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      用于治療癌癥的恩扎妥林的制作方法

      文檔序號(hào):990231閱讀:387來(lái)源:國(guó)知局
      專(zhuān)利名稱(chēng):用于治療癌癥的恩扎妥林的制作方法
      用于治療癌癥的恩扎妥林本發(fā)明涉及與使用恩扎妥林(Enzastaurin)的癌癥治療聯(lián)合使用HDAC2作為生物學(xué)標(biāo)志物的方法。本發(fā)明還涉及與I類(lèi)選擇性HDAC抑制劑組合的恩扎妥林的應(yīng)用以便在治療癌癥中實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)的治療效果。恩扎妥林是PKC β選擇性抑制劑。恩扎妥林的化學(xué)名稱(chēng)為3-(1_甲基-IH-吲哚-3-基)-4- [1- [1-(吡啶-2-基甲基)哌啶-4-基]-IH-吲哚-3-基]-IH-吡咯-2, 5_ 二酮,其在美國(guó)專(zhuān)利5,668,152中被公開(kāi)。HDAC屬于組蛋白脫乙酰酶超家族。存在至少18種HDAC酶,根據(jù)它們對(duì)于酵母脫乙酰酶的同源性將其分為4類(lèi)。HDAC除去組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶所添加的乙酰基。乙?;某ナ沟媒M蛋白能與DNA結(jié)合,從而限制對(duì)DNA的接近。因此,HDAC阻止轉(zhuǎn)錄發(fā)生。Ropero報(bào)道,子宮內(nèi)膜、結(jié)腸和胃腫瘤樣品攜帶使HDAC2失活的突變。Ropero, S.等人(2006) Nat Genet, 38 (5) :566_569。癌細(xì)胞系和腫瘤(乳腺腫瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、卵巢腫瘤、腎腫瘤、膀胱腫瘤和結(jié)腸直腸腫瘤)的QRT-PCR已經(jīng)顯示HDAC2 RNA水平降低。Ozdag,H.等人(2006)BMCGenomics, 7 :90。此夕卜,Protein Atlas (http//www. proteinatlas.org)揭示,在胃、子宮內(nèi)膜、卵巢、乳腺、腎、子宮頸、肝、肺、惡性類(lèi)癌、淋巴瘤、胰腺、甲狀腺和前列腺腫瘤的亞群中觀察到中度至陰性的HDAC2免疫組織化學(xué)(IHC)染色。I類(lèi)HDAC是公知的轉(zhuǎn)錄協(xié)阻抑物,在體內(nèi)總是與轉(zhuǎn)錄因子和輔因子結(jié)合。生物學(xué)數(shù)據(jù)表明,I類(lèi)HDAC與細(xì)胞周期進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和細(xì)胞凋亡相關(guān),是有前景的癌癥治療靶標(biāo)?!癐 類(lèi)HDAC抑制劑”如伏林司他、縮肽、MS-275、MGCD0103、貝林司他(belinostat)、Baceca、 帕比司他(panobinostat)、PCI-24781、TSA、LAQ834、SBHA、丁酸鈉、丙戊酸、ApicidiruT 酸苯酯、C1994、Trapoxin, SB-429201、雙吡啶箱f 二烯(Bispyridinium diene)、SHI-I :2、 R306465、SB-379278A 和 PCI-34051 是已知的。盡管在理解癌癥的生物學(xué)基礎(chǔ)和在其治療方面已經(jīng)取得了許多進(jìn)展,但是癌癥仍然是主要的死亡原因之一。患者對(duì)藥物的響應(yīng)的變化造成了重大挑戰(zhàn),因?yàn)樵谂R床中經(jīng)常遇到抗藥性和缺乏響應(yīng)。許多因素被認(rèn)為在患者對(duì)藥物的響應(yīng)的變化中發(fā)揮作用,包括遺傳學(xué)、伴隨的藥物治療、環(huán)境、生活方式、健康狀況和疾病狀況。存在確定對(duì)化療方案產(chǎn)生最佳響應(yīng)的患者的醫(yī)療需求。已經(jīng)確定的預(yù)測(cè)性生物學(xué)標(biāo)志物很少,開(kāi)發(fā)用于診斷檢測(cè)以便最后指導(dǎo)治療決策的預(yù)測(cè)性生物學(xué)標(biāo)志物更少?;颊哌x擇方法對(duì)于定制恩扎妥林在治療癌癥中的應(yīng)用具有重要價(jià)值。獲得及時(shí)確定患者是否將可能對(duì)使用恩扎妥林的治療有響應(yīng)的方法將具有巨大價(jià)值。本發(fā)明涉及在首先確定能用作恩扎妥林功效的生物學(xué)標(biāo)志物的HDAC2的表達(dá)水平之后用恩扎妥林治療癌癥的方法。當(dāng)HDAC2的水平低或不可檢測(cè)時(shí),預(yù)計(jì)單獨(dú)使用恩扎妥林特別有效。當(dāng)HDAC2的水平高時(shí),本發(fā)明涉及組合施用有效量的恩扎妥林和I類(lèi)選擇性HDAC抑制劑。本發(fā)明包括治療患者的癌癥的方法,其包括向患者施用有效量的恩扎妥林,其中所述患者具有低水平或不可檢測(cè)水平的HDAC2。
      此外,本發(fā)明提供了治療患者的癌癥的方法,其包括a)獲得包含來(lái)自患者的癌細(xì)胞的樣品;b)確定該癌癥樣品中的HDAC2水平;和c)如果該癌癥樣品具有低水平或不可檢測(cè)水平的HDAC2,則向患者施用有效量的恩扎妥林。本發(fā)明包括治療患者的癌癥的方法,其包括向患者施用有效量的恩扎妥林,其中所述患者具有HDAC2移碼無(wú)義突變。此外,本發(fā)明提供了治療患者的癌癥的方法,其包括a)獲得包含來(lái)自患者的癌細(xì)胞的樣品;b)確定該癌癥樣品中HDAC2是否突變;和c)如果該患者樣品具有HDAC2移碼無(wú)義突變,則向患者施用有效量的恩扎妥林。本發(fā)明包括治療患者的癌癥的方法,其包括向患者施用有效量的恩扎妥林和有效量的I類(lèi)選擇性HDAC抑制劑,其中所述患者具有高水平的HDAC2。此外,本發(fā)明提供了治療患者的癌癥的方法,其包括a)獲得包含來(lái)自患者的癌細(xì)胞的樣品;b)確定該癌癥樣品中的HDAC2水平;和c)如果該癌癥樣品具有高水平的 HDAC2,則向患者施用有效量的恩扎妥林和有效量的I類(lèi)選擇性HDAC抑制劑。本發(fā)明包括恩扎妥林在制備用于治療患者的癌癥的藥物中的用途,其中所述患者具有低水平或不可檢測(cè)水平的HDAC2。此外,本發(fā)明提供了與I類(lèi)選擇性HDAC抑制劑組合的恩扎妥林在制備治療患者的癌癥的藥物中的用途,其中所述患者具有高水平的HDAC2,并且其中所述藥物與I類(lèi)選擇性 HDAC抑制劑組合施用。本發(fā)明提供了本文所述的方法和用途,其中所述癌癥選自結(jié)腸直腸癌、胃癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、腎癌、皮膚T-細(xì)胞淋巴瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、淋巴瘤、胰腺癌和前列腺癌。此外,所述I類(lèi)選擇性HDAC抑制劑可以選自伏林司他、縮肽、MS-275、 MGCD0103、貝林司他、Baceca、帕比司他、PCI-24781、TSA、LAQ834、SBHA、丁酸鈉、丙戊酸、 Apicidin、丁酸苯酯、CI994、Trapoxin, SB-429201、雙吡啶二箱言烯、SHI-I :2、R306465、 SB-379278A 和 PCI-34051。本發(fā)明包括生物學(xué)標(biāo)志物的鑒定以幫助針對(duì)恩扎妥林在癌癥治療中的應(yīng)用預(yù)測(cè)患者的結(jié)果和對(duì)目前可用的治療進(jìn)行知情選擇。本發(fā)明采用HDAC2作為優(yōu)選的生物學(xué)標(biāo)志物。腫瘤發(fā)展過(guò)程中獲得的遺傳畸變既代表疾病的驅(qū)動(dòng)物,又代表定制癌癥療法的機(jī)會(huì)。具有在特定腫瘤類(lèi)型中改變的基因和途徑的患者可能對(duì)靶向治療有不同的響應(yīng)。在發(fā)現(xiàn)過(guò)程中早期理解藥物敏感性的這些遺傳決定因素能幫助改善和加速關(guān)于臨床適應(yīng)癥、患者分層和組合研究的決策。這些亞群代表具有受損的HDAC2性質(zhì)的患者群體,所述受損的HDAC2性質(zhì)能被作為靶標(biāo)以提高治療益處和對(duì)作為單一藥物的或與I類(lèi)選擇性HDAC抑制劑組合的恩扎妥林的響應(yīng)。本發(fā)明涉及治療選自以下的癌癥結(jié)腸直腸癌、胃癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、腎癌、皮膚T細(xì)胞淋巴瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、淋巴瘤、胰腺癌和前列腺癌。本發(fā)明提供了與恩扎妥林組合的I類(lèi)選擇性HDAC抑制劑的用途,所述I類(lèi)選擇性HDAC抑制劑選自伏林司他、縮肽、MS-275、MG⑶0103、貝林司他、Baceca、帕比司他、 PCI-24781、TSA、LAQ834、SBHA、丁酸鈉、丙戊酸、Apicidin、丁酸苯酯、CI994、Trapoxin,SB-429201、雙吡啶箱t二烯、SHI-I :2、R306465、SB-379278A 和 PCI-34051。已知有許多方法用于確定癌細(xì)胞的基因或蛋白質(zhì)表達(dá)。免疫組織化學(xué)、蛋白質(zhì)印跡法、微矩陣和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)是已被用于獲得癌癥類(lèi)型、亞型、預(yù)后和治療效果的分子水平認(rèn)識(shí)的幾個(gè)例子。這些用于測(cè)量基因和蛋白質(zhì)表達(dá)的方法的發(fā)展使得尋找和系統(tǒng)地評(píng)價(jià)癌癥分類(lèi)和各種腫瘤類(lèi)型的結(jié)果預(yù)測(cè)的生物學(xué)標(biāo)志物成為可能。在本發(fā)明中,優(yōu)選通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法或免疫組織化學(xué)測(cè)定或檢測(cè)HDAC2蛋白的表達(dá)。此外,在本發(fā)明中,通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、然后測(cè)序以確定是否存在突變體等位基因來(lái)測(cè)定HDAC2突變。所采用的檢測(cè)方法將根據(jù)可利用的專(zhuān)業(yè)知識(shí)、技術(shù)和試劑而改變。提供下面的定義以幫助本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員理解本文的公開(kāi)內(nèi)容。這些定義是本領(lǐng)域已知的那些定義的代表,因此不限于所給出的具體要素。術(shù)語(yǔ)“治療”是指包括減緩、中斷、阻止、控制、減輕或逆轉(zhuǎn)癥狀、障礙、病癥或疾病的進(jìn)展或嚴(yán)重程度等的過(guò)程?!盎颊摺笔遣溉閯?dòng)物,優(yōu)選人。術(shù)語(yǔ)“有效量”是指恩扎妥林或HDAC2抑制劑或藥學(xué)上可接受的鹽的量或劑量,當(dāng)將其單劑量或多劑量施用于患者后,其提供所需的治療。一般而言,這些治療藥物中每一種的最佳劑量會(huì)根據(jù)活性成分在各患者中的相對(duì)效力而變化。醫(yī)學(xué)執(zhí)業(yè)者能根據(jù)所測(cè)量的活性成分在體液或組織中的停留時(shí)間和濃度和/或?qū)μ囟ò┌Y的相關(guān)的與疾病有關(guān)的生物學(xué)標(biāo)志物的監(jiān)測(cè)來(lái)確定給藥的劑量和重復(fù)率。術(shù)語(yǔ)“可檢測(cè)水平”是指基因、基因轉(zhuǎn)錄物或基因產(chǎn)物以通過(guò)診斷方法或測(cè)定法如蛋白質(zhì)印跡法或免疫組織化學(xué)能檢測(cè)到的水平存在于生物樣品中。在本發(fā)明中,低水平或不可檢測(cè)水平的HDAC2是指相對(duì)于HCT116細(xì)胞中的HDAC2表達(dá)蛋白質(zhì)印跡法顯示HDAC2 的表達(dá)< 20%。此外,在本發(fā)明中,高水平的HDAC2是指相對(duì)于HCTl 16細(xì)胞中的HDAC2表達(dá)蛋白質(zhì)印跡法顯示HDAC2的表達(dá)> 20%??梢允褂帽绢I(lǐng)域已充分確定的技術(shù)測(cè)量樣品中HDAC2的表達(dá)?;旧?,腫瘤活組織檢查物取自患者。將組織勻漿,通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法對(duì)裂解物進(jìn)行分析以確定HDAC2蛋白表達(dá)的量。在福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)的樣品的情況下,對(duì)腫瘤核心切片,通過(guò)免疫組織化學(xué)染色以進(jìn)行HDAC2檢測(cè)。通過(guò)已知的免疫組織化學(xué)評(píng)分方法如H-評(píng)分(H-score) 組織病理學(xué)工作者對(duì)這些樣品給出低或高的評(píng)分。術(shù)語(yǔ)“移碼無(wú)義突變”是指Ropero,S.等人(2006) Nat Genet, 38 (5) 566-9 報(bào)道的HDAC2基因中的截?cái)嗷蚴Щ钔蛔???墒褂靡殉浞执_立的方法確定移碼無(wú)義突變?;旧?,通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 和直接測(cè)序法對(duì)來(lái)自患者樣品的DNA進(jìn)行分析以確定移碼突變的存在。將由DNA樣品獲得的序列圖譜與野生型序列進(jìn)行比較,以尋找截?cái)嗤蛔儭oper0,S.等人。實(shí)施例1HDAC2作為恩扎妥林藥物響應(yīng)的敏化劑HCTl 16細(xì)胞是從美國(guó)組織培養(yǎng)物保藏中心ATCC(Rockville,MD, USA)獲得的,將其在具有5% CO2的加濕的37°C培養(yǎng)箱中在補(bǔ)充有2mML-谷氨酰胺和10%胎牛血清(FBS) 的 McCoy, s 5A 士音中 ;Ι$#。 $ Druggable Genome v2 Library (Qiagen)中i^ffi* 個(gè)靶標(biāo)2種siRNA對(duì)板(384孔)進(jìn)行預(yù)印跡(pre-print),使得每孔含有13nM各siRNA雙鏈體。通過(guò)按照標(biāo)準(zhǔn)的反向轉(zhuǎn)染(reverse transfection)方案向每個(gè)孔中加入轉(zhuǎn)染劑 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)和 1500 個(gè)稀釋在補(bǔ)充有 2mM L-谷氨酰胺和 2% FBS 的McCoy’ s 5A培養(yǎng)基中的細(xì)胞進(jìn)行高通量反向轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后24小時(shí),將每個(gè)測(cè)定板用或不用5個(gè)濃度(0-10 μ M)的在DMSO中的恩扎妥林處理。72小時(shí)后,根據(jù)制造商的介紹使用基于化學(xué)發(fā)光的CellTiter Glo (Promega)測(cè)定法讀出器測(cè)量細(xì)胞生存力。UBB SiRNA(Qiagen)是陽(yáng)性細(xì)胞殺傷對(duì)照,All Star Non-silencing(NS-AS)或綠色熒光蛋白 (GFP)是陰性對(duì)照。將原始信號(hào)值相對(duì)于未處理的對(duì)照孔進(jìn)行歸一化以進(jìn)行板間比較。將這些擬合為 4參數(shù)邏輯模型以確定IC50值。如下計(jì)算IC50值相對(duì)于陰性對(duì)照(如上所述)的‘移變’: (IC50靶標(biāo)-IC50對(duì)照)/IC50對(duì)照。對(duì)于RT-PCR,如上述對(duì)細(xì)胞進(jìn)行反向轉(zhuǎn)染,將其于37°C與siRNA —起孵育72小時(shí),使用板洗滌器用IX PBS洗滌,然后進(jìn)行裂解。根據(jù)制造商的方案,使用磁珠(Ambion, MagMax-96Total RNA Isolation Kit, Cat #1830)提取 RNA。使用 NanoDrop-IOOO 分光光度計(jì)測(cè)量樣品的總RNA濃度。用Bio-Rad,s iScript cDNA合成試劑盒(Cat#170_8891)進(jìn)行 cDNA 合成,根據(jù)制造商的介紹在 MJ Research's DNA Engine Tetrad Peltier Thermal Cycler上運(yùn)行反應(yīng)。每10 μ L qPCR反應(yīng)體積使用5納克(5ng) cDNA?;蛱禺愋詑PCR是使用Taq Mail 探針化學(xué)(ABI,F(xiàn)oster City,CA)進(jìn)行的并且在ABI 7900HT快速實(shí)時(shí)PCR 系統(tǒng)上運(yùn)行。用內(nèi)源性甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、緩沖液、零亂(scrambled)(如上所述)和非模板(用于探針的標(biāo)準(zhǔn)物)對(duì)照每種樣品一式三份地進(jìn)行反應(yīng)。將基因表達(dá)值相對(duì)于GAPDH進(jìn)行歸一化并通過(guò)相對(duì)定量方法(Δ ACt方法)使用ABI’ s SDS RQManager 1.2軟件計(jì)算。Ct是一種標(biāo)準(zhǔn)度量,其是指循環(huán)閾值數(shù)。相對(duì)于內(nèi)源性表達(dá),特定siRNA對(duì)感興趣的基因的敲除通過(guò)以下公式給出( Δ Ct)測(cè)試=[平均靶基因Ct-平均GAPDH Ct]測(cè)試( Δ Ct)對(duì)照=[平均靶基因Ct-平均GAPDH Ct]對(duì)照Δ Δ Ct = (ACt)測(cè)試-(ACt)對(duì)照RQ= 2~ aacT% KD = (RQsi-RQ 緩沖液)* 100/RQ 緩沖液其中,‘測(cè)試’是指處理的siRNA(si)或緩沖液對(duì)照(緩沖液);‘對(duì)照’是指零亂 siRNA對(duì)照,即陰性對(duì)照。如上所示計(jì)算RQsi和RQ緩沖液,以分別確定使用和不使用(內(nèi)源性水平)siRNA處理的感興趣的靶標(biāo)的相對(duì)基因表達(dá)值。如所看到的那樣,相對(duì)于陰性對(duì)照,靶向于HDAC2的3種siRNA導(dǎo)致劑量響應(yīng)殺傷曲線移變,其中IC50值具有> 2倍的移變,從而使得HCT116對(duì)恩扎妥林的作用敏感。高含量圖像也反映了相對(duì)于陰性對(duì)照和任何一個(gè)條件單獨(dú)(未給出數(shù)據(jù))在用恩扎妥林和 HDAC2 siRNA處理的HCT116細(xì)胞中較高程度的細(xì)胞殺傷。
      權(quán)利要求
      1.治療患者的癌癥的方法,其包括向患者施用有效量的恩扎妥林,其中所述患者具有低水平或不可檢測(cè)水平的HDAC2。
      2.治療患者的癌癥的方法,其包括a)獲得包含來(lái)自患者的癌細(xì)胞的樣品;b)確定該癌癥樣品中的HDAC2水平;和c)如果該患者樣品具有低水平或不可檢測(cè)水平的HDAC2,則向患者施用有效量的恩扎妥林。
      3.治療患者的癌癥的方法,其包括向患者施用有效量的恩扎妥林,其中所述患者具有 HDAC2移碼無(wú)義突變。
      4.治療患者的癌癥的方法,其包括a)獲得包含來(lái)自患者的癌細(xì)胞的樣品;b)確定該癌癥樣品中HDAC2是否突變;和c)如果該患者樣品具有HDAC2移碼無(wú)義突變,則向患者施用有效量的恩扎妥林。
      5.治療患者的癌癥的方法,其包括向患者施用有效量的恩扎妥林和有效量的I類(lèi)選擇性HDAC抑制劑,其中所述患者具有高水平的HDAC2。
      6.治療患者的癌癥的方法,其包括a)獲得包含來(lái)自患者的癌細(xì)胞的樣品;b)確定該癌癥樣品中的HDAC2水平;和c)如果該患者樣品具有高水平的HDAC2,則向患者施用有效量的恩扎妥林和有效量的 I類(lèi)選擇性HDAC抑制劑。
      7.權(quán)利要求5或6的方法,其中所述I類(lèi)選擇性HDAC抑制劑選自伏林司他、縮肽、 MS-275、MGCD0103、貝林司他、Baceca、帕比司他、PCI-24781、TSA、LAQ834、SBHA、丁酸鈉、 丙戊酸、Apicidin、丁酸苯酯、CI994、Trapoxin, SB-429201、雙吡啶錯(cuò)二烯、SHI-I :2、 R306465、SB-379278A 和 PCI-34051。
      8.權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)的方法,其中所述癌癥選自結(jié)腸直腸癌、胃癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、腎癌、皮膚T-細(xì)胞淋巴瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、淋巴瘤、胰腺癌和前列腺癌。
      9.恩扎妥林在制備用于治療患者的癌癥的藥物中的用途,其中所述患者具有低水平或不可檢測(cè)水平的HDAC2。
      10.與I類(lèi)選擇性HDAC抑制劑組合的恩扎妥林在制備用于治療患者的癌癥的藥物中的用途,其中所述患者具有高水平的HDAC2,并且其中所述藥物與I類(lèi)選擇性HDAC抑制劑組合施用。
      11.權(quán)利要求10的用途,其中所述I類(lèi)選擇性HDAC抑制劑選自伏林司他、縮肽、 MS-275、MGCD0103、貝林司他、Baceca、帕比司他、PCI-24781、TSA、LAQ834、SBHA、丁酸鈉、 丙戊酸、Apicidin、丁酸苯酯、CI994、Trapoxin, SB-429201、雙吡啶錯(cuò)二烯、SHI-I :2、 R306465、SB-379278A 和 PCI-34051。
      12.權(quán)利要求9-11中任意一項(xiàng)的用途,其中所述癌癥選自結(jié)腸直腸癌、胃癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、腎癌、皮膚T-細(xì)胞淋巴瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、淋巴瘤、胰腺癌和前列腺癌。
      全文摘要
      本發(fā)明涉及在使用作為單一藥物的或與I類(lèi)選擇性HDAC抑制劑組合的恩扎妥林的患者中作為生物學(xué)標(biāo)志物用于治療癌癥的HDAC2。
      文檔編號(hào)A61K31/4406GK102245184SQ200980150302
      公開(kāi)日2011年11月16日 申請(qǐng)日期2009年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月15日
      發(fā)明者G·甘吉 申請(qǐng)人:伊萊利利公司
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