專利名稱：來自人單核細(xì)胞的治療用干細(xì)胞及其誘導(dǎo)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過使在生物體內(nèi)正常分化的細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)去分化而提供能夠用于細(xì)胞藥物的細(xì)胞的方法。另外，本發(fā)明涉及一種與細(xì)胞、組織或器官的損傷有關(guān)的疾病的治療劑。進(jìn)而，本發(fā)明涉及有效誘導(dǎo)細(xì)胞去分化的細(xì)胞藥物用劑、干細(xì)胞的生產(chǎn)方法、 單核細(xì)胞(monocytes)的去分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基、去分化誘導(dǎo)劑、細(xì)胞藥物用試劑盒或產(chǎn)生去分化細(xì)胞的試劑盒、藥物組合物，并涉及一種干細(xì)胞。
背景技術(shù)：
作為對疾病的根本的治療方法，補(bǔ)充由于某些原因引起的組織中喪失的細(xì)胞的方法即再生醫(yī)療很久以來備受關(guān)注。但是，近年細(xì)胞藥物的概念更加廣受關(guān)注，所述細(xì)胞藥物是通過注入干細(xì)胞或者組織細(xì)胞的前體細(xì)胞而在疾病部位再生并通過細(xì)胞間生理活性物質(zhì)的相互作用修復(fù)組織。與此相對應(yīng)，已經(jīng)出現(xiàn)了許多關(guān)于下述內(nèi)容的報(bào)道組織中的分化細(xì)胞例如來自末梢血的單核細(xì)胞通過在特定的細(xì)胞因子的存在下進(jìn)行培養(yǎng)，去分化為干細(xì)胞。但是，當(dāng)以干細(xì)胞或組織前體細(xì)胞作為細(xì)胞藥物給與生物體時(shí)，細(xì)胞到達(dá)目標(biāo)損傷部位的百分率未必高，而且不恒定。因此，存在必須準(zhǔn)備大量細(xì)胞的問題。另外，還未詳細(xì)研究分布在目標(biāo)部位之外的部分的細(xì)胞在該部位如何作用，存在產(chǎn)生副作用的問題。進(jìn)而，為了提高治療效果必須給與大量細(xì)胞，但認(rèn)為難以在短時(shí)間內(nèi)得到自體細(xì)胞。近年，已經(jīng)明確了下述現(xiàn)象的產(chǎn)生在損傷部位在缺血狀態(tài)下SDFl (來自基質(zhì)細(xì)胞的因子1)或VEGF(血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子)表達(dá)，這些分子成為生物體內(nèi)修復(fù)系統(tǒng)的一個(gè)環(huán)節(jié)的誘導(dǎo)分子，與這些誘導(dǎo)分子對應(yīng)的表達(dá)受體的細(xì)胞被引到損傷部位(所謂歸巢)。 關(guān)于上述受體，與SDFl對應(yīng)的為CXCR4，與VEGF對應(yīng)的為VEGFR。例如，非專利文獻(xiàn)1報(bào)道了在缺血部位阻擋SDF1、或從血液中除去CXCR4表達(dá)細(xì)胞時(shí)，傷不能治愈。Fandrich和Huberman(非專利文獻(xiàn)2、；3)等已經(jīng)報(bào)道了通過對人單核細(xì)胞進(jìn)行去分化誘導(dǎo)而得到具有多分化能的干細(xì)胞的技術(shù)。上述技術(shù)均使用以M-CSF為代表的各種細(xì)胞因子用于培養(yǎng)。上述培養(yǎng)方法中，均確認(rèn)了一些未分化標(biāo)記轉(zhuǎn)化為陽性。另外，桑名等 (非專利文獻(xiàn)4)報(bào)道了使用涂布有纖連蛋白的培養(yǎng)皿能夠由人單個(gè)核細(xì)胞(mononuclear cells)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞MOMC。非專利文獻(xiàn)1 :Nat. Med. 2004 Aug ； 10 (8) :858-64非專利文獻(xiàn)2 =Ruhnke M,Fandrich F. ,Differentiation of in vitro—modified human peripheral blood monocytes into hepatocyte-like and pancreatic islet-like cells. , Gastroenterology. 128(2005) 1774非專利文獻(xiàn) 3 :Yong Zhao, Eliezer Huberman, A human peripheral blood monocyte-derived subset acts as pluripotent stem cells, PNAS 100 (2003)2426非專利文獻(xiàn) 4 :Kuwana Μ. et al. , Human circulating CD 14+ monocytes as a source of progenitors that exhibit mesenchymal cell differentiation.
J Leukoc Biol. 74(2003)833非專利文獻(xiàn) 5 :Folch J.，Lees Μ.，Sloane-Stanley G. H. :A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues, J. Biol. Chem.，226，497-509 (1957).

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種干細(xì)胞、干細(xì)胞的短期大量制造方法、及用于誘導(dǎo)該細(xì)胞的藥物組合物，所述干細(xì)胞已經(jīng)成為細(xì)胞藥物領(lǐng)域中的挑戰(zhàn)，能夠有效地到達(dá)目標(biāo)部位。另外，本發(fā)明的目的在于提供一種與細(xì)胞、組織或器官的損傷有關(guān)的疾病的治療劑。進(jìn)而，本發(fā)明的目的在于提供去分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基、去分化誘導(dǎo)劑、細(xì)胞藥物用試劑盒或產(chǎn)生去分化細(xì)胞的試劑盒及干細(xì)胞。作為解決上述課題的方法，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)通過使用末梢血單核細(xì)胞、在本發(fā)明去分化誘導(dǎo)劑的存在下進(jìn)行短時(shí)間培養(yǎng)，能夠大量誘導(dǎo)去分化細(xì)胞。另外發(fā)現(xiàn)通過直接對生物體給與本發(fā)明的藥物組合物，能夠有效地治療與損傷有關(guān)的疾病。進(jìn)而發(fā)現(xiàn)通過給與選自神經(jīng)節(jié)苷脂及水溶性植物提取物中的至少1種，可能與生物體內(nèi)的M-CSF協(xié)作，能夠?qū)魏思?xì)胞誘導(dǎo)為干細(xì)胞等能夠修復(fù)細(xì)胞、組織或器官的損傷的細(xì)胞，由此，本發(fā)明能夠提供與細(xì)胞、組織或器官的損傷有關(guān)的疾病的治療劑。即，具體而言，本發(fā)明提供以下發(fā)明。項(xiàng)1. 一種干細(xì)胞，所述干細(xì)胞是在(i)M-CSF及(ii)選自神經(jīng)節(jié)苷脂及水溶性植物提取物中的至少1種存在下培養(yǎng)單核細(xì)胞，使其去分化而得到的。項(xiàng)2.如項(xiàng)1所述的干細(xì)胞，其中，水溶性植物提取物的使單核細(xì)胞去分化的有效成分為糖或含糖復(fù)合物。項(xiàng)3.如項(xiàng)1所述的干細(xì)胞，其中，水溶性植物提取物的使單核細(xì)胞去分化的有效成分的分子量為1000 500000。項(xiàng)4.如項(xiàng)1所述的干細(xì)胞，其中，水溶性植物提取物的使單核細(xì)胞去分化的有效成分吸附在ConA柱上。項(xiàng)5.如項(xiàng)1所述的干細(xì)胞，其中，水溶性植物提取物的使單核細(xì)胞去分化的有效成分吸附在陰離子交換樹脂上。項(xiàng)6.如項(xiàng)1所述的干細(xì)胞，其中，水溶性植物提取物是來自植物的R)lch提取的水相級分(fraction)或其純化物。項(xiàng)7.如項(xiàng)1所述的干細(xì)胞，其中單核細(xì)胞為人單核細(xì)胞。項(xiàng)8.如項(xiàng)1 7中任一項(xiàng)所述的干細(xì)胞，其特征在于，表達(dá)未分化標(biāo)記Nanog， Nestin，c-Kit，CD9，0ct3/4中的至少一種，與在M-CSF單獨(dú)存在下培養(yǎng)單核細(xì)胞時(shí)所得的干細(xì)胞相比，CXCR4基因顯著地強(qiáng)表達(dá)。項(xiàng)9. 一種干細(xì)胞，其特征在于，表達(dá)未分化標(biāo)記Nanog，Nestin, c-Kit, CD9, 0ct3/4中的至少1種，并且CXCR4基因顯著地強(qiáng)表達(dá)。項(xiàng)10. —種干細(xì)胞的生產(chǎn)方法，其特征在于，在⑴M-CSF及(ii)選自神經(jīng)節(jié)苷脂及水溶性植物提取物中的至少1種存在下培養(yǎng)單核細(xì)胞。項(xiàng)11.如項(xiàng)10所述的方法，其中，培養(yǎng)時(shí)間為7天 14天。項(xiàng)12. —種單核細(xì)胞的去分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基，含有(i)M-CSF及(ii)選自神經(jīng)節(jié)苷脂及水溶性植物提取物中的至少1種。項(xiàng)13. —種藥物組合物，含有項(xiàng)1 9中任一項(xiàng)所述的干細(xì)胞作為有效成分。項(xiàng)14. 一種細(xì)胞藥物用劑，含有項(xiàng)1 9中任一項(xiàng)所述的干細(xì)胞作為有效成分。項(xiàng)15. —種去分化誘導(dǎo)劑，含有⑴M-CSF及(ii)選自神經(jīng)節(jié)苷脂及水溶性植物提取物中的至少1種作為有效成分。項(xiàng)16. —種與細(xì)胞、組織或器官的損傷有關(guān)的疾病的治療劑，含有選自神經(jīng)節(jié)苷脂及水溶性植物提取物中的至少1種作為有效成分。項(xiàng)17.如項(xiàng)16所述的治療劑，其中，所述疾病選自外傷、炎癥性疾病、骨·軟骨的損傷、循環(huán)系統(tǒng)疾病、神經(jīng)障礙、肝病及腎病、糖尿病、特應(yīng)性皮炎、GVHD。項(xiàng)18.如項(xiàng)16所述的治療劑，其中，所述疾病選自外傷、胰腺炎、放射線損傷、 皮肌炎、多發(fā)性肌炎、壞死性筋膜炎、慢性支氣管炎、骨折、骨質(zhì)疏松癥、骨軟骨骨折、骨軟骨炎、擴(kuò)張型心肌病、心肌梗塞、缺血性心肌病、心功能不全、心肌肥大、充血性心功能不全、再狹窄、心律不齊、動(dòng)脈粥樣硬化、血管炎、周圍神經(jīng)病變、神經(jīng)病理性疼痛、腦卒中、腦炎、腦膜炎、糖尿病性神經(jīng)病、注意缺陷障礙、自閉癥、阿爾茨海默病、帕金森病、克雅氏病 (Creutzfeldt-Jakob disease)、腦或脊髓外傷或缺血、肝硬化、慢性肝炎、慢性腎功能不全、腎小球腎炎、腎缺血、糖尿病、特應(yīng)性皮炎、GVHD。項(xiàng)19. 一種細(xì)胞藥物用試劑盒，含有至少項(xiàng)1 9中任一項(xiàng)所述的干細(xì)胞作為必要構(gòu)成成分。項(xiàng)20. —種產(chǎn)生去分化細(xì)胞的試劑盒，含有⑴M-CSF及(ii)選自神經(jīng)節(jié)苷脂及水溶性植物提取物中的至少1種作為必要構(gòu)成成分。項(xiàng)21.如項(xiàng)20所述的試劑盒，進(jìn)一步含有單核細(xì)胞作為構(gòu)成成分。項(xiàng)22.如項(xiàng)1 21中任一項(xiàng)所述的干細(xì)胞、干細(xì)胞的生產(chǎn)方法、單核細(xì)胞的去分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基、細(xì)胞藥物用劑、治療劑、去分化誘導(dǎo)劑、細(xì)胞藥物用試劑盒或產(chǎn)生去分化細(xì)胞的試劑盒，其中，神經(jīng)節(jié)苷脂為選自GDla、ffl)lb、a)2、a)3、GMl、GM2、GM3、GTlb&GQlb中的至少1種。根據(jù)本發(fā)明，能夠使用單核細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)大量供給能夠到達(dá)組織損傷部位的干細(xì)胞。另外，本發(fā)明也能夠提供該干細(xì)胞誘導(dǎo)劑，能夠期待本發(fā)明為細(xì)胞藥物領(lǐng)域做出貢獻(xiàn)。進(jìn)而，證明了神經(jīng)節(jié)苷脂及水溶性植物提取物例如來自植物的R)lch提取的水相級分(fraction)或其純化物能夠作為與細(xì)胞、組織或器官的損傷有關(guān)的疾病的治療劑。


[圖1]表示通過在培養(yǎng)基1 培養(yǎng)基5中培養(yǎng)由單核細(xì)胞誘導(dǎo)得到的干細(xì)胞的增殖曲線。[圖2]表示利用RT-PCR的基因表達(dá)的結(jié)果。[圖3]表示通過添加各神經(jīng)節(jié)苷脂對去分化為干細(xì)胞的作用。
[圖4]表示添加各神經(jīng)節(jié)苷脂后的細(xì)胞形態(tài)。[圖5]表示各植物提取成分中的去分化誘導(dǎo)活性。[圖6]表示來自甘薯莖提取物的去分化誘導(dǎo)成分的利用各種色譜法得到的餾化的活性結(jié)果。[圖7]表示小鼠肝組織中的抗膠原抗體的染色圖像。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明使用單核細(xì)胞例如末梢血單核細(xì)胞作為被去分化的細(xì)胞。本發(fā)明中使用的單核細(xì)胞來自哺乳動(dòng)物。作為哺乳動(dòng)物，可以舉出人、馬、牛、猿、 黑猩猩、豬、羊、兔、小鼠、大鼠、狗、貓等，優(yōu)選可以舉出人、猿、黑猩猩等靈長類，特別優(yōu)選人單核細(xì)胞。單核細(xì)胞來自骨髓、血液等，優(yōu)選使用來自血液的單核細(xì)胞，特別優(yōu)選使用末梢血單核細(xì)胞。從血液等樣品中分離單核細(xì)胞的方法是公知的，例如存在下述方法使用血細(xì)胞分離溶液 Lymphopi^p (Cosmo Bio Co. Ltd.)分離單個(gè)核細(xì)胞(mononuclear cells),使用能夠識別CD14的表面抗原的抗體磁珠(Miltenyi Viotec公司)處理所得的單個(gè)核細(xì)胞； 或者也可以將單個(gè)核細(xì)胞直接用作本發(fā)明的單核細(xì)胞的供給源。或者，人單核細(xì)胞也可以使用市售品。作為市售品，例如可以舉出PT038(L0NZA公司)等。本發(fā)明設(shè)想如下將單核細(xì)胞去分化為干細(xì)胞，使其增殖后將其返回到人等受檢體。此時(shí)，由于從患者分離單核細(xì)胞，所以需要由盡可能少的量的單核細(xì)胞得到大量的干細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明，去分化單核細(xì)胞得到干細(xì)胞的增殖效率高，能夠由少量的單核細(xì)胞制備大量的干細(xì)胞，故優(yōu)選。作為單核細(xì)胞，包含具有M-CSF受體(c-fms)的單核細(xì)胞類細(xì)胞(單核細(xì)胞、單個(gè)核細(xì)胞、原單核細(xì)胞(monoblasts))。由于同時(shí)使用單核細(xì)胞和單個(gè)核細(xì)胞時(shí)，只有增殖單核細(xì)胞，所以不僅可以使用單核細(xì)胞而且可以使用單個(gè)核細(xì)胞作為去分化的對象細(xì)胞。本說明書中，所謂“干細(xì)胞”是指表達(dá)未分化標(biāo)記并且具有自我復(fù)制能力的細(xì)胞。 本發(fā)明的干細(xì)胞可以由單核細(xì)胞大量地獲得。另外，本發(fā)明的干細(xì)胞能夠誘導(dǎo)分化，優(yōu)選具有多能分化能。本發(fā)明中得到的干細(xì)胞為CD14及CD45陽性。作為本發(fā)明的干細(xì)胞的特征，可以舉出CXCR4基因的顯著的強(qiáng)表達(dá)；和Nanog， Nestin，c-Kit，CD9及0ct3/4的至少1種、優(yōu)選至少2種、較優(yōu)選至少3種、更優(yōu)選至少4 種、特別優(yōu)選Nanog，Nestin, c-Kit,⑶9及0ct3/4全部基因被表達(dá)。優(yōu)選的本發(fā)明的干細(xì)胞，與在M-CSF單獨(dú)存在下培養(yǎng)單核細(xì)胞時(shí)所得的干細(xì)胞相比，CXCR4基因顯著地強(qiáng)表達(dá)，并且Nanog, Nestin, c-Kit, CD9及0ct3/4基因的至少1種、 優(yōu)選至少2種、較優(yōu)選至少3種、更優(yōu)選至少4種、特別優(yōu)選5種全部被表達(dá)。在較優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明干細(xì)胞的特征列舉如下(i)與在M-CSF單獨(dú)存在下培養(yǎng)單核細(xì)胞時(shí)得到的干細(xì)胞相比，CXCR4基因顯著地強(qiáng)表達(dá)；(ii)表達(dá) c-Kit ；及(iii)表達(dá)選自Nanog，Nestin,⑶9及0ct3/4中的至少1種的未分化標(biāo)記。
本發(fā)明的來自單核細(xì)胞的干細(xì)胞與其他的去分化干細(xì)胞的區(qū)別特征為與細(xì)胞的歸巢作用有關(guān)的CXCR4基因的強(qiáng)表達(dá)。本發(fā)明干細(xì)胞與在M-CSF單獨(dú)存在下培養(yǎng)單核細(xì)胞所得的干細(xì)胞相比，CXCR4基因顯著地強(qiáng)表達(dá)。例如，本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案之一中， 本發(fā)明的干細(xì)胞用RT-PCR解析時(shí)，CXCR4基因的表達(dá)量為在M-CSF單獨(dú)、M-CSF+IL-3、 M-CSF+IL-6&LIF等存在下培養(yǎng)單核細(xì)胞所得的表達(dá)量的3倍以上、特別為4倍以上。另外，本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案之一中，本發(fā)明的干細(xì)胞即使與來自骨髓的間充質(zhì)干細(xì)胞相比， CXCR4基因也顯著地強(qiáng)表達(dá)，具體而言，用RT-PCR解析時(shí)，CXCR4基因的表達(dá)量為來自骨髓的間充質(zhì)干細(xì)胞的2倍以上，優(yōu)選為3倍以上。本發(fā)明的來自單核細(xì)胞的干細(xì)胞的特征在于與其他的去分化干細(xì)胞同樣表達(dá)作為干細(xì)胞標(biāo)記的c-Kit。已知CXCR4受體的配體SDFl在骨折和循環(huán)系統(tǒng)疾病造成的損傷組織、或神經(jīng)組織的損傷部位等表達(dá)，從細(xì)胞藥物的觀點(diǎn)考慮，本細(xì)胞具有更強(qiáng)的向損傷部位歸巢的效果，因此是有效的。本發(fā)明中得到的干細(xì)胞可以通過直接給與/注入患部而用于疾病的治療。在注入患部之前，優(yōu)選在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)干細(xì)胞，在數(shù)量增加后直接給與/注入患部。作為干細(xì)胞的培養(yǎng)用培養(yǎng)基，可以使用普通的細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基，但優(yōu)選在本發(fā)明的去分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。根據(jù)本發(fā)明的方案之一，作為使用本發(fā)明的干細(xì)胞能夠治療的疾病，可以舉出外傷、炎癥性疾病(胰腺炎、放射線損傷、皮肌炎、多發(fā)性肌炎、壞死性筋膜炎、慢性支氣管炎)、骨 軟骨的損傷(例如骨折、骨質(zhì)疏松癥、骨軟骨骨折、骨軟骨炎)、循環(huán)系統(tǒng)疾病(例如擴(kuò)張型心肌病、心肌梗塞、缺血性心肌病、心功能不全、心肌肥大、充血性心功能不全、再狹窄、心律不齊、動(dòng)脈粥樣硬化、血管炎等)、神經(jīng)障礙(例如周圍神經(jīng)病變、神經(jīng)病理性疼痛、腦卒中、腦炎、腦膜炎、糖尿病性神經(jīng)病、注意缺陷障礙、自閉癥、阿爾茨海默病、帕金森病、克雅氏病、腦或脊髓外傷或缺血)、肝病(肝硬化、慢性肝炎)、腎病(慢性腎功能不全、 腎小球腎炎、腎缺血)、糖尿病、特應(yīng)性皮炎、GVHD等。需要說明的是，本發(fā)明去分化干細(xì)胞于2009年9月30日保藏在日本國〒 305-8566茨城縣筑波市東1 丁目1番地1中央第6的獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心。受理編號為FERM ABP-111840如上所述，可以通過在(i)M-CSF及(ii)選自神經(jīng)節(jié)苷脂及水溶性植物提取物中的至少1種存在下培養(yǎng)單核細(xì)胞，將單核細(xì)胞誘導(dǎo)為干細(xì)胞。本說明書中，所謂水溶性植物提取物是指植物的整體或其一部分(例如葉、莖、地下莖、根莖、塊莖、藤、根、花、花蕾、花瓣、子房、果實(shí)、莢、蒴果、種子、纖維、胚珠)的提取物。 作為提取溶劑，可以舉出水或含水溶劑(例如含水甲醇、含水乙醇、含水丙醇等含水醇、含水THF、含水丙酮)、DMF、DMS0、二甲基乙酰胺等極性溶劑。所謂水溶性植物提取物是指由上述水、含水溶劑或?qū)O性物質(zhì)的溶解度大的極性溶劑提取的物質(zhì)。水溶性植物提取物也可以如下得到利用下述溶劑對植物進(jìn)行提取，之后用水或含水溶劑提取作為目標(biāo)的水溶性物質(zhì)，所述溶劑為氯仿、二氯甲烷等氯化烴；甲醇、乙醇、丙醇等醇；苯、甲苯等芳香族烴；乙酸乙酯等酯；THF、乙醚等醚；丙酮、甲基乙基酮等酮；己烷、環(huán)己烷等脂肪族或脂環(huán)族烴等。 水或含水溶劑、極性溶劑等的提取物，根據(jù)需要也可以用下述溶劑洗滌除去脂溶性成分，所述溶劑為氯仿、二氯甲烷等氯化烴；苯、甲苯等芳香族烴；乙酸乙酯等酯；THF、乙醚等醚；己烷、環(huán)己烷等脂肪族或脂環(huán)族烴。水溶性植物提取物優(yōu)選為來自植物的i^lch提取的水相級分或其純化物。Folch提取是指將植物用氯仿甲醇=2 1提取，用水洗滌該混合溶劑而轉(zhuǎn)移到水相中的級分?？梢允褂枚燃淄?、四氯化碳、1，2_ 二氯乙烷等其他的氯化烴代替氯仿，也可以使用乙醇、正丙醇、異丙醇、丁醇等低級醇代替甲醇。另外，氯化烴和醇的比也不限于上述的2 1，可以舉出較廣的范圍。此處，氯化烴和醇的混合溶劑對物質(zhì)具有較高的溶解能力，可以有效地進(jìn)行提取。氯化烴和醇的比率優(yōu)選為如下比率，即在其中加入水時(shí)能夠分離為水相和有機(jī)相，并且能夠?qū)⒒钚晕镔|(zhì)提取到水相中的比率。加入水不分離為2相時(shí)，也可以加入有機(jī)溶劑使其分離為二層。本說明書中，將加入水分離為二層的水相稱作“來自植物的Rich提取的水相級分”。需要說明的是，“來自植物的R)lch提取的水相級分”，只要具有與其相同的活性物質(zhì)即可，包括利用其他方法提取的水相級分。本發(fā)明的水溶性植物提取物含有糖脂樣物質(zhì)(包括糖脂和糖中的一者或兩者)作為有效成分。由于該糖脂樣物質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度低，所以水溶性植物提取物優(yōu)選作為水相級分被分離。進(jìn)而，水溶性植物提取物能夠使用離子交換色譜法、親合色譜法等色譜法進(jìn)一步純化，可以使用上述純化物作為有效成分。水溶性植物提取物的有效成分可以只由糖構(gòu)成，也可以含有糖和除糖之外的成分 (脂質(zhì)等)兩者。作為糖的構(gòu)成成分，可以舉出葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、核糖、鼠李糖、巖藻糖、脫氧核糖、甘露糖、果糖、半乳糖、麥芽糖、乳糖、纖維二糖、蔗糖、海藻糖、棉籽糖、蜜二糖、麥芽三糖、松三糖、松二糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸、艾杜糖醛酸、氨基葡萄糖、半乳糖胺、甘露糖胺、N-乙酰氨基葡萄糖、N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰甘露糖胺、神經(jīng)氨酸、N-乙酰神經(jīng)氨酸等，它們也可以被硫酸化。優(yōu)選它們以低聚糖、多糖、苷或糖脂的形式存在。作為多糖，具體而言可以舉出糖胺聚糖、α-葡聚糖、β-葡聚糖、果聚糖(Ievan)、果聚糖(fructan)、半乳聚糖、甘露聚糖、木聚糖、阿拉伯聚糖、果膠酸、藻酸、果膠物質(zhì)、瓜爾糖 (guaran)、硫酸化多糖、結(jié)合有1種或2種以上的糖殘基的多糖、或以1種或2種以上的上述糖殘基為重復(fù)單元的多糖、多個(gè)糖殘基復(fù)雜結(jié)合的多糖。優(yōu)選水溶性植物提取物在提取后用陽離子交換樹脂處理。在實(shí)施方案之一中，本發(fā)明的水溶性植物提取物優(yōu)選含有被陰離子交換樹脂吸附的(在水中具有陰離子基團(tuán))成分作為有效成分。在其他的實(shí)施方案中， 本發(fā)明的水溶性植物提取物優(yōu)選含有與Con A瓊脂糖結(jié)合的成分作為有效成分。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，水溶性植物提取物含有被陰離子交換樹脂吸附、且與Con A瓊脂糖結(jié)合的成分作為有效成分。作為與Con A瓊脂糖結(jié)合的有效成分，優(yōu)選含有葡萄糖殘基及/或甘露糖殘基的多糖或糖(包括糖脂等含糖復(fù)合物)，特別優(yōu)選含有甘露糖殘基的多糖或糖(包括糖脂等含糖復(fù)合物)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，水溶性植物提取物含有具有糖殘基且在冷水或熱水中為可溶性(可提取)的成分，優(yōu)選舉出分子量的下限為500、1000、2000、3000、4000 或 5000 左右、上限為 500000、300000、200000、100000、80000、60000、50000、40000、30000或 20000左右的含有多糖或復(fù)合多糖的成分?？梢酝ㄟ^在選自神經(jīng)節(jié)苷脂及水溶性植物提取物中的至少1種存在下培養(yǎng)單核細(xì)胞而將其誘導(dǎo)為干細(xì)胞。生物體內(nèi)(例如人)，由于已經(jīng)存在M-CSF，所以選自神經(jīng)節(jié)苷脂及水溶性植物提取物中的至少1種可以作為由單核細(xì)胞誘導(dǎo)為干細(xì)胞的誘導(dǎo)劑發(fā)揮作用，該干細(xì)胞到達(dá)疾病部位，作為各種疾病的治療劑發(fā)揮作用。以選自神經(jīng)節(jié)苷脂及水溶性植物提取物中的至少1種為有效成分的治療劑對下述疾病的治療是有用的外傷、炎癥性疾病(胰腺炎、放射線損傷、皮肌炎、多發(fā)性肌炎、壞死性筋膜炎、慢性支氣管炎)、骨·軟骨的損傷(例如骨折、 骨質(zhì)疏松癥、骨軟骨骨折、骨軟骨炎)、循環(huán)系統(tǒng)疾病(例如擴(kuò)張型心肌病、心肌梗塞、缺血性心肌病、心功能不全、心肌肥大、充血性心功能不全、再狹窄、心律不齊、動(dòng)脈粥樣硬化、血管炎等)、神經(jīng)障礙(例如周圍神經(jīng)病變、神經(jīng)病理性疼痛、腦卒中、腦炎、腦膜炎、糖尿病性神經(jīng)病、注意缺陷障礙、自閉癥、阿爾茨海默病、帕金森病、克雅氏病、腦或脊髓外傷或缺血)、肝病(肝硬化、慢性肝炎)、腎病(慢性腎功能不全、腎小球腎炎、腎缺血)、糖尿病、特應(yīng)性皮炎、GVHD。以選自神經(jīng)節(jié)苷脂及水溶性植物提取物中的至少1種作為有效成分的治療劑的有效量根據(jù)其用法、患者的年齡、性另U、疾病的程度等適當(dāng)選擇，通常，相對于成人每Ikg體重，有效成分的量為0. 0001 IOOmg左右，優(yōu)選為0. 001 IOmg左右，較優(yōu)選為0. 01 5mg左右。該治療劑可以1天分1 4次給與。來自植物的R)lch提取的水相級分廣泛包括利用同樣的方法提取得到的植物提取物。需要說明的是，含有來自植物的i^lch提取的水相級分的水溶性植物提取物的有效成分具有與陰離子交換樹脂、Con A瓊脂糖結(jié)合的性質(zhì)，可以通過使其經(jīng)過陽離子交換樹脂來提高活性。將本發(fā)明的治療劑或藥物組合物以藥物制劑的形式實(shí)際使用時(shí)，可以同時(shí)使用含有下述成分的有效成分和制劑載體制成通常的劑型(dosage form)，所述成分含有選自神經(jīng)節(jié)苷脂及水溶性植物提取物中的至少1種和根據(jù)需要使用的M-CSF。該制劑載體根據(jù)劑型和給與方法適當(dāng)選擇使用，可以舉出通常使用的填充劑、增量劑、粘合劑、潤濕劑、崩解劑、表面活性劑、潤滑劑等稀釋劑或賦形劑。作為本發(fā)明劑型，可以根據(jù)治療目的選擇各種形式，作為其代表，可以舉出片劑、 丸劑、散劑、溶液劑、懸浮劑、乳劑、顆粒劑、膠囊劑、栓劑、注射劑(溶液劑、懸浮劑等)、軟膏劑等，它們均可以通過常規(guī)方法、使用上述合適的載體制備。另外，根據(jù)需要片劑可以為進(jìn)行了通常包衣的片劑，例如可以為糖衣片、明膠衣片、腸溶衣片、薄膜衣片或雙層片、多層片。本發(fā)明藥物以溶液劑、乳劑、懸浮劑等形式制成注射劑時(shí)，優(yōu)選它們被滅菌且與血液等滲，因此，本發(fā)明藥物組合物中可以含有用于調(diào)節(jié)等滲性溶液的充足量的食鹽、葡萄糖或甘油，另外也可以添加通常的助溶劑、緩沖劑、鎮(zhèn)痛劑等。進(jìn)而，本發(fā)明的藥物組合物中，根據(jù)需要也可以含有著色劑、防腐劑、香料、調(diào)味劑、甜味劑等或其他藥物。另外，給與選自神經(jīng)節(jié)苷脂及水溶性植物提取物中的至少1種和M-CSF兩者時(shí)，它們可以同時(shí)給與，也可以分別給與。選自神經(jīng)節(jié)苷脂及水溶性植物提取物中的至少1種可以以食品形式攝取，例如以飲料類或棒(補(bǔ)充棒)等形式攝取。所述食品組合物可以按照常規(guī)方法制備，在其制備中可以適當(dāng)使用通常熟知的其他的食品原料(原料成分)、賦形劑、稀釋劑等。去分化干細(xì)胞可以通過在(i) M-CSF及(ii)選自神經(jīng)節(jié)苷脂及水溶性植物提取物中的至少1種共存下將上述原料細(xì)胞培養(yǎng)一定時(shí)間進(jìn)行去分化誘導(dǎo)而得到。M-CSF存在分子量約22000的膜結(jié)合型和分子量約42000的分泌型，通過二硫鍵，它們的分子量變?yōu)榧s45000(22000的二聚體)、約85000(42000的二聚體)，也存在85kDa 型進(jìn)一步與蛋白聚糖結(jié)合所得的高分子量型，可以使用上述任一種M-CSF。優(yōu)選使用分子量約42000的分泌型、分子量約8500(K42000的二聚體)、85kDa型進(jìn)一步與蛋白聚糖結(jié)合所得的高分子量型。另外，M-CSF的由來，可以舉出哺乳動(dòng)物(人、馬、牛、猿、黑猩猩、豬、羊、 兔、小鼠、大鼠、狗、貓)，可以優(yōu)選舉出人、猿、黑猩猩等靈長類，特別優(yōu)選人。可以使用通過純化天然物得到的M-CSF，但優(yōu)選使用通過基因重組制造的M-CSF。例如，由于已知M-CSF 具有至少從N末端到第153位的氨基酸時(shí)，具有與天然型相同程度的比活度，所以可以使用不具有上述糖鏈的大腸桿菌表達(dá)的重組體等。作為神經(jīng)節(jié)苷脂的種類，只要為GM1，⑶la，GTlb等以下記載的種類即可，沒有特殊限制。進(jìn)而可以使用它們的混合物。進(jìn)而，來自植物的提取成分(來自植物的糖脂樣物質(zhì))也可以顯著地誘導(dǎo)去分化。另外，也可以使用來自動(dòng)物組織的提取物(來自動(dòng)物的糖脂樣物質(zhì))。該提取物可以在用于提取糖脂樣物質(zhì)的通常的條件下制備。本發(fā)明的藥物的有效成分為神經(jīng)節(jié)苷脂或水溶性植物提取物，也可以使用含有上述成分的植物提取物、動(dòng)物組織提取物中的任一種。例如，動(dòng)物的腦 神經(jīng)組織中富含神經(jīng)節(jié)苷脂，可以使用來自動(dòng)物的腦 神經(jīng)組織的提取物作為神經(jīng)節(jié)苷脂。被提取的神經(jīng)節(jié)苷脂可以被純化。在級分含有具有神經(jīng)節(jié)苷脂的糖脂成分的范圍內(nèi)，可以改變純化度。作為提取成分，通常情況下可以使用在糖脂樣物質(zhì)被提取的條件下得到的級分。作為天然的提取成分，例如可以舉出利用了 Folch提取法(非專利文獻(xiàn)5)的水相級分。作為動(dòng)物，可以優(yōu)選舉出哺乳動(dòng)物(牛、豬、 兔、羊、馬等)，特別優(yōu)選來自豬的腦·神經(jīng)組織的神經(jīng)節(jié)苷脂。另外，也可以使用來自牛奶之類的哺乳動(dòng)物的奶的神經(jīng)節(jié)苷脂。作為神經(jīng)節(jié)苷脂或用作糖脂樣物質(zhì)的材料的水溶性植物提取物，可以優(yōu)選舉出甘暮(sweet potato)、番暮(Ipomea Batatas sp)、牽牛花(morning-glory)、空心菜(swamp morning—glory)、械卩十牽牛(Ivy-leaved morning glory)、七爪龍(f ingerleaf morning glory)、鸞蘿(cardinal climber)、藍(lán)色牽?；?blue morning glory)、銳葉牽牛(Ipomoea congesta)等方寵花禾斗、蓮(Nelumbo nucifera)(蓮藕(lotus root))、黃蓮(Nelumbo lutea) 等蓮禾斗、光果龍奏(Solanum americanum)(Solanum lycopersicum)(Solanum mammosum)、爺子(Solanum melongena)、龍葵(Solanum nigrum)、馬鈴薯(Solanum tuberosum) > 1 (Capsicum annuum) > ^^7^ (Capsicum frutescens)、洋金# (Datura metel)、Datura meteloides、曼陀羅(Datura stramonium)、曼陀羅木(Brugmansia arborea) > ^M K (Brugmansia suaveolens) > Sik^T (Physalis alkekengi var. franchetii)、日本走燈蘚(P. japonicum)、矮牽牛(Petunia χ hybrida)等茄科植物的提取物。上述植物僅僅是列舉，可以廣泛使用神經(jīng)節(jié)苷脂或具有糖或糖脂的水溶性植物提取物。 植物可以為葉、莖、地下莖、根莖、塊莖、藤、根、花、花蕾、花瓣、子房、果實(shí)、莢、蒴果、種子、纖維、胚珠、全草等，也可以提取它們中的任一種。例如，甘薯、馬鈴薯等薯類未必一定使用球莖部分，也可以使用它們的葉、莖、地下莖、根莖、塊莖、藤、根、花、花蕾、花瓣、子房、果實(shí)、莢、蒴果、種子、纖維、胚珠、全草等中的任一種。作為植物，例如為了大量地制造神經(jīng)節(jié)苷脂或糖脂樣物質(zhì)，也可以使用引入了必要的基因及/或剔除了非必要基因的基因重組植物。
神經(jīng)節(jié)苷脂是具有唾液酸的鞘糖脂的總稱，具有⑶la、⑶lb、⑶2、⑶3、GMl、GM2、 GM3、GTlb及GQlb等種類。另外，各神經(jīng)節(jié)苷脂具有以下結(jié)構(gòu)。GDla = aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-3)bDGalNAc(1-4)[aNeu5Ac(2-3)JbDGalp(1-4) bDGlcp(l-l)CerGDlb = bDGalp(1-3)bDGalNAc(1-4)[aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac0-3)]bDGalp(1-4) bDGlcp(l-l)CerGD2 = bDfeilpNAc(1-4)[aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)]bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1) CerGD3 = aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer GMl = bDGalp(1-3)bDGalNAc[aNeu5Ac(2-3)]bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)CerGM2 = bDGalpNAc(1-4)[aNeu5Ac(2-3)]bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)CerGM3 = aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)CerGTlb = aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-3)bDGalNAc(1-4)[aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)] bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)CerGQ lb = aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-3)bDGalNAc(1-4)[aNeu5Ac(2-8) aNeu5Ac(2-3)]bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1) CeraNeu5Ac = 5_ 乙酉先基-α -神經(jīng)氨酸(5-acetyl-α -neuraminic acid)aNeu5Ac9Ac = 5，9_ 二乙酉先基 _ α _ 神經(jīng)氛酸(5，9_diacetyl_ α -neuraminic acid)bDGalp = β -D-吡喃半乳糖(β -D-galactopyranose) 7bDGalpNAc = N-乙酰基 _ β -D-吡喃半乳糖(N-acetyl- β -D-galactopyranose)bDGlcp = β -D-吡喃葡萄糖(β -D-glucopyranose)OCer =神經(jīng)酉先胺(general N-acylated sphingoid)使用的培養(yǎng)基只要是哺乳動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)基即可，沒有特殊限制，例如，可以通過在RPMI 1640，DMEM, EagleMEM, α MEM, IMEM, M199各培養(yǎng)基中加入1 20%左右的例如 FBS,FCS,CS,HS等血清成分進(jìn)行培養(yǎng)。作為優(yōu)選例，可以舉出在含有10%左右FBS的DMEM 培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，但不限于此。進(jìn)而也可以使用無血清培養(yǎng)基。作為無血清培養(yǎng)基的例子，可以舉出作為哺乳動(dòng)物培養(yǎng)用的UltraCULTURE ，沒有特殊限制?？梢酝ㄟ^在下述培養(yǎng)條件下培養(yǎng)單核細(xì)胞而得到去分化干細(xì)胞，所述培養(yǎng)條件為在含有(i)M-CSF及(ii)選自神經(jīng)節(jié)苷脂及水溶性植物提取物中的至少1種的培養(yǎng)基中， 優(yōu)選在5% CO2存在下、在37°C下培養(yǎng)7天 14天左右。即，通過在該培養(yǎng)過程中進(jìn)行去分化，能夠得到上述本發(fā)明的特定的表達(dá)未分化標(biāo)記的干細(xì)胞。進(jìn)而，在該培養(yǎng)過程中為本發(fā)明干細(xì)胞的特征的CXCR4基因的表達(dá)顯著上升，即使延長該培養(yǎng)過程，只要CXCR4基因高度表達(dá)，則也屬于本發(fā)明干細(xì)胞。另外，在上述條件下培養(yǎng)原料細(xì)胞時(shí)，最終得到的干細(xì)胞數(shù)與在M-CSF單獨(dú)或與其他細(xì)胞因子組合的情況下進(jìn)行培養(yǎng)相比，能夠得到約5倍的干細(xì)胞。需要說明的是，也可以使用M-CSF和選自神經(jīng)節(jié)苷脂及水溶性植物提取物中的至少1種的以共價(jià)或非共價(jià)的形式鍵合的復(fù)合物作為去分化誘導(dǎo)劑。雖然已經(jīng)報(bào)道了即使在M-CSF單獨(dú)存在下培養(yǎng)單核細(xì)胞也能得到去分化干細(xì)胞，但本發(fā)明通過組合(i)M-CSF和(ii)選自神經(jīng)節(jié)苷脂及水溶性植物提取物中的至少1種， 能夠得到顯著強(qiáng)表達(dá)CXCR4基因的干細(xì)胞。作為培養(yǎng)條件，可以使用5-lOOng/ml濃度的 M-CSF、優(yōu)選使用25ng/ml的M-CSF進(jìn)行培養(yǎng)。神經(jīng)節(jié)苷脂可以使用來自植物、動(dòng)物等的提取物等的混合物，也可以使用純化天然的神經(jīng)節(jié)苷脂含有材料得到的物質(zhì)或化學(xué)合成物。神經(jīng)節(jié)苷脂可以以最終濃度1-100μ g/ml左右用于培養(yǎng)基。水溶性植物提取物可以以最終濃度0. 1-100 μ g/ml左右用于培養(yǎng)基。選自神經(jīng)節(jié)苷脂及水溶性植物提取物中的至少1種的最終濃度為Ι-lOOug/ml左右。需要說明的是，本說明書中“神經(jīng)節(jié)苷脂”是指⑶la、⑶lb、GD2、GD3、GMU GM2、GM3、 GTlb, GQlb等神經(jīng)節(jié)苷脂單品、或它們的混合物。神經(jīng)節(jié)苷脂的量是指其中的神經(jīng)節(jié)苷脂量，神經(jīng)節(jié)苷脂為多種時(shí)是指其總量。試劑盒本發(fā)明還提供以本發(fā)明的干細(xì)胞為必要構(gòu)成成分的細(xì)胞藥物用試劑盒、及以(i) M-CSF及(ii)神經(jīng)節(jié)苷脂或水溶性植物提取物為必要構(gòu)成成分的產(chǎn)生去分化細(xì)胞的試劑
品.ο細(xì)胞藥物用試劑盒含有本發(fā)明的來自單核細(xì)胞的干細(xì)胞作為必要構(gòu)成成分，根據(jù)需要還可以進(jìn)一步含有下述培養(yǎng)基及培養(yǎng)容器等，所述培養(yǎng)基含有(i)M-CSF和(ii)選自神經(jīng)節(jié)苷脂及水溶性植物提取物中的至少1種?；蛘?，試劑盒也可以為填充有來自單核細(xì)胞的干細(xì)胞的注射器。細(xì)胞藥物用試劑盒中含有的來自單核細(xì)胞的干細(xì)胞數(shù)為每1個(gè)試劑盒中例如為 IXlO4 IXlO7個(gè)左右。本發(fā)明的產(chǎn)生去分化細(xì)胞的試劑盒以⑴M-CSF及(ii)選自神經(jīng)節(jié)苷脂及水溶性植物提取物中的至少1種為必要構(gòu)成成分，進(jìn)而根據(jù)需要還可以進(jìn)一步含有細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基、培養(yǎng)容器、單核細(xì)胞等。[產(chǎn)業(yè)上的可利用性] 本細(xì)胞的適用領(lǐng)域本發(fā)明可以適用于干細(xì)胞能夠適用的全部領(lǐng)域。特別是能夠用于近年來備受關(guān)注的細(xì)胞藥物領(lǐng)域，用于該領(lǐng)域時(shí)需要短時(shí)間內(nèi)制備使用細(xì)胞。并且，如果考慮到排斥反應(yīng)的問題，使用自體細(xì)胞制備去分化干細(xì)胞然后返還到生物體的方法在安全方面是重要的。因此，在攝取自體細(xì)胞后能夠在短時(shí)間以某種程度生產(chǎn)干細(xì)胞是重要的。本發(fā)明從該觀點(diǎn)考慮是重要的。作為本發(fā)明的具體使用方案之一，可以進(jìn)行去分化細(xì)胞的靜脈內(nèi)給藥。關(guān)于細(xì)胞的給與形式，可以為在通過培養(yǎng)得到目標(biāo)細(xì)胞后，按照合適的常規(guī)方法給與使用的細(xì)胞。例如，胰蛋白酶處理后，通過離心分離回收細(xì)胞，之后使其分散在適當(dāng)?shù)牡葷B液中，然后例如進(jìn)行靜脈內(nèi)給藥。進(jìn)而，此時(shí)也可以添加合適的藥學(xué)上允許的載體使細(xì)胞穩(wěn)定化。另外，通過培養(yǎng)得到的細(xì)胞在從培養(yǎng)液中回收和給與細(xì)胞之間存在時(shí)間差時(shí)，可以按照常規(guī)方法在液氮存在下或-80°C下保存。優(yōu)選在將單核細(xì)胞去分化培養(yǎng)開始后7 天 14天的期間內(nèi)回收細(xì)胞直接用于目的治療。這是因?yàn)镃XCR4基因的表達(dá)水平在該期間很可能達(dá)到最大限。從該點(diǎn)上考慮，該基因標(biāo)記的表達(dá)水平也可以決定該干細(xì)胞的使用期間而不限于培養(yǎng)期間?！ぶ委焺?藥物組合物的適用領(lǐng)域本發(fā)明通過將選自神經(jīng)節(jié)苷脂及水溶性植物提取物中的至少1種和根據(jù)需要的 M-CSF給與人等哺乳動(dòng)物，能夠治療外傷、炎癥性疾病、骨·軟骨的損傷、循環(huán)系統(tǒng)疾病、神經(jīng)障礙、肝病及腎病、糖尿病、特應(yīng)性皮炎、GVHD等疾病。這是通過選自神經(jīng)節(jié)苷脂及來自植物的Rich提取的水相級分中的至少1種和根據(jù)需要的M-CSF的作用，將被給與的受檢體的單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化為能夠修復(fù)上述疾病的干細(xì)胞，該干細(xì)胞移動(dòng)到疾病部位作為治療劑發(fā)揮作用。或者，也不否定選自神經(jīng)節(jié)苷脂及來自植物的i^olch提取的水相級分中的至少1種直接或間接地作用于單核細(xì)胞以外的細(xì)胞?！ぷ鳛樵噭┖械膽?yīng)用使用本去分化誘導(dǎo)劑制備的去分化干細(xì)胞在經(jīng)過適當(dāng)?shù)谋４嫣幚砗罂梢杂米髟噭┖?。另外，去分化誘導(dǎo)劑也同樣地可以作為含有該誘導(dǎo)劑作為必要構(gòu)成成分的試劑
品.ο[實(shí)施例]以下，基于實(shí)施例更詳細(xì)地說明本發(fā)明，但不言而喻，本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例。實(shí)施例1根據(jù)本發(fā)明，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加以下的添加物1 5，對人單核細(xì)胞(L0NZA公司、PT038)進(jìn)行培養(yǎng)(濃度以最終濃度(以下以“FC”表示)表示)。結(jié)果示于圖1。圖1 的縱軸相當(dāng)于活細(xì)胞數(shù)，橫軸為培養(yǎng)天數(shù)。由結(jié)果可知，與Fandrich和Huberman等報(bào)道的方法相比，本發(fā)明的來自單核細(xì)胞的干細(xì)胞的增殖性非常高。添加物1 :M-CSF(FC :25ng/ml) + 神經(jīng)節(jié)苷月旨(牛腦 GDlaSIGMA) (FC :100ug/ml)添加物2 =M-CSF (FC :5ng/ml)+IL-3 (FC :0. 5ng/ml)(非專利文獻(xiàn) 2)添加物3 =M-CSF (FC :25ng/ml)+IL-6 (FC :20ng/ml) &LIF (FC :1000unit/ml)(非專利文獻(xiàn)3)添加物4 =M-CSF (FC :25ng/ml)添加物5 :M_CSF(FC :25ng/ml) +糖脂(將植物(甘薯)的Ig干燥重量的R)lch提取的水相級分溶解在500ml培養(yǎng)基中而獲得)需要說明的是，添加物5中使用的R)lch提取的水相級分如下制備將經(jīng)冷凍干燥的細(xì)胞(甘薯植物組織)在適量的生理鹽水中充分均化后，與等容量的氯仿 甲醇2 1 溶液劇烈地混合，通過離心分離分離為有機(jī)溶劑相、變性蛋白質(zhì)相、水相后，使用能夠被提取到上層的水溶性級分中的成分。將全部添加物添加到DMEM (20%胎牛血清中，在1. 5 X 105/ml (200ul/孔、96孔板) 濃度下開始培養(yǎng)人單核細(xì)胞。使用Promega公司的CellTiter-Glo 發(fā)光法細(xì)胞活力檢測試劑盒(Luminescent Cell Viability Assay)對活細(xì)胞數(shù)進(jìn)行定量化。即，每個(gè)培養(yǎng)日用生理鹽水對孔洗滌3次，除去不粘連的細(xì)胞，然后將粘連·增殖的細(xì)胞定量化。另一方面，利用RT-PCR對按照本發(fā)明及現(xiàn)有技術(shù)的培養(yǎng)方法得到的干細(xì)胞的基因表達(dá)進(jìn)行解析。人單核細(xì)胞是在上述條件下并在1.5X105/ml(6ml/皿、直徑6cm)的濃度下開始培養(yǎng)，第14天回收mRNAanvitrogen公司=Micro Fast Track 2. OKit)，然后，利用RT-PCR進(jìn)行表達(dá)量解析。項(xiàng)目及引物的序列信息如下所示。
0137]Nanog F 5，-GCTTGCCTTGCTTTGAAGCA-3，(序列號 1)
0138]R 5，-TTCTTGACTGGGACCTTGTC-3，(序列號 2)
0139]Nestin F 5，-CTCTGACCTGTCAGAAGAAT-3，(序列號 3)
0140]R 5，-GACGCTGACACTTACAGAAT-3，(序列號 4)
0141]0ct3/4F 5，-GAGCAAAACCCGGAGGAGT-3，(序列號 5)
0142]R 5，-TTCTCTTTCGGGCCTGCAC-3，(序列號 6)
0143]c-Kit F 5，-CCAAGTCATTGTTGGATAAG-3，(序列號 7)
0144]R 5，-CTTAGATGAGTTTTCTTTCAC-3，(序列號 8)
0145]CXCR4
0146]
0147]
0148]
0149]
0150]
0151] 3)
0152]
0153]
0154]
0155]
0156] cDNA)
0157]
F 5，-ATCTTCCTGCCCACCATCTACTCCATCATC-3，(序列號 9) R 5，-ATCCAGACGCCAACATAGACCACCTTTTCA-3，(序列號 10) 泳道構(gòu)成(濃度以最終濃度(以下以“FC”表示)表示)
1=M-CSF (FC :25ng/ml) + 神經(jīng)節(jié)苷脂(牛腦 GDla SIGMA) (FC :100ug/ml)
2=M-CSF (FC :5ng/ml)+IL-3 (FC :0. 5ng/ml)(非專利文獻(xiàn) 2)
3=M-CSF(FC :25ng/ml)+IL-6 (FC :20ng/ml)+LIF(FC lOOOunit/ml)(非專利文獻(xiàn)
4=M-CSF(FC :25ng/ml)
5=M-CSF (FC :25ng/ml) +來自植物的R)lch提取的水相級分
6無培養(yǎng)基
7無培養(yǎng)基
1-6 人單核細(xì)胞、7 人骨髓(Clontech 公司 Human Bone Marrow Marathon-Ready
結(jié)果示于圖2。圖2的結(jié)果表明利用本發(fā)明(泳道1或泳道5)得到的干細(xì)胞的 CXCR4的表達(dá)量極高。
0158]接下來，對各種神經(jīng)節(jié)苷脂的干細(xì)胞誘導(dǎo)活性進(jìn)行比較。
0159]S卩，將神經(jīng)節(jié)苷脂添加到培養(yǎng)基中，使最終濃度為lOOug/ml，培養(yǎng)末梢血單核細(xì)胞。添加rhM-CSF使最終濃度為 25ng/ml。結(jié)果，利用 cell-titer Glo (Promega 公司) 將培養(yǎng)第二周的活細(xì)胞數(shù)定量化，作為熒光素酶活性。即，使用GMl、GDla、GTlb及它們的混合物進(jìn)行培養(yǎng)，均顯示出相同程度的強(qiáng)干細(xì)胞誘導(dǎo)活性(圖幻。另外，也未觀察到細(xì)胞形態(tài)上的差異(照片表示培養(yǎng)第二周)(圖4)。圖3的泳道構(gòu)成如下所述(濃度以最終濃度(以下以“FC”表示)表示)。1 :GM1 (FC :25ng/ml)、2 :GDla(FC :25ng/ml)、3 :GTlb FC :25ng/ml)、4 :GM1, GDla, GTlb 的等量混合物(Mix)、共計(jì)的 FC :25ng/ml)、5:只有 M-CSF、
15
6:只有血清。各種來自植物的提取物的干細(xì)胞誘導(dǎo)活性從蓮藕、銳葉牽牛的莖的提取均采用與上述甘薯的莖相同的條件進(jìn)行。需要說明的是，活性的比較以提取中使用的干燥重量為基準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。比活度是以甘薯莖提取物的細(xì)胞增殖活性作為100的值。如圖5所示，確認(rèn)了從蓮藕、銳葉牽牛的莖提取的提取物具有相同的干細(xì)胞誘導(dǎo)活性。該有效成分的特征之一是通過R)lch的提取方法主要被提取到水相中。水溶性植物提取物可以通過若干種柱色譜法進(jìn)行分餾、分離或純化。即，水溶性植物提取物的有效成分的特征在于，在廣范圍的PH范圍內(nèi)結(jié)合到陰離子交換樹脂⑴-瓊脂糖凝膠、DEAE-瓊脂糖凝膠等)、外源凝集素結(jié)合樹脂(Con A等)上。圖6表示將提取液涂到與有效成分具有結(jié)合能力的樹脂上，評價(jià)流過級分 (flow-through fractions)的活性的結(jié)果。結(jié)果顯示，由于有效成分結(jié)合到陰離子交換樹脂、Con A瓊脂糖上，所以流過級分活性消失。結(jié)果也表明通過陽離子交換樹脂消除阻礙因子，因此活性上升。以甘薯莖提取物的活性作為100進(jìn)行計(jì)算。流過陽離子交換樹脂的級分的活性上升表明阻礙物質(zhì)被除去。流過陰離子交換樹脂、外源凝集素的Con A樹脂的級分的活性消失，表明活性因子被保持。實(shí)施例2干細(xì)胞給與動(dòng)物模型中的治愈效果(使用肝硬化模型小鼠的治療試驗(yàn)例)連續(xù)12周每周2次對實(shí)驗(yàn)用小鼠給與四氯化碳(lml/kg體重)人為地誘發(fā)肝硬化。通過尾靜脈對該肝硬化模型小鼠給與2次(在給與第1次后1周給與第二次，每1個(gè)體IXlO5細(xì)胞)本發(fā)明的來自人單核細(xì)胞的去分化干細(xì)胞(hMDDSC)，給與第2次后的1周后(首次給與后的2周)取出肝臟，利用組織切片進(jìn)行病理解析和生化學(xué)分析。有報(bào)道指出由四氯化碳誘導(dǎo)的肝炎中，與病毒性肝炎相同，在炎癥部位SDFl (質(zhì)細(xì)胞衍化因子-1)高表達(dá)(Jung et al.，2006)，由于本發(fā)明的hMDDSC高表達(dá)作為SDFl的受體的CXCR4，所以期待通過hMDDSC與CXCR4的結(jié)合，hMDDSC聚集在炎癥部位，從而達(dá)到在組織周圍的治愈效果 (Kollet et al.，2003 ；Nervi et al. ,2006) 關(guān)于可以利用血中標(biāo)記檢測的肝功能，G0T/GPT值在結(jié)束給與四氯化碳后迅速降低返回到正常值，因此在2周的治療處置后已經(jīng)基本顯示正常值，未觀察到在試驗(yàn)組間存在測量值的較大差異。但是，如下所示上述的12周的藥物處理引起了肝組織中嚴(yán)重的纖維化，成為肝硬化狀態(tài)。本發(fā)明的hMDDSC對在上述肝中生長的纖維狀組織的降低和除去顯示出明顯的效果。1.病理組織解析由取出并被固定的小鼠肝臟制備石蠟切片，利用抗膠原I抗體檢測作為纖維結(jié)構(gòu)的主成分的膠原纖維(圖7、茶褐色)。同時(shí)將細(xì)胞核染成藍(lán)色(蘇木精染色)。上行表示肝硬化誘導(dǎo)后未給與hMDDSC而給與生理鹽水的對照實(shí)驗(yàn)，下行表示靜脈給與2次hMDDSC的3個(gè)例子。通過給與hMDDSC，利用抗膠原抗體檢測的粗纖維束(上行箭頭)顯著消失。
另外，對相同的肝臟切片進(jìn)行han/Mallory染色，利用圖像解析顯微鏡 (KeyenceBZ9000)計(jì)算被染成藍(lán)色的纖維組織部分的面積(表1)。[表 1]表1.利用han/Mallory染色的纖維部分圖像解析結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種干細(xì)胞，是在(i)M-CSF及(ii)選自神經(jīng)節(jié)苷脂及水溶性植物提取物中的至少 1種存在下培養(yǎng)單核細(xì)胞，使其去分化而得到的。
2.如權(quán)利要求1所述的干細(xì)胞，其中，水溶性植物提取物的使單核細(xì)胞去分化的有效成分為糖或含糖復(fù)合物。
3.如權(quán)利要求1所述的干細(xì)胞，其中，水溶性植物提取物的使單核細(xì)胞去分化的有效成分的分子量為1000 500000。
4.如權(quán)利要求1所述的干細(xì)胞，其中，水溶性植物提取物的使單核細(xì)胞去分化的有效成分吸附在ConA柱上。
5.如權(quán)利要求1所述的干細(xì)胞，其中，水溶性植物提取物的使單核細(xì)胞去分化的有效成分吸附在陰離子交換樹脂上。
6.如權(quán)利要求1所述的干細(xì)胞，其中，水溶性植物提取物是來自植物的i^olch提取的水相級分或其純化物。
7.如權(quán)利要求1所述的干細(xì)胞，其中單核細(xì)胞為人單核細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求1 7中任一項(xiàng)所述的干細(xì)胞，其特征在于，未分化標(biāo)記Nanogjestin、 c-Kit、⑶9、0ct3/4中的至少一種被表達(dá)，且與在M-CSF單獨(dú)存在下培養(yǎng)單核細(xì)胞時(shí)所得的干細(xì)胞相比，CXCR4基因顯著地強(qiáng)表達(dá)。
9.一種干細(xì)胞，其特征在于，未分化標(biāo)記Nanog、Nestin、c-Kit、CD9、0ct3/4中的至少 1種被表達(dá)，且CXCR4基因顯著地強(qiáng)表達(dá)。
10.一種干細(xì)胞的生產(chǎn)方法，其特征在于，在(i)M-CSF及(ii)選自神經(jīng)節(jié)苷脂及水溶性植物提取物中的至少1種存在下培養(yǎng)單核細(xì)胞。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中，培養(yǎng)時(shí)間為7天 14天。
12.—種單核細(xì)胞的去分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基，含有(i)M-CSF及(ii)選自神經(jīng)節(jié)苷脂及水溶性植物提取物中的至少1種。
13.一種藥物組合物，含有權(quán)利要求1 9中任一項(xiàng)所述的干細(xì)胞作為有效成分。
14.一種細(xì)胞藥物用劑，含有權(quán)利要求1 9中任一項(xiàng)所述的干細(xì)胞作為有效成分。
15.一種去分化誘導(dǎo)劑，含有(i)M-CSF及(ii)選自神經(jīng)節(jié)苷脂及水溶性植物提取物中的至少1種作為有效成分。
16.一種與細(xì)胞、組織或器官的損傷有關(guān)的疾病的治療劑，以選自神經(jīng)節(jié)苷脂及水溶性植物提取物中的至少1種作為有效成分。
17.如權(quán)利要求16所述的治療劑，其中，所述疾病選自外傷、炎癥性疾病、骨 軟骨的損傷、循環(huán)系統(tǒng)疾病、神經(jīng)障礙、肝病及腎病、糖尿病、特應(yīng)性皮炎、GVHD。
18.如權(quán)利要求16所述的治療劑，其中，所述疾病選自外傷、胰腺炎、放射線損傷、皮肌炎、多發(fā)性肌炎、壞死性筋膜炎、慢性支氣管炎、骨折、骨質(zhì)疏松癥、骨軟骨骨折、骨軟骨炎、擴(kuò)張型心肌病、心肌梗塞、缺血性心肌病、心功能不全、心肌肥大、充血性心功能不全、再狹窄、心律不齊、動(dòng)脈粥樣硬化、血管炎、周圍神經(jīng)病變、神經(jīng)病理性疼痛、腦卒中、腦炎、腦膜炎、糖尿病性神經(jīng)病、注意缺陷障礙、自閉癥、阿爾茨海默病、帕金森病、克雅氏病、腦或脊髓外傷或缺血、肝硬化、慢性肝炎、慢性腎功能不全、腎小球腎炎、腎缺血、糖尿病、特應(yīng)性皮炎、GVHD。
19.一種細(xì)胞藥物用試劑盒，至少含有權(quán)利要求1 9中任一項(xiàng)所述的干細(xì)胞作為必要構(gòu)成成分。
20.一種產(chǎn)生去分化細(xì)胞的試劑盒，以(i)M-CSF及(ii)選自神經(jīng)節(jié)苷脂及水溶性植物提取物中的至少1種作為必要構(gòu)成成分。
21.如權(quán)利要求20所述的試劑盒，進(jìn)一步含有單核細(xì)胞作為構(gòu)成成分。
22.如權(quán)利要求1 21中任一項(xiàng)所述的干細(xì)胞、干細(xì)胞的生產(chǎn)方法、單核細(xì)胞的去分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基、細(xì)胞藥物用劑、治療劑、去分化誘導(dǎo)劑、細(xì)胞藥物用試劑盒或產(chǎn)生去分化細(xì)胞的試劑盒，其中，神經(jīng)節(jié)苷脂為選自GDla, GDlb, GD2、GD3、GMl、GM2、GM3、GTlb及GQlb中的至少1種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種干細(xì)胞，是在(i)M-CSF及(ii)選自神經(jīng)節(jié)苷脂及水溶性植物提取物中的至少1種存在下培養(yǎng)單核細(xì)胞，使其去分化而得到的。另外本發(fā)明還涉及與細(xì)胞、組織或器官的損傷有關(guān)的疾病的治療劑、細(xì)胞藥物用劑、干細(xì)胞的生產(chǎn)方法、單核細(xì)胞的去分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基、去分化誘導(dǎo)劑、細(xì)胞藥物用試劑盒或產(chǎn)生去分化細(xì)胞的試劑盒及藥物組合物。
文檔編號A61P43/00GK102245757SQ20098014697
公開日2011年11月16日 申請日期2009年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月25日
發(fā)明者佐佐木賢次郎, 大久保悌, 平野尚伸, 石山廣信 申請人:大塚制藥株式會(huì)社