專利名稱：牛皰疹病毒1型組合物,疫苗及方法
牛皰疹病毒1型組合物，疫苗及方法
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背景技術(shù)：
牛皰疹病毒1型(BHV-I)是傳染性的牛鼻氣管炎(IBR)的致病體，并且是一種可以導(dǎo)致重大經(jīng)濟損失的牛病毒性病原體，它可以引起嚴(yán)重的呼吸道感染、結(jié)膜炎、流產(chǎn)、外陰陰道炎、莖頭包皮炎、新生牛崽的全身性感染(Wyler等人，(1989)HERPESVIRUS DISEASES OF CATTLE,HORSES,AND PIGS 1-72(Boston)In G. Witman(ed.)Kluwer Academic Publishers) 0已知BHV-I染色體(1361Λ)的核苷酸序列。它通常包括67個獨特的基因和其它2個逆向復(fù)制的基因。一般來說，BHV-I基因和其它α皰疹病毒(HSV-1，VZV，EHV-1) 在氨基酸序列水平上展示出同源性并按照相似順序排列。BHV-I屬于α皰疹病毒亞科(皰疹病毒科)、水痘病毒屬。該亞科包括人皰疹病毒3型，偽狂犬病病毒，以及牛和其它馬科動物的皰疹病毒。BHV-I也是誘發(fā)上呼吸道感染的因素之一，上呼吸道感染也被稱作“船運熱”(shipping fever)或牛呼吸綜合癥(Tikoo 等人，(1995)Adv. Virus Res. 45 :191;美國專利申請第2004-0185056號)。BHV-I不是誘發(fā)船運熱的唯一傳染源，但是它會抑制被感染牛的免疫系統(tǒng)從而引起免疫失調(diào)，這通常會進一步引起繼發(fā)性的細(xì)菌感染和肺炎。感染BHV-I之后會使細(xì)胞介導(dǎo)的免疫受到抑制，從而使感染后的動物更容易遭受繼發(fā)性的感染(Carter 等人，(1989) J. Virol. 63 :1525 ；Griebel 等人(1990) J. Gen. Virol. 71 :369 ； Griebel 等人(1987) Viral Immunol. 1 :287 ；Griebel 等人(1987) Viral Immunol. 1 267)。 BHV-I最初在黏膜上皮細(xì)胞中進行復(fù)制，隨后通常終生潛伏在周身神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元，并且使感染動物具有超出急性感染傳染性。潛伏的BHV-I病毒再激活通常會引起病毒散播并傳染給其它易受感染的動物。再激活通常在自然誘導(dǎo)的或者皮質(zhì)類固醇誘導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng)后出現(xiàn)(Rock 等人，(1992) J. Virol. 66 :2484 ；Sheffy and Davies (1972) Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 140 :974)。為了控制BHV-I感染，現(xiàn)已開發(fā)出了常規(guī)的病毒滅活疫苗和減毒活病毒疫苗?，F(xiàn)市場上銷售的疫苗，例如減毒活病毒疫苗，可能會引起宿主免疫系統(tǒng)的免疫抑制或免疫下降或者引起宿主免疫系統(tǒng)的其它改變。這些改變可以歸咎于BHV-I編碼的蛋白，該蛋白會抑制或者改變被感染宿主的免疫系統(tǒng)。這種免疫抑制會造成這些疫苗喪失預(yù)防BHV-I野外強毒株建立潛伏性感染的能力(參見例如Gerber等人，(1978) Am. J. Vet. Res. 39 :753 ； Jericho 等人，(1983) Can. J. Com. Med. 47 :133 ；Pastoret 等人，(1980) Infect. Immun. 29 483)。當(dāng)前疫苗的一個趨勢是共同給藥(co-administrated)疫苗或者聯(lián)合疫苗，這些疫苗通常含有來源于多種病原體或生物體的抗原。這些疫苗可以針對多種病原體和/或疾病提供免疫保護，并且可以在同一個時間點給予宿主或給藥。在含有BHV-I的疫苗中，BHV-I可以影響或改變宿主針對共同給藥的其它成分的免疫應(yīng)答。在一個實施例中，相比于抗原沒有與BHV-I共同給藥時所能誘發(fā)的宿主免疫應(yīng)答，當(dāng)抗原與BHV-I共可給藥或者抗原與BHV-I以聯(lián)合疫苗形式給藥時抗原所能誘導(dǎo)的宿主免疫應(yīng)答會被抑制、減少或者改變。被影響或者被改變的免疫應(yīng)答會減弱跟BHV-I共同給藥的疫苗抗原誘導(dǎo)宿主針對感染和/或疾病的免疫應(yīng)答能力，所述感染和/或疾病是由共同給藥的抗原所衍生自的傳染原所引起。以前和現(xiàn)在的減毒BHV-I病毒通常都不能解決BHV-I免疫抑制和/或宿主針對共同給藥抗原的免疫應(yīng)答被改變的問題。 發(fā)明概沭現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，通過對BHV-I病毒的特定基因進行修飾和/或改變表達可以減輕、預(yù)防或者逆轉(zhuǎn)因BHV-I而引起的宿主免疫應(yīng)答的改變(例如免疫抑制)。并且還發(fā)現(xiàn)，與未經(jīng)修飾的BHV-I相比，含有修飾和/或改變的BHV-I可以減輕或預(yù)防宿主針對共同給藥的抗原或者針對聯(lián)合給藥的抗原的免疫應(yīng)答改變(例如，抑制了對其它抗原的免疫應(yīng)答)。在這些發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，對以下發(fā)明進行描述。在一個實施例中，本發(fā)明提供了一種含有BHV-I免疫原的組合物和疫苗，其中所述BHV-I免疫原至少有一個基因被修飾。在另一個實施例中，含有修飾的BHV-I疫苗和非 BHV-I免疫原共同給藥或者以聯(lián)合疫苗形式給藥。BHV-I可以是經(jīng)過修飾的活BHV-I疫苗株。在一個實施例中，BHV-I上被修飾的基因通常是編碼在BHV-I感染期間參與抑制宿主免疫應(yīng)答的蛋白的基因。組合物或疫苗也可以包含能夠降低BHV-I毒性的修飾。修飾的BHV-I基因的實例可以包括，修飾的BHV-I UL49. 5, BHV-I UL4LBHV-I Us4 和BHV-I Cir0可以通過單點突變方式對這些基因進行修飾，在有些情況下，單點突變可以是缺失突變。缺失突變可以是基因的完全缺失也可以是部分缺失。這些修飾可能會使該基因不產(chǎn)生蛋白質(zhì)。這些修飾也可能會使該基因產(chǎn)生非天然的或者非野生型的蛋白質(zhì)。在一個實施例中，BHV-I UL49. 5被修飾。在另一個實施例中，BHV-I UL41被修飾。在另一個實施例中，BHV-I Us4被修飾。在另一個實施例中，BHV-I Circ被修飾。修飾還可以發(fā)生在其它基因上。含有基因修飾的BHV-I病毒可以包含一個修飾、兩個修飾、三個修飾、四個修飾或更多個修飾。這樣的修飾也可以發(fā)生在已經(jīng)存在修飾的基因之外，例如在減毒疫苗株上已經(jīng)存在修飾的基因之外進行修飾。在一個實施例中，BHV-I病毒可以含有UL49. 5和UL41這兩個修飾的基因。在另一個實施例中，至少一個選自BHV-I UL49. 5, BHV-I UL41,BHV-1 Us4 禾口 BHV-I Circ 組的基因和至少一個選自 BHV-I LR-ORF 1, BHV-I LR-ORF 2 禾口 BHV-1 Us9 組的基因被修飾。此處公開的任意組合物和疫苗都可以包含標(biāo)記基因。在特定的實施方式中，標(biāo)記基因可以是BHV-I UL49. 5, BHV-I UL41, BHV-I Us4禾口 /或BHV-1 Circ0特定的組合物和疫苗也可以包含作為標(biāo)記基因BHV-I Us8。本發(fā)明所公開的疫苗也可以含有藥學(xué)上可接受的載體。組合物和疫苗也可以含有其它免疫原(例如除BHV-I免疫原之外的免疫原)。所述其它免疫原可以共同給藥也可以以聯(lián)合多價疫苗方式給藥。其它免疫原還可以通過其它方式給藥。所述其它免疫原可以是細(xì)菌免疫原，例如，弧菌、溶血性曼氏桿菌、睡眠嗜組織菌、壞死梭桿酸、梭菌、大腸桿菌、沙門氏菌、牛支原體，和/或豕鉤端螺旋體免疫原，和/或病毒免疫原比如BVD I和II、PI3和BRSV免疫原。所述的疫苗和組合物還可以包含寄生蟲免疫原，例如犬新孢子蟲和/或毛滴蟲。本發(fā)明所公開的方法包括通過給予宿主治療劑量的本發(fā)明組合物或疫苗(例如含有修飾基因的BHV-I和至少一種其它免疫原)來預(yù)防或治療宿主(通常指牛)BHV-I感染。所述方法通常也包括治療或預(yù)防由病原體引起的感染和/或疾病，其中通過該病原體可以獲得其它免疫原。在一個實施例中，給予宿主本發(fā)明的組合物或疫苗可以提高宿主對 BHV-I和其它免疫原的免疫應(yīng)答。在另一個實施例中，給予宿主本發(fā)明的組合物或疫苗可以減輕或預(yù)防不含有修飾基因的BHV-I所引起的對宿主免疫應(yīng)答的免疫抑制。在另一實施例中，給予宿主本發(fā)明的組合物可以減輕或預(yù)防未修飾BHV-I所引起的宿主針對其它免疫原免疫應(yīng)答的免疫抑制。


本發(fā)明所附的附圖并入并構(gòu)成說明書內(nèi)容的一部分，附圖示出了有關(guān)本發(fā)明組合物、疫苗和方法的實施方式，這些內(nèi)容與以下記載的詳細(xì)描述一起用來描述本發(fā)明的實施方式。此處應(yīng)當(dāng)理解，附圖所示的實施方式僅為舉例說明之目的，其不對本發(fā)明構(gòu)成任何限制。此處還應(yīng)當(dāng)理解，在不背離本發(fā)明精神和范圍的前提下可以對附圖所示的實施方式進行任意的變化、修飾和衍生，這些都落在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。圖1示出了 Cooper病毒株BHV-1 UL49. 5基因的DNA序列(SEQ ID NO 1)和氨基酸序列(SEQ ID NO :2)。圖2示出了 Cooper病毒株BHV-1 UL41基因的DNA序列(SEQ ID NO 3)和氨基酸序列(SEQ ID NO :4)。圖3示出了 Cooper病毒株BHV-1 Circ基因的DNA序列(SEQ ID NO 5)和氨基酸序歹丨J (SEQ IDNO 6)。圖 4 示出了 Cooper 病毒株 BHV-1 LR-ORF 1 基因的 DNA 序列(SEQ ID NO 7)和氨基酸序列(SEQ ID NO :8)。圖 5 示出了 Cooper 病毒株 BHV-1 LR-ORF 2 基因的 DNA 序列(SEQ ID NO 9)和氨基酸序列(SEQ ID NO 10)。圖6示出了 Cooper病毒株BHV-1 Us4基因的DNA序列(SEQ ID NO 11)和氨基酸序列(SEQ ID N0:12)。如說明書記載，加下劃線的核苷酸表示來自BHV-1 GL756病毒株 Us4基因中被去除的區(qū)域，從而獲得用于進行某些研究的突變體。加下劃線苷酸的缺失會造成基因表達時相應(yīng)的加下劃線氨基酸的缺失。圖7示出了 Cooper病毒株BHV-1 Us9基因的DNA序列(SEQ ID NO 13)和氨基酸序列(SEQ ID NO 14)。圖8示出了 Cooper病毒株BHV-1 Us8基因的DNA序列(SEQ ID NO 15)和氨基酸序列(SEQ ID NO 16)。圖9示出了來源于BHV-1 GL756病毒株的UL49. 5突變體基因的DNA序列(SEQ ID N0:23)。加下劃線的核苷酸表示野生型GL756 UL49. 5序列中增加的序列。加下劃線的核苷酸在編碼序列中增加了兩個框內(nèi)翻譯終止子。圖10示出了流式細(xì)胞儀測得的BHV-1 GL756影響MHC I類分子在細(xì)胞表面表達的數(shù)據(jù)。使用對MHC I類分子具有特異性的單克隆抗體PT85A對模擬感染的MDBK細(xì)胞、 被BHV-I GL756感染的MDBK細(xì)胞進行染色。使用無反應(yīng)活性的并且同型匹配的對照抗體 MM605對陰性對照細(xì)胞進行染色。圖11示出了一項研究數(shù)據(jù)，該研究是在第0天單獨給予牛犢LkT抗原(LkT)或者一起給予牛犢LkT和BHV-I (GL756+LkT)，并在第21天再次給予牛犢LkT抗原(在第21天單獨給予LkT)。對照的牛犢只在第0天時給予BHV-1(GL756)。給藥的同一天從牛犢身上抽取血清并用ELISA測定對LkT具有特異性的抗體水平。誤差線表示測量的平均標(biāo)準(zhǔn)誤差 (SEM)。三角符號表示存在顯著區(qū)別的時間點，所述顯著區(qū)別是指給予GL756+LkT動物的血清樣品中存在的LkT特異的抗體水平與給予LkT動物的血清樣品中存在的LkT特異的抗體水平相比存在顯著區(qū)別。圖12示出了一項研究數(shù)據(jù)，該研究是在第0天單獨給予牛犢LkT抗原(LkT)或者一起給予牛犢LkT和BHV-I (GL756+LkT)，并在第21天再次給予牛犢LkT (在第21天單獨給予LkT)。給藥的同一天從牛犢身上抽取血清并用ELISA方法測定對LkT具有特異性的 IgGl和IgG2的水平。數(shù)據(jù)被表示成IgGl與IgG2的比例。誤差線表示SEM。圖13示出了一項研究數(shù)據(jù)，該研究是在第0天單獨給予牛犢LkT抗原(LkT)或者一起給予牛犢LkT和BHV-I (GL756+LkT)，并在第21天再次給予牛犢單獨的LkT (在第21天單獨給予LkT)。對照的牛犢只在第0天給予BHV-I (GL756)。在第23天采集牛犢的外周血。 將血液樣品中的細(xì)胞與LkT接觸，隨后用ELISA方法檢測樣品中的IL-2水平。圖 14 示出了 BHV-I GL756 Δ UL49. 5 (A)和 Us4 Δ (B)缺失重組構(gòu)建體(DRC)，其可用來通過同源重組的方式來產(chǎn)生缺失修飾。圖14也示出了 UL49. 5重組構(gòu)建體的DNA序列 (SEQ ID NO: 17)和 Us4 重組構(gòu)建體的 DNA 序列(SEQ ID NO: 18)。圖 15 示出了 BHV-I UL41 重組構(gòu)建體的DNA序列(SEQ ID NO :19)禾口BHV-1 LR-ORF 2重組構(gòu)建體的DNA序列(SEQ ID NO 20)。圖 16示出了 BHV-I GL756 AUL49. 5_EGFP 的克隆體Al和B8 以及原型GL756 BHV-I 經(jīng)核酸擴增后的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)物，缺失/重組位點使用外側(cè)引物。圖 17 示出了 BHV-I GL756 Δ Us4_EGFP 的克隆體 1 和 2 以及原型 GL756 BHV-I 經(jīng)核酸擴增后的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)物，缺失/重組位點使用外側(cè)引物。圖 18 示出了 BHV-I GL756 Δ UL49. 5 的克隆體 A1、A5、B7 和 B8 或原型 GL756 BHV-I 的蛋白印跡實驗結(jié)果，所用抗體與UL49. 5具有特異性。蛋白印跡結(jié)果表明修飾的BHV-I中目標(biāo)基因的缺失。圖19示出了 BHV-I GL756 Δ UL49. 5的克隆體Al和Β8的蛋白印跡，以及 GL756AUs4的克隆體1和2或者原型GL756 BHV-I的蛋白印跡，所用抗體與Us4具有特異性。蛋白印跡結(jié)果表明修飾的BHV-I中目標(biāo)基因的缺失。圖20示出了 BHV-I GL756染色體上UL49. 5 (插入了兩個終止密碼子)和UL41 (完全缺失)的突變。圖的上面部分示出了染色體的獨特區(qū)域(隊和仏)以及重復(fù)區(qū)域aR和 TR)。圖的下面部分示出了染色體上J片段內(nèi)的UL49. 5基因以及I片段內(nèi)的UL41基因。圖21示出了 BHV-I GL756染色體上Us4基因(部分缺失和插入)的突變。圖的上面部分示出了染色體的獨特區(qū)域(隊和仏)和重復(fù)區(qū)域(IR和TR)。圖的下面部分示出了染色體K片段內(nèi)的Us4基因。
圖22示出了在BHV-I GL756染色體上Circ基因的突變(完全缺失)。圖的上面部分示出了染色體的獨特區(qū)域(隊和仏)以及重復(fù)區(qū)域(IR和TR)。圖的下面部分示出了染色體N片段內(nèi)的Circ基因。圖23示出了 BHV-I病毒在MDBK細(xì)胞上的生長趨勢。病毒具有GL756原型。測試了 GL756 (BHV-1 WT)，GL756 的 UL49. 5 突變體(BHV-1 Δ UL49. 5)，GL756 的 UL41 突變體的兩個克隆體(BHV-1AUL41 :1606和BHV-I Δ UL41 1607)，兩個UL41/49. 5的雙重突變體的克隆體(BHV-1 AUL41/UL49. 5 :1614 和 BHV-I Δ UL41/UL49. 5 :1616)，GL756 的 Circ 突變體 (BHV-1 Δ Circ :1697)和 Us4 突變體(BHV-1 AUs4gG :1698)。圖M示出了流式細(xì)胞儀測得的BHV-1 GL756和修飾的BHV-I影響MHC I類分子在細(xì)胞表面表達的數(shù)據(jù)。使用對MHC I類分子具有特異性的單克隆抗體PT85A對模擬感染的MDBK細(xì)胞、以及被BHV-1 GL756或者GL756 Δ UL4. 5克隆體Al或者Β8感染的MDBK細(xì)胞進行染色。使用無反應(yīng)活性的同型匹配的對照抗體ΜΜ605對陰性對照細(xì)胞進行染色。圖25示出了流動細(xì)胞儀測得的BHV-1 GL756和GL756 Δ UL49. 5- Δ UL41影響MHC I類分子在細(xì)胞表面表達的數(shù)據(jù)。使用對MHC I類分子具有特異性的單克隆抗體ΡΤ85Α對模擬感染的MDBK細(xì)胞、被BHV-1 GL756或者GL756 Δ UL49. 5- Δ UL41感染的MDBK細(xì)胞進行染色。使用無反應(yīng)活性的同型匹配的對照抗體ΜΜ605對陰性對照細(xì)胞進行染色。圖沈示出了流式細(xì)胞儀測得的各種BHV-I病毒突變體影響MHC I類分子在細(xì)胞表面表達的數(shù)據(jù)。該數(shù)據(jù)表示成相對于模擬感染細(xì)胞的百分比(100%)。MDBK細(xì)胞用BHV-I GL576、GL756 Δ UL49. 5、GL756AUL41 或 GL756AUL49. 5-AUL41 進行感染，并使用可以與 MHC I類分子反應(yīng)的抗體進行染色。圖27示出了各種病毒變異體影響MHC I類分子表達的蛋白印跡實驗數(shù)據(jù)(圖中頂部所示)。對這些印跡進行掃描和定量分析，并將結(jié)果表示成相對于模擬感染的細(xì)胞的百分比(100%，圖中底部所示)。MDBK 細(xì)胞使用 BHV-1 GL576、GL756 Δ UL49. 5、GL756 Δ UL41、 GL756 Δ UL49. 5-Δ UL41、GL756 Δ Circ 或 GL756 Δ Us4 進行感染。圖觀示出了流式細(xì)胞儀測得的BHV-I病毒和各種BHV-I病毒變異體影響MHC II類分子在細(xì)胞表面表達的數(shù)據(jù)。結(jié)果被表示成相對于模擬感染的IFN-Y 處理過的細(xì)胞的百分比(100 % )。MDBK細(xì)胞使用BHV-1 GL576 (WT克隆體1584)、 GL756 Δ UL49. 5 (克隆體 1610)、GL756 Δ UL41 (克隆體 1606)、GL756 Δ UL41 (克隆體 1607)、GL756 Δ UL49. 5-AUL41(克隆體 1614)、GL756 Δ UL49. 5-AUL41(克隆體 1616)、 GL756ACirc(克隆體1697)或GL756 Δ化4 (克隆體1698)進行感染，并在4°C下培養(yǎng)30分鐘，然后在37°C下培養(yǎng)1小時，隨后再用IFN-Y進行處理。感染72小時后，使用對MHC II 類分子具有特異性的單克隆抗體CAT82A對細(xì)胞進行染色。陰性對照細(xì)胞不進行染色。圖四示出了流式細(xì)胞儀測得的各種BHV-1病毒突變體影響MHC II類分子在細(xì)胞表面表達的數(shù)據(jù)。結(jié)果表示為MHC II類分子表達的百分比恢復(fù)率(也就是將 GL756感染的細(xì)胞中的MHC II類分子水平假定為0，將MHC II類分子恢復(fù)到模擬感染的細(xì)胞中的水平假定為100)。IFN-Y處理過的MDBK細(xì)胞使用BHV-1 GL576(WT克隆體 1584)、GL756 Δ UL49. 5 (克隆體 1610)、GL756AUL41(克隆體 1606)、GL756AUL41(克隆體 1607)、GL756 Δ UL49. 5- Δ UL41 (克隆體 1614)、GL756 Δ UL49. 5- Δ UL41 (克隆體 1616)、 GL756ACirc(克隆體1697)或GL756 Δ化4 (克隆體1698)進行感染，然后使用可以與MHCII類分子反應(yīng)的抗體對其進行染色。圖30示出了一項研究數(shù)據(jù)，該研究是在第0天給予牛犢單獨的LkT抗原(LkT)，或者一起給予 LkT 和 BHV-I GL756 (GL756+LKT)，或者一起給予 LkT 和 GL756 Δ UL49. 5- Δ UL41 或GL756 Δ&4，并在第21天再次給予牛犢LkT (第21天單獨給予LkT)。在給藥的同一天收集牛犢的血清，并使用ELISA方法測定對LkT具有特異性的IgGl和IgG2抗體水平。數(shù)據(jù)結(jié)果表示成IgGl相對于IgG2的比例。誤差線表示SEM。圖31示出了另一項研究數(shù)據(jù)，該研究是在第0天給予牛犢LkT抗原和BHV-I GL756 (LKT+GL756)，或者給予 LkT 和 GL756 Δ UL49. 5- Δ UL41，或者給予 LkT 和 GL756 Δ Us4, 在第21天再次給予牛犢LkT (第21天單獨給予LkT)。在第23天收集牛犢的外周血。將血液樣品中的細(xì)胞與LkT抗原接觸，然后利用ELISA法測定樣品中的IL-2水平。
詳細(xì)描述已知BHV-I病毒會引起被感染宿主的免疫抑制。當(dāng)BHV-I作為疫苗給予宿主時， 它也會抑制或壓制宿主針對跟BHV-I —起給藥的免疫原的免疫應(yīng)答。本申請公開了一類 BHV-I病毒，本申請的BHV-I病毒對于宿主的免疫抑制要比正常野生型BHV-I病毒來的低。 此處公開的BHV-I病毒還可以減輕宿主針對跟BHV-I —起給藥免疫原的免疫應(yīng)答的抑制或壓制。在有些情況下，同單獨給藥的免疫原在宿主體內(nèi)所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答相比(沒有 BHV-1)，免疫原和本發(fā)明的BHV-I病毒共同給藥并未引起針對該免疫原的免疫應(yīng)答抑制。 在某些情況下，同單獨給藥的免疫原所引起的免疫應(yīng)答相比，免疫原和本發(fā)明的BHV-I病毒共同給藥時，還可以提高宿主針對該免疫原的免疫應(yīng)答。本申請還公開了含有本發(fā)明的 BHV-I病毒和其它免疫原的組合物。本申請還公開了一種使用本發(fā)明的BHV-I病毒在宿主體內(nèi)誘導(dǎo)針對BHV-I和其它免疫原的免疫應(yīng)答的方法，其中所述BHV-I病毒可以通過共同給藥的方式或者以聯(lián)合疫苗的方式給予宿主。除非特別指出，本發(fā)明的實施采用了常規(guī)的病毒學(xué)、微生物學(xué)、分子生物學(xué)、DNA重組技術(shù)，這些技術(shù)都屬于本領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)。這些技術(shù)已經(jīng)詳細(xì)記載在現(xiàn)有文獻中。所有本申請引用的專利、專利申請以及公開文獻，無論其引用在前面或后面，在此全部通過引用方式全文并入本申請以作參考。以下列出本發(fā)明所用術(shù)語的含義。
定義術(shù)語“疫苗組合物”和“疫苗”是指，用于刺激動物產(chǎn)生免疫應(yīng)答從而減輕現(xiàn)有損害或者是保護動物免受進一步損害的藥劑。術(shù)語“共同給藥疫苗”是指，在基本相同的時間給藥但是做成不同制劑的疫苗。此處所用的基本相同的時間可以是在第一種藥劑給藥后的第五天之內(nèi)的任意時間。術(shù)語“聯(lián)合疫苗”或“多價疫苗”是指，可以刺激宿主產(chǎn)生針對多種病原體的免疫應(yīng)答的疫苗，該疫苗使用了多種免疫原來生產(chǎn)并以一種藥劑形式給藥。術(shù)語“雙鏈DNA分子”是指，處在正常的雙鏈螺旋結(jié)構(gòu)的脫氧核糖核苷酸(腺嘌呤， 鳥嘌呤，胸腺嘧啶，胞嘧啶)的聚合物形式。該術(shù)語僅指分子的一級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)，而并不將其限定在任何特定的三級結(jié)構(gòu)形式。因此，該術(shù)語包括現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的線性DNA分子(例如限制性片段)、病毒、質(zhì)粒和染色體中的雙鏈DNA及其它。在討論特定雙鏈DNA分子結(jié)構(gòu)時， 序列采用常規(guī)方式進行表示，也就是只給出沿著DNA非轉(zhuǎn)錄鏈5'到3'方向的序列(也就與mRNA具有同源序列的鏈)。術(shù)語DNA“編碼序列”是指，在適當(dāng)?shù)恼{(diào)控序列控制下可以轉(zhuǎn)錄和翻譯成多肽的DNA序列。編碼序列的邊界由位于5'(氨基)末端的起始密碼子和位于3'(羧基)末端的翻譯終止密碼子來確定。編碼序列可以包括但不限于，原核生物的序列，來自真核生物mRNA 的cDNA，來自真核生物(例如哺乳動物)DNA的染色體DNA序列，以及合成的DNA序列。編碼序列的3'末端通常帶有多腺苷酸化信號和轉(zhuǎn)錄終止序列。當(dāng)多核苷酸在其天然狀態(tài)下或者通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法進行操控后可以被轉(zhuǎn)錄和/或翻譯從而生成編碼多肽和/或多肽片段的mRNA時，該多核苷酸被稱為“編碼”多肽。反義鏈?zhǔn)窃摵怂岬幕パa序列，從反義鏈中可以推斷出編碼序列。 術(shù)語“調(diào)控序列，，是指，啟動子序列、核糖體結(jié)合位點、多腺苷酸化信號、轉(zhuǎn)錄終止序列、上游調(diào)控區(qū)、增強子以及類似序列的統(tǒng)稱，它們共同調(diào)控宿主細(xì)胞中編碼序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯。術(shù)語“重組核苷酸”是指，非天然存在的核苷酸或者是通過人工組合序列中兩個分離的片段后獲得的核苷酸。這種人工組合通常通過化學(xué)合成的方法來完成，或者通過對分離的核苷酸片段進行人工操控來完成，例如基因工程技術(shù)?？梢允褂镁幋a相同氨基酸或者保守氨基酸的冗余密碼子來替換某一密碼子，通常還可以引入或去除某序列識別位點。或者，也可以將具有期望功能的核苷酸片段連接起來以產(chǎn)生具有期望功能的組合。本申請中， “分離的多肽”是指由分離的以及經(jīng)過操控的基因序列產(chǎn)生的表達產(chǎn)物，甚至可以是在同源細(xì)胞中表達的多肽產(chǎn)物。通過合成方法獲得的分子或者通過異源細(xì)胞表達獲得的分子在本質(zhì)上都是分離的分子。術(shù)語“重組多肽”是指通過重組DNA技術(shù)或者重組核苷酸產(chǎn)生的多肽，也就是通過被編碼期望的多肽的外源DNA構(gòu)建體修飾過的細(xì)胞生產(chǎn)獲得的多肽。術(shù)語“啟動子序列”或“啟動子”是指，能夠結(jié)合細(xì)胞中的RNA聚合酶并啟動下游 (3'方向)編碼序列轉(zhuǎn)錄的DNA調(diào)節(jié)區(qū)域。為定義本發(fā)明之目的，啟動子序列起始于3'末端編碼序列的翻譯起始密碼子(ATG)并向上游(5'方向)延伸直到包含啟動和適當(dāng)調(diào)節(jié)可檢測水平的轉(zhuǎn)錄所必須的最小數(shù)量的堿基或元件。啟動子序列中具有轉(zhuǎn)錄起始位點以及用于結(jié)合RNA聚合酶的蛋白結(jié)合區(qū)域。真核生物啟動子通常但并非總是含有“TATA”盒和 “CAT”盒。原核生物啟動子除了含有-10和-35保守序列外，還可以含有Siine-Dalgarno 序列。術(shù)語“可操作地連接”是指組份的連接，其中所述組份之間的連接能夠使它們以預(yù)期方式起作用。例如，如果啟動子影響到了編碼序列的轉(zhuǎn)錄或表達，那么可以將啟動子可操作地連接到編碼序列。除非特別指出外，否則兩個DNA或多肽序列“基本上同源”是指在分子中確定的一段長度中，兩個DNA或多肽序列的氨基酸匹配率至少為約85% (優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少約95% )。可以通過Southern雜化實驗來確定DNA序列是否基本上同源，例如在適用于特定系統(tǒng)的嚴(yán)格條件下進行Southern雜化實驗。確定適當(dāng)?shù)碾s化條件屬于本領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)。術(shù)語“功能相當(dāng)”是指，編碼蛋白的氨基酸序列所引起的生物應(yīng)答與特定免疫原或蛋白所引起的生物應(yīng)答相當(dāng)，所述特定免疫原或蛋白通常是天然蛋白。在有些情況中，該生物應(yīng)答是免疫應(yīng)答。在有些情況中，該生物應(yīng)答是指編碼蛋白在宿主體內(nèi)抑制免疫應(yīng)答的能力。術(shù)語“非功能相當(dāng)”是指與天然蛋白調(diào)控的的生物應(yīng)答不相當(dāng)?shù)纳飸?yīng)答。此外，如果基因序列編碼相同的多肽或者編碼的多肽自身是功能相當(dāng)?shù)?，則這些基因被稱為功能相當(dāng)?shù)?。術(shù)語“多肽”作最廣義理解，也就是任何通過肽鍵連接的氨基酸聚合物(二肽或更多肽)。因此，術(shù)語“多肽”包括蛋白、寡肽、蛋白片段、類似物、突變蛋白、融合蛋白及類似物。術(shù)語“糖蛋白”是指糖基化的多肽。術(shù)語“天然的”蛋白或多肽是指，與野生型BHV-I蛋白或其片段具有相同序列的蛋白或多肽。術(shù)語“天然的”基因是指，與野生型BHV-I中發(fā)現(xiàn)的基因或片段具有相同核苷酸序列的基因。此處所用的基因“修飾”是指，編碼BHV-I蛋白的基因或其片段的核苷酸序列的突變、替換或刪除，基因修飾的結(jié)果是產(chǎn)生與原型BHV-I蛋白非功能相當(dāng)?shù)腂HV-I蛋白?；虮蝗縿h除或部分刪除也被認(rèn)為是一種修飾。被完全刪除的基因通常不能編碼蛋白。被部分刪除的基因可以編碼修飾的蛋白。基因修飾也包括在基因中插入一個或多個序列。基因修飾可以包括各個類型的修飾或者突變的組合。在一個實施例中，可以刪除基因的一部分， 并在原刪除位置處插入其它序列或者在基因的其它位置處插入其它序列。蛋白質(zhì)序列也可以被修飾。修飾的蛋白質(zhì)可以通過用修飾的基因來編碼獲得。與未修飾過的蛋白質(zhì)或天然蛋白質(zhì)相比，修飾的蛋白質(zhì)通常具有不同的氨基酸序列。在有些情況中，修飾的蛋白質(zhì)與天然蛋白質(zhì)具有不同的功能。在這種情況下，與原型BHV-I相比， 修飾的蛋白質(zhì)屬于非功能相當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)。與原型BHV-I相比，修飾的蛋白質(zhì)可以含有氨基酸突變、替換或刪除。在特定的實施方式中，對基因或蛋白質(zhì)進行修飾從而產(chǎn)生與野生型的基因或蛋白質(zhì)非功能相當(dāng)?shù)牡鞍?。修飾基因或蛋白的技術(shù)屬于本領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)，例如基因刪除構(gòu)建體和細(xì)菌人工染色體(BACs)，但本發(fā)明又并不局限于這些技術(shù)。本發(fā)明可以使用任何修飾本發(fā)明的基因或蛋白質(zhì)序列的方法。例如，可以使用任何可以產(chǎn)生非功能相當(dāng)?shù)鞍椎男揎椉夹g(shù)?；蛐揎椧部梢园ú皇轻槍蚓幋a序列而是針對影響基因表達水平的調(diào)節(jié)序列而進行的改變。在一個實施例中，這種類型的修飾可以降低基因表達水平。就本發(fā)明而言，針對特定基因所進行的修飾的類型部分取決于編碼蛋白的功能。 在一個實施例中，特定BHV-I基因編碼的蛋白被認(rèn)為可能是抑制了宿主針對跟BHV-I —起給藥的抗原的免疫應(yīng)答。因此，人們希望將該基因刪除(例如完全刪除該基因)從而使得不會出現(xiàn)由該基因表達的蛋白質(zhì)。但是當(dāng)由該特定的BHV-I基因編碼的蛋白缺失時，BHV-I 也會因為毒性太強而無法用作疫苗株。出現(xiàn)這種結(jié)果的一個原因可能是，由該特定的BHV-I 基因編碼的蛋白是可以部分引起宿主體內(nèi)強免疫應(yīng)答的強免疫原。病毒缺失該蛋白會導(dǎo)致宿主無法產(chǎn)生足夠的免疫應(yīng)答來抵御感染性病毒的侵入。宿主可能會感染疾病或者遭受其它有害的副作用。解決該問題的一個潛在方案是對特定的BHV-I基因進行修飾，從而使編碼的蛋白仍具有免疫原性但又不至于對宿主的免疫應(yīng)答產(chǎn)生抑制作用。通過該方法可以使宿主仍能產(chǎn)生抵御感染性BHV-I病毒入侵所需的足夠的免疫應(yīng)答能力，同時又能消除蛋白抑制宿主免疫應(yīng)答的能力。當(dāng)然還可以使用其它方案來解決這個問題，這些方案中涉及的 BHV-I基因修飾并非全部針對那些抑制宿主免疫系統(tǒng)的基因。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何鑒別和解決這些問題及其類似的問題。此處所用的術(shù)語“MHC相關(guān)蛋白”是指，任何直接參與通過MHC I類或者MHC II類分子進行抗原加工和呈遞過程的蛋白質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知這些蛋白。因此MHC相關(guān)蛋白質(zhì)不僅指MHC分子，還包括但不限于那些參與將抗原傳遞給MHC I類呈遞的蛋白，例如與宿主動物中的抗原加工(TAP)蛋白相關(guān)的傳遞子。術(shù)語“標(biāo)記基因”是指，可以被用來區(qū)分被感染的動物與免疫的動物的基因。此處所用的標(biāo)記基因與野生型的基因的區(qū)別可以通過診斷實驗方法來進行測定。標(biāo)記疫苗是指含有至少一個標(biāo)記基因的疫苗。在本發(fā)明的一個實施方式中，標(biāo)記基因是BHV-I UL49.5， BHV-I UL4LBHV-I Us4或BHV-I Circ。在其它的實施方式中，標(biāo)記基因可以是BHV-I Us80 如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，疫苗中的標(biāo)記基因可以被用作DIVA(區(qū)分感染的動物與免疫的動物)疫苗。在一個實施例中，可以設(shè)計和使用一種診斷實驗方法來區(qū)分給藥用的BHV-I疫苗(DIVA疫苗)和天然感染宿主的BHV-I。術(shù)語BHV-I蛋白或基因的“突變體類似物”在此是指，與野生型的BHV-I蛋白具有一個或多個不同氨基酸序列修飾的蛋白或者與野生型的BHV-I基因具有一個或多個核苷酸序列修飾的基因。術(shù)語“宿主”是指可以天然感染BHV-I病毒的動物。因此，宿主期望獲得針對BHV-I 感染的免疫，不管該宿主是否已經(jīng)被BHV-I感染還是隨后將被BHV-I感染。宿主通常是有蹄類動物。有蹄類動物宿主可以是包括任何品種任何年齡的牛。牛宿主包括牛犢和成年的牛，并且還包括食用牛、公牛、小母牛、奶牛和牛犢。牛也可以包括處在懷孕期和哺乳期的牛。本發(fā)明還可以應(yīng)用在獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。在一些實施方式中，本發(fā)明的組合物和疫苗不給予懷孕的、新生期的或三月齡以下的宿主。在特定的實施方式中，將本發(fā)明的組合物和疫苗給予一月齡左右的宿主。在另一個具體實施方式
中，將本發(fā)明的組合物和疫苗給予懷孕的動物。在這些實施方式中，給予組合物和疫苗是為了避免胎兒感染。在其它具體實施方式
中， 在宿主繁殖后的近30天內(nèi)，不會對宿主給予本發(fā)明的組合物和疫苗。術(shù)語“抗原”是指含有一個或多個表位的分子，其中所述表位可以刺激宿主免疫系統(tǒng)以使其產(chǎn)生分泌的體液介導(dǎo)和/或細(xì)胞介導(dǎo)的抗原特異性應(yīng)答。術(shù)語抗原和“免疫原” 可以相互替換使用。特定的抗原可以是蛋白質(zhì)、多糖、脂多糖、脂肽或其它分子；或者可以是以上任意的組合?？乖部梢允瞧渌慕M合。特定地，特定抗原可以包括天然蛋白質(zhì)或其片段，或者包括合成的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段或多肽片段；也可以包括糖蛋白、糖肽、脂蛋白、 脂肽、核蛋白質(zhì)、核多肽；也可以包括多肽與多肽的綴合物；或者也可以包括重組核酸表達產(chǎn)物?？乖姆窍薅ㄐ詫嵗ǖ幌抻?，那些能夠誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生針對病毒性的牛皰疹病毒、牛呼吸道病毒、牛病毒性腹瀉病毒、牛冠狀病毒以及通常與“船運熱”相關(guān)的細(xì)菌菌株的免疫應(yīng)答的抗原。術(shù)語“免疫原的有效量”是指，能夠誘導(dǎo)明顯的體液分泌和/或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的免疫原的量。所用免疫原的合適量取決于特定的免疫原，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是公知的。術(shù)語“表位”是指，免疫原或半抗原上結(jié)合特定的抗體分子或被T細(xì)胞識別的位點。術(shù)語表位可以與“抗原決定簇”或“抗原決定位點，，替換使用。術(shù)語“免疫應(yīng)答”是指個體中細(xì)胞和/或抗體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的過程。該應(yīng)答通常包括但不限于一種或多種以下作用產(chǎn)生抗體，產(chǎn)生B細(xì)胞，產(chǎn)生輔助T細(xì)胞，產(chǎn)生抑制性T 細(xì)胞，和/或產(chǎn)生細(xì)胞毒T細(xì)胞和/或產(chǎn)生γ δ T細(xì)胞，其中所產(chǎn)生的這些抗體和細(xì)胞可以特異性地作用于組合物或疫苗中所包含的目標(biāo)抗原。有很多成分都可以引起免疫應(yīng)答，例如前面所提到的B細(xì)胞和T細(xì)胞等?？梢酝ㄟ^檢測這些成分來推測是否出現(xiàn)了或改變了體液的免疫應(yīng)答、細(xì)胞的免疫應(yīng)答或者兩者組合的免疫或其它免疫應(yīng)答。例如，體液免疫應(yīng)答或細(xì)胞免疫應(yīng)答可以分別通過特定的抗體或者抗原抗異性的細(xì)胞毒T細(xì)胞的形式來進行， 它們可以被許多成分所影響。一種可能的影響成分是，在抗原呈遞細(xì)胞(APCs)或其它細(xì)胞的表面MHC I類和/或MHC II類分子的作用下，將特定表位“呈遞”給位于T細(xì)胞的能力。 因此，MHC I類分子和/或MHC II類分子的存在或其水平可以表明有機體引發(fā)特定類型免疫應(yīng)答的能力。并且，MHC I類分子和/或MHC II類分子的水平隨著時間所發(fā)生的變化或在不同情形下所發(fā)生的變化可以用來推斷是否存在或可能存在特定類型的免疫應(yīng)答。另外一種免疫應(yīng)答的成分具有使抗原刺激產(chǎn)生二次免疫應(yīng)答或“喚醒”初次免疫應(yīng)答的能力，其中所述抗原已經(jīng)被呈遞給了有機體的免疫系統(tǒng)并且已經(jīng)刺激引發(fā)了初次免疫應(yīng)答。當(dāng)抗原被用作喚醒免疫應(yīng)答時，參與這個過程的免疫細(xì)胞可以分泌出各種細(xì)胞因子。在一個實例中，可以通過測定白細(xì)胞介素_2(IL-2)的變化來推斷免疫原是否喚醒了初次免疫應(yīng)答或者推斷喚醒的程度。免疫應(yīng)答的喚醒與IL-2的量成比例。關(guān)于體液免疫應(yīng)答，表明是否存在免疫應(yīng)答以及存在的免疫應(yīng)答是否可以抵御病原體的一個特征是，血清中對于病原體抗原具有特異性的抗體的水平。除了抗體水平外， 特定的抗體類別或抗體類別的組合，或者給定抗體類別情形下的抗體的特定亞類別或子類別，或者特定亞類別或子類別的組合或者組合中各類別的比例都是進行上述推斷非常有用的信息。在一個實施例中，血清可以含有IgG類別的不同子類別。子類別IgGl可以是中和特定抗原的抗體(因此被認(rèn)為具有保護作用)。子類別IgG2可以不是中和特定抗原的抗體 (所以被認(rèn)為不具有保護作用或者比IgGl子類別的保護作用弱)。因此在這個實施例中， 高比率的IgGl/IgG2(IgG對于特定抗原具有特異性)要比低比率的IgGl/IgG2顯示出更好的免疫應(yīng)答潛力。免疫應(yīng)答或者免疫應(yīng)答的成分通?？梢杂妹庖叻治龇椒▉頊y定。使用野生型的 BHV-I病毒感染或者用商業(yè)渠道可以獲得的BHV-I疫苗感染后，可以檢測到免疫應(yīng)答的增加。與使用商業(yè)渠道可以獲得的疫苗進行感染或者未經(jīng)感染的細(xì)胞中檢測到的結(jié)果相比， 可以檢測到免疫應(yīng)答的抑制。在一些實施方式中，通過評估MHC I類細(xì)胞表面表達的水平來確定免疫應(yīng)答的抑制。在其它實施方式中，通過評估MHC I類細(xì)胞的胞質(zhì)表達來確定免疫應(yīng)答的抑制，也可以同時評估或不評估其細(xì)胞表面的表達。在其它實施方式中，通過評估 MHC II類的表達來確定免疫應(yīng)答的抑制。在其它實施方式中，通過評估細(xì)胞因子或其它免疫應(yīng)答的指示因子來確定免疫應(yīng)答的抑制，例如測定宿主針對共同給藥的免疫原的免疫應(yīng)答的抑制，并以此作為指示因子。用于測定免疫應(yīng)答的方法以及免疫應(yīng)答成分在本領(lǐng)域中是已知的，但本發(fā)明又不局限于已知的這些技術(shù)。術(shù)語“免疫原性多肽”或“免疫原性氨基酸序列”分別是指，可以引發(fā)宿主產(chǎn)生中和病毒感染性的抗體和/或調(diào)節(jié)抗體補體或者調(diào)節(jié)抗體依賴的細(xì)胞毒或者調(diào)節(jié)細(xì)胞介異的免疫從而為免疫宿主提供保護的一類多肽或氨基酸序列。此處所用的“免疫原性多肽”， 包括插入蛋白的全長序列(或近全長序列)及其免疫原性片段。術(shù)語“免疫原性片段”是指一類多肽片段，該多肽片段包含一個或多個表位因此可以誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和病毒感染性的抗體和/或調(diào)節(jié)抗體補體或者調(diào)節(jié)抗體依賴的細(xì)胞毒或者調(diào)節(jié)細(xì)胞介異的免疫從而為免疫宿主提供保護。這些片段的長度至少為約5個氨基酸，在特定的實施方式中長度至少為約10至15個氨基酸。片段長度的上限并沒有特別的要求，其可以包含近乎蛋白序列的全長，或者甚至是包含兩個或多個亞單元抗原的融合蛋白。術(shù)語“治療”和“治療的”是指，給予個體可以預(yù)防感染或者再度感染BHV-I或者與其它免疫原有關(guān)的疾病的組合物(預(yù)防)，或者給予個體可以減輕或消除BHV-I或者與其它免疫原有關(guān)的疾病的癥狀的組合物(治療)。治療在此也指縮短BHV-I潛伏-再激活周期或者防止出現(xiàn)BHV-I潛伏-再激活周期，潛伏-再激活周期縮短是指相對于感染野生型 BHV-I后出現(xiàn)的潛伏-再激活周期而言，潛伏-再激活周期可以通過測定激活后的病毒脫落情況來測定。例如，如果初次感染期間或者潛伏期間在宿主動物的糞便中檢測出的BHV-I 脫落的量得到了減少或消除，則可以認(rèn)為動物宿主已經(jīng)得到了治療。如果檢測后發(fā)現(xiàn)可見脫落得到了減少或者傳染性病毒在扁桃體或者TG中的脫落得到了減少則可以認(rèn)為治療成功。術(shù)語“潛伏-再激活周期”是指BHV-I建立潛伏、維持潛伏以及再激活的過程。建立潛伏包括急性感染。維持潛伏是存續(xù)于宿主整個生命周期的階段，其可操作性的定義是使用標(biāo)準(zhǔn)的病毒分離手段不能再檢測出傳染性病毒的期間。術(shù)語“再激活”和“從潛伏期再激活”是指，在給予外源性的皮質(zhì)類固醇或者因為壓力引起天然皮質(zhì)類固醇水平的提高之后所導(dǎo)致的病毒再激活過程。免疫抑制也會刺激病毒基因的表達從而引起病毒再激活。一旦再激活，在傳感神經(jīng)元中可以檢測到大量的病毒基因表達，并且可以從三叉神經(jīng)節(jié)、眼睛分泌物和/或鼻子分泌物中分離出傳染性的BHV-I病毒。再激活期間，病毒重新回到初始的感染位置并從該處擴散到其它易受感染的宿主。這種從潛伏期再激活回來的能力會引起重新感染疾病和病毒的傳染。病毒已經(jīng)被“減毒”是指病毒株的致病性和/或毒性被減弱從而使得其可以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答但又不會引起特定的疾病。此處所用的修飾的活疫苗(MLV)是指，含有已經(jīng)被減毒的活病毒的疫苗。在一些實施方式中，本發(fā)明的疫苗可以被進一步減毒。被進一步減毒的病毒的一個實例是，與常規(guī)的減毒活病毒疫苗相比，減弱了該病毒引起宿主發(fā)熱、淋巴球減少、產(chǎn)奶下降、食物攝入下降、自然懷孕的母牛的流產(chǎn)以及未滿三日齡牛的致命的病毒血癥的能力。在特定的實施方式中，BHV-I病毒可以被進一步減毒。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的媒介物”是指與期望的給藥途徑相適應(yīng)的載體，該術(shù)語在此可以與“獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體”或“獸醫(yī)學(xué)上可接受的媒介物”相互替換使用。給藥途徑的實例包括，非腸道給藥，比如靜脈注射，皮內(nèi)注射，皮下注射，口服(比如吸入)，經(jīng)皮給藥(局部的)，透粘膜吸收，直腸給藥，以及其它的給藥方式。可用于非腸道給藥或者皮內(nèi)給藥或者皮下給藥的溶液或者懸浮液可以包含以下組份無菌的稀釋劑，比如注射用水、鹽水、非揮發(fā)性油、聚乙烯二醇類、甘油、丙二醇，或其它的合成溶劑；抗菌劑，比如芐醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，比如抗壞血酸、亞硫酸氫鈉；螯合劑，比如乙二胺四乙酸；緩沖溶液，比如醋酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽；調(diào)節(jié)滲透壓的試劑，比如氯化鈉或者葡萄糖。PH值可以用酸或堿進行調(diào)節(jié)，比如鹽酸或氫氧化鈉。非腸道給藥的制劑可以裝在玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或者多劑量小瓶中。術(shù)語“缺失修飾”或“缺失突變”包括至少有一個核苷酸缺失的基因序列，缺失通常發(fā)生在蛋白的開放閱讀框內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道在某些情況下，缺失突變可以包括點突變。在特定的實施方式中，缺失突變會引起修飾的核苷酸序列不表達某些蛋白。在其它具體實施方式
中，缺失突變?nèi)詴沟闷浔磉_蛋白但所表達的蛋白與野生型的蛋白非功能相當(dāng)。在一些實施方式中，缺失突變包括刪除整個基因序列。這樣的缺失突變可以稱作完全缺失。在其它實施方式中，缺失突變包括至少缺失小于1^,1^-5^,5% -10%基因序列， 或者缺失更多基因序列。這樣的缺失突變可以被稱為部分缺失。在特定的實施方式中，缺失可以是點缺失，所述點缺失是指單個核苷酸的缺失。缺失修飾或缺失突變也可以包括多于一個核苷酸的缺失?！皥蟾婊颉笔侵?，除了天然地可操控地連接有引物的編碼序列之外的任何可以檢測或者測定出其表達的序列。報告基因通常與可以檢測到其內(nèi)啟動子活性的細(xì)胞是異源的。報告基因的實例包括但不限于，編碼綠色熒光蛋白(或任何其它熒光標(biāo)記物)的基因，編碼氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶(cat)的基因，編碼葡萄糖苷酸酶(gus)的基因，編碼半乳糖苷酶(IacZ)的基因，編碼熒光素酶的基因，以及編碼其它類似物的基因。報告基因的表達可以通過許多常規(guī)方法進行檢測，優(yōu)選的方法取決于許多因素例如報告基因的性質(zhì)與功能。分析報告基因表達的合適方法通常包括，例如⑴分析報告基因產(chǎn)物的功能(比如檢測報告基因產(chǎn)物所催化的酶促反應(yīng))；(ii)分析報告基因所表達的蛋白水平(比如通過 SDS-PAGE凝膠電泳方法進行分析，或者通過使用可以與報告基因產(chǎn)物特異性結(jié)合的抗體 (比如單克隆抗體或多克隆抗體)來進行免疫測定；以及(iii)測量報告基因轉(zhuǎn)錄的mRNA 的水平。本發(fā)明還包括通過高通量篩選測試化合物的分析方法。在一個實施例中，可以在白光下通過可視的綠色熒光來檢測GFP或者EGFP的表達。
修飾的BHV-I病毒廣義地來說，本發(fā)明的許多實施方式都包括了對BHV-I基因進行修飾后所獲得的修飾的活BHV-I疫苗病毒，從而可以防止或者減少用野生型BHV-I或者疫苗病毒進行感染后所出現(xiàn)的宿主免疫抑制的現(xiàn)象。在一個實施例中，BHV-I修飾可以使獲得的病毒不會或者減少其對于跟BHV-I —起給藥的免疫原所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答抑制。在另一個實施例中，BHV-I 修飾后所產(chǎn)生的病毒當(dāng)它與其它非BHV-I免疫原共同給藥后可以使得所述的其它免疫原所引起的免疫應(yīng)答要比其單獨給藥(沒有BHV-1)所引起的免疫應(yīng)答來的更強。本發(fā)明所使用的BHV-I病毒通常是活病毒。該病毒可以是被減毒的或者未經(jīng)減毒的。在特定的實施方式中，可以使用修飾過的滅活病毒。本發(fā)明也提供了一種減輕宿主針對共同給藥的和/或以聯(lián)合疫苗形式給藥的其它免疫原應(yīng)答所存在的免疫抑制的方法。本發(fā)明也提供了一種使用本發(fā)明創(chuàng)造性的疫苗來治療宿主動物的方法。本發(fā)明提供了一類含有修飾的BHV-I基因的組合物和疫苗，其中所述的基因經(jīng)過修飾從而使得可以治療牛皰疹病毒感染期間出現(xiàn)的宿主免疫應(yīng)答的抑制，和/或減輕宿主針對共同給藥的和/或以聯(lián)合疫苗形式給藥的其它免疫原應(yīng)答的免疫抑制。在多數(shù)實施方式中，本發(fā)明包括用于治療BHV-1. 1和BHV-1. 2亞型的疫苗。本發(fā)明也包括了使用本發(fā)明提供的疫苗的方法。并非所有，但很多具有抑制免疫系統(tǒng)活性的BHV-I基因都具有可以使其被容易識別的細(xì)胞同源性。在特定的實施方式中，基因修飾發(fā)生在參與MHC免疫原處理和遞呈的基因上。MHC I類分子是分布在所有脊椎動物有核細(xì)胞中的抗原呈遞分子，而MHC II類分子是主要分布在巨噬細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的抗原呈遞分子。修飾可以發(fā)生在涉及MHC I類分子和MHC II類分子功能的基因上。在許多實施方式中，修飾的BHV-I基因是編碼一類特定蛋白的基因，該蛋白會引起宿主MHC相關(guān)蛋白的下調(diào)，和/或該蛋白會通過避開宿主免疫系統(tǒng)的方式來避開宿主針對病毒的免疫應(yīng)答。這種類型的基因的實例包括BHV-1 UL49. 5 (SEQ ID NO. :1)，BHV-I UL41 (SEQ ID NO. :3)，以及 BHV-I Circ (SEQ ID NO. :5)。在另一些實施方式中，修飾的基因所編碼的蛋白可以通過調(diào)節(jié)補體、作用于細(xì)胞生長和/或影響干擾素的表達來抑制免疫功能。BHV-I Us4(SEQ ID NO. :11)被認(rèn)為是通過其作為趨化因子結(jié)合蛋白的功能來實現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)。BHV-I UL49. 5基因編碼的蛋白與所有已知的皰疹病毒中發(fā)現(xiàn)的高度保守的糖蛋白(gN)具有同源性。gN參與了細(xì)胞表面上MHC I類的下調(diào)，從而可以使BHV-I避開抗原遞呈以及宿主免疫系統(tǒng)的激活。Lipinska等人，(2006) J. Virol. 80 :5822對BHV-1 UL49. 5 基因進行了詳細(xì)描述，該文獻在此通過引用方式并入本申請以作參考。BHV-I UL41基因編碼的蛋白與被膜宿主關(guān)閉蛋白(tegument host shutoff protein)或病毒宿主關(guān)閉蛋白(virion host shutoff,vhs)同源。被膜宿主關(guān)閉蛋白似乎通過下調(diào)MHC I類mRNA的方式參與了免疫抑制。Gopinath等人Q002) Viral Immun. 15 595記載了 BHV-I UL49. 5基因的修飾。BHV-I Circ基因編碼的蛋白與馬立克氏被膜蛋白(myristylated tegument protein)同源。BHV-1馬立克氏被膜蛋白似乎下調(diào)了 MHC II類分子的表達。ktiwyzer等人，(2002) Vet. Microbiol. 86 :165 中記載了該基因。BHV-1 Us4基因編碼的蛋白與糖蛋白(g)G同源，該糖蛋白是一類趨化因子結(jié)合蛋白。Bryant 等人，(2003)EMBO J. 22 :833 記載了 Us4 基因。BHV-1 Us9基因編碼的蛋白似乎參與了潛伏-再激活期間從三叉神經(jīng)節(jié)到鼻部的順向輸運過程。BHV-1 LR-ORF 1和2基因或者潛伏相關(guān)的ORF基因被認(rèn)為參與了潛伏感染的發(fā)展過程以及病毒在三叉神經(jīng)節(jié)的寄居。BHV-1 UsS基因編碼的蛋白與糖蛋白(g)E同源，該糖蛋白被仍為對IgG介導(dǎo)的免疫應(yīng)答具有抑制作用。在此應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的公開內(nèi)容包括了所有前面提到的基因的修飾。在一個實施方式中，修飾的BHV-I病毒可以含有單個基因的修飾。在其它的實施方式中，修飾的BHV-I病毒可以含有兩個、三個、四個或者甚至更多個不同基因的修飾。在許多實施方式中，同時對參與細(xì)胞調(diào)亡的基因和參與MHC處理的基因進行修飾，在其它非限定性的實施方式中，針對通過誘導(dǎo)或者抑制細(xì)胞凋亡或者程序性細(xì)胞死亡的方式來抑制免疫應(yīng)答的基因進行修飾。作為非限制性的實施例，修飾可以發(fā)生在UL49. 5和LR-ORF KSEQ ID N0. 7)上。在其它實施方式中，修飾可以發(fā)生在UL49. 5、Us4和LR-ORF 1上，或者僅在UL49. 5和Us4上。在另一個實施方式中，修飾可以發(fā)生在UL49. 5和UL41上。應(yīng)當(dāng)理解，這些實施方式僅是示例性的，本發(fā)明同樣包括了免疫抑制基因的各種不同組合。在特定的實施方式中，可以根據(jù)修飾的基因在刺激免疫應(yīng)答方面的協(xié)同作用能力來選擇不同的組合。在特定的實施方式中，組合物和疫苗含有至少一個修飾的BHV-1 UL49. 5, BHV-I Us4,BHV-1 UL41，和/或BHV-1 Circ0這些修飾的基因通常被認(rèn)為可以減輕免疫抑制。在有些實施方式中，所有這四種基因都經(jīng)過修飾。在其它實施方式中，可以是一種、兩種或三種基因被經(jīng)過修飾。這些基因可以是任何組合的修飾。作為非限定性的實施例，組合物或疫苗中可以有兩個基因經(jīng)過修飾，這些修飾的基因可以是BHV-I UL49. 5和BHV-141，UL49. 5 和h4，UL41和Us4，以及BHV-I Circ和BHV-I UL49. 5。在包括對具有減輕免疫抑制反應(yīng)活性的基因進行修飾的實施方式中，修飾也可以發(fā)生在BHV-I LR-ORF 1和2 (SEQ ID NO. 9) 以及BHV-I Us9 (SEQ ID NO. : 13)。反之，組合物和疫苗也可以包含僅發(fā)生在BHV-I LR-ORFl 和2，和/或BHV-I Us9的修飾。應(yīng)當(dāng)理解，修飾可以發(fā)生在BHV-I LR-ORFl或2或BHV-I Us9。BHV-I LR-ORFl和2以及BHV-I Us9被認(rèn)為可以預(yù)防/減少BHV-I的潛伏或者BHV-I 的脫落。在其它的實施方式中，可以將標(biāo)記基因和具有免疫抑制活性的基因和/或具有預(yù)防/減少BHV-I潛伏和脫落活性的基因一起進行修飾，或者將標(biāo)記基因同時與具有免疫抑制和潛伏的基因一起進行修飾。標(biāo)記基因可以是BHV-I Us8 (SEQ ID NO. :15)。在一個實施方式中，疫苗可以包含對參與免疫抑制的基因進行的三個修飾，對參與潛伏的基因進行的兩個修飾，以及一個標(biāo)記基因。對于修飾基因組合的唯一限定條件是要求其所產(chǎn)生的免疫原必須同時與動物和疫苗制劑具有相容性。本發(fā)明所涉及到的制備和評估修飾的基因和蛋白的方法屬于本領(lǐng)域的公知技術(shù)。 修飾技術(shù)的非限定性實例包括，通過DNA序列的修飾使得(1) 一個或多個氨基酸被其它氨基酸取代，例如被具有不同功能的非等同殘基替換，比如用天冬氨酸替代天冬酰胺；被具有相同功能但卻有不同的一級、二級或三級結(jié)構(gòu)的殘基替換，比如用谷氨酸替代天冬氨酸；被可以破壞環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸替換，比如脯氨酸替換；使用糖基化氨基酸替代非糖基化氨基酸及其類似物，或者反過來進行替換；用其它殘基替換半胱氨酸以破壞雙硫鍵橋構(gòu)型；以及 (2)增加或刪除一個或多個氨基酸從而使獲得的蛋白具有非等同的功能或結(jié)構(gòu)。一級結(jié)構(gòu)的改變包括疏水性和親水性的改變，二級結(jié)構(gòu)的改變包括蛋白局部折疊的改變，三級結(jié)構(gòu)的改變包括蛋白立體結(jié)構(gòu)的改變。在許多實施方式中，這些結(jié)構(gòu)的變化可以產(chǎn)生敲除蛋白 (knocked out proteins)或者產(chǎn)生與野生型的蛋白非功能等同的蛋白。在有些實施方式中，基因通過非MHC相關(guān)途徑引起免疫抑制反應(yīng)，例如Us4，UL41。 在其它非限定性的實施方式中，修飾可以發(fā)生在通過誘導(dǎo)或抑制細(xì)胞凋亡或者程序性的細(xì)胞死亡的方式來抑制免疫應(yīng)答的基因上。例如，當(dāng)細(xì)胞調(diào)亡發(fā)生在包括CD4+細(xì)胞在內(nèi)的白細(xì)胞亞群上時，宿主的免疫系統(tǒng)會被抑制。具有這種細(xì)胞調(diào)亡活化功能的基因包括， bICPO (Geiser等人，(2008)Microb. Pathog. 44 :459)。在有些實施方式中，修飾發(fā)生在編碼 bICPO (Jones等人，(2006) Vet. Microb. 113 199)的基因上。在其它實施方式中，修飾發(fā)生在與潛伏相關(guān)的基因上，例如BHV-I LR-ORF 1和2以及BHV-I Us49。其它非MHC相關(guān)的路徑可以包括例如BHV-I LR-ORF IiPBHV-I Us9基因的修飾。本發(fā)明包括了所有與BHV-I原型有關(guān)的不同實施方法。例如，BHV-I原型可以是 Cooper病毒株(野生型的)，或者反之，可以是通過商業(yè)渠道獲得的疫苗中所存在的病毒株例如BHV-I GL756。GL756是常規(guī)衍生的經(jīng)過修飾的活BHV-I病毒實例。其它常規(guī)衍生的經(jīng)過修飾的活BHV-I病毒已為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。這些示例性的病毒株不對本發(fā)明構(gòu)成任何限制，本發(fā)明的實施方式中可以使用任何可以感染宿主的BHV-I病毒株作為原型。在本發(fā)明的疫苗中，原型BHV-I通常是經(jīng)過減毒處理的病毒或者經(jīng)過修飾的活病毒。在特定實施方式中，原型BHV-I是滅活的病毒。在有些實施方式中，宿主免疫應(yīng)答的抑制可以通過與使用野生型BHV-I或者其它
18免疫原進行感染后檢測到的免疫應(yīng)答進行比較的方式來加以判斷。在可替換的實施方式中，宿主免疫應(yīng)答的抑制是通過與使用BHV-I GL756或者BHV-I Cooper病毒株感染后出現(xiàn)的免疫應(yīng)答進行比較的方式來加以判斷?，F(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)披露了許多檢測宿主免疫應(yīng)答的方法，例如酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISAs)，或者測定MHC表達的方法。在特定的實施方式中，本發(fā)明的組合物被置于適于在體內(nèi)產(chǎn)生含有修飾基因的 BHV-I的載體內(nèi)?？梢酝ㄟ^添加藥學(xué)上可接受的媒介物以及可選的佐劑將所述載體配制成疫苗組合物。這些的制劑屬于本領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)。合適的載體可以包括含有修飾基因的人工染色體構(gòu)建體。人工染色體的一個實例是細(xì)菌的人工染色體(BAC)，比如pBeloBACll或 PBAC108L ；參見 Shizuya 等人(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :8794 ；Wang 等人(1997) Biotechniques 23 :992。可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法來組裝人工染色體構(gòu)建體的各組份。例如，可以通過共傳染細(xì)胞的方式將修飾的BHV-I基因插入到人工修飾的染色體中，包括將(i)含有人工染色體的構(gòu)建體細(xì)胞，其中所述人工染色體的側(cè)翼具有與BHV-I染色體區(qū)域同源的序列，和(ii)含有BHV-I基因的細(xì)胞共轉(zhuǎn)染，從而使得在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生重組進而產(chǎn)生獲得含有人工染色體的重組病毒。從經(jīng)過共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中可以分離得到重組的BHV-1，其中所述經(jīng)過共傳染的細(xì)胞是指其細(xì)胞內(nèi)的人工染色體構(gòu)建體和BHV-I已經(jīng)進行了共轉(zhuǎn)染并通過同源重組的方式產(chǎn)生了重組病毒，分離得到的BHV-I病毒可以被操控用來產(chǎn)生期望的BHV-I修飾基因。也可以通過直接克隆方法來組裝人工染色體的各組份，所述直接克隆使用了 BHV-I 染色體和人工染色體上的獨特位點。有關(guān)插入有外源基因的人工染色體的實例可以參見美國專利公開第2004-0171569號，該文獻在此通過引用方式并入本申請以作參考。在本發(fā)明疫苗的具體實施方式
中，通過將人工染色體引入到細(xì)胞的方法所獲得的重組BHV-I病毒不會殺死細(xì)胞。本發(fā)明實施例5和6記載了將特定的修飾的BHV-I基因引入到活性病毒中的實例。
制劑本發(fā)明所公開的免疫組合物和疫苗可以包含一種或多種獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體。 這些獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體可以包括溶劑、分散媒介、涂層、佐劑、穩(wěn)定劑、稀釋劑、抗菌劑、 殺真菌劑、等滲劑、吸附劑、延緩劑及其它類似物。此處所用的獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體和藥學(xué)上可接受的載體可以互相替換使用。稀釋劑可以包括水、鹽水、葡萄糖、乙醇、甘油及類似物。等滲劑可以包括氯化鈉、 葡萄糖、甘露醇、山梨糖醇、乳糖等。穩(wěn)定劑包括白蛋白等。適于非腸道注射用的藥學(xué)上可接受的媒介物，通常是無毒的并且是沒有治療活性的。這些媒介物的實例是水、鹽水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和Hanks液。非水的媒介物，例如是非揮發(fā)性的油、麻油、油酸乙酯，或者也可以使用甘油三酯。非腸道給藥用的媒介物可以是含有粘性增強劑的懸浮液，例如羥甲基纖維素鈉、山梨糖醇、葡聚糖。媒介物也可以含有少量的添加劑，例如增強等滲性和化學(xué)穩(wěn)定性的物質(zhì)，比如緩沖溶液和防腐劑。緩沖溶液的實例包括磷酸緩沖液、碳酸氫鹽緩沖液、三羥基甲基氨基甲烷緩沖液，而防腐劑實例例如硫柳汞、間甲酚或鄰甲酚、福爾馬林、苯甲醇。標(biāo)準(zhǔn)的制劑是可注射的液體或固體，如果是固體則該固體可以在適宜的液體中形成可用于注射的懸浮液或溶液。因此，在非液體制劑中， 媒介物可以包括葡萄糖、人血清白蛋白、防腐劑等，在給藥之前可以加入適量的無菌水或生理鹽水。
本發(fā)明可以使用任何藥學(xué)上可接受的水溶性物質(zhì)或者其混合物。藥學(xué)上可接受的水溶性物質(zhì)可以包括一種或多種單糖、二糖、多糖或碳水化合物。它們的實施例包括右旋葡萄糖、甘露醇、果糖、多聚果糖、聚葡萄糖、糊精、葡萄糖、轉(zhuǎn)化糖、乳糖醇、乳糖、異麥芽酮糖醇、麥芽糖醇、麥芽糖、麥芽糖糊精、山梨糖醇、木糖醇、蔗糖、三氯蔗糖、甘露糖、半乳糖、 木糖、阿拉伯糖、果糖、氨基葡萄糖、半乳糖胺、鼠李糖、6-0-甲基-D-半乳糖、2-0-丙酮醇基- β -D-木糖、2-乙酰氨基-2- 二羥基- β -D-半乳糖-4-硫酸鹽、N-乙酰葡糖胺、艾杜糖醛酸、單糖醛酸、甲基半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖、α -D-吡喃甘露糖，以及一個或多個單糖或二糖單元通過共價鍵結(jié)合形成的生物大分子。碳水化合物的實例包括藻蛋白酸鹽、 淀粉糖、纖維素、角叉(菜)膠、果膠。為了方便，單糖、二糖、多糖、碳水化合物可以統(tǒng)稱為 “糖”。本發(fā)明也可以使用其它本領(lǐng)域已知的藥學(xué)上可接受的物質(zhì)。本發(fā)明的疫苗制劑也可以使用本領(lǐng)域中公知的各種佐劑。佐劑可以包括但不限于礦物膠，如氫氧化鋁；表面活性劑，如溶血卵磷脂；糖苷，例如皂角苷衍生物比如Quil A或GPI-0100 ；復(fù)合多元醇；多聚陰離子；菲離子型嵌段聚合物，如Pluronic通 F-127 (B. Α. S. F.，USA)；多肽；礦物油例如 Montanide ISA-50、聚羥乙烯、Amphigen 、Amphigen . 、Mark I (Hydronics, USA) > Alhydrogel (BSA2 ；Accurate Scientific, Westbury，NY)，油乳劑例如礦物油的乳劑，比如BayolF/Arlacel A和水，或者植物油的乳劑，或者水和乳化劑如卵磷脂形成的乳劑；明礬；牛細(xì)胞因子；膽固醇；以及各種佐劑的組合。其它油乳劑還包括在油包水乳劑，以及油包水水包油乳劑。本發(fā)明還可以使用其它具有免疫刺激或免疫調(diào)節(jié)或抗原呈遞的性質(zhì)的佐劑或試劑，以及其它通過商業(yè)渠道可以獲得的如 Impran (Boehringer Ingelheim Vetmedica, St. Joseph, MO), Emunade (Schering-Plough Animal Health,Summit,NJ),MetaStim (Fort Dodge Animal Health, Overland Park, KS)禾口 / 或 Emulsigen (MVP Laboratories, Inc. , Omaha, NE)等產(chǎn)品。 本發(fā)明也可以使用Emulsigen D。在多數(shù)實施方式中，只要不與Beef Quality Assurance 抵觸的佐劑的類型都可以不受限制的加以使用。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定本發(fā)明中佐劑和添加劑的用量和濃度。佐劑的使用方式取決于本發(fā)明疫苗的給藥方式。例如，當(dāng)本發(fā)明的BHV-I病毒與其它非BHV-I免疫原共同給藥時(例如BHV-I在宿主的一個部位給藥，而其它免疫原在宿主的另一個部位給藥)，則佐劑可以與其它免疫原一起給藥，而不與BHV-I —起給藥。在其它實施例中，佐劑可以與BHV-I—起給藥，而不與其它免疫原一起給藥。佐劑也可以同時與 BHV-I和其它免疫原一起給藥或者都不給予佐劑(例如當(dāng)BHV-I和非BHV-I免疫原以多價疫苗組合物形式給藥時)。在有些實施例中，BHV-I可以與一種佐劑一起給藥，而其它免疫原可以與不同的佐劑一起給藥。在有些實施方式中，本發(fā)明疫苗被配制成液體形式。在其它實施方式中，本發(fā)明的疫苗被配制成干粉。在疫苗是干粉的實施方式中，疫苗的終端用戶可以使用適宜的稀釋劑對其進行再配制。稀釋劑在本領(lǐng)域中是已知的，其包括但不限于如無菌水這樣的物質(zhì)。在有些情況下，疫苗最好在特定時間內(nèi)使用，例如在疫苗再配制后的M小時內(nèi)使用。
給藥與其它免疫原經(jīng)過修飾的BHV-I疫苗通常與至少一種其它免疫原通過共同給藥方式和/或以聯(lián)合疫苗形式給藥。此處所用的“其它免疫原”是指除BHV-I以外的其它免疫原。此外，在特定實施方式中，其它免疫原可以不含有插入到BHV-I載體中的外源基因。其它免疫原可以包含在共同給藥的疫苗中或者包含在聯(lián)合疫苗/多價疫苗中，也就是含有至少兩種免疫原的疫苗。這些其它免疫原可以是來源于一種或多種特定病原體(細(xì)菌、支原體、病毒、寄生蟲等)的單個免疫原，亦或者可以包含來源于一種或多種特定病原體的至少兩種免疫原的組合。所述共同給藥疫苗和/或聯(lián)合疫苗可以全部或者部分是細(xì)胞制劑和/或修飾的活制劑，這些制劑對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是已知。其它免疫原也可以包括其它免疫調(diào)節(jié)分子?？梢宰鳛樗銎渌庖咴瓉碓吹牟≡w和免疫調(diào)節(jié)分子的實例包括但不限于，牛病毒性腹瀉病毒(BVDV) I型，II型和III型；牛呼吸道合胞病毒(BRSV)；副流感病毒3型(PI3)； 溶血性曼氏桿菌；睡眠嗜組織菌(以前稱為睡眠嗜血菌)(H. somni)；輪狀病毒(BRV)；冠狀病毒(BCV)；牛支原體；鉤端螺旋體??；犬新孢子蟲；毛滴蟲類；弧菌；梭菌類抗原；出血敗血性巴斯德氏菌；壞死梭桿菌；大腸桿菌0157:H7 ；沙門氏菌和免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，例如白細(xì)胞介素-Ia (IL-la)，白細(xì)胞介素(IL_1 β )，白細(xì)胞介素_2 (IL_2)，白細(xì)胞間介素-4(IL-4)，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)以及干擾素類。如上所述，在特定的實施方式中，針對BVD的免疫原可以被包含在共同給藥疫苗和/或聯(lián)合疫苗中。BVDV I型、II型和III型可以引起多種臨床綜合癥。研究表明，這些病毒可以引起嚴(yán)重的呼吸道疾??；被持續(xù)感染的牛是其它易受感染牛的主要傳染源；BVD感染白細(xì)胞庫，從而引起免疫系統(tǒng)深遠而又廣泛的缺損。此外，懷孕母牛感染該病毒會引起流產(chǎn)或者木乃伊化，尤其是在懷孕頭三個月感染該病毒。粘膜病是牛病毒性腹瀉(BVD)的又一個致命病癥，其產(chǎn)生是因為早期胎兒感染了非致細(xì)胞病變的BVD生物型，產(chǎn)生了對該病毒的免疫耐受性，進而產(chǎn)出被持久感染的小牛，隨后又再度感染了致細(xì)胞病變的BVD生物型。BVD II型病毒以前被認(rèn)為是乳畜群體中可以經(jīng)常性檢測到的主要出血性BVD病毒株。在特定實施方式中，針對牛支原體的免疫原可以包含在共同給藥疫苗和/或聯(lián)合疫苗中，以用來預(yù)防食用牛和奶牛中出現(xiàn)的臨床疾病以及與支原體感染相關(guān)的受損。這些疾病包括傳染性的乳腺炎，呼吸道肺炎，關(guān)節(jié)感染(關(guān)節(jié)炎癥狀)，角膜結(jié)膜炎，以及中耳炎。出血敗血性巴斯德氏菌是一種引起牛肺炎的細(xì)菌，本發(fā)明的共同給藥疫苗和聯(lián)合疫苗可以包含來源于該病原體的所述其它免疫原。溶血性曼氏桿菌免疫原可以包括白細(xì)胞毒素(LkT)，外膜蛋白(OMP)相關(guān)的抗原， 或其它抗原。本發(fā)明的共同給藥疫苗和聯(lián)合疫苗也可以包含針對鉤端螺旋體病的其它細(xì)菌免疫原。鉤端螺旋體種細(xì)菌引起的鉤端螺旋體病是一種會引起巨大經(jīng)濟損失的牲畜傳染病0 鉤端 累旋體 borgpeterseriii serovar hardjo (L. hardjo)禾口鉤端 累旋體 interrogans serovar pomona(L. pomona)是世界上與鉤端螺旋體病有關(guān)聯(lián)的兩種最常見的血清變型。在許多情形下，本發(fā)明的共同給藥疫苗和/或聯(lián)合疫苗包含來源于這兩種血清變型的所述其它免疫原。其它鉤端螺旋體病免疫原包括那些源于犬鉤端螺旋體、感冒傷寒群鉤端螺旋體、 和出血性黃疸鉤端螺旋體的免疫原。牛感染鉤端螺旋體可以造成急性發(fā)燒，無乳癥，流產(chǎn)， 早產(chǎn)，產(chǎn)出虛弱的被感染小牛，并且導(dǎo)致育種失敗和受孕率下降。本發(fā)明的實施方式還可以使用來源于弧菌屬細(xì)菌(Vibrio spp.)和梭菌屬細(xì)菌 (Clostridial species)的其它細(xì)菌病原體外源免疫原。梭菌類免疫原的實例包括，來源于肖韋(氏)梭菌，敗血梭狀芽胞桿菌，諾維氏梭狀芽胞桿菌，污泥梭狀芽胞桿菌，產(chǎn)氣莢膜梭狀芽胞桿菌C型和D型，以及溶血梭狀芽胞桿菌的免疫原。在另一些實施方式中，本發(fā)明的共同給藥疫苗和/或聯(lián)合疫苗可以包含針對犬新孢子蟲的其它免疫原。犬新孢子蟲是一種引起牛流產(chǎn)的成囊原生動物。在牛中因犬新孢子蟲傳染而導(dǎo)致的流產(chǎn)通常發(fā)生在孕期的中期到晚期，但并非所有受感染的胎兒都會流產(chǎn)。 盡管與那些流產(chǎn)的小牛一樣有些被感染的小牛出生時就患有疾病并在新生期夭折，但也有許多先天被感染的小?？赡軙】档爻錾⑹艿匠志玫母腥?。本發(fā)明的共同給藥疫苗和/或聯(lián)合疫苗可以包含來源于毛滴蟲的其它免疫原。在特定實施方式中，BHV-I共同給藥疫苗和/或聯(lián)合疫苗可以包含的其它免疫原選自如上所述的細(xì)菌組、病毒組、寄生蟲組、免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子組中的一種或者其任意組合。在其它實施方式中，共同給藥疫苗和/或聯(lián)合疫苗中的其它免疫原可以僅是來自前面所述的一種組別的免疫原。在另一些實施方式中，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的共同給藥疫苗和/或聯(lián)合疫苗可以含有來自上述組別的其它免疫原的任何組合。舉例來說，聯(lián)合疫苗可以由修飾過的BHV-1，BVDV I型和II型，PI3以及BRSV組成。在一個實施方式中，聯(lián)合疫苗含有修飾過的BHV-I, BVD I和II、波摩那群鉤端螺旋體、Lepto hardjo-bovis、弧菌、毛滴蟲抗原。這種疫苗特別適用于大于一歲齡的食用母牛。這種示例性疫苗可以用在懷孕的母牛中以預(yù)防由BVD I和II引起的胎兒感染，預(yù)防因BHV-I導(dǎo)致的流產(chǎn)，預(yù)防由于弧菌和L.hardjo bovis引起的胚胎早期死亡，以及預(yù)防毛滴蟲感染。在另一個實施方式中，本發(fā)明的聯(lián)合疫苗含有針對于修飾過的BHV-1、BVD I和II型、波摩那群鉤端螺旋體、Lepto hardjo-bovis、弧菌、以及犬新孢子蟲的免疫原。這種疫苗特別適用于大于一歲齡的母奶牛。在另一個實施方式中，適用于一個月到六個月齡小牛的聯(lián)合疫苗可以含有修飾過的 BHV-U BVD I和II、BRSV、溶血性曼氏桿菌、睡眠嗜組織菌、牛支原體、波摩那群鉤端螺旋體、L印to hardjo-bovis抗原。在有些實施方式中，可以對大于一天小于一個月齡的小牛進行預(yù)防接種。對于六個月到十二個月齡的小牛，聯(lián)合疫苗可以含有針對修飾過的BHV-1、 BVD I和II、溶血性曼氏桿菌、睡眠嗜組織菌、牛支原體、波摩那群鉤端螺旋體、以及L印to hardjo-bovis 的抗原。示例性的共同給藥疫苗包括那些具有一種或多種梭菌抗原、溶血性曼氏桿菌、睡眠嗜組織菌、出血敗血性巴斯德氏菌、壞死梭形桿菌、大腸桿菌0157:H7以及沙門氏菌的免疫原的疫苗。在特定實施方式中，所述共同給藥疫苗是一種僅針對梭菌的疫苗。在其它實施方式中，所述共同給藥疫苗是僅針對睡眠嗜組織菌、壞死梭形桿菌、或者二聯(lián)沙門菌(死) 菌(Salmonella Dublin-Typhimurium)的疫苗。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，共同給藥疫苗和/或聯(lián)合疫苗的唯一區(qū)別是疫苗中的單個成分是共同給藥的還是以聯(lián)合疫苗形式給藥以達到減少BHV-I引起的免疫抑制作用的期望目的。應(yīng)當(dāng)理解，每個本發(fā)明所述的共同給藥疫苗和/或聯(lián)合疫苗都可以包含任何此處記載的獸藥學(xué)上可接受的組份，包括但不限于佐劑、稀釋劑、溶劑等。應(yīng)當(dāng)理解，在特定的實施方式中雖然共同給藥疫苗和/或聯(lián)合疫苗誘導(dǎo)的免疫原性可能與單個疫苗的不同，但共同給藥疫苗或者聯(lián)合疫苗仍是優(yōu)選的疫苗。在許多情況下， 用聯(lián)合疫苗替代數(shù)種不同的疫苗是有利的，因為聯(lián)合疫苗通?？梢詮墓ぷ髁亢筒牧线@兩方面來降低治療費用。此外，聯(lián)合疫苗占用的空間更少從而使其易于運輸和儲存。
將本發(fā)明的疫苗組合物給予宿主動物的許多方法都是本領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)，包括口服，經(jīng)鼻給藥，局部給藥，經(jīng)皮給藥，以及非腸道給藥。在特定的實施方式中，給藥途徑是經(jīng)鼻給藥或者非腸道給藥，特別是肌內(nèi)給藥。在特定的實施方式中，本發(fā)明的制劑特別適宜通過肌內(nèi)注射方式給藥，因為靜脈注射不適宜家畜的大規(guī)模應(yīng)用。盡管如此，本發(fā)明的制劑也可以通過其它途徑給藥，例如皮下注射或皮內(nèi)注射，因為當(dāng)宿主動物作為食用肉制品時就不適宜通過肌內(nèi)注射方式給藥?？蛇x擇地，疫苗也可以與藥學(xué)上可接受的媒介物一起配制并通過口服方式給藥。在這些實施方式中，本發(fā)明的疫苗可以通過口服方式給藥以提高黏膜免疫，以及通過肌肉注射方式給藥以提高全身免疫。對于鼻內(nèi)滴注的給藥方式，宿主動物的接種量可以在將近102至108 TCID50的各修飾的活疫苗病毒株的范圍之間。對于肌內(nèi)注射的疫苗來說，可以將102至108 TCID50的病毒注射到宿主的肋腹部(尾部肌肉群)或頸部(臂頭肌)。對于皮下給藥，宿主動物的接種劑量將近102至108 TCID50的各修飾的活疫苗株。在許多實施方式中，每劑量疫苗至少含有102. 5 TCID50病毒。在特定的實施方式中，疫苗的劑量體積為將近2mL至5mL。前面提到的疫苗給藥途徑僅是為了示例作用，本發(fā)明的疫苗還可以通過任何本領(lǐng)域已知的適宜方法進行給藥。疫苗組合物中抗原的濃度足以在宿主體內(nèi)產(chǎn)生有效劑量從而使得抗原可以在宿主體內(nèi)誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫或者誘導(dǎo)宿主體內(nèi)產(chǎn)生針對多肽中和表位的抗體。只要疫苗劑量在允許的大限量范圍內(nèi)，那么疫苗劑量本身就不是個非常關(guān)鍵的因素?？蛇x地，在特定的實施方式中，可以在初始免疫后的數(shù)周至數(shù)月時間內(nèi)給予宿主動物第二免疫促進劑。在特定的實施方式中，可以在初始免疫后的一年時間內(nèi)給予宿主動物免疫促進劑。為了保持針對疾病的穩(wěn)定的高水平免疫保護，可以定期地給予宿主動物免疫促進劑。定期可以是在每月至每六個月、每年、或數(shù)年的時間范圍。在特定的實施方式中， 本發(fā)明的組合物不使用在懷孕期或哺乳期的個體。在其它實施方式中，本發(fā)明的組合物不使用在繁殖后還未滿一周、兩周、三周或四周的個體。在其它一些實施方式中，本發(fā)明疫苗不使用在將在觀天或更短時間內(nèi)屠宰的動物。僅為示例性說明之目的，對于食用動物而言，通常在打烙印的時候(在夏季放牧之前)對其進行免疫接種，在斷奶期間對其進行免疫接種，在送到育成牛棚 (back-grounding facility)(冬季麥田放牧)時對其進行免疫接種，在到達飼育場時對其進行免疫接種。對母牛來說，也可以在進入斷奶期或者在孕檢期間對其進行免疫接種。對奶牛來說，通常在斷奶期對其進行免疫接種。本發(fā)明的經(jīng)過修飾的組合物和疫苗可以用作標(biāo)記物。通過分析宿主動物的樣品可以確定宿主動物是否被本發(fā)明的疫苗保護，以及確定宿主動物是否暴露于野生型的BHV-I 病毒株。在特定的實施方式中，本發(fā)明提供了一種采用免疫分析方法來確定樣品中是否存在針對BHV-I基因和修飾的BHV-I基因的抗體以及此類抗體的濃度(如果存在)的方法。 該免疫分析方法的特征在于使用可以與BHV-I抗體進行反應(yīng)的修飾的BHV-I免疫原作為反應(yīng)試劑，從而形成BHV-I抗體和修飾的BHV-I免疫原的復(fù)合物，然后再通過測定是否存在該復(fù)合物以及該復(fù)合物的濃度(如果存在)的方式來測定是否存在針對修飾的BHV-I的抗體，而后再確定該抗體的濃度(如果存在)。例如，可以在免疫分析方法中使用修飾的免疫原作為底物試劑來測定樣品(例如，來自宿主動物的血樣)中針對BHV-I蛋白的抗體，進而再確定宿主動物是否被BHV-I感染以及樣品中抗體的濃度。BHV-I免疫原可以被混合在或者固定在合適的基質(zhì)(支托)或載體上，例如橡膠顆粒，塑料微型滴定板或者其它類似材料。根據(jù)所用免疫分析方法的需要，BHV-I免疫原也可以與酶、染料、放射性同位素或者其它類似物質(zhì)偶聯(lián)。本發(fā)明所述使用修飾的BHV-I免疫原進行免疫分析的方法包括但不限于， 放射免疫測定，競爭免疫分析法，免疫沉淀反應(yīng)，酶聯(lián)免疫吸附測定，免疫熒光測定等等。在許多實施方式中，優(yōu)選方便、快速、靈敏并具有特異性的方法來進行免疫分析。以下對本發(fā)明進行舉例說明，所舉的例子僅為示例之目的。這些例子不對本發(fā)明的保護范圍構(gòu)成任何限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明公開的內(nèi)容可以容易地知道權(quán)利要求保護范圍內(nèi)的許多實施方式。本領(lǐng)域技術(shù)人員被認(rèn)為熟知本申請中所引用的文獻，這些文獻在此通過引用方式全文并入本申請以作參考。
實施例下列實施例僅為對本發(fā)明實施方式進行說明之目的，其不對本發(fā)明構(gòu)成任何限制。
實施例1 BHV-I感染引fe被感染細(xì)朐卜.MHC I類分子表汰的下調(diào)。為了評估BHV-I感染對被感染細(xì)胞表面上MHC I類分子表達的影響，現(xiàn)使用BHV-I GL756病毒株以10的感染復(fù)數(shù)(MOI)感染馬-達氏牛腎細(xì)胞(MDBK)或者對其進行模擬感染。在感染后的16-24小時，使用與MHC I類分子具有特異性的單克隆抗體PT85A(VMRD， Inc. ；Pullman, Washington, USA)對細(xì)胞進行染色。陰性對照細(xì)胞使用無反應(yīng)活性的同型匹配對照抗體(MM605 ；Dr. Subramaniam Srikumaran ；Washington State University)進行染色° 一級抗體用 Zenon Mouse IgG Labeling Kits (Molecular Probes, Invitrogen Detection Technologies,Carlsbad,California,USA)進行標(biāo)記或者使用熒光標(biāo)記的二級抗體。然后通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的表面免疫熒光。如圖10所示，檢測數(shù)據(jù)顯示被BHV-I感染的細(xì)胞在細(xì)胞表面表達MHC I類分子，但是與模擬的被感染細(xì)胞相比，其表達水平被降低或調(diào)低。因此，野生型的BHV-I會降低MHC I類分子在被感染細(xì)胞表面上的表達水平。
^MM 2 BHV-I弓丨走(寸其它共同i合藥免疫 的免疫應(yīng)答抑泡丨為了評估BHV-I對牛犢針對跟其共同給藥的其它非BHV-I免疫原免疫應(yīng)答的影響，進行下列研究。所使用的牛犢是3至6月齡的BHV-I血清陰性牛犢(Hereford-Angus 雜交?；蛘逪olstein-Dairy雜交牛)。這些牛犢具有最小限度的ELISA測定的LkT滴定度。這些牛犢在第O天通過頸部皮下給藥方式單獨給予來源于溶血性曼氏桿菌的重組 LkTdOOyg重組LkT分散在2mL含有Emulsigen D佐劑的制劑中)，或是單獨給予BHV-I (將近IO5-5BHV-I GL756病毒株分散在2mL制劑中)，或者是給予LkT和BHV-I (BHV-1和LkT 在頸部共同給藥，給藥部位相隔將近5厘米)。對于單獨給予LkT的牛犢組以及共同給予 BHV-I和LkT的牛犢組，在第21天時再次給予LkT。在給藥前(第O天)、第4天、第10天、 第14天、第21天、第觀天和第35天分別抽取血液并收集血清。用ELISA方法分別測定前述時間點血清中可以與LkT反應(yīng)的血清抗體。將第4天血清中測得的抗體水平設(shè)為1，然后再分別計算其它時間點抗體水平相對此的數(shù)值。
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圖11中的結(jié)果顯示，單獨給予LkT的牛犢組和同時給予LkT和BHV-I的牛犢組中 LkT特異性抗體的水平在研究期間基本上是被提高的，并在第觀-35天時達到頂峰水平。在所有時間點的血清中，單獨給予LkT的牛犢血清中所存在的LkT特異性抗體的水平要高于同時給予BHV-I和LkT的牛犢。單獨給予LkT的牛犢組與同時給予BHV-I和LkT的牛犢組之間在LkT特異性抗體水平上出現(xiàn)明顯差別的時間是在第10、14、21和觀天。這些結(jié)果表明，與單獨給予某種免疫原相比，BHV-I會抑制宿主針對與其共同給藥的其它免疫原的免疫應(yīng)答。
t施例3給予BHV-I引fe牛ft體內(nèi)與跟BHV-I共同給藥它免,瘡原H有特異t牛的 IgG中IgGl亞型與IgG2亞型比例的下降。為了評估BHV-I對宿主體內(nèi)特異于跟BHV-I共同給藥的其它免疫原的IgG亞型所產(chǎn)生的影響，現(xiàn)使用實施例2所記載的從單獨給予LkT以及同時給予BHV-I和LkT的牛犢中收集的血清樣品來進行試驗。使用包被有LkT和IgG亞型特異性抗體的ELISA板來檢測這些血清樣品中LkT特異性的IgGl亞型和IgG2亞型。如圖12的結(jié)果所示，與單獨給予LkT的牛犢相比，同時給予LkT和BHV-I的牛犢血清中LkT特異的IgGl/IgG2的比例被降低了。這些結(jié)果說明，BHV-I可以改變(降低)宿主體內(nèi)與跟BHV-I共同給藥的免疫原具有特異性的IgGl/IgG2比例。
t施徹丨4給予BHV-I抑制了牛ft體內(nèi)針對共同給藥免鹿原的杭原回僅俯答為了評估BHV-I對宿主動物針對跟BHV-I共同給藥的非BHV-1免疫原的抗原回憶應(yīng)答的影響(通過檢測IL-2的生成水平來進行評估)，在第23天抽取實施例2研究中所用牛犢的血樣。對血樣進行稀釋然后再加入LkT抗原。隨后用ELISA方法測定血樣中IL-2 的水平。如圖13中的結(jié)果所示，與單獨給予LkT的牛犢相比，共同給予BHV-I和LkT的牛犢樣品中響應(yīng)回憶抗原的IL-2生成水平被抑制。這些結(jié)果表明，BHV-I可以抑制宿主動物針對跟BHV-I共同給藥的其它免疫原的回憶應(yīng)答。
實施例5利用缺失重組構(gòu)建體在哺乳動物細(xì)胞中構(gòu)建BHV-I缺失變異體利用圖14A所示的以及圖14中SEQ ID NO 17所示的缺失重組構(gòu)建體(DRC)來生成BHV-I GL756的UL49. 5突變體，克隆體A1、A5、A7和B8。將增強型綠色熒光蛋白(EGFP) 插入到該構(gòu)建體從而可以對重組病毒進行分離。將DRC轉(zhuǎn)染到MDBK細(xì)胞中，隨后用BHV-I GL756感染該細(xì)胞。稀釋被感染細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液，然后將其點板到新的MDBK細(xì)胞中。 分離呈現(xiàn)綠色熒光的病毒斑，然后利用重組聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)篩選技術(shù)對該病毒斑進行純化和鑒定。PCR篩選中使用的引物位于缺失/重組位點的兩側(cè)。對于突變體而言，其PCR 產(chǎn)物的期望尺寸是2072堿基對(bp)，對于野生型/母代病毒而言，其PCR產(chǎn)物的期望尺寸是657bp。圖16示出了 Al和B8突變體的期望式樣。使用被感染細(xì)胞培養(yǎng)物的裂解物通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)來篩選 BHV-I GL756 Δ UL49. 5 Al 和 Β8，并通過蛋白印跡法(Western blot)來確認(rèn)目標(biāo)基因是否刪除。UL49. 5基因在原型病毒中表達的蛋白產(chǎn)物的期望尺寸為15kDa。 圖18顯示，A1、A5、B7和B8克隆體沒有表達UL49.5基因的蛋白產(chǎn)物。在此使用模擬感染的細(xì)胞作為對照。利用圖14B所示的以及圖14中SEQ ID NO 18所示的缺失重組構(gòu)建體(DRC)來生成BHV-I GL756的Us4缺失突變體，克隆體1和2。將EGFP插入到該構(gòu)建體從而可以對重組病毒進行分離。將DRC轉(zhuǎn)染到MDBK細(xì)胞中，隨后用BHV-I GL756感染該細(xì)胞。稀釋被感染細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液，然后將其點板到新的MDBK細(xì)胞中。分離呈現(xiàn)綠色熒光的病毒斑， 然后利用PCR篩選技術(shù)對該病毒斑進行純化和鑒定。PCR篩選使用的引物位于缺失/重組位點的兩側(cè)。對于突變體而言，其PCR產(chǎn)物的期望尺寸是2072堿基對(bp)，對于野生型/ 母代病毒而言，其PCR產(chǎn)物的期望尺寸是1757bp。圖17示出了 1和2突變體的期望式樣。使用被感染細(xì)胞培養(yǎng)物的裂解物通過SDS-PAGE來篩選BHV-1 GL75 Δ Us4-1和2， 并通過蛋白印跡法來確認(rèn)目標(biāo)基因是否刪除。Us4基因在原型病毒中表達的蛋白產(chǎn)物的期望尺寸為40kDa。圖19顯示，克隆體1和2沒有表達Us4基因的蛋白產(chǎn)物。在此使用模擬感染的細(xì)胞作為對照。
實施徹丨6用細(xì)人工染fM本構(gòu)律體在Π甫gL云M勿細(xì)胞構(gòu)律BHV-I缺失突奪體在有些研究中，使用細(xì)菌人工染色體構(gòu)建體(BAC)來生成BHV-I突變體。該方法已經(jīng)記載在Tischer等人，(2006)BioTechniques 20 :191中。該方法通常使用一種重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒(transfer plasmid)，其含有期望被引入到BHV-I中的突變，該突變體的兩側(cè)與野生型的BHV-I序列相連。重組轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒含有編碼綠色熒光蛋白(GFP)的基因以及細(xì)菌復(fù)制起點。將重組的轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到MDBK細(xì)胞中，隨后用BHV-I GL756進行感染。稀釋被感染細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液并將其點板到新的MDBK細(xì)胞中。分離呈現(xiàn)出綠色熒光的病毒斑， 然后對病毒斑進行純化并通過電穿孔方式將其引入到大腸桿菌細(xì)胞中。通過限制性內(nèi)切酶酶切消化和Southern印跡法(Southern blotting)從轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌克隆體中篩選出 DNA，從而獲得期望的BHV-I突變體。通過Tische等人的文獻中所記載的順勢突變方法(en passant mutagenesis)從BHV-1突變克隆體中除去不想要的GFP和細(xì)菌復(fù)制起點序列。該方法利用紅色催化插入法生成一段序列，該段序列會在隨后的紅色催化(Red-catalyzed) 步驟中與GFP和細(xì)菌起點序列一起被切除。將產(chǎn)生的BHV-I克隆體轉(zhuǎn)染到了 MDBK細(xì)胞中， 進而獲得具有傳染性的突變病毒庫。通過上述方法得到五種不同的BHV-I突變或修飾的病毒。所有BHV-I突變病毒都是在GL756病毒株原型上進行制備。一種突變的BHV-I病毒含有在UL49. 5基因上進行的修飾。圖9的SEQ ID NO 23示出了 UL49. 5突變的DNA序列。圖9所示DNA序列中加下劃線的核苷酸表示被插入到GL756野生型UL49. 5序列中的核苷酸。所述加下劃線的核苷酸在編碼序列中增加了兩個框內(nèi)翻譯終止密碼子。另外一種突變BHV-I病毒的UL41編碼序列完全缺失。第三種突變BHV-1病毒同時含有之前已經(jīng)描述過的UL49. 5和UL41突變。因此，該種BHV-I含有在兩個基因上進行的修飾，即UL49. 5和UL41上進行的修飾。圖20示出了 UL49. 5和UL41基因區(qū)在BHV-I染色體上的位置，同時也示出了前面提到過的修飾。第四種突變BHV-I病毒含有Us4編碼序列的部分缺失，并在缺失位置處插入了一段新序列。圖6示出了來源于BHV-I Cooper病毒株的Us4基因的DNA序列(SEQ ID N0: 11)和氨基酸序列(SEQ ID N0:12)，其與來源于GL756病毒株的Us4基因的序列相同。圖 6DNA序列中加下劃線的核苷酸表示BHV-I Us4突變中被刪除的核苷酸。刪除這些核苷酸會相應(yīng)地造成如圖6所示的氨基酸序列中加下劃線氨基酸的缺失。所述缺失是框內(nèi)缺失。因此，缺失的核苷酸下游所編碼的氨基酸序列與野生型的Us4序列的核苷酸編碼的氨基酸序列相同。除了這些缺失外，Us4突變基因也可以在前面提到的缺失位置處插入M個核苷酸 (GGATCTGGTAGTGGCTCCGGGAGC ；SEQ ID NO :21)。這M個核苷酸編碼的氨基酸序列為Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser (SEQ ID NO :22)。因為這種插入屬于框內(nèi)缺失，所以修飾后的Us4基因所編碼的蛋白含有Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser的氨基酸序列，該氨基酸序列替代了圖6中SEQ ID NO :12所示的加下劃線的氨基酸。圖21示出了基因Us4區(qū)在 BHV-I染色體中的位置，以及所進行的修飾。第五種突變BHV-I病毒的Circ編碼序列完全缺失。圖22示出了 Circ基因區(qū)在 BHV-I染色體中的位置，以及所進行的修飾。
實施例7含有修飾的BHV-I病毒的牛長為了評估目標(biāo)基因所含的修飾對BHV-I病毒的生長性能所產(chǎn)生的影響，現(xiàn)使用實施例6中記載的病毒對MDBK細(xì)胞進行感染，此后檢測各個時間點的病毒滴度。被檢測的病毒包括，不包含前面提到過的修飾的病毒(GL756;BHV-1 WT)，在UL49. 5基因位置處有修飾的病毒(BHV-1 AUL49. 5)，在UL41基因位置處有修飾的兩個不同的BHV-I克隆體 (BHV-1 AUL41 1606禾口 BHV-1 Δ UL41 1607)，在UL49. 5和UL41基因位置處同時有修飾的兩個不同的 BHV-I 克隆體(BHV-1 AUL41/AUL49. 5 :1614 和 BHV-I ΔUL41/Δ UL49. 5 :1616)， 在Circ基因位置處有修飾的病毒(BHV-lACirc 1697)，在Us4基因位置處有修飾的病毒 (BHV-1 AUs4gG :1698)。圖23的結(jié)果顯示，所有被檢測的帶有修飾的BHV-I病毒與未經(jīng)修飾的BHV-1病毒具有相似的生長動力學(xué)。這些數(shù)據(jù)說明，針對被測試的基因所進行的修飾并未對病毒的生長性能產(chǎn)生影響。
MHC I類分子在被含有修飾的BHV-I病毒感染i寸的細(xì)胞,表面表汰的t灰復(fù)情況為了評估含有修飾的BHV-I病毒對MHC I類分子在被感染細(xì)胞表面上表達的影響，現(xiàn)使用實施例5所記載的經(jīng)修飾的BHV-I病毒對MDBK細(xì)胞進行感染(圖M示出了獲得的實驗數(shù)據(jù))，或者使用實施例6所記載的經(jīng)修飾的BHV-I病毒對MDBK細(xì)胞進行感染(圖25-31示出了獲得的實驗數(shù)據(jù))。為了在本實施例的實驗中對MHC I類分子的表達進行檢測，使用10的感染復(fù)數(shù)對MDBK細(xì)胞進行感染，或者進行模擬感染。在感染后的 16-24小時，使用與MHC 1類分子具有特異性的單克隆抗體PT85A(VMRD，Inc. ；Pullman, Washington, USA)對細(xì)胞進行染色。陰性對照細(xì)胞使用無反應(yīng)活性的同型對照抗體 (MM605 ；Dr. Subramaniam Srikumaran ；Washington State University)進行染色。一級抗體用 Zenon Mouse IgG Labeling Kits (Molecular Probes, Invitrogen Detection Technologies, Carlsbad, California, USA)進行標(biāo)記，或者使用熒光標(biāo)記的二級抗體。然后通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的表面熒光。圖M的結(jié)果顯示，與被UL49. 5基因位置處不含有修飾的BHV-I (BHV-1 GL756)進行感染后的細(xì)胞相比，被BHV-I Δ UL49. 5 Al或Β8 (如實施例5中所記載的)感染的細(xì)胞表面具有部分逆轉(zhuǎn)或恢復(fù)的MHC I類分子表達。圖25的結(jié)果顯示，與使用不含有修飾的 BHV-1 (BHV-1 GL756)進行感染后的細(xì)胞相比，被同時在UL49. 5和UL41基因都含有修飾的 BHV-1GL756AUL41-AUL49. 5(如實施例6所記載)感染的細(xì)胞在其細(xì)胞表面完全逆轉(zhuǎn)或恢復(fù)了 MHC I類分子的表達。這些數(shù)據(jù)說明含有這些修飾的BHV-I病毒沒有引起MHC I類分子表達的下調(diào)，或者至少沒有達到未經(jīng)修飾的BHV-I病毒所引起的MHC I類分子下調(diào)的程度。附圖沈中的數(shù)據(jù)顯示，與使用不包含修飾的BHV-I GL756進行感染的細(xì)胞相比， 使用在UL49. 5有修飾的BHV-I GL756AUL49. 5感染的細(xì)胞(如實施例6所記載)，以及使用在UL41有修飾的GL756AUL41感染的細(xì)胞(如實施例6所記載)部分逆轉(zhuǎn)或恢復(fù)了 MHC I類分子在被感染細(xì)胞表面上的表達。這些數(shù)據(jù)也顯示了，與使用不含有修飾的 BHV-I GL756進行感染后的細(xì)胞相比，使用同時在UL49. 5和UL41基因都含有修飾的BHV-I GL756AUL49. 5-AUL41感染的細(xì)胞完全逆轉(zhuǎn)或恢復(fù)了 MHC I類分子在被感染細(xì)胞表面上的表達。除了使用流式細(xì)胞儀對MHC I類分子的細(xì)胞表面表達進行分析外，本發(fā)明還從前面所述的被感染細(xì)胞中制備獲得了細(xì)胞裂解物，并使用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和蛋白印跡法(Western Bloting)來對細(xì)胞裂解物進行分析，所述蛋白印跡法中使用了可以與MHC I類分子反應(yīng)的抗體。附圖27(頂部)示出了被感染細(xì)胞的分析結(jié)果，用于感染細(xì)胞的病毒包括不含有修飾的BHV-I病毒(GL756)，含有在UL49.5 上修飾的BHV-I病毒(GL756 Δ UL49. 5)，含有在UL41上修飾的兩個BHV-I病毒克隆體 (GL756 AUL41)，同時含有在UL49. 5和UL41上修飾的兩個BHV-I病毒克隆體(GL756 Δ UL49. 5- Δ UL41)，含有在Circ上修飾的BHV-I病毒(GL756 Δ Circ)，以及含有在Us4上修飾的BHV-I病毒(GL756 Δ Us4)。這些病毒都是實施例6中所記載的BHV-I病毒突變體。 附圖27示出了蛋白印跡法分析獲得的光密度定量數(shù)據(jù)。附圖27中的數(shù)據(jù)顯示，與不含有修飾的BHV-I病毒相比，就在單個基因上有修飾的BHV-I病毒組而言，在UL41上有修飾的BHV-I病毒對MHC I類分子表達具有最大的恢復(fù)效果(也就是具有最小的抑制作用)。這些數(shù)據(jù)也顯示了，與不含有修飾的BHV-I病毒相比，含有在UL49. 5和UL41都有修飾的BHV-I病毒完全恢復(fù)了 MHC I類分子的表達(沒有抑制作用)。這些數(shù)據(jù)還顯示了，與模擬感染的細(xì)胞相比，含有GL756 AUL49.5-AUL41修飾的BHV-I病毒甚至增強了 MHC I類分子的表達。
實施例9 BHV-I下調(diào)了 MHC II類分子在被感染細(xì)胞上的表達，含有修飾的BHV-I病毒恢復(fù)了 MHC II分子的表達為了評估BHV-I病毒和含有修飾的BHV-I病毒對MHC II類分子在被感染細(xì)胞表面上表達的影響，現(xiàn)使用實施例6中所記載的修飾的BHV-I病毒來對MDBK細(xì)胞進行感染。 使用0. 1的感染復(fù)數(shù)對MDBK細(xì)胞進行感染，或者進行模擬感染，并在4°C下孵化30分鐘，然后在37°C下繼續(xù)孵化1小時，最后進行IFN-Y處理。感染72小時后，使用與MHC II類分子具有特異性的單克隆抗體CAT82A(VMRD)對細(xì)胞進行染色。CAT82A抗體用Zenon. Mouse IgG Labeling Kits(Molecular Probes,Invitrogen Detection Technologies,Carlsbad, California,USA)進行標(biāo)記，或者使用熒光標(biāo)記的二級抗體。陰性對照的細(xì)胞未經(jīng)過染色。 然后通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的熒光。附圖觀中的數(shù)據(jù)示出了 MHC II類分子在被病毒感染的細(xì)胞上的表達相對于在模擬感染的細(xì)胞中的表達(模擬感染的細(xì)胞表示為100%表達)的情況。附圖四中的數(shù)據(jù)顯示了，與使用不含有修飾基因的病毒進行感染的細(xì)胞相比，MHC II類分子在被含有修飾的病毒感染的細(xì)胞中表達的恢復(fù)百分比(假定MHC II類分子在感染了 BHV-I GL756的細(xì)胞內(nèi)的表達水平為0 ；在模擬感染細(xì)胞的表達水平為100% )。這些數(shù)據(jù)表明，不含修飾的BHV-I 病毒抑制了 MHC II類分子在被感染細(xì)胞表面上的表達。這些數(shù)據(jù)還顯示，與未經(jīng)修飾或野生型的BHV-I病毒相比，在UL49. 4上有修飾的BHV-I病毒和在UL41上有修飾的BHV-I病毒部分恢復(fù)了 MHC II類分子的表達(沒有明顯的抑制反應(yīng))。這些數(shù)據(jù)還顯示，同時含有 UL49. 5和UL4修飾的BHV-I病毒對MHC II類分子在被感染細(xì)胞表面上的表達所產(chǎn)生的抑制作用要低于只含有單個基因修飾的BHV-I病毒(也就是說，要比只含有單個修飾基因的 BHV-I病毒具有更好的MHC II類分子表達恢復(fù)能力)。
t施徹丨10含有修飾的BHV-I病毒t灰復(fù)禾時是高了牛ft體內(nèi)與共同給藥它免,瘡原H 有特異件的IgG中IgGl/IgG2亞型的比例實施例3和圖12中的數(shù)據(jù)表明，與單獨給予免疫原誘導(dǎo)的IgG中IgGl/IgG2比例相比較，BHV-I會降低與其同時給藥的其它免疫原具有特異性的IgG中IgGl/IgG2亞型的比例。為了評估含有修飾的BHV-I病毒對與其同時給藥的免疫原所誘導(dǎo)的IgG中IgGl/ IgG2亞型比例所產(chǎn)生的影響，現(xiàn)使用BHV-I血清陰性的3-6月齡牛犢(Hereford-Angus 或者Holstein-Dairy cross)來進行試驗。用ELISA測定，這些牛犢也都只具有最小量的LkT滴度。通過頸部皮下給藥的方式給予它們以下組單獨給予來自溶血性曼氏桿菌的重組LkT (IOOyg分散在2ml含有Emulsigen D佐劑的體系中)，LkT和BHV-1 GL756 (將近IO5 5BHV-I GL756菌株分散在2ml的體系中)，LkT和同時含有UL49. 5和UL41修飾的BHV-I (如實施例6所記載的GL756 Δ UL49. 5- Δ UL41)，或者LkT和含有Us4修飾的 BHV-I (如實施例6所記載的GL756 Δ Us4)。在第0天，在間隔5cm的部位同時給予BHV-I或者修飾的BHV-I以及LkT。在第21天，再次單獨給予牛犢LkT (沒有病毒)。在第14、21、觀和35天分別抽取血液并收集血清。使用ELISA板測定每個時間點血清所含的可以與LkT 反應(yīng)的IgGl和IgG2血清抗體，該ELISA板使用LkT和IgG亞型特異性的抗體來進行包被。附圖30中的結(jié)果顯示，與單獨給予LkT所產(chǎn)生的與LkT特異性的IgGl/IgG2的比例相比，同時給予野生型BHV-I (GL756)和LkT降低了 LkT特異性的IgGl/IgG2的比例(見第洲天和第35天時間點的結(jié)果)。這些結(jié)果與實施例3中所討論的以及實施例12中所顯示的結(jié)果相同。附圖30中的結(jié)果還顯示，當(dāng)LkT與同時含有UL49. 5和UL41上修飾的BHV-I 病毒同時給藥時，或者與含有Us4上修飾的BHV-I病毒一起給藥時，沒有觀察到IgGl/IgG2 比例的下降。這些數(shù)據(jù)還顯示，與同時給予LkT和野生型的BHV-I后所觀察到的LkT特異性的IgGl/IgG2比例下降情況相反(與單獨給予LkT相比)，同時給予LkT以及兩種修飾的BHV-I病毒中的一種后所觀察到的LkT特異性的IgGl/IgG2的比例得到了提高(要高于單獨給予LkT后所觀察到的IgGl/IgG2比例)。這些數(shù)據(jù)表明，修飾的BHV-I病毒可以逆轉(zhuǎn)IgGl/IgG2比例的下降，IgGl和IgG2是與跟野生型的BHV-I共同給藥的其它免疫原具有特異性的抗體。這些數(shù)據(jù)還表明，與單獨給予免疫原(沒有野生型的BHV-1)后產(chǎn)生的 IgGl/IgG2比例相比，修飾的BHV-I病毒甚至可以提高與共同給藥的免疫原具有抗體特異性的IgGl/IgG2比例。
^MM η y^mm BHV-I病毒對Φ 體寸共同i合藥的其它免疫 的抗ic回憶應(yīng)答的恢復(fù)情況實施例4和附圖14中的數(shù)據(jù)說明，與單獨給予免疫原所產(chǎn)生的回憶應(yīng)答相比， BHV-I會抑制針對與野生型BHV-I共同給藥的其它免疫原的回憶應(yīng)答。為了評估含有修飾的BHV-I病毒對于針對與其共同給藥的其它免疫原回憶應(yīng)答所產(chǎn)生的影響，現(xiàn)使用IL-2的生成水平來進行相關(guān)測量，并從實施例10研究中所用的牛犢中抽取其第23天的血樣。對血樣進行稀釋并加入LkT抗原。然后利用ELISA測定樣品中IL-2的水平。附圖31中的結(jié)果顯示，通過測定血液中細(xì)胞生成的IL-2水平，與同時給予牛犢 LkT和不包含修飾的BHV-I病毒(GL756)相比，當(dāng)LkT與同時含有UL49. 5和UL41修飾的 BHV-I病毒(如實施例6中所記載的GL756AUL49. 5-UL41)共同給予牛犢時，可以提高抗原回憶。這些數(shù)據(jù)還顯示，當(dāng)LkT與含有Us4修飾的BHV-I病毒(如實施例6中所記載的 GL756AUs4)同時給予牛犢時，可以進一步增強抗原回憶。本說明書列舉了示例性的組合物、方法等，但這些例子不對本申請的保護范圍構(gòu)成任何限制。當(dāng)然，為了描述本發(fā)明中的組合物、方法等之目的，在此不可能列舉出所有可能的組合和方法。本發(fā)明的其它優(yōu)化和變化方案對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見。因此，本發(fā)明并不限于說明書和實施例中所描述的內(nèi)容。因而，本申請包括任何落入本申請范圍內(nèi)的變化和修改。此外，前面的描述并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本發(fā)明的保護范圍取決于所附的權(quán)利要求書以及其等同物。本發(fā)明說明書或權(quán)利要求書中所用的術(shù)語 “或”(例如，A或B)是指“A或B或兩者”。如果申請人想要表明的是“只有A或B，而不包括兩者”則會使用術(shù)語“只有A或B，而不包括兩者”。因此，術(shù)語“或”在本申請包含了同時含有多個元素的情形，而并非排除了同時包含多個元素的情形。
權(quán)利要求
1.一種含有對兩個或多個基因進行了修飾的牛皰疹病毒1型(BHV-I)，其中所述基因編碼的蛋白會抑制被感染宿主的免疫系統(tǒng)，其中所述修飾可以減輕或預(yù)防免疫系統(tǒng)受到的抑制。
2.如權(quán)利要求1所述的BHV-1，其中所述基因編碼的蛋白會引起宿主MHC相關(guān)蛋白的下調(diào)，或者引起宿主不對BHV-I產(chǎn)生免疫應(yīng)答。
3.如權(quán)利要求1所述的BHV-1，其中所述修飾可以減輕或預(yù)防宿主針對其它免疫原的免疫系統(tǒng)抑制。
4.如權(quán)利要求3所述的BHV-1，其中所述其它免疫原與BHV-I通過共同給藥的方式或者以聯(lián)合疫苗的形式給予宿主。
5.如權(quán)利要求1所述的BHV-1，其中所述修飾的基因參與了一種或多種以下活動MHC I類表達、趨化因子表達、MHC II類表達、潛伏感染和病毒持續(xù)感染的發(fā)展、潛伏再激活、以及IgG介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的表達。
6.如權(quán)利要求1所述的BHV-1，其中所述修飾的基因是一個或多個以下基因UL49.5、 UL41、Us4、Circ、LR-ORF-1、LR-0RF-2、Us9 和 Us8。
7.如權(quán)利要求1所述的BHV-I，其中所述修飾的基因是UL49.5和UL41。
8.如權(quán)利要求1所述的BHV-1，其中所述的BHV-I原型包括Cooper病毒株或者GL756 病毒株。
9.一種含有BHV-I和其它免疫原的組合物，其中所述BHV-I包含基因的修飾，修飾所針對的基因會抑制宿主對其它免疫原的免疫應(yīng)答，其中該修飾可以減輕免疫應(yīng)答的抑制。
10.如權(quán)利要求9所述的BHV-1，其中被修飾的基因參與了一種或多種以下活動MHCI 類表達、趨化因子表達、MHC II類表達、潛伏感染和病毒持續(xù)感染的發(fā)展、潛伏再激活、以及 IgG介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的表達。
11.如權(quán)利要求9所述的BHV-1，其中被修飾的基因參與了MHC I類表達和趨化因子表達中的一種。
12.如權(quán)利要求9所述的BHV-1，其中修飾的基因是UL49.5、UL41js4、Circ、LR-0RF_l、 LR-0RF-2、Us9 或Us8。
13.如權(quán)利要求9所述的BHV-I，其中修飾的基因是UL49.5或UL41。
14.如權(quán)利要求9所述的BHV-I，其中修飾的基因是Us40
15.如權(quán)利要求9所述的BHV-I，其中修飾的基因是UL49.5，并且所述BHV-I還在UL41 或Us4基因上有修飾。
16.如權(quán)利要求9所述的BHV-I，其中BHV-I原型包括Cooper病毒株和GL756病毒株。
17.如權(quán)利要求9所述的BHV-1，其中所述其它免疫原包括細(xì)菌免疫原、病毒免疫原或寄生蟲免疫原。
18.如權(quán)利要求9所述的BHV-1，其中所述其它免疫原包括來源于以下組的免疫原牛病毒性腹瀉病毒(BVDV) I型、BVDV II型、BVDV III型、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、副流感病毒3型(PI3)、輪狀病毒(BRV)、冠狀病毒(BCV)、溶血性曼氏桿菌、睡眠嗜組織菌、牛支原體、豕鉤端螺旋體種、弧菌種、梭狀芽胞桿菌種、多殺性巴氏桿菌、壞死梭桿菌、大腸桿菌 0157:H7、腸道沙門氏菌、牛新孢子蟲或者毛滴蟲種。
19.如權(quán)利要求9所述的BHV-1，其中所述的其它免疫原包括來自溶血性曼氏桿菌的LkT。
20.如權(quán)利要求9所述的BHV-1，其中所述的BHV-I是經(jīng)過修飾的BHV-I活疫苗株。
21.如權(quán)利要求9所述的BHV-1，其中所述的BHV-I是滅活病毒。
22.—種誘導(dǎo)宿主免疫應(yīng)答的方法，包括給予宿主a)不是BHV-I抗原的免疫原(非BHV-I免疫原)；和b)含有基因修飾的BHV-1，修飾所針對的基因所編碼的蛋白會抑制宿主對非BHV-I免疫原的免疫應(yīng)答。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述基因包括UL49.5、UL41js4、Circ、LR-0RF_l、 LR-0RF-2、Us9 或 Us8。
24.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述基因包括UL49.5，并且所述BHV-I還在U41 基因處有修飾。
25.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述非BHV-I免疫原來源于牛病毒性腹瀉病毒 (BVDV) I型、BVDV II型、BVDV III型、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、副流感病毒3型(PI3)、 輪狀病毒(BRV)、冠狀病毒(BCV)、溶血性曼氏桿菌、睡眠嗜組織菌、牛支原體、豕鉤端螺旋體種、弧菌種、梭狀芽胞桿菌種、多殺性巴氏桿菌、壞死梭桿菌、大腸桿菌0157:H7、腸道沙門氏菌、牛新孢子蟲或者毛滴蟲種。
26.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述非BHV-I免疫原和BHV-I通過共同給藥方式或者以聯(lián)合疫苗方式給予宿主。
27.如權(quán)利要求22所述的方法，與使用野生型BHV-I或者使用可以通過商業(yè)渠道獲得的BHV-I疫苗進行感染后所產(chǎn)生的宿主免疫應(yīng)答進行對比，宿主對所述非BHV-I免疫原的免疫應(yīng)答得到了提高。
28.如權(quán)利要求22所述的方法，相比于野生型的BHV-I或者可以通過商業(yè)渠道獲得的 BHV-I疫苗株，所述含有修飾的BHV-I減少了 MHC I類表達的下調(diào)水平，提高了非BHV-I免疫原具有特異性的IgG中IgGl與IgG2的比例，和/或提高了用非BHV-I免疫原再刺激血細(xì)胞后所產(chǎn)生的IL-2的量。
29.—種含有基因修飾的BHV-I在誘導(dǎo)有蹄類宿主對BHV-I和非BHV-I免疫原的免疫應(yīng)答中的應(yīng)用，其中所述BHV-I中被修飾的基因所編碼的蛋白會抑制被感染的有蹄類動物的免疫應(yīng)答。
30.如權(quán)利要求四所述的應(yīng)用，其中所述BHV-I含有至少在兩個基因上的修飾，所述被修飾的基因所編碼的蛋白會抑制被感染的有蹄類宿主的免疫應(yīng)答。
31.如權(quán)利要求四所述的應(yīng)用，其中所述被修飾的基因是UL49.5和UL41。
32.如權(quán)利要求四所述的應(yīng)用，其中所述基因編碼的蛋白參與了一種或多種以下活動MHC I類表達、趨化因子表達、MHC II類表達、潛伏感染或病毒持續(xù)感染的發(fā)展、潛伏再激活、以及IgG介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的表達。
33.如權(quán)利要求四所述的應(yīng)用，其中所述基因編碼的蛋白參與了一種或多種MHCI類表達和趨化因子表達。
34.如權(quán)利要求四所述的應(yīng)用，其中所述修飾的基因是UL49.5、UL41、Us4、Circ, LR-ORF-1、LR-0RF-2、Us9 或 Us8。
35.如權(quán)利要求四所述的應(yīng)用，其中所述修飾的基因是化4。
36.一種含有基因修飾的BHV-I用于制備誘導(dǎo)有蹄類宿主針對BHV-I和非BHV-I免疫原免疫應(yīng)答的疫苗中的應(yīng)用，其中所述被修飾的基因所編碼的蛋白會抑制被感染的有蹄類動物的免疫應(yīng)答，其中所述BHV-I和非BHV-I免疫原通過共同給藥或者以組合多價疫苗的形式給予有蹄類宿主。
37.如權(quán)利要求36所述的應(yīng)用，其中所述修飾的基因是化4。
38.如權(quán)利要求36所述的應(yīng)用，其中所述修飾的基因是化49.5，并且所述BHV-I還在 UL41處有修飾。
全文摘要
本發(fā)明主要涉及治療或預(yù)防牛的疾病。更具體地說，本發(fā)明涉及生產(chǎn)和使用經(jīng)修飾的牛皰疹病毒1型(BHV-1)以及它們在組合物和疫苗中的應(yīng)用，所述的組合物和疫苗可以保護牛免受BHV-1的感染且不會抑制宿主的免疫應(yīng)答。在一個實施方式中，本發(fā)明涉及修飾的牛皰疹病毒1型與其它免疫原共同給藥的應(yīng)用，它們通過共同給藥的方式和/或以聯(lián)合疫苗的形式給予宿主，本發(fā)明還涉及這些疫苗在預(yù)防牛疾病方面的應(yīng)用。在另一個實施方式中，給藥組合物中所包含的修飾的BHV-1可以提高宿主針對其它免疫原的免疫應(yīng)答。
文檔編號A61K39/265GK102238961SQ200980148786
公開日2011年11月9日 申請日期2009年10月1日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月3日
發(fā)明者B·B·考弗, G·拉尤西斯曼, M·N·帕特爾, N·奧斯特萊德, 理查德·哈蘭, 里戴維德·奧爾比二世 申請人:康奈爾大學(xué), 諾華公司