專利名稱：有效抑制病毒感染的siRNA組合物及方法
有效抑制病毒感染的siRNA組合物及方法相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
本申請(qǐng)要求2008年12月11日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)61/121614的權(quán)益，其通過(guò)引用整體并入本文，包括所有的附圖、表格、氨基酸序列和核酸序列。
背景技術(shù)：
最近在家禽和人類中爆發(fā)的高致病性H5m禽流感病毒感染已經(jīng)引起關(guān)注，不遠(yuǎn)的將來(lái)可能發(fā)生大范圍流行的新型流感⑴?？紤]到H5m禽流感相關(guān)的死亡率高達(dá)45%到 8P/。(2,3)，以及現(xiàn)有疫苗和藥物療效有限⑷5)，開(kāi)發(fā)用于預(yù)防和治療禽流感H5W病毒感染的新策略迫在眉睫。H5m禽流感病毒屬于甲型流感病毒，是一種包膜的、負(fù)鏈RNA病毒。單鏈RNA病毒的獨(dú)特性質(zhì)使采用小干擾RNAs(siRNAs)作為抗禽流感預(yù)防劑和治療劑具有吸引力。siRNA 是雙鏈RNA，其反義鏈與RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)結(jié)合后，介導(dǎo)mRNA序列特異性的降解(6,7)。已報(bào)道針對(duì)H5W病毒的PA和NP基因的siRNA在培養(yǎng)的細(xì)胞中可以有效抑制病毒復(fù)制，并在小鼠模型中提供預(yù)防效果，但是不能提供任何顯著的治療效果(8,9)。因此，對(duì)于開(kāi)發(fā)基于RNA干擾的抗H5W劑來(lái)說(shuō)，迫切需要設(shè)計(jì)和鑒定更有效的siRNAs。

發(fā)明內(nèi)容
我們?cè)O(shè)計(jì)和鑒定了 25個(gè)候選siRNAs，其靶向H5W病毒基因PB1、PB2、PA、NP、M、 NS和HA的相對(duì)保守區(qū)。有意思的是，幾個(gè)與任何其他報(bào)道過(guò)的siRNAs (8_13)不同的有效 siRNAs包含新型基序(命名為“siRNA-m”)。與不含此基序的siRNAs (命名為“siRNA_n”)， 包括兩種已經(jīng)報(bào)道的在培養(yǎng)的細(xì)胞和體內(nèi)最有效的siRNAs (8,9)相比，這些siRNAs在細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定中顯示出較低的抗病毒效果，但是在被致死量高致病性流感病毒攻擊的小鼠模型中，出人意料地提供高得多的保護(hù)作用。并且，該強(qiáng)大的體內(nèi)保護(hù)效果可與該基序誘導(dǎo)的 β-防衛(wèi)素和IL-6的早期產(chǎn)生有關(guān)。因此提供了新型的病毒抑制劑。提供了新的篩選潛在抗病毒藥物的方法。還提供了制備有效的病毒抑制劑的方法，以及預(yù)防、抑制和治療病毒感染和增殖的方法。本發(fā)明提供下列技術(shù)方案
1. siRNA，其包含基序GGAGU或反向基序ACUCC。2.根據(jù)第 1 項(xiàng)(item)的 siRNA，其包含選自 SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 36 禾口 SEQ ID NO: 37 的序列。3.在對(duì)象中刺激IL-6產(chǎn)生的方法，其包括向所述對(duì)象施用有效量的如第1項(xiàng)所述的siRNA。4.在對(duì)象中刺激IL-6產(chǎn)生的方法，其包括向所述對(duì)象施用有效量的如第2項(xiàng)所述的siRNA。5.組合物，其包含如第1項(xiàng)所述的siRNA和藥學(xué)可接受的載體。
6.組合物，其包含如第2項(xiàng)所述的SiRNA和藥學(xué)可接受的載體。7.在對(duì)象中刺激IL-6產(chǎn)生的方法，其包括向所述對(duì)象施用有效量的如第5項(xiàng)所述的siRNA。8.在對(duì)象中刺激IL-6產(chǎn)生的方法，其包括向所述對(duì)象施用有效量的如第6項(xiàng)所述的siRNA。9.篩選潛在抗病毒劑的方法，其包括 獲得如第1項(xiàng)所述的siRNA;
在所述siRNA的抗病毒性質(zhì)可以被觀察的條件下，使所述siRNA與培養(yǎng)的細(xì)胞接觸；并將所述siRNA的任何抗病毒性質(zhì)與對(duì)照比較；其中顯示高于所述對(duì)照的抗病毒性質(zhì)的 siRNA被確定為潛在抗病毒劑。10.根據(jù)第9項(xiàng)的方法，其中所述對(duì)照為陰性對(duì)照或未處理的細(xì)胞培養(yǎng)物。11.根據(jù)第9項(xiàng)的方法，其中所述對(duì)照為陽(yáng)性對(duì)照。12.根據(jù)第11項(xiàng)的方法，其中所述陽(yáng)性對(duì)照為siRNA，其包含選自SEQ ID NO:3、 SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 36 和 SEQ ID NO: 37 的序列。13.篩選潛在抗病毒劑的方法，其包括 獲得一個(gè)根據(jù)第1項(xiàng)的siRNA ；
在所述siRNA的抗病毒性質(zhì)可以被觀察的條件下，將所述siRNA施用給動(dòng)物模型，并用病毒攻擊所述動(dòng)物；以及
測(cè)定所述siRNA是否在體內(nèi)顯示抗病毒性質(zhì)。14.根據(jù)第13項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括將所述siRNA的任何抗病毒性質(zhì)與對(duì)照比較；其中顯示高于所述對(duì)照的抗病毒性質(zhì)的siRNA被確定為潛在抗病毒劑。15.根據(jù)第14項(xiàng)的方法，其中所述對(duì)照為陰性對(duì)照或未處理的動(dòng)物。16.根據(jù)第14項(xiàng)的方法，其中所述對(duì)照為陽(yáng)性對(duì)照。17.根據(jù)第16項(xiàng)的方法，其中所述陽(yáng)性對(duì)照為siRNA，其包含選自SEQ ID N0:3、 SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 36 禾口 SEQ ID NO: 37 的序列。18.根據(jù)第9項(xiàng)的方法，其中所要觀察的抗病毒性質(zhì)為抗甲型流感病毒性質(zhì)。19.根據(jù)第9項(xiàng)的方法，其中所要觀察的抗病毒性質(zhì)為抗H5W病毒性質(zhì)。20.根據(jù)第10項(xiàng)的方法，其中所要觀察的抗病毒性質(zhì)為抗甲型流感病毒性質(zhì)。21.根據(jù)第10項(xiàng)的方法，其中所要觀察的抗病毒性質(zhì)為抗H5W病毒性質(zhì)。22.根據(jù)第11項(xiàng)的方法，其中所要觀察的抗病毒性質(zhì)為抗甲型流感病毒性質(zhì)。23.根據(jù)第11項(xiàng)的方法，其中所要觀察的抗病毒性質(zhì)為抗H5W病毒性質(zhì)。24.根據(jù)第12項(xiàng)的方法，其中所要觀察的抗病毒性質(zhì)為抗甲型流感病毒性質(zhì)。25.根據(jù)第12項(xiàng)的方法，其中所要觀察的抗病毒性質(zhì)為抗H5W病毒性質(zhì)。26.根據(jù)第13項(xiàng)的方法，其中所述病毒為甲型流感病毒。27.根據(jù)第13項(xiàng)的方法，其中所述病毒為H5W。28.根據(jù)第14項(xiàng)的方法，其中所述病毒為甲型流感病毒。29.根據(jù)第14項(xiàng)的方法，其中所述病毒為H5W。
30.根據(jù)第15項(xiàng)的方法，其中所述病毒為甲型流感病毒。31.根據(jù)第15項(xiàng)的方法，其中所述病毒為H5W。32.根據(jù)第16項(xiàng)的方法，其中所述病毒為甲型流感病毒。33.根據(jù)第16項(xiàng)的方法，其中所述病毒為H5W。34.根據(jù)第17項(xiàng)的方法，其中所述病毒為甲型流感病毒。35.根據(jù)第17項(xiàng)的方法，其中所述病毒為H5W。36.在對(duì)象中刺激β-防衛(wèi)素產(chǎn)生的方法，其包括向所述對(duì)象施用有效劑量的根據(jù)第1項(xiàng)的siRNA。37. 憤Φ束丨· 據(jù)第2項(xiàng)的siRNA。38.在對(duì)象中刺激防衛(wèi)素產(chǎn)生的方法，其包括向所述對(duì)象施用有效量的根據(jù)第5項(xiàng)的組合物。39.在對(duì)象中刺激防衛(wèi)素產(chǎn)生的方法，其包括向所述對(duì)象施用有效量的根據(jù)第6項(xiàng)的組合物。


圖1為siRNA靶序列位置的示意圖。25個(gè)siRNA針對(duì)所示的病毒基因，其包括4 個(gè)siRNAs-m (黑色箭頭)和21個(gè)siRNAs-n (白色箭頭)。兩個(gè)報(bào)道過(guò)的siRNAs (含向上對(duì)角線的箭頭)也進(jìn)行了標(biāo)示。圖2圖解地描述了在血清樣本中檢測(cè)siRNA-m刺激的先天免疫應(yīng)答。(a) IFN- α 應(yīng)答的檢測(cè)。(b) IFN-γ應(yīng)答的檢測(cè)。(c) TNF-α應(yīng)答的檢測(cè)。(d) IL-6應(yīng)答的檢測(cè)。標(biāo)示的小鼠血清樣本中的細(xì)胞因子的檢測(cè)如圖6的注釋所述進(jìn)行。圖3表示在細(xì)胞培養(yǎng)中抑制H5W甲型流感病毒的有效siRNAs的篩選。(a)25個(gè) siRNAs在細(xì)胞培養(yǎng)中的抗病毒效果。MDCK細(xì)胞用化學(xué)合成的siRNAs轉(zhuǎn)染12小時(shí)，然后用 IOOTCId50的H5m A/Vietnam/1194/04病毒株感染48小時(shí)。收集細(xì)胞上清液進(jìn)行RT-PCR 來(lái)檢測(cè)病毒RNA拷貝。12個(gè)siRNAs (包括新設(shè)計(jì)的4個(gè)siRNAs-m (黑色)和6個(gè)siRNAs-n (白色)，以及2個(gè)之前報(bào)道有效的陽(yáng)性對(duì)照siRNA O^9))顯示超過(guò)75%的抑制效果，用虛線標(biāo)示。(b)所選擇的siRNAs-m和siRNAs-n的序列以及獨(dú)特基序的鑒定。siRNAs-m中鑒定的序列基序在正鏈(F)中用下劃線標(biāo)示，在負(fù)鏈(R)中用框標(biāo)示。對(duì)小RNAPB2-U91中的基序也進(jìn)行了強(qiáng)調(diào)。圖4圖解地描述了 siRNAs-m和siRNAs-n的體內(nèi)抗病毒效果的評(píng)價(jià)。(a)、(b)、 (c)和(d)評(píng)價(jià)4對(duì)分別靶向病毒PB1、PB2、PA和NP基因的siRNAs—m禾口 siRNAs-n的預(yù)防效果。小鼠氣管內(nèi)(i. t.)施用一個(gè)劑量的100、50或25Pg (括號(hào)內(nèi)標(biāo)明)siRNAs-m或 siRNAs-n, 16-18小時(shí)后進(jìn)行病毒攻擊。給予對(duì)照小鼠(對(duì)照)PBS和/或PEG8-PEI1. 8。監(jiān)測(cè)生存率、體重和一般狀況至21天或直到死亡前。(e)、(f)、(g) (h)和(j)監(jiān)測(cè)siRNA-m 和siRNA-n處理的小鼠體重。監(jiān)測(cè)這些小鼠的體重21天或直到死亡。(i)評(píng)價(jià)siRNA-m和 siRNA-n的治療效果。小鼠被病毒攻擊后M小時(shí)，鼻內(nèi)(i. n.)給予4個(gè)劑量的ΝΡ-1122 (siRNA-m)或NP-1496 (siRNA-n)。給予對(duì)照小鼠(對(duì)照)PEG8-PEI1. 8。監(jiān)測(cè)生存率、體重和一般狀況21天或直到死亡前。
圖5表示在用siRNAs-m和siRNAs-n處理的小鼠肺部中病毒復(fù)制和組織損傷的檢測(cè)。攻擊后的第6天從用siRNAs-m (黑色)或siRNAs-n (白色)處理的小鼠獲取肺部組織。 給予對(duì)照小鼠(對(duì)照)PEG8-PEI1. 8。(a)小鼠肺部組織的病毒滴度的檢測(cè)。通過(guò)TCID5tl確定肺部樣品病毒滴度。檢測(cè)限為1:10，用虛線標(biāo)示。(b)小鼠肺部組織中病毒RNA拷貝的檢測(cè)。通過(guò)實(shí)時(shí)RT-PCR測(cè)量病毒RNA拷貝。(c)肺部組織中組織病理學(xué)的檢測(cè)。肺部組織典型的組織切片用H&E染色(原始放大倍數(shù)100X)。在此放大倍數(shù)下，可見(jiàn)炎癥浸潤(rùn)和肺泡損傷為肺泡隔加厚，伴有部分肺泡腔的消失。圖6研究獨(dú)特基序在體內(nèi)抗病毒效果的效力方面的作用。(a)所選擇的siRNA-m (PA-2109)和在不同H5m病毒株中相應(yīng)區(qū)的序列。通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)一個(gè)錯(cuò)配核苷酸 (nt)(粗體)。(b) siRNA-m在細(xì)胞培養(yǎng)中的交叉株抗病毒效果。使用實(shí)時(shí)RT-PCR通過(guò)測(cè)量感染后48小時(shí)收集的培養(yǎng)上清液中病毒RNA拷貝來(lái)檢測(cè)PA-2109針對(duì)完全匹配的病毒株A/Vietnam/1194/2004 (VN)以及不完全匹配的病毒株A/Shenzhen/406H (SZ)和 A/Hong Kong/156/97 (HK)的抗病毒效果。結(jié)果表示為與它們未處理的對(duì)照相比，siRNAs-m針對(duì)不同病毒株的抑制率。(c)和(d)在分別用不完全匹配的病毒株攻擊的動(dòng)物中評(píng)價(jià)siRNA-m 的交叉保護(hù)作用。給予小鼠一個(gè)劑量的25Pg PA-2109，并在處理后16-18小時(shí)，分別用10 LD50的A/Shenzhen/406H和A/Hong Kong/156/97攻擊。(e)含有該基序的小RNA的體內(nèi)抗病毒效果。給予小鼠一個(gè)劑量的PB2-1291 (根據(jù)一般接受的標(biāo)準(zhǔn)其不是最優(yōu)化的siRNA， 但是包含該基序)，然后在16-18小時(shí)后用H5m病毒株A/Vietnam/1194/2004感染。給予這些試驗(yàn)(c，d和e)的對(duì)照小鼠(對(duì)照)PEG8-PEI1. 8。監(jiān)測(cè)存活率、體重和一般狀況21天或直到死亡。圖7圖解地描述了在肺部組織中siRNA-m刺激的先天免疫應(yīng)答的檢測(cè)。(a) IFN-α應(yīng)答的檢測(cè)。(b) IFN-Y應(yīng)答的檢測(cè)。(c)TNF_a應(yīng)答的檢測(cè)。(d)IL_6應(yīng)答的檢測(cè)。(e)不同時(shí)間點(diǎn)IL-6應(yīng)答的檢測(cè)。(f)接受不同劑量siRNA-m的小鼠中IL-6應(yīng)答的檢測(cè)。(g)在用siRNA-m的正義和反義鏈處理的小鼠中IL-6應(yīng)答的檢測(cè)。(h)在用另外一種siRNA-m (PA-2109)處理的小鼠中IL-6應(yīng)答的檢測(cè)。小鼠氣管內(nèi)施用一個(gè)劑量的100 Pg或所示量的siRNA-m (PB2-719)或所示的siRNAs及其對(duì)照。在處理后7小時(shí)或所示的時(shí)間點(diǎn)收集肺部樣本。用ELISA檢測(cè)肺部樣本中所示的細(xì)胞因子。這些細(xì)胞因子的檢測(cè)限用虛線標(biāo)示。#與其他處理相比/7 < 0.005，*與其他處理相比/^ < 0.05。圖8圖解地描述了在肺部組織中siRNA-m刺激的β -防衛(wèi)素_4應(yīng)答的檢測(cè)。(a) siRNAs-m (PB2-719 和 PA-2109)和 siRNAs-n (PB2-696 和 PA-2087)刺激的 β -防衛(wèi)素 _4 (β -D-4)應(yīng)答的檢測(cè)。(b)用siRNA-m (PB2-719)的正義和反義鏈處理的小鼠中β _D_4 應(yīng)答的檢測(cè)。(c)不同時(shí)間點(diǎn)應(yīng)答的檢測(cè)。(d)用不同劑量siRNA-m (PB2-719) 給予的小鼠中β -D-4應(yīng)答的檢測(cè)。(e)用siRNAs-m (PB2-719和PA-2109)和siRNAs-n (PB2-696和PA-2087)處理的小鼠肺部組織中i3_D_4產(chǎn)生的檢測(cè)。肺部組織的代表性組織切片用被合成的β-D-4多肽免疫的兔抗血清染色或正常兔血清染色(未染色)(原始放大倍數(shù)100Χ)。小鼠氣管內(nèi)施用一個(gè)劑量的100 Pg或所示劑量的siRNAs-m或所示劑量的 siRNAs-n及其對(duì)照(PEG/PEI和PBS)。在處理后7小時(shí)或所示的時(shí)間點(diǎn)收集肺部樣本。** 與其他處理相比/7 < 0.005，*與其他處理相比/7 < 0.05。圖9圖解地描述了 β -防衛(wèi)素-4體外(ex vivo)和體內(nèi)抗病毒效果的評(píng)價(jià)。(a)細(xì)胞培養(yǎng)中β-防衛(wèi)素-4 (i3-D_4)體外抗病毒效果的評(píng)價(jià)。所示濃度的i3-D-4加入到 MDCK細(xì)胞中，然后用100 TCID5tl的H5m A/Vietnam/1194/04株感染細(xì)胞48小時(shí)。收集細(xì)胞上清液用于噬菌斑測(cè)定來(lái)檢測(cè)釋放的病毒滴度。感染率定義為3-D-4處理的細(xì)胞培養(yǎng)物的病毒滴度相比未處理的細(xì)胞培養(yǎng)物的病毒滴度。(b) i3-D-4在H5W病毒感染的小鼠模型中體內(nèi)抗病毒效果的評(píng)價(jià)。小鼠鼻內(nèi)施用一個(gè)劑量的75 μg或?qū)φ盏鞍?，然?br> 用10 LD50的H5m A/Vietnam/1194/04株攻擊。監(jiān)測(cè)存活率、體重和一般狀況21天或直到死亡。
3]序列f 述SEQIDNO:1為siRNA-n〃PBl-666〃的正向序列SEQIDNO:2為siRNA-n〃PBl-788〃的正向序列SEQIDNO:3為siRNA-m〃PBl-797〃的正向序列SEQIDNO:4為siRNA-n〃PBl-1688〃的正向序列SEQIDNO:5為siRNA-n〃PBl-1780〃的正向序列SEQIDNO:6為siRNA-n〃PBl-696〃的正向序列SEQIDNO:7為siRNA-m〃PB2-719〃的正向序列SEQIDNO:8為siRNA-n〃PB2-1558〃的正向序列SEQIDNO:9 為 siRNA-n〃PB2-18318〃 的正向序列SEQIDNO:10為siRNA-n〃PA-209〃的正向序列SEQIDNO:11為siRNA-n〃PA-;359〃的正向序列SEQIDNO:12為siRNA-n"PA-2036"的正向序列SEQIDNO:13為報(bào)道的siRNA〃PA-2087〃的正向序列SEQIDNO:14為siRNA-m〃PA-2109〃的正向序列SEQIDNO:15為siRNA-n"NP-321〃的正向序列SEQIDNO:16為siRNA-m"NP-1122"的正向序列SEQIDNO:17為siRNA-n〃NP-1178"的正向序列SEQIDNO:18為報(bào)道的siRNA〃NP-1496〃的正向序列SEQIDNO:19為siRNA-n〃HA-869"的正向序列SEQIDNO:20為siRNA-n〃HA-855"的正向序列SEQIDNO:21為siRNA-n〃M-97〃的正向序列SEQIDNO:22為siRNA-n〃M-101〃的正向序列SEQIDNO:23為siRNA-n〃M-925〃的正向序列SEQIDNO:24為siRNA-n〃NS-338"的正向序列SEQIDNO:25為siRNA-n〃NS-604〃的正向序列SEQIDNO:26為siRNA-n〃NS-677"的正向序列SEQIDNO:27為siRNA-n〃NS-782"的正向序列SEQIDNO:28為siRNA-m〃PBl-797〃 的反向序列SEQIDNO:29為siRNA-n〃PBl-788〃 的反向序列SEQIDNO:30為siRNA-m〃PB2-719〃 的反向序列SEQIDNO:31為siRNA-n〃PB2-696〃 的反向序列SEQ ID NO:32 為 siRNA-m〃PA_2109〃 的反向序列 SEQ ID NO:33為報(bào)道的siRNA〃PA_2087〃的反向序列 SEQ ID NO:34 為 siRNA-m"NP-1122"的反向序列 SEQ ID NO:35為報(bào)道的siRNA〃NP_1496〃的反向序列 SEQ ID NO:36 為小 RNA〃PB2_U91〃 的正向序列 SEQ ID N0:37 為小 RNA〃PB2-1291〃 的反向序列。
具體實(shí)施例方式我們已發(fā)現(xiàn)了在體內(nèi)能夠有效抑制H5W甲型流感病毒感染的siRNAs共同具有的一個(gè)獨(dú)特基序。使用公認(rèn)的高毒性人H5m病毒株A/Vietnam/1194/04 (17)感染的小鼠模型，我們證明siRNAs-m具有有效的體內(nèi)保護(hù)效果。關(guān)于預(yù)防作用，即使給予動(dòng)物低達(dá)25 μ g 的siRNAs-m，它們?nèi)匀豢梢酝耆Ｗo(hù)試驗(yàn)動(dòng)物(100%存活率)免于H5W病毒的致死攻擊， 而siRNAs-n，其包括兩條已經(jīng)報(bào)道能夠完全保護(hù)小鼠免于幾種其他流感病毒株致死攻擊的siRNAs⑼，即使動(dòng)物被給予100 μ g的siRNAs-n，它們也對(duì)動(dòng)物提供很少或沒(méi)有保護(hù)作用 (圖4a、b、c和d)。關(guān)于治療，我們的研究表明60%的在病毒攻擊后對(duì)小時(shí)接受siRNA-m 的動(dòng)物存活，但是所有給予siRNA-n的小鼠均死亡(圖4i )。這是至今報(bào)道的由siRNAs介導(dǎo)的最好的治療效果(8,18,19)，很可能的是通過(guò)遞送系統(tǒng)、施用途徑和siRNAs-m劑量的常規(guī)優(yōu)化可以獲得甚至更好的效果。此外，siRNAs-m針對(duì)兩種不完全匹配的H5W病毒株的致死攻擊可以提供全面的交叉保護(hù)(圖6c和6d)，表明siRNAs-m甚至可以成為能夠靶向突變病毒?？紤]到甲型流感病毒的快速突變，這些siRNAs-m可以是高效的預(yù)防和治療劑。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“分離的”分子(例如，分離的核酸分子)指實(shí)質(zhì)上不含其它細(xì)胞物質(zhì)，或通過(guò)重組技術(shù)產(chǎn)生時(shí)實(shí)質(zhì)上不含培養(yǎng)基，或通過(guò)化學(xué)合成時(shí)實(shí)質(zhì)上不含化學(xué)前體或其他化學(xué)物質(zhì)的分子。另外，分離的分子，例如核酸分子，如果其借助人類活動(dòng)處于與其在自然界中發(fā)現(xiàn)時(shí)不同的條件、背景或成分中，則也認(rèn)為是“分離的”。如本文所使用的，SiRNA的“有效量”是SiRNA體外(例如先體外后體內(nèi))或體內(nèi)施用時(shí)，有效地在細(xì)胞內(nèi)帶來(lái)期望的生理變化的量。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“治療有效量”指在研究人員、獸醫(yī)、醫(yī)生或其他醫(yī)師嘗試的細(xì)胞(例如組織)中引發(fā)生物學(xué)或醫(yī)學(xué)應(yīng)答(其中包括減輕和/或預(yù)防和/或抑制所治療的疾病或病癥的癥狀)的單獨(dú)siRNA或與另一種根據(jù)本發(fā)明的具體方面的試劑組合的量。本發(fā)明的各種方法可以包括涉及與“合適的對(duì)照”(指本文中可互換的“適當(dāng)?shù)膶?duì)照”)比較數(shù)值、水平、特征、特點(diǎn)、性質(zhì)等的步驟。“合適的對(duì)照”或“適當(dāng)?shù)膶?duì)照”指本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的用于比較目的的任何對(duì)照或標(biāo)準(zhǔn)。在一個(gè)實(shí)施方式中，“合適的對(duì)照” 或“適當(dāng)?shù)膶?duì)照”是如本文所述在進(jìn)行RNAi方法學(xué)之前確定的數(shù)值、水平、特征、特點(diǎn)、性質(zhì)等。例如，在將本發(fā)明的siRNA引入細(xì)胞或生物體之前可以確定轉(zhuǎn)錄速率、mRNA水平、翻譯速率、蛋白水平、生物活性、細(xì)胞特點(diǎn)或性質(zhì)、基因型、表型等。在另外一個(gè)實(shí)施方式中，“合適的對(duì)照”或“適當(dāng)?shù)膶?duì)照”是細(xì)胞或生物體內(nèi)確定的數(shù)值、水平、特征、特點(diǎn)、性質(zhì)等，例如對(duì)照或正常細(xì)胞或生物體顯示出的例如正常特征。在還另一個(gè)實(shí)施方式中，“合適的對(duì)照” 或“適當(dāng)?shù)膶?duì)照”是預(yù)先確定的數(shù)值、水平、特征、特點(diǎn)、性質(zhì)等。病毒減少(抑制)導(dǎo)致病毒量(viral load)降低(或抑制)。例如，在細(xì)胞培養(yǎng)中，通過(guò)施用SiRNA產(chǎn)生的病毒抑制導(dǎo)致病毒量相比未處理的細(xì)胞培養(yǎng)物的降低。抑制可以是部分的。優(yōu)選的抑制程度為至少50%，更優(yōu)選為至少60%、70%、80%、85%或90%之一，以及最優(yōu)選在90%到100%之間。術(shù)語(yǔ)“處理”和“治療”在本文中可互換地使用，并且如本文使用，包括預(yù)防和應(yīng)答處理，可以是急性短期或慢性長(zhǎng)期，以及表示患者中病毒感染的抑制或改善?！盎颊摺卑▌?dòng)物，其包括人。術(shù)語(yǔ)“治療有效的”意思是治療劑(siRNA)的量是足夠抑制或改善病毒感染癥狀的量。RNA 干擾
RNAi是雙鏈RNA (dsRNA，本文也稱作siRNAs或ds siRNAs，指雙鏈小干擾RNAs)在動(dòng)物和植物細(xì)胞中誘導(dǎo)靶向的單鏈RNA序列特異性降解的高效過(guò)程(Hutvagner和Zamore， Curr. Opin. Genet. Dev. 12， 225—232 (2002) ； Sharp, Genes Dev. , 15:485—490 (2001))。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，RNAi可以被小干擾RNA(siRNA)的21個(gè)核苷酸(nt)的雙鏈體引發(fā)(Chiu等人，Mol. Cell. 10:549-561 (2002) ； Elbashir等人，Nature 411:494-498
(2001))，或被微RNAs(miRNA),功能性小發(fā)夾RNA (shRNA),或其他可使用DNA模板用 RNA聚合酶III啟動(dòng)子在體內(nèi)表達(dá)的dsRNAs引發(fā)(Zeng等人，Mol Cell 9:1327-1333
(2002)； Paddison等人，Genes Dev 16:948—958 (2002) ； Lee等人，Nature Biotechnol 20:500-505 (2002) ； Paul 等人，Nature Biotechnol 20:505-508 (2002) ； Tuschl, Τ. , Nature Biotechnol 20:440-448 (2002) ； Yu 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(9) :6047-6052 (2002) ； McManus 等人，RNA 8:842-850 (2002) ； Sui 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(6) :5515-5520 Q002))，其中各個(gè)通過(guò)整體引用而并入本文?？茖W(xué)文獻(xiàn)包括很多使用SiRNA沉默內(nèi)源性或外源性基因表達(dá)的報(bào)道，突出了它們的治療潛力(GuptEi, S.等人，PNAS, 2004，101:1927-1932; Takaku, H. Antivir Chem. Chemother, 2004, 15:57-65; Pardridge, W. Μ. Expert Opin. Biol. Ther., 2004, 4:1103-1113; Zheng, B.J. Antivir. Ther., 2004，9:365-374; Shen, W. G. Chin. Med. J. (Engl), 2004，117:1084-1091; Fuchs, U. ^A, Curr. Mol. Med., 2004，4:507-517; ffadhwa, R.等人，Mutat. Res. , 2004，567:71-84; Ichim, Τ. E.等人，Am. J. Transplant, 2004，4:1227—1236; Jana, S.等人，App 1. Microbiol. Biotechnol., 2004，65:649—657; Ryther, R. C.等人，Gene Ther. , 2005，12:5—11; Chae, S-S.等人，J. Clin. Invest.，2004，114:1082-1089; Fougerolles, A.等人， Methods Enzymol. , 2005, 392:278-296)，其中各個(gè)通過(guò)整體引用而并入本文。通過(guò)全身施用siRNAs治療性沉默內(nèi)源基因已在文獻(xiàn)中描述((Kim B.等人，American Journal of Pathology, 2004，165:2177-2185; Soutschek J.等人，Nature, 2004，432:173-178; Pardridge W. Μ. , Expert Opin. Biol. Ther. , 2004，July, 4 (7) : 1103-1113)，)其中各個(gè)通過(guò)整體引用而并入本文。相應(yīng)地，本發(fā)明包括針對(duì)病毒、甲型流感病毒尤其是H5W病毒的這種干擾RNA分子。干擾RNA可以是雙鏈siRNA。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)理解并且如本文進(jìn)一步解釋，siRNA 分子也可以包括短3，DNA序列?？蛇x地，核酸可以是DNA (通常是雙鏈DNA)，在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄時(shí)，其產(chǎn)生具有兩個(gè)互補(bǔ)區(qū)通過(guò)間隔區(qū)連接的RNA，以使當(dāng)互補(bǔ)部分相互雜交時(shí)，該RNA形成發(fā)夾形式。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，發(fā)夾結(jié)構(gòu)可以通過(guò)Dicer酶從分子中切除，產(chǎn)生兩個(gè)不同的但是雜交的RNA分子。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了干擾RNA，其當(dāng)其被適合地引入可被病毒攻擊的細(xì)胞或在其中表達(dá)時(shí)，能夠通過(guò)RNAi來(lái)抑制病毒載荷表達(dá)，其中干擾RNA—般針對(duì)病毒。優(yōu)選地，干擾RNA序列在大約19到23個(gè)核苷酸范圍內(nèi)。例如，在那些利用shRNA的實(shí)施方式中，shRNA針對(duì)病毒的部分優(yōu)選在大約19到23個(gè)核苷酸范圍內(nèi)。如本文所解釋，在本發(fā)明所述方法中所使用的干擾RNA和靶病毒序列之間的完全同一性/互補(bǔ)性雖然有時(shí)是優(yōu)選的，但不是必須的。相應(yīng)地，與靶病毒序列相比，干擾RNA 可以包括一些錯(cuò)配。siRNA 分子
短干擾RNAs (siRNAs)誘導(dǎo)由RNAi過(guò)程引起的序列特異性抑制或沉默基因(例如減少表達(dá)，可以是部分或完全抑制的程度)。因此，siRNA發(fā)揮RNAi過(guò)程的效應(yīng)分子的作用。發(fā)揮病毒抑制劑作用的siRNA分子可以是化學(xué)合成，或可以在體外從DNA模板轉(zhuǎn)錄，或在體內(nèi)從例如shRNA轉(zhuǎn)錄。dsRNA分子可以使用現(xiàn)有技術(shù)已知的任何方法設(shè)計(jì)，例如通過(guò)使用下列方法
1.使用現(xiàn)有技術(shù)任何已知方法，將潛在目標(biāo)與適當(dāng)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(人類、小鼠、大鼠等)進(jìn)行比較，并排除任何與其他編碼序列具有顯著同源性的靶序列。已知的這樣一種序列同源性搜索的方法是BLAST，可美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院的國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站得到。NCBI網(wǎng)站上還可利用的是HomoloGene數(shù)據(jù)庫(kù)，該數(shù)據(jù)庫(kù)是公眾可利用的系統(tǒng)，用于自動(dòng)檢測(cè)幾個(gè)完全測(cè)序的真核基因組中注解的基因之間的同源基因，并且是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易使用的。2.選擇一個(gè)或多個(gè)符合你的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的序列。關(guān)于siRNA的設(shè)計(jì)和使用的進(jìn)一步的一般信息可見(jiàn)于“!"he siRNA User Guide”，在洛克菲勒大學(xué)Dr. Thomas Tuschl的實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)站可得到(Elbashir 等人，EMBO J. , 2001, 20:6877-6888)。3.陰性對(duì)照siRNAs優(yōu)選具有與所選擇的siRNA相同的核酸組成，但是與相應(yīng)的基因組沒(méi)有顯著的序列互補(bǔ)性。這些陰性對(duì)照可以通過(guò)隨機(jī)打亂所選擇的siRNA的核苷酸序列進(jìn)行設(shè)計(jì)；可以進(jìn)行同源性搜索以保證陰性對(duì)照與相應(yīng)的基因組中任何其他基因缺乏同源性。另外，陰性對(duì)照siRNAs有時(shí)可以通過(guò)向序列中引入一個(gè)或多個(gè)堿基錯(cuò)配來(lái)設(shè)計(jì)。最初，定義了鑒定有效siRNA的基本標(biāo)準(zhǔn)，例如mRNA內(nèi)容中靶序列GC含量和組成(Elbashir SM.等人，Methods, 2002,洸199-213)。最近獲得了進(jìn)一步的進(jìn)展， RNAi酶復(fù)合物的組裝被描述為取決于siRNA的熱力學(xué)特征(Khrvorova Α.等人，Cell, 2003，115:209-216; khwarz D. S.等人，Cell, 2003，115:199-208)。確定雙鏈體兩端的相對(duì)穩(wěn)定性，對(duì)于單個(gè)鏈進(jìn)入RNAi途徑的程度有影響。另外，報(bào)道了在siRNA的確定位點(diǎn)的某些序列基序能夠影響其效力(Amarzguioui M.和H. Prydz, Biochem. Biophys. Res. Commun. , 2004，316:1050—1058; Reynolds Α·等人，Nature Biotechnol. , 2004， 22:326-330)o在此基礎(chǔ)上，開(kāi)發(fā)了復(fù)雜算法來(lái)增加siRNA設(shè)計(jì)的成功率，并且這些方法對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是可以獲得的(Amarzguioui Μ.和H. Prydz, 2004; Reynolds Α.等人，2004;以及 Ui-iTei K.等人，Nucl Acids Res.，2004，32:936-948，其中各個(gè)均通過(guò)引用整體并入本文)。其他可以用于選擇本發(fā)明siRNAs的計(jì)算工具包括在麻省劍橋的生物醫(yī)藥研究白頭研究所(Whitehead Institute)的生物信息學(xué)研究組開(kāi)發(fā)的白頭siRNA選擇網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器，以及 Yuan, B.等人("siRNA Selection Server: an automated siRNA oligonucleotide prediction server", Nucleic Acids Research, 2004, Vol. 32, W130-W134, Web Server issue) 禾口 Bonetta L. ("RNAi: Silencing never sounded better”，Nature Methods, October, 2004, 1 (1) :79-86)中公開(kāi)的其他工具，其中各個(gè)均通過(guò)引用整體并入本文。如本文所述，不同siRNAs的效果可能有顯著差異。但是，存在有效干擾RNA的合理設(shè)計(jì)策略(Gong D.和 J. E. Ferrell Jr. , TRENDS in Biotechnology, 2004，22(9):451; Schubert S.等人，J. Mol. Biol. , 2005, 348:883-893; Pancoska P.等人，Nucleic Acids Research, 2004， 32(4) :1469-1479; Mittal V. , Nat. Rev. Genet. , 2004， 5(5) :355-365,其中各個(gè)均通過(guò)引用整體并入本文)。可以進(jìn)行使用細(xì)胞培養(yǎng)篩選最有效的siRNAs。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了幾種基于使用siRNA 混合物的體外篩選方法，混合物中可含有特別有效的siRNA (或者幾種)。這些方法包括使用foiaseIII或Dicer酶來(lái)消化較長(zhǎng)的雙鏈RNAs，例如BLOCK-IT產(chǎn)物，來(lái)制備siRNA混合物(INVITR0GEN，Carlsbad CA) (Yang D.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002， 99:9942-9947; Myers J. W.等人，Nat. Biotechnol. , 2003，21:324-328)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這些消化產(chǎn)生的短RNAs在RNAi中是有效的。寡核苷酸陣列也可用于有效制備siRNAs的確定混合物，以減少外源和內(nèi)源基因例如I3KO1的表達(dá)(Oleinikov Α. V.等人，Nucleic Acids Research, 2005， 33(10):e92)。本發(fā)明的病毒抑制劑可以包括現(xiàn)有技術(shù)中已知的未修飾的siRNAs和修飾的 siRNAs.因此，本發(fā)明包括siRNA衍生物，其包括具有兩條互補(bǔ)鏈核酸的siRNA，以使兩條鏈交聯(lián)。例如，其中一條鏈的3’ OH端可以被修飾，或者兩條鏈可以交聯(lián)并在3’ OH端修飾。 siRNA衍生物可以包含單交聯(lián)(例如，補(bǔ)骨脂素交聯(lián))。在一些實(shí)施方式中，siRNA衍生物在其3’端具有生物素分子(例如，可以光裂解的生物素)、多肽(例如，Tat多肽)、納米顆粒、擬肽、有機(jī)化合物(例如，染料，如熒光染料)，或樹(shù)狀高分子。用這種方式修飾siRNA衍生物可以改善所產(chǎn)生的siRNA衍生物與相應(yīng)siRNA相比的細(xì)胞吸收或增強(qiáng)細(xì)胞靶向活性，可以用于在細(xì)胞中追蹤siRNA衍生物，或提高siRNA衍生物相比相應(yīng)siRNA的穩(wěn)定性。本發(fā)明的病毒抑制劑可以不偶聯(lián)或可以偶聯(lián)到另一個(gè)部分，例如納米顆粒，以增強(qiáng)組合物的性質(zhì)，例如藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，例如吸收、有效性、生物可利用度和/或半衰期。偶聯(lián)可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法實(shí)現(xiàn)，例如使用Lambert等人，Drug Deliv. Rev. 47(1) 99-112 (2001)(描述了將核酸負(fù)載至聚氰基丙烯酸烷酯(PACA)納米顆粒)；！^attal等人， J. Control Release 53(1-3):137-43 (1998)(描述了核酸結(jié)合納米顆粒)；khwab 等人，Ann. Oncol. 5 Supp 1. 4:55-8 (1994)(描述了核酸連接到嵌入劑、疏水基團(tuán)、多聚陽(yáng)離子或PACA納米顆粒)；以及Godard等人，Eur. J. Biochem. 232(2) :404-10 (1995) (描述了核酸連接到納米顆粒)所描述的方法。本發(fā)明的病毒抑制劑還可以使用任何本領(lǐng)域已知方法進(jìn)行標(biāo)記，例如核酸可以用熒光團(tuán)，例如Cy3、熒光素或羅丹明標(biāo)記?？梢允褂脛┖羞M(jìn)行標(biāo)記，例如SILENCER siRNA標(biāo)記劑盒(AMBION)。另外，siRNA可以被放射性標(biāo)記，例如使用3H、32P或其他適當(dāng)?shù)耐凰?。因?yàn)镽NAi被認(rèn)為是通過(guò)至少一個(gè)單鏈RNA中間體進(jìn)行加工，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)理解ss-siRNAs (例如ds-siRNA的反義鏈)也可以如本文所述進(jìn)行設(shè)計(jì)，并根據(jù)要求保護(hù)的方法學(xué)使用。有大量公司生產(chǎn)針對(duì)特定基因的干擾RNAs。Thermo Electron Corporation (ffaltham, MA)已經(jīng)開(kāi)展了客戶合成服務(wù)用于合成短干擾RNA (siRNA)。每條鏈由18-20 個(gè)RNA堿基和在3’端突出的兩個(gè)DNA堿基組成。Dharmacon, Inc. (Lafayette, CO)使用 2’-ACE RNA合成技術(shù)提供siRNA雙鏈體。Qiagen (Valencia, CA)使用TOM-化學(xué)法提供 siRNA，具有高的個(gè)體偶聯(lián)產(chǎn)率(Li, B.等人，Nat. Med. , 2005，11(9)，944-951)。用于長(zhǎng)期表達(dá)的siRNA遞送
合成的siRNA可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法遞送到細(xì)胞內(nèi)，例如包括陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染(例如LIP0FECTAMINE 2000試劑)和電穿孔。但是這些外源siRNA通常顯示短期持續(xù)的沉默效果(在培養(yǎng)的細(xì)胞中4到5天)，在某些實(shí)施方式中可能是有益的。為了獲得對(duì)病毒表達(dá)的長(zhǎng)期抑制并為了促進(jìn)某些環(huán)境下的遞送，一種或更多種siRNA雙鏈體，例如H5W ds siRNA-m可以在細(xì)胞內(nèi)從重組DNA構(gòu)建體表達(dá)(Mchtyre G. J.和G. C. Fanning, BMC Biotechnology, 2006, 6:1-8)。這些在細(xì)胞內(nèi)從重組DNA構(gòu)建體表達(dá)siRNA雙鏈體以使得在細(xì)胞內(nèi)對(duì)靶基因長(zhǎng)期抑制的方法在本領(lǐng)域中是已知的，其包括哺乳動(dòng)物Pol III啟動(dòng)子系統(tǒng)(例如，Hl或TO/snRNA啟動(dòng)子系統(tǒng)(Tuschl (2002),如上)能夠表達(dá)功能性雙鏈 si RNAs; (Bagella 等人，J. Cell. Physiol. 177:206-213 (1998) ； Lee 等人，(2002)， 如上；Miyagishi 等人，(2002)，如上；Paul 等人，(2002)，如上；忉等人，(2002)， 如上；Sui等人，(2002)，如上)。RNA Pol III轉(zhuǎn)錄終止發(fā)生在運(yùn)行到DNA模板中4個(gè)連續(xù)T堿基處，提供了在特定序列處終止siRNA轉(zhuǎn)錄的機(jī)制。siRNA在5’-3’和3’-5’方向與靶基因序列互補(bǔ)，siRNA的兩條鏈可以在同一個(gè)構(gòu)建體或分開(kāi)的構(gòu)建體中表達(dá)。Hl或 U6 snRNA啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的發(fā)夾siRNA可以在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，并可抑制靶基因表達(dá)(Bagella等人，(1998)，如上；Lee 等人，(2002)，如上；Miyagishi 等人，(2002)，如上；Paul 等人，(2002)，如上；Yu等人，(2002)，如上；Sui等人，(2002)，如上)。當(dāng)與表達(dá) T7 RNA聚合酶的載體共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)時(shí)，含有在T7啟動(dòng)子控制下的siRNA序列的構(gòu)建體也可以產(chǎn)生功能性siRNAs (Jacque (2002),如上)。單個(gè)構(gòu)建體可以含有多個(gè)編碼siRNAs 的序列，例如病毒RNA的多個(gè)區(qū)域，以及例如可以被分離的Pol III啟動(dòng)子位點(diǎn)驅(qū)動(dòng)。動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)一系列的大約22個(gè)核苷酸的非編碼RNAs，稱作微RNA(miRNA)，可以在動(dòng)物發(fā)育過(guò)程中在轉(zhuǎn)錄后水平或翻譯水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)。miRNAs的一個(gè)共同特征是它們均從大約70個(gè)核苷酸前體RNA莖-環(huán)切割，可以是被一種III型核糖核酸酶Dicer酶或其同源物消化。通過(guò)使用與靶mRNA互補(bǔ)的miRNA序列替換miRNA前體的莖部序列，可以使用表達(dá)新型miRNA的載體構(gòu)建體產(chǎn)生siRNAs以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中啟動(dòng)針對(duì)特定mRNA靶標(biāo)的 RNAiCZeng (2002),如上)。當(dāng)被含有聚合酶III啟動(dòng)子的DNA載體表達(dá)時(shí)，微RNA產(chǎn)生的發(fā)夾結(jié)構(gòu)可以沉默基因表達(dá)(McManus (2002),如上)。病毒介導(dǎo)的遞送機(jī)制也可以通過(guò)表達(dá)siRNA用于誘導(dǎo)靶基因的特異性沉默，例如通過(guò)產(chǎn)生含有在RNA Pol II啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄控制下的siRNA的重組腺病毒(Xia等人，000 ，如上)。這些重組腺病毒感染HeLa細(xì)胞使得減少的內(nèi)源靶基因表達(dá)。將重組腺病毒載體注射進(jìn)表達(dá)siRNA靶基因的轉(zhuǎn)基因小鼠中引起在體內(nèi)靶基因表達(dá)的減少。在動(dòng)物模型中，全胚胎電穿孔可以有效將合成的siRNA遞送到移植后的小鼠胚胎中(Calegari 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(22) :14236-40(2002))。在成年小鼠中，siRNA的有效遞送可以通過(guò)“高壓”遞送技術(shù)實(shí)現(xiàn)，其為通過(guò)尾靜脈將大量含有siRNA的溶液快速注射(5秒內(nèi))到動(dòng)物體內(nèi)(Liu (1999)，如上；McCaffrey (2002)，如上；Lewis, Nature Genetics 32:107-108 (2002) )0 納米顆粒、脂質(zhì)體和其他陽(yáng)離子脂分子也可以用于將siRNA遞送到動(dòng)物體內(nèi)。已顯示在非人類的靈長(zhǎng)類中，以脂質(zhì)體制劑全身遞送siRNAs可以沉默疾病靶載脂蛋白B (ApoB) (Zimmermann T. S.等人， Nature, 2006, 441:111-114)。也可利用基于凝膠的瓊脂/脂質(zhì)體/siRNA制劑(Jiamg M.等人，Oligonucleotides, 2004，Winter, 14(4) 239-48)0使用工稈化的RNA前體來(lái)誘導(dǎo)RNAi
如本文所述，將工程化的RNA前體引入細(xì)胞或整個(gè)生物體，將引起所期望的siRNA分子的產(chǎn)生。然后，這種siRNA分子與RNAi途徑的內(nèi)源性蛋白成分相關(guān)，以結(jié)合并靶向特定的 mRNA序列進(jìn)行切割和破壞。在此方式下，工程化的RNA前體產(chǎn)生的siRNA所靶向的病毒將被從細(xì)胞或生物體內(nèi)清除，導(dǎo)致細(xì)胞或生物體內(nèi)該mRNA所編碼的任何翻譯產(chǎn)物的濃度降低。RNA前體是典型的核酸分子，其能夠單獨(dú)編碼dsRNA的一條鏈或編碼RNA發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)的整個(gè)核苷酸序列。藥學(xué)組合物和施用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的病毒抑制劑可以被并入藥學(xué)組合物中。這些組合物一般包括病毒抑制劑和藥學(xué)可接受的載體。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)可接受的載體”包括鹽水、溶劑、分散介質(zhì)、 涂層(coatings)、抗細(xì)菌和抗真菌劑、等滲和吸收延緩劑等，能夠與藥學(xué)施用相容。補(bǔ)充的活性化合物也可以被并入組合物。制劑(組合物)描述在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知和容易得至 |J 的大量來(lái)源中。Remington' S Pharmaceutical Sciences (Martin Ε. W. , Easton Pennsylvania, Mack Publishing Company, 19th ed.，1995)描述了能夠與本發(fā)明聯(lián)合使用的制劑。配制了能與其預(yù)期的施用途徑相容的藥學(xué)組合物。施用途徑的例子包括腸胃外的，如靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、口腔(如吸入)、局部、透皮、透粘膜和直腸施用。用于腸胃外的、皮內(nèi)或皮下應(yīng)用的溶液或懸液可以包括下列組分無(wú)菌稀釋液，例如注射用水、鹽溶液、非揮發(fā)油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗菌劑，如苯甲醇或羥苯甲酸甲酯；抗氧化劑，如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，如乙二胺四乙酸；緩沖液，如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；以及用于調(diào)節(jié)張力的試劑，如氯化鈉或葡萄糖。PH值可用酸或堿調(diào)節(jié)，如鹽酸或氫氧化鈉。腸胃外制備物可以密封在安瓿、一次性注射器或玻璃或塑料制成的多個(gè)劑量瓶中。適合可注射用途的藥物組合物包括無(wú)菌水溶液(水可溶的)或分散劑和用于臨時(shí)制備無(wú)菌可注射的溶液或分散劑的無(wú)菌粉末。對(duì)于靜脈內(nèi)施用，適合的載體包括生理鹽水、 抑菌水、CREM0PH0R EL (BASF, Parsippany, N. J.)或磷酸鹽緩沖液(PBS)。在所有情況下， 組合物必須是無(wú)菌的，并且其流動(dòng)性應(yīng)為存在簡(jiǎn)易的注射能力的程度。其應(yīng)當(dāng)在制備和儲(chǔ)存條件下穩(wěn)定，并且保存免于微生物例如細(xì)菌和真菌的污染作用。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)及其適當(dāng)?shù)幕旌衔?。適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性可以例如通過(guò)使用如卵磷脂包被，通過(guò)在分散劑的情況下保持所需顆粒大小以及通過(guò)使用表面活性劑來(lái)保持?？梢酝ㄟ^(guò)各種抗細(xì)菌和抗真菌劑來(lái)防止微生物的作用，例如對(duì)羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等。等滲劑，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇、氯化鈉也可以包括在組合物中。通過(guò)在組合物中包含的延緩吸收的試劑，例如單硬脂酸鋁和明膠，可以引起可注射的組合物的延緩吸收?？梢愿鶕?jù)需要，在含有上文列舉一種成分或其組合的適當(dāng)溶劑中加入所需量的活性化合物(例如，本發(fā)明的多核苷酸)，然后過(guò)濾除菌，來(lái)制備無(wú)菌注射液。一般來(lái)說(shuō)，將活性化合物加入無(wú)菌容器(其中含有基礎(chǔ)分散介質(zhì)和所需的其他上文列舉的成分)來(lái)制備分散劑。在用于制備無(wú)菌注射液的無(wú)菌粉末的情況中，適當(dāng)?shù)闹苽浞椒òㄕ婵崭稍锖蛢龈桑鋸闹盁o(wú)菌過(guò)濾的溶液中產(chǎn)生活性成分與任何另外希望的成分的粉末。口服組合物一般包括惰性稀釋液或可食用的載體。對(duì)于口服治療施用的目的，活性化合物可以并入賦形劑并以片劑、錠劑或膠囊例如明膠膠囊的形式使用?？诜M合物也可以使用液體載體制備，作為漱口水使用。藥學(xué)相容的結(jié)合劑和/或佐劑材料可以被包含作為組合物的一部分。片劑、丸劑、膠囊、錠劑等可以含有任何下列成分，或類似性質(zhì)的化合物粘合劑如微晶纖維素、黃芪膠或明膠；賦形劑如淀粉或乳糖，崩解劑如褐藻酸、 PRIM0GEL或玉米淀粉；潤(rùn)滑劑如硬脂酸鎂或Merotes ；助流劑如膠態(tài)二氧化硅；甜味劑如蔗糖或糖精；或調(diào)味劑如薄荷、水楊酸甲酯或橙香精。對(duì)于吸入施用，本發(fā)明病毒抑制劑可以從加壓容器或含有適合的噴射劑例如氣體如二氧化碳的分散器，或噴霧器中以氣溶膠噴霧形式遞送。這些吸入方法和吸入制劑包括那些在美國(guó)專利號(hào)6，468，798中描述的那些。病毒抑制劑的全身施用也可以通過(guò)透粘膜或透皮方式進(jìn)行。對(duì)于透粘膜或透皮施用，在制劑中使用對(duì)于所要穿透的屏障適當(dāng)?shù)臐B透劑。這些滲透劑在本領(lǐng)域中公知，并且例如對(duì)于透粘膜施用，包括去垢劑、膽酸鹽和梭鏈孢酸衍生物。可以通過(guò)使用鼻腔噴霧劑或栓劑進(jìn)行透粘膜施用。對(duì)于透皮施用，活性化合物(例如，本發(fā)明的多核苷酸)被配制成本領(lǐng)域中公知的軟膏、油膏、凝膠或乳膏(crearn)。藥學(xué)組合物也可以制備成栓劑的形式(例如，傳統(tǒng)的栓劑基質(zhì)，例如可可脂和其他甘油酯)或保留灌腸用于直腸施用。病毒抑制劑也可以使用本領(lǐng)域中已知的方法通過(guò)轉(zhuǎn)染或感染來(lái)施用，但是不限于 McCaffrey 等人，Nature 418 (6893) 38-39 (2002)(水動(dòng)力轉(zhuǎn)染)；Xia 等人，Nature Biotechnol 20(10) :1006-10 (2002)(病毒介導(dǎo)的遞送)；或 Putnam, Am. J. Health Syst. Pharm. 53(2) :151-160 (1996)，在 Am. J. Health Syst. Pharm. 53(3):325 (1996)更正中所描述的方法。多核苷酸病毒抑制劑也可以使用任何適合核酸試劑施用的方法例如DNA疫苗進(jìn)行施用。這些方法包括基因槍、生物注射器和皮膚鉗以及無(wú)針?lè)椒ɡ缑绹?guó)專利號(hào) US6194389中公開(kāi)的微顆粒DNA疫苗技術(shù)，以及美國(guó)專利號(hào)US6168587中公開(kāi)的使用粉末形式的疫苗進(jìn)行哺乳動(dòng)物透皮無(wú)針接種。另外，鼻內(nèi)遞送也是可能的，如Hamajima等人， Clin. Immunol. Immunopatho1. 88(2) :205-10 (1998)中所述。也可以使用脂質(zhì)體(例如美國(guó)專利號(hào)US6，472，375所述)和微囊化技術(shù)。也可以使用生物可降解的可靶向的微顆粒遞送系統(tǒng)(例如美國(guó)專利號(hào)US6，471，996所述)。在一個(gè)實(shí)施方式中，多核苷酸病毒抑制劑使用這樣的載體制備，其將保護(hù)多核苷酸在體內(nèi)不會(huì)快速清除或降解，例如控釋制劑，其包括內(nèi)植體和微囊化遞送系統(tǒng)?？梢允褂蒙锟山到?、生物相容的聚合體，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚羥基乙酸、膠原蛋白、多正酯類和聚乳酸。這些制劑可以使用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)制備。脂質(zhì)體懸液(包括具有單克隆抗體的針對(duì)抗原呈遞細(xì)胞的脂質(zhì)體)也可以用作藥學(xué)可接受的載體。這些可以根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法制備，例如美國(guó)專利號(hào)4522811中所述。可以應(yīng)用抑制RNAse A家族酶類成員或可另外保護(hù)本發(fā)明多核苷酸病毒抑制劑免于這些酶作用的策略。例如美國(guó)專利號(hào)6，096，720 (Love等人)描述了針對(duì)人raf mRNA的寡核苷酸，其被包埋在空間穩(wěn)定的脂質(zhì)體中。在一個(gè)實(shí)施方式中，在Love等人中所述的寡核苷酸是嵌合的寡核苷酸，其包含用以增強(qiáng)目標(biāo)親合力的第一區(qū)域和作為RNase底物的第二區(qū)域。siSHIELD RNAse抑制劑被設(shè)計(jì)用于防止siRNA被RNase (MP BIOMEDICALS, Irvine, CA)降解。將短的寡核苷酸濃縮 (compaction)至完好確定(well-defined)的濃縮物的策略也可以用于遞送本發(fā)明的多核苷酸(Sarkar T.等人，Nucleic Acids Research, 2005, 33 (1) 143-151 )，其通過(guò)引用整體并入本文。 具體地，在體外或體內(nèi)將多核苷酸病毒抑制劑例如干擾RNA進(jìn)行細(xì)胞施用的合適技術(shù)在下列文獻(xiàn)中公開(kāi)
一般綜述
Borkhardt, A. Cancer Cell, 2002，2:167-8; Hannon, G. J. Nature, 2002， 418:244-51; McManus, Μ. Τ. and Sharp, P. A. Nat Rev Genet. , 2002，3:737-47; Scherr, M.等人，Curr MecL Chem., 2003, 10:245-56; Shuey, D. J.等人，Drug Discov Today, 2002，7:1040—6; Gilmore, I. R.等人，J. Drug Target. , 2004， 12(6) :315-340; Dykxhoorn, D. M. and Lieberman J. , Annu. Rev. Med. , 2005， 56:401-423.
使用脂質(zhì)體全身施用
Lewis, D. L.等人，Nat Genet. , 2002, 32:107-8; Paul, C. P.等人，Nat Biotechnol., 2002, 20:505-8; Song, Ε.等人，Nat Med. , 2003, 9:347-51; Sorensen, D. R.等人，J Mol Biol. ’ 2003，327:761-6.
病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移
Abbas-Terki, T.等人，Hum Gene Ther., 2002，13:2197-201; Barton, G. Μ. and Medzhitov, R. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99:14943-5; Devroe, E. and Silver, P. A. BMC Biotechnol. , 2002，2:15; Lori, F.等人，Am J Pharmacogenomics, 2002， 2:245-52; Matte, H.等人，Cancer Biol Ther., 2003, 2:206-10; Qin, X. F.等人， Proc Natl Acad Sci USA, 2003, 100:183-8; Scherr, M.等人，Cell Cycle, 2003， 2:251-7; Shen, C.等人，F(xiàn)EBS Lett. , 2003，539:111-4; Lee S.K.等人，Blood, 2005，106(3) :818-826, epub April 14，2005.
多肽遞送
Morris, M.C·等人，Curr Opin Biotechnol. , 2000，11:461-6; Simeoni, F.等人， Nucleic Acids Res. , 2003，31:2717-24.
Song E.等人描述了通過(guò)細(xì)胞表面受體的抗體介導(dǎo)的siRNAs體內(nèi)遞送(Song Ε.等人，Nat. Biotechnol. , 2005，23(6) :709-717, epub May 22, 2005).
其他可適用于向靶細(xì)胞遞送多核苷酸病毒抑制劑例如干擾RNA的技術(shù)基于納米顆?；蚣{米膠囊，例如美國(guó)專利號(hào)6，649，192B和5，843，509B所公開(kāi)。可以用于選擇、遞送和監(jiān)測(cè)干擾RNA分子的最近的技術(shù)包括Raab, R. M.和乂印1^110口011108，G. Biotechnol.Bioeng. , 2004，88:121-132; Huppi, K.等人，Mol. Cell, 2005，17:1-10; Spagnou, S.等人，Biochemistry， 2004，43:13348—13356; Muratovska, A. and Eccles, Μ. R. FEBS Lett. , 2004，558:63-68; Kumar, R.等人，Genome Res. , 2003，13:2333-2340; Chen, A. A.等人，Nucleic Acids Res. , 2005，33:el90; Dykxhoorn, D. M.等人，Gene Ther., 2006，先于印刷的電子出版；Rodriguez-Lebron, Ε.禾口 Paulson, H. L. Gene Ther., 2005,先于印刷的電子出版；Pai，S.I.等人，Gene Ther., 2005,先于印刷的電子出版；Raoul, C.等人，Gene Ther. , 2005,先于印刷的電子出版；Manfredsson, F. P.等人，Gene Ther. , 2005，先于印刷的電子出版；Downward, J. BMJ, 2004， 328:1245-1248。相同類型或不同類型的病毒抑制劑混合物可以在體內(nèi)或體外引入細(xì)胞。例如，可以向細(xì)胞內(nèi)引入多核苷酸病毒抑制劑例如干擾RNA分子(例如，2-4種干擾分子或更多)的混合物或庫(kù)(Oleinikov A. V.等人，Nucleic Acids Research, 2005，33(10) :e92)。優(yōu)選地，干擾RNA分子靶向病毒RNA的不同區(qū)域。優(yōu)選地，這些干擾RNA分子之前已經(jīng)被單獨(dú)驗(yàn)證具有降低病毒載荷的功能?；旌衔镏袉为?dú)的干擾RNAs可以被化學(xué)合成(Elbashir S.M.等人，Gerws Dev. , 2001, 15:188-200)，或作為含RNA多聚酶啟動(dòng)子的短DNA模板引入，其在體內(nèi)或體外在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄(Yu J.Y.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:6047-6052)ο組合物的毒性和療效可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的藥學(xué)方法在細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中進(jìn)行測(cè)定，例如測(cè)定LD5tl (50%群體致死的劑量)和ED5tl (對(duì)50%群體有治療效果的劑量)。毒性和療效的劑量比為治療指數(shù)，可用LD5tZED5tl的比值表示。可以使用顯示出高治療指數(shù)的組合物。當(dāng)使用顯示毒副作用的組合物時(shí)，應(yīng)注意設(shè)計(jì)這樣的遞送系統(tǒng)，其將這些化合物靶向到被感染組織位點(diǎn)，以便將對(duì)未感染細(xì)胞的潛在損傷最小化，以及從而降低副作用。從細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定和動(dòng)物研究中獲取的數(shù)據(jù)可以用于設(shè)計(jì)用于人類的劑量范圍。這些組合物的劑量一般在循環(huán)濃度范圍之內(nèi)，包括具有很小毒性或沒(méi)有毒性的ED5tlt5劑量可以在此范圍內(nèi)變化，取決于使用的劑量形式和利用的施用途徑。對(duì)于本發(fā)明方法中使用的任何組合物，治療有效劑量最初可以從細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定中估計(jì)。可以在動(dòng)物模型中設(shè)計(jì)劑量以獲得循環(huán)血漿濃度范圍，其包括如在細(xì)胞培養(yǎng)中測(cè)定的IC5tl (即，獲得癥狀最大抑制效果的一半的測(cè)試組合物的濃度)。這些信息可以用于更準(zhǔn)確地測(cè)定用于人體的劑量。血漿水平可以通過(guò)例如高效液相色譜測(cè)量。病毒抑制劑可以根據(jù)任何合適的時(shí)間表施用，例如，從每天一次或多次到每周一次或多次，包括隔一天一次，進(jìn)行任何天數(shù)或周數(shù)，例如1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、 10天、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、2個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月或更長(zhǎng)，或其任何變化。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)理解某些因素可影響有效治療對(duì)象所需的劑量和時(shí)間，其包括但不限于疾病或紊亂的嚴(yán)重性、前期治療、對(duì)象的一般健康狀況和/或年齡、存在的其他疾病。而且，使用治療有效量的病毒抑制劑來(lái)治療對(duì)象可以包括單一治療或可包括一系列治療。多核苷酸病毒抑制劑可以在體內(nèi)或體外使用如本文所述的已知技術(shù)引入(施用) 至細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞)來(lái)抑制病毒。類似地，含有本發(fā)明DNA的遺傳構(gòu)建體(例如，轉(zhuǎn)錄載體)可以在體內(nèi)或體外使用如本文所述的暫時(shí)或穩(wěn)定表達(dá)RNA的已知技術(shù)引入細(xì)胞來(lái)抑制病毒。當(dāng)在體內(nèi)施用給細(xì)胞時(shí)，多核苷酸病毒抑制劑可以向?qū)ο笕硎┯?例如，靜脈內(nèi)施用)。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“對(duì)象”、“患者”和“個(gè)體”可以互換施用，并且意在包括人類和非人類哺乳動(dòng)物物種。類似地，本發(fā)明的體外方法可以在這些哺乳動(dòng)物物種的細(xì)胞中進(jìn)行。包含本發(fā)明的外源多核苷酸的宿主細(xì)胞可以施用給對(duì)象，并且可以是相對(duì)于對(duì)象例如自體(使用其自身細(xì)胞)、異體(從一個(gè)人到另一個(gè)人)或轉(zhuǎn)基因或異種基因(從一個(gè)哺乳動(dòng)物物種到另一個(gè)哺乳動(dòng)物物種)。本發(fā)明的多核苷酸病毒抑制劑可以插入遺傳構(gòu)建體，例如，病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、表達(dá)盒或質(zhì)粒病毒載體，例如使用本領(lǐng)域已知方法，包括但不限于那些Xia等人， (2002),如上中描述的方法進(jìn)行。遺傳構(gòu)建體可以通過(guò)例如吸入、口服、靜脈內(nèi)注射、局部施用(參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)5，328，470)或通過(guò)立體定位注射(參見(jiàn)，例如，Chen等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054-3057 (1994))來(lái)遞送給對(duì)象。遞送載體的藥學(xué)制備物可以包括在可接受的稀釋液中的載體，或可包含其中包埋遞送載體的緩釋基質(zhì)。可選地，在完整的遞送載體可從重組細(xì)胞中完整地產(chǎn)生的情況下，例如反轉(zhuǎn)錄載體，藥學(xué)制備物可以包括產(chǎn)生多核苷酸遞送系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞。多核苷酸病毒抑制劑可以是小發(fā)夾RNAs (shRNAs)和工程化表達(dá)shRNAs的表達(dá)構(gòu)建體。shRNA的轉(zhuǎn)錄在聚合酶III (pol III)啟動(dòng)子處起始，并認(rèn)為在4-5-胸腺嘧啶轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)的第2位終止。一旦表達(dá)，認(rèn)為shRNAs折疊成具有3’ UU-突出的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)；然后，這些shRNAs的末端被加工，將shRNA轉(zhuǎn)化成siRNA樣的大約21個(gè)核苷酸的分子(Brummelkamp 等人，Science 296:550-553 (2002) ； Lee 等人，(2002)，如上； Miyagishi and Taira, Nature Biotechnol. 20:497—500 (2002)； Paddison 等人， (2002)，如上；Paul (2002)，如上；Sui (2002)，如上；Yu 等人，(2002)，如上)
針對(duì)病毒的siRNAs可以融合到其他核酸分子上或多肽上，以引導(dǎo)它們的遞送或者完成其他功能。因此，例如，含有能夠特異性干擾靶病毒的siRNA寡核苷酸的融合蛋白可以包含親和標(biāo)簽多肽序列，其指通過(guò)與配體的特異性親和相互作用促進(jìn)多肽檢測(cè)和分離的多肽或肽。配體可以是任何分子、受體、反受體、抗體或類似物，親和標(biāo)簽可以通過(guò)本文提供的特異性結(jié)合相互作用與之作用。這些肽包括例如多聚His或“FLAG”或類似物，例如美國(guó)專利號(hào) 5，011，912和 Hopp 等人 Wio/Technology 6:1204, 1988)中所述抗原鑒定肽，或XPRESS 表位標(biāo)簽(INVITROGEN，Carlsbad, Calif.)。在細(xì)菌宿主的情況下，親和序列可以是例如 pBAD/His (INVITROGEN)或pQE_9載體提供的6個(gè)組氨酸標(biāo)簽，用于純化融合到標(biāo)記上的成熟多肽，或者，例如，當(dāng)使用哺乳動(dòng)物宿主例如C0S-7時(shí)，親和序列可以是血凝素(HA)標(biāo)簽。HA標(biāo)簽對(duì)應(yīng)來(lái)自于流感病毒血凝素蛋白的抗體限定的表位(Wilson等人，1984 Cell 37:767)。本發(fā)明還涉及載體和包含或編碼多核苷酸病毒抑制劑(例如siRNA)的構(gòu)建體，特別涉及“重組核酸構(gòu)建體”，其包含任意核酸例如DNA多核苷酸片段，可以被轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生如本文所提供的根據(jù)本發(fā)明的抗病毒siRNA多核苷酸；涉及宿主細(xì)胞，其被用本發(fā)明的載體和/或構(gòu)建體遺傳工程化，以及涉及通過(guò)重組技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明的siRNA多核苷酸、多肽和/ 或融合蛋白，或其片段或變體。本文公開(kāi)的如RNA多核苷酸的siRNA序列可以使用已良好確立的方法例如本文中所述方法被工程化以產(chǎn)生相應(yīng)的DNA序列。因此，例如，DNA多核苷酸可以產(chǎn)生自本文描述的任意siRNA序列，以使本發(fā)明的siRNA序列將被認(rèn)為還提供相應(yīng)的DNA多核苷酸(及其互補(bǔ)體)。因此，這些DNA多核苷酸被包括在本發(fā)明預(yù)期的范圍內(nèi)，例如，并入到本發(fā)明重組核酸構(gòu)建體中，在構(gòu)建體中SiRNA可以被轉(zhuǎn)錄。根據(jù)本發(fā)明，載體可以包含重組核酸構(gòu)建體，其含有一個(gè)或幾個(gè)啟動(dòng)子用于轉(zhuǎn)錄RNA分子，例如人U6 snRNA啟動(dòng)子(參見(jiàn)，例如Miyagishi等人，Nat. Biotechnol. 20:497-500 (2002) ； Lee 等人，Nat. Biotechnol. 20:500-505 (2002) ； Paul 等人，Nat. Biotechno1. 20:505-508 (2002) ； Grabarek 等人，BioTechniques 34:73544 (2003)； 也可參見(jiàn) Sui 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:5515-20 (2002) )0 siRNA 多核苷酸的各條鏈可以單獨(dú)轉(zhuǎn)錄，每一條由單獨(dú)的啟動(dòng)子控制，然后在細(xì)胞內(nèi)雜交形成siRNA多核苷酸雙鏈體。各條鏈也可以從單獨(dú)的載體轉(zhuǎn)錄(參見(jiàn)Lee等人，如上)?？蛇x地，特異性針對(duì)靶病毒序列的正義和反義序列可以在單個(gè)啟動(dòng)子的控制下轉(zhuǎn)錄，這樣siRNA多核苷酸形成發(fā)夾分子(Paul等人，如在這種情況下，siRNA特異性序列的互補(bǔ)鏈由間隔區(qū)分開(kāi)，間隔區(qū)包含至少4個(gè)核苷酸，但是可以如本文所述包含至少5、6、7、8、9、10、11、12、14、 16或18或更多個(gè)核苷酸。另外，在TO啟動(dòng)子控制下被轉(zhuǎn)錄的形成發(fā)夾的siRNAs可以在 3’末端延伸大約4個(gè)尿嘧啶，其作為轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)(Miyagishi等人，如上；Paul等人， 如通過(guò)說(shuō)明，如果靶序列為19個(gè)核苷酸，siRNA發(fā)夾多核苷酸(從5’末端起始)具有 19個(gè)核苷酸的正義序列，然后是間隔區(qū)(其為靠近19個(gè)核苷酸正義序列的3’端的兩個(gè)尿嘧啶核苷酸)，并且間隔區(qū)連接19個(gè)核苷酸的反義序列，然后是4個(gè)尿嘧啶的終止序列，形成突出。具有這種突出的siRNA多核苷酸有效干擾靶多肽的表達(dá)。也可以用另一個(gè)RNA聚合酶III啟動(dòng)子，Hl RNA啟動(dòng)子制備重組構(gòu)建體，該啟動(dòng)子可以被可操作地連接到siRNA 多核苷酸特異性序列，可用于轉(zhuǎn)錄包含siRNA特異性序列的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，或者單獨(dú)轉(zhuǎn)錄siRNA 雙鏈體多核苷酸的每條鏈(參見(jiàn),例如Brummelkamp等人，Science 296 550-53 (2002)； I^ddison等人，如上)?？捎糜诓迦胄蛄羞M(jìn)行轉(zhuǎn)錄siRNA多核苷酸的DNA載體包括pSUPER 載體(參見(jiàn)，例如Bru_elkamp等人，如JJ ；源自pCWRSVN的pAV載體(參見(jiàn)，例如I^aul等人，如JJ和pIND (參見(jiàn)，例如Lee等人，如JJ等。如本文所提供的，多核苷酸病毒抑制劑可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母、細(xì)菌或其他細(xì)胞中在適當(dāng)?shù)膯?dòng)子的控制下表達(dá)，為評(píng)價(jià)能夠抑制病毒載荷的siRNA多核苷酸提供現(xiàn)成的系統(tǒng)。在原核和真核宿主中使用的適當(dāng)?shù)目寺『捅磉_(dá)載體在例如Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N. Y. , 。001)中描述，。適當(dāng)?shù)腄NA序列可以通過(guò)各種方法插入載體。一般來(lái)說(shuō)，DNA序列通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法插入適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶位點(diǎn)?？寺?、DNA分離、擴(kuò)增和純化、涉及DNA連接酶、DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶等的酶反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，以及各種分離技術(shù)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知和常用的技術(shù)。很多標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)描述在例如Ausubel等人，(1993 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. Inc. & John Wiley & Sons, Inc. , Boston, Mass.) ； Sambrook 等人,(2001 Molecular Cloning, Third Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, N. Y. ); Maniatis 等人, (1982 Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, N. Y.)等中。表達(dá)載體中的DNA序列可操作地連接到至少一個(gè)適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)控制序列上(例如， 啟動(dòng)子或被調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子)以指導(dǎo)mRNA合成。這些表達(dá)控制序列的代表性實(shí)例包括LTR或SV40啟動(dòng)子，大腸桿菌Iac或trp，λ噬菌體P,啟動(dòng)子和其他已知的能夠在原核或真核細(xì)胞或其病毒中控制基因表達(dá)的啟動(dòng)子。使用CAT (氯霉素轉(zhuǎn)移酶)載體或其他帶有選擇標(biāo)記的載體，啟動(dòng)子區(qū)域可以選自任何期望的基因。真核啟動(dòng)子的實(shí)例包括CMV前早期、HSV胸腺激酶、早期和晚期SV40、反轉(zhuǎn)錄病毒LTRs和小鼠金屬硫蛋白-I。選擇適當(dāng)?shù)妮d體和啟動(dòng)子是在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員水平之內(nèi)熟知的，本文描述了某些特別優(yōu)選的重組表達(dá)構(gòu)建體的制備，其包含至少一個(gè)啟動(dòng)子或受調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子可操作地連接到本發(fā)明的多核苷酸上。如上文所述，在某些實(shí)施方式中，載體可以是病毒載體，例如哺乳動(dòng)物病毒載體 (如，反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、慢病毒)。例如，可衍生自反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒的反轉(zhuǎn)錄病毒包括但不限于，莫洛尼鼠白血病病毒，脾壞死病毒，反轉(zhuǎn)錄病毒，如勞斯肉瘤病毒，哈維肉瘤病毒，禽白血病病毒，猿長(zhǎng)臂猿白血病病毒，人類免疫缺陷病毒，腺病毒，骨髓增生肉瘤病毒，和乳腺腫瘤。病毒載體包含一個(gè)或幾個(gè)啟動(dòng)子。可以使用的適當(dāng)?shù)膯?dòng)子包括，但不限于，反轉(zhuǎn)錄病毒LTR、SV40啟動(dòng)子和人巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子，如Miller等人，Biotechniques 7:980-990 (1989)中所述的，或任何其他啟動(dòng)子(例如細(xì)胞啟動(dòng)子，例如真核細(xì)胞啟動(dòng)子， 包括但不限于組蛋白、pol III和β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子)。其他可以使用的病毒啟動(dòng)子包括， 但不限于，腺病毒啟動(dòng)子、腺相關(guān)病毒啟動(dòng)子、胸腺激酶(TK)啟動(dòng)子和Β19細(xì)小病毒啟動(dòng)子。合適的啟動(dòng)子的選擇對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)本文所含的教導(dǎo)是顯而易見(jiàn)的，并可以來(lái)自受調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子(例如，組織特異性的或可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子)或上文所述的啟動(dòng)子。在另一方面，本發(fā)明涉及含有上述重組構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞使用本發(fā)明的載體和/或表達(dá)構(gòu)建體被遺傳工程化/修飾(轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染)，所述本發(fā)明的載體和/ 或表達(dá)構(gòu)建體可以是例如克隆載體、穿梭載體或表達(dá)構(gòu)建體。載體或構(gòu)建體可以是，例如， 以質(zhì)粒、病毒顆粒、噬菌體等形式。工程化的宿主細(xì)胞可以在常規(guī)的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基被修飾為適于活化啟動(dòng)子、選擇轉(zhuǎn)化子或擴(kuò)增特定基因例如編碼siRNA多核苷酸或其融合蛋白的基因。選擇用于表達(dá)的特定宿主細(xì)胞的培養(yǎng)條件，例如溫度、PH等對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。宿主細(xì)胞可以是高等真核細(xì)胞，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，或低等真核細(xì)胞，例如酵母細(xì)胞，或者宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，例如細(xì)菌細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞的代表性實(shí)例包括，但不限于，細(xì)菌細(xì)胞，例如大腸桿菌(五c^i)、鏈霉菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌 {Salmonella typhimurium)；真菌細(xì)胞，例如酵母；昆蟲(chóng)細(xì)胞，例如果蠅S2細(xì)胞和夜蛾Sf9 細(xì)胞；動(dòng)物細(xì)胞，例如CHO、COS或293細(xì)胞；腺病毒；植物細(xì)胞或任何已經(jīng)適于體外增殖的或如此從頭建立的適合的細(xì)胞。各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)也可以用于從本發(fā)明的重組核酸構(gòu)建體產(chǎn)生多核苷酸病毒抑制劑。因此本發(fā)明部分涉及產(chǎn)生多核苷酸例如siRNA的方法，其通過(guò)培養(yǎng)含有重組核酸構(gòu)建體的宿主細(xì)胞來(lái)進(jìn)行，所述構(gòu)建體包含至少一個(gè)可操作連接多核苷酸病毒抑制劑的啟動(dòng)子。在某些實(shí)施方式中，啟動(dòng)子可以是本文提供的受調(diào)控的啟動(dòng)子，例如四環(huán)素可抑制性啟動(dòng)子。在某些實(shí)施方式中，重組表達(dá)構(gòu)建體是本文提供的重組病毒表達(dá)構(gòu)建體。哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)的實(shí)例包括Gluzman，Cell 23:175 (1981)描述的猴腎成纖維細(xì)胞C0S-7 細(xì)胞系，以及能夠表達(dá)相容載體的其他細(xì)胞系，例如C127、3T3、CHO、HeLa, HEK和BHK細(xì)胞系。哺乳動(dòng)物表達(dá)載體將包括復(fù)制起點(diǎn)、適當(dāng)?shù)膯?dòng)子和增強(qiáng)子，還包括任何必要的核糖體結(jié)合位點(diǎn)、聚腺苷酸化位點(diǎn)、剪接供體和受體位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止序列和5’側(cè)非轉(zhuǎn)錄序列，例如， 如本文關(guān)于重組多核苷酸構(gòu)建體制備所述的序列。源自SV40剪接位點(diǎn)和聚腺苷酸化位點(diǎn)的DNA序列可以用于提供所需的非轉(zhuǎn)錄遺傳元件。將構(gòu)建體引入宿主細(xì)胞可以通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的各種方法實(shí)現(xiàn)，其包括但不限于，例如脂質(zhì)體，其包括陽(yáng)離子脂質(zhì)體、 磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或電穿孔法(Davis等人，1986 Basic Methods in Molecular Biology)或其他適合的技術(shù)。表達(dá)的多核苷酸可以用于完整的宿主細(xì)胞；完整的細(xì)胞器、例如細(xì)胞膜、胞內(nèi)囊泡或其他細(xì)胞器；或破損的細(xì)胞制備物，其包括但不限于細(xì)胞勻漿或裂解液、微粒體、單層或多層膜泡或其他制備物?？蛇x地，表達(dá)的多核苷酸可以從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化，采用的方法包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸抽提、陰離子或陽(yáng)離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水相互作用層析、親和層析、羥基磷灰石層析和凝集素層析。最后，高效液相色譜(HPLC)可以用于最終的層析步驟。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“施用”、“引入”、“應(yīng)用”、“處理”、“移植”、“植入”、“遞送”及其語(yǔ)
法上的變化可以互換使用，以在體外(例如，先體外后體內(nèi))或體內(nèi)將病毒抑制劑提供給靶細(xì)胞，或者將本發(fā)明的遺傳修飾(工程化)的細(xì)胞提供給對(duì)象。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“共同施用，，及其變化是指將兩種或更多試劑同時(shí)(在一種或多種制備物中)施用或連續(xù)施用。例如，一種或多種類型的本發(fā)明的遺傳修飾的細(xì)胞可以與其他試劑共同施用。病毒抑制劑(本文中也稱為“活性化合物”)可以加入適合施用的藥學(xué)組合物中。這些組合物一般包括抑制病毒的核酸分子和藥學(xué)可接受的載體。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)可接受的載體”旨在包括任何以及所有溶劑、分散介質(zhì)、涂層、抗細(xì)菌和抗真菌劑、等滲和吸收延緩劑等，能夠與藥學(xué)施用相容。用于藥學(xué)活性物質(zhì)的這些介質(zhì)和試劑是本領(lǐng)域公知的。除了任何常規(guī)介質(zhì)或試劑與活性化合物不相容的，其他在組合物中用途都在考慮范圍之內(nèi)。 補(bǔ)充的活性化合物也可以被并入組合物。配制了可與其預(yù)期的施用途徑相容的藥物組合物。施用途徑的實(shí)例包括腸胃外， 如靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、口腔(如吸入)、透皮(局部)、透粘膜和直腸施用。用于腸胃外、皮內(nèi)或皮下應(yīng)用的溶液或懸液可以包括下列組分無(wú)菌稀釋液，例如注射用水、生理鹽水、非揮發(fā)油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗菌劑，如苯甲醇或羥苯甲酸甲酯；抗氧化劑，如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，如乙二胺四乙酸；緩沖液，如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；以及用于調(diào)節(jié)張力的試劑，如氯化鈉或葡萄糖。PH值可用酸或堿調(diào)節(jié)，如鹽酸或氫氧化鈉。腸胃外制備物可以密封在安瓿，一次性注射器或玻璃或塑料制成的多個(gè)劑量瓶中。適合可注射用途的藥物組合物包括無(wú)菌水溶液(水可溶的)或分散劑和用于臨時(shí)制備無(wú)菌可注射的溶液或分散劑的無(wú)菌粉末。對(duì)于靜脈內(nèi)施用，適合的載體包括生理鹽水、 抑菌水、CREM0PH0R EL (BASF, Parsippany, N. J.)或磷酸鹽緩沖液(PBS)。在所有情況下， 組合物必須是無(wú)菌的，并且其流動(dòng)性應(yīng)為存在簡(jiǎn)易的注射能力的程度。其必須在制備和儲(chǔ)存條件下穩(wěn)定，并且必須保存免于微生物例如細(xì)菌和真菌的污染作用。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)及其適當(dāng)?shù)幕旌衔?。適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性可以例如通過(guò)使用如卵磷脂包被，通過(guò)在分散的情況下保持所需顆粒大小以及通過(guò)使用表面活性劑來(lái)保持?？梢酝ㄟ^(guò)各種抗細(xì)菌和抗真菌劑來(lái)達(dá)到防止微生物的作用，例如對(duì)羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等。在許多情況下，將優(yōu)選地包含等滲劑，例如在組合物中的糖、多元醇如甘露醇、山梨醇、氯化鈉。通過(guò)在組合物中包含的延緩吸收的試劑，例如單硬脂酸鋁和明膠，可以引起可注射的組合物的延緩吸收?？梢愿鶕?jù)需要，在含有上文列舉一種成分或其組合的適當(dāng)溶劑中加入所需量的活性化合物，然后過(guò)濾除菌，來(lái)制備無(wú)菌注射液。一般來(lái)說(shuō)，將活性化合物加入無(wú)菌載體(其中含有基礎(chǔ)分散介質(zhì)和所需的其他上文列舉的成分)來(lái)制備分散劑。在用于制備無(wú)菌注射液的無(wú)菌粉末的情況中，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和凍干，其從之前無(wú)菌過(guò)濾的溶液中產(chǎn)生活性成分與任何另外希望的成分的粉末。口服組合物一般包括惰性稀釋液或可食用的載體。它們可以被包裹在明膠膠囊中或壓縮成片劑。對(duì)于口服治療施用的目的，活性化合物可以并入賦形劑并以片劑、錠劑或膠囊的形式使用?？诜M合物也可以使用液體載體制備，作為漱口水使用，其中流體載體中的化合物經(jīng)口腔應(yīng)用，漱口并吐出或咽下。藥學(xué)相容的結(jié)合劑和/或佐劑材料可以被包含作為組合物的一部分。片劑、丸劑、膠囊、錠劑等可以含有任何下列成分或類似性質(zhì)的化合物 粘合劑如微晶纖維素、黃芪膠或明膠；賦形劑如淀粉或乳糖，崩解劑如褐藻酸、Primogel或玉米淀粉；潤(rùn)滑劑如硬脂酸鎂或^erotes ；助流劑如膠態(tài)二氧化硅；甜味劑如蔗糖或糖精； 或調(diào)味劑如薄荷、水楊酸甲酯或橙香精。對(duì)于吸入施用，化合物以從加壓容器或含有適合的噴射劑例如氣體如二氧化碳的分散器，或噴霧器中以氣溶膠噴霧形式遞送。全身施用也可以通過(guò)透粘膜或透皮方式進(jìn)行。對(duì)于透粘膜或透皮施用，在制劑中使用對(duì)于所要穿透的屏障適當(dāng)?shù)臐B透劑。這些滲透劑在本領(lǐng)域中公知，并且例如對(duì)于透粘膜施用，包括去垢劑、膽酸鹽和梭鏈孢酸衍生物?？梢酝ㄟ^(guò)使用鼻腔噴霧劑或栓劑進(jìn)行透粘膜施用。對(duì)于透皮施用，活性化合物被配制成本領(lǐng)域中公知的軟膏、油膏、凝膠或乳膏?；衔镆部梢灾苽涑伤▌┑男问?例如，傳統(tǒng)的栓劑基質(zhì)，例如可可脂和其他甘油酯)或保留灌腸用于直腸施用。在一個(gè)實(shí)施方式中，使用載體制備活性化合物，所述載體將保護(hù)該化合物在體內(nèi)不會(huì)快速清除，例如控釋制劑，其包括內(nèi)植體和微囊化遞送系統(tǒng)?？梢允褂蒙锟山到狻?生物相容的聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚羥基乙酸、膠原蛋白、多正酯類和聚乳酸。這些劑型的制備方法對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。材料可以從Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals, Inc.購(gòu)得。脂質(zhì)體懸液(包括具有單克隆抗體的針對(duì)靶細(xì)胞的脂質(zhì)體)也可以用作藥學(xué)可接受的載體。這些可以根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法制備，例如US4, 522，811中所述。尤其有利的是以易于施用和劑量一致的劑量單位形式配制口服或腸胃外組合物。 本文所使用的劑量單位形式指對(duì)于所要施用的對(duì)象適合單一劑量的離散單位，每個(gè)單位含有預(yù)先確定量的活性化合物，經(jīng)計(jì)算與所需的藥學(xué)載體一起可以產(chǎn)生所期望的治療效果。 本發(fā)明的劑量單位形式的規(guī)格根據(jù)活性化合物的獨(dú)特的特征和期望獲得的具體治療效果， 以及本領(lǐng)域中配制這種活性化合物用于治療個(gè)體的固有限制來(lái)規(guī)定并直接取決于上述因素。藥學(xué)組合物可以被包含在容器、包裝或分散器(dispenser)中，并帶有施用說(shuō)明書(shū)。篩詵分析。本發(fā)明還提供了方法(在本文也稱為“篩選分析”)，用于鑒定病毒抑制劑，即對(duì)例如病毒增殖尤其是H5W病毒增殖具有抑制效果的候選或測(cè)試混合物或試劑。處理方法。本發(fā)明提供了對(duì)處于病毒感染風(fēng)險(xiǎn)(或易于感染病毒)的對(duì)象進(jìn)行處理的預(yù)防性和治療性方法。予頁(yè)防件方法。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于在對(duì)象中預(yù)防有關(guān)病毒感染的疾病或狀況的方法，通過(guò)向?qū)ο笫┯眠f送有效量的本發(fā)明siRNAs的試劑。治療件方法。本發(fā)明的另一方面涉及用于治療目的的調(diào)節(jié)病毒活性的方法。本發(fā)明的方法中公開(kāi)的靶基因表達(dá)調(diào)節(jié)涉及使細(xì)胞與試劑接觸，所述試劑將有效量的本發(fā)明 siRNAs遞送到靶細(xì)胞。同樣地，本發(fā)明提供了治療經(jīng)受特征在于病毒感染的疾病或紊亂的個(gè)體的方法。本發(fā)明的治療劑的施用劑量范圍是對(duì)于被治療的病毒感染癥狀足以產(chǎn)生所期望效果的劑量范圍。劑量不能太大而導(dǎo)致不良副作用，例如不想要的交叉反應(yīng)、過(guò)敏反應(yīng)等。 一般來(lái)說(shuō)，劑量應(yīng)隨患者年齡、條件、性別和癥狀程度而變化，并可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所確定。在發(fā)生任何禁忌癥時(shí)，醫(yī)生個(gè)人可以對(duì)劑量進(jìn)行調(diào)整。劑量可取決于所治療的病毒，并且在治療這些疾病時(shí)，可以由具有普通技能的醫(yī)生使用已知的劑量調(diào)整技術(shù)很容易的加以確定。劑量一般處于對(duì)治療化合物已經(jīng)確立的治療窗內(nèi)，其應(yīng)在提供治療效果的同時(shí)將額外的發(fā)病率和死亡率最小化。典型地，治療化合物的施用劑量范圍從每個(gè)劑量0. 001 mg/kg到大約100 mg/kg，優(yōu)選0. 1-20 mg/kg。優(yōu)選的大約0. 5-5 mg/kg的劑量對(duì)于含有本文所公開(kāi)的治療劑的化合物尤其有用，每天一個(gè)或幾個(gè)劑量施用，施用一天或多天。本文描述的任何組合物可以配制用于對(duì)哺乳動(dòng)物或更優(yōu)選地對(duì)人類的藥理學(xué)或治療性施用。同樣地，該組合物可以包含在藥學(xué)可接受的載體中。優(yōu)選的肽活性劑的施用方式為通過(guò)注射，靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或皮下。其他施用途徑也可以是可能的，并且應(yīng)包括在本發(fā)明公開(kāi)的范圍之內(nèi)。該組合物可以腸胃外的或腹膜內(nèi)施用。以游離堿或藥理學(xué)可接受的鹽形式的活性化合物的溶液可以在水中制備，并適當(dāng)混合表面活性劑，例如羥丙纖維素。分散液也可以在甘油、液體聚乙二醇及其混合物以及油脂中制備。在普通的儲(chǔ)存和使用條件下，這些制備物含有防腐劑以防止微生物生長(zhǎng)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)可接受的載體”包括任何以及所有的溶劑、分散介質(zhì)、涂層、抗細(xì)菌和抗真菌劑、等滲和吸收延緩劑等。用于藥學(xué)活性物質(zhì)的這些介質(zhì)和試劑的用途是本領(lǐng)域公知的。除了任何常規(guī)介質(zhì)或試劑與活性化合物不相容的，其他在治療組合物中用途都在考慮范圍之內(nèi)。補(bǔ)充的活性成分也可以被并入組合物。本發(fā)明的治療劑可以腸道外施用，通過(guò)注射或通過(guò)緩慢的逐漸灌注進(jìn)行。本發(fā)明的治療劑可以靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、腔內(nèi)或透皮施用。腸胃外施用的制備物包括無(wú)菌的水溶液或非水溶液、懸液和乳濁液。非水溶劑的實(shí)例包括丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄欖油，以及注射用有機(jī)酯例如油酸乙酯。含水載體包括水、醇/水溶液、乳濁液或懸液，包括鹽水和緩沖介質(zhì)。腸胃外載體包括氯化鈉溶液、 任氏葡萄糖(Ringer’ s dextrose)、葡萄糖和氯化鈉、乳酸化任氏液或非揮發(fā)油。靜脈載體包括流體和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑、電解質(zhì)補(bǔ)充劑(例如基于任氏葡萄糖的)等。也可以存在防腐劑和其他添加劑，例如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑以及惰性氣體等。本發(fā)明也涉及制備含有本發(fā)明治療劑的藥物或藥學(xué)組合物的方法，所述藥學(xué)組合物用于治療病毒感染。在本發(fā)明某些實(shí)施方式中，病毒是分子治療的靶標(biāo)。對(duì)于這種情況，可以應(yīng)用小干擾RNA (siRNA)作為病毒拮抗劑來(lái)抑制或下調(diào)病毒復(fù)制?！耙种啤?、“下調(diào)”、“敲除”或“沉默”意思是靶向的病毒RNAs的表達(dá)降低到低于不存在本發(fā)明siRNAs時(shí)所觀察到的水平。在一個(gè)實(shí)施方式中，使用本發(fā)明的siRNAs-m抑制或下調(diào)H5m在存在siRNAs-m時(shí)比其不存在時(shí)要明顯。本發(fā)明涉及使用短干擾核酸(siRNA)分子用于調(diào)節(jié)病毒例如H5W增殖的化合物、 組合物和方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及使用小核酸分子通過(guò)RNA干擾(RNAi)用于調(diào)節(jié)H5W和 /或H5m基因表達(dá)和活性的化合物、組合物和方法。具體地，本發(fā)明涉及小核酸分子，例如短干擾核酸(SiNA)、短干擾RNA (siRNA)、雙鏈RNA (dsRNA)、微-RNA (miRNA)和短發(fā)夾RNA (shRNA)分子和方法，用于調(diào)節(jié)病毒尤其是H5W的增殖。本發(fā)明的siRNA可以是未修飾的或化學(xué)修飾的。本發(fā)明的siRNA可以被化學(xué)合成、載體表達(dá)或酶合成。本發(fā)明也可以涉及各種化學(xué)修飾的合成的短干擾核酸(siNA)分子，能夠通過(guò)RNA干擾(RNAi)在細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)病毒例如H5W的增殖。使用化學(xué)修飾的siNA通過(guò)增加體內(nèi)對(duì)核酸酶降解的抗性和/或改善的細(xì)胞吸收來(lái)改善天然siNA分子的各種性質(zhì)。本發(fā)明的siNA分子提供有用的試劑和方法，用于各種治療性、診斷性、靶標(biāo)確認(rèn)、基因組發(fā)現(xiàn)、遺傳工程和藥物基因組應(yīng)用。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的特征在于含有本發(fā)明SiRNA分子的藥物。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的特征在于含有本發(fā)明SiRNA分子的活性成分。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的特征在于在藥學(xué)可接受的載體或稀釋劑中含有本發(fā)明siRNA分子的組合物。但是，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不限于所描述的具體實(shí)施方式
，同樣地，當(dāng)然其可以變化。 也應(yīng)當(dāng)理解本文所用的術(shù)語(yǔ)目的僅在于描述具體實(shí)施方式
，不試圖限制。如本文所使用的，其包括附加的權(quán)利要求，單數(shù)“一”和“其”(“a”、“an”和“the”) 包括復(fù)數(shù)，除非文中另有指出。因此，例如“一個(gè)多核苷酸”的指代包括超過(guò)一個(gè)這樣的多核苷酸?！耙粋€(gè)核酸序列”的指代包括超過(guò)一個(gè)這樣的序列?！耙粋€(gè)細(xì)胞”的指代包括超過(guò)一個(gè)這樣的細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“包含”、“由……組成”和“主要包括”根據(jù)它們標(biāo)準(zhǔn)的含義來(lái)定義。在本申請(qǐng)中，為了給每個(gè)術(shù)語(yǔ)加上具體含義，術(shù)語(yǔ)可以替換成另一個(gè)。除非另有說(shuō)明，所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的相同含義。雖然與本文所描述類似或等價(jià)的任何方法和材料都可以用于實(shí)踐或測(cè)試本發(fā)明，但是現(xiàn)僅描述了優(yōu)選的方法和材料。本文所教導(dǎo)的siRNAs-m的出色的體內(nèi)抗病毒效果主要?dú)w因于所鑒定的基序的獨(dú)特特征。首先，siRNA-m，尤其是與其siRNA-n相似物(counterpart)共享10個(gè)重疊的nt 殘基的PB1-797，在培養(yǎng)的細(xì)胞中在抑制病毒復(fù)制上顯示出比其相應(yīng)的siRNAs-n更低的效果(圖3a)。截然相反的是，它們?cè)趧?dòng)物中顯示出比其siRNA-n相似物顯著更高的抗病毒效果(圖4和5)。其次，siRNAs-m在培養(yǎng)的細(xì)胞中顯示較低的株間交叉抗病毒效果(圖6b)，但是在體內(nèi)對(duì)兩種不完全匹配的H5W病毒株展示出全面的交叉保護(hù)效果(圖6c和d)。第三， 含有基序的小RNA (根據(jù)一般接受的標(biāo)準(zhǔn)被認(rèn)為是不是最優(yōu)的選擇并且也不能用Promega 公司的siRNA target designer程序鑒定出)在培養(yǎng)的細(xì)胞中沒(méi)有顯示出任何抗病毒效果，但是在體內(nèi)比大多數(shù)siRNAs-n都顯示更明顯的抗病毒效果(圖4和6g)，而所述大多數(shù) siRNAs-n在培養(yǎng)的細(xì)胞中顯示非常高的抗病毒活性(圖3a)。這表明除了 siRNA-介導(dǎo)的抗病毒活性，該基序本身也能夠刺激宿主產(chǎn)生更強(qiáng)的抗病毒效果。siRNAs-m有效保護(hù)動(dòng)物模型免于高毒性H5W病毒致死攻擊的的根本機(jī)理還不完全理解。但是，本文所鑒定的siRNAs-m不同于其他報(bào)道的可以序列依賴性或非依賴性的方式刺激哺乳動(dòng)物先天免疫應(yīng)答的siRNAs (14；16；20；21),因?yàn)槲覀兊慕Y(jié)果顯示在不同時(shí)間點(diǎn)收集的小鼠血清樣本或肺組織勻漿中，針對(duì)siRNAs-m處理的應(yīng)答沒(méi)有任何IFN-α、 IFN-y和TNF-α的產(chǎn)生。有意思的是，siRNAs-m在肺部急性期刺激局部IL-6的產(chǎn)生 (圖7d到f)。進(jìn)一步分析揭示，基序的反義序列5’ -GGAGU-3’與刺激IL-6產(chǎn)生有關(guān)(圖 7g)。這是本研究中鑒定的新序列基序，與先前報(bào)道的siRNA基序例如5’-UGUGU-3’和 5’ -GUCCUUCAA-3’(15,16)不同。雖然已經(jīng)報(bào)道病毒感染誘導(dǎo)的局部IL-6產(chǎn)生與急性肺損傷和流感病毒感染嚴(yán)重度有關(guān)(22, 23)，但是幾項(xiàng)研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)局部IL-6產(chǎn)生與上皮細(xì)胞免疫防御系統(tǒng)上調(diào)有關(guān)(24_29)。也有報(bào)道IL-6介導(dǎo)的更直接的抗病毒活性與誘導(dǎo)能夠通過(guò)破壞病毒特異性mRNAs、雙鏈RNAs和蛋白質(zhì)積累來(lái)抑制病毒復(fù)制的蛋白質(zhì)和酶有關(guān)(30)。無(wú)論 siRNA-m誘導(dǎo)的IL-6產(chǎn)生是否直接或間接與siRNAs-m的體內(nèi)抗病毒活性有關(guān)，我們的結(jié)果表明IL-6產(chǎn)生在針對(duì)H5W病毒感染的宿主防御中具有保護(hù)性。我們的結(jié)果進(jìn)一步顯示siRNAs-m刺激小鼠肺組織中高水平的局部β -防衛(wèi)素_4 產(chǎn)生(圖8a和b)，處理后早達(dá)7個(gè)小時(shí)達(dá)到最高水平(圖Sc)。β -防衛(wèi)素-4的產(chǎn)生是劑量依賴性的(圖8d)。使用β -防衛(wèi)素-4特異性抗體對(duì)肺組織進(jìn)行免疫染色揭示siRNA-m 刺激的β -防衛(wèi)素-4主要在氣管粘膜上皮細(xì)胞中表達(dá)，在肺泡組織中很少發(fā)現(xiàn)(圖Se)。 siRNAs-m在小鼠肺部對(duì)β -防衛(wèi)素-4的刺激在mRNA和蛋白質(zhì)水平均得到證實(shí)。另外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)β -防衛(wèi)素對(duì)各種感染性病原，例如細(xì)菌、真菌和一些包膜病毒提供第一線的宿主防御(33)。重要的是，防衛(wèi)素在先天和獲得性免疫之間還起到橋梁作用 (34)。例如，β-防衛(wèi)素作為T(mén)oll樣受體-4的配體直接作用于未成熟的樹(shù)突細(xì)胞，從而促進(jìn)樹(shù)突細(xì)胞的成熟(35)。對(duì)于另一個(gè)實(shí)例，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)人β-防衛(wèi)素-2在人體肺部的先天免疫和宿主防御應(yīng)答中發(fā)揮重要作用μ)。也有報(bào)道小鼠β -防衛(wèi)素_4，人β -防衛(wèi)素-2的同源物，在動(dòng)物模型中可以被結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tokrcWosis)和甲型流感病毒感染所誘導(dǎo)，并作為針對(duì)感染的先天免疫(37』。但是，siRNAs-m誘導(dǎo)的β-防衛(wèi)素-4是否具有抗H5W活性還沒(méi)有被評(píng)價(jià)過(guò)。為了檢查siRNAs-m誘導(dǎo)的β -防衛(wèi)素_4在先體外后體內(nèi)和體內(nèi)系統(tǒng)中的抗H5W 活性，對(duì)β-防衛(wèi)素-4進(jìn)行了克隆和表達(dá)。在先體外后體內(nèi)系統(tǒng)中，β-防衛(wèi)素-4顯示強(qiáng)的抗H5m活性，具有大約在45 yg/ml水平的IC50(圖9a)。在體內(nèi)系統(tǒng)中，一個(gè)劑量75 Ug 的β-防衛(wèi)素-4可以保護(hù)40%的小鼠免于H5M病毒的致死攻擊。即使對(duì)于β-防衛(wèi)素-4 處理后沒(méi)有存活的小鼠，它們也比對(duì)照能夠多存活2天(圖％)。這些結(jié)果顯示siRNAs-m的有效的抗H5W效果可以歸因于，至少部分可以歸因于，新型的基序刺激強(qiáng)烈的β-防衛(wèi)素應(yīng)答，在保護(hù)宿主針對(duì)高致病性H5W病毒感染中發(fā)揮重要作用。因此，我們已經(jīng)證明含有新型基序的siRNAs在體內(nèi)大大增強(qiáng)了抗H5W活性。此基序與先前報(bào)道的siRNA相關(guān)的基序不同。其他的基序通常靶向宿主基因的特定序列，而我們的新型基序看起來(lái)不以序列特異性的方式發(fā)揮作用。在本研究中，分別靶向4個(gè)不同病毒基因的siRNAs-m在保護(hù)動(dòng)物針對(duì)高致病性H5W病毒感染的致死攻擊中提供了類似的效果。該基序在很多其他重要病毒中也曾發(fā)現(xiàn)過(guò)，例如SARS-CoV、RSV、AdV、HIV、HBV*HCV， 因此可能提供不僅針對(duì)H5m流感病毒，而且針對(duì)其他重要的病毒病原例如這些病毒的基于siRNA的抗病毒劑。本文提及或引用的所有的專利、專利申請(qǐng)、臨時(shí)申請(qǐng)和公開(kāi)均通過(guò)引用整體并入， 其包括所有的附圖和表格，其程度為它們不與本說(shuō)明書(shū)的明確教導(dǎo)相矛盾。下面是解釋實(shí)踐本發(fā)明的方法的實(shí)施例。這些實(shí)施例不應(yīng)解釋為限制。除非另有說(shuō)明，所有百分比都為重量百分比，所有溶劑混合物比例均為體積比。
實(shí)施例實(shí)施例1:在培養(yǎng)的細(xì)胞中具有該基序的siRNAs (siRNA_m)顯示低于不含基序的 siRNAs (siRNA-n)的抑制效果
設(shè)計(jì)并合成了 25個(gè)分別靶向甲型流感病毒的PBl、PB2、PA、NP、M、NS和HA基因的 siRNA雙鏈體，其包括4個(gè)含有新型基序的siRNAs (命名為siRNAs-m)和21個(gè)不含該基序的siRNAs (命名為siRNAs-n)(圖1和表1)。表1本研究中設(shè)計(jì)和測(cè)試的siRNAs的序列
權(quán)利要求
1.一種siRNA，其包含基序GGAGU或反向基序ACUCC。
2.根據(jù)權(quán)利要求1 的 siRNA，其包含選自 SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 36 和 SEQ ID NO: 37 的序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的siRNA在制備用于在對(duì)象中刺激IL-6產(chǎn)生的試劑中的用途。
4.一種組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1或2的siRNA和藥學(xué)可接受的載體。
5.一種篩選潛在抗病毒劑的方法，其包括獲得根據(jù)權(quán)利要求1的siRNA ；在所述siRNA的抗病毒性質(zhì)可以被觀察的條件下，使所述siRNA與培養(yǎng)的細(xì)胞接觸；并將所述siRNA的任何抗病毒性質(zhì)與對(duì)照比較；其中顯示高于對(duì)照的抗病毒性質(zhì)的 siRNA被確定為潛在抗病毒劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述對(duì)照選自陰性對(duì)照、未處理細(xì)胞培養(yǎng)物和陽(yáng)性對(duì)照。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述陽(yáng)性對(duì)照為siRNA，其包含選自SEQID NO:3,SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 36 禾口 SEQ ID NO: 37 的序列。
8.一種篩選潛在抗病毒劑的方法，其包括產(chǎn)生一個(gè)根據(jù)權(quán)利要求1的siRNA ；在所述siRNA的抗病毒性質(zhì)可以被觀察的條件下，將所述siRNA施用給動(dòng)物模型，并用病毒攻擊所述動(dòng)物；以及測(cè)定所述siRNA是否在體內(nèi)顯示抗病毒性質(zhì)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，進(jìn)一步包括將所述siRNA的任何抗病毒性質(zhì)與對(duì)照比較； 其中顯示高于所述對(duì)照的抗病毒性質(zhì)的siRNA被確定為潛在抗病毒劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述對(duì)照選自陰性對(duì)照、未處理的動(dòng)物和陽(yáng)性對(duì)照。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述陽(yáng)性對(duì)照為siRNA，其包含選自SEQID N0:3、 SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 36 禾口 SEQ ID NO: 37 的序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所要觀察的抗病毒性質(zhì)為抗甲型流感病毒性質(zhì)，優(yōu)選為抗H5W性質(zhì)。
13.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所要觀察的抗病毒性質(zhì)為抗甲型流感病毒性質(zhì)，優(yōu)選為抗H5m性質(zhì)。
14.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所要觀察的抗病毒性質(zhì)為抗甲型流感病毒性質(zhì)，優(yōu)選為抗H5W性質(zhì)。
15.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述病毒為甲型流感病毒，優(yōu)選H5W。
16.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述病毒為甲型流感病毒，優(yōu)選H5m。
17.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述病毒為甲型流感病毒，優(yōu)選H5m。
18.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述病毒為甲型流感病毒，優(yōu)選H5m。
19.根據(jù)權(quán)利要求1或2的siRNA在制備用于在對(duì)象中刺激β-防衛(wèi)素產(chǎn)生的試劑中的用途。
全文摘要
尚沒(méi)有抗病毒劑能夠成功治療H5N1病毒感染。我們證明一組高效的靶向H5N1病毒基因的siRNAs共同具有獨(dú)特基序GGAGU/ACUCC。我們進(jìn)一步證明含有此基序的siRNAs的有效性不是序列特異性的。結(jié)果表明該獨(dú)特基序的結(jié)構(gòu)對(duì)于確定siRNA-介導(dǎo)的針對(duì)病毒感染的保護(hù)效果的效力至關(guān)重要，以及這種有效的體內(nèi)保護(hù)與該基序誘導(dǎo)的β-防衛(wèi)素和IL-6的早期產(chǎn)生有關(guān)。提供了用于針對(duì)H5N1流感病毒和其他病毒感染的方法以及預(yù)防劑和治療劑。
文檔編號(hào)A61K48/00GK102203254SQ200980143026
公開(kāi)日2011年9月28日 申請(qǐng)日期2009年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月11日
發(fā)明者林勇平, 鄭伯建, 隋洪艷 申請(qǐng)人:香港大學(xué)