專利名稱：使用絲狀噬菌體治療帕金森病的方法
使用絲狀噬菌體治療帕金森病的方法發(fā)明背景發(fā)明領域本發(fā)明涉及用于治療帕金森病(Parkinson’ s disease)的療法和方法。相關技術描述帕金森病(PD)是進行性神經變性疾病，其主要臨床特征包括運動異常，諸如靜止性震顫、運動徐緩和強直(Fahn和Sulzer，2004)。PD的特征在于黑質致密部中失去多巴胺能神經元和相同區(qū)域的仍然存在的神經元中存在稱為雷維小體和雷維神經突的包含體 (Forno，1996)。盡管普遍公認失去中腦多巴胺能神經元在很大程度上負責主要的運動癥狀，但是這不是顯示PD患者中病理改變的唯一區(qū)域。雷維病理學和細胞失去首先出現(xiàn)在下腦干神經核(lower brain stem nuclei)中，逐漸上升至中腦并以高度可預測的方式最終到達皮質區(qū)(Braak等，2004)。雷維病理學向中腦外不同區(qū)域的進展可以解釋PD患者中常見次要癥狀，諸如憂郁、癡呆和多種自主神經和感覺功能障礙的大量存在。盡管PD的原因仍不清楚，但是存在大量證據提示α -突觸核蛋白的錯折疊和異常聚集是該疾病發(fā)病機理的重要組成。遺傳連鎖分析已經鑒定了三種處于帕金森病遺傳形式的錯義突變(Kruger等1998 ；Polymeropoulos等1997 ；Zarranz等2004)，且所有突變變體已經顯示出加速低聚化作用或纖維化顫動(Conway等2000 ；Greenbaum等200 。野生型 α-突觸核蛋白的累積足以導致該疾病。α-突觸核蛋白纖維狀聚集體似乎是雷維小體和雷維神經突的主要組成，且這些現(xiàn)在被認為是用于驗尸診斷的最可靠PD標記物(Spillantini等1998)。因為α -突觸核蛋白是胞質蛋白，所以已經假設由該蛋白誘導的病理學變化和影響出現(xiàn)在胞質中并局限在單個細胞中。然而，近期關于胞外α-突觸核蛋白的研究提示病理學作用范圍超出其起源的胞質(Lee，2008)。最近體內和體外地證明了 α-突觸核蛋白的存在及其在胞外流體中的聚集形式。 胞外α-突觸核蛋白似乎通過泡囊內α-突觸核蛋白的非常規(guī)胞吐作用來遞送，盡管精確的機制尚未表征。泡囊內α-突觸核蛋白傾向于聚集并是胞外聚集體的潛在來源。胞外空間中的分泌的α-突觸核蛋白的作用可以由使用組織培養(yǎng)系統(tǒng)的研究來推斷。若干研究報告了胞外α -突觸核蛋白及其內部疏水性片段(非淀粉狀成分或NAC)在所述蛋白被加入至培養(yǎng)基時的細胞毒性作用(Albani等2004 ；Bodies等2000 ；Du等2003 ； El-Agnaf 等 1998 ；Forloni 等 2000 ；Lee 等 2004 ；Seo 等 2002 ；Sung 等 2001)。一些研究已經證明了纖維狀聚集體的毒性作用(Bodies等2000 ；El-Agnaf等1998)，而其他研究將初原纖維狀或低聚聚集體確定為引起毒性的原因(Du等2003)。α -突觸核蛋白可以容易地結合到膜中并可以存在于突觸泡囊中和細胞膜上。不存在很大關于毒性機制的充分構造的模型。近期研究說明α-突觸核蛋白孔樣初原纖維在帕金森病發(fā)病機制中的可能作用(Tsigelny等，2007 ；Lee等，2002 ；Voiles和Lansbury, 2002)。一種模型提議低聚α-突觸核蛋白可以形成具有中心孔的環(huán)狀結構(Voiles和Lansbury 2003)。這些聚集體可以與膜結合(Voiles等2001)，并且它們的膜滲透作用已經在合成模型膜，諸如磷脂脂質體(Voiles等2001)和平面雙層膜(Kayed等2004)中證明。將這些聚集體插入至細胞膜中應該對細胞存活具有災難性影響，這歸因于離子和小代謝物在胞質和胞外空間之間的自由交換。盡管這種毒性孔模型解釋至少一些低聚聚集體的細胞毒性，但是孔和孔活性尚未在生物學系統(tǒng)中得到證明。胞外α-突觸核蛋白，和特別是其他聚集體形式的神經毒性的另一種潛在機制可以包括神經炎性應答Chang等，2005 ；Klegeris 等，2006)。盡管至今已對開發(fā)治療PD的療法獲得了進步，但是仍存在對另外的療法的巨大需求。本文中任何文件的引用不意欲承認該文件是相關的現(xiàn)有技術，或關于本發(fā)明任何權利要求專利性所考慮的內容。關于內容的任何陳述或任何文件的日期基于提交申請時申請人所能獲得的信息并不構成關于該陳述的正確性的認可。發(fā)明概述本發(fā)明提供用于治療帕金森病或帕金森病的易感性的絲狀噬菌體，和用于治療患有或易感帕金森病(PD)的患者的方法。所述方法包括向所述患者施用絲狀噬菌體，所述噬菌體不展示出哺乳動物細胞內化信號。本發(fā)明還提供藥物組合物，所述組合物包含絲狀噬菌體，其展示特異于促炎細胞因子的抗體和第二絲狀噬菌體，其不展示(i)哺乳動物細胞內化信號；(ii) α-突觸核蛋白抗原或α-突觸核蛋白抗體；(iii) β-淀粉狀抗原或β-淀粉狀抗體；或(iv)特異于促炎細胞因子的抗體。附圖簡述圖IA和IB顯示膜α-突觸核蛋白(AS)聚集體的計算機模型，來自以孔樣結構嵌入細胞膜中的α-突觸核蛋白聚集體前面的透視圖(

圖1Α)和顯示插入至膜中的蛋白深度的膜橫截面圖(圖IB) (Tsigelny等，2007)。圖2Α和2Β顯示噬菌體在體外對AS片段聚集體的分散活性，如通過Tht測量地 (圖2Α)和通過TEM視覺化地(圖2Β)。圖3是描述噬菌體對SH-SY5Y細胞存活的影響的圖。圖4Α和4Β顯示在α-突觸核蛋白過濾阻滯測定中利用α-突觸核蛋白多克隆抗體，如視覺化(圖4Α)和在ELISA中測量(圖4Β)的由噬菌體(輔助子)引起的AS聚集體的減少。圖5Α顯示SH-SY5Y細胞的膜級分的Western印跡分析，其證明多種α -突觸核蛋白(AS)低聚物的存在，且圖5B顯示用于在M13處理后測量低聚物的ELISA。在圖5A中， As使用針對AS的多克隆抗體(Sigma(西格瑪))來檢測。在圖5B中，來自膜級分的AS低聚物的量在特異于AS低聚物的ELISA中量化，所述AS低聚物使用針對AS的單克隆抗體 (Sigma (西格瑪)，克隆Syn 211)來檢測。在使用野生型絲狀噬菌體處理的SH-SY5Y細胞的膜級分中測量到AS低聚物的量的顯著減少。*=與非處理細胞相比的限制性差別(ρ < 0. 05)。圖6是顯示與載體相比，在與M13相互作用后AS反應性減小的圖。該數據表示為用M13注射的一半腦半球中觀察到的AS的神經元聚集體的平均數與使用PBS載體注射的另一半腦半球相比的比率(+M13)。在-M13對照中，兩半腦半球均注射PBS載體。發(fā)明詳述定義為了本說明書和附加權利要求的目的，應用以下定義。術語“患者”、“受試者”和“受體”可交替使用。它們包括作為治療處理目標的人和其他哺乳動物。術語關于帕金森病的“治療”意指基本抑制、減慢或逆轉帕金森病的進展，諸如減少或抑制α-突觸核蛋白聚集體的形成或分解預形成的α-突觸核蛋白聚集體；基本改善帕金森病的一種或多種臨床癥狀，諸如減少與帕金森病相關的炎癥；或疾病預防帕金森病臨床癥狀的出現(xiàn)。術語“共施用”意指通過同時、相繼或分別施用的單劑量形式或多劑量形式施用。 優(yōu)選地，共施用導致各待施加的施用對以重疊時期，更優(yōu)選同時處理的細胞的作用。術語“抗體”用于本文中時包括多克隆抗體、單克隆抗體、具有多肽特異性的抗體組合物、雙特異性抗體、雙抗體、或其他純化的抗體和重組抗體試劑?？贵w可以是完整抗體， 例如任何同種型(IgG，IgA, IgE, IgM，等)的抗體，或結合目的抗原的抗體片段。在本發(fā)明中使用的抗體的特殊實例中，待配制的抗體是具有IgG同種型的抗體?？贵w可以利用常規(guī)或其他技術來片段化，并且篩選所述片段與目的抗原的結合。一般地，抗體片段包含完整抗體的抗原結合和/或可變區(qū)。術語“抗體片段”包括通過蛋白水解裂解或通過重組制備抗體分子部分的片斷， 其可以選擇性結合選擇的蛋白。所述蛋白水解和/或重組片段的非限制性實例包括Fab， F(ab' )2, Fab'，F(xiàn)v，和包含由肽連接體相連的Vl和/或Vh結構域的單鏈抗體(scFv)，結構域抗體(dAbs)，Nanobodies (抗體-來源的生物治療劑，其包含天然存在的重鏈抗體的獨特結構和功能特性)，和UniBodies (缺乏鉸鏈區(qū)的抗體)。scFvs可以共價或非共價連接，以形成具有兩個或更多結合位點的抗體。在一些實施方案中，抗體或抗體片段是人源化單克隆抗體或完全人源化的單克隆抗體。術語“人源化單克隆抗體”用于本文中時，是來自非人來源(受體)的單克隆抗體，其已經被改變?yōu)榘葍r人單克隆抗體(供體)中存在的至少一個或多個氨基酸殘基?！巴耆嗽椿瘑慰寺】贵w”是來自非人來源的單克隆抗體，其已經被改變?yōu)榘葍r人單克隆抗體的抗原結合區(qū)中存在的全部氨基酸殘基。人源化抗體還可以包含受體抗體或供體抗體中均不存在的殘基?？梢赃M行這些修飾，從而進一步改善和最優(yōu)化抗體的功能性。人源化抗體還可以任選地包含人免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)的至少一部分。術語“促炎細胞因子”指參與與帕金森病相關的腦炎癥的促炎細胞因子，其優(yōu)選地包括IL-6，IL-1，IL-17和TNFa，并且最優(yōu)選是IL-6。術語“哺乳動物細胞內化信號”指任何細胞粘著序列，其作為細胞粘著/附著于細胞的結果，促進內在化。已知許多哺乳動物細胞粘著序列并且包括Arg-Gly-Asp (RGD) 細胞粘著序列，來自HIV的Tat肽和包含序列Arg-Glu-Asp (RED)，Arg-Lys-Lys (RKK)， Leu-Asp-Val(LDV ；Humphries,1992)， Leu-Leu-Gly (LLG ；Koivunen 2001), Asp-Gly-Glu-Ala(DGEA ；SEQ ID NO 2), Ile-Arg-Val-Val-Met(IRVVM ；SEQ ID NO 3 ； Kosfeld 等，1993)，Pro-His-Ser-Arg-Asp (PHSRN ；SEQ ID NO 4)和 RFYWMWK(SEQ ID NO 5;K0Sfeld等，199 的肽。在細胞粘性分子諸如層粘連蛋白，纖連蛋白，玻連蛋白，纖維蛋白原，血小板反應蛋白，等中已知許多細胞粘著序列(也稱為細胞附著基序)。術語“α-突觸核蛋白抗原”指來自人α-突觸核蛋白的抗原，其中人α -突觸核蛋白優(yōu)選具有氨基酸序列SEQ ID NO 6 (NCBI基因ID :6622，登記號ΝΡ000336 ；UniProtKB/ Swiss-Prot登記號Ρ37840)?！?α -突觸核蛋白抗體”是識別和結合α -突觸核蛋白SEQ ID NO 6或其變體或突變體的抗體。術語“ β -淀粉狀抗原”指來自斑形成“ β -淀粉狀肽”的抗原，也稱為“ β ΑΡ”， “βΑ”，“Αβ ”或“ΑβΡ”，其源自人淀粉狀前體蛋白?！唉?淀粉狀抗體”是識別和結合天然存在的人A β 1-42肽及其變體和突變體的β -淀粉狀肽的抗體。用于本文中時，“藥物組合物”指本文中偶數的一種或多種活性成分與其他化學成分諸如生理學適合的載體和賦形劑的制劑。藥物組合物的目的是促進化合物向患者的施用。短語“生理學可接受載體”和“藥用載體”，可交替使用，指不對生物體引起顯著刺激并不消除所施用的化合物的生物學活性和性質的載體或稀釋劑。術語“賦形劑”指添加至藥物組合物以進一步促進活性成分施用的惰性物質。賦形劑的非限制性實例包括碳酸鈣、磷酸鈣、多種糖和多種類型的淀粉、纖維素衍生物、明膠、 植物油和聚乙二醇。術語“野生型絲狀噬菌體”用于本文中時意指天然存在的絲狀噬菌體，所述絲狀噬菌體與其在自然界中典型相關的其他成分分隔開。術語還包括可商購的絲狀噬菌體，其特征為“野生型”。術語“失活的野生型絲狀噬菌體”用于本文中時意指這樣的野生型絲狀噬菌體，其不通過重組DNA手段遺傳改變，但是已經，諸如通過UV照射，致使不能復制。致使噬菌體不能復制但是不干涉噬菌體絲狀結構(保持其通過嗅覺途徑滲透入腦中的能力)的任何機制通過本發(fā)明預期。
術語“WT噬菌體”指野生型絲狀噬菌體和失活的野生型絲狀噬菌體二者。用于治療的絲狀噬菌體和治療方法在一個實施方案中，本發(fā)明提供用于治療帕金森病或對帕金森病的易感性的絲狀噬菌體和通過向患者施用絲狀噬菌體來治療患有或易感帕金森病的患者的方法，其中所述噬菌體不展示(i)哺乳動物細胞內化信號，(ii) α-突觸核蛋白抗原或α-突觸核蛋白抗體，或(iii) β -淀粉狀抗原或β -淀粉狀抗體。在該實施方案的一方面，噬菌體作為藥用組合物的一部分施用于患者，所述藥用組合物另外包含藥用載體。在該實施方案的另一方面，噬菌體是WT噬菌體。在不受理論束縛的條件下，提議本發(fā)明中使用的噬菌體結合膜中的胞外α -突觸核蛋白或α-突觸核蛋白聚集體并減少細胞膜中α-突觸核蛋白的聚集。本發(fā)明人提議膜中α-突觸核蛋白聚集體的這種減少也導致α-突觸核蛋白的胞內聚集體的減少，其可能由α-突觸核蛋白的平衡由胞內向胞外移動引起。然而，在不受人具體機制束縛的條件下， 本發(fā)明的絲狀噬菌體和方法有效用于治療患有或易感帕金森病的患者。在一個實施方案中，所述絲狀噬菌體有效用于鼻內施用。鼻內使用容許這些噬菌體跨過血腦屏障。噬菌體然后在不對外周器官產生不利影響的條件下，經由尿液和糞便從腦和身體中排出。促炎細胞因子對帕金森病的神經炎性癥狀作出貢獻。去除這些促炎細胞因子將改善這些癥狀。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供用于治療帕金森病或對帕金森病的易感性的展示特異于促炎細胞因子的抗體的絲狀噬菌體，和通過向患者施用展示特異于促炎細胞因子的抗體的絲狀噬菌體來治療患有或易感帕金森病的患者的方法。在該實施方案的一方面，噬菌體通過鼻內施用。在另一方面，噬菌體作為藥用組合物的一部分施用，所述藥用組合物另外包含藥用載體。在另一方面，特異于促炎細胞因子的抗體是IgG類的抗體并具有Fc部分。在再一方面，所述抗體是特異于IL-6的抗體。在又一方面，具有促炎細胞因子的噬菌體不包含哺乳動物細胞內化信號。當鼻內施用時，具有抗體的噬菌體將被遞送至腦，在那里它們將通過其上展示的抗體被指引至促炎細胞因子，由此滅活這些細胞因子。這些噬菌體-展示抗體的噬菌體部分應該具有雙重作用，即使所述抗體越過血腦屏障和直接抑制α -突觸核蛋白聚集。根據相關實施方案，本發(fā)明提供用于治療的第一和第二絲狀噬菌體和通過向患者共施用(a)第一絲狀噬菌體，其展示特異于促炎細胞因子的抗體；和(b)第二絲狀噬菌體， 其中所述第二噬菌體不展示特異于促炎細胞因子的抗體來治療患有或易感帕金森病的患者的方法。在一方面，所述第二絲狀噬菌體另外不展示哺乳動物細胞內化信號。在另一方面，所述第二絲狀噬菌體另外不展示(i) α-突觸核蛋白抗原或α-突觸核蛋白抗體；或 (ii) β-淀粉狀抗原或β-淀粉狀抗體。在再一方面，所述第二絲狀噬菌體另外不展示(i) 哺乳動物細胞內化信號；(ii) α -突觸核蛋白抗原或α -突觸核蛋白抗體；或(iii) β -淀粉狀抗原或β -淀粉狀抗體。在另一方面，各絲狀噬菌體作為藥用組合物的一部分施用，所述藥用組合物另外包含藥用載體。在任意上述組合物的另一方面，所述第二絲狀噬菌體是WT噬菌體。在再一方面，所述第二絲狀噬菌體是UV-照射的噬菌體。在又一方面，所述第一和所述第二噬菌體各自鼻內施用于患者。在另一方面，特異于促炎細胞因子的抗體是IgG類的抗體并具有Fc部分。在再一方面，所述抗體是特異于 IL-6的抗體。在另一方面，所述第一噬菌體不包含哺乳動物細胞內化信號。可以通過本領域已知任何技術將噬菌體制成展示針對促炎細胞因子的抗體。例如，可以通過公知的技術將抗體改造為單鏈抗體并且可以修飾噬菌體載體以使其在噬菌體表面上展示這樣的單鏈抗體(scFv)。導致任何給定的抗體，優(yōu)選單克隆抗體展示在噬菌體上的另一種方法時產生展示多肽的噬菌體，所述多肽結合免疫球蛋白的Fc部分。這樣的噬菌體是本領域中已知的且記述在PCT公開W02007/095616中。使用這樣的修飾的噬菌體，可以僅通過使抗體和噬菌體相接觸而導致任何含有Fc部分的抗體在其上展示?？贵w的Fc部分應該通過由噬菌體展示的Fc結合多肽來結合。因此，抗體或其片段的結合得到促進。在一個實施方案中，結合免疫球蛋白的Fc部分的多肽是蛋白A、蛋白G、其包含蛋白A的抗體結合部分(即結合結構域B)的片段或蛋白G、或蛋白A或蛋白G的變體。在另一個實施方案中，蛋白A的變體是具有氨基酸序列SEQ ID NO :1的變體。當使用缺乏Fc區(qū)的抗體時，其必須通過噬菌體直接展示。
絲狀噬菌體是一組結構相關的病毒，其包含環(huán)狀單鏈DNA基因組。它們在生產性感染過程中不殺死它們的宿主。感染包含F(xiàn)質粒的大腸桿菌(Escherichia coli)的噬菌體總稱為Ff噬菌體。它們不感染哺乳動物。在一個實施方案中，上述發(fā)明中使用的各種絲狀噬菌體獨立地選自絲狀噬菌體M13、Π和fd。在一方面，當使用第一和第二絲狀噬菌體時，各噬菌體是同一亞型的噬菌體并且選自絲狀噬菌體M13、fl和fd。改造具有特異于促炎細胞因子的抗體或結合免疫球蛋白Fc部分的多肽的噬菌體，以在其表面上展示所述蛋白。這典型地涉及表達待展示的多肽的cDNA克隆，作為與噬菌體外殼蛋白的融合蛋白。展示外源蛋白或肽作為與噬菌體外殼蛋白的融合的絲狀噬菌體是本領域技術人員公知的?？梢允褂枚喾N噬菌體和外殼蛋白，包括，但不僅限于M13蛋白 III，M13 蛋白 VIII，M13 蛋白 VI，M13 蛋白 IX，和 fd 小外殼蛋白 pill (Saggio 等，1995 ； Uppala和Koivunen，2000)?？色@得一大列載體來生成這樣的融合蛋白(參見Kay等，1996 ； Berdichevsky等，1999 ；和Benhar，2001)。用于將外源編碼序列插入至噬菌體基因中的方法是公知的(參見例如，Sambrook等，1989 ；和Brent等，2003)。在一個實施方案中，結合免疫球蛋白的Fc部分的多肽通過其與絲狀噬菌體的小外殼蛋白(蛋白III)的融合來展示。本文中描述的方法還包括那些方法，其中鑒定患者為需要特別指定的治療。鑒定患者需要所述治療可以通過患者或健康護理專業(yè)人員的判斷并可以是主觀的(例如鑒定) 或客觀的(例如可通過測試或診斷方法測量)。藥物組合物在相關的實施方案中，本發(fā)明提供藥物組合物(例如，無熱原)，所述藥物組合物包含(a)第一絲狀噬菌體，其展示特異于促炎細胞因子的抗體；和(b)第二絲狀噬菌體，其中所述第二噬菌體不展示特異于促炎細胞因子的抗體。在一方面，所述第二絲狀噬菌體另外不展示哺乳動物細胞內化信號。在另一方面，所述第二絲狀噬菌體另外不展示(i) α-突觸核蛋白抗原或α -突觸核蛋白抗體；或(ii) β -淀粉狀抗原或β -淀粉狀抗體。在再一方面，所述第二絲狀噬菌體另外不展示(i)哺乳動物細胞內化信號；(ii) α-突觸核蛋白抗原或α -突觸核蛋白抗體；或(iii) β -淀粉狀抗原或β -淀粉狀抗體。在該實施方案的一方面，所述第二噬菌體是WT噬菌體。在更特殊的方面，所述第二噬菌體是UV照射的噬菌體。在另一方面，特異于促炎細胞因子的抗體是IgG類的抗體并具有Fc部分。在又一方面，所述組合物中的第一噬菌體展示特異于IL-6的抗體。在再一方面，所述第一噬菌體不包含哺乳動物細胞內化信號。在進一步的方面，所述組合物配制為用于鼻內施用。用于配制和施用藥物的技術可以參見〃 Remington' s Pharmaceutical Sciences (雷明頓制藥科學)，“Mack Publishing Co.(馬克出版公司)，Easton, PA，最新版，其通過參考被結合在本文中并且在本領域中公知。根據本發(fā)明使用的藥物組合物因此可以以常規(guī)方式，使用一種或多種包括賦形劑和助劑的生理學可接受載體來配制，其促進處理活性成分進入可以制藥使用的制劑。為了通過鼻吸入施用，根據本發(fā)明使用的活性成分方便地以氣溶膠噴霧表觀形式，由加壓包裝或噴霧器中，借助于合適的推進物，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯-四氟乙烷或二氧化碳來遞送。鼻腔噴霧劑，其不需要加壓包裝或噴霧器作為吸入噴霧劑，可以備選地用于鼻內施用。在加壓氣溶膠的情形中，給藥單元可以通過提供閥來遞送計量的量來確定。分配器中使用的例如，明膠的膠囊和藥盒可以被配制為包含所述化合物和合適的粉末基諸如乳糖或淀粉的粉末混合物。適合在本發(fā)明的方法的背景中使用的藥物組合物包括這樣的組合物，其中以有效實現(xiàn)預期目的的量包含活性成分。更具體地，有效量意指有效治療帕金森病的活性成分的量。治療有效量的確定充分在本領域技術人員的能力之內，特別是根據本文中提供的詳細內容。給藥量和間隔可以逐個地調節(jié)，以提供足以治療的絲狀病毒展示載體的腦水平 (最小有效濃度，MEC)。MEC對于各種制劑是不同的，但是可以由體外數據來評估。獲得MEC 所必需的劑量應該取決于個體特征。給藥間隔也可以使用MEC值來確定。制劑應該利用這樣的方案來施用，所述方案保持腦水平在治療期間內10-90 %的時間，優(yōu)選30-90 %的時間和最優(yōu)選50-90 %的時間內高于MEC。根據患者中待治療的帕金森病的嚴重性和應答性，給藥可以是單次給藥或多次施藥，治療時期持續(xù)數日至數周或直至實現(xiàn)帕金森病狀態(tài)的消減。待施用的組合物的量當然應該取決于待治療的受試者、痛苦的嚴重性、開處方醫(yī)師的判斷等。本發(fā)明的方法中使用的組合物，如果需要，可以存在于包裝或分配器裝置，諸如 FDA批準的試劑盒中，其可以包含一種或多種包含活性成分的單位給藥形式。所述包裝可以，例如，包括金屬或塑料薄片，諸如泡罩包裝。所述包裝或分配器裝置可以附帶有關于施用的說明書。所述包裝或分配器裝置還可以通過公告聯(lián)合處于管理醫(yī)藥品制造、使用或銷售的政府機構規(guī)定的形式的容器來提供，所述公告反映該機構批準的組合物或人或獸施用形式。該公共，例如，可以是由美國食品藥品管理局(U. S. Food and Drug Administration) 批準的處方藥的標簽或批準的產品插頁。還可以制備包含在兼容藥物載體中配制的本發(fā)明制劑的組合物，將其置于合適容器中，并標記指定病癥的治療，好像以上進一步詳述的那樣。在一個特殊實施方案中，本發(fā)明提供治療帕金森病的試劑盒，其在分開的容器中包含(a)第一絲狀噬菌體，其展示特異于促炎細胞因子的抗體；和(b)第二絲狀噬菌體，其中所述第二噬菌體不展示(i)哺乳動物細胞內化信號；(ii) α-突觸核蛋白抗原或α-突觸核蛋白抗體；(iii) β-淀粉狀抗原或β-淀粉狀抗體；或(iv)特異于促炎細胞因子的抗體；和(C)描述使用該試劑盒來治療帕金森病的方法的說明書。雖然現(xiàn)在已經一般性地描述了本發(fā)明，但是通過參考以下實施例將更容易理解本發(fā)明，所述實施例通過示范是方式提供并且不意欲限制本發(fā)明。
實施例該實施例中的實驗結果證明絲狀噬菌體對參與PD發(fā)病機理的α -突觸核蛋白聚集體分解的影響。
制備絲狀噬菌體M13絲狀噬菌體由感染的TGl大腸桿菌培養(yǎng)物，使用Mi;3K07輔助噬菌體(New England Biolabs (新英格蘭生物實驗室)，Beverly, ΜΑ)，在含有50 μ g/ml卡那霉素 (kanamycin)的2YT培養(yǎng)液(Sigma-Aldrich (西格瑪奧德里奇)，Louis，M0)中制備。離心細菌細胞(8300Xg，15min)，并噬菌體通過添加l/5(wt/vol)的16. 7%聚乙二醇(PEG) 從上清中沉淀出來，并離心(14，OOOXg, lh，在4°C )。將沉淀物重新懸浮在無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)(上清體積的3%)中。剩余的細菌通過以6，OOOXg離心15min除去，并然后對噬菌體進行PEG-NaCl沉淀。最后將沉淀物重新懸浮在PBS (上清體積的2% )中并使噬菌體溶液經過無熱原0. 45 μ m濾器過濾以除去任何剩余的細菌。球形噬菌體通過在具有等體積氯仿的PBS中培養(yǎng)絲狀噬菌體產生。溶液在室溫(RT)下經過;3min渦旋6次，每次10s， 并以18，5000xg離心lmin。水溶液和氯仿溶液均無蓋地置于排風罩內，直至所有氯仿殘余已經蒸發(fā)并然后重新懸浮在PBS中達到初始體積。通過使用超聲波細胞分解儀(Microson Heat Systems (Microson 熱系統(tǒng))，F(xiàn)armingdale，NY，美國)對處于冰上的 PBS 中的 500 μ 1 IxlO13個噬菌體進行超聲波處理l^^sec來破壞噬菌體的完整性。研究體外α -突觸核蛋白聚集測試和分析與人α-突觸核蛋白(SEQ ID NO 7)的氨基酸71-82，即雷維小體中心相對應的12個氨基酸的片段，和完全重組α-突觸核蛋白二者的聚集水平。檢驗絲狀噬菌體防止并分解所述肽和重組α-突觸核蛋白二者的能力。α-突觸核蛋白聚集的水平針對硫黃素T(Tht)和蛋白質過濾測定來決定，如下所述。通過電子顯微術視覺化α -突觸核蛋白原纖維和絲狀噬菌體為了評價絲狀噬菌體的抗聚集作用，將900μ 1跨越α-突觸核蛋白的氨基酸殘基 71-82的α-突觸核蛋白片段樣品在37°C溫育6周。在該階段，使用聚集的肽溫育絲狀噬菌體1周的時期。檢驗兩種噬菌體濃度1012/ml和IO11AiL將肽樣品稀釋至水性0.3μΜ Tht溶液中，達到最濃度225 μ Μ。量化480nm處的樣品熒光發(fā)射。如通過480nm處發(fā)射的減少觀察的，在含有1012/ml噬菌體的量的樣品中檢測到顯著的43%減少(圖2A)。樣品還通過透射電子顯微術(TEM)來觀察。將樣品加載在碳格中并包被乙酸鈾酰。在僅含有α-突觸核蛋白肽的樣品中，檢測到顯著量的處于密集形式的復合原纖維(圖 2Β，左圖)。在使用IO11噬菌體溫育的樣品中觀察到原纖維量和復雜性的充分降低，而在使用IO12噬菌體溫育的樣品中，沒有檢測到原纖維，并且僅可見無定形聚集體(圖2Β，中圖和右圖)。作為細胞模型的SH-SY5Y細胞培養(yǎng)物成神經細胞瘤細胞系SH-SY5Y是作為PD模型使用的良好候選者，因為它是多巴胺能細胞。所述細胞使用野生型人α-突觸核蛋白基因和突變α-突觸核蛋白Α53Τ基因來穩(wěn)定轉染。 通過Wfestern印跡來確定α -突觸核蛋白表達。 使用α-突觸核蛋白抗體染色細胞以視覺化雷維小體。穩(wěn)定轉染從而過表達Α53Τα -突觸核蛋白的SH-SY5Y細胞在IOcm器皿中生長并保持在含有非必需氨基酸(NEAAs)并增補FCS (10% )，谷氨酰胺QmM)，青霉素-鏈霉素溶液(1%)的 DMEM Ham' s F12(l 1)改良培養(yǎng)基(Biological hdustries (生物工業(yè)))中，其處于37°C，5%C02的濕潤溫育器中。細胞溶解為了分離α-突觸核蛋白，利用由Lee等Q004)所述的細胞提取，如由本發(fā)明人的實驗改進地，進行溶解程序。簡言之，細胞使用PBS來沖洗，使用收集在15ml管中的 1. 5ml胰蛋白酶/器皿進行胰蛋白酶化，使用PBS離心并再次洗滌，隨后收集至Eppendorf 管中。細胞使用 ΙΟΟμ 1 緩沖液 T (含有 20mM Tris pH7. 4,25mM KCl,5mM MgCl2，0. 25M 蔗糖，Triton X-IOO和蛋白酶抑制劑混合物)來溶解，吸吹直至不存在細胞團，在室溫下溫育lOmin，并以13，OOOkg離心lOmin。收集上清并將其置于分開的Eppendorf管中，標記為"sup"(注意任何上清均不應該與沉淀物級分保持在一起)。用緩沖液N(含有0. IM Na2CO3,pH 11. 5和蛋白酶抑制劑混合物)在不混合的條件下輕輕地覆蓋該沉淀物，并在4°C 溫育過夜。這容許該蛋白輕輕地重新懸浮在該緩沖液中。溫育后，利用小吸移管頭移出現(xiàn)在渾濁的緩沖液并棄去。管中的剩余物質標記物“沉淀物”。將上清和沉淀物提取物保持在_20°C，并通過Wfestern印跡來分析，從而測量可溶和不可溶α -突觸核蛋白的量。噬菌體毒性使用噬菌體溫育后的不同SH-SY5Y細胞的存活力使用MTT試劑來測試。在96孔板中，使用IxlO9和IxlO11噬菌體/孔來溫育細胞過夜。該溫育后沒有觀察到細胞死亡(圖 3)。過濾阻滯測定為了蛋白聚集體過濾，使用可商購的狹線印跡裝置(Bio-Rad Laboratories，慕尼黑，德國)。樣品經過阻斷的硝化纖維膜(0-. 2 μ m孔尺寸，Schleicher & Scheull,Dassel, 德國)來過濾。過濾后，使用0.1% SDS洗滌各狹線。α-突觸核蛋白聚集體使用單克隆抗體LB509(1 10，000)及二級HRP-偶聯(lián)的山羊抗小鼠抗體來檢測，并最后通過化學發(fā)光來視覺化。PAF印跡的密度計量化使用SigmaGel vl. 0來進行。加入相等數量的細胞/IOcm器皿，并容許達到80%匯合。在那時，使用不同量的噬菌體處理細胞M和72小時。然后從各板收集細胞并溶解和分析，如下所述。過表達野生型α -突觸核蛋白的不同SH-SY5Y細胞使用總量IxlO12噬菌體在37°C溫育3小時的時期或過夜。提取可溶和不可溶的級分并通過0.2μπι硝化纖維膜來過濾不可溶的級分。保留濾器上的α -突觸核蛋白聚集體的量在未處理的細胞中較高(圖4Α)。α -突觸核蛋白低聚物的ELISA改進用于檢測α -突觸核蛋白低聚種類的ELISA(El-Agnaf等，2000)，從而測量 SH-SY5Y細胞不可溶級分中的α-突觸核蛋白低聚物的量。為了僅檢測AS的低聚物，使用用于包被(與生物素綴合)的相同單克隆抗體。在使用噬菌體處理3小時和溫育過夜的細胞的不可溶級分中均檢測到AS低聚物的40% -50%減少。在細胞模型中Μ13噬菌體與α -突觸核蛋白的相互作用α-突觸核蛋白(AQ是位于突觸前端的天然未折疊蛋白。As容易地通過N端結合至膜中，并由此以兩種形式存在于細胞中膜結合和無序胞質形式。不斷積累的數據表明 AS的膜形式在細胞毒性中起作用。初原纖維可以形成在細胞膜上的嵌入的環(huán)狀結構，并引起膜滲透性。最近證明AS在存在液體的條件下具有較高聚集的傾向并且膜聚集體可以誘導AS胞質形式的聚集。在此，呈現(xiàn)在過表達野生型AS的SH-SY5Y細胞中使用野生型(MU)絲狀噬菌體處理后的AS低聚物的調節(jié)。細胞的膜級分利用用于AS檢測的膜提取試劑盒(MBL)，通過 Western印跡分析來提取。在膜級分中不僅檢測到AS單體，而且還檢測到AS 二聚體和三聚體(圖5A)，這證明在我們的細胞模型的膜區(qū)室內存在AS低聚物。在使用絲狀噬菌體溫育后，絲狀噬菌體對AS膜低聚化作用的影響顯示在圖5A和5B中。SH-SY5Y細胞利用視黃酸來區(qū)分，并使用處于噬菌體/ml的野生型噬菌體來溫育過夜。次日提取膜級分，并在設計用于僅識別AS低聚種類的ELISA中測量各提取物樣品的AS低聚物的量(圖5B)。在使用絲狀噬菌體溫育后的SH-SY5Y細胞中測量到來自膜級分的AS低聚物的顯著減少。野生型噬菌體對由膜級分提取的AS聚集體的影響提示野生型噬菌體影響質膜上的AS，其可能是通過經由以前證明的相互作用區(qū)域與AS直接相互作用實現(xiàn)，所述相互作用區(qū)域位于AS 的NAC區(qū)的氨基酸73-85。還可能的是，由于使用噬菌體長期溫育細胞，小百分比的噬菌體內在化進入細胞，從而影響細胞中除質膜以外的其他膜區(qū)室。噬菌體與細胞的結合以及可能的內在化作用可以通過激活溶酶體降解來促進α-突觸核蛋白從質膜中清除。使用帕金森病的轉基因小鼠模型來研究與α -突觸核蛋白的Μ13相互作用年齡為7個月的PDGFa-突觸核蛋白轉基因小鼠(D品系)和非轉基因小鼠接受海馬內注射IxlO14 Μ13噬菌體，并在7天后使用針對α-突觸核蛋白的抗體Μ13和Ibal(用于小膠質活化)通過IHC分析腦。在注射Μ13的α-突觸核蛋白Tg小鼠中觀察到大量Μ13 免疫反應性。在新皮質和海馬中的神經元細胞體中觀察到Μ13免疫染色。在海馬中，Μ13免疫染色也在神經氈中很豐富。在一半球中進行Μ13注射和在另一半球中進行磷酸鹽緩沖液 (PBS)載體注射后，在腦兩半球中測量α-突觸核蛋白的神經元聚集體的平均數目，并且各半球中測量值之間的比率顯示在圖6中。雖然現(xiàn)在已經完整地描述了本發(fā)明，但是本領域技術人員應該理解本發(fā)明可以在不偏離本發(fā)明的精神和范圍并不需要過度實驗的條件下，在廣泛范圍的等價參數、濃度和條件下進行。盡管本發(fā)明已經關于其具體的實施方案進行了描述，但是應該理解可以進一步改進。本申請意欲涵蓋本發(fā)明的任何變體、應用或改進，它們一般性地遵從本發(fā)明原則并包括如在本發(fā)明所屬領域中已知或常規(guī)實踐范圍內的和如可以應用于在所附權利要求范圍內如上所述的基本特性的那些偏離本發(fā)明的內容。參考已知的方法步驟、常規(guī)方法步驟、已知方法或常規(guī)方法不以任何方式承認相關領域中公開、教導或提示了本發(fā)明的任何方面、描述或實施方案。具體實施方案的前述描述應該如此完整地揭示本發(fā)明的一般天性，從而使其他人可以通過應用本領域技術人員的知識(包括本文中引用的參考文獻的內容)，在不需要過度實驗、不偏離本發(fā)明一般概念的條件下，容易地改變和/或改進多種應用諸如具體的實施方案。因此，基于本文中存在的教導和指導，這些改進和改變意欲屬于所公開的實施方案的等價物的含義和范圍。應該理解本文中的措詞或術語是為了描述而非限制的目的，因此本說明書的術語或措詞應該由技術人員根據本文中存在的教導和指導，結合本領域一般技術人員的知識來解釋。參考文獻
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權利要求
1.用于治療帕金森病或對帕金森病的易感性的絲狀噬菌體，其中所述絲狀噬菌體展示針對促炎細胞因子的抗體。
2.用于治療帕金森病或對帕金森病的易感性的絲狀噬菌體，其中所述絲狀噬菌體不展示(i)哺乳動物細胞內化信號；(ii) α-突觸核蛋白抗原或α-突觸核蛋白抗體；或(iii) β-淀粉狀抗原或β-淀粉狀抗體。
3.根據權利要求1或2的絲狀噬菌體，其中所述噬菌體不展示哺乳動物細胞內化信號。
4.根據權利要求1-3中任一項的絲狀噬菌體，其中所述噬菌體是WT噬菌體。
5.根據權利要求4的絲狀噬菌體，其中所述噬菌體是UV照射的噬菌體。
6 用于治療帕金森病的第一和第二絲狀噬菌體，其中a)所述第一絲狀噬菌體展示針對促炎細胞因子的抗體；和b)所述第二絲狀噬菌體不展示(i)哺乳動物細胞內化信號；(ii)α-突觸核蛋白抗原或α-突觸核蛋白抗體；(iii) β-淀粉狀抗原或β-淀粉狀抗體；或(iv)針對促炎細胞因子的抗體。
7.根據權利要求6的絲狀噬菌體，其中所述第一噬菌體不展示哺乳動物細胞內化信號。
8.根據權利要求6或7的絲狀噬菌體，其中所述第二噬菌體是WT噬菌體。
9.根據權利要求8的絲狀噬菌體，其中所述第二噬菌體是UV照射的噬菌體。
10.根據權利要求1、3、4和5中任一項的絲狀噬菌體，其中展示結合促炎細胞因子的抗體的絲狀噬菌體進一步展示蛋白A或蛋白G的抗體結合部分，并且其中結合促炎細胞因子的抗體與蛋白A或蛋白G的抗體結合部分結合。
11.根據權利要求3-10中任一項的絲狀噬菌體，其中所述結合促炎細胞因子的抗體是結合IL-6的抗體。
12.根據權利要求1-11中任一項的絲狀噬菌體，其中各噬菌體用于鼻內施用。
13.根據權利要求1和3-12中任一項的絲狀噬菌體，其中各絲狀噬菌體獨立地選自 M13、Π和fd噬菌體，及其混合物。
14.根據權利要求13的絲狀噬菌體，其中各絲狀噬菌體是M13。
15.一種藥物組合物，其包含a)第一絲狀噬菌體，其展示特異于促炎細胞因子的抗體；b)第二絲狀噬菌體，其中所述第二噬菌體不展示(i)哺乳動物細胞內化信號；(ii) α -突觸核蛋白抗原或α -突觸核蛋白抗體；β -淀粉狀抗原或β -淀粉狀抗體；或(iv)特異于促炎細胞因子的抗體；和c)藥用載體。
16.權利要求15的組合物，其配制為用于鼻內施用。
17.權利要求15或16的組合物，其中所述第一噬菌體不展示哺乳動物細胞內化信號。
18.權利要求15-17中任一項的組合物，其中所述第二噬菌體是WT噬菌體。
19.權利要求18的組合物，其中所述第二噬菌體是UV照射的噬菌體。
20.權利要求15-19中任一項的組合物，其中所述第一絲狀噬菌體進一步展示蛋白A或蛋白G的抗體結合部分，并且其中結合促炎細胞因子的抗體與蛋白A或蛋白G的抗體結合部分結合。
21.權利要求15-20中任一項的組合物，其中所述結合促炎細胞因子的抗體是結合 IL-6的抗體。
22.權利要求15-21中任一項的組合物，其中所述第一和第二絲狀噬菌體中的每個獨立地選自M13、Π和fd噬菌體，及其混合物。
23.權利要求22的組合物，其中所述第一和第二絲狀噬菌體是M13。
24.一種通過向有此需要的患者施用絲狀噬菌體來治療患有或易感帕金森病的患者的方法，其中所述噬菌體不展示(i)哺乳動物細胞內化信號；(ii) α-突觸核蛋白抗原或 α -突觸核蛋白抗體；或(iii) β -淀粉狀抗原或β -淀粉狀抗體。
25.一種通過向有此需要的患者施用絲狀噬菌體來治療患有或易感帕金森病的患者的方法，所述絲狀噬菌體展示針對促炎細胞因子的抗體。
26.權利要求25的方法，其中所述噬菌體不展示哺乳動物細胞內化信號。
27.權利要求M或25的方法，其中所述噬菌體是WT噬菌體。
28.權利要求27的方法，其中所述噬菌體是UV照射的噬菌體。
29.一種通過向有此需要的患者共施用以下各項來治療患有或易感帕金森病的患者的方法a)第一絲狀噬菌體，其展示針對促炎細胞因子的抗體；和b)第二絲狀噬菌體，其中所述第二絲狀噬菌體不展示(i)哺乳動物細胞內化信號； (ii) α-突觸核蛋白抗原或α-突觸核蛋白抗體；(iii) β-淀粉狀抗原或β-淀粉狀抗體； 或(iv)針對促炎細胞因子的抗體。
30.權利要求四的方法，其中所述第一噬菌體不展示哺乳動物細胞內化信號。
31.權利要求四或30的方法，其中所述第二噬菌體是WT噬菌體。
32.權利要求31的方法，其中所述第二噬菌體是UV照射的噬菌體。
33.權利要求25-32中任一項的方法，其中展示結合促炎細胞因子的抗體的絲狀噬菌體進一步展示蛋白A或蛋白G的抗體結合部分，并且其中結合促炎細胞因子的抗體與蛋白 A或蛋白G的抗體結合部分結合。
34.權利要求25-33中任一項的方法，其中所述結合促炎細胞因子的抗體是結合IL-6 的抗體。
35.權利要求M-34中任一項的方法，其中各噬菌體通過鼻內施用。
36.權利要求M-35中任一項的方法，其中各絲狀噬菌體獨立地選自M13、fl和fd噬菌體，及其混合物。
37.權利要求36的方法，其中各絲狀噬菌體是M13。
全文摘要
本發(fā)明涉及展示特異性結合促炎細胞因子的抗體的絲狀噬菌體單獨地或與不展示哺乳動物細胞內化信號的絲狀噬菌體組合地治療帕金森病的應用。
文檔編號A61K35/76GK102223887SQ200980146744
公開日2011年10月19日 申請日期2009年11月24日 優(yōu)先權日2008年11月24日
發(fā)明者海姆·M·戴門特, 貝卡·所羅門 申請人:臺拉維夫大學拉莫特