Medicine 11，1-15(2005)]ο最近報(bào)道了亞微摩爾濃度的ITF2357能夠抑制患有PV或ET的患者中獲得的干細(xì)胞的產(chǎn)克隆活性[V. Guerini等人，Leukemia 22，740—747 (2008)]。但是，獲得抑制產(chǎn)克隆活性的濃度遠(yuǎn)低于獲得分子標(biāo)志物(JAK2V617F* STAT蛋白質(zhì))修飾或細(xì)胞毒效應(yīng)所需的濃度；這些結(jié)果的不確定性使得難以提供將體外獲得的這些效應(yīng)移植到體內(nèi)治療情形中，特別是對(duì)于人的任何治療性治療。發(fā)明描述現(xiàn)在我們發(fā)現(xiàn)并且這構(gòu)成本發(fā)明的一個(gè)方面，給患有真性紅細(xì)胞增多癥、原發(fā)性血小板增多或骨髓纖維化的患者施用二乙基46-(4-羥基氨基甲?；?苯基氨基甲?；趸谆?-萘-2-基甲基]-氯化銨、優(yōu)選一水合物形式、更優(yōu)選一水合物晶體形式引起完全或部分響應(yīng)；另外，在最初確診為脾腫大的患者中，觀察到脾體積的顯著減小。我們還發(fā)現(xiàn)并且這構(gòu)成本發(fā)明的第二個(gè)方面，治療人費(fèi)城-陰性骨髓增生綜合征的該活性物質(zhì)的治療劑量顯著低于治療腫瘤綜合征通常所用的劑量，并且該治療劑量可以是10至150mg/天/患者、優(yōu)選30至120mg/天/患者并且甚至更優(yōu)選50至IOOmg/天/患者。
完全以實(shí)例的方式，治療皮膚T細(xì)胞淋巴瘤所示的hlinza (伏立諾他)的劑量為 400mg/天。本發(fā)明涉及二乙基46-(4-羥基氨基甲?；?苯基氨基甲?；趸谆?-萘-2-基甲基]-氯化銨、優(yōu)選一水合物形式、更優(yōu)選一水合物晶體形式在治療性治療費(fèi)城-陰性骨髓增生綜合征(真性紅細(xì)胞增多癥、原發(fā)性血小板增多或特發(fā)性骨髓纖維化) 中的用途。該活性成分可以單獨(dú)應(yīng)用，即不與其它活性成分組合，或者與其它細(xì)胞抑制活性成分組合，例如完全以實(shí)例的方式，羥基脲或哌泊溴烷。本發(fā)明還涉及該活性成分以低于治療腫瘤病理學(xué)(例如皮膚T細(xì)胞淋巴瘤)所用的日劑量在治療費(fèi)城-陰性骨髓增生綜合征中的治療性用途，這些劑量為10至150mg/ 天/患者、優(yōu)選30至120mg/天/患者并且甚至更優(yōu)選50至IOOmg/天/患者。本發(fā)明相關(guān)的術(shù)語(yǔ)“治療”應(yīng)當(dāng)被理解為表示緩解、減輕、最小化、消除或阻斷疾病病理狀態(tài)或進(jìn)程引起的有害效應(yīng)的治療作用。特別的化合物對(duì)于組蛋白脫乙酰酶的抑制活性可以在體外應(yīng)用例如酶試驗(yàn)來(lái)測(cè)量，所述的酶試驗(yàn)證實(shí)抑制這些酶中的至少一種酶。該類型的試驗(yàn)是文獻(xiàn)中已知的 參見(jiàn)，例如 P.A.Marks 等人，J. Natl. Cancer Inst. 92 1210-1215(2000) ； L. Μ. Butler 等人，Cancer Res. 605165-517(^2000) ;V. Μ. Richon 等人，Proc. Natl. Acad. ki. USA 95 3003-3007(1998) ；Μ. Yoshida 等人，J. Biol. Chem. 265 17174-17179(1990)；測(cè)量 HDAC抑制的試劑盒也是可商購(gòu)獲得的(例如，Biomol International LP(USA) ；HDACl Fluorimetric Drug Discovery Kit，產(chǎn)品號(hào) BML-AK511-0001)。以下實(shí)施例旨在說(shuō)明本發(fā)明，而不是限制其范圍。實(shí)施例1ITF2357在患有費(fèi)城-陰性骨髓增生綜合征的患者中的臨床研究。設(shè)計(jì)11期，開(kāi)放，非隨機(jī)研究。研究中的人群27名具有JAK2V617F突變的患者，患有標(biāo)準(zhǔn)藥理學(xué)治療(羥基脲)不足以控制的骨髓增生綜合征。研究下的藥物ITF2357，劑量為每天50mg兩次。治療周期連續(xù)施用至多M周。主要目的評(píng)價(jià)ITF2357在治療患有JAK2V617F-陽(yáng)性骨髓增生疾病(PV、ET、IM)的患者中的有效性和耐受性。次要目的通過(guò)定量PCR評(píng)價(jià)治療對(duì)突變的JAK2等位基因負(fù)荷的作用。初步數(shù)據(jù)的檢查(治療持續(xù)時(shí)間4至12周)表明給患有真性紅細(xì)胞增多癥、原發(fā)性血小板增多或骨髓纖維化的患者施用ITF2357在約60%的病例中誘導(dǎo)完全或部分響應(yīng)； 另外，在最初表現(xiàn)為脾腫大的患者中觀察到脾體積顯著減小。實(shí)施例2對(duì)人細(xì)胞系SET-2克隆效率的比較效應(yīng)從以^皿突變的人細(xì)胞系SET_2(由具有原發(fā)性血小板增多的白血病轉(zhuǎn)化的患者的外周血建立的原巨核細(xì)胞系)來(lái)自德國(guó)細(xì)胞庫(kù)DSMZ(目錄號(hào)ACC 608)，并且其生長(zhǎng)在含培養(yǎng)基(RPMI 1640+Hepes 緩沖液 IM+ 青霉素 10. 000IU/mL+ 鏈霉素 10. 000 μ g/mL+20%胎牛血清)的對(duì)孔板中。先前的試驗(yàn)用于測(cè)定細(xì)胞的最佳數(shù)量，從而在每個(gè)培養(yǎng)皿中產(chǎn)生足夠數(shù)量的克隆以便可重復(fù)計(jì)數(shù)。在SET-2系的情況下，數(shù)量對(duì)應(yīng)為3X IO3個(gè)細(xì)胞/培養(yǎng)皿。 當(dāng)獲得足夠數(shù)量的細(xì)胞時(shí)，通過(guò)離心(以103rpm離心10分鐘)收集細(xì)胞，然后以90 X IO3 個(gè)細(xì)胞/mL的濃度懸浮于培養(yǎng)基中。將100 μ L的懸浮液加入至如廠家描述所制備的3. OmL 的甲基纖維素(Methocult ,目錄號(hào) H4230，Stemcell Technologies)中，然后加入 50 μ L 的63倍濃縮的HDAC抑制劑的0. 1 % DMSO溶液。對(duì)于每種化合物，試驗(yàn)5個(gè)系列稀釋度 (1000-12ηΜ范圍)。然后用無(wú)菌塑料巴斯德吸管小心地混合含HDAC抑制劑的甲基纖維素溶液，避免形成氣泡。最后，應(yīng)用配有18G針的注射器將ImL溶液均勻地分布在培養(yǎng)皿(35mm 直徑，帶有格網(wǎng)，目錄號(hào)174^6Nimc)中。對(duì)于每個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)制備2份培養(yǎng)皿。將2份試驗(yàn)平皿放在帶有無(wú)菌水槽的更大的培養(yǎng)皿中，確保恒定的濕度。然后，將所有的平皿維持在37°C 的一定的濕度和CO2-控制的無(wú)菌培養(yǎng)箱中。生長(zhǎng)14天后，通過(guò)應(yīng)用雙目顯微鏡測(cè)量每個(gè)平皿中的克隆數(shù)量。計(jì)算出平皿每個(gè)分隔中克隆的平均數(shù)量，并且根據(jù)不含任何化合物(對(duì)照平皿)獲得的克隆數(shù)量來(lái)測(cè)定克隆形成的抑制百分?jǐn)?shù)。應(yīng)用GraphPad Prism 5. 0軟件計(jì)算出EC5tl值(降低50%克隆數(shù)量所需的濃度)，并且報(bào)告在下表中。還報(bào)告了 rhHDACl 抑制值酶是從BPS Biosciences (目錄號(hào)50001)獲得的，并且試驗(yàn)是應(yīng)用BIOMOL試劑盒根據(jù)廠家說(shuō)明書(shū)進(jìn)行的。表 權(quán)利要求
1.二乙基-[6-(4-羥基氨基甲?；?苯基氨基甲?；趸谆?-萘-2-基-甲基]-氯化銨或其它可藥用鹽和/或溶劑化物，其用于治療費(fèi)城-陰性骨髓增生綜合征。
2.權(quán)利要求1的二乙基46-(4-羥基氨基甲?；?苯基氨基甲?；趸谆?-萘-2-基-甲基]-氯化銨，其特征在于它是一水合物形式。
3.權(quán)利要求1的二乙基46-(4-羥基氨基甲酰基-苯基氨基甲?；趸谆?_萘-2-基-甲基]-氯化銨，其特征在于它是一水合物晶體形式。
4.權(quán)利要求1的二乙基46-(4-羥基氨基甲酰基-苯基氨基甲?；趸谆?-萘-2-基-甲基]-氯化銨，其特征在于日劑量為每位患者10至150mg。
5.權(quán)利要求4的二乙基46-(4-羥基氨基甲酰基-苯基氨基甲?；趸谆?-萘-2-基-甲基]-氯化銨，其特征在于日劑量為每位患者30至120mg。
6.權(quán)利要求5的二乙基46-(4-羥基氨基甲?；?苯基氨基甲?；趸谆?-萘-2-基-甲基]-氯化銨，其特征在于日劑量為每位患者50至lOOmg。
7.權(quán)利要求1的二乙基46-(4-羥基氨基甲?；?苯基氨基甲?；趸谆?_萘-2-基-甲基]-氯化銨，其特征在于費(fèi)城-陰性骨髓增生綜合征是真性紅細(xì)胞增多癥。
8.權(quán)利要求1的二乙基46-(4-羥基氨基甲?；?苯基氨基甲?；趸谆?-萘-2-基-甲基]-氯化銨，其特征在于費(fèi)城-陰性骨髓增生綜合征是原發(fā)性血小板增多O
9.權(quán)利要求1的二乙基46-(4-羥基氨基甲?；?苯基氨基甲?；趸谆?-萘-2-基-甲基]-氯化銨，其特征在于費(fèi)城-陰性骨髓增生綜合征是原發(fā)性骨髓纖維化。
10.權(quán)利要求1的二乙基46-(4-羥基氨基甲?；?苯基氨基甲?；趸谆?_萘-2-基-甲基]-氯化銨，其特征在于費(fèi)城-陰性骨髓增生綜合征是繼發(fā)性骨髓纖維化。
11.權(quán)利要求1的二乙基46-(4-羥基氨基甲?；?苯基氨基甲酰基氧基甲基)-萘-2-基-甲基]-氯化銨，其特征在于它不與其它活性成分組合施用。
12.權(quán)利要求1的二乙基46-(4-羥基氨基甲?；?苯基氨基甲?；趸谆?_萘-2-基-甲基]-氯化銨，其特征在于它與至少一種其它細(xì)胞抑制活性成分組合施用。
全文摘要
本發(fā)明描述了能夠抑制組蛋白脫乙酰酶家族中的一種或多種酶的物質(zhì)(組蛋白脫乙酰酶抑制劑)在治療性治療費(fèi)城-陰性骨髓增生綜合征(真性紅細(xì)胞增多癥、原發(fā)性血小板增多或特發(fā)性骨髓纖維化)中的用途。上述物質(zhì)的劑量顯著低于治療其它腫瘤綜合征通常所用的劑量，并且可以是10至150mg/天/患者。
文檔編號(hào)A61P11/10GK102164638SQ200980138246
公開(kāi)日2011年8月24日 申請(qǐng)日期2009年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月29日
發(fā)明者倫巴迪 A, P·馬斯卡尼, T·奧爾多尼, T·巴爾布伊 申請(qǐng)人:意大利法爾馬科有限公司