專利名稱：含有分選酶錨定乳房鏈球菌表面蛋白的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于誘發(fā)對乳房鏈球菌、Str印tococcus uteris)的免疫反應(yīng)的免疫原性組合物，尤其涉及一種能誘發(fā)保護性免疫反應(yīng)的免疫原性組合物。
背景技術(shù)：
在英國，目前有約20-30%的臨床乳腺炎病例由乳房鏈球菌、S. uberis)弓丨起的，在世界范圍內(nèi)也有著相似的致病率。乳腺炎依然是對全世界乳牛業(yè)經(jīng)濟影響最重大的傳染病。在英國，因臨床乳腺炎造成的年度損失估計約為￡1.7億，在美國約為 $15-20億。這些損失可歸因于牛奶生產(chǎn)的減少，相關(guān)治療費用和淘汰持續(xù)性重復(fù)感染的奶牛。導(dǎo)致乳腺炎的微生物可分為具有傳染性傳播途徑的那些，例如金黃色葡萄球 |if {Staphylococcus aureus )禾口無乳鏈球菌(StrepiococciAs aga/ac iiae )；以及來自于環(huán)境儲庫(environmental reservoir)的還會經(jīng)常感染乳房的那些，例如大腸桿菌 (.Escherichia coli )(.Streptococcus uberis).過去二十年間，基于改進的擠奶操作、擠奶后乳頭消毒和每次哺乳期后例行的乳房內(nèi)抗菌處理，各種控制措施的應(yīng)用已經(jīng)被證明對具有單一傳染性傳播路徑的病原體是有效的，但是對來自環(huán)境儲庫的乳腺感染的發(fā)生幾乎沒有作用，如果有也是極少的。對5 Maris引起的牛乳腺炎的控制失敗很大程度上是因為對傳染的發(fā)病機理的不了解。引起乳腺(乳房)炎癥的牛乳腺炎通常是由于乳房內(nèi)的細(xì)菌感染所致。乳腺炎的病癥隨宿主內(nèi)的因子而變化，且入侵病原體和乳房內(nèi)感染可導(dǎo)致亞臨床或臨床疾病。亞臨床乳腺炎，從定義上看，不表現(xiàn)出明顯的病癥。與臨床疾病相關(guān)的感染可以是牛奶中的可見異物(蛋白聚集或凝塊)并伴有被感染腺體的疼痛和腫脹，也可以是僅僅由漿液中聚集的蛋白組成的分泌物。在嚴(yán)重的病例中，也可以是全身性的病癥，例如高溫和食欲不振，這可發(fā)展為菌血癥、敗血癥，和導(dǎo)致動物的死亡。來自未受感染乳腺的牛奶包含通常為150000細(xì)胞/ml以下的白細(xì)胞，包括巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。感染通常導(dǎo)致局部的炎癥反應(yīng)，其特征是中性粒細(xì)胞大量進入乳腺被感染部位和牛奶。國際上使用得到的牛奶細(xì)胞計數(shù)作為乳腺感染的替代測量方法， 并作為牛奶質(zhì)量和乳房健康狀況的測量方法。來自亞臨床感染部位(infected quarters) 的牛奶細(xì)胞計數(shù)的結(jié)果超過250000細(xì)胞/ml，但該數(shù)字變化很大。來自臨床感染部位的乳房的牛奶通常含有超過2000000細(xì)胞/ml。細(xì)菌和/或其產(chǎn)物與分泌物中大量中性粒細(xì)胞之間的相互作用已被視為是引起牛奶生產(chǎn)率降低、分泌物降解、和誘導(dǎo)具有乳腺炎特征的普遍炎性變化的主要原因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種或多種組合物，它們可被用來誘發(fā)對乳房鏈球菌 {Streptococcus uteris)的保護性免疫反應(yīng)，從而預(yù)防或降低乳腺炎的發(fā)病率。按照本發(fā)明的第一個方面，本發(fā)明提供一種免疫原性組合物，其包含一種或多種乳房鏈球菌蛋白或其免疫原性部分，其中，當(dāng)該組合物被用于研究對象時能誘發(fā)免疫反應(yīng)。優(yōu)選地，該一種或多種多種乳房鏈球菌蛋白是分選酶錨定蛋白 (sortase-anchored proteins)或其免疫原t生部分。乳房鏈球菌分選酶錨定蛋白是指任何在野生型乳房鏈球菌中因酶分選作用而錨定在細(xì)菌表面的蛋白。一種或多種分選酶錨定蛋白，或一種或多種乳房鏈球菌蛋白可選自包含下列蛋白的組蛋白SUBO145, SUB1095和SUB1154，或與上述蛋白中的一種具有50%、60%、70%、80%、 90%、95%或更高，優(yōu)選80%或更高的序列同源性的蛋白。免疫原性組合物可包括兩種或兩種以上乳房鏈球菌蛋白或其免疫原性部分。兩種或兩種以上分選酶錨定蛋白，或兩種或兩種以上乳房鏈球菌蛋白可選自包含下列蛋白的組蛋白SUB0145、SUB1095和SUB11M，或與上述蛋白中的一種具有50%、60%、 70%、80%、90%、95%或更高，優(yōu)選80%或更高的序列同源性的蛋白。免疫原性組合物可包括蛋白SUB0145、SUB1095和SUBl巧4，或與上述蛋白中的一種具有50%、60%、70%、80%、90%、95%或更高，優(yōu)選80%或更高的序列同源性的蛋白。免疫原性組合物可包括蛋白SUB1095和SUB11M，或與上述蛋白中的一種具有 50%、60%、70%、80%、90%、95%或更高，優(yōu)選80%或更高的序列同源性的蛋白。一種或多種分選酶錨定蛋白，或一種或多種乳房鏈球菌蛋白可選自包含下列蛋白的組蛋白 SUB0135、SUBO145, SUB0207、SUB0826、SUB0888、SUB1095、SUBl 154、SUB1370, SUB1730和SUBOMl，或與上述蛋白中的一種具有50%、60%、70%、80%、90%、95%或更高，優(yōu)選 80%或更高的序列同源性的蛋白。一種或多種分選酶錨定蛋白，或一種或多種乳房鏈球菌蛋白可選自包含下列蛋白的組蛋白 SUB0135、SUB0207、SUB0826、SUB0888、SUB1095、SUB1154、SUB1370, SUB1730 和 SUB0241，或與上述蛋白中的一種具有50%、60%、70%、80%、90%、95%或更高，優(yōu)選80%或更高的序列同源性的蛋白。同源性百分比的出處與兩個被比對序列的相同性百分比(percent identity)有關(guān)。相同性百分比指，當(dāng)?shù)鞍仔蛄袑Ρ茸畲笙嗨贫葧r，且考慮到倒位和易位(inversions and translocations)的情況下，兩個蛋白中的相同殘基。優(yōu)選地，相同性百分比不考慮被比對序列之間不影響功能的保守性差別(conservative differences)。被比對序列間的相同性百分比可使用已為人們接受的工具(例如BLAST算法-堿基局部對準(zhǔn)檢索工具(Basic Local Alignment Search Tool)，Altschul 等人，(1990) J MoI Biol. 215:403-10)進行確定。在一個實施方式中，一種或多種分選酶錨定蛋白或一種或多種乳房鏈球菌蛋白為 SUB0135。在另一實施方式中，一種或多種分選酶錨定蛋白或一種或多種乳房鏈球菌蛋白不是 SUB 0135ο在一個實施方式中，一種或多種分選酶錨定蛋白或一種或多種乳房鏈球菌蛋白為 SUB0145。在另一實施方式中，一種或多種分選酶錨定蛋白或一種或多種乳房鏈球菌蛋白不是 SUBO145。在一個實施方式中，一種或多種分選酶錨定蛋白或一種或多種乳房鏈球菌蛋白為 SUB0207。在另一實施方式中，一種或多種分選酶錨定蛋白或一種或多種乳房鏈球菌蛋白不是 SUB0207。 在一個實施方式中，一種或多種分選酶錨定蛋白或一種或多種乳房鏈球菌蛋白為 SUB0826。在另一實施方式中，一種或多種分選酶錨定蛋白或一種或多種乳房鏈球菌蛋白不是 SUB0826。在一個實施方式中，一種或多種分選酶錨定蛋白或一種或多種乳房鏈球菌蛋白為 SUB0888。在另一實施方式中，一種或多種分選酶錨定蛋白或一種或多種乳房鏈球菌蛋白不是 SUB0888。在一個實施方式中，一種或多種分選酶錨定蛋白或一種或多種乳房鏈球菌蛋白為 SUB1095。在另一實施方式中，一種或多種分選酶錨定蛋白或一種或多種乳房鏈球菌蛋白不是 SUB1095。在一個實施方式中，一種或多種分選酶錨定蛋白或一種或多種乳房鏈球菌蛋白為 SUB1154。在另一實施方式中，一種或多種分選酶錨定蛋白或一種或多種乳房鏈球菌蛋白不是 SUB11M。在一個實施方式中，一種或多種分選酶錨定蛋白或一種或多種乳房鏈球菌蛋白為 SUB1370。在另一實施方式中，一種或多種分選酶錨定蛋白或一種或多種乳房鏈球菌蛋白不是 SUB1370。在一個實施方式中，一種或多種分選酶錨定蛋白或一種或多種乳房鏈球菌蛋白為 SUB1730。在另一實施方式中，一種或多種分選酶錨定蛋白或一種或多種乳房鏈球菌蛋白不是 SUB1730。在一個實施方式中，一種或多種分選酶錨定蛋白或一種或多種乳房鏈球菌蛋白為 SUB0241。在另一實施方式中，一種或多種分選酶錨定蛋白或一種或多種乳房鏈球菌蛋白不是 SUBOMl。在另一實施方式中，一種或多種分選酶錨定蛋白或一種或多種乳房鏈球菌蛋白不是SUB0164。在另一實施方式中，一種或多種分選酶錨定蛋白或一種或多種乳房鏈球菌蛋白不是SUB0348。在另一實施方式中，一種或多種分選酶錨定蛋白或一種或多種乳房鏈球菌蛋白不是SUB1739。在另一實施方式中，一種或多種分選酶錨定蛋白或一種或多種乳房鏈球菌蛋白不是SUB0206。在另一實施方式中，一種或多種分選酶錨定蛋白或一種或多種乳房鏈球菌蛋白不是SUB0337。蛋白的免疫原性部分是指能誘發(fā)免疫反應(yīng)的一個較大蛋白的部分。優(yōu)選地，被誘發(fā)的免疫反應(yīng)能識別蛋白的該部分和該蛋白整體。優(yōu)選地，該免疫原性部分包括全長蛋白的至少一個表位。免疫原性組合物是一種在向研究對象受治者給予該組合物時能夠誘發(fā)對組合物中抗原的免疫反應(yīng)的組合物。優(yōu)選地被誘發(fā)的免疫反應(yīng)是保護性的。優(yōu)選地，研究對象是哺乳動物，更優(yōu)選是反芻動物，例如牛，綿陽或山羊。本發(fā)明的免疫原性組合物中的抗原可以是一種或多種通過酶分選作用而被錨定在乳房鏈球菌表面的蛋白。優(yōu)選地，被本發(fā)明組合物誘發(fā)的免疫反應(yīng)是針對組合物中的抗原的，用來預(yù)防或減少在被給予免疫原性組合物的研究對象中的乳房鏈球菌的感染。該免疫反應(yīng)可識別或者消滅乳房鏈球菌。可選地或者另外地，被誘發(fā)的免疫反應(yīng)可阻止或預(yù)防乳房鏈球菌的復(fù)制。 可選地或者另外地，被誘發(fā)的免疫反應(yīng)可阻止或預(yù)防研究對象體內(nèi)由乳房鏈球菌引起的疾病，例如乳腺炎。優(yōu)選地，被組合物誘發(fā)的免疫反應(yīng)還能用于除從其中得到組合物中的蛋白的菌株之外的乳房鏈球菌菌株。產(chǎn)生的免疫反應(yīng)可以是細(xì)胞的和/或抗體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。通常地，免疫反應(yīng)包括但不限于下列效果中的一種或多種產(chǎn)生作用于組合物中的一種或多種免疫原性蛋白的抗體、B細(xì)胞(B cells)、輔助性T細(xì)胞(helper T cells)、抑制性T細(xì)胞(suppressor T cells)和 / 或細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞(cytotoxic T cells)。除了一種或多種乳房鏈球菌分選酶錨定蛋白或一種或多種乳房鏈球菌蛋白之外， 該組合物還可包括另外一種或多種抗原。該另外的抗原也會誘發(fā)免疫反應(yīng)，作用于從中獲得該抗原的病原生物。該另外的抗原可得自乳房鏈球菌，或者他們可得自不同的病原生物。當(dāng)該組合物被給予研究對象受治者時，可用來誘發(fā)/產(chǎn)生保護性免疫反應(yīng)。保護性免疫反應(yīng)可導(dǎo)致乳房鏈球菌在感染研究對象時被消滅，或者它可以預(yù)防或抑制乳房鏈球菌的復(fù)制和/或在研究對象體內(nèi)引起疾病。該組合物可用作對抗乳房鏈球菌的預(yù)防性或治療性疫苗。按照另一方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，它包括一種或多種乳房鏈球菌分選酶錨定蛋白或一種或多種乳房鏈球菌蛋白或其部分，和藥物學(xué)上可接受的載體或賦形劑。優(yōu)選地，該藥物組合物包括如本發(fā)明的任意方面中的組合物。優(yōu)選地，該藥物組合物能夠產(chǎn)生作用于乳房鏈球菌的保護性免疫反應(yīng)。本文中的措辭“產(chǎn)生保護性免疫反應(yīng)”意指該組合物能夠在被給藥的宿主生物體內(nèi)，例如，牛，產(chǎn)生保護性反應(yīng)。優(yōu)選地，保護性免疫反應(yīng)保護不受隨后的乳房鏈球菌感染。 該保護性免疫反應(yīng)可通過影響乳房鏈球菌的作用方式，減少乳房鏈球菌的復(fù)制來消除或減少感染的程度。優(yōu)選地，該保護性免疫反應(yīng)減少或預(yù)防由乳房鏈球菌引發(fā)的疾病。適合的用于藥物組合物中的可接受的賦形劑和載體對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是熟知的。這些包括固體或液體的載體。適合的液體載體包括水和鹽溶液。組合物中的蛋白可配制在乳液中，或者它們可以配制在生物可降解的微?；蛘咧|(zhì)體中。該組合物可進一步包括佐劑。適合的佐劑對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是熟知的，包括弗氏不完全佐劑(用于動物中)，和金屬鹽，例如鋁鹽或鈣鹽。該組合物還可包括聚合物或其它助劑以控制組合物的稠度，和/或控制蛋白從組合物中的釋放。該組合物還可包括其它助劑，例如稀釋劑，可包括水、鹽溶液；甘油或其他適合的醇等；潤濕或乳化劑；緩沖劑；增稠劑，例如纖維素或纖維素衍生物；防腐劑；洗滌劑；抗菌劑等。優(yōu)選地，組合物中的活性成分大于50%純度，通常大于80%純度，經(jīng)常大于90%純度，更優(yōu)選大于95%，98%或99%純度。最常使用的是活性成分接近100%純度，例如約99. 5% 純度或約99. 9%純度。本發(fā)明的組合物可用作對抗乳房鏈球菌引起的感染的疫苗。該疫苗可預(yù)防性地給予有暴露于乳房鏈球菌中的風(fēng)險的動物，和/或治療性地給予已經(jīng)暴露于乳房鏈球菌中的動物。優(yōu)選地，如果該組合物被用作疫苗，該組合物包括有效免疫劑量的抗原(由乳房鏈球菌蛋白構(gòu)成)?？乖摹坝行庖邉┝俊笔钱?dāng)在向單個個體單份量或多劑量地給藥時，對乳房鏈球菌的感染的治療或預(yù)防有效的劑量。該劑量依據(jù)所治療個體的健康和身體狀況和抗原而變化?？梢灶A(yù)料的是，該劑量會落入一個相對寬的范圍內(nèi)，該范圍可通過常規(guī)測試來確定。組合物的給藥途徑依據(jù)組合物中蛋白的配制而變化。該組合物可以被制成通過肌肉、皮層內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、靜脈或乳房內(nèi)給藥?？蛇x地，該組合物可以被制成通過腸胃外，例如鼻內(nèi)、口服、口腔、吸入、表皮、經(jīng)皮、局部、陰道或直腸給藥。該組合物可以制成按單劑量或多劑量的一部分來給藥。多劑量可以按照伴有一種或多種加強免疫的初次免疫來給藥。初次和加強免疫間合適的時間間隔可按常規(guī)方法確定。本發(fā)明的組合物在被給予研究對象受治者后可能會誘發(fā)血清殺菌抗體反應(yīng)。這些反應(yīng)能很方便地在小鼠中測得，且結(jié)果為疫苗效力的標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)。本發(fā)明的組合物可以也，或者可選擇地，會誘發(fā)免疫反應(yīng)，其能影響宿主細(xì)胞上的蛋白以防御乳房鏈球菌的感染，而不一定殺死細(xì)菌。按照另一方面，本發(fā)明提供一種或多種乳房鏈球菌分選酶錨定蛋白在制備用于誘發(fā)免疫反應(yīng)的藥物上的應(yīng)用。該藥物可用于對研究對象進行抗乳房鏈球菌的預(yù)防性或治療性疫苗接種。該藥物可以是預(yù)防性或治療性疫苗。按照再一方面，本發(fā)明提供一種保護人類或優(yōu)選是牛的非人類動物免受乳房鏈球菌感染的影響的方法，其包括向人類或非人類動物給予本發(fā)明任意其它方面的組合物。按照另一方面，本發(fā)明提供一種在人類或優(yōu)選是牛的非人類動物中增強免疫反應(yīng)的方法，包括向人類或非人類動物給予本發(fā)明的組合物。該免疫反應(yīng)優(yōu)選為保護性的。該方法可增強已經(jīng)過初次免疫的研究對象體內(nèi)的加強免疫。該免疫反應(yīng)可為預(yù)防性的或治療性的。本發(fā)明中的應(yīng)用、方法和組合物優(yōu)選用于乳房鏈球菌引起的疾病的預(yù)防和/或治療。熟練技術(shù)人員將理解上述討論的任意優(yōu)選特征能夠應(yīng)用于本發(fā)明的任意方面。現(xiàn)在僅通過實施例，結(jié)合下面的附圖和示例來描述本發(fā)明的優(yōu)選實施方式。


圖1A、B和C -顯示用野生型乳房鏈球菌0140J和乳房鏈球菌Srt變體在乳牛中進行免疫性試驗后的細(xì)菌分離、體細(xì)胞計數(shù)、臨床反應(yīng)的結(jié)果。圖1 (A)顯示免疫性試驗后乳房鏈球菌的細(xì)菌復(fù)蘇。數(shù)據(jù)表示用菌株0140J (正方形，n=4)或SrtA突變體(三角形， n=8)進行免疫性試驗后的動物牛奶中得到的細(xì)菌數(shù)量的幾何平均。圖1 (B)說明用野生型乳房鏈球菌和乳房鏈球菌Srt變體進行免疫性試驗后的炎癥反應(yīng)。數(shù)據(jù)表示用菌株0140J (正方形，n=4)或SrtA突變體(三角形，n=8)進行免疫性試驗后的動物牛奶中得到的體細(xì)胞數(shù)量的幾何平均。圖1 (C)說明用野生型乳房鏈球菌和乳房鏈球菌Srt變體進行免疫性試驗后臨床表現(xiàn)的綜合臨床得分。數(shù)據(jù)用依照如圖2所列使用了菌株0140J(正方形，n=4)或 SrtA突變體(三角形，n=8)的乳房部位外觀和牛奶外觀的給出的臨床得分的平均值表示。圖2 -以表格形式說明對乳房鏈球菌感染的臨床反應(yīng)的表現(xiàn)。在免疫性試驗后每次擠奶時按照這些標(biāo)準(zhǔn)來分析所有的乳房部位和牛奶樣品。
圖3 -以表格形式說明通過乳房鏈球菌基因組的生物信息學(xué)檢測所發(fā)現(xiàn)的蛋白，它們?nèi)菀妆环诌x酶錨定。用LPXXG基序(motif)檢索乳房鏈球菌基因組中推定存在的分選酶錨定的蛋白。列表中被識別出的蛋白通過基序(motif )的結(jié)構(gòu)和位置(context and position)進行純化，即，在C端處LPXXG朝向C端且其后跟著疏水區(qū)域和帶電殘基，在N端存在可識別的分泌信號肽。圖4A 列出在THB培養(yǎng)基中培養(yǎng)的乳房鏈球菌0140J的細(xì)胞壁提取物中發(fā)現(xiàn)的分選酶錨定蛋白。a按照乳房鏈球菌0140J的基因組序列的基因和蛋白注釋(Ward等人， 2009)。b從韋爾科姆基金會桑格學(xué)院研究所(Wellcome Trust Sanger Institute) (http:// www. Sanger, ac. uk/)的Artemis數(shù)據(jù)庫中獲得的蛋白前體的理論分子量數(shù)值。e每個蛋白的單獨肽段匹配數(shù)(unique peptide hits)。<1實驗檢測到的肽所涵蓋的蛋白質(zhì)序列的百分比。eSrtA突變體細(xì)胞壁片斷中發(fā)現(xiàn)的2種肽。圖4B 列出在BHI培養(yǎng)基中培養(yǎng)的乳房鏈球菌0140J的細(xì)胞壁提取物中發(fā)現(xiàn)的分選酶錨定蛋白。a按照乳房鏈球菌0140J的基因組序列的基因和蛋白注釋(Ward等人，2009)。b從韋爾科姆基金會桑格學(xué)院研究所(Wellcome Trust Sanger Institute) (http://www. sanger. ac. uk/)的 Artemis 數(shù)據(jù)庫中獲得的蛋白前體的理論分子量數(shù)值。e每個蛋白的單獨肽段匹配數(shù)(unique peptide hits)。d實驗檢測到的肽所涵蓋的蛋白質(zhì)序列的百分比。eSrtA突變體細(xì)胞壁片斷中發(fā)現(xiàn)的4種肽。圖5A和5B -顯示乳房鏈球菌0140J和srtA突變體的提取物中的SubllM和 Subl370的識別。圖5A -將兔抗SubllM抗血清用于對得自0140J (第2泳道)和SrtA 突變體(第3泳道)的蛋白質(zhì)洗滌劑提取物(protein detergent extracts)的印跡、和得自0140J (第4泳道)、srtA突變體(第5泳道)和SubllM突變體(第6泳道)的濃縮的沉淀介質(zhì)的印跡進行免疫印跡探針。分子量標(biāo)準(zhǔn)品示于第1泳道。圖5B -將兔抗Subl370抗血清用于對得自0140J (第1泳道)和SrtA突變體(第2泳道)的蛋白質(zhì)洗滌劑提取物的印跡、和得自0140J (第3泳道)、srtA突變體(第4泳道)和Subl370突變體(第5泳道)的濃縮的沉淀介質(zhì)的印跡進行免疫印跡探針。分子量標(biāo)準(zhǔn)品示于第6泳道。圖6A至60 -是乳房鏈球菌分選酶錨定蛋白的氨基酸序列。圖 6A 是 SUB1370 的序列(Seq ID No: 1)，鋅羧肽酶。圖6B是SUB0145的序列(Seq ID No: 2)，乳鐵結(jié)合蛋白。圖6C是SUB0135的序列(Seq ID No: 3)，果聚糖β果糖苷酶前體。圖 6D 是 SUB1730 的序列(Seq ID No: 4)。圖 6Ε 是 SUB0888 的序列(Seq ID No: 5)。圖 6F 是 SUB0207 的序列(Seq ID No: 6)。圖6G是SUBllM的序列(Seq ID No: 7)，枯草菌素類絲氨酸蛋白酶。圖6Η是SUB1095的序列(Seq ID No: 8)，膠原類蛋白質(zhì)。圖61是SUB0^6的序列(Seq ID No: 9)，推定的表面錨定的枯草桿菌酶 (putative surface anchored subtilase)。圖6J是SUB0164的序列(Seq ID No: 10)，推定的截短型表面錨定的纖維蛋白結(jié)合蛋白(但可能由假基因編碼)。圖6K是SUB0348的序列(Seq ID No: 11)，推定的膠原類蛋白質(zhì)的殘余(但是由假
基因編碼)。
圖6L是SUB1739的序列(Seq ID No: 12)，推定的表面錨定蛋白(但是由假基因編碼)。圖6M是SUB0206的序列(Seq ID No: 13)，推定的功能未知的輸出蛋白。圖6N是SUB0241的序列(Seq ID No: 14)，推定的功能未知的表面錨定蛋白。圖60是SUB0337的序列(Seq ID No: 15)，推定的表面定位的谷氨酰胺結(jié)合蛋白。圖7顯示經(jīng)過野生型(0140J)和缺少sub0145、subl095或subll54的減毒突變菌株進行免疫性試驗后的細(xì)菌繁殖。數(shù)據(jù)免疫性試驗后每次擠奶獲得的牛奶樣品中測量的 Log10 cfu/m的幾何平均數(shù)來表示。
具體實施例方式以下的數(shù)據(jù)證明，被分選酶，即轉(zhuǎn)酰氨基酶錨定到乳房鏈球菌表面的蛋白在毒性上是很重要的，而且也進一步說明某些這樣的蛋白(例如，subl095、subllM和sub0145)對毒性是非常重要的，因而要讓這種細(xì)菌引發(fā)疾病必須是有功能活性的。蛋白是很好的免疫原。對這些抗體形式的蛋白的免疫反應(yīng)有可能會消除他們的功能活性，因此，被識別出的蛋白將是意欲用于減少或預(yù)防乳房鏈球菌引起感染或疾病的免疫原性組合物中的有用成分。實施例1 乳房鏈球菌SrtA突變體的制備和鑒定方法和原料
菌株和反應(yīng)試劑
在整個研究過程中，使用的是從英國的一個牛乳腺炎臨床病例中原始分離出的乳房鏈球菌菌株0140J。細(xì)菌在Todd Hewitt或腦心浸液肉湯(Brain Heart Infusion broth)中按常規(guī)生長。用從動物健康研究所(Institute for Animal Health)的乳畜群中的數(shù)只母牛無菌采集得到的鮮牛奶制備脫脂牛奶。牛奶從無乳房內(nèi)感染的動物處采集。離心過濾(3，000 χ g, 10分鐘)后，小心地將脫脂牛奶從上表脂層(upper flat-layer)和沉淀細(xì)胞粒子 (pellet of sedimented cells)中取出。將500 μ 1牛奶直接置于含有七葉苷(aesculin) (1. 0%, w/v; ABA)的血液瓊脂平板培養(yǎng)，并以5ml牛奶和等體積的Todd Hewitt肉湯富集培養(yǎng)后在ABA上分離單菌落，以進行脫脂牛奶的無菌檢查。在這兩種情況下，平板在37° C 下孵育18小時。脫脂牛奶在4° C下保藏并于72小時內(nèi)使用。其它菌株和試劑依照本文中的描述使用。用基因型選擇(genotypic selection)分離srtA突變體
按照與在先描述類似的方法PCR篩選乳房鏈球菌0140J pGhost9::ISSl突變體庫 (Taylor, D. L.等人，2003. J Bacteriol 185:5210-5219; Ward, P. N.等人 2001 Infect Immun 69:392-399)后，分離SrtA (Sub0881)突變體。簡單地說，匯集單個的96 孔平板中的過夜培養(yǎng)物，制備基因組DNA用作PCR擴增反應(yīng)的模板，包括基因座特異引物 (locus-specific primer)、P261 (srtA)和 ISSl-特異引物、PM7 或P250。使用 35 個循環(huán) (95° C 下 20 秒，54° C 下 1 分鐘，72°C 下 3 分鐘)并用 AmpliTaq Gold master mix (ABI) 進行擴增反應(yīng)。凝膠電泳、溴化乙碇染色和紫外線光透射后觀察產(chǎn)物。平板確定之后，使用匯集自目標(biāo)平板的列和行的基因組DNA來類似地識別確定孔位置。突變體克隆分離后，在無抗生素選擇、允許的溫度C)下生長從而促進質(zhì)粒載體的切除。通過如前所述的DNA印跡法(Southern blotting) ( Ward, P. N.等人，2001 Infect Immun 69:392- 399)確認(rèn)了 p(ihost9載體的去除和ISSl的保留。通過對開放閱讀框架(open reading frame)的 PCR擴增和對制得的橫跨ISSl和被破壞的ORF之間連接點的產(chǎn)物的測序，確認(rèn)了 srtA中插入片段的存在。使用的PCR引物如下表1所示。
權(quán)利要求
1.一種免疫原性組合物，其包含一種或多種乳房鏈球菌蛋白或其免疫原性部分，其中， 當(dāng)該組合物被給予受治者時能誘發(fā)免疫反應(yīng)。
2.如權(quán)利要求1所述的免疫原性組合物，其中，所述一種或多種乳房鏈球菌蛋白是分選酶錨定蛋白或其免疫原性部分。
3 如權(quán)利要求1或2所述的免疫原性組合物，其中，所述一種或多種分選酶錨定蛋白，或所述一種或多種乳房鏈球菌蛋白選自包含下列蛋白的組蛋白SUB0145、SUB1095和 SUB11M，或與上述蛋白中的一種具有50%、60%、70%、80%、90%、95%或更高，優(yōu)選80%或更高的序列同源性的蛋白。
4.如權(quán)利要求1或2所述的免疫原性組合物，其中，所述一種或多種分選酶錨定蛋白，或所述一種或多種乳房鏈球菌蛋白可選自包含下列蛋白的組蛋白SUB0135、SUB0145、 SUB0207、SUB0826、SUB0888、SUB1095、SUBl 154、SUB1370, SUB1730 和 SUB0241，或與上述蛋白中的一種具有50%、60%、70%、80%、90%、95%或更高，優(yōu)選80%或更高的序列同源性的蛋白。
5.如權(quán)利要求1或2所述的免疫原性組合物，其中，所述一種或多種分選酶錨定蛋白，或所述一種或多種乳房鏈球菌蛋白可選自包含下列蛋白的組蛋白SUB0135、SUB0207、 SUB0826、SUB0888、SUB1095、SUBl 154、SUB1370, SUB1730 和 SUB0241，或與上述蛋白中的一種具有50%、60%、70%、80%、90%、95%或更高，優(yōu)選80%或更高的序列同源性的蛋白。
6.如權(quán)利要求1或2所述的免疫原性組合物，其中，所述一種或多種分選酶錨定蛋白， 或所述一種或多種乳房鏈球菌蛋白是SUB1K4。
7.如權(quán)利要求1或2所述的免疫原性組合物，其中，所述一種或多種分選酶錨定蛋白， 或所述一種或多種乳房鏈球菌蛋白是SUB1095。
8.如權(quán)利要求1或2所述的免疫原性組合物，其中，所述一種或多種分選酶錨定蛋白， 或所述一種或多種乳房鏈球菌蛋白是SUB0145。
9.如前述任一項權(quán)利要求所述的免疫原性組合物，其中，所述免疫原性組合物包含兩種或兩種以上乳房鏈球菌蛋白或其免疫原性部分。
10.如權(quán)利要求9所述的免疫原性組合物，其中，所述兩種或兩種以上分選酶錨定蛋白，或所述兩種或兩種以上多種乳房鏈球菌蛋白選自包含下列蛋白的組蛋白SUB0145、 SUB1095和SUB1154，或與上述蛋白中的一種具有50%、60%、70%、80%、90%、95%或更高，優(yōu)選 80%或更高的序列同源性的蛋白。
11.如前述任一項權(quán)利要求所述的免疫原性組合物，其中，所述免疫原性組合物包含蛋白SUB0145、SUB1095和SUBllM或與上述蛋白中的一種具有50%或更高的序列同源性的蛋白。
12.如前述任一項權(quán)利要求所述的免疫原性組合物，其中，所述組合物的免疫原性部分包括全長蛋白中的至少一個表位。
13.如前述任一項權(quán)利要求所述的免疫原性組合物，其中，所述受治體是哺乳動物，任意的反芻動物。
14.如前述任一項權(quán)利要求所述的免疫原性組合物，其中，所述免疫原性組合物包括一種或多種通過酶分選作用而被錨定在乳房鏈球菌表面的蛋白。
15.如前述任一項權(quán)利要求所述的免疫原性組合物，其中，所述抗原組合物能夠誘發(fā)對組合物中抗原的免疫反應(yīng)，并用來預(yù)防或減少乳房鏈球菌在被給予免疫原性組合物的受治者中的感染。
16.如前述任一項權(quán)利要求所述的免疫原性組合物，其中，所述組合物還包括除了一種或多種乳房鏈球菌分選酶錨定蛋白或一種或多種乳房鏈球菌蛋白之外的另外一種或多種抗原。
17.如前述任一項權(quán)利要求所述的免疫原性組合物，其中，當(dāng)所述組合物被給予受治者時，其被用來誘發(fā)/產(chǎn)生保護性免疫反應(yīng)。
18.如前述任一項權(quán)利要求所述的免疫原性組合物，其中，所述組合物用作對抗乳房鏈球菌的預(yù)防性或治療性疫苗。
19.如前述任一項權(quán)利要求所述的免疫原性組合物，其中，所述組合物進一步包括佐劑。
20.如前述任一項權(quán)利要求所述的免疫原性組合物，其中，所述組合物包括聚合物或其它助劑以控制組合物的稠度，和/或控制蛋白從組合物中的釋放。
21.如前述任一項權(quán)利要求所述的免疫原性組合物，其中，所述組合物中的活性成分大于50%純度。
22.如前述任一項權(quán)利要求所述的免疫原性組合物，其中，所述組合物用作對抗乳房鏈球菌引起的感染的疫苗。
23.如權(quán)利要求22所述的免疫原性組合物，其中，所述疫苗可預(yù)防性地給予暴露于乳房鏈球菌的風(fēng)險中的動物，和/或治療性地給予已經(jīng)暴露于乳房鏈球菌中的動物。
24.如權(quán)利要求22或23所述的免疫原性組合物，其中，所述組合物包括有效免疫劑量的由乳房鏈球菌蛋白構(gòu)成的抗原。
25.一種藥物組合物，其包含一種或多種乳房鏈球菌分選酶錨定蛋白或一種或多種乳房鏈球菌蛋白或其部分，和藥物學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
26.如權(quán)利要求25所述的藥物組合物，其進一步包括如權(quán)利要求I-M中任一項所述的組合物。
27.如權(quán)利要求25或沈所述的藥物組合物，其中，所述藥物組合物能對乳房鏈球菌產(chǎn)生保護性免疫反應(yīng)。
28.—種或多種乳房鏈球菌分選酶錨定蛋白在制備用于誘發(fā)免疫反應(yīng)的藥物中的應(yīng)用。
29.如權(quán)利要求觀所述的應(yīng)用，其中，所述藥物用于受治者對抗乳房鏈球菌的預(yù)防性或治療性疫苗接種。
30.一種保護人類或非人類動物免受乳房鏈球菌感染的影響的方法，其包括向人類或非人類動物給予如權(quán)利要求1-27所述的組合物。
31.一種在人類或非人類動物中增強免疫反應(yīng)的方法，包括向人類或非人類動物給予如權(quán)利要求1-27所述的組合物。
32.如權(quán)利要求1-27中任一項所述的組合物用于預(yù)防和/或治療由乳房鏈球菌引起的疾病。
全文摘要
本發(fā)明提供一種免疫原性組合物，其包含一種或多種乳房鏈球菌分選酶錨定的表面蛋白或其免疫原性部分，其中，當(dāng)該組合物被給予受治體時能夠誘發(fā)免疫反應(yīng)。
文檔編號A61K39/09GK102209555SQ200980144357
公開日2011年10月5日 申請日期2009年10月6日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月6日
發(fā)明者詹姆斯·利 申請人:諾丁漢大學(xué)