專利名稱：塞爾托利細(xì)胞微膠囊化方法、所獲得的微膠囊及其用于預(yù)防和治療1型糖尿病的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及經(jīng)微膠囊化制成水凝膠類微膠囊的塞爾托利細(xì)胞(Sertoli cell) (SC)在預(yù)防和/或治療1型糖尿病(TlDM)方面的用途，以及涉及一種用于制造形狀優(yōu)選為微球體的微膠囊的方法。本發(fā)明的產(chǎn)品目標(biāo)在于能夠誘導(dǎo)被糖尿病病理破壞的細(xì)胞的新生并且“切斷”導(dǎo)致Tl DM的這種破壞的同一自身免疫過程。微膠囊化SC的治療允許預(yù)防和治療Tl DM,而無需借助任何黑索金(hexogen)胰島(人或動物)移植。應(yīng)當(dāng)注意，由SC微膠囊化獲得的產(chǎn)品足以與“傳統(tǒng)”藥物相比。
背景技術(shù)：
目前全世界1型糖尿病(Tl DM)發(fā)病率為一年約30，000新病例。主要但并非僅影響青年和青少年的1型DM發(fā)病機(jī)理主要是自身免疫機(jī)制破壞了產(chǎn)生胰島素的大多數(shù)胰腺β-細(xì)胞。簡言之，有機(jī)體失去了對負(fù)責(zé)胰島素制造的胰腺β-細(xì)胞的免疫耐受性，并誘導(dǎo)主要由細(xì)胞介導(dǎo)的、與自身抗體的產(chǎn)生關(guān)聯(lián)、導(dǎo)致細(xì)胞自毀的免疫應(yīng)答?；谑┯煤谒鹘鹨葝u素的現(xiàn)行Tl DM療法傾向于將糖類穩(wěn)態(tài)恢復(fù)為盡可能接近于在生理狀態(tài)下所觀察到的狀態(tài)。然而，胰島素療法不能重現(xiàn)(!^produce)正常β -細(xì)胞對促分泌刺激的應(yīng)答所特有的胰島素分泌的脈動節(jié)奏(脈動節(jié)律，pulsating rhythm)。所以，生理和穩(wěn)定的內(nèi)分泌-胰腺功能的恢復(fù)代表從根本上解決病理問題的最終目標(biāo)。為此，提出了新策略，如移植所有胰腺或移植從人供體胰腺中分離的胰島。當(dāng)前使用的黑索金胰島素療法無論如何都無法代表治療Tl DM的最終療法。為了解決這個問題，早已提出這樣的途徑，其設(shè)想了移植全部胰腺器官或從人或動物供體的胰腺中分離出的胰島。胰島移植與全部胰腺移植相比侵襲性較小但具有類似問題，特別是1、來自死亡供體的人胰腺的有效性降低，結(jié)果胰島的有效性降低。2、使得接受者需要接受終身的一般藥理免疫抑制方案。然而，用于阻止移植組織免疫排斥的此種治療選擇方案受副作用困擾，該副作用當(dāng)前仍了解很少，但潛在地非常嚴(yán)重。3、異源性胰島的移植排斥，因為當(dāng)前使用的免疫抑制藥物中沒有一種能夠有效地阻止它們。4、經(jīng)移植的胰島組織隨著時間的推移存活率較低。塞爾托利細(xì)胞(SC)的功能最近被再次評價，并從僅睪丸精小管的結(jié)構(gòu)支撐上升為有無數(shù)營養(yǎng)和免疫功能的真正生物化學(xué)實驗室。特別地，已證明，SC培養(yǎng)物產(chǎn)生了抑制B和T淋巴細(xì)胞(1)增殖的分子。而且，為了增強(qiáng)它們的免疫調(diào)節(jié)功能，該SC可以誘導(dǎo) T、B細(xì)胞的細(xì)胞凋亡和，通過使其配體FAS連接到被靶細(xì)胞( 表達(dá)的FAS的天然殺傷物 (natural killer)。SC實施其免疫調(diào)節(jié)作用的另一種機(jī)制是制造轉(zhuǎn)化生長因子-β (TGF-β) (3)。這
3種分子影響了對Th2型(保護(hù)性免疫)的偏愛高于Thl型(非保護(hù)性免疫)的T CD4+淋巴細(xì)胞分化的表型?？傊?，塞爾托利(Sertoli)活性因此可以對Tl DM具有直接的臨床重要性，因為β-細(xì)胞被主要由淋巴細(xì)胞ThKINF-γ陽性)組成的滲入物破壞。而且，SC免疫調(diào)節(jié)效果與分化和抗細(xì)胞凋亡的數(shù)個生長因子的產(chǎn)生相關(guān)聯(lián)，如轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-D)、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)、白介素-I(IL-I)、干細(xì)胞因子 (cKit-配體)、Fas/Fas 配體(Fas-L)、激活素 A 和最終 BCLi (4)。最相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)(參考文獻(xiàn)5)描述了將SC引入到超純藻酸鹽微膠囊中的方法，所得微膠囊平均直徑為520 士 14 μ m。在寫本文時，在國際水平上這樣的膠囊是令人滿意的直徑為約500 μ m并且“尾部(tail)”百分比不大于5%。該膠囊直徑和尾部百分比都是非常重要的參數(shù)。該第一個參數(shù)應(yīng)盡可能減小從而允許更有效的代謝物交換，對于該第二個參數(shù)，最近發(fā)現(xiàn)甚至<5% 的尾部百分比都可能會引發(fā)具有非常重大影響的炎癥，因為形成了 “抵抗減弱部(loci minoris resistentiae) ”，其中細(xì)胞抗原將被暴露。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)一種能夠在不存在尾部結(jié)構(gòu)的情況下制造較小尺寸的均勻微膠囊的方法，該尾部結(jié)構(gòu)可以封裝SC同時保持它們的活力和功能不受影響?？紤]到上面情況，本發(fā)明人首次提出，通過在不存在黑索金胰島組織的情況下移植經(jīng)微膠囊化制成水凝膠類微球體的SC來預(yù)防和/或治療TlDM的可能性。因此，本發(fā)明的目的在于制造包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的塞爾托利細(xì)胞(SC)的水凝膠類微膠囊的方法。


本說明書附有九個附圖，其示出圖1.豬SC的微觀照片。A:免疫細(xì)胞化學(xué)，通過將該制劑和抗苗勒氏 (anti-mullerian)抑制因子(MK)抗體一起孵化獲得。B 免疫細(xì)胞化學(xué)，通過將該制劑與抗波形蛋白(anti-vimentin)抗體一起孵化獲得。C-D 為了證明間質(zhì)細(xì)胞和管周細(xì)胞的存在較少，利用組織化學(xué)技術(shù)對該制劑進(jìn)行處理，從而評價用堅牢紅染色的堿性磷酸酶(管周細(xì)胞特有的)(C)，和用硝基藍(lán)四唑染色的3-β-羥基-類固醇脫氫酶活性(間質(zhì)特有的) 的存在率⑶。圖2.通過“空氣-單噴射器(air-mono jet) ”制造經(jīng)微膠囊化制成藻酸鹽類水凝膠的SC的設(shè)備(組A)。組B示出所設(shè)計系統(tǒng)的最重要的組件。圖3.利用BaCl2 (A-C)和CaCl2+多鳥氨酸(B-D)作為膠凝劑，通過霧化系統(tǒng)“空氣-單噴射器”獲得的藻酸鹽類微顆粒的微觀照片。圖4.在植入后4個月的NOD大鼠腹腔中回收之后，與鋇㈧和鈣⑶離子交聯(lián)的多糖微顆粒透明區(qū)(亮場，clear field)的微觀照片。圖C示出用EB/FDA雙重染色之后， 通過熒光顯微鏡觀察裝入到海藻酸鋇中的微膠囊化的SC所獲得的微觀照片。圖5.由NOD大鼠(Taconic)供應(yīng)者宣稱的TlDM自發(fā)發(fā)病的百分比(85% ) (A)可與用空微膠囊治療的“自然(naive)”對照組的前驅(qū)糖尿病動物顯示的那些(B)相比。另一方面，組C示出用膠囊化SC治療的前驅(qū)糖尿病動物的TlDM發(fā)病百分比大大降低，僅為9% (預(yù)防效果)。圖6.用微膠囊化SC治療的患有明顯自發(fā)性糖尿病的NOD大鼠(組E)移植后平均血糖值(治療效果)。圖7.用微膠囊化SC治療的動物脾細(xì)胞的RT-PCR分析。結(jié)果表明對于組C和組 E動物(參見部分VII)，SC的治療可以增大陽性的體內(nèi)Foxp3細(xì)胞數(shù)目。這個結(jié)果表示T 細(xì)胞數(shù)目有著重要的增長，該T細(xì)胞具有調(diào)節(jié)特征，即，能夠調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答涉及的數(shù)個細(xì)胞的活化和增殖。圖8.前驅(qū)/糖尿病NOD大鼠㈧和自發(fā)性糖尿病大鼠⑶的胰島的組織學(xué)分析。 該圖片表明該胰島完全不受島周和島內(nèi)胰島素滲入物(insulitic infiltrate)約束。組 C和D示出用空膠囊治療的前驅(qū)糖尿病“自然”NOD大鼠(C)和患有自發(fā)性糖尿病大鼠(D) 的胰島的組織學(xué)分析。圖9.根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備的布局。
具體實施例方式首先，制造了 SC的均勻多糖懸浮液該溶液純度就細(xì)胞組分而言為90%，該溶液是在濃度為1至5% w/v，有利地為1至3% w/v的超純海藻酸鈉鹽水溶液中獲得的。所使用的海藻酸鹽是超純的，因為它表現(xiàn)出的內(nèi)毒素含量不大于20EU/g且蛋白質(zhì)含量<0.4%; 空氣有利地用作流體。SC預(yù)先用胰蛋白酶和EDTA處理(aiiin)，以便獲得均勻的細(xì)胞懸浮液。利用下面技術(shù)對它進(jìn)行評價·免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)，將該制劑與抗苗勒氏抑制因子(MIQ抗體和熒光素抗波形蛋白抗體一起孵化，其分別標(biāo)記僅被SC表達(dá)的MIS和波形蛋白分子?！そM織化學(xué)技術(shù)，以便評價管周細(xì)胞特有的堿性磷酸酶(用堅牢紅染色)的存在率，以及另一方面為間質(zhì)細(xì)胞特有的3-β-羥基-類固醇脫氫酶(用硝基藍(lán)四唑染色)的
存在率。用此種組織化學(xué)分析法獲得的結(jié)果可以證明管周細(xì)胞和間質(zhì)(Leydig)細(xì)胞的存在率為5-8% ；而且，這些細(xì)胞群體(當(dāng)以這些比例存在時)對確保有利于SC正確功能的分子“串?dāng)_(cross-talk)”有用。以10至60ml/min的速率抽吸這種懸浮液，通過利用流體流，有利地受控壓力下的空氣吸入和擠出從而產(chǎn)生連續(xù)的尺寸均勻的微滴流。將如此抽吸的懸浮液引入到針狀元件中從而使其分成高度均勻的微滴。有利地，該針狀元件在其側(cè)表面上有鈕孔開口，通過該鈕孔開口以3-7升/分鐘的速率引入流體流從而獲得連續(xù)的均勻尺寸的微滴流。該流體流從發(fā)生器中獲得并在使用之前經(jīng)受以下步驟處理經(jīng)受降低壓力，從而在瞬變流-非瞬變流之間獲得不小于0. 3巴的壓力降；經(jīng)受調(diào)節(jié)，從而在瞬變流-非瞬變流之間獲得高重現(xiàn)性并在旋轉(zhuǎn)數(shù)和分散流體流之間獲得線性關(guān)系，在0至lONL/min之間調(diào)節(jié)和控制輸出流。該微滴的平均直徑為300至700 μ m,標(biāo)準(zhǔn)偏差小于40 μ m。將所獲得的微滴引入到水溶液中，有利地使用包含二價陽離子或聚陽離子物質(zhì)的注射制劑用無菌水，F(xiàn). U，從而發(fā)生膠凝化并獲得所述微膠囊。本發(fā)明的進(jìn)一步目的是作為單獨治療劑預(yù)防和根治Tl DM的塞爾托利細(xì)胞。
有利地，根據(jù)本發(fā)明的工藝，該抽吸可以通過蠕動泵以10至16ml/min流速連續(xù)進(jìn)行，并且所述擠出通過“空氣-單噴射器”系統(tǒng)利用3至71/min的流體流，優(yōu)選空氣進(jìn)行。 在該工藝中，先前方法(包括“最相關(guān)現(xiàn)有技術(shù)”中使用的方法)中不存在的下面系統(tǒng)組件確保了，所述空氣流的精確校準(zhǔn)、整個方法的特征元件。在與所述階段b)的所述懸浮液接觸之前，利用下述設(shè)備對所述空氣流進(jìn)行下述操作；·膜壓減小器Swagelok (KPR1JRF411A20000)，其能夠確保輸出壓力的高重現(xiàn)性并以便在瞬變流/非瞬變流之間獲得小于0. 3巴的非常小的壓力降，用于穩(wěn)定空氣流和使空氣流運送到可再生的擠壓機(jī)中；·通過微米閥Swagelok(SS-SS6MM)調(diào)節(jié)，向壓力調(diào)節(jié)器輸出，該壓力調(diào)節(jié)器允許以在瞬變流/非瞬變流的高重現(xiàn)性非常精細(xì)地調(diào)節(jié)輸出空氣流(O-lONL/min)，并維持旋轉(zhuǎn)數(shù)和分散流之間的線性關(guān)系；·在該微米閥下游安設(shè)由 Precision Fluid (RAGK41-T0SS-SSNNN-M74IA-TTCG N*A)供應(yīng)的旋轉(zhuǎn)浮標(biāo)型流量計(ROTAMETRO)Yokogawa,其允許精確而快速地閱讀輸出流 (0-10NL/min)，因而允許通過該微米閥對其進(jìn)行調(diào)節(jié)。本發(fā)明的進(jìn)一步目的是包含可根據(jù)本發(fā)明工藝獲得的SC的微膠囊，其特征之一在于與所表現(xiàn)出的微膠囊化SC的IGF-I分泌與非微膠囊化SC或“游離” SC的相同。本發(fā)明的進(jìn)一步目的是有利地為根據(jù)本發(fā)明工藝微膠囊化的塞爾托利細(xì)胞，作為單獨的治療劑來制造預(yù)防和根治Tl DM的藥物的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明，可以對獲得的微膠囊執(zhí)行洗滌操作，和/或用天然和/或人工聚合物
進(jìn)一步包覆。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明工藝允許a)制造較小尺寸、直徑固定(從300μπι開始)， 優(yōu)選為均勻的微膠囊，而不存在“尾部”結(jié)構(gòu)，且沒有使微膠囊化SC的活力和功能喪失；b) 使微膠囊化SC的數(shù)目從每毫升海藻酸鹽IO6個SC增加到每毫升海藻酸鹽206個SC，這可想象地暗示著在最小的可能體積的聚合物中植入大量SC的可能性，和c)增加微膠囊化SC 的功能，特別是與IGF-I制造相關(guān)的功能，其分泌物從50ng/ml/20X 106個細(xì)胞變化為基本等于“游離” SC的80ng/ml/20X 106個細(xì)胞。參考本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)注意1、首次提出將微膠囊化SC作為誘導(dǎo)被自身免疫過程破壞的患者β -細(xì)胞新生的最終治療途徑。2.已獲得了對微膠囊化工藝的最優(yōu)化，其導(dǎo)致制造具有改進(jìn)的特征的微膠囊，如平均尺寸減小、多分散性降低以及不存在微膠囊的形態(tài)畸形(“尾部”和聚結(jié))。本發(fā)明的進(jìn)一步方面是包含SC的組合物，該SC與生理上可耐受的載體一起容納在可通過本發(fā)明工藝獲得的微膠囊中，用于預(yù)防和治療T1DM。載體的實例由用于腹膜內(nèi)施用的鹽水組成。下面是本發(fā)明的詳細(xì)方面。聚合物的純化市場上無法購得可用于微膠囊化SC的高純形式聚合物，該高純形式是腸胃外施用，如人移植所需應(yīng)用所嚴(yán)格要求的。在這些情況下，實際上，需要嚴(yán)格的國際認(rèn)可的“質(zhì)量控制，，標(biāo)準(zhǔn)(參見 guidelines of the Ministry of Health and of U. S. Pharmacopeia)。
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實際上，大多數(shù)商業(yè)產(chǎn)品的內(nèi)毒素水平都非常高(一般在30，000和60，000EU/g 之間)，這使得它們完全不適合于移植程序，移植程序要求內(nèi)毒素水平不大于100EU/g。因為上面的原因，用于制造微顆粒的所有聚合物都適合經(jīng)受隨后的純化循環(huán)，該循環(huán)使得存在的內(nèi)毒素大幅減少。SC的分離可從一般為青春期前的各種動物來源中分離和純化出SC。麻醉之后，對動物執(zhí)行雙側(cè)睪丸切除術(shù)。在除去副睪之后，對該睪丸執(zhí)行多酶消化(multienzymatic digestion) 處理。該消化處理完成后，過濾管狀組織。將如此獲得的小管放置在37°C、5%C02氣氛下的培養(yǎng)物中。在孵化器中48小時之后，該SC開始粘附到培養(yǎng)皿中，形成細(xì)胞單層。對所得 SC的純度、活力和功能進(jìn)行分析。該細(xì)胞活力測試通常在分離之后常規(guī)地立即進(jìn)行、在培養(yǎng)的第二天，以及緊接在微膠囊化過程之前和之后進(jìn)行。微膠囊化塞爾托利細(xì)胞的制造可將該SC固定到由各種水凝膠組成的微膠囊中，該水凝膠由單獨使用或混合使用的親水性聚合物組成。該微膠囊工藝的起始階段設(shè)想了獲得連續(xù)和校準(zhǔn)的微滴流?？梢岳酶鞣N程序獲得微滴(a)“空氣-單噴射器”微膠囊包裝器、(b)自動振動式膠囊包裝器、 (c)靜電式微膠囊包裝器、(d)微流控芯片系統(tǒng)(microfluidic lab-on-a-chip system)。一旦獲得具有受控和均勻尺寸的微滴流后，這些通過凝膠化程序轉(zhuǎn)化成固體微球體。例如，處理聚集的SC單層從而獲得均勻的細(xì)胞懸浮液，將該SC重懸在各種超純聚合溶液(按“純化聚合物”部分中描述的方法獲得)中，最后，洗滌和分離在凝膠浴中獲得的微膠囊。所制造的微膠囊可以照原樣使用或用各種天然、半合成或合成的聚合物層進(jìn)一步包覆。 因此，所提出的方法允許(如圖3中的圖所示)將SC固定在尺寸高度均勻的微膠囊中，而沒有形態(tài)缺陷(存在聚結(jié)或“尾部”結(jié)構(gòu))，從而確保該膠囊化細(xì)胞的活力和功能特征得以維持。膠囊化SC的體內(nèi)生物相容性該微顆粒生物相容性通過腹膜內(nèi)植入進(jìn)行評價，該腹膜植入通過剖腹術(shù)進(jìn)行。在整個體內(nèi)研究中監(jiān)測每個接受動物的體重。在移植后的不同時間，將微膠囊移出(explant) 從而評價該膠囊化細(xì)胞的形態(tài)和功能?；厥盏奈⑶蝮w的一般特征可通過顯微分析確定，評價膠囊表面形態(tài)和存在的任何炎性細(xì)胞。微膠囊化SC的活力也可以利用EB/FDA的雙重染色技術(shù)評價。微膠囊化SC的體內(nèi)活性評價已證明鹽水中微膠囊化SC的腹膜內(nèi)移植能夠預(yù)防和治療人Tl DM的“嚴(yán)謹(jǐn)型 (stringent) ”動物模型，如NOD大鼠，中的Tl DM。有利地，但非絕對，從根據(jù)本發(fā)明的SC 微膠囊化過程中獲得的產(chǎn)物通過腹膜內(nèi)施用而施用，該產(chǎn)品用鹽水運送。本發(fā)明的進(jìn)一步目的是有利地用于應(yīng)用本發(fā)明工藝、用于制造微膠囊的設(shè)備。該設(shè)備及其操作參考圖9進(jìn)行描述。第一容器2與流量分配裝置4配合，該分配裝置4有利地為容積泵，并通過捕捉管(catching tube) 3將懸浮液1遞送給針狀元件5。該針狀元件 5在其側(cè)壁具有鈕孔開口 6，和輸出孔7。聯(lián)接件8允許來自發(fā)生器9并被調(diào)節(jié)裝置11調(diào)節(jié)的受壓流體流10，優(yōu)選空氣進(jìn)入到元件5的內(nèi)部。通過適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)流10，可以中斷懸浮液流并獲得均勻尺寸的微滴13，該微滴在包含存在于第二容器12中的二價陽離子的溶液中形成凝膠。上述空氣噴射儀器和所述條件適于獲得均勻的微膠囊。可在無菌條件和GLP下使用的微膠囊包裝器原型的開發(fā)實施例塞爾托利細(xì)胞微膠囊化成為海藻酸鹽類微球體的過程以及體內(nèi)生物相容性和功能的評價聚合物的純化通過相繼的過濾過程獲得的海藻酸鈉用作制造微膠囊的原料聚合物(base polymer)，其通?？梢?-6% (w/v)溶液形式利用，并適當(dāng)?shù)貎Υ嬖?至6°C的避光場所中。 隨著時間的推移所述化合物可以穩(wěn)定約5年，其內(nèi)毒素含量不大于20EU/g，實際上無蛋白質(zhì)含量(< 0. 4% -美國FDA “生物不可見性(bioinvisibility) ”的另一標(biāo)準(zhǔn))。從青春期前幼豬中的SC的分離從幼豬(7-15天大)“大白豬(Large-White) ”的睪丸中分離出SC。在通過肌肉注身寸 0. lmg/kg 阿扎哌隆(azaperon) ( Stresnil 40mg/ml, Janssen, Brusselle, Belgium) 禾口 15mg/kg 開他敏(ketamine) (Imalgene lOOmg/ml, Gellini Farmaceutici)進(jìn) 亍麻醉之后，對該豬執(zhí)行雙側(cè)睪丸切除術(shù)。在除去副睪之后，從白膜中剝?nèi)ゲG丸，將其切成小組織片段(l-3mm3)，并立即基于 HBSS (Sigma Chemical Co, St. Louis, USA)中的膠原酶 P (Roche Diagnostics, S. p. A.，Monza, Italy) (2mg/ml)對該片段進(jìn)行第一次酶消化處理。該消化持續(xù)到細(xì)精管的分離。所收集的小管然后用HBSS洗滌，并在500r. p. m下離心。在洗滌之后，該小管用含有胰蛋白酶Omg/ml)和DNAse I (Sigma)的HBSS溶液孵化。在完成第二次消化之后，該胰蛋白酶溶液用Hank' s+20%FBS進(jìn)行1 1稀釋從而終止其酶活性。在用 HBSS進(jìn)一步洗滌之后，通過在300rpm下的輕微離心從管周細(xì)胞中分離出小管。包含管狀組織的“球粒”適合用帶有500 μ m網(wǎng)孔的不銹鋼過濾器過濾。最后，為了除去污染該制劑的任何管周細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞，將包含該小管的懸浮液進(jìn)一步在SOOrpm下離心5分鐘，所得球粒用甘氨酸溶液IM和pH 7. 2的HBSS中的EDTA 2mM處理7分鐘。將如此獲得的小管放置在37°C，5% CO2氣氛下的HAM F12 (Euroclone)中的培養(yǎng)物中，該培養(yǎng)物補充有維甲酸0. 166nM(Sigma)和5ml/500ml胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒 (ITS) (Becton Dickinson#354352)。培養(yǎng)48小時之后，該SC開始粘附該培養(yǎng)皿，形成細(xì)胞單層。為了除去殘余的生殖細(xì)胞(如所知的，如果植入在腹膜腔中其可引起無性細(xì)胞瘤 (dysgerminoms))，用緩沖液三(羥甲基)_氨基甲烷鹽酸鹽(TRIS) (Sigma)處理該SC單層， 該緩沖溶液可以通過滲透裂解消除殘余的生殖細(xì)胞。最后，SC在上述條件下生長，通常在 75cm2燒瓶中。對所得SC的純度、活力和功能進(jìn)行分析。通過免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)評價，SC的純度大于90%，將該制劑與抗苗勒氏抑制因子(MIQ和熒光素抗波形蛋白抗體一起孵化，其分別標(biāo)記僅被SC表達(dá)的MIS和波形蛋白分子的(圖1A、B)。為了證明作為可能的污染物的間質(zhì)和管周細(xì)胞的減少，對SC制劑進(jìn)行組織化學(xué)評價。這些測試允許評價管周細(xì)胞特有的堿性磷酸酶(用堅牢紅染色)的存在率，和間質(zhì)特有的3-β-羥基-類固醇脫氫酶(用硝基藍(lán)四唑染色)的存在率(圖1C、D)。用這些組織化學(xué)分析法獲得的結(jié)果可以證明管周細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的存在率為5-8% ；而且，這些細(xì)胞群體(當(dāng)以這些比例存在時)對確保有利于SC正確功能的分子“串?dāng)_”有用。
SC的活力通過用溴化乙錠(EB)和熒光素雙醋酸酯(FDA) (Sigma)的處理確定。通過熒光顯微鏡觀察到的細(xì)胞在所有條件下都表現(xiàn)出大于95%的活力。細(xì)胞活力測試通常在分離之后常規(guī)地立即進(jìn)行、在培養(yǎng)的第二天，以及緊接在微膠囊化過程之前和之后進(jìn)行。C)膠囊化塞爾托利細(xì)胞的微滴的制造將該SC固定到由各種單獨使用或混合使用的多糖聚合物組成的微膠囊中。所選聚合物是在我們實驗室超純化的海藻酸鈉。微膠囊化過程的起始階段設(shè)想了從在聚合物濃度可在1和5% (w/v)之間變化的水性多糖懸浮液中的SC細(xì)胞懸浮液開始獲得連續(xù)和校準(zhǔn)的微滴流。各種程序是并且可以用于獲得微滴(a) “空氣-單噴射器”微膠囊包裝器、(b)自動振動式膠囊包裝器、(c)靜電式微膠囊包裝器、(d)微流控芯片系統(tǒng)。特別地，該方法選擇基于半自動化、緊密的、可滅菌并可運送的微膠囊包裝器(圖 2示出該系統(tǒng)的總體外觀)的(a)，已允許制造包含尺寸(300 μ m至700 μ m直徑)高度尺寸均勻的SC的微膠囊，而沒有任何明顯的形態(tài)缺陷(如存在聚結(jié)或“尾部”結(jié)構(gòu))，并且重要的是，沒有使微膠囊化SC失去活力和功能。圖2的組B系統(tǒng)化地描述了通過“空氣-單噴射器”的微膠囊化過程的程序D)制備超純的海藻酸鹽類微膠囊一旦獲得具有受控和均勻尺寸的微滴流后，這些通過凝膠化程序轉(zhuǎn)化成固體微球體，該程序設(shè)想了根據(jù)在我們實驗室開發(fā)且生效的方法由二價離子形成離子連接物(ionic link)ο特別地，用0. 05%胰蛋白酶/EDTA(Gibco，Garndisland，USA)處理聚集的SC單層 (2min)，以便獲得均勻的細(xì)胞懸浮液。洗滌后，通過血球計算分析對該SC進(jìn)行計數(shù)，并測試其活力。然后，將SC重懸在各種超純聚合懸浮液中，該懸浮液中AG的濃度可在1.5-2% (w/ ν)之間變化。對于用“空氣-單噴射器”系統(tǒng)制造微膠囊，通過蠕動泵，以10至16ml/min 的流速連續(xù)抽吸該聚合物中的SC懸浮液。然后通過該“空氣-單噴射器”系統(tǒng)(利用3至 71/min的空氣流)擠出該細(xì)胞懸浮液。整個過程中，保持SC懸浮液處在輕微攪拌狀態(tài)下， 從而阻止該細(xì)胞的聚集以及SC在其中非均勻分布的微膠囊形成的可能。所制得的微滴利用包含二價陽離子如Cf2或Ba+2(0.5-2.5%，w/v)的溶液膠凝。 以這種方式，將該微滴瞬間轉(zhuǎn)化成凝膠微球體。然后，將該微膠囊放在凝膠浴中，持續(xù)一段可在2和15分鐘之間變化的時間。在這個步驟結(jié)束時，用鹽水對該微膠囊執(zhí)行重復(fù)的洗滌循環(huán)。所制造的微膠囊可以照原樣使用或通過在包含天然、半合成或合成的陽離子聚合物的溶液中相繼孵化而被進(jìn)一步包覆。例如，使用0.12% (持續(xù)10分鐘)和0.06% (持續(xù)6分鐘)的聚-L-鳥氨酸(PLO)。最后，用PLO包覆的微膠囊利用稀釋的多糖溶液進(jìn)一步處理，從而提供高度生物相容的最終外包覆層。圖3示出通過均僅僅利用鋇離子的上述步驟(A-C)，和用鈣/聚鳥氨酸/聚合物離子多層涂覆的步驟(B-D)獲得的海藻酸鹽類微膠囊的微觀照片。因此，所提出的方法允許 (如圖3中的圖所示)將SC固定在高度尺寸均勻的微膠囊中，而沒有形態(tài)缺陷如存在聚結(jié)或“尾部”結(jié)構(gòu)，并最終確保該膠囊化細(xì)胞的活力和功能特征得以維持。E)膠囊化SC的體內(nèi)生物相容性
在通過腹膜內(nèi)施用100mg/kg 開他敏(Parke-Davis/Pfizer，Karlsruhe，德國)和 15mg/kg甲苯噻嗪(xylazine) (Bayer, Leverkusen，德國)誘導(dǎo)的全身麻醉之后，通過在雌性NOD大鼠(意大利，Harlan，重量約為25g)腹膜腔上的小剖腹術(shù)引入該海藻酸鹽微顆粒。 將106微膠囊化SC植入每只動物中。在整個體內(nèi)研究過程中監(jiān)測每只接受大鼠的體重。移植4個月之后，麻醉后從該動物的腹膜腔內(nèi)移出微膠囊，從而評價其內(nèi)含物的形態(tài)和功能。該微膠囊利用鹽水通過腹膜洗滌回收?；厥盏奈⑶蝮w的一般特征可通過顯微分析確定，評價膠囊表面形態(tài)和存在的任何炎性細(xì)胞。還可以利用EB/FDA的雙重染色技術(shù)評價該微膠囊化SC的活力。圖4(A_B)中示出的微觀照片表明該多肽微顆粒保持著高生物相容性標(biāo)準(zhǔn)，如膠囊表面上存在最低水平的炎性細(xì)胞所示的。而且，在植入后4個月(圖4C)，海藻酸鋇(圖 4A)和海藻酸鈣(圖4B)中的微膠囊化SC都保持著優(yōu)異的活力水平。E)微膠囊化SC的體內(nèi)和體外活性評價本發(fā)明可以應(yīng)用于移植生物技術(shù)領(lǐng)域，例如預(yù)防和治療Tl DM。實際上，在我們實驗室我們已證明海藻酸鋇微球體中微膠囊化SC的腹膜內(nèi)移植(206/大鼠)能夠預(yù)防和治療人Tl DM的“嚴(yán)謹(jǐn)型”動物模型，如NOD大鼠的Tl DM。特別地，經(jīng)微膠囊化制成海藻酸鋇 (BaAG)微球體的SC在72小時的培養(yǎng)之后移植在前驅(qū)糖尿病NOD大鼠腹膜腔中，而且明顯受到糖尿病的影響。該植入是在全身麻醉的情況下通過剖腹術(shù)進(jìn)行的。然后每周檢查受移植動物的體重以及餐前和餐后血糖。我們所依照的實驗方案設(shè)想了對多組動物進(jìn)行不同的治療，如下所指出的。組A “自然”前驅(qū)糖尿病對照動物(用空微膠囊治療)組B 自發(fā)性糖尿病對照動物(用空微膠囊治療)組C 通過腹膜內(nèi)植入微膠囊化SC治療的“自然”前驅(qū)糖尿病動物組D 通過腹膜內(nèi)植入“游離” SC(206/大鼠)治療的“自然”前驅(qū)糖尿病動物組E 通過腹膜內(nèi)植入微膠囊化SC治療的自發(fā)性糖尿病動物在體內(nèi)研究過程中，處死一些動物從而通過收集脾、胰周淋巴結(jié)和胰腺，用并行的組織形態(tài)學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)檢查評價外周免疫布局。NOD大鼠體內(nèi)實驗的完整分析已可以證明在罹患自發(fā)性糖尿病的前驅(qū)糖尿病動物中的移植的微膠囊化SC可以獲得如下所示重要的治療結(jié)果。-㈧微膠囊化SC能夠阻止NOD大鼠的TlDM發(fā)病。這種極好的(sensational) 結(jié)果可以通過分析Tl DM自發(fā)性發(fā)病的百分比而獲得。實際上，這種病理自發(fā)地發(fā)生在A 組的85%的動物中(圖5B)。這個結(jié)果與NOD大鼠的供應(yīng)商(Taconic)宣稱的Tl DM發(fā)生百分比完全一致(圖5A)。另一方面，在C組動物(用膠囊化SC治療的前驅(qū)糖尿病動物)中，TlDM發(fā)病百分比僅為9% (圖5C)。最后，在D組動物(通過腹膜內(nèi)植入“游離” SC治療的前驅(qū)糖尿病動物)中，Tl DM發(fā)病百分比相比“自然”組動物的發(fā)病百分比(19%)大大降低，但高于C組動物(圖5D)。-⑶在植入后的7至15天，該微膠囊化SC能夠使已患有自發(fā)性糖尿病E組(N= 30)中多于60%大鼠的血糖值(達(dá)到低于200mg/dl的血糖水平)恢復(fù)正常(圖6A)。另一方面，B組動物(用空膠囊治療的糖尿病動物)總是保持著高血糖水平，它們在1-2周內(nèi)很快死亡。最后，F(xiàn)組動物(N = 30)(通過腹膜內(nèi)植入“游離”SC治療的糖尿病動物)可以使血糖值正?；前俜直容^低，約等于40 %。"(C)對淋巴結(jié)、胰腺和脾進(jìn)行的研究已證明，SC能夠“再教育(re-educating) ”C 和E組動物的免疫系統(tǒng)，“阻擋”導(dǎo)致疾病的自身免疫攻擊，如與對受治療動物脾細(xì)胞的實時聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)結(jié)果相關(guān)的圖7所示。特別地，此種結(jié)果表明，用SC治療的其中一個主要效果是它們在活體內(nèi)誘導(dǎo) ^οχρβ+細(xì)胞的能力。Foxp3是T細(xì)胞的選擇性標(biāo)記物，該T 細(xì)胞具有調(diào)節(jié)特征，即，能夠調(diào)節(jié)涉及免疫應(yīng)答的數(shù)個細(xì)胞的活化和增殖，其數(shù)目在NOD大鼠模型中降低。-(D)對所研究的所有動物組進(jìn)行的組織化學(xué)測定表明，與對照組(A和B)相比，利用SC的治療能夠除去C組和E組動物中胰腺水平的胰島素單核滲入物(圖8)。而且，此種效果之后即為胰腺間充質(zhì)干細(xì)胞的活化，該干細(xì)胞能夠產(chǎn)生新β-細(xì)胞，該新β-細(xì)胞能夠使利用SC治療的動物血糖恢復(fù)正常，因為它們不再被自身免疫攻擊漸漸破壞。在用SC治療后，免疫應(yīng)答的再調(diào)節(jié)通過活化吲哚胺2，3-二氧化酶(IDO)免疫調(diào)節(jié)途徑介導(dǎo)，其同種型也在SC中被表達(dá)和功能化。參考文獻(xiàn)1. DeCesaris P, Filippini A, Cervelli C, Riccioloi, Α. ；Muci, S. ；Starace, G. ；Stefanini, M. Ziparo, E. Immuno-suppressive molecules produced by Sertoli cells cultured in vitro :Biological effects on lymphocytes. Biochem. Biophys Res. Commun. 1992,1861639-1646.2. Lynch DH, Ramsdell F, Alderson MR. Fas and FasL in the homeostatic regulation of immune responses. Immunol. Today 1995,16 :569-574.3. Suarez-Pinzon W,Korbutt G S,Power R,Hooten J,Rajotte R V,Rabinovitch A. Testicular Sertoli cells protect islet B—cells from autoimmune destruction by a transforming growth factor-β 1-dependent mechanism. Diabetes 2000,49: 1810-1818.4. Emerich, D. F. , Hemendinger , R. , and Halberstadt, C. R. The Testicular-Derived Sertoli Cell Ce 1IuIar Immunoscience to Enable Transplantation,Cell Transplantation 12,335,2003.5. Luca, G. , Calvitti, Μ. , Nastruzzi, C, Bilancetti, L. , Becchetti, Ε., Mancuso, F. , Calafiore R.Encapsulation, in Vitro Characterization and in Vivo Biocompatibility of Sertoli' s Cells in Alginate Based Microcapsules. Tissue Eng.2007，13 :641-648.
權(quán)利要求
1.一種用于制造含有塞爾托利細(xì)胞(SC)的水凝膠類微膠囊的方法，包含下列步驟a.制造在濃度為1至5%w/v的超純海藻酸鈉的鹽水溶液中的SC均勻懸浮液，其純度對于細(xì)胞組分而言大于90% ；b.以10至60ml/min的速率抽吸所述懸浮液，并將其引入到針狀元件中；c.通過注入3至7升/min的流體流來擠出所述針狀元件內(nèi)的所述懸浮液，從而獲得均勻尺寸的連續(xù)微滴流；d.將所述流的所述微滴引入到含有二價陽離子或聚陽離子物質(zhì)的水溶液中，從而發(fā)生凝膠化并獲得所述微膠囊。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述針狀元件在其側(cè)壁上具有鈕孔開口，并且所述流體流通過所述開口加入。
3.根據(jù)前述權(quán)利要求中至少一項所述的方法，其中，所述微膠囊由海藻酸鈉制成，其濃度為1-3% w/v，其中內(nèi)毒素含量不超過20EU/g且蛋白質(zhì)含量低于0. 4%。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中至少一項所述的方法，其中，所述流體流通過發(fā)生器獲得，并在用于所述步驟c)中之前經(jīng)受下列步驟處理a.降低壓力，從而在瞬態(tài)流/非瞬態(tài)流之間獲得小于0.3巴的壓力降；b.調(diào)節(jié)，以便在瞬態(tài)流/非瞬態(tài)流之間獲得較高的重現(xiàn)性，以及在路徑數(shù)和所產(chǎn)生的流體流之間獲得線性關(guān)系；c.在O和10NL/min之間調(diào)節(jié)和調(diào)整所述流出流。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中至少一項所述的方法，其中，對從步驟d)中獲得的所述微膠囊進(jìn)行洗滌和/或隨后用天然和/或人工聚合物進(jìn)一步涂覆。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中至少一項所述的方法可獲得的包含SC的微膠囊。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的微膠囊，其含有至少20X IO6個SC。
8.作為用于預(yù)防和治療TlDM的單獨的治療劑的SC。
9.包含根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的微膠囊以及生理上可耐受的載體的組合物，所述組合物用于預(yù)防和治療Tl DM。
10.用于從多糖懸浮液開始制造微膠囊的設(shè)備，包含a.用于所述懸浮液的容器b.用于通過針狀元件遞送所述懸浮液流體的裝置；c.用于中斷能夠與所述針狀元件配合的所述流的裝置，以制造微膠囊，其特征在于，所述用于中斷所述流的所述裝置包含用于在受控壓力下在所述針狀元件中注入流體流的系統(tǒng)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的設(shè)備，其中，用于注入流體流的所述系統(tǒng)包括在所述針狀元件側(cè)壁上獲得的紐扣開口，所述紐扣開口用于在受控壓力下注入所述流體。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11的至少一項所述的設(shè)備，其中，所述用于遞送的裝置包含捕捉管、蠕動泵和針狀元件。
13.根據(jù)權(quán)利要求10至12中的至少一項所述的裝置，其中，用于注入的所述系統(tǒng)包含連接元件、流體發(fā)生器，優(yōu)選空氣發(fā)生器，以及用于調(diào)節(jié)壓力的裝置。
全文摘要
本發(fā)明涉及經(jīng)微膠囊化制成水凝膠類微膠囊的塞爾托利細(xì)胞(SC)，用于預(yù)防和/或治療1型糖尿病(T1 DM)，以及涉及用于制造形狀優(yōu)選為微球體的微膠囊的方法。
文檔編號A61P3/10GK102256601SQ200980151428
公開日2011年11月23日 申請日期2009年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月19日
發(fā)明者喬瓦尼·盧卡, 保羅·普塞蒂, 克勞迪奧·納斯特魯齊, 弗朗西斯卡·法拉里諾, 恩尼奧·比切蒂, 里卡爾多·卡拉菲奧雷, 馬里奧·卡爾維蒂 申請人:生長激素護(hù)理公司d/b/a奧特尤賽爾公司