專利名稱：用微rna-196的過表達(dá)治療丙型肝炎病毒感染的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及用于治療丙型肝炎感染的方法和制劑。更具體而言，本發(fā)明涉及調(diào)控Bachl和/或HCV。能夠通過miR-196來使Bachl和HCV NS5A蛋白下調(diào)，同時(shí)使HMOXl上調(diào)。
背景技術(shù)：
丙型肝炎病毒(HCV)是黃病毒科中的一種小體積(尺寸為50nm)、具包膜的正義單鏈RNA病毒。雖然甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒因其都引起肝臟炎癥而具有相似的名稱，但在遺傳上和臨床上每種都是獨(dú)特且不同的病毒。HCV引起血源性(即通過血液與血液的接觸而傳播)傳染病，即丙型肝炎。該感染經(jīng)常是無癥狀的，但一旦建立，慢性感染能夠引起肝臟炎癥(慢性肝炎)。此病癥能夠進(jìn)展為肝臟瘢痕(纖維化)和晚期瘢痕(肝硬化)。在一些情況下，患肝硬化者會(huì)繼續(xù)發(fā)展出肝功能衰竭或其他肝硬化并發(fā)癥， 包括肝癌。急性丙型肝炎是指感染HCV后的前6個(gè)月。在急性期約60% 70%受感染的人不會(huì)出現(xiàn)癥狀。在經(jīng)歷急性期癥狀的一小部分患者中，這些癥狀通常是輕微的且非特異性的， 并幾乎不會(huì)導(dǎo)致對(duì)丙型肝炎的特定診斷。急性丙型肝炎感染的癥狀包括食欲降低、疲勞、腹痛、黃疸、癢和流感樣癥狀。在感染后1 3周內(nèi)，通常在血液中可檢測(cè)到HCV，并且在3 12周內(nèi)通常可檢測(cè)到針對(duì)此病毒的抗體。如肝功能檢驗(yàn)(LTF)中的歸一化(例如丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)歸一化)和血漿HCV-RNA清除(自發(fā)病毒清除)所顯示，在感染HCV的人中約15% 40%會(huì)在急性期將病毒從其身體中清除掉。剩余的60% 85%受HCV感染的患者會(huì)發(fā)展為慢性丙型肝炎(CHC)。慢性丙型肝炎被定義為持續(xù)超過6個(gè)月的HCV感染。慢性丙型肝炎的自然進(jìn)程在不同人之間會(huì)明顯有別?；旧纤惺蹾CV感染的人在肝臟活檢上都顯示出炎癥跡象。然而，肝臟瘢痕(纖維化)的進(jìn)展速度在個(gè)體間會(huì)顯示出顯著的可變性。最近的數(shù)據(jù)表示在未受治療的患者中約1/3會(huì)在不到20年內(nèi)進(jìn)展為肝硬化。另外1/3會(huì)在30年內(nèi)進(jìn)展為肝硬化。在實(shí)質(zhì)性的肝臟瘢痕出現(xiàn)前，通常沒有能特異性地指示肝臟疾病的癥狀。然而，丙型肝炎是全身性疾病，在發(fā)展為晚期肝臟疾病前，患者可能經(jīng)歷從無癥狀到癥狀更明顯的病況的多種臨床表現(xiàn)形式。與慢性丙型肝炎有關(guān)的普遍體征和癥狀包括疲勞、明顯的體重減輕、流感樣癥狀、肌肉痛、關(guān)節(jié)痛、間歇性低熱、癢、睡眠障礙、腹痛(尤其在右上腹部)、食欲改變、惡心、腹瀉、消化不良、認(rèn)知改變、抑郁、頭痛和情緒波動(dòng)?！┞员透窝滓堰M(jìn)展為肝硬化，可能出現(xiàn)通常由肝功能減弱或肝循環(huán)高壓 (一種被稱為門靜脈高血壓的病癥)引起的體征和癥狀?？赡艿母斡不w征和癥狀包括腹水(腹內(nèi)液體的積累)、挫傷和出血傾向、骨痛、血管曲張(靜脈擴(kuò)張，尤其在胃和食道中)、 脂肪糞(脂肪瀉)、黃疸和一種被稱為肝性腦病的認(rèn)知缺損綜合征。慢性丙型肝炎比其他形式肝炎更多地被診斷出來，其原因在于與HCV的存在有關(guān)的肝外表現(xiàn)形式，例如具有甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)或甲狀腺機(jī)能減退的甲狀腺炎(甲狀腺炎癥)、 遲發(fā)性皮膚卟啉病、冷球蛋白血癥(一種小血管血管炎形式)和腎小球腎炎(腎臟炎癥) 尤其是膜性增生性腎小球腎炎(MPGN)。丙型肝炎還與干燥綜合征、血小板減少、扁平苔蘚、 糖尿病以及B細(xì)胞淋巴增生性紊亂有關(guān)。丙型肝炎病毒感染是世界性健康問題，其疫苗目前尚不存在。慢性丙型肝炎(CHC) 目前的標(biāo)準(zhǔn)療法是組合使用聚乙二醇化干擾素(IFN)和三氮唑核苷，但僅有50%的患者對(duì)該治療有響應(yīng)。另外，這種治療價(jià)格高、用時(shí)長，并伴有多種令人不快的副作用。據(jù)估計(jì)全世界有1. 5 2億人感染了丙型肝炎。因此，仍然需要發(fā)現(xiàn)并開發(fā)針對(duì)HCV的且用于治療全部丙型肝炎形式的抗病毒療法和程序。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供通過使表達(dá)丙型肝炎病毒蛋白的人類肝瘤細(xì)胞中的Bachl蛋白表達(dá)水平降低來治療患有HCV感染的細(xì)胞或哺乳動(dòng)物的方法，從而滿足至少一些前述需求。 Bachl蛋白表達(dá)水平的降低能夠通過下述方式來實(shí)現(xiàn)用miRNA-196模擬物來轉(zhuǎn)染細(xì)胞，從而使miRNA-196與Bachl mRNA的3，_UTR結(jié)合來降低Bachl的表達(dá)。該miRNA僅需包含匹配性的“種子區(qū)”來有效地結(jié)合Bachl mRNA的3’ -UTR。優(yōu)選使該miRNA上調(diào)或過表達(dá)來增大Bachl表達(dá)水平的降低幅度。通過合成的miRNA模擬物來使miRNA-196的水平上調(diào)， 該合成miRNA模擬物進(jìn)入miRNA途徑并充當(dāng)成熟miRNA-196。還可以通過使表達(dá)HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的細(xì)胞中的HMOXl基因表達(dá)上調(diào)來治療患有 HCV感染的哺乳動(dòng)物。在多個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞中HMOXl基因表達(dá)的上調(diào)伴有Bachl基因表達(dá)的下調(diào)。因此，miRNA-196通過與負(fù)調(diào)控HMOXl的Bachl結(jié)合來間接地使HMOXl上調(diào)。 對(duì)每個(gè)的調(diào)控都能夠通過用miRNA-196模擬物轉(zhuǎn)染細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)。此外，通過用miRNA-196 模擬物轉(zhuǎn)染細(xì)胞來使HCV在受感染細(xì)胞中的表達(dá)降低，從而能夠治療受HCV感染的細(xì)胞，例如肝細(xì)胞。在另一方面，本發(fā)明提供藥物制劑，該制劑適合用于向哺乳動(dòng)物施用miRNA-196 模擬物，從而能夠用miRNA模擬物轉(zhuǎn)染受HCV感染的細(xì)胞。施用這些制劑會(huì)在肝細(xì)胞中在翻譯階段阻遏Bachl表達(dá)、使HMOXl上調(diào)并調(diào)控HCV復(fù)制。重要的是，本發(fā)明展示了位于Bachl的3，-UTR中的功能性miRNA-196結(jié)合位點(diǎn)，該位點(diǎn)導(dǎo)致Bachl基因表達(dá)的下調(diào)、HMOXl基因表達(dá)的上調(diào)和HCV基因表達(dá)的下調(diào)。 miRNA-196的應(yīng)用為治療受HCV感染的細(xì)胞和患有丙型肝炎(例如慢性HCV感染)的哺乳動(dòng)物并且也許還為治療以氧化應(yīng)激升高為特征的其他疾病提供了新的額外療法。


在對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了上述一般性描述之后，現(xiàn)將述及附圖，所述附圖不一定按比例繪制，其中
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圖IA顯示了 miR-196與所靶定的第一個(gè)推定Bachl3’ -UTR位點(diǎn)間的第一個(gè)種子區(qū)匹配的示意圖；圖IB顯示了 miR-196與所靶定的推定Bachl3，-UTR位點(diǎn)間的第二個(gè)種子區(qū)匹配的示意圖；圖2A闡明了與用miRNA-196模擬物轉(zhuǎn)染相關(guān)的下調(diào)的Bachl蛋白水平；圖2B闡明了與用miRNA-196抑制劑轉(zhuǎn)染相關(guān)的上調(diào)的Bachl蛋白水平；圖2C顯示了 miRNA-196模擬物轉(zhuǎn)染并未改變Bachl mRNA的水平；
圖3A闡明了與miRNA-196模擬物相關(guān)的HMOXl mRNA水平上調(diào)；圖;3B顯示了用miRNA-196模擬物轉(zhuǎn)染并未改變Cullin 3 mRNA的水平；圖4A闡明了與用miRNA-196模擬物轉(zhuǎn)染相關(guān)的HCV NS5A蛋白水平下調(diào)；圖4B闡明了與用miRNA-196抑制劑轉(zhuǎn)染相關(guān)的HCV NS5A蛋白水平上調(diào)；圖4C闡明了在Con 1 (亞型lb)全長復(fù)制子細(xì)胞中通過用miRNA-196模擬物轉(zhuǎn)染而引起的HCV NS5A水平和核心mRNA水平的下調(diào)；圖5A顯示了 Bachl3，-UTR的兩個(gè)針對(duì)miRNA-196的種子匹配位點(diǎn)；圖 5B 闡明了 pGL3_Bachl 的示意圖，pGL3_Bachl 是通過 Lipofectamine 2000 與 pGL3-BachU pRL_TK(海腎)和miR-196模擬物或抑制劑一起用于對(duì)細(xì)胞進(jìn)行共轉(zhuǎn)染的螢火蟲熒光素酶(f-luc)報(bào)告基因構(gòu)建體；圖5C顯示了 miRNA-196模擬物抑制了 pGL3-Bachl報(bào)告基因載體的f_luc活性；圖5D顯示了 miRNA-196抑制劑使pGL3-Bachl報(bào)告基因載體的f_luc活性略微升尚；圖6A闡明了對(duì)Bachl3’ -UTR的兩個(gè)種子匹配位點(diǎn)中的四個(gè)核苷酸的置換；圖 6B 闡明了在用突變 pGL3-Bachl 或 pGL3_Bachl、pRL_TK(海腎)以及 miR-196 模擬物共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中miRNA-196模擬物使pGL3-Bachl_WT而非pGL-Bachl_Mut報(bào)告基因的f-luc活性降低；圖 6C 闡明了在用突變 pGL3-Bachl 或 pGL3_Bachl、pRL-TK(海腎)以及 miR-155 模擬物共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中miR-155模擬物使pGL3-Bachl-WT和pGL-Bachl_Mut報(bào)告基因的 f-luc活性降低；圖7A闡明了被引入miRNA-196種子匹配位點(diǎn)的四個(gè)核苷酸突變；圖7B顯示了用pGL3-Bachl、pRL-TK和濃度逐步升高的模擬物陰性對(duì)照、miR-196 模擬物或突變miR-196共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中的熒光素酶活性；圖8A闡明了突變miRNA-196和突變Bachl3，-UTR間的種子匹配的恢復(fù)；圖8B顯示了用突變報(bào)告基因(pGL3-Bachl-Mut)、pRL-TK以及突變miRNA-196或野生型miRNA-196共轉(zhuǎn)染48小時(shí)的細(xì)胞中的測(cè)量出的熒光素酶活性；圖9A顯示了在轉(zhuǎn)染有J6/Jrai RNA的Huh-7. 5細(xì)胞中miRNA-196模擬物對(duì)HCVJ6/ JFHl RNA水平的下調(diào)作用；圖9B顯示了在轉(zhuǎn)染有分泌到了培養(yǎng)物上清液中的J6/JFH1丙型肝炎病毒的 Huh-7. 5細(xì)胞；和圖9C顯示了在轉(zhuǎn)染有分泌到了培養(yǎng)物上清液中的J6/JFH1丙型肝炎病毒的 Huh-7. 5細(xì)胞中miRNA-196模擬物對(duì)HCV J6/JFH1蛋白水平的下調(diào)作用。
具體實(shí)施例方式現(xiàn)將參照附圖在下文對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更全面的描述，在附圖中顯示了一些但非所有本發(fā)明的實(shí)施方式。實(shí)際上，這些發(fā)明可以以多種不同的形式來實(shí)施并且不應(yīng)將其解讀為受限于本文所述的實(shí)施方式；而提供這些實(shí)施方式是為了使本公開滿足適用的法律要求。已承認(rèn)丙型肝炎病毒(HCV)在肝細(xì)胞中直接誘發(fā)氧化應(yīng)激。同樣已承認(rèn)的是， 血紅素加氧酶I(HMOXl)是具有抗氧化和抗炎癥活性的關(guān)鍵細(xì)胞保護(hù)性酶。因此，可以將 HMOXl的存在或應(yīng)用視為用來消除或減輕HCV所誘發(fā)的氧化應(yīng)激的方法。然而，Bachl,-種堿性亮氨酸拉鏈(bZip)哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)錄阻遏物，會(huì)負(fù)調(diào)控HMOXl。因此，僅Bachl水平的降低或者其伴隨HMOXl水平的升高，能夠潛在地預(yù)防或改善丙型肝炎。Bachl是編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因，所述因子屬于cap’ η’ collar型堿性區(qū)亮氨酸拉鏈因子家族(CNC-bZip)。所編碼的蛋白含有Broad簇(broad complex)、iTramtrack、 bric-a-brac/痘病毒和鋅指(ΒΤΒ/Ρ0Ζ)結(jié)構(gòu)域，這對(duì)于CNC-bZip家族成員而言是非典型的。這些ΒΤΒ/Ρ0Ζ結(jié)構(gòu)域促進(jìn)蛋白-蛋白間相互作用和同源及異源寡聚體的形成。當(dāng)該編碼的蛋白與MafK形成異源二聚體時(shí)，其充當(dāng)Maf識(shí)別元件(MARE)的阻遏物并使轉(zhuǎn)錄受到阻遏。更突出的是，Bachl是哺乳動(dòng)物的HMOXl轉(zhuǎn)錄阻遏物，其對(duì)HMOXl的基因表達(dá)進(jìn)行負(fù)調(diào)控。Bachl與Maf相關(guān)致癌基因家族形成拮抗性異源二聚體。這些異源二聚體與Maf識(shí)別元件(MARE)結(jié)合，并抑制對(duì)含有Maf的異源二聚體和其他正轉(zhuǎn)錄因子產(chǎn)生響應(yīng)的基因 (例如，HMOXl和NQ01)的表達(dá)。miRNA是小分子非編碼RNA(約22nt)，通常認(rèn)為其是基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)子。在本發(fā)明之前，對(duì)微RNA是否調(diào)控和如何調(diào)控Bachl或HCV還基本未知。本發(fā)明首次認(rèn)識(shí)到 miRNA-196直接作用于BachlmRNA的3 ’-UTR，并且在翻譯階段阻遏該蛋白的表達(dá)并使HMOXl 上調(diào)。此外，miR-196還抑制HCV NS5A蛋白的表達(dá)。所以，miRNA-196在對(duì)肝細(xì)胞中的HCV 復(fù)制和HMOXl/Bachl表達(dá)的調(diào)控中起到重要作用，也許甚至是關(guān)鍵作用。因此，通過施用 miRNA-196模擬物從而用miRNA-196模擬物轉(zhuǎn)染受感染的細(xì)胞，從而能夠治療受HCV感染的細(xì)胞或患有肝炎的哺乳動(dòng)物。優(yōu)選的是，miRNA-196的過表達(dá)及其向受感染細(xì)胞的轉(zhuǎn)染可以有利地提供預(yù)防或改善丙型肝炎感染的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，miRNA-196的水平通過合成的miRNA模擬物而上調(diào)，該miRNA模擬物進(jìn)入miRNA途徑并充當(dāng)成熟miRNA-196。如上所述，miRNA是小分子非編碼RNA (約22nt)，通常認(rèn)為其是基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)子。更具體而言，miRNA是長度為約21 23個(gè)核苷酸的單鏈RNA分子，其主要通過翻譯阻遏來對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。miRNA由轉(zhuǎn)錄自DNA但不翻譯成蛋白的基因(非編碼RNA)編碼； 相反miRNA從初級(jí)轉(zhuǎn)錄物(稱作pri-miRNA)經(jīng)加工成為短莖環(huán)結(jié)構(gòu)(稱作pre-miRNA)， 并最終成為功能性的miRNA。成熟miRNA分子與一種或多種信使RNA(mRNA)的一部分互補(bǔ)，并且其主要功能是使基因表達(dá)下調(diào)。miRNA看似在基因調(diào)控中發(fā)揮功能。出于此目的， miRNA與一種或多種信使RNA (mRNA)的一部分互補(bǔ)。動(dòng)物miRNA通常與3’UTR中的位點(diǎn)互補(bǔ)。miRNA向mRNA的退火隨后會(huì)抑制蛋白翻譯，但有時(shí)會(huì)促進(jìn)mRNA的剪切。在這種情況下，通過miRNA的結(jié)合所導(dǎo)致的雙鏈RNA形成會(huì)通過與類似于RNA干擾(RNAi)的過程來觸發(fā)mRNA轉(zhuǎn)錄物的降解。然而，在其他情況下，據(jù)信miRNA復(fù)合體會(huì)在不引起mRNA降解的情況下阻斷蛋白翻譯機(jī)制或者阻止蛋白翻譯。目前，靶基因發(fā)生下調(diào)的確切機(jī)制尚不清楚。
出于本發(fā)明的目的，微RNA模擬物(例如，miRNA-196模擬物)是用ON-TARGET 進(jìn)行化學(xué)修飾以增加其穩(wěn)定性和提高其活性的雙鏈RNA寡核苷酸。微RNA模擬物模擬內(nèi)源性前體miRNA而進(jìn)入miRNA途徑并充當(dāng)成熟的miRNA物種。在miRNA-mRNA異源雙鏈體末端的6 8堿基對(duì)“種子區(qū)”的序列互補(bǔ)性似乎決定了 miRNA-靶RNA間相互作用的特異性。最早認(rèn)識(shí)到miR-196與同源框(HOX)簇(對(duì)動(dòng)物中多種發(fā)育程序至關(guān)重要的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因群)具有相當(dāng)大程度的且進(jìn)化上保守的互補(bǔ)性，并調(diào)控HOX基因表達(dá)。本發(fā)明提出miRNA-196靶定HCV基因組并且通過靶定Bachl mRNA的3，UTR來使 HMOXl基因上調(diào)。因此，能夠通過用miRNA-196模擬物轉(zhuǎn)染受HCV感染的細(xì)胞來治療該受感染的細(xì)胞。通過對(duì)受HCV感染的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，可以在提高HMOXl水平的同時(shí)降低Bachl 的表達(dá)水平。有利的是，對(duì)負(fù)調(diào)控HMOXl的Bachl的下調(diào)有助于提高HMOXl的表達(dá)。如上所述，HMOXl提供抗氧化效果來減輕HCV所誘發(fā)的氧化應(yīng)激。此外，可以用IFNii治療來誘導(dǎo)miRNA-196的上調(diào)。這種對(duì)miRNA-196的誘導(dǎo)可見于人類肝細(xì)胞瘤細(xì)胞系Huh_7以及原代小鼠肝細(xì)胞中。miRNA的數(shù)量持續(xù)增加，而且其所調(diào)控的其他mRNA和候選基因持續(xù)得到鑒定。就肝臟而言，miRNA-122經(jīng)鑒定為肝細(xì)胞中表達(dá)豐度最高的miRNA，并且據(jù)顯示其對(duì)若干膽固醇代謝酶有重要影響。此外據(jù)顯示，miRNA-122是HCV表達(dá)所必需的。通常，miRNA-122 的影響取決于其同源種子序列結(jié)合位點(diǎn)的環(huán)境和位置，并且在5’區(qū)的位點(diǎn)主要與表達(dá)的上調(diào)有關(guān)，而在3’未翻譯區(qū)的位點(diǎn)主要與表達(dá)的阻遏有關(guān)。本發(fā)明的實(shí)施方式包括使用 miRNA-196模擬物來作為HCV NS5A蛋白表達(dá)的下調(diào)調(diào)節(jié)子。該蛋白對(duì)于HCV的完整表達(dá)和正常表達(dá)而言是必不可少的。因此，本發(fā)明的實(shí)施方式包括用治療有效量的miRNA-196模擬物來治療受感染的細(xì)胞或患有丙型肝炎的哺乳動(dòng)物的方法。治療有效量可以通過已知的施用途徑來提供。例如，根據(jù)本發(fā)明多個(gè)實(shí)施方式，可以通過局部施用途徑、經(jīng)腸施用途徑或胃腸外施用途徑來施用包含miRNA-196模擬物的治療劑?，F(xiàn)已普遍接受，HCV感染會(huì)在受感染的肝細(xì)胞中造成氧化應(yīng)激升高，并且可能在其他受感染的細(xì)胞中也是如此。這種升高的氧化應(yīng)激的一個(gè)重要介導(dǎo)物是HCV核心蛋白。同樣已被接受的是，HMOXl有助于保護(hù)多種細(xì)胞和組織免受過高的氧化應(yīng)激的潛在損害性效果。如上所述，HMOXl是具有抗氧化和抗炎癥活性的關(guān)鍵細(xì)胞保護(hù)性酶，其可以消除或減輕 HCV所誘發(fā)的氧化應(yīng)激。更具體而言，HMOXl是催化血紅素降解并產(chǎn)生在體內(nèi)具有抗氧化和抗炎癥活性的亞鐵、一氧化碳和膽綠素的關(guān)鍵細(xì)胞保護(hù)性酶。HMOXl的這些有利性質(zhì)是基于HMOXl的下述能力其可減少可以作為強(qiáng)力促氧化劑的“游離”或松散結(jié)合的血紅素，并提高具有強(qiáng)抗氧化劑和抗炎癥及抗成纖維效果的一氧化碳、膽綠素和膽紅素的產(chǎn)量。對(duì)HMOXl基因表達(dá)的調(diào)控是復(fù)雜的。然而，本發(fā)明已顯示，在多個(gè)物種的HMOX基因 5’未翻譯區(qū)中，用于調(diào)控HMOXl的重要位點(diǎn)包含一系列擴(kuò)展的AP-I位點(diǎn)(亦稱為抗氧化響應(yīng)元件)、Maf蛋白響應(yīng)元件[MARE]和金屬卟啉響應(yīng)元件[MPRE]。Bachl是cap，n，collar 家族鋅亮氨酸拉鏈蛋白成員。其在對(duì)HMOXl基因表達(dá)的增強(qiáng)性阻遏(tonic repression) 中起關(guān)鍵作用。其通過與小Maf蛋白形成異源二聚體并阻斷該基因的轉(zhuǎn)錄激活來發(fā)揮此作用。Bachl包含若干共有結(jié)合位點(diǎn)(都包含CP基序)，這些部位在結(jié)合血紅素時(shí)，會(huì)導(dǎo)致該蛋白的構(gòu)象發(fā)生變化并且使其與Maf蛋白的親和力明顯降低并使隨后的抑制作用降低，并且增加HMOXl基因表達(dá)活性。一種主要刺激性Maf蛋白是Nrf2。Nrf2的上調(diào)與HMOXl基因表達(dá)的升高有關(guān)。鑒于上文所述，HMOXl活性可能在HCV感染中升高。然而，臨床研究已鑒定出在慢性丙型肝炎情況中HMOXl表達(dá)降低。因此，具有導(dǎo)致較低水平HMOXl基因表達(dá)的遺傳因素或其他因素的患者在急性接觸HCV后發(fā)展慢性丙型肝炎感染的風(fēng)險(xiǎn)可能升高，并且/或者因HCV感染而發(fā)展更快速進(jìn)展的肝臟疾病的風(fēng)險(xiǎn)更高。較低水平的HMOXl基因表達(dá)可能與慢性丙型肝炎感染相關(guān)，并且Bachl負(fù)調(diào)控 HMOXl。因此，以降低受感染細(xì)胞中的Bachl水平的方式對(duì)受HCV感染的細(xì)胞或患有丙型肝炎的哺乳動(dòng)物進(jìn)行治療能夠有利地減輕HCV的影響。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式包括治療患有丙型肝炎感染的哺乳動(dòng)物的方法，所述方法通過下述方式來進(jìn)行用miRNA-196模擬物轉(zhuǎn)染細(xì)胞，從而使miRNA-196與Bachl mRNA的3，-UTR結(jié)合來降低Bachl的表達(dá)并使 HMOXl上調(diào)。優(yōu)選使該miRNA-196過表達(dá)，從而提供更多的miRNA-196用來結(jié)合Bachl并使 HMOXl上調(diào)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，用miRNA-196治療患有HCV感染(例如慢性丙型肝炎)的哺乳動(dòng)物。特別而言，用使Bachl表達(dá)下調(diào)的miRNA-196模擬物來轉(zhuǎn)染受感染的細(xì)胞。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，在表達(dá)HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的受感染細(xì)胞中Bachl蛋白表達(dá)水平能夠通過下述方式來降低用miRNA-196模擬物轉(zhuǎn)染細(xì)胞，從而使miRNA-196與Bachl mRNA 的3，-UTR結(jié)合來降低Bachl的表達(dá)。在一個(gè)優(yōu)選的方法中，與Bachl mRNA的3，-UTR結(jié)合的miRNA-196被過表達(dá)。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，還通過施用干擾素β來使miRNA-196 上調(diào)。在另一實(shí)施方式中，還通過miRNA-196模擬物的單獨(dú)施用或與干擾素β的共同施用來使miRNA-196上調(diào)。對(duì)單個(gè)受感染細(xì)胞或者對(duì)攜帶此類受感染細(xì)胞的哺乳動(dòng)物的治療在施用治療有效量的miRNA-196模擬物時(shí)能夠?qū)е翨achl蛋白表達(dá)水平的顯著降低?！爸委熡行Я俊笔侵赣脕碛行е委熀?或防止一種或多種所靶向的病癥的針對(duì)受感染細(xì)胞或具有肝炎的哺乳動(dòng)物的miRNA-196模擬物的量。作為一般性指導(dǎo)，用于治療HCV感染的miRNA-196模擬物的每日治療量一般可以是0. 5 μ mol/kg體重 5 μ mol/kg體重，或1. 0 μ mol/kg體重 4ymol/kg體重，或2ymol/kg體重 3ymol/kg體重。在替代性實(shí)施方式中，miRNA-196 模擬物的治療量可以是0. 1 μ mol/kg體重 1 μ mol/kg體重，或0. 25 μ mol/kg體重 1 μ mol/kg 體重，或 0· 25 μ mol/kg 體重 0. 75 μ mol/kg 體重。在多個(gè)實(shí)施方式中，Bachl蛋白表達(dá)水平可以減少約10% 約75%，或約25% 約65%。在其他實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)染后M小時(shí)的Bachl蛋白表達(dá)水平可以減少約25% 約 75%，或約50% 約60%。在另外的實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)的Bachl蛋白表達(dá)水平可以減少約40 % 約80 %，或約60 % 約70 %。如上文所討論，提高HM0X1基因表達(dá)水平能夠有利于消除或減輕HCV所誘發(fā)的氧化應(yīng)激。在用miRNA-196進(jìn)行轉(zhuǎn)染后，能夠有利地使表達(dá)HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的細(xì)胞中的HM0X1 基因表達(dá)升高。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式提供通過在表達(dá)HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的細(xì)胞中使 HM0X1基因表達(dá)上調(diào)來治療感染HCV的細(xì)胞或患有HCV感染的哺乳動(dòng)物的方法。通過用治療有效量的miRNA-196模擬物轉(zhuǎn)染受感染的細(xì)胞來使HM0X1基因表達(dá)上調(diào)。在一個(gè)實(shí)施方式中，在細(xì)胞中HM0X1的上調(diào)伴有Bachl基因表達(dá)的下調(diào)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，上述方法包括使miRNA-196上調(diào)或過表達(dá)來治療肝細(xì)胞。在多個(gè)實(shí)施方式中，相對(duì)于未用miRNA_196 模擬物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中的HMOXl表達(dá)水平，HMOXl的表達(dá)提高了約2倍 約3倍。除了阻遏Bachl表達(dá)外，在表達(dá)HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的人類肝細(xì)胞中，HCV非結(jié)構(gòu)蛋白 5a(HCV NS5A)的表達(dá)也受到了阻遏。因此，本發(fā)明的實(shí)施方式包括用miRNA模擬物治療受 HCV感染的細(xì)胞?？梢杂胢iRNA-196模擬物來轉(zhuǎn)染受感染的細(xì)胞，從而使HCVNS5A的表達(dá)下調(diào)。優(yōu)選使所述miRNA-196過表達(dá)。本發(fā)明的某些實(shí)施方式包括通過用miRNA-196模擬物轉(zhuǎn)染細(xì)胞來使表達(dá)HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的細(xì)胞中的HCV NS5A表達(dá)降低，從而治療受HCV感染的細(xì)胞或患有HCV感染的哺乳動(dòng)物。也就是說，在某些實(shí)施方式中，通過用miRNA模擬物轉(zhuǎn)染細(xì)胞來使HCV復(fù)制子細(xì)胞及受HCV感染的細(xì)胞中的HCV RNA表達(dá)和/或蛋白表達(dá)降低，從而治療患有HCV感染的哺乳動(dòng)物。在一個(gè)這樣的實(shí)施方式中，HCV NS5A蛋白的表達(dá)水平降低了 10% 60%，或20% 50%。在另一個(gè)實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)染后M小時(shí)的HCV NS5A蛋白表達(dá)水平降低了約45% 約 55%，而轉(zhuǎn)染后48小時(shí)的HCVNS5A蛋白表達(dá)水平降低了約35% 約45%。本申請(qǐng)中所用的術(shù)語“轉(zhuǎn)染”用來描述使用病毒載體或其他轉(zhuǎn)移方法將外來物質(zhì)導(dǎo)入真核細(xì)胞中。動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染通常涉及在細(xì)胞質(zhì)膜中打通短暫存在的孔或“洞”，從而允許攝取物質(zhì)。可以轉(zhuǎn)染遺傳物質(zhì)(例如超螺旋質(zhì)粒DNA或siRNA構(gòu)建體)甚至蛋白質(zhì) (例如抗體)。除了電穿孔外，還能夠通過使陽離子脂類與所述物質(zhì)混合以產(chǎn)生脂質(zhì)體來進(jìn)行轉(zhuǎn)染，所述脂質(zhì)體與細(xì)胞質(zhì)膜融合并將其運(yùn)載物存放到內(nèi)部。轉(zhuǎn)染的一個(gè)可行的方法可以利用磷酸鈣。將含有磷酸離子的HEPES緩沖鹽溶液 (HeBS)與含有待轉(zhuǎn)染物質(zhì)的氯化鈣溶液混合。當(dāng)二者混合時(shí)，將形成帶正電的鈣和帶負(fù)電的磷酸的細(xì)小沉淀物，并在其表面結(jié)合有待轉(zhuǎn)染的物質(zhì)。隨后將該沉淀物的懸浮液加至待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。雖然尚未完全理解此過程，但是細(xì)胞會(huì)攝取一些沉淀物并伴隨攝取待轉(zhuǎn)染物質(zhì)。其他方法使用高度支化的有機(jī)化合物(例如樹枝狀高分子)來結(jié)合遺傳物質(zhì)(例如DNA、RNA或miRNA)并使其進(jìn)入細(xì)胞。另一種方法是將待轉(zhuǎn)染的遺傳物質(zhì)包含到脂質(zhì)體中，即具有膜邊界的小體，其在某些方面與細(xì)胞結(jié)構(gòu)相似并且事實(shí)上也能夠與質(zhì)膜融合從而將遺傳物質(zhì)釋放到細(xì)胞中。對(duì)于真核細(xì)胞，更常用的是脂-陽離子類的轉(zhuǎn)染，因?yàn)榧?xì)胞會(huì)更加敏感。另一方法是使用陽離子聚合物，例如DEAE-葡聚糖或聚乙醇胺。帶負(fù)電的遺傳物質(zhì)結(jié)合聚陽離子，隨后該復(fù)合物由細(xì)胞通過胞吞作用來攝取。轉(zhuǎn)染的直接方法是基因槍，其中使遺傳物質(zhì)與惰性固體(通常為金)的納米粒偶聯(lián)，并隨后將其直接“射”入靶細(xì)胞的細(xì)胞核中。還可以用病毒作為運(yùn)載體來將遺傳物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞中。在這種情況下，該技術(shù)稱為病毒性轉(zhuǎn)導(dǎo)，并且稱所述細(xì)胞被轉(zhuǎn)導(dǎo)。其他轉(zhuǎn)染方法包括核轉(zhuǎn)染(rmcleofection)、電穿孔、熱休克、磁轉(zhuǎn)染和專用轉(zhuǎn)染試劑(例如 Lipofectamine、Dojindo Hi Iymax、Fugene、jetPEI、Effectene 或 DreamFect)。通過援引并入本文的美國專利第5，942，634號(hào)描述了使用陽離子雙親分子來促進(jìn)生物活性(治療性)分子轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞中。美國專利第5，942，634號(hào)還教導(dǎo)了如何通過使治療性分子與一種或多種陽離子雙親分子的分散體接觸來制造含有該治療性分子的治療組合物?？梢赃f送至細(xì)胞中的治療性分子包括DNA、RNA和多肽。此類組合物能夠用來提供基因療法并將反義多核苷酸或生物活性多肽遞送至細(xì)胞中。在又一方面，本發(fā)明提供用來治療患有丙型肝炎、優(yōu)選慢性丙型肝炎的細(xì)胞或哺乳動(dòng)物的藥物制劑。本發(fā)明的制劑應(yīng)包含治療有效量的miRNA-196模擬物，從而在HMOXl 表達(dá)升高的同時(shí)使Bachl和/或HCV NS5A下調(diào)。本發(fā)明的實(shí)施方式適于使得能夠?qū)?miRNA-196模擬物轉(zhuǎn)染至表達(dá)HCV的肝細(xì)胞中。本發(fā)明的制劑可以包含或使用但不限于用來將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)染至靶細(xì)胞中的任何前述方法。根據(jù)多個(gè)實(shí)施方式，本發(fā)明的制劑能夠以用于經(jīng)腸施用的形式提供。例如，能夠以用于口服施用的片劑、膠囊或液體藥劑形式提供本發(fā)明實(shí)施方式的制劑。然而更優(yōu)選的是， 將所述制劑提供為靜脈內(nèi)注射用液體制劑。在其他實(shí)施方式中，能夠以注射用或輸注用的形式提供所述制劑。舉例而言，可以將本發(fā)明的各種制劑靜脈內(nèi)施用(進(jìn)入靜脈)、動(dòng)脈內(nèi)施用(進(jìn)入動(dòng)脈)、肌肉內(nèi)施用(進(jìn)入肌肉)、皮下施用(在皮下)、皮內(nèi)施用(進(jìn)入皮膚本身)、鞘內(nèi)施用(進(jìn)入脊髓管)或腹膜內(nèi)施用(輸注或注射至腹膜內(nèi))。在施用治療有效量的miRNA-196模擬物時(shí)，用本發(fā)明實(shí)施方式的制劑對(duì)單個(gè)受感染細(xì)胞或者對(duì)含有此類受感染細(xì)胞的哺乳動(dòng)物進(jìn)行的治療能夠造成Bachl和HCVNS5A 蛋白表達(dá)水平的顯著降低和HMOXl水平的升高?！爸委熡行Я俊笔侵赣脕碛行е委熀?或預(yù)防一種或多種所靶向的病癥的針對(duì)受感染細(xì)胞或患有肝炎的哺乳動(dòng)物的miRNA-196模擬物的量。作為一般性指導(dǎo)，用于治療HCV感染的miRNA-196模擬物的每日治療量一般可以是0. 5 μ mol/kg體重 5 μ mol/kg體重，或1. 0 μ mol/kg體重 4 μ mol/kg體重，或 2 μ mol/kg體重 3 μ mol/kg體重。在替代性實(shí)施方式中，miRNA-196模擬物的治療量可以是0. 1 μ mol/kg體重 1 μ mol/kg體重，或0· 25 μ mol/kg體重 1 μ mol/kg體重，或 0. 25 μ mol/kg 體重 0. 75 μ mol/kg 體重。實(shí)施例I.材料和實(shí)驗(yàn)A.試劑和抗體BCA 蛋白測(cè)定試劑從 Pierce Biotechnology(Rockford，IL)獲得。達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)和胎牛血清(FBS)來自HyClone (Logan, UT)。Dual-Glo 熒光素酶測(cè)定系統(tǒng)來自 Promega(Madison，WI)。TRIzol 購自 hvitrogen(Carlsbad， CA)，遺傳霉素(G-418)來自 Gibco (Grand Island, NY)。引物由 htegrated DNA Technologies (Coralville, ΙΑ)合成。4 % 15 % 梯度的 SDS-PAGE 凝膠和 ImmunBlot PVDF膜購自Bio-Rad(Hercules，CA)。鼠抗HCV NS5A和鼠抗HCV NS3單克隆抗體購自Virogen (Watertown，ΜΑ)。山羊抗人Bachl和GAPDH多克隆抗體來自Santa CruzBiotechnology(Santa Cruz, CA)。 ECL_Plus : 自 Amersham(Piscataway, NJ)。B.細(xì)胞培養(yǎng)9-13細(xì)胞由海德堡大學(xué)(海德堡，德國)提供。9-13細(xì)胞系是人類肝細(xì)胞瘤Huh-7 細(xì)胞群，含有復(fù)制性的HCV非結(jié)構(gòu)區(qū)并穩(wěn)定表達(dá)HCV非結(jié)構(gòu)蛋白NS3至NS5B。將細(xì)胞保養(yǎng)在補(bǔ)充有10% (體積/體積)FBS、100u/ml青霉素、100 μ g/ml鏈霉素和500 μ g/ml G-148 的DMEM中。Con 1 (亞型lb)全長復(fù)制子Huh-7. 5細(xì)胞(Conl細(xì)胞)來自Rockefeller大學(xué)(紐約，NY)。Conl細(xì)胞系是含有全長HCV基因型Ib復(fù)制子的Huh_7. 5細(xì)胞群，其中在多肽的第2204位氨基酸上進(jìn)行了高度適應(yīng)性的從絲氨酸到異亮氨酸的取代。將Conl細(xì)胞保養(yǎng)在補(bǔ)充有10% (體積/體積)FBS及0. ImM非必須氨基酸、100單位/ml青霉素、100 μ g/ ml鏈霉素和選擇抗體750 μ g/ml G148的DMEM中。將細(xì)胞保養(yǎng)在37°C的加濕的氣氛(95% 室內(nèi)空氣和5% CO2)中。C.小分子RNA及構(gòu)建體用于has-miRNA-196、has-miRNA-16、定制的突變 has-miRNA-196 和 miRNA 模擬物陰性對(duì)照(MMNC)的 miRIDIAN 微 RNA 模擬物從 Dharmacon (Lafayette，CO)獲得。微 RNA 模擬物是用ON-TARGET 對(duì)其進(jìn)行了化學(xué)修飾從而提高了其穩(wěn)定性和活性的雙鏈RNA寡核苷酸。微RNA模擬物模擬內(nèi)源前體miRNA而進(jìn)入miRNA途徑并充當(dāng)成熟的miRNA物種。此外，下述miRNA抑制劑也來自Dharmacon :has_miR-196和miRNA抑制劑陰性對(duì)照(MINC)。 miRIDIAN小分子RNA發(fā)卡抑制劑是最新一代的合成寡核苷酸抑制劑，其被設(shè)計(jì)用來抑制天然miRNA活性。pRL-TK載體來自!Iomega。pRL_TK報(bào)告基因載體包含編碼海腎熒光素酶的 cDNA(Rluc)來作為內(nèi)參對(duì)照?qǐng)?bào)告基因。包含1837bp的Bachl 3，-UTR片段的pGL3_Bachl 熒光素酶報(bào)告基因構(gòu)建體由佛羅里達(dá)大學(xué)((Gainesville，F(xiàn)L)提供。突變pGL3-Bachl由 GENEWIZ, Inc. (South Plainfield, NJ)制成。構(gòu)建體通過限制性酶切和測(cè)序來確認(rèn)。D.轉(zhuǎn)染和熒光素酶活性測(cè)定根據(jù)制造商的操作規(guī)程使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)來進(jìn)行轉(zhuǎn)染。簡言之，用pGL3-Bachl或突變pGL3-Bach、pRL_TK和測(cè)試過的miRNA來共轉(zhuǎn)染9-13細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，收集細(xì)胞并使其裂解。使用Dual-Glo 熒光素酶測(cè)定系統(tǒng)來測(cè)量熒光素酶報(bào)告基因的活性。將螢火蟲熒光素酶活性歸一化至海腎熒光素酶活性，并使用BCA蛋白測(cè)定試劑盒確定總蛋白。為了便于比較，將轉(zhuǎn)染有pGL3-Bachl和pRL_TK的細(xì)胞的值設(shè)為等于 1。E.體外轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)染和感染HCV感染性克隆體PJ6/JFH1由C. M. Rice (Rockefeller大學(xué)，紐約，NY)慷慨贈(zèng)與， 該克隆體是全長嵌合基因組，其中核心NS2區(qū)來自感染性的J6 (基因型2a)，NS3 NS5B 區(qū)來自感染性的JFHl (基因型2b)。先前已報(bào)導(dǎo)了由基于J6/JFH1的細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的 HCV(HCVcc)的制備。簡言之，用^CbaI使PJ6/JFH1質(zhì)粒線型化，隨后通過乙醇沉淀進(jìn)行純化，用蛋白酶K酶切，并進(jìn)行苯酚-氯仿提取。使用該線型質(zhì)粒作為體外轉(zhuǎn)錄的模板，所述體外轉(zhuǎn)錄用MEGAscript T7試劑盒(Ambion，Austin，TX)進(jìn)行。為了進(jìn)行HCV RNA轉(zhuǎn)染，在轉(zhuǎn)染前一天將Hub-7. 5細(xì)胞平板接種至M孔板中，并且在覆蓋度(confluence)為70% 80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。通過使用2 μ g/孔的HCV RNA和4 μ 1/孔的Lipofectamine 2000從而以1 2的RNA/Lipofectamine比來對(duì)細(xì)胞進(jìn)行48小時(shí)的轉(zhuǎn)染。為了感染初始Hub_7. 5細(xì)胞，收集來自用HCV RNA轉(zhuǎn)染了 48小時(shí)的細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液，使其過濾通過0. 20 μ m 過濾器，并加到初始Huh-7. 5細(xì)胞的培養(yǎng)物中。F.蛋白質(zhì)印跡如此前所述進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。簡言之，在SDS-PAGE凝膠上分離總蛋白(30 μ g 50μ g)。在電泳轉(zhuǎn)移至ImmunBlot PVDF膜上后，在含有5%脫脂奶粉和0. 1% Tween-20的 PBS中將膜封閉1小時(shí)，并隨后于4°C與一抗溫育過夜。對(duì)一抗的稀釋如下對(duì)于抗Bachl抗體為1 1000，對(duì)于抗HCV NS5A和抗GAPDH抗體為1 2000。隨后使膜與綴合有辣根過氧物酶的二抗(1 10，000稀釋)溫育1小時(shí)。最后，根據(jù)制造商的操作規(guī)程用ECL-Plus化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)來使結(jié)合的抗體可視化。使用Kodak 1DV3. 6基于計(jì)算機(jī)的成像系統(tǒng)(Rochester， NY)來對(duì)進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡后所獲得的每個(gè)特定條帶的相對(duì)光密度進(jìn)行測(cè)量。G.定量 RT-PCR從受測(cè)細(xì)胞中提取總RNA，如此前所述合成cDNA。所用的引物如下=Bach-I特異性正義引物 5，-GGACACTCCTTGCCAAATGCAG-3，(22bp)，反義引物 5，-TGACCTGGTTCTGGGCTCTCAC -3，(22bp) ；HMOXl 特異性正義引物 5，-CGGGCCAGCAACAAAGTG-3，(18bp)，反義引物 5，-AGTG TAAGGACCCATCGGAGAA-3，(22bp) ；Cul3 特異性正義引物 5，-GTGCTCACGACAGGATA-3，(17bp)， 反義弓丨物 5，-GTTTGGCTAAGTAGAACCTTC-3，2Ibp) ；GAPDH 特異性正義引物 5，-TTGTTGCCATCAATGACCC-3，(19bp)，反義引物 5，-CTTCCCGTTCTCAGCCTTG-3，(19bp)。使用 CFX96 實(shí)時(shí) PCR 檢測(cè)系統(tǒng)(Bio-Rad)和 iQ SYBR Green Supermix 實(shí)時(shí) PCR 試劑盒 (Bio-Rad)來執(zhí)行實(shí)時(shí)定量RT-PCR。包括了無模板和無逆轉(zhuǎn)錄酶的樣品來作為陰性對(duì)照， 其如預(yù)期產(chǎn)生了可忽略的信號(hào)(Ct值>35)。在針對(duì)同一樣品中的GAPDH量進(jìn)行歸一化后， 通過比較Ct分析來計(jì)算倍數(shù)變化值。初始實(shí)驗(yàn)顯示對(duì)細(xì)胞進(jìn)行的若干處理和操作未影響 GAPDH基因的表達(dá)。H.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析初始分析顯示結(jié)果呈正態(tài)分布。因此，使用了參數(shù)性統(tǒng)計(jì)方法。使用學(xué)生t檢驗(yàn) (用于兩種情況的比較)或方差分析(用于多于兩種情況的比較)來分析樣品間的差異。 將小于0.05的P值認(rèn)為在統(tǒng)計(jì)上是顯著的。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)進(jìn)行了三次，其結(jié)果相似。對(duì)每個(gè)治療組的所有實(shí)驗(yàn)都包含至少三等分的樣品。示出了單個(gè)實(shí)驗(yàn)的代表結(jié)果。用來自SAS Institute (Cary，NC)的JMP 4. 0. 4軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。II.結(jié)果A.電腦分析預(yù)測(cè)出miR-196與Bachl mRNA 3，-UTR的兩個(gè)種子區(qū)匹配使用生物信息學(xué)方法來鑒定潛在的miRNA靶標(biāo)。對(duì)TargetScan 4. 0數(shù)據(jù)庫的在線搜索顯示了在Bachl mRNA的3，-UTR中包含至少兩個(gè)推定的miRNA_196種子匹配位點(diǎn)。 如圖IA和IB所示，所預(yù)測(cè)的結(jié)合位點(diǎn)之一 0觀0 2^6nt)在人、小鼠、大鼠、雞和狗中高度保守，而另一個(gè)推定部位(2161 2166nt)在不同物種間的保守性較差。在Nrf2和 HMOXl基因中未發(fā)現(xiàn)所預(yù)測(cè)的miRNA-196結(jié)合位點(diǎn)，在Bachl基因的編碼區(qū)中未發(fā)現(xiàn)推定的 miRNA-196結(jié)合位點(diǎn)(數(shù)據(jù)未示出)。B.在表達(dá)HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的9-13細(xì)胞中miRNA-196下調(diào)轉(zhuǎn)錄阻遏物Bachl并上調(diào) HMOXl為了在實(shí)驗(yàn)中證實(shí)推定的miR-196結(jié)合位點(diǎn)具有功能，用miRNA-196特異性模擬物或抑制劑轉(zhuǎn)染了 9-13細(xì)胞。Bachl蛋白和mRNA水平分別通過蛋白質(zhì)印跡和qRT-PCR來評(píng)估。與miRNA模擬物陰性對(duì)照(MMNC)相比，轉(zhuǎn)染有miRNA-196模擬物的9_13細(xì)胞在轉(zhuǎn)染M小時(shí)后顯示出Bachl蛋白表達(dá)水平的顯著降低(降低了約55% )，并且在轉(zhuǎn)染48小時(shí)后降低了約64%。與空轉(zhuǎn)染(mock)相比，在轉(zhuǎn)染有miRNA模擬物陰性對(duì)照的細(xì)胞中未檢測(cè)到對(duì)Bachl蛋白水平的影響(圖2A)。與miRNA抑制劑陰性對(duì)照不同的是，miRNA-196特異性抑制劑對(duì)miRNA-196的下調(diào)作用使Bachl蛋白水平顯著升高(圖2B)。然而，在9_13 細(xì)胞中未觀察到miRNA-196對(duì)Bachl mRNA水平有顯著影響。miRNA-196模擬物轉(zhuǎn)染并未改變Bachl mRNA的水平(圖2C)。這些結(jié)果表明在人類干細(xì)胞瘤9_13細(xì)胞中miRNA_196對(duì) Bachl的調(diào)控可能出現(xiàn)在翻譯水平。由于Bachl是公認(rèn)的HMOXl基因的轉(zhuǎn)錄阻遏物，本發(fā)明接下來確定了 miRNA_196 對(duì)Bachl蛋白的下調(diào)作用是否可以使HMOXl基因表達(dá)升高。所以用miRNA_196模擬物或 miRNA模擬物陰性對(duì)照對(duì)9-13細(xì)胞進(jìn)行了 48小時(shí)的轉(zhuǎn)染。48小時(shí)后，通過qRT-PCR對(duì) HMOXl和Cullin 3 (Cul 3，非特異性基因?qū)φ?的mRNA水平進(jìn)行了定量。如圖3A所示，與等量的miRNA模擬物陰性對(duì)照相比，mRNA-196模擬物使HMOXl的mRNA水平顯著上調(diào)了 2. 4 倍。如圖:3B所示，Cul 3的mRNA水平未上調(diào)。C.在表達(dá)HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的9-13細(xì)胞中miRNA-196阻遏HCV非結(jié)構(gòu)NS5A蛋白的表達(dá)在本發(fā)明之前，尚不知道在表達(dá)HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的人類肝細(xì)胞瘤細(xì)胞中 miRNA-196是否會(huì)使HCV非結(jié)構(gòu)NS5A蛋白的水平發(fā)生變化。為了確定在表達(dá)HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的人類肝細(xì)胞瘤細(xì)胞中miRNA-196是否會(huì)使HCV非結(jié)構(gòu)NS5A蛋白的水平發(fā)生變化，用 miRNA-196模擬物或抑制劑轉(zhuǎn)染了 9_13細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后M小時(shí)和48小時(shí)，進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡來分析NS5A和GAPDH蛋白的水平。如圖4A所示，與等量的miRNA模擬物陰性對(duì)照相比，轉(zhuǎn)染M小時(shí)后50nM miRNA-196模擬致使NS5A蛋白表達(dá)水平顯著降低了約52%，并且在轉(zhuǎn)染 48小時(shí)后降低了約37%。相比之下，如圖4B所示，miRNA-196特異性抑制劑對(duì)miRNA-196 的下調(diào)作用使NS5A蛋白的水平顯著升高了 2. 2倍。為了評(píng)估m(xù)iRNA-196是否可以抑制HCV 復(fù)制，用陰性對(duì)照或miRNA-196模擬物對(duì)Conl全長HCV復(fù)制子Huh_7. 5細(xì)胞進(jìn)行了 48小時(shí)的轉(zhuǎn)染。如圖4C所示，與miRNA模擬物陰性對(duì)照(MMNC)相比，miRNA-196導(dǎo)致病毒RNA 水平顯著降低。D.在基于HCV JFHl的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中miR-196抑制HCV表達(dá)通過Lipofectamine 2000 用 2 μ g/孔的 HCV J6/JFH1 RNA 轉(zhuǎn)染 Huh_7. 5 細(xì)胞。48 小時(shí)后，用miRNA-196模擬物或miRNA模擬物陰性對(duì)照(MMNC)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。為了進(jìn)行HCV感染，如前所述，將初始Huh-7. 5與采集自轉(zhuǎn)染有J6/JFH1的細(xì)胞的Iml細(xì)胞培養(yǎng)物上清液一起培養(yǎng)。暴露于該上清液48小時(shí)后，用miRNA-196模擬物或miRNA模擬物陰性對(duì)照(MMNC) 轉(zhuǎn)染細(xì)胞48小時(shí)。收集細(xì)胞，提取總RNA和蛋白。通過qRT-PCR對(duì)HCV RNA進(jìn)行了定量， 并通過蛋白質(zhì)印跡測(cè)量了 HCV NS3和GAPDH蛋白水平。在HCV JFHl基因組的HCVNS5A基因的編碼區(qū)中，發(fā)現(xiàn)了 miRNA-196的極佳匹配。 在HCV J6/JFH1細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中觀察到了 miRNA-196對(duì)HCV表達(dá)的下調(diào)效果。在轉(zhuǎn)染有J6/ JFHl 的 Huh-7. 5 細(xì)胞中，50nM miRNA-196 致使 HCV J6/JFH1 RNA 顯著減少了幾乎 70% (如圖9A所示)，在感染有J6/JFH1的Huh-7. 5細(xì)胞中減少了約50% (如圖9B所示)，并且在感染有J6/JFH1的Huh-7. 5細(xì)胞中使HCV NS3蛋白減少了約60% (如圖9C所示)。這些結(jié)果與之前在JFHl細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中觀察到的一致。E.在表達(dá)HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的9-13細(xì)胞中miRNA-196與Bachl mRNA的3，-UTR直接相互作用為了進(jìn)一步確定miRNA-196 靶定 Bachl mRNA 的 3，_UTR，如圖 5A 所示，BachlmRNA 的3’-UTR包含兩個(gè)所預(yù)測(cè)的miR-196種子匹配位點(diǎn)。使用了被稱作pGL3-Bachl的報(bào)告基因構(gòu)建體，而不是進(jìn)行較間接和特異性較低的調(diào)控，在該構(gòu)建體中Bachl3’ -UTR位于螢火蟲熒光素酶(f-luc)開放閱讀框下游(圖5B)。用pGL-BaChl(f-lUC)、pRL-TK(海腎，用來為轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行歸一化)和miRNA陰性對(duì)照以及miRNA-196模擬物或抑制劑或miRNA_196 (在 Bachl mRNA的3’ -UTR中不具有所預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)的“陰性”miR)來共轉(zhuǎn)染9_13細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，測(cè)試熒光素酶報(bào)告基因活性。miRNA-196模擬物轉(zhuǎn)染使報(bào)告基因活性顯著降低了約53%，而miRNA模擬物陰性對(duì)照和miRNA-196模擬物對(duì)熒光素酶報(bào)告基因活性無影響。此外，在轉(zhuǎn)染有miRNA-196抑制劑的細(xì)胞中未觀察到報(bào)告基因活性有顯著變化。如圖 5C所示，miRNA-196模擬物抑制了 pGL3_Bachl報(bào)告基因的f_luc活性，而miRNA-196抑制劑使pGL3-Bachl報(bào)告基因的f_luc活性略微升高。 接下來，用含有四個(gè)核苷酸突變的Bachl 3’ -UTR的Luc報(bào)告基因構(gòu)建體(稱為 pGL3-BachI-Mut)(圖 6A)及 pRL_TK、miRNA-196 模擬物或 miRNA-155 模擬物(未對(duì) pGL3-Bachl-WT和pGL3_BachI-Mut中所預(yù)測(cè)的miR-155結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行更改的“陰性”miR) 共轉(zhuǎn)染9-13細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，使用雙重?zé)晒馑孛笢y(cè)定系統(tǒng)(來自！Iomega)來測(cè)量熒光素酶報(bào)告基因活性，將螢火蟲熒光素酶活性歸一化至海腎熒光素酶活性和總蛋白。如圖6B所示，miRNA-196模擬物使pGL3_Bachl_WT的f-luc活性降低,但未使pGL_Bachl_Mut 報(bào)告基因載體的f-luc活性降低。miRNA-196模擬物轉(zhuǎn)染以劑量依賴性方式使熒光素酶活性顯著降低，而在轉(zhuǎn)染有包含突變了的miRNA-196結(jié)合位點(diǎn)的報(bào)告基因構(gòu)建體的細(xì)胞中 miRNA-196未使報(bào)告基因活性發(fā)生變化。如圖6C所示，miRNA_155使pGL3_Bachl_WT和 pGL3-BachI-Mut中的報(bào)告基因活性都略微下降。這些結(jié)果表明miRNA-196直接調(diào)控Bachl 基因表達(dá),并且miRNA-196通過BachlmRNA的3，-UTR來介導(dǎo)Bachl的下調(diào)。
為了進(jìn)一步確定miRNA-196和Bachl_3’ -UTR之間的直接相互作用，如圖7A所示， 導(dǎo)入四核苷酸突變物來產(chǎn)生突變的miRNA-196，其中刪除了 Bachl mRNA的3’ -UTR的種子匹配位點(diǎn)。用pGL3-Bachl-WT、pRL-TK、濃度逐步升高的miRNA模擬物陰性對(duì)照、miRNA-196 模擬物或突變的miRNA-196模擬物來共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，測(cè)試熒光素酶報(bào)告基因活性。如圖7B所示，miRNA-196以劑量依賴性方式使熒光素酶活性顯著降低，這與本文中之前的觀察一致； 然而miRNA陰性對(duì)照和突變的miR-196并未影響熒光素酶活性，進(jìn)一步表明了 miR-196和 Bachl mRNA的3，-UTR之間的直接相互作用。由于包含與突變pGL3-Bachl (pGL3-Bachl-Mut)互補(bǔ)的堿基的突變 miRNA-196 (miR-196-Mut)與突變報(bào)告基因(Bachl_3，-UTR-Mut)重新在其種子區(qū)形成極佳匹配(如圖8A所示)，所以miR-196-Mut應(yīng)當(dāng)恢復(fù)其對(duì)Bach 1-3，-UTR-Mut活性的影響。在轉(zhuǎn)染有突變pGL3-Bachl(其經(jīng)突變而與突變的miRNA-196 “契合”)的細(xì)胞中，突變 miRNA-196模擬物明顯抑制了熒光素酶活性。在另一方面，未觀察到野生型miRNA-196對(duì)突變報(bào)告基因(pGL3-Bachl-MUt)的熒光素酶基因活性有顯著影響。所以，如圖8B所示，這進(jìn)一步證實(shí)了 miR-196和Bachl mRNA的3，-UTR之間的直接相互作用。上述實(shí)驗(yàn)工作說明，miRNA-196模擬物轉(zhuǎn)染使Bachl和HCV非結(jié)構(gòu)NS5A蛋白水平顯著下調(diào)，并使HMOXl基因表達(dá)上調(diào)。因此，在對(duì)肝細(xì)胞中的HCV復(fù)制和HMOXl/Bachl表達(dá)所進(jìn)行的調(diào)控中，miRNA-196能夠起到重要作用、甚至是關(guān)鍵作用。所以，miR-196的上調(diào)能夠?yàn)槁员透窝谆蛟S還有其他肝病癥的療法提供額外的新治療途徑。得益于上述說明書和附圖中所呈現(xiàn)的教導(dǎo)，本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將會(huì)想到本文所述的發(fā)明的多種修改及其他實(shí)施方式。因此，應(yīng)理解的是，本發(fā)明將不限于所公開的具體實(shí)施方式
，并且意在將修改和其他實(shí)施方式包含在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。雖然本文采用了特定的術(shù)語，但對(duì)其的使用僅在一般性和描述性的意義上而并非出于限制性目的。
權(quán)利要求
1.一種治療患有HCV感染的哺乳動(dòng)物的方法，所述方法包括使表達(dá)HCV的受感染細(xì)胞中的Bachl蛋白表達(dá)水平降低。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，使表達(dá)HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的細(xì)胞中的所述Bachl蛋白表達(dá)水平降低包括用miRNA-196模擬物轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞，從而使miRNA_196與BachlmRNA 的3，-UTR結(jié)合來降低Bachl的表達(dá)。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，所述方法還包括使miRNA-196或miRNA-196模擬物上調(diào)或過表達(dá)。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，通過施用干擾素β來使miRNA-196上調(diào)。
5.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述Bachl蛋白表達(dá)水平降低了約10% 約75%。
6.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，轉(zhuǎn)染M小時(shí)后所述Bachl蛋白表達(dá)水平降低了約 50% 約 60%。
7.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后所述Bachl蛋白表達(dá)水平降低了約 60% 約 70%。
8.一種治療患有HCV感染的哺乳動(dòng)物的方法，所述方法包括使受HCV感染的細(xì)胞中的 HMOXl基因表達(dá)上調(diào)。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，所述方法還包括使所述細(xì)胞中的Bachl基因表達(dá)下調(diào)。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，通過用miRNA-196模擬物轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞來使 Bachl基因表達(dá)下調(diào)。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，所述方法還包括使miRNA-196上調(diào)或過表達(dá)。
12.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述細(xì)胞包括肝細(xì)胞。
13.如權(quán)利要求11所述的方法，其中，相對(duì)于未用miRNA-196模擬物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中的 HMOXl表達(dá)水平，HMOXl的表達(dá)提高了約2倍 約3倍。
14.一種治療患有HCV感染的哺乳動(dòng)物的方法，所述方法包括通過用miRNA模擬物轉(zhuǎn)染HCV復(fù)制子細(xì)胞及受HCV感染的細(xì)胞來使所述細(xì)胞中的HCV RNA表達(dá)和蛋白表達(dá)降低。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，所述方法還包括使miRNA-196上調(diào)或過表達(dá)。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中，HCVNS5A蛋白表達(dá)水平降低了 10% 60%。
17.如權(quán)利要求15所述的方法，其中，轉(zhuǎn)染后M小時(shí)所述HCVNS5A蛋白表達(dá)水平降低了約45% 約55%。
18.如權(quán)利要求15所述的方法，其中，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)所述HCVNS5A蛋白表達(dá)水平降低了約35% 約45%。
19.一種用于治療表達(dá)HCV非結(jié)構(gòu)蛋白的細(xì)胞和患有丙型肝炎的哺乳動(dòng)物的制劑，所述制劑包含治療有效量的miRNA-196模擬物，從而在使HMOXl表達(dá)升高的同時(shí)使Bachl和 HCV NS5A表達(dá)水平下調(diào)；其中，所述制劑適于使miRNA-196模擬物能夠轉(zhuǎn)染至表達(dá)HCV蛋白的肝細(xì)胞中。
20.如權(quán)利要求19所述的制劑，其中，所述miRNA-196模擬物包含于脂質(zhì)體中，從而使所述miRNA-196模擬物能夠釋放至表達(dá)HCV蛋白的細(xì)胞中。
21.如權(quán)利要求20所述的制劑，其中，所述制劑包含陽離子脂。
22.如權(quán)利要求19所述的制劑，所述制劑還包含陽離子雙親分子，從而使所述 miRNA-196模擬物能夠釋放至表達(dá)HCV蛋白的細(xì)胞中。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過用miRNA-196模擬物轉(zhuǎn)染受HCV感染的細(xì)胞來治療所述受感染的細(xì)胞和患有HCV感染的哺乳動(dòng)物的方法。miRNA-196使Bach1蛋白和HCV基因表達(dá)顯著下調(diào)，同時(shí)還使HMOX1基因表達(dá)上調(diào)。miRNA-196結(jié)合Bach1 mRNA的3’-UTR來降低Bach1的表達(dá)。因此，miRNA-196能夠在對(duì)肝細(xì)胞中的HCV復(fù)制和HMOX1/Bach1表達(dá)的調(diào)控中起到重要作用。本發(fā)明還提供用于治療表達(dá)HCV的細(xì)胞的制劑，該制劑包含治療有效量的miRNA-196，從而在提高HMOX1表達(dá)的同時(shí)使Bach1和HCV基因表達(dá)下調(diào)。該制劑適于使miRNA-196模擬物能夠轉(zhuǎn)染至表達(dá)HCV蛋白的肝細(xì)胞中。
文檔編號(hào)A61K31/713GK102257140SQ200980145162
公開日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2009年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月8日
發(fā)明者侯衛(wèi)紅, 赫伯特·L·幫科夫斯基 申請(qǐng)人:夏洛特-梅克倫堡醫(yī)院管理局D/B/A卡羅萊納醫(yī)學(xué)中心