專利名稱：從皇冠分離的作為抗癌藥的化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及來自皇冠(Phaleria macrocarpa(Scheff. )Boerl)植物的化合物，包括化合物分離的制備方法以及這些化合物的生物活性。已從皇冠中分離出分別被命名為 DLBS1425E2. 2和DLBS1425F1的兩種化合物。這兩種化合物均顯示出針對(duì)MDA-MB-231癌細(xì)胞的抗增殖活性。DLBS1425E2. 2化合物還顯示出細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物的活性。根據(jù)本發(fā)明的這兩種化合物均可用于如涉及乳房、子宮、宮頸和卵巢的癌癥、腺瘤、囊腫等的婦科相關(guān)疾病或其它婦產(chǎn)科疾病的治療。
背景技術(shù)：
在印度尼西亞，癌癥是最有可能導(dǎo)致死亡的疾病之一，因?yàn)榈侥壳盀橹谷詿o有效治療方法，特別是晚期癌癥。癌癥由瘤形成(neoplasia)引起，瘤形成是細(xì)胞在組織或器官內(nèi)的異常增殖，導(dǎo)致稱為贅生物(neoplasm)的團(tuán)塊。腫瘤(tumor)是已經(jīng)形成腫塊的贅生物；而其他類型的贅生物可以不形成腫塊，例如宮頸上皮內(nèi)贅生物、肛門上皮內(nèi)贅生物和白血病。贅生物可以是良性的，但也可以是惡性的。良性贅生物包括如平滑肌瘤或子宮纖維狀瘤和黑色素細(xì)胞痣或胎塊。惡性贅生物包括如畸胎瘤，還包括各種癌癥，包括乳腺癌。預(yù)防和治療癌癥的方法之一是使用草藥。其中一種具有抗癌性能的植物是皇冠， 一種在印度尼西亞被廣泛稱為“mahkota dewa”的原產(chǎn)巴布亞(Papua)的植物。在印度尼西亞專利申請(qǐng)P00 2005 00077中，已教導(dǎo)了皇冠的類黃酮提取物基于其降低酪氨酸激酶活性的能力、作為抗氧化劑的能力以及其對(duì)抗HeLa癌細(xì)胞的活性而可用作抗癌藥。另一個(gè)印度尼西亞專利申請(qǐng)P00 2008 00334教導(dǎo)，皇冠提取物可用作抗瘤劑、抗炎劑和抗血管生成劑。然而在這些專利申請(qǐng)中，并未說明在這樣的植物提取物中那種化合物是有用的。在本發(fā)明中將了解有關(guān)從皇冠果實(shí)中分離并鑒定的作為主要組分的苯甲酮化合物，以及通過它們?cè)谝种萍?xì)胞生長(zhǎng)和可誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡的刺激細(xì)胞凋亡中的潛在作用而顯示出的它們作為抗增殖劑的效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明教導(dǎo)的目的和/或方案將以優(yōu)選實(shí)施方式的形式給出。對(duì)這些實(shí)施方式的說明是用于對(duì)本發(fā)明的理解，而非限制可行的其他實(shí)施方式，這些其他實(shí)施方式可由對(duì)本發(fā)明的實(shí)踐得知。本發(fā)明教導(dǎo)的目的和/或方案由本文的權(quán)利要求書詳細(xì)記載的要求及組合實(shí)現(xiàn)。如在實(shí)施方式中所說明的以及在本申請(qǐng)中廣泛描述的，為達(dá)到本發(fā)明的目的和/ 或方案，本發(fā)明的第一方面涉及一種藥物制劑，包括(1)本發(fā)明中命名為DLBS1425E2. 2的皇冠化合物，以下簡(jiǎn)稱E2. 2，和( 本發(fā)明中命名為DLBS1425F1的皇冠化合物，以下簡(jiǎn)稱 F1。此E2. 2和Fl化合物作為單獨(dú)的活性化合物或組合，以有效量或有效劑量用于癌癥的處理(treatment)或治療(therapy)。根據(jù)本發(fā)明的藥物劑型還可包含藥學(xué)上可用的賦形劑。本發(fā)明的第二方面涉及一種包含E2. 2和Fl化合物的藥物制劑，所述化合物起到抗癌細(xì)胞增殖的作用，以及抗如涉及乳房、子宮、宮頸和卵巢的癌癥、腺瘤、囊腫等的婦科相關(guān)疾病或其他婦產(chǎn)科疾病的作用。本發(fā)明的第三方面涉及E2. 2純化合物，所述化合物具有在苯甲酮 (benzophenone)、二苯基甲基酮(diphenylmethanone)、二苯基酮(diphenylketone)或苯甲酰基苯(benzoylbenzene)的2、6和4，位碳上取代有三個(gè)羥基(-0H)和在4位碳上取代有甲氧基(-OCH3)的基本結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的第四方面涉及Fl純化合物，所述化合物具有在苯甲酮、二苯基甲基酮、 二苯基酮或苯甲酰基苯的4’和6位碳上取代有兩個(gè)羥基(-0H)、在4位碳上取代有甲氧基 (-OCH3)和在2位碳上取代有β-D-吡喃葡糖苷的結(jié)構(gòu)。


并入本申請(qǐng)說明書并構(gòu)成其一部分的以下各圖說明了本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式。以下各圖用于解釋本發(fā)明的原理。圖1顯示了 Ε2. 2純度測(cè)試的二維薄層色譜(TLC)圖結(jié)果。圖2顯示了 Ε2. 2化合物MS的測(cè)定結(jié)果。圖3顯示了 Ε2. 2化合物的結(jié)構(gòu)。圖4顯示了 Fl純度測(cè)試的二維TLC結(jié)果圖。圖5(a)顯示了來自MS FAB Fl數(shù)據(jù)的離子的測(cè)定結(jié)果。圖5(b)顯示了來自MS FAB Fl數(shù)據(jù)的離子碎片的圖示說明。圖6顯示了 Fl化合物的結(jié)構(gòu)。圖7顯示了說明Fl化合物對(duì)抗MDA-MB-231癌細(xì)胞增殖效果的柱形圖。圖8顯示了說明Ε2. 2化合物對(duì)抗MDA-MB-231癌細(xì)胞增殖效果的柱形圖。圖9顯示了說明由Ε2. 2化合物引起MDA-MB-231細(xì)胞中DNA斷裂形成的電泳結(jié)果圖。圖10(a)顯示了 BCl2 RT-PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果圖。圖10(b)顯示了半定量說明在MDA-MB-231細(xì)胞中BCl2 RT-PCR產(chǎn)物的柱形圖。圖11 (a)顯示了 Bax RT-PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果圖。圖11(b)顯示了半定量說明在MDA-MB-231細(xì)胞中Bax RT-PCR產(chǎn)物的柱形圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明將通過給出實(shí)施例，而不將本發(fā)明的范圍限制于所述的這些實(shí)施例的方式進(jìn)行詳細(xì)討論。根據(jù)本發(fā)明教導(dǎo)的E2. 2和Fl化合物源自皇冠的果實(shí)。所用果實(shí)是皇冠的成熟果實(shí)?；使谥参锷L(zhǎng)分布在印度尼西亞本土和海外多個(gè)地區(qū)，優(yōu)選種植在爪哇海拔10 1200 米的皇冠。在此將描述用于E2. 2和Fl化合物的提取過程的制備方法。根據(jù)本發(fā)明的E2. 2和Fl化合物用作抗增殖劑(anti proliferation)、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑(apoptosis inducer)、抗癌藥(anti cancer)禾口抗月中瘤藥(anti neooplasia)，其可用于治療宮頸上皮內(nèi)贅生物、肛門上皮內(nèi)贅生物、白血病或其他由贅生物引起的疾病，包括平滑肌瘤，以及如涉及乳房、子宮、宮頸和卵巢的癌癥、腺瘤、囊腫等的女性婦產(chǎn)科相關(guān)疾病。A.分離方法1. E2. 2和Fl化合物制備的第一方法(方法1)單獨(dú)的化合物E2. 2和Fl通過以下工藝步驟由成熟的皇冠果實(shí)得到醇提取，用有機(jī)溶劑或液-液提取分級(jí)(fractionation)，制備色譜分離或純化，結(jié)晶并鑒定。a.醇提取將確定為皇冠成熟果實(shí)的植物材料(名稱為DLBS14)研磨，在室溫到70°C的溫度下溫育一段時(shí)間，最多4天，然后用1 2到1 20比例的醇溶劑進(jìn)行提取。將不需要的植物材料作為殘留物分離。該工藝的干燥提取物稱為DLBS1437。b.液-液提取 /LLE 將一定量的DLBS1437用1 1到2 1比例的有機(jī)溶劑和水的混合物在室溫下通過LLE技術(shù)進(jìn)行分級(jí)，然后溫育最多1個(gè)晚上，從而成為兩層。收集上層有機(jī)相以用于后續(xù)工藝，而丟棄剩下的水的級(jí)分(fraction)。c.純化對(duì)于上述有機(jī)相，LLE產(chǎn)物用制備色譜柱分級(jí)(固定相硅膠；流動(dòng)相有機(jī)溶劑)，其中E2. 2分離化合物通過用氯仿溶劑結(jié)晶從E級(jí)分純化獲得。Fl化合物通過醇-水重結(jié)晶純化從F級(jí)分獲得。d.鑒定E2. 2化合物物理學(xué)上是熔點(diǎn)為173. 1 174. 7°C的桔黃色晶體。TLC分析使用 SiO2膠體介質(zhì)，用以Rf 0. 32遷移的氯仿/乙酮溶劑系統(tǒng)5/1 (ν/ν)洗脫，用UV燈分析在長(zhǎng)波或短波下均產(chǎn)生陽性結(jié)果，當(dāng)用5%硫酸并隨后加熱進(jìn)行衍生(derivatization)產(chǎn)生亮桔色。參見圖1。光譜學(xué)UV數(shù)據(jù)顯示兩個(gè)峰，最大峰在^4.5nm。E2. 2化合物的頂光譜學(xué)顯示以下的峰3288 (作為羥基)，1731 (作為共軛酮C = 0，中等強(qiáng)度)，1070(作為C-0，強(qiáng))，1579、1608(作為C = C共軛)，1400-1600 (作為芳族 C-C)，2858,2913 (作為脂族C-H)。以上E2. 2化合物的IR光譜數(shù)據(jù)顯示代表羥基、羰基、 0-醚、共軛碳-碳鍵和氫-碳脂基的吸收率?；贜MR結(jié)果，獲得在以下化學(xué)位移處顯示出信號(hào)的質(zhì)子NMR數(shù)據(jù)，(δ) :5.9(s)； 7. 52 (d，JHz = 8. 55) ；6. 68 (d, JHz = 8. 55) ；3.68 (s)。碳 NMR 數(shù)據(jù)在以下化學(xué)位移處顯示出碳信號(hào)198. 5 ；165. 6 ；161. 2 ；161 ；133 ；132. 8 ；115. 5 ； 108 ；94. 3 ；55. 5。基于 MS (質(zhì)譜) 數(shù)據(jù)，E2. 2化合物的相對(duì)分子量為沈0. 88g/mol，分子式為C14H1205。MS數(shù)據(jù)結(jié)果示于圖2。由E2. 2分離化合物顯示出的所有光譜數(shù)據(jù)指示其為苯甲酮基化合物(或稱二苯基甲酮、二苯基酮、苯甲?；?。E2. 2化合物結(jié)構(gòu)示于圖3。E2.2化合物是在2、6和4’位碳上取代有3個(gè)羥基(-0H)；在4位碳上取代有甲氧基(-OCH3)的苯甲酮基化合物。因此， E2. 2化合物的化學(xué)名稱(IUPAC)為2，4，，6-三羥基-4-甲氧基苯甲酮(2，4，，6-trihydrox y-4-methoxybenzophenone)。Fl化合物物理上是熔點(diǎn)為204. 5-204. 7V的白色固體。TLC分析使用SW2膠體介質(zhì)，用以Rf 0. 35遷移的氯仿/甲醇/水溶劑系統(tǒng)8/2/0. 1 (ν/ν)洗脫，用UV燈分析在長(zhǎng)波或短波下均產(chǎn)生陽性結(jié)果，當(dāng)用5%硫酸并隨后加熱進(jìn)行衍生產(chǎn)生比E2. 2化合物更強(qiáng)的亮桔色。參見圖4。光譜學(xué)UV數(shù)據(jù)顯示兩個(gè)峰，最大峰在^2.5nm。Fl化合物的頂光譜學(xué)數(shù)據(jù)顯示以下的峰3363 (作為芳基上的羥基)，3207 (作為脂基上的羥基，峰相對(duì)較寬，因?yàn)镺H > 1)，1651 (作為共軛酮C = 0，中等強(qiáng)度)，1087 (作為 C-0,強(qiáng))，1608 (作為共軛 C = C), 1400-1600 (作為芳族 C-C)，2970,2920,2872,2821 (作為脂族C-H)。以上Fl化合物的頂光譜數(shù)據(jù)顯示分別代表羥基(鍵合在芳基C上)、羥基(鍵合在脂基C上)、羰基、0-醚、共軛碳鍵、氫-碳脂基單鍵的吸收率。不同于E2. 2化合物的頂光譜數(shù)據(jù)，檢測(cè)到Fl化合物中的羥基多于一個(gè)。這由不尖銳的3207處的吸收峰顯示。 氫-碳脂基單鍵的四個(gè)吸收峰也給出C-H鍵位于連接到主體結(jié)構(gòu)的其他基團(tuán)中的信息?；贜MR結(jié)果，質(zhì)子NMR數(shù)據(jù)在以下化學(xué)位移處顯示出信號(hào)(δ) 6. 2 ；6. 4 ；6. 8 ； 7. 7 ； δ 6. 2(1H, d, JHz = 1. 85) ； δ 6. 4(1H, d, JHz = 1. 85) ； δ 6. 8 (2Η, d, JHz = 8. 5)和 δ 7. 7 (2Η, d，JHz = 8.5) ； δ 3. 8 (1H，s)，δ 4. 8 (2Η, d，JHz = 7.9)。碳 NMR 數(shù)據(jù)在以下化學(xué)位移處顯示出信號(hào)δ 164. 3 ；164. 10 ；159. 03 ；158. 51 ；133. 69 ；131. 84 ；116. 04 ；111. 77 ； 102. 55 ；96. 80 ；94. 90 ；78. 41 ；77. 91 ；4. 83 ；71. 31 ；62. 65 ；56. 01 和 δ 192. 5 (C = 0)?；?MS數(shù)據(jù)，F(xiàn)l化合物的相對(duì)分子量為422. 6g/mol，分子式為C2tlH22Oltlt5參見圖fe。這個(gè)MS數(shù)據(jù)以在FAB MS(快速原子轟擊質(zhì)譜)分析法中的離子碎片支持了 Fl結(jié)構(gòu)檢測(cè)的事實(shí)。Fl 化合物用FAB MS儀分析，在該儀器中Fl結(jié)構(gòu)發(fā)生H+原子轟擊反應(yīng)，因此產(chǎn)生在m/z 422.6、 260. 99和167. 15處顯示出峰數(shù)據(jù)的碎片?；谒槠?，隨后重新構(gòu)成如圖恥所示的結(jié)構(gòu)。 該重新構(gòu)成的結(jié)果符合MS數(shù)據(jù)分析結(jié)果。由Fl分離化合物給出的所有光譜數(shù)據(jù)指示其為苯甲酮基化合物(或二苯基甲酮、二苯基酮、苯甲?；?。Fl化合物結(jié)構(gòu)示于圖6。Fl化合物是在4’和6位碳上取代有2個(gè)羥基(-0H)；在4位碳上取代有甲氧基(-OCH3)和在2位碳上取代有β-D-吡喃葡糖苷的苯甲酮基化合物。因此，F(xiàn)l化合物的化學(xué)名稱(IUPAC)為4’，6-二羥基-4-甲氧基苯甲酮-2-0- β -D-吡喃葡糖苷(4，，6-di-hydroxy-4-methoxybenzophenone-2-0- β -D-glyc opyranoside)。2. Ε2· 2和Fl化合物的制備(方法2)作為另一種選擇，為從成熟的皇冠果實(shí)獲得單獨(dú)的分離化合物Ε2. 2和F1，進(jìn)行一些步驟，包括常規(guī)的提取工藝和超臨界CO2(SCFE-CO2)提取方法，用與水不混溶的有機(jī)溶劑組合通過液-液提取分級(jí)，制備/純化柱色譜，結(jié)晶和鑒定。a.醇提取從DLBS14至DLBS1437產(chǎn)生，方法2中的醇提取方法與方法1中的醇提取方法是相似的。b.液-液提取 /LLE 直到產(chǎn)生有機(jī)級(jí)分，方法2中的液-液提取方法與方法1中的液-液提取方法是相似的。c.純化隨后將來自LLE工藝的干燥的有機(jī)級(jí)分用液相SCFE-(X)2裝置，5%共溶劑，在以下條件下選擇性提取操作時(shí)間2小時(shí)，溫度50-60°C。更簡(jiǎn)單的選擇級(jí)分用于制備色譜柱步驟。基于色譜定位，從類似于E2. 2分離物的B-I級(jí)分獲得一種分離物，其隨后用醇和水溶劑的混合物重結(jié)晶而純化。此外，從類似于Fl分離物的B-2級(jí)分獲得一種分離物，其隨后也用醇和水溶劑的混合物重結(jié)晶而純化。d.鑒定由SCFE-(X)2提取工藝獲得的兩種分離的化合物與基于根據(jù)方法1制備得到的 E2. 2和Fl相當(dāng)。SCFE-(X)2提取工藝的鑒定結(jié)果顯示由B-I級(jí)分得到的分離化合物與E2. 2 一致，由B-2級(jí)分得到的分離化合物與Fl —致。B. E2. 2和Fl化合物對(duì)MDA_MB_231癌細(xì)胞的抗增殖效果在此試驗(yàn)中，觀察到E2. 2和Fl化合物作為MDA_MB_231癌細(xì)胞的抗增殖劑的效果，以及E2. 2化合物作為MDA-MB-231癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑的效果。MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)在補(bǔ)充的培養(yǎng)基中，并隨后在37°C，5% CO2條件下孵育。1、方法a. MDA-MB-231癌細(xì)胞的抗增殖試驗(yàn)該試驗(yàn)在96孔板中進(jìn)行。每個(gè)孔含一定密度的癌細(xì)胞。孵育M小時(shí)后，將培養(yǎng)基換為無血清的培養(yǎng)基，隨后向其中加入各種濃度的E2. 2化合物樣品作為單一試劑，F(xiàn)l化合物也同樣加入。然后將細(xì)胞進(jìn)行再孵育，隨后，通過細(xì)胞死亡測(cè)定試驗(yàn)來測(cè)定處理后的活細(xì)胞數(shù)量。在微板塊讀數(shù)器中讀出吸收值。用標(biāo)準(zhǔn)曲線將該吸收值轉(zhuǎn)換后，得到活的和死的細(xì)胞數(shù)量。各處理中活細(xì)胞數(shù)量的百分?jǐn)?shù)可通過以下方法計(jì)算用在孔中接受過處理的活細(xì)胞數(shù)量除以健康對(duì)照的活細(xì)胞數(shù)量，并乘以100%。% 活細(xì)胞數(shù)量=Β/ΑΧ ιοο%注Α為健康對(duì)照的活細(xì)胞數(shù)量，B為接受過處理的活細(xì)胞數(shù)量。IC50值是引起 50%細(xì)胞死亡時(shí)的樣品濃度的數(shù)值。該值采用Biostat統(tǒng)計(jì)程序獲得。b. DNA斷裂分析法細(xì)胞凋亡是以DNA染色體分裂、染色質(zhì)凝集和DNA斷裂為標(biāo)志的細(xì)胞死亡的活動(dòng)進(jìn)程。在本實(shí)驗(yàn)中，將觀察到E2. 2化合物的加入對(duì)作為細(xì)胞凋亡指示之一的DNA斷裂形成的效果。細(xì)胞在板中孵育。在孵育M小時(shí)后，加入各種濃度的E2. 2化合物。用DNA細(xì)胞凋亡Ladder試劑盒測(cè)定DNA斷裂。DNA斷裂結(jié)果在電泳凝膠中用溴化乙錠直觀化來進(jìn)行觀察。c. RNA 分離法及 RT-PCRBCl2和Bax基因是在細(xì)胞凋亡過程中起作用的基因。為鑒定BCl2和Bax mRNA表達(dá)，進(jìn)行RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄PCR)。MDA-MB-231癌細(xì)胞在板中生長(zhǎng)，并向其中加入各種濃度的 E2. 2化合物樣品作為單一試劑。實(shí)驗(yàn)條件是在無血清的培養(yǎng)基中進(jìn)行。從MDA-MB-231癌細(xì)胞分離總RNA。RNA分離產(chǎn)物用分光光度計(jì)定量并用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)觀察。此RNA 隨后用在使用特異性引物的RT-PCR方法中。RT-PCR方法以優(yōu)化的條件在PCR儀中進(jìn)行。 RT-PCR產(chǎn)物在電泳凝膠中用溴化乙錠直觀化來進(jìn)行觀察。2.結(jié)果a. E2. 2和Fl化合物對(duì)MDA_MB_231癌細(xì)胞增殖效果的試驗(yàn)結(jié)果結(jié)果顯示E2. 2和Fl化合物在MDA-MB-231細(xì)胞中顯示出有抗增殖效果。此效果顯示為活癌細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)隨提取物濃度的增加而減少。圖7顯示了 Fl化合物的效果，圖8顯示了 E2. 2化合物的效果?；罴?xì)胞的百分?jǐn)?shù)數(shù)據(jù)用于計(jì)算MDA-MB-231細(xì)胞的IC50。在 MTT結(jié)果中由E2. 2化合物得到的IC50值為36. 91 μ g/mL,而在MTT結(jié)果中由Fl化合物得到的IC50值為65. 80 μ g/mL。用Bic^tat統(tǒng)計(jì)程序獲得上述數(shù)據(jù)。b. DNA斷裂分析結(jié)果從MDA-MB-231細(xì)胞獲得，并經(jīng)50、70和100 μ g/mL濃度的E2. 2化合物處理的樣品中的DNA碎片顯示E2. 2化合物具有細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑的效果。細(xì)胞凋亡標(biāo)志之一是如圖 9所示的DNA斷裂的形成。c. BCL 和 Bax RT-PCT 結(jié)果BCl2基因是具有抗細(xì)胞凋亡性能的BCL-2家族成員的致癌基因之一。BCL-2家族成員分兩類活性，促細(xì)胞凋亡和抗細(xì)胞凋亡。刺激細(xì)胞凋亡的細(xì)胞敏感性取決于促細(xì)胞凋亡蛋白和抗細(xì)胞凋亡蛋白之間的平衡。如果促細(xì)胞凋亡蛋白過量，細(xì)胞將傾向發(fā)生凋亡；但如果抗細(xì)胞凋亡蛋白過量，則細(xì)胞將傾向抵抗死亡。從用特定BCl2引物的PCR結(jié)果可知，用E2. 2化合物處理后，在MDA_MB_231細(xì)胞中BCl2 mRNA表達(dá)下調(diào)。在凝膠上，觀察到BCl2基因擴(kuò)增產(chǎn)物帶因加入的提取物濃度增加而變窄。圖IOa和Ib中定量說明了 8(12在1^離水平上的下調(diào)。與BCl2相反，在MDA-MB-231細(xì)胞中Bax的mRNA水平上調(diào)。分析結(jié)果顯示，E2. 2 化合物濃度越高，所產(chǎn)生的帶越粗。參見圖Ila和lib。3.討論與結(jié)論上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果的結(jié)論是E2. 2和Fl化合物能引起對(duì)MDA_MB_231乳癌細(xì)胞增殖的抑制。由E2. 2化合物得到的IC50值為36. 91 μ g/mL，而由Fl化合物得到的為65. 80 μ g/
mLo
一種材料，如果它具有IC50 < 100 μ g/mL的抗增殖效果，則認(rèn)為是有活性的?；衔顴2. 2和Fl均為具有癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制活性的苯甲酮基化合物。以上結(jié)果顯示，與Fl化合物相比，E2. 2化合物對(duì)于在較低劑量下抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)更為有效。因此，細(xì)胞凋亡檢測(cè)更多地集中在E2. 2化合物上。以上數(shù)據(jù)還顯示，E2. 2和Fl化合物作為MDA-MB-231乳癌細(xì)胞的抗增殖劑是有效的。加入E2. 2化合物后，MDA-MB-231細(xì)胞中細(xì)胞凋亡的標(biāo)志是DNA碎片的形成，BCl2 mRNA表達(dá)的減少和Bax mRNA表達(dá)的增加。這些結(jié)果支持了 E2. 2和Fl化合物能夠抑制癌細(xì)胞增殖并因此能用于抗癌的推論。此外，E2. 2和Fl化合物能用于治療由瘤形成(異常增殖)引起的疾病以及婦產(chǎn)科相關(guān)疾病，例如涉及乳房、子宮、宮頸和卵巢的宮頸上皮內(nèi)贅生物、肛門上皮內(nèi)贅生物、白血病、平滑肌瘤、腺瘤和囊腫。E2. 2化合物能夠在癌細(xì)胞中刺激細(xì)胞凋亡或細(xì)胞死亡的結(jié)果也支持此結(jié)論。C.藥物劑型和營(yíng)養(yǎng)藥(nutraceutical)本發(fā)明包括含有作為活性成分的藥學(xué)上可用且生理學(xué)上適宜的有效量的E2. 2和 Fl化合物或其中之一的組合物和藥物劑型。在制備根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物的方法中，將E2. 2化合物和/或Fl與賦形劑混合、用賦形劑溶解、或混合在能制成膠囊、袋(sachet)、紙、以及其他材料或包裝的藥物載體中。如果藥學(xué)上推薦的賦形劑被用作溶劑，則這樣的賦形劑作為用于活性物質(zhì)的載體或介質(zhì)可為固體、半固體或液體(口服和注射)形式。因此，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合為可制成丸劑、膠囊、片劑、粉劑、袋、溶液、糖漿、乳液、懸液、泡騰片、凝膠、膏劑、霜?jiǎng)?、以及漱口液、按摩油、栓劑、或針劑形式。此外，根?jù)本發(fā)明，包括E2. 2和Fl或其中之一的藥物組合還可制成補(bǔ)充劑、維生素、以及食品和飲品。一些適宜的賦形劑的實(shí)例是微晶纖維、明膠、乳糖、葡萄糖(dextrose)、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、面粉、磷酸鈣、硅酸鈣等。根據(jù)本發(fā)明的制劑還可包含潤(rùn)滑劑(如滑石、硬脂酸鎂和礦物油)、潤(rùn)濕劑、防腐劑、甜味劑和調(diào)味劑。根據(jù)本發(fā)明的組合物，采用已經(jīng)用于制藥工業(yè)的方法，還可制成當(dāng)患者服用后引起活性成分直接釋放、持續(xù)釋放或控制釋放的制劑。根據(jù)本發(fā)明的片劑或丸劑可被包被以延長(zhǎng)上述提取物的半衰期，從而降低服用頻率。采用以固體形式如片劑配制所述提取物的方法，可將E2. 2和Fl或其中之一與賦形劑混合，以形成含根據(jù)本發(fā)明組合物的均勻混合物的初始制劑。該初始制劑是含有均勻分散的E2. 2和Fl化合物或其中之一的活性成分的混合物，因而能適當(dāng)?shù)匾詣┬托问饺缒z囊、片劑或丸劑分成所需劑量。根據(jù)本發(fā)明的片劑或丸劑可增加保護(hù)層以降低或遮蔽來自組合物，或E2. 2和Fl 化合物或其中之一的活性物質(zhì)的苦味。根據(jù)本發(fā)明的E2. 2和Fl化合物或其中之一的有效量或有效劑量是指能夠抑制乳癌細(xì)胞和/或其他婦產(chǎn)科病理細(xì)胞生長(zhǎng)的E2. 2和Fl化合物或其中之一的濃度或劑量。該有效濃度取決于患者的身體條件，包括體重、年齡等，還取決于癌細(xì)胞的類型、大小和量，以及其他病理學(xué)指標(biāo)。本發(fā)明還預(yù)見E2. 2和Fl化合物或其中之一的預(yù)防治療用途，在摘出或取出瘤體的侵入性外科手術(shù)期間或之后的治療用途。E2. 2和Fl化合物或其中之一可直接施用到這種侵入性外科手術(shù)取出瘤體的部位，或施用到該部位周圍。本發(fā)明還預(yù)見E2. 2和Fl化合物或其中之一在放療的期間或之后的治療用途。本發(fā)明還預(yù)見E2. 2和Fl化合物或其中之一與以下組合物一起使用或進(jìn)一步使用的用途，所述組合物為抗增殖劑、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑、抗癌藥以及抗瘤形成引起的疾病和涉及乳房、子宮、宮頸和卵巢的癌癥、腺瘤、囊腫的婦科相關(guān)疾病或其他婦產(chǎn)科疾病的組合物。P.工業(yè)應(yīng)用E2. 2和Fl化合物或其中之一以及其藥物劑型能夠在工業(yè)規(guī)模上以提取物、粉末提取物和/或主要用于如固體、半固體或液體的口服劑量形式之類的藥物劑型的產(chǎn)品生產(chǎn)，用作抗增殖劑；細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑；抗癌藥；抗涉及乳房、子宮、宮頸和卵巢的癌癥、腺瘤、 囊腫的婦科相關(guān)疾病或其他婦產(chǎn)科疾病的藥劑。
權(quán)利要求
1.一種純化合物，具有在苯甲酮、二苯基甲基酮、二苯基酮或苯甲?；降?、6和4’位碳上取代有三個(gè)羥基(-0H)和4位碳上取代有甲氧基(-OCH3)的基本結(jié)構(gòu)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化合物，其中所述化合物具有沈0.88g/mol的相對(duì)分子量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化合物，其中所述化合物具有羥基、羰基、0-醚基、共軛的碳雙鍵和氫-碳脂基鍵。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化合物，其中NMR實(shí)驗(yàn)，所述化合物的氫原子在5.9 (s)；7.52 (d, JHz = 8. 55) ；6. 68 (d, JHz = 8. 55) ；3. 68 (s)顯示出化學(xué)位移。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化合物，其中NMR實(shí)驗(yàn)，所述化合物的碳原子在198.5 ； 165. 6 ；161. 2 ；161 ；133 ；132. 8 ；115. 5 ； 108 ；94. 3 ；55. 5 顯示出化學(xué)位移。
6.一種純化合物，具有在苯甲酮、二苯基甲基酮、二苯基酮或苯甲?；降?’和6位碳上取代有兩個(gè)羥基(-0H)、4位碳上取代有甲氧基(-OCH3)和2位碳上取代有β -D-吡喃葡糖苷的基本結(jié)構(gòu)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的純化合物，其中所述化合物具有422.6g/mol的相對(duì)分子量。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的純化合物，其中所述化合物分別具有羥基(與芳基碳鍵合)、 羥基(與脂基碳鍵合)、羰基、0-醚基、共軛碳鍵和氫-碳脂基單鍵。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的純化合物，其中NMR實(shí)驗(yàn)，所述化合物的氫原子在(δ)6.2； 6. 4 ；6. 8 ；7. 7 ； δ 6. 2 (1Η, d, JHz = 1. 85) ； δ 6. 4 (1Η, d, JHz = 1. 85) ； δ 6. 8 (2Η, d, JHz =8.5)和 δ 7. 7 (2Η, d, JHz = 8. 5) ； δ 3. 8 (1Η, s)，δ 4. 8 (2Η, d, JHz = 7. 9)顯示出化學(xué)位移。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的純化合物，其中NMR實(shí)驗(yàn)，所述化合物的碳原子在δ= 164. 3 ；164. 10 ；159. 03 ；158. 51 ；133. 69 ；131. 84 ；116. 04 ；111. 77 ；102. 55 ；96. 80 ；94. 90 ； 78. 41 ；77. 91 ；4. 83 ；71. 31 ；62. 65 ；56. 01 和 δ 192. 5 (C = 0)處顯示出化學(xué)位移。
11.包括從皇冠獲得的Ε2.2和/或Fl化合物的皇冠提取物在制備作為抗癌細(xì)胞增殖劑、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑、抗癌藥、以及抗與瘤形成相關(guān)的疾病和治療如涉及乳房、子宮、宮頸和卵巢的婦科相關(guān)疾病或其他婦產(chǎn)科疾病的藥劑的藥物劑型中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及從植物皇冠的提取物中分離并鑒定的化合物DLBS1425E2.2和DLBS1425F1。本發(fā)明還涉及所述化合物作為單獨(dú)的活性化合物或以組合的形式在具有對(duì)腫瘤細(xì)胞抗增殖活性的藥物劑型中的用途，及其針對(duì)婦科相關(guān)疾病的用途。
文檔編號(hào)A61K36/83GK102245555SQ200980148316
公開日2011年11月16日 申請(qǐng)日期2009年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月2日
發(fā)明者波皮·菲爾薩尼·阿里芬, 阿塞佩·阿勒平, 雷蒙德·R·錢德拉維納塔 申請(qǐng)人:地塞醫(yī)藥有限公司