專利名稱：：包含鞘磷脂的脂質(zhì)體系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及脂質(zhì)體
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：除了其他應(yīng)用之外，脂質(zhì)體作為藥物載體用于經(jīng)由多種機(jī)制進(jìn)行遞送。為此，使用了各種類型的脂質(zhì)體，包括小單層囊泡(SUV)、大單層囊泡(LUV)、多層囊泡(MLV)、多泡囊泡(MVV)、大多泡囊泡(LMVV，有時(shí)也稱為巨大多泡囊泡“GMV”)、寡層囊泡(OLV)等等。本領(lǐng)域的技術(shù)人員理解的是，LMVV與各種尺寸的具有“洋蔥樣”MLV結(jié)構(gòu)的單層囊泡稍有不同。在LMVV中，相對(duì)于脂質(zhì)的量的形成水相的水性介質(zhì)的量多于MLV中的情況，這可能使更多量的藥物裝載入水相中，即與尺寸分布類似的MLV系統(tǒng)相比具有更高的藥物/脂質(zhì)摩爾比。該差異已由Grant等，2004[Anesthesiology101(1)133-7，2004]和美國(guó)專利6，162，462例證。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)MLV與LMVV的結(jié)構(gòu)差異不僅能夠使更多量的藥物裝載入脂質(zhì)體中，而且延長(zhǎng)了藥物從LMVV系統(tǒng)的釋放。具體而言，美國(guó)專利6，162，462公開了脂質(zhì)體布比卡因組合物，其中布比卡因通過(guò)跨膜硫酸銨梯度裝入，所述脂質(zhì)體是巨大多泡囊泡(GMV，LMVV的異名)，在所述脂質(zhì)體組合物中包封的藥物與脂質(zhì)的摩爾比為至少1.0。US6，162，462的脂質(zhì)體中包封的具體藥物是兩親性止痛藥布比卡因(BUP)。這些裝載了布比卡因的LMVV顯示出對(duì)小鼠和人提供了優(yōu)異的鎮(zhèn)痛作用[Grantetal.2004和US6，162，462，同上]。然而，利用這些LMVV仍未解決的現(xiàn)象在于在4°C或室溫保存期間從LMVV泄露布比卡因。因此，一段時(shí)間之后，系統(tǒng)中包含游離藥物(其量高于藥物MTD)，施用包含該游離藥物的脂質(zhì)體系統(tǒng)可能導(dǎo)致毒性和有害的副作用(源自與高含量的游離藥物接觸)、不利的藥物代謝動(dòng)力學(xué)和較短的治療效果持續(xù)時(shí)間。因此，本領(lǐng)域需要提供一種能夠減少或防止在保存期間藥物自包封該藥物的脂質(zhì)體泄露的系統(tǒng)。
發(fā)明內(nèi)容本公開基于以下發(fā)現(xiàn)如果脂質(zhì)體膜包含鞘磷脂，而且LMVV位于與脂質(zhì)體內(nèi)水性介質(zhì)處于等滲平衡的水性介質(zhì)中，則裝載有大量?jī)捎H性藥物(布比卡因，BUP)的大多泡囊泡(LMVV)在減少BUP泄露方面能夠得到穩(wěn)定。因此，本公開根據(jù)其第一方面提供一種脂質(zhì)體系統(tǒng)，所述脂質(zhì)體系統(tǒng)包括水性介質(zhì)，在所述水性介質(zhì)中分散有脂質(zhì)體，所述脂質(zhì)體在其脂質(zhì)體內(nèi)水性區(qū)室中包封至少一種活性劑，所述水性介質(zhì)與所述脂質(zhì)體內(nèi)水性區(qū)室處于等滲平衡，所述脂質(zhì)體具有包含形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)的膜，所述形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)中的至少一種是鞘磷脂(SPM)，所述脂質(zhì)體系統(tǒng)相比于不含SPM的同種脂質(zhì)體(S卩，形成脂質(zhì)體的膜中不含SPM)具有更大的穩(wěn)定性。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述脂質(zhì)體系統(tǒng)在長(zhǎng)期保存期間穩(wěn)定，所述穩(wěn)定性的特征在于在所述保存之后所述水性介質(zhì)中存在不超過(guò)30%的所述至少一種活性劑。本公開根據(jù)其第二方面還提供一種保存脂質(zhì)體的方法，所述脂質(zhì)體在其脂質(zhì)體內(nèi)水性區(qū)室中包封至少一種活性劑，所述脂質(zhì)體具有包含形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)的膜，至少一種形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)是鞘磷脂(SPM)，所述方法包括形成脂質(zhì)體系統(tǒng)，在所述脂質(zhì)體系統(tǒng)中所述脂質(zhì)體分散在與所述脂質(zhì)體的脂質(zhì)體內(nèi)水性區(qū)室處于等滲平衡的水性介質(zhì)中；和保存所述脂質(zhì)體系統(tǒng)，所述脂質(zhì)體系統(tǒng)相比于不含SPM的同種脂質(zhì)體具有更大的穩(wěn)定性。本公開的一些方面還提供本文中所定義的脂質(zhì)體系統(tǒng)用于制備藥物或診斷組合物的應(yīng)用；以及所定義的脂質(zhì)體系統(tǒng)用于醫(yī)療狀況的治療或用于醫(yī)療狀況的診斷。此外，本公開的一個(gè)方面提供一種藥物或診斷組合物，所述藥物或診斷組合物包含本文中所定義的脂質(zhì)體系統(tǒng)和至少一種生理上可接受的載體。進(jìn)而本公開提供一種用于治療或診斷醫(yī)療狀況的方法，所述方法包括向?qū)ο笫┯靡欢康谋疚闹兴x的脂質(zhì)體系統(tǒng)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述活性劑是兩親性化合物，通過(guò)主動(dòng)裝載(remoteloading)技術(shù)裝載入脂質(zhì)體中；SPM是合成或半合成的C16或C18SPM，所述脂質(zhì)體是大多泡囊泡(LMVV)。本公開的具體脂質(zhì)體系統(tǒng)包括由至少氫化大豆卵磷脂(HSPC)、C16SPM、膽固醇和包封的BUP的組合形成的LMVV。為理解本發(fā)明并領(lǐng)會(huì)如何實(shí)際實(shí)施本發(fā)明，現(xiàn)將通過(guò)僅非限制性實(shí)例的方式，參照如下附圖對(duì)實(shí)施方式進(jìn)行說(shuō)明，附圖中圖IAIB是顯示在4°C(圖1A)或37°C(圖1B)保存期間，布比卡因(BUP)從具有不同脂質(zhì)組成(設(shè)定各自的BUP與磷脂的摩爾比)的大多泡囊泡(LMVV)中釋放的圖示，所述大多泡囊泡利用通過(guò)跨膜硫酸銨(AQ梯度驅(qū)動(dòng)的主動(dòng)裝載而已經(jīng)裝載入BUP。圖2A2B是顯示在4°C(圖2A)或37°C(圖2B)保存期間，布比卡因(BUP)從具有不同脂質(zhì)組成(設(shè)定各自的BUP與磷脂的摩爾比)的大多泡囊泡(LMVV)中釋放的圖示，所述大多泡囊泡利用通過(guò)跨膜醋酸鈣(CA)梯度驅(qū)動(dòng)的主動(dòng)裝載而已經(jīng)裝載入BUP。圖3A;3B是顯示在4°C(圖3A)或37°C(圖3B)保存期間，布比卡因(BUP)從具有不同脂質(zhì)組成(HSPC/CH0L6/4摩爾比；HSPC/C16SPM/CH0L3/3/4摩爾比；和HSPC100/CHOL6/4摩爾比，設(shè)定各組成的BUP與磷脂的摩爾比)的LMVV中釋放的圖示，所述LMVV使用被動(dòng)裝載法已經(jīng)裝載入BUP。圖4A4C是顯示使用表8中標(biāo)示為制劑18的各脂質(zhì)體系統(tǒng)(在附圖中用對(duì)應(yīng)的制劑編號(hào)“X”標(biāo)示為“l(fā)ipX”)的小鼠鎮(zhèn)痛作用的持續(xù)時(shí)間的圖示，圖4A顯示脂質(zhì)體BUP或其游離態(tài)的注射體積的效果，BUP的量為恒定的6mg/小鼠；圖4B顯示5種不同的LMVV制劑的效果，BUP的量為恒定的3mg；圖4C描述八種不同的LMVV制劑(表8)在^ig/小鼠的劑量時(shí)的對(duì)比。圖5A5F是比較表8中標(biāo)示的5種不同的LMVV制劑(圖5A5E中的“l(fā)ipχ”)的兩種不同劑量的BUPCMg/小鼠和6mg/小鼠)，以及兩種不同量(0.375mg/小鼠和0.75mg/小鼠)的非包封(游離)的BUP(圖5F中)的鎮(zhèn)痛作用持續(xù)時(shí)間的圖示；圖5A比較lip2(3mgBUP/小鼠和6mgBUP/小鼠)的效果，圖5B比較lip3(3mgBUP/小鼠和6mgBUP/小鼠)的效果，圖5C比較lip4CBmgBUP/小鼠和4.5mgBUP/小鼠)的效果，圖5D比較lip5(3mgBUP和6mgBUP)的效果，圖5E比較lip8(3mgBUP/小鼠和6mgBUP/小鼠)的效果，圖5F比較使用兩種體積(150μ1和300μ1)在0.375mg/小鼠時(shí)和使用150μ1體積在0.75mg/小鼠時(shí)的游離(非脂質(zhì)體)BUP的效果。圖6是顯示包含HSPCC16SPM膽固醇[3/3/4]3mgBUP的LMVV禾口Grantetal.2004描述的LMVV以及游離的BUP0.75mg/小鼠(最大耐受劑量，MTD)在20小時(shí)之后的體內(nèi)鎮(zhèn)痛作用的圖示。圖7是顯示包含HSPCC16SPM膽固醇[3/3/4]3mgBUP-LMVV的LMVV和游離的BUP0.75mg/小鼠(最大耐受劑量，MTD)在40小時(shí)之后的體內(nèi)鎮(zhèn)痛作用的圖示.圖8A8E是比較當(dāng)保存在各種保存介質(zhì)(鹽水、0.5%BUP或2.0%BUP)中時(shí)按原樣經(jīng)由AS跨膜裝載有布比卡因的HSPC100/C16SPM/CH0L(3/3/4摩爾比)LMVV在4°C于標(biāo)示的保存時(shí)間期間的游離布比卡因的水平的變化(以保存介質(zhì)中的％表示)的圖示。具體實(shí)施例方式本公開基于以下理解諸如US6，162，462和Grantetal.(Grantetal.2004，同上)中描述的那些等現(xiàn)有的布比卡因脂質(zhì)體制劑在低溫下進(jìn)行長(zhǎng)期保存期間存在泄漏的趨勢(shì)，這可能在給需要該藥物的對(duì)象進(jìn)行施用時(shí)導(dǎo)致中毒的風(fēng)險(xiǎn)。這些布比卡因脂質(zhì)體制劑在大多泡囊泡(LMVV，在US6，162,462中稱為巨大多泡囊泡，GMV)中包含的藥物/磷脂比很高(>0.5摩爾/摩爾)，但是在保存之后，發(fā)現(xiàn)大量的先前包封的藥物存在于外部介質(zhì)中。因此，設(shè)計(jì)了一種新型的脂質(zhì)體系統(tǒng)，在這種脂質(zhì)體系統(tǒng)中，與迄今為止現(xiàn)有的布比卡因脂質(zhì)體制劑相比，在脂質(zhì)體外部的介質(zhì)中的游離布比卡因的量在4°C進(jìn)行長(zhǎng)期保存后明顯減少。還發(fā)現(xiàn)，盡管所述脂質(zhì)體系統(tǒng)在4°C保存期間是穩(wěn)定的，但在生理?xiàng)l件下(即，在37°C時(shí))，布比卡因以可控的持久的速率從脂質(zhì)體中釋放從而獲得長(zhǎng)期(持久的)鎮(zhèn)痛作用。具體而言，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在脂質(zhì)體雙層中包含用于形成脂質(zhì)體雙層的全部磷脂的至多75%的量或全部脂質(zhì)(包含約33摩爾％的膽固醇)的50%的量的鞘磷脂的脂質(zhì)體減少了泄漏量，而且沒(méi)有損害布比卡因在37°C從脂質(zhì)體中的釋放率并且沒(méi)有損害藥物在脂質(zhì)體中的高裝載。因此，根據(jù)本公開的第一方面，本公開提供一種脂質(zhì)體系統(tǒng)，所述脂質(zhì)體系統(tǒng)包括水性介質(zhì)，在所述水性介質(zhì)中分散有脂質(zhì)體，所述脂質(zhì)體在其脂質(zhì)體內(nèi)水性區(qū)室中包封至少一種活性劑，所述水性介質(zhì)與所述脂質(zhì)體內(nèi)水性區(qū)室處于等滲平衡，所述脂質(zhì)體具有包含形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)的膜，所述形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)中的至少一種是鞘磷脂(SPM)，所述脂質(zhì)體系統(tǒng)是穩(wěn)定的。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，包含SPM的脂質(zhì)體的穩(wěn)定性明顯高于在其脂質(zhì)膜中不含SPM的脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。脂質(zhì)體系統(tǒng)的穩(wěn)定性也根據(jù)長(zhǎng)期保存性確定，所述穩(wěn)定性的特征在于在所述保存之后所述水性介質(zhì)中存在不超過(guò)30%，有時(shí)不超過(guò)20%，甚至不超過(guò)10%的所述系統(tǒng)的所述至少一種活性劑。正如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“脂質(zhì)體系統(tǒng)”表示包含形成至少一種脂質(zhì)體并封住至少一個(gè)脂質(zhì)體內(nèi)水性區(qū)室的有組織集合的脂質(zhì)的系統(tǒng)。除了脂質(zhì)體之外，所述系統(tǒng)還包含其中分散或懸浮所述脂質(zhì)體的水性介質(zhì)。所述水性介質(zhì)是具有所期望的滲透壓摩爾濃度和離子濃度的任何水基緩沖液，應(yīng)當(dāng)理解為包括各種生理上可接受的緩沖液。緩沖系統(tǒng)通常是弱酸及其可溶性鹽的混合物，如檸檬酸鈉/檸檬酸；或二元酸的單陽(yáng)離子或雙陽(yáng)離子鹽，如酒石酸氫鉀；酒石酸氫鈉、磷酸/磷酸二氫鉀和磷酸/磷酸氫二鈉。弱酸緩沖液是具有47的恒定的pH值的緩沖溶液，弱堿緩沖液是具有710的恒定的pH值的緩沖溶液?？捎糜谥圃毂竟_的水性介質(zhì)的緩沖液的一些非限制性實(shí)例包括生理鹽水(0.9%NaCl)、磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、蔗糖緩沖液、組氨酸緩沖液等，PH設(shè)定在約48，或5.57(如通常用于脂質(zhì)體藥物遞送系統(tǒng))。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述水性介質(zhì)包含一定量的游離活性劑，水性介質(zhì)中存在所述游離活性劑可實(shí)現(xiàn)或參與形成所述等滲平衡。游離活性劑的量確定為以致形成所述等滲平衡。如本文中的實(shí)例所示，水性介質(zhì)中游離試劑的存在也減少了試劑從脂質(zhì)體中的泄露(這比得上水性介質(zhì)中不含游離藥物的相同制劑)。在水性介質(zhì)中分散有脂質(zhì)體。術(shù)語(yǔ)“分散”用于表示脂質(zhì)體在水性介質(zhì)中的分布或懸浮。正如所知的，脂質(zhì)體由以下討論的包含形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)的脂質(zhì)雙層和水性脂質(zhì)體內(nèi)核心構(gòu)成。根據(jù)本公開，脂質(zhì)體外部的水性介質(zhì)和脂質(zhì)體內(nèi)水性區(qū)室處于等滲平衡。所述等滲平衡應(yīng)當(dāng)理解為意指水性介質(zhì)與脂質(zhì)體內(nèi)水性區(qū)室的介質(zhì)具有相似的滲透壓摩爾濃度，相似性定義為滲透壓摩爾濃度差不超過(guò)50m0Smole。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，所述水性介質(zhì)和所述脂質(zhì)體內(nèi)水相的滲透壓摩爾濃度為約50m0sm/kg約600m0sm/kg，或甚至為約250m0sm/kg約550m0sm/kg。等滲平衡可通過(guò)用具有與脂質(zhì)體內(nèi)水性區(qū)室相似的滲透壓摩爾濃度的緩沖溶液洗滌包封活性劑的脂質(zhì)體獲得。具體而言，一旦活性劑裝載入脂質(zhì)體中，未被包封的試劑可由選擇的緩沖溶液洗去。脂質(zhì)體的膜是雙層膜，可制備為包含各種生理上可接受的形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)。正如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)”用來(lái)主要表示甘油磷脂和鞘磷脂。甘油磷脂具有甘油骨架，其中，首基處的至少一個(gè)、優(yōu)選兩個(gè)羥基被?；⑼榛蛳┗?、磷酸酯基團(tuán)的一種或兩種、或以上基團(tuán)的任何組合和/或以上基團(tuán)的衍生物取代，并且可以在首基處包含化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)(例如胺、酸、酯、醛或醇)，由此使脂質(zhì)具有極性首基。鞘磷脂由1位上連接有磷酰膽堿部分的神經(jīng)酰胺單元構(gòu)成，因而實(shí)際上為N-酰基鞘氨醇。鞘磷脂中的磷酰膽堿部分構(gòu)成鞘磷脂的極性首基。在形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)中，?；湹拈L(zhǎng)度通常為14約M個(gè)碳原子，并具有為完全氫化、部分氫化或非氫化脂質(zhì)的不同的飽和度。此外，脂質(zhì)基質(zhì)可以是天然來(lái)源的、半合成的或者全合成的脂質(zhì)，并且可以是電中性的、帶負(fù)電的或帶正電的。形成脂質(zhì)體的甘油磷脂的實(shí)例包括但不限于甘油磷脂、磷脂酰甘油(PG)，包括二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)；磷脂酰膽堿(PC)，包括蛋黃磷脂酰膽堿、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(DMPC)U-棕櫚酰-2-油酰磷脂酰膽堿(POPC)、氫化大豆磷脂酰膽堿(HSPC)、二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)；磷脂酸(PA)、磷脂酰肌醇(PI)和磷脂酰絲氨酸(PS)。正如所知的，形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)還可以包括陽(yáng)離子脂質(zhì)(單陽(yáng)離子或多陽(yáng)離子脂質(zhì))。陽(yáng)離子脂質(zhì)通常由親脂性部分構(gòu)成，例如固醇或同一甘油骨架，兩個(gè)?；騼蓚€(gè)烷基，或者一個(gè)?；鸵粋€(gè)烷基鏈向其貢獻(xiàn)兩親性分子的疏水區(qū)域，由此形成具有整體上的凈正電荷的脂質(zhì)。優(yōu)選的是，脂質(zhì)的首基帶正電。單陽(yáng)離子脂質(zhì)例如可包括1，2-二肉豆蔻酰-3-三甲基銨丙烷(DMTAP)、1，2-二油烯氧基-3-(三甲基氨基)丙烷(D0TAP)、N-[l-(2，3-二(十四烷氧基))丙基]_N，N-二甲基-N-羥乙基溴化銨(DMRIE)、N-[1-(2，3-二油烯氧基)丙基]-N，N-二甲基-N-羥乙基-溴化銨(DORIE)、N-[l-(2，3-二油烯氧基)丙基]-N，N,N-三甲基氯化銨(DOTMA)、3β[N-(N'，N'-二甲基氨基乙烷)氨基甲?；鵠膽固醇(DC-Chol)和二甲基-二(十八烷基)溴化銨(DDAB)。多陽(yáng)離子脂質(zhì)可包括與單陽(yáng)離子脂質(zhì)相似的親脂性部分，其上連接精胺或亞精胺。這些包括但不局限于N-[2-[[2，5-雙(3-氨丙基)氨基]-1-氧戊基]氨基]乙基]-N，N-二甲基-2，3-雙[(1-氧-9-十八碳烯基)氧基]-1-丙銨(DOSPA)和神經(jīng)酰胺氨基甲?；?CCS)。陽(yáng)離子脂質(zhì)可形成衍生的磷脂的一部分，例如，中性脂質(zhì)二油?；字Ｒ掖及?DOPE)與聚賴氨酸衍生，從而形成陽(yáng)離子脂質(zhì)聚合物。根據(jù)本公開，形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)至少包括鞘磷脂。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“鞘磷脂”或“SPM”表示與磷酰膽堿基團(tuán)結(jié)合的任何N-?；拾贝?，所述磷酰膽堿基團(tuán)形成鞘磷脂的極性首基(N-酰基鞘氨醇磷酰膽堿)。與鞘氨醇的伯氨基連接的酰基鏈可以是飽和的或不飽和的，支化的或不支化的。在一個(gè)實(shí)施方式中，?；湴?2M個(gè)碳原子(C12C24)，有時(shí)為1420個(gè)碳原子。在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，SPM是C16:0或C18:0鞘磷脂，S卩，飽和的C16或C18SPM。SPM優(yōu)選是合成的或半合成的SPM，即，天然的SPM的衍生物，并且可包括天然的D-赤式(2S，3R)異構(gòu)體和非天然的L-蘇式(2S，3S)異構(gòu)體，不過(guò)前者(也就是天然的異構(gòu)體)是優(yōu)選的。另外，在本公開的情況下，鞘磷脂也用于表示對(duì)應(yīng)的二氫物種，S卩，與本文中如上限定的SPM對(duì)應(yīng)的任何二氫鞘磷脂(DHSM)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述脂質(zhì)體系統(tǒng)包含的脂質(zhì)體膜中的SPM的含量為所述膜中的全部磷脂(形成脂質(zhì)體的脂質(zhì))的25摩爾％75摩爾％，或在包含膽固醇時(shí)為全部脂質(zhì)的約50摩爾％。在另一個(gè)實(shí)施方式中，除SPM之外的所述形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)與所述SPM的摩爾比為1121，與本公開使用的SPM無(wú)關(guān)。通常，形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)在組裝為脂質(zhì)體膜時(shí)具有的固體有序相(SO)到液體無(wú)序相(LD)的相變溫度具有限定*Tm>37°C的特征溫度。Tm是SO至LD相變溫度范圍內(nèi)相變的熱容量發(fā)生最大變化時(shí)的溫度。令人感興趣的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)而且如下所示，固體有序相到液體無(wú)序相的Tm為約53°C的HSPC與Tm為約41.4°C的C16SPM的組合令人意外地形成了穩(wěn)定的脂質(zhì)體系統(tǒng)，也就是說(shuō)，與缺少C16SPM的脂質(zhì)體系統(tǒng)相比，4°C保存期間的藥物泄露減少，缺少C16SPM的脂質(zhì)體系統(tǒng)欠穩(wěn)定，S卩，在4°C保存(S卩，相同的保存條件)期間顯示更高的藥物泄露速率。在本公開的上下文中，術(shù)語(yǔ)“穩(wěn)定性”用來(lái)表示，得到的脂質(zhì)體與然而不含SPM的同種脂質(zhì)體(即，脂質(zhì)體膜不包含SPM作為形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)的一部分)相比更為穩(wěn)定(在保存期間或保存后較少的試劑從脂質(zhì)體中泄露，泄露差在統(tǒng)計(jì)上顯著)。所述穩(wěn)定性也可以定義為裝載藥物的脂質(zhì)體在4°C保存至少3個(gè)月的時(shí)間時(shí)不會(huì)發(fā)生化學(xué)和物理變化。所述穩(wěn)定性例如通過(guò)測(cè)定存在于或釋放(泄露)至脂質(zhì)體外水性介質(zhì)的游離活性劑(即未包封的活性劑)的量而確定，表示穩(wěn)定性的該量小于脂質(zhì)體系統(tǒng)內(nèi)的活性劑的總量(總量包括包封的和未包封的試劑)的30%、20%、有時(shí)甚至小于10%。令人驚訝的是，本文中呈現(xiàn)的結(jié)果表明，當(dāng)對(duì)脂質(zhì)體制劑(例如包含HSPC和膽固醇)比較包封的試劑從同種制劑中的泄漏量時(shí)，若脂質(zhì)膜中含有SPM，試劑的泄露減少。所述脂質(zhì)體還可以包含通常用于形成脂質(zhì)體的其他脂質(zhì)，例如，用于穩(wěn)定化，用于影響表面電荷、膜的流動(dòng)性和/或輔助將活性劑裝載入脂質(zhì)體中。該脂質(zhì)的實(shí)例可包括固醇，如膽固醇、膽固醇半琥珀酸酯、膽固醇硫酸酯或膽固醇的任何其他的衍生物。脂質(zhì)體還可包含脂質(zhì)聚合物。術(shù)語(yǔ)“脂質(zhì)聚合物”本文中用于表示在其極性首基處由親水性聚合物修飾的脂質(zhì)物質(zhì)。脂質(zhì)聚合物的聚合物首基通常是水溶性的，并且與疏水的脂質(zhì)區(qū)域共價(jià)或非共價(jià)連接。通常，親水性聚合物具有的分子量等于或高于750Da，可以是極性的或非極性的。諸如根據(jù)本公開可以使用的那些等脂質(zhì)聚合物已知對(duì)于形成長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體是有效的。有大量的可以連接到脂質(zhì)上形成脂質(zhì)聚合物的聚合物，例如但不限于聚乙二醇(PEG)、聚唾液酸、聚乳酸(也稱為聚丙交酯)、聚羥基乙酸(也稱為聚乙交酯)、聚乳酸-聚羥基乙酸、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羥乙基噁唑啉、聚羥丙基噁唑啉、聚天冬酰胺、聚羥丙基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚乙烯基甲基醚、聚丙烯酸羥乙基酯、諸如羥甲基纖維素或羥乙基纖維素等衍生纖維素。這些聚合物可以以均聚物或嵌段共聚物或無(wú)規(guī)共聚物的形式使用。衍生為脂質(zhì)聚合物的脂質(zhì)可以是中性、帶負(fù)電以及帶正電的。最常使用的市售的可衍生為脂質(zhì)聚合物的脂質(zhì)是基于磷脂酰乙醇胺(PE)、通常為二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)的那些脂質(zhì)?？筛鶕?jù)本公開使用的一族具體的脂質(zhì)聚合物是連接至DSPE的單甲基化PEG(具有不同長(zhǎng)度的PEG鏈)，其中所述PEG聚合物通過(guò)氨基甲酸酯鍵與脂質(zhì)相連而形成帶負(fù)電的脂質(zhì)聚合物，或中性的甲基聚乙二醇二硬脂酰甘油(mPEG-DSG)和中性的甲基聚乙二醇羥羰基-3-氨基-1，2-丙二醇二硬脂酰酯(mPEG-DS)[Garbuzenko0.等，Langmuir.212560-2568(2005)]。另外的脂質(zhì)聚合物是磷脂酸PEG(PA-PEG)。所述PEG部分的首基的分子量為約750Da約20，OOODa，有時(shí)為約750Da約12，OOODa，通常為約1，OOODa約5，OOODa0脂質(zhì)體中通常采用的一種具體的PEG-DSPE是其中PEG具有2000Da分子量的PEG-DSPE，在本文中稱為2_PEG_DSPE或者2kPEG_DSPE。脂質(zhì)體系統(tǒng)的脂質(zhì)包封至少一種活性劑。包封包括在脂質(zhì)體內(nèi)相中俘獲/封入至少一種活性劑。俘獲是非共價(jià)的俘獲，即，在脂質(zhì)體水相中，活性劑游離地分散而且在適宜的條件下可從脂質(zhì)體中以可控的方式釋放。所述活性劑可以是小分子量的化合物以及聚合物(例如，肽、蛋白質(zhì)、核酸序列等)。術(shù)語(yǔ)“活性劑”用于表示包封的試劑一旦施用則具有有益的效果，例如，作為治療劑，作為造影劑(例如，放射性核素染料或與載體配合的染料、發(fā)色團(tuán)或熒光團(tuán)生成劑等)、作為保健用化合物等。所述活性劑可以是水溶性的、親水性化合物以及兩親性化合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述活性劑是兩親性化合物。術(shù)語(yǔ)“兩親性化合物”用來(lái)表示同時(shí)具有親水性和親脂性的活性劑。有各種本領(lǐng)域中已知的具有生物活性的兩親性化合物。一個(gè)實(shí)例包括抗癌化合物阿霉素。將阿霉素(例如D0XIL)裝載入預(yù)制的脂質(zhì)體中通過(guò)跨膜硫酸銨梯度驅(qū)動(dòng)(美國(guó)5，192,549,US5，316，771和Haran等[HaranG，etal.(1993)Transmembraneammoniumsulfategradientsinliposomesproduceefficientandstableentrapmentofamphipathicweakbases.BiochimBiophysActa.1151(2)201-15]。在一個(gè)其他的實(shí)施方式中，兩親性活性劑是止痛藥。所述止痛藥通常用于局部止痛。一組非限制性的止痛藥選自由苯坐卡因、氯普魯卡因、可卡因、環(huán)美卡因、二甲卡因、丙氧卡因、普魯卡因、丙美卡因、丁卡因、阿替卡因、布比卡因、卡鐵卡因、辛可卡因、依替卡因、左布比卡因、利多卡因、甲哌卡因、哌羅卡因、丙胺卡因、羅哌卡因、三甲卡因、蛤蛘毒素和河豚毒素組成的組。一組優(yōu)選的止痛藥包括但不限于布比卡因、利多卡因、羅哌卡因、左布比卡因、普魯卡因、氯普魯卡因、苯坐卡因、依替卡因、甲哌卡因、丙胺卡因、ciprocaine、丁卡因、地布卡因、庚卡因、美索卡因、丙泮卡因、卡比唑卡因和布他卡因。本公開的具體的止痛藥是布比卡因(以下有時(shí)稱為“BUP”)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述活性劑是水溶性分子，例如肽、蛋白質(zhì)或核酸序列，例如包括細(xì)胞因子、抗體、免疫刺激寡核苷酸(ISS-ODN)、siRNA等。正如所知的，脂質(zhì)體通常可具有各種形狀和尺寸。所述脂質(zhì)體可以是多層脂質(zhì)體(MLV)或多泡囊泡(MVV)。MVV脂質(zhì)體已知具有多個(gè)非同心的緊密填裝的內(nèi)部水性腔室由脂質(zhì)膜的網(wǎng)絡(luò)分隔并包封在脂質(zhì)膜內(nèi)。在本發(fā)明的上下文下，MVV稱為大多泡囊泡(LMVV)，在本領(lǐng)域中也以術(shù)語(yǔ)巨大多泡囊泡(GMV)指代。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，脂質(zhì)體通常具有的直徑為至少200nm，一般在約200nm25μm的范圍內(nèi)，有時(shí)為約250nm25μm。當(dāng)所述脂質(zhì)體是MVV或LMVV時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解將試劑裝載入LMVV中包括使所述試劑容納在通過(guò)脂質(zhì)膜形成的多個(gè)水性區(qū)室中，并且通常還處于環(huán)繞非同心的脂質(zhì)膜的水性環(huán)境中。有時(shí)，所述試劑可以被俘獲(嵌埋)在脂質(zhì)膜中，例如，在所述活性劑是親脂性化合物的時(shí)候。本文中公開的脂質(zhì)體系統(tǒng)的特征在于具有很高的活性劑/脂質(zhì)比，即，相對(duì)于脂質(zhì)體而言活性劑的水平很高。盡管不排除其他情況，不過(guò)高裝載一般取決于使用的脂質(zhì)體的種類、它們的尺寸、裝載條件等。在一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)在高初始活性劑濃度的條件下將所述活性劑主動(dòng)裝載(見下文)入LMVV中實(shí)現(xiàn)高裝載。在本公開的上下文中，高裝載用于表示這樣的裝載在得到的脂質(zhì)體系統(tǒng)中活性劑與脂質(zhì)的比例為至少約0.5摩爾藥物/摩爾形成脂質(zhì)體的磷脂(摩爾/摩爾)的比例(這是本公開的LMVV的特性)。將活性劑裝載入脂質(zhì)體中可通過(guò)本領(lǐng)域中已知的任何技術(shù)進(jìn)行。這樣的技術(shù)通常包括將試劑被動(dòng)裝載或主動(dòng)(“remoteloading")裝載入脂質(zhì)體中。將試劑包封入脂質(zhì)體中的被動(dòng)裝載技術(shù)通常涉及在制備脂質(zhì)體的過(guò)程中裝載試劑，例如，用活性劑的溶液使干燥的形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)水合。利用被動(dòng)裝載，試劑可以與脂質(zhì)體膜結(jié)合或包封在水性核心中。Bangham等[BanghamAD,StandishMM,WatkinsJC(1965)Diffusionofunivalentionsacrossthelamellaeofswollenphospholipids.JMoIBiol.13(1):238-52]記載了一種用于被動(dòng)裝載的方法，其中，使含有所關(guān)注的試劑的水相與沉積在反應(yīng)容器壁上的干燥的形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)的膜接觸。在機(jī)械手段攪拌下，脂質(zhì)發(fā)生溶脹，由此形成多層囊泡(MLV)。用于被動(dòng)裝載的其他方法是Szoka禾口Papahadjopoulos[SzokaF.C.Jr5PapahadjopoulosD.(1978)Procedureforpreparationofliposomeswithlargeinternalaqueousspaceandhighcapturebyreverse-phaseevaporation.ProcNatlAcadSciUSA.75(9):4194-8.]描述的反相蒸發(fā)(REV)法，根據(jù)該方法，將脂質(zhì)在水不溶性有機(jī)溶劑中的溶液在水性載體相中乳化，隨后在減壓下除去有機(jī)溶劑。被動(dòng)裝載的其他方法包括使脂質(zhì)體進(jìn)行連續(xù)的脫水和再水合處理，或冷凍和解凍。脫水通過(guò)蒸發(fā)或凍干進(jìn)行[KirbyCandGregoriadisG(1984)Dehydration-RehydrationVesicles:ASimpleMethodforHighYieldDrugEntrapmentinLiposomes.Nat.Biotechnol.2，979-984]，或者使通過(guò)在水溶液中進(jìn)行超聲波處理而制備的脂質(zhì)體與待包封的溶質(zhì)混合，然后將混合物在氮?dú)庀略谛D(zhuǎn)燒瓶中干燥。再水合時(shí)，制得大脂質(zhì)體，其中包封了大部分的溶質(zhì)[ShewRL,DeamerDff.(1985)Anovelmethodforencapsulationofmacromoleculesinliposomes.BiochimBiophysActa.816(1):1_8]0裝載還可以通過(guò)使活性劑與干燥的形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)共同凍干而改善[國(guó)際專利申請(qǐng)公報(bào)W003000227]。也可使用主動(dòng)裝載技術(shù)。例如，利用離子梯度或PH梯度作為預(yù)制的脂質(zhì)體裝載驅(qū)動(dòng)力來(lái)裝載脂質(zhì)體。利用PH梯度的裝載可以根據(jù)美國(guó)專利5，616，341、5，736，155和5，785，987、美國(guó)5，192，549、美國(guó)5，316，771和Haran等[HaranG,etal.(1993)Transmembraneammoniumsulfategradientsinliposomesproduceefficientandstableentrapmentofamphipathicweakbases.BiochimBiophysActa.1151(2)201-15]中描述的方法進(jìn)行，以引用的方式并入本文中。PH梯度可以是基于檸檬酸鈣的梯度或基于硫酸銨的梯度。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，脂質(zhì)體具有多層囊泡(MLV)或多泡囊泡(MVV)的形式，優(yōu)選大多泡囊泡(LMVV)。本公開還提供一種如上所限定的脂質(zhì)體的保存方法，S卩，在脂質(zhì)體內(nèi)水性區(qū)室中包封至少一種活性劑，所述脂質(zhì)體具有包含形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)的膜，至少一種形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)是鞘磷脂(SPM)，所述方法包括形成脂質(zhì)體系統(tǒng)，在所述脂質(zhì)體系統(tǒng)中所述脂質(zhì)體分散在與所述脂質(zhì)體的脂質(zhì)體內(nèi)水性區(qū)室處于等滲平衡的水性介質(zhì)中；和保存所述脂質(zhì)體系統(tǒng)，由此在所述保存之后所述水性介質(zhì)中存在不超過(guò)30%，有時(shí)不超過(guò)20%，甚至不超過(guò)10%的所述至少一種活性劑。所述方法可實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期穩(wěn)定的保存(在低溫下，例如4°C)所述脂質(zhì)體。盡管最小的穩(wěn)定保存期是3個(gè)月，不過(guò)如將在以下非限制性實(shí)例中展示的，在4°C保存時(shí)也可以獲得4個(gè)月(120天)、4.5個(gè)月、甚至達(dá)到6個(gè)月的穩(wěn)定保存。不過(guò)，如上所示，在低于身體的生理溫度(即，低于37°C)的任何其他溫度也可以維持所述穩(wěn)定性。當(dāng)提及較低的溫度時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解合理的保存溫度應(yīng)當(dāng)為比體中心溫度低至少15°C，S卩，低于22°C。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，在約2°C8°C的溫度保存。由于在含有SPM的LMVV的保存期間活性劑的泄露較少，因而已經(jīng)發(fā)現(xiàn)不必在將脂質(zhì)體系統(tǒng)施用給需要的對(duì)象之前洗滌該脂質(zhì)體系統(tǒng)。所述脂質(zhì)體系統(tǒng)可直接施用給需要的對(duì)象，或可以與生理上可接受的添加劑組合。因此，本發(fā)明還提供如上限定的脂質(zhì)體系統(tǒng)用于制備藥物或診斷組合物的應(yīng)用，以分別用于治療醫(yī)療狀況或用于診斷的目的。除了所述脂質(zhì)體系統(tǒng)之外，組合物通常還包含至少一種生理上可接受的添加劑。此外，本發(fā)明提供一種用于治療或診斷醫(yī)療狀況的方法，所述方法包括向需要所述治療或診斷的對(duì)象施用一定量的如上限定的脂質(zhì)體系統(tǒng)或包含該脂質(zhì)體系統(tǒng)的生理上可接受的組合物。單獨(dú)的或組合了生理上可接受的添加劑的脂質(zhì)體系統(tǒng)可通過(guò)本領(lǐng)域中可接受的任何途徑施用。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，脂質(zhì)體系統(tǒng)的施用通過(guò)胃腸外注射或輸注進(jìn)行。這包括但不限于靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、肌內(nèi)、腦內(nèi)、腦室內(nèi)、心臟內(nèi)、皮下、骨內(nèi)(進(jìn)入骨髓)、皮內(nèi)、鞘內(nèi)、腹膜內(nèi)、膀胱內(nèi)、海綿體腔內(nèi)和硬腦膜外(硬膜外)注射或輸注。胃腸外施用也可包括經(jīng)皮施用(例如通過(guò)透皮貼劑)、透粘膜施用(例如，通過(guò)擴(kuò)散或注射到腹膜內(nèi))、吸入和玻璃體內(nèi)施用(通過(guò)眼睛)。當(dāng)活性劑是止痛藥時(shí)，施用的優(yōu)選模式是通過(guò)可由醫(yī)生或任何其他適合的醫(yī)師確定的任何可接受的途徑的局部施用。脂質(zhì)體系統(tǒng)的施用量以及由此的包封在其中的活性劑的量對(duì)于在目標(biāo)位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)活性劑的所期望的效果應(yīng)當(dāng)是有效的。例如，如果活性劑是藥物，則脂質(zhì)體系統(tǒng)的量應(yīng)確定為使得在目標(biāo)位點(diǎn)處包封在脂質(zhì)體系統(tǒng)中的藥物的量足以實(shí)現(xiàn)所期望的治療效果。該所期望的治療效果可包括但不限于改善與醫(yī)療狀況有關(guān)的癥狀、防止與醫(yī)療狀況有關(guān)的癥狀的顯現(xiàn)、減緩醫(yī)療狀況的進(jìn)展?fàn)顟B(tài)、增強(qiáng)好轉(zhuǎn)期的開始、防止或減緩由醫(yī)療狀況所造成的不可逆的損害、減輕醫(yī)療狀況的嚴(yán)重性、治愈醫(yī)療狀況或防止其發(fā)展等。用脂質(zhì)體系統(tǒng)治療的醫(yī)療狀況可以是任何可通過(guò)包封在本公開的脂質(zhì)體中的活性劑治療的狀況。此外，活性劑可以是診斷劑。為此，脂質(zhì)體系統(tǒng)的量應(yīng)當(dāng)使得能夠在目標(biāo)位點(diǎn)令標(biāo)記物成像。脂質(zhì)體系統(tǒng)的量將根據(jù)本領(lǐng)域中已知的那些考慮因素而確定，通常使用恰當(dāng)設(shè)計(jì)的臨床試驗(yàn)(劑量范圍研究等)來(lái)確定。本文中使用的形式“a”、“an”和“the”包括單數(shù)以及復(fù)數(shù)指代，除非上下文另有明確規(guī)定。例如，術(shù)語(yǔ)“alipsomeforminglipid”包括一種或多種能夠形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)。此外，本文中使用的術(shù)語(yǔ)“包含(包括)”意指所述脂質(zhì)體系統(tǒng)包含所列舉的成分，即，形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)、SPM和活性劑，但是并不排除其他要素，諸如生理上可接受的載體和賦形劑以及其他活性劑。術(shù)語(yǔ)“主要由……構(gòu)成”用來(lái)限定脂質(zhì)體系統(tǒng)包含所列舉的要素但是不含其他可能對(duì)脂質(zhì)體系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的效果具有重要意義的要素。“由……構(gòu)成”應(yīng)當(dāng)意味著不含超過(guò)痕量的其他要素。由這些轉(zhuǎn)換術(shù)語(yǔ)各自限定的實(shí)施方式均在本發(fā)明的范圍內(nèi)。此外，所有的數(shù)值，例如，當(dāng)提及構(gòu)成包含所列舉的要素的脂質(zhì)體系統(tǒng)的要素的量或范圍時(shí)，是由所述的值變化⑴或㈠至多20%，有時(shí)至多10%的近似值。應(yīng)當(dāng)理解的是，即使并不總是明確規(guī)定，所有的數(shù)值標(biāo)示前均可加上術(shù)語(yǔ)“約”。下面，將在以下根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行的試驗(yàn)的描述中對(duì)本發(fā)明舉例說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例旨在描述的性質(zhì)而非限制。顯然，根據(jù)以上教導(dǎo)，能夠?qū)崿F(xiàn)這些實(shí)施例的許多修改和變化。因此，應(yīng)理解的是，在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)，本發(fā)明可以以無(wú)數(shù)可能的方式另外實(shí)施，而非以下所具體描述的方式。一些非限制性實(shí)例的說(shuō)明材料藥物鹽酸布比卡因(BUP)USPXXIII(Orgamol,SA,Evionnaz,Switzerland)。甲潑尼龍琥珀酸鈉(MPS)(PHARMACIANV/SAPuurs-Belgium)。脂質(zhì)膽固醇(CHOL)(NE；SolvayPharmaceuticals(Veenedaal,Netherlands))。完全氫化的大豆卵磷脂(HSPC-100)，Phospholipon100H，批次號(hào)50190(PhospholipidsGmbHNattermannallee1*D50829KoIn，Germany)。HSPC100^99.5純度，即，包含的IysoPC和脂肪酸的量低于檢測(cè)限。完全氫化的大豆卵磷脂(HSPC)(LipoidGmbh,Ludwigshafen,Germany)。98.0純度，即，包含少于1.2%的IysoPC和約的脂肪酸。完全合成的N-棕櫚酰基-D-赤式-鞘氨醇-1-磷酰膽堿，N-棕櫚?；柿字?，(C16-SPM)>98%純度，批號(hào)546701(BiolabLtd.，POB34038Jerusalem91340)。緩沖液硫酸銨(AS，MERCK)；醋酸鈣一水合物(CA，Aldrich)；氯化鈣二水合物(MERCK)；方法裝載藥物的LMVV的制備大多泡囊泡(LMVV)的制備將具有所期望的摩爾比(關(guān)于成分及摩爾比的細(xì)節(jié)見表1)的脂質(zhì)的粉末混合物溶解在60°C65°C的乙醇中，然后添加至水溶液(硫酸銨(AQ、醋酸鈣(CA)或其他緩沖液，如下所示)中以達(dá)到最終磷脂(PL)濃度為60mM且最終乙醇濃度為10%。使得到的溶液于65°C混合30分鐘以獲得多層囊泡(MLV)。也可以使用制備MLV的替代方法(例如參見Barenholz&Crommelin,1994,In!EncyclopediaofPharmaceuticalTechnology.(Swarbrick,J.andBoylan,J.C.,Eds.),Vol.9,MarcelDekker,NY,1-39頁(yè))。使用所期望的水相(例如，硫酸銨250mM或127mM，醋酸鈣250mM或200mM，或所期望的緩沖液)由MLV制得LMVV，即，由MLV使其經(jīng)歷10個(gè)在液氮中冷凍然后在60°C的水浴中解凍的循環(huán)由此形成LMVV。在每一個(gè)循環(huán)時(shí)，將每Iml的分散的LMVV溶液在液氮中保持1分鐘。例如，3ml的分散液在液氮中保持3分鐘。梯度生成通過(guò)從脂質(zhì)體外水相除去AS或CA(分別地)并以NaCl取代，由此生成跨膜AS或CA梯度。三種方法用來(lái)生成pH梯度⑴離心法(Grantetal2004，同上)，用于AS和CA梯度，在1000g，溫度4°C，持續(xù)5分鐘。除去上清液，在4°C用鹽水洗滌球粒。洗滌過(guò)程重復(fù)7次。(ii)使用MWCO12_14000Dalton滲析管的滲析法(iii)使用具有中空纖維盒500000NMWC的Midjet臺(tái)式系統(tǒng)(GEHealthcareBio-SciencesCorp.ffestborough,MA01581USA)的滲濾法。布比卡因的裝載使用兩種替代性方法使LMVV裝載布比卡因具有跨膜硫酸銨(AQ梯度的預(yù)制脂質(zhì)體的主動(dòng)裝載(Haran等(199，BBA，1151201-215)，改進(jìn)為適應(yīng)LMVV(Grant等2004，同上)；或裝載入具有跨膜醋酸鈣(CA)梯度的預(yù)制LMVV中(Clerc&Barenholz.(1995)，BBA，1240，65-257，Avniretal(2008)Arthritis&Rheumatism，58，119-1)。該方法利用BUP與阿霉素類似是兩親性弱堿這一事實(shí)。(ii)使用BUP的水溶液通過(guò)脂質(zhì)水合進(jìn)行被動(dòng)裝載，以形成裝載BUP的MLV，由該MLV如上所述制備裝載BUP的LMVV(LMVV制備)。在兩種方法中，裝載于60°C65°C進(jìn)行，該溫度高于HSPC和C16SPM的固體有序相(so)到液體無(wú)序相(LD)的相變溫度范圍(Tm)。注意，HSPC和C16SPM是此處描述的LMW的形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)。對(duì)于主動(dòng)裝載，裝載于60°C65°C，使用處于蒸餾水中的4.5%、5.5%或5.7%的BUP(與(鹽水=0.9%重量/體積)的滲透壓摩爾濃度相當(dāng))，或6%的BUP作為脂質(zhì)體外部水相進(jìn)行30分鐘。0.5ml的量的濕LMVV球粒和2ml的BUP溶液用于主動(dòng)裝載。然后將混合物冷卻至4°C一整夜。BUP的被動(dòng)裝載通過(guò)用包含4.5%(231m0sm/kg)、或5.5%(285m0sm/kg)、或6%(301m0sm/kg)、或7%(346m0sm/kg)、或8%(373m0sm/kg)或10%(454m0sm/kg)BUP(W/V)的蒸餾水的水溶液于65°C將脂質(zhì)乙醇溶液水合30分鐘來(lái)進(jìn)行。對(duì)于該過(guò)程，使用包含225mg磷脂和77mgCHOL的0.5ml脂質(zhì)乙醇溶液。將該溶液與5ml的上述BUP水溶液中的一種混合。用10個(gè)冷凍解凍循環(huán)(如上所述)處理懸浮液，然后使其在冷室內(nèi)6°C)保持一整夜。游離藥物的除去未包封的BUP通過(guò)用鹽水洗滌(Iml脂質(zhì)體/細(xì)1鹽水)然后在IOOOg于4°C5°C將分散液離心5分鐘而從LMVV除去。洗滌過(guò)程重復(fù)7次。用于替換CA梯度裝載的脂質(zhì)體的脂質(zhì)體外部分的最終的介質(zhì)(本文中稱為“水性介質(zhì)”)是PBS。PBS的使用優(yōu)于鹽水。AS和用于脂質(zhì)體的被動(dòng)裝載的介質(zhì)被替換，LMVV用非緩沖鹽水洗滌。LMVV濃縮至2%BUP的最終溶液用于被動(dòng)裝載和AS裝載。對(duì)于CA梯度裝載，使用具有1%BUP最終濃度的LMVV，因?yàn)檫@些LMVV的體積很大。這些濃度接近用于BUP注射的最高濃度。針對(duì)在4°C保存期間BUP從脂質(zhì)體中的釋放率來(lái)測(cè)定由此形成的LMVV的穩(wěn)定性。在等滲條件下的布比卡因的裝載當(dāng)提及等滲條件時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解意指脂質(zhì)體內(nèi)水性核心和脂質(zhì)體內(nèi)外的外部介質(zhì)的滲透壓摩爾濃度基本相等或接近，均如上所限定。測(cè)試了三種滲透壓摩爾濃度(i)280m0sm/kg等滲于生理鹽水(0.9%NaCl)條件AS和CA梯度LMVV用約20mg/ml的AS或CA溶液制備，通過(guò)AS或CA溶液調(diào)節(jié)至^OmOsm/kg。BUP裝載濃度為在水中5.7%BUP，或在NaCl溶液中4.5%BUP以達(dá)到^0m0sm/kg。(ii)550m0sm/kg，等滲于250mMAS用于生成AS梯度的洗滌溶液和用于在裝載后除去游離藥物的溶液是NaCl溶液，調(diào)節(jié)至550m0sm/kg。藥物裝載濃度為在NaCl溶液中4.5%BUP，或在蔗糖溶膠中4.5%BUP以達(dá)到550m0sm/kg。(iii)650m0sm/kg，等滲于250mMCA。布比卡因與脂質(zhì)的比例使用三種類型的BUP與脂質(zhì)的體積比將BUP裝載入AS-LMVV中。(i)濕LMVV球粒5.7%BUP脂質(zhì)，14體積/體積。(ii)濕LMVV球粒5.7%BUP脂質(zhì)，12體積/體積。(iii)濕LMVV球粒5.7%BUP脂質(zhì)，11體積/體積。表1中提供了得到的LMVV的特征。表1:BUP裝載的LMVV脂質(zhì)/Chol比裝載方法平均尺寸(μm)SPM/CH0L6/4CA梯度8.33±4.71SPM/CH0L6/4AS梯度5.7±2.6HSPC/CH0L6/4被動(dòng)6.0±3.2此外，圖IA和IB比較了根據(jù)在4°C(圖1A)和37°C(圖1B)的釋放率測(cè)定的BUP-LMVV(通過(guò)類似的步驟制備，不過(guò)用H100)的裝載穩(wěn)定性。所述比較涉及的LMVV的不同脂質(zhì)組成如下(i)HSPC(LipoidGmbH的)和CHOL的先前的制劑，如美國(guó)6，162，46中描述的，其內(nèi)容以引用的方式并入本文中；(ii)HSPC-100(PhospholipidsGmbH,Germany)和CHOL；(iii)HSPC/C16SPM和CHOL；(iv)HSPC100/C16SPM和CH0L。圖IA和IB中提供的數(shù)據(jù)表明，HSPC/CH0L脂質(zhì)體在4°C保存60天期間BUP的釋放率最高，然后是HSPC100/CH0L脂質(zhì)體的釋放率。HSPC100/C16SPM/CH0L脂質(zhì)體實(shí)現(xiàn)最低的釋放率。在M小時(shí)內(nèi)，在37°C的釋放達(dá)到脂質(zhì)體的BUP的60%70%的水平-該情況下沒(méi)有達(dá)到穩(wěn)定水平。因此推斷盡管在由HSPC100/C16SPM/CH0L構(gòu)成的LMVV的情況中BUP的裝載稍有降低(較低的BUP/PL比)，但在4°C時(shí)該特定制劑的BUP的低釋放率仍然使得這一組合是優(yōu)選的制劑。此外還推斷出，與不含SPM的同種制劑相比SPM的存在減少了泄漏。檢驗(yàn)了使用不同的裝載技術(shù)、不同的活性劑(BUP或MPS，即“藥物”)和不同的水性介質(zhì)(洗滌緩沖液)的包含HSPC100/C16SPM/CH0L3/3/4(所述的SUV或者LMVV)的脂質(zhì)體的釋放率。結(jié)果顯示在表2中。圖2A禾口2的相同脂質(zhì)組成的(圖2B)從具有與圖IAIB所用？鈣梯度主動(dòng)裝載。使用的SPM是13/22頁(yè)(P寸坩)s^s^^^s-ss^sss寸§loH3/wds9io/02odsH￠6SSVSs卜πdnOQ-ΛΛΙηIsolmro9.fes制輯SVdnpq-AAm-SOMONinmS制輯SVS日卜ΠdnCQ-AAmιωοΝOSVossosrNISIAnSI-HOSvoss卜0s§_AAmO(NCOmS制輯SVSUI卜^<Ια9_ΛΛ1ΑηsetOO<ΝT-Hdns%/.o若朝SVSUIAndnpq-AAmΠσ\<Νdna%6.0芩朝SVδε卜πdns_AAmuojNO/OSA.T—ι#SVIAOAIO。das_AAm(NC\Q\(N寸+κ!Ν%卜.1輯SVSUIOadnpq-AAmdnm^朝SvssoszdnPQ-AAmΙΛ11—1τ~I輯voSUIASdnPQ-AAmSe(Ndne%9o長(zhǎng)朝V3Ss/.οdna_AAm寸寸6+6I-HI-HOOοdnCQ%rsed齡輯νοΙΛΙεοζdas_AAm9寸I-HdnPQ-AAm1OmSTCNIT-Hdna%9標(biāo)堪dnpq-AAme.9rn6.0<N卜+dnoq-AAm8+ζ.ITiT-Hχ/朝dna%s.寸涵寵dnm-AAmIT9Irs.寸lKogH<06H<9卜H<〇寸Η<εΗ<<ΝΗ<卜雪幾7蓉椒^ssC16SPM,與HSPC/SPM/CH0L和HSPC100/SPM/CH0L的比較也在4°C進(jìn)行。用于CA梯度裝載的BUP/PL比低于AS梯度裝載獲得的比例。穩(wěn)定性根據(jù)4°C的釋放評(píng)估。該比例也比于37°C通過(guò)AS梯度主動(dòng)裝載的LMVV得到的比例低(即，更高的釋放率)。所述釋放率與通過(guò)AS梯度裝載BUP的LMVV的釋放率相似，不同之處在于在第一個(gè)10小時(shí)釋放率更快，隨后幾乎達(dá)到穩(wěn)定。由圖2A明顯可知，HSPC100LMVV具有比基于HSPC的LMVV更好的穩(wěn)定性(即，在4°C的泄露較少)，而且C16SPM對(duì)于改善穩(wěn)定性的效果遠(yuǎn)大于兩種HSPC制劑間的差異。C16SPM還使兩種HSPC組合物的泄漏率降低了類似的程度。圖3A和;3B描述了與圖IA和IB所用相同的脂質(zhì)組成的BUP裝載的LMVV在4°C(圖3A)和37°C(圖:3B)的釋放率，其中LMVV被動(dòng)裝載BUP。使用的SPM是C16SPM，與HSPC/SPM/CH0L和HSPC100/SPM/CH0L的比較也在4°C進(jìn)行。通常，所用的3種脂質(zhì)組成的被動(dòng)裝載的LMVV在4°C的釋放率高于經(jīng)由CA梯度主動(dòng)裝載的釋放率，甚至與AS主動(dòng)裝載的LMVV相比也更高。不過(guò)，LMVV脂質(zhì)組成在4°C和37°C對(duì)于釋放率的影響類似于(不過(guò)在量值上更大)對(duì)通過(guò)AS和CA梯度驅(qū)動(dòng)的主動(dòng)裝載所觀察到的，因此表明離子梯度驅(qū)動(dòng)的主動(dòng)裝載增大了4°C時(shí)的裝載穩(wěn)定性。LMVV的優(yōu)化制備具有不同的HSPC100C16SPM摩爾比的各種制劑以確定這兩種成分的最優(yōu)比例。表3A和3B中提供了各種制劑。表3A利用AS梯度通過(guò)主動(dòng)裝載形成的HSPC100/C16SPM/CH0LLMVV中的HSPC100C16SPM摩爾比的影響權(quán)利要求1.一種脂質(zhì)體系統(tǒng)，所述脂質(zhì)體系統(tǒng)包括水性介質(zhì)，在所述水性介質(zhì)中分散有脂質(zhì)體，所述脂質(zhì)體在其脂質(zhì)體內(nèi)水性區(qū)室中包封至少一種活性劑，所述水性介質(zhì)與所述脂質(zhì)體內(nèi)水性區(qū)室處于等滲平衡，所述脂質(zhì)體具有包含形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)的膜，所述形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)中的至少一種是鞘磷脂(SPM)，所述脂質(zhì)體系統(tǒng)相比于不含SPM的同種脂質(zhì)體具有更大的穩(wěn)定性。2.如權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)體系統(tǒng)，所述脂質(zhì)體系統(tǒng)在長(zhǎng)期保存期間穩(wěn)定，所述穩(wěn)定性的特征在于在所述保存之后所述水性介質(zhì)中存在不超過(guò)30%的所述至少一種活性劑。3.如權(quán)利要求2所述的脂質(zhì)體系統(tǒng)，其中，在所述保存之后所述水性介質(zhì)中存在不超過(guò)10%的所述至少一種活性劑。4.如權(quán)利要求13中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體系統(tǒng)，其中，所述SPM是C12C24SPM。5.如權(quán)利要求13中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體系統(tǒng)，其中，所述SPM是C16SPM。6.如權(quán)利要求15中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體系統(tǒng)，其中，所述SPM是合成或半合成的SPM。7.如權(quán)利要求16中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體系統(tǒng)，其中，所述膜包含的SPM的量為所述膜中全部磷脂的25摩爾％75摩爾％。8.如權(quán)利要求17中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體系統(tǒng)，所述脂質(zhì)體系統(tǒng)包含的除SPM之外的所述形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)與所述SPM的摩爾比為1121。9.如權(quán)利要求18中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體系統(tǒng)，其中，所述形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)共同具有的固體有序相到液體無(wú)序相的相變溫度(Tm)高于37°C。10.如權(quán)利要求19中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體系統(tǒng)，其中，所述膜包含固醇。11.如權(quán)利要求10所述的脂質(zhì)體系統(tǒng)，其中，所述固醇是膽固醇。12.如權(quán)利要求111中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體系統(tǒng)，其中，所述脂質(zhì)體是多層囊泡(MLV)或多泡囊泡(MVV)。13.如權(quán)利要求12所述的脂質(zhì)體系統(tǒng)，其中，所述MVV是直徑為200nm25μm的大MVV(LMVV)。14.如權(quán)利要求113中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體系統(tǒng)，其中，所述水性介質(zhì)和所述脂質(zhì)體內(nèi)水性區(qū)室具有的滲透壓摩爾濃度為50m0sm/kg600m0sm/kg。15.如權(quán)利要求14所述的脂質(zhì)體系統(tǒng)，其中，所述水性介質(zhì)和所述脂質(zhì)體內(nèi)水性區(qū)室具有的滲透壓摩爾濃度為275m0sm/kg550m0sm/kg。16.如權(quán)利要求115中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體系統(tǒng)，其中，所述水性介質(zhì)和所述脂質(zhì)體內(nèi)水性區(qū)室具有的滲透壓摩爾濃度差為不超過(guò)50m0Smole。17.如權(quán)利要求116中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體系統(tǒng)，其中，所述水性介質(zhì)包含一定量的游離態(tài)的所述至少一種活性劑。18.如權(quán)利要求117中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體系統(tǒng)，其中，所述水性介質(zhì)是生理上能夠接受的介質(zhì)。19.如權(quán)利要求118中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體系統(tǒng)，其中，所述活性劑是兩親性化合物。20.如權(quán)利要求19所述的脂質(zhì)體系統(tǒng)，其中，所述兩親性化合物是止痛藥。21.如權(quán)利要求20所述的脂質(zhì)體系統(tǒng)，其中，所述止痛藥是選自由苯坐卡因、氯普魯卡因、可卡因、環(huán)美卡因、二甲卡因、丙氧卡因、普魯卡因、丙美卡因、丁卡因、阿替卡因、布比卡因、卡鐵卡因、辛可卡因、依替卡因、左布比卡因、利多卡因、甲哌卡因、哌羅卡因、丙胺卡因、羅哌卡因、三甲卡因、蛤蛘毒素和河豚毒素組成的組中的局部止痛藥。22.如權(quán)利要求21所述的脂質(zhì)體系統(tǒng)，其中，所述止痛藥選自由布比卡因、利多卡因、羅哌卡因、左布比卡因、普魯卡因、氯普魯卡因、苯坐卡因、依替卡因、甲哌卡因、丙胺卡因、ciprocaine、丁卡因、地布卡因、庚卡因、美索卡因、丙泮卡因、卡比唑卡因和布他卡因組成的組。23.如權(quán)利要求122中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體系統(tǒng)，其中，所述活性劑與所述形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)的摩爾比為高于0.5摩爾/摩爾。24.如權(quán)利要求123中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體系統(tǒng)，其中，所述長(zhǎng)期保存包括在4°C保存至少3個(gè)月的時(shí)間。25.一種保存脂質(zhì)體的方法，所述脂質(zhì)體在其脂質(zhì)體內(nèi)水性區(qū)室中包封至少一種活性劑，所述脂質(zhì)體具有包含形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)的膜，至少一種形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)是鞘磷脂(SPM)，所述方法包括形成脂質(zhì)體系統(tǒng)，在所述脂質(zhì)體系統(tǒng)中所述脂質(zhì)體分散在水性介質(zhì)中，所述水性介質(zhì)與所述脂質(zhì)體的脂質(zhì)體內(nèi)水性區(qū)室處于等滲平衡；和保存所述脂質(zhì)體系統(tǒng)，所述脂質(zhì)體系統(tǒng)相比于不含SPM的同種脂質(zhì)體具有更大的穩(wěn)定性。26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中，在所述保存之后所述水性介質(zhì)中存在不超過(guò)30%的所述至少一種活性劑。27.如權(quán)利要求沈所述的方法，其中，在所述保存之后所述水性介質(zhì)中存在不超過(guò)10%的所述至少一種活性劑。28.如權(quán)利要求2527中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法包括將所述活性劑裝載入所述脂質(zhì)體內(nèi)水性區(qū)室中，所述裝載包括主動(dòng)裝載或被動(dòng)裝載。29.如權(quán)利要求觀所述的方法，其中，所述活性劑是兩親性化合物，利用PH梯度將所述兩親性化合物主動(dòng)裝載到脂質(zhì)體的所述脂質(zhì)體內(nèi)水性區(qū)室中。30.如權(quán)利要求四所述的方法，其中，所述pH梯度是硫酸銨或醋酸鈣梯度。31.如權(quán)利要求2530中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述SPM是C12C24SPM。32.如權(quán)利要求31所述的方法，其中，所述SPM是C16SPM。33.如權(quán)利要求2532中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述SPM是合成或半合成的SPM。34.如權(quán)利要求2533中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述膜包含的SPM的量為所述膜中全部脂質(zhì)的25摩爾％75摩爾％。35.如權(quán)利要求2534中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法包括使除SPM之外的所述形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)與所述SPM的摩爾比為1121。36.如權(quán)利要求2535中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)共同具有的固體有序相到液體無(wú)序相的相變溫度(Tm)高于37°C。37.如權(quán)利要求25沈中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述脂質(zhì)體膜包含固醇。38.如權(quán)利要求37所述的方法，其中，所述固醇是膽固醇。39.如權(quán)利要求2537中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法包括選自多層囊泡(MLV)或多泡囊泡(MVV)的脂質(zhì)體。40.如權(quán)利要求39所述的方法，其中，所述MVV是直徑為200nm25μπι的大MVV(LMVV)。41.如權(quán)利要求2540中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述水性介質(zhì)和所述脂質(zhì)體內(nèi)水性區(qū)室具有的滲透壓摩爾濃度為50m0sm/kg600m0sm/kg。42.如權(quán)利要求41所述的方法，其中，所述水性介質(zhì)和所述脂質(zhì)體內(nèi)水性區(qū)室具有的滲透壓摩爾濃度為275m0sm/kg295m0sm/kgo43.如權(quán)利要求2542中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述水性介質(zhì)和所述脂質(zhì)體內(nèi)水性區(qū)室具有的滲透壓摩爾濃度差為不超過(guò)50m0Smole。44.如權(quán)利要求2543中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法包含一定量的游離態(tài)的所述至少一種活性劑。45.如權(quán)利要求2544中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述水性介質(zhì)是生理上能夠接受的介質(zhì)。46.如權(quán)利要求2545中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述兩親性試劑是止痛藥。47.如權(quán)利要求46所述的方法，其中，所述止痛藥是選自由苯坐卡因、氯普魯卡因、可卡因、環(huán)美卡因、二甲卡因、丙氧卡因、普魯卡因、丙美卡因、丁卡因、阿替卡因、布比卡因、卡鐵卡因、辛可卡因、依替卡因、左布比卡因、利多卡因、甲哌卡因、哌羅卡因、丙胺卡因、羅哌卡因、三甲卡因、蛤蛘毒素和河豚毒素組成的組中的局部止痛藥。48.如權(quán)利要求47所述的方法，其中，所述止痛藥選自由布比卡因、利多卡因、羅哌卡因、左布比卡因、普魯卡因、氯普魯卡因、苯坐卡因、依替卡因、甲哌卡因、丙胺卡因、ciprocaine、丁卡因、地布卡因、庚卡因、美索卡因、丙泮卡因、卡比唑卡因和布他卡因組成的組。49.如權(quán)利要求2548中任一項(xiàng)所述的方法，其中，在制備的所述脂質(zhì)體中所述活性劑與所述形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)的摩爾比為高于0.5摩爾/摩爾。50.如權(quán)利要求2549中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法包括在4°C保存所述脂質(zhì)體至少3個(gè)月的時(shí)間。51.權(quán)利要求1M中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體系統(tǒng)用于制備藥物或診斷組合物的應(yīng)用。52.權(quán)利要求1M中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體系統(tǒng)，所述脂質(zhì)體系統(tǒng)用于醫(yī)療狀況的治療或用于醫(yī)療狀況的診斷。53.一種藥物或診斷組合物，所述藥物或診斷組合物包含權(quán)利要求1M中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體系統(tǒng)，以及生理上能夠接受的載體。54.一種用于治療或診斷醫(yī)療狀況的方法，所述方法包括向?qū)ο笫┯靡欢康臋?quán)利要求12中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體系統(tǒng)或權(quán)利要求53所述的組合物。全文摘要本公開提供一種脂質(zhì)體系統(tǒng)，所述脂質(zhì)體系統(tǒng)包括水性介質(zhì)，在所述水性介質(zhì)中分散有脂質(zhì)體，所述脂質(zhì)體在其脂質(zhì)體內(nèi)水性區(qū)室中包封至少一種活性劑，所述水性介質(zhì)與所述脂質(zhì)體內(nèi)水性區(qū)室處于等滲平衡，所述脂質(zhì)體具有包含形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)的膜，所述形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)中的至少一種是鞘磷脂(SPM)，所述脂質(zhì)體系統(tǒng)相比于不含SPM的同種脂質(zhì)體具有更大的穩(wěn)定性，而且在一個(gè)實(shí)施方式中在長(zhǎng)期保存期間具有穩(wěn)定性，所述穩(wěn)定性的特征在于在所述保存之后所述水性介質(zhì)中存在不超過(guò)30％的所述至少一種活性劑。本公開還提供利用所述脂質(zhì)體系統(tǒng)保存脂質(zhì)體的方法；所述脂質(zhì)體系統(tǒng)用于治療醫(yī)療狀況或用于診斷醫(yī)療狀況的應(yīng)用；包含所述脂質(zhì)體系統(tǒng)的藥物或診斷組合物；以及治療或診斷醫(yī)療狀況的方法，所述方法包括向?qū)ο笫┯靡欢康乃鲋|(zhì)體系統(tǒng)。文檔編號(hào)A61K31/445GK102223878SQ200980147144公開日2011年10月19日申請(qǐng)日期2009年10月11日優(yōu)先權(quán)日2008年10月7日發(fā)明者葉切科爾·巴倫霍茨,瑞夫卡·科恩申請(qǐng)人:耶路撒冷希伯來(lái)大學(xué)伊森姆研究發(fā)展公司