專利名稱：新的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白貨物結(jié)合分子的制作方法
新的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白貨物結(jié)合分子本發(fā)明涉及新的通式(I)D1LLLxDm(LLLyDn)a的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物及其變體。本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白貨物結(jié)合分子，特別是具有貨物部分的新的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物結(jié)合物，貨物部分例如蛋白質(zhì)或肽、核酸、細(xì)胞毒性劑、有機(jī)分子等。此外，本發(fā)明公開(kāi)了包括這些結(jié)合物的 (藥物)組合物和牽涉這樣的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物的治療方法和用途。使感興趣的物質(zhì)，如核酸、蛋白質(zhì)或細(xì)胞毒性劑，而且還有其它(治療上有用的) 化合物能夠從外部介質(zhì)有效地轉(zhuǎn)移進(jìn)組織或細(xì)胞，特別是轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核的技術(shù)在生物技術(shù)領(lǐng)域相當(dāng)受關(guān)注。這些技術(shù)可適于體外和體內(nèi)運(yùn)輸并翻譯核酸進(jìn)細(xì)胞，并因此適于蛋白質(zhì)或肽生產(chǎn)、適于基因表達(dá)調(diào)節(jié)、適于細(xì)胞毒性效應(yīng)或凋亡效應(yīng)的誘導(dǎo)、適于細(xì)胞內(nèi)過(guò)程的分析以及適于運(yùn)輸各種不同貨物進(jìn)細(xì)胞(或細(xì)胞核)的影響的分析等。感興趣貨物從外部介質(zhì)到組織或細(xì)胞的這種轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要應(yīng)用是基因治療，其中所述貨物通常是核酸或基因。管該技術(shù)在過(guò)去十年已顯示一些相當(dāng)有前景的發(fā)展，但是基因轉(zhuǎn)移通常受限于基因轉(zhuǎn)移載體不能有效地將生物活性貨物轉(zhuǎn)移進(jìn)將被治療的宿主的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核而不影響宿主基因組或改變活性貨物的生物學(xué)性質(zhì)。在這方面，已發(fā)展了幾項(xiàng)技術(shù)，以努力更有效地將例如核酸，如DNA或RNA，轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞。通過(guò)基因轉(zhuǎn)移的方法將核酸轉(zhuǎn)染進(jìn)患者的細(xì)胞或組織是分子醫(yī)學(xué)的重要方法并在眾多疾病的治療和預(yù)防中起關(guān)鍵作用?；蜣D(zhuǎn)移方法的代表性例子包括普通(物理的或物理化學(xué)的)方法如用磷酸鈣或 DEAE-葡聚糖共沉淀核酸，這是能使核酸穿透質(zhì)膜然后進(jìn)入細(xì)胞和/或細(xì)胞核的方法。然而，該技術(shù)遭受低轉(zhuǎn)移效率和高百分比細(xì)胞死亡的困擾。另外，由于其本身的性質(zhì)，該方法局限于體外或離體方法，但不適用于體內(nèi)情況。對(duì)于涉及體外電穿孔的方法同樣如此。體外電穿孔基于高壓電流的使用，使細(xì)胞膜變得可透過(guò)，以允許新的核酸，例如DNA或RNA引入細(xì)胞。然而，這樣的方法通常不適于體內(nèi)。此外，該技術(shù)同樣遭受低轉(zhuǎn)移效率和高百分比細(xì)胞死亡的困擾。另外熟知的物理或物理化學(xué)方法包括(裸)核酸的(直接)注射或生物射彈基因轉(zhuǎn)移。生物射彈基因轉(zhuǎn)移(也稱作生物射彈粒子轟擊)是在康奈爾大學(xué)開(kāi)發(fā)的方法，其允許將遺傳物質(zhì)引入組織或培養(yǎng)細(xì)胞。生物射彈基因轉(zhuǎn)移通常通過(guò)表面包被金屬的顆粒，如金或銀顆粒而完成，并通過(guò)使用基因槍將包括被吸附的DNA的這些金屬顆粒射進(jìn)細(xì)胞。與上面所討論的相似，該方法局限于體外或離體方法，但通常不適用于體內(nèi)情況。其它方法利用所謂的轉(zhuǎn)運(yùn)分子的轉(zhuǎn)運(yùn)能力。將在該上下文中使用的轉(zhuǎn)運(yùn)分子通?？梢员环譃椴《据d體，即轉(zhuǎn)運(yùn)分子，其包括病毒元件(viral element)；以及非病毒載體。當(dāng)今可利用的最成功的基因治療策略依賴于病毒載體，如腺病毒、腺伴隨病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和皰疹病毒。這些病毒載體通常應(yīng)用對(duì)DNA和核酸具有強(qiáng)親和力的病毒相關(guān)物質(zhì)的結(jié)合物。由于其感染性質(zhì)，病毒或病毒載體具有非常高的轉(zhuǎn)染速率。以在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中不形成功能性感染顆粒的方式，基因修飾通常使用的病毒載體。然而，盡管有這個(gè)安全措施， 但是存在許多與涉及免疫原性、細(xì)胞毒性和插入誘變的病毒載體有關(guān)的問(wèn)題。舉例來(lái)說(shuō)，不能排除引入的治療上有活性的基因或病毒基因的不受控增殖的危險(xiǎn)，例如，由于可能的重組事件。另外，病毒結(jié)合物難于利用并通常在治療之前需要長(zhǎng)期的制備(參考，例如，美國(guó)專利號(hào) 5，521，291)。盡管非病毒載體不象病毒載體一樣有效，但是已開(kāi)發(fā)了許多非病毒載體以在基因治療中提供更安全的選擇。最常見(jiàn)的非病毒載體中的一些包括聚乙稀亞胺、樹(shù)狀聚體、殼聚糖、聚賴氨酸和基于肽的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)，例如許多種類的肽，它們通常本性是陽(yáng)離子的并能與核酸諸如質(zhì)粒DNA通過(guò)靜電相互作用而相互作用。為了成功的輸送，非病毒載體，特別是基于肽的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)必須能克服許多障礙。這樣的障礙包括在運(yùn)輸期間貨物部分，例如DNA或其它化合物的保護(hù)，以及貨物部分在體內(nèi)早期降解或代謝的預(yù)防。在核酸，如DNA和RNA分子的情況下，非病毒載體必須另外能特異性地輸送這些分子，以在靶細(xì)胞中有效表達(dá)基因。尤其是對(duì)于核酸，如DNA和RNA分子，非病毒載體目前必須克服4個(gè)障礙以達(dá)到成功地輸送基因(參考，例如 Martin et al. ,The AAPS Journal 2007 ；9 (I)Article 3)。非病毒載體必須能1)緊密地結(jié)合并保護(hù)核酸，2)它必須能靶向特異的細(xì)胞表面受體，3)非病毒載體必須能分裂內(nèi)體膜，和4)它必須將核酸貨物輸送到核并允許編碼的蛋白質(zhì)或肽序列的翻譯。這樣的非病毒載體，特別是基于肽的非病毒載體，相對(duì)于其它非病毒策略有利，因?yàn)樗鼈円话愣阅艿竭_(dá)所有這4個(gè)目的，然而，關(guān)于不同的障礙具有不同的效率。舉例來(lái)說(shuō)，富含堿性殘基如賴氨酸和/或精氨酸的陽(yáng)離子肽能有效地將核酸如 DNA濃縮成可以穩(wěn)定于血清中的小的緊密的顆粒。此外，肽配體與多聚物/核酸復(fù)合物 (polyplex)的連接允許靶向特異受體和/或特異細(xì)胞類型。如上述的多聚物/核酸復(fù)合物或陽(yáng)離子聚合物通常與帶負(fù)電荷的核酸形成復(fù)合物，所述復(fù)合物導(dǎo)致核酸的濃縮，并保護(hù)這些核酸免于降解。利用多聚物/核酸復(fù)合物(陽(yáng)離子聚合物)向運(yùn)細(xì)胞運(yùn)輸通常通過(guò)受體介導(dǎo)的胞吞作用而發(fā)生。因此，通過(guò)例如結(jié)合到表面受體并觸發(fā)胞吞作用的多聚物/核酸復(fù)合物聚左旋賴氨酸(PLL)，將DNA偶聯(lián)到獨(dú)特的分子，如轉(zhuǎn)鐵蛋白。多聚物/核酸復(fù)合物(陽(yáng)離子聚合物)包括例如聚左旋賴氨酸(PLL)、殼聚糖、聚乙稀亞胺(PEI)、聚甲基丙烯酸二甲胺乙酯(polydimethylaminoethylmethacrylate) (PD-MAEMA)、聚酰胺(PAMAM)。這樣的作用還從納米顆粒/核酸復(fù)合物(nanoplexes)(納米顆粒系統(tǒng))或脂質(zhì)/核酸復(fù)合物 (lipoplexes)(脂質(zhì)體系統(tǒng))得知。納米顆粒/核酸復(fù)合物(納米顆粒系統(tǒng))通常包括聚丙烯酸酯、聚酰胺、聚苯乙烯、氰基丙烯酸酯、聚乳酸(polylactat) (PLA)、聚(乳酸乙醇酸共聚物)(PLGA)等的使用。脂質(zhì)/核酸復(fù)合物或脂質(zhì)體系統(tǒng)通常包括能模擬細(xì)胞膜的陽(yáng)離子脂質(zhì)的使用。因此，脂質(zhì)帶有正電荷的部分與核酸帶有負(fù)電荷的部分相互作用，并因而能夠與細(xì)胞膜融合。脂質(zhì)/核酸復(fù)合物或脂質(zhì)體系統(tǒng)包括，例如D0TMA、DOPE、D0SPA、DOTAP, DC-Cho 1、EDMPC 等。在該上下文中，受體介導(dǎo)的胞吞作用在實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中同樣被廣泛利用，以向細(xì)胞靶內(nèi)向輸送貨物如核酸或治療劑。在受體介導(dǎo)的胞吞作用期間，含有貨物的復(fù)合物被位于細(xì)胞膜中的對(duì)該貨物特異的受體或者位于細(xì)胞膜組分中的特異抗體選擇性地內(nèi)在化。針對(duì)包括IgG Fe、生長(zhǎng)抑素、胰島素、IGF-I和-II、轉(zhuǎn)鐵蛋白、EGF、GLP-I、VLDL或整合素受體等在內(nèi)的許多受體，已經(jīng)描述了胞吞作用活性。通過(guò)受體介導(dǎo)的胞吞作用，已經(jīng)廣泛檢驗(yàn)了不同的肽或蛋白質(zhì)序列在基因轉(zhuǎn)移方法中的用途。令人驚奇地，通過(guò)噬菌體展示技術(shù)的應(yīng)用，已經(jīng)深深地推動(dòng)了指導(dǎo)有效的受體介導(dǎo)的胞吞作用的肽序列的分離。噬菌體展示文庫(kù)是極其強(qiáng)大的工具，其為細(xì)胞受體提供分子變體的實(shí)際上無(wú)限的來(lái)源以及短肽，所述變體包括對(duì)天然配體或貨物部分的修飾。相似的文庫(kù)也已被直接注射進(jìn)小鼠中，并且肽序列已被成功地分離，所述序列顯示對(duì)腦和腎的13倍的選擇性。前蛋白轉(zhuǎn)化酶可作為可用于將分子運(yùn)輸至細(xì)胞的肽或蛋白質(zhì)序列的例子。前蛋白轉(zhuǎn)化酶是細(xì)胞表面受體的例子，其通過(guò)受體介導(dǎo)的胞吞作用變得內(nèi)在化。已經(jīng)顯示，這些蛋白質(zhì)是造成肽激素、神經(jīng)肽和許多其它蛋白質(zhì)的前體轉(zhuǎn)變成其生物學(xué)活性形式的原因。前蛋白轉(zhuǎn)化酶家族的所有切割位點(diǎn)遵從共有序列R-X-X-R。哺乳動(dòng)物前蛋白轉(zhuǎn)化酶在其組織分布的基礎(chǔ)上可以分成三組。弗林蛋白酶、PACE4、PC5/PC6和LPCIPC7/PC8/SPC7在廣泛范圍的組織和細(xì)胞系中表達(dá)。相反，PC2和PC1/PC3的表達(dá)限于神經(jīng)內(nèi)分泌組織，如胰島、垂體、腎上腺髓質(zhì)和許多腦區(qū)域。PC4的表達(dá)高度局限于睪丸生精細(xì)胞。神經(jīng)內(nèi)分泌特異轉(zhuǎn)化酶——PC2和PC1/PC3主要位于分泌顆粒中。也已經(jīng)報(bào)道PC5/PC6A位于分泌顆粒中。此外，間接的證據(jù)已經(jīng)表明，一部分前蛋白轉(zhuǎn)化酶分子存在于細(xì)胞表面上，并且已經(jīng)顯示，弗林蛋白酶在TGN和細(xì)胞表面之間循環(huán)。總之，這些性質(zhì)表明，前蛋白轉(zhuǎn)化酶將細(xì)胞外配體運(yùn)輸進(jìn)細(xì)胞內(nèi)間隙。所謂的易位蛋白(translocatory protein)或蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(PTDs)也是有利的。來(lái)源于易位蛋白或蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(PTDs)的肽序列通常能在其酸性環(huán)境中選擇性地裂解內(nèi)體膜，導(dǎo)致多聚物/核酸復(fù)合物的胞質(zhì)釋放。易位蛋白被認(rèn)為是能影響大分子在細(xì)胞(易位蛋白)之間轉(zhuǎn)運(yùn)的一組肽，如HIV-I TAT(HIV)、觸角(果蠅屬(Drosophila)觸角)、 HSV VP22(單純皰疹)、FGF或乳鐵蛋白等。相反，蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(PTDs)被認(rèn)為是能指導(dǎo)與這些序列共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)和肽通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞的一組肽(Leifert and Whitton Translocatory proteins and protein transduction domains :a critical analysis of their biological effects and the underlying mechanisms. Molecular Therapy Vol. 8 No. 1 2003)。易位蛋白共有的以及PTDs共有的是堿性區(qū)，由于所述堿性區(qū)能結(jié)合聚陰離子如核酸，其被認(rèn)為是造成融和肽轉(zhuǎn)運(yùn)的主要原因。利用受體依賴的非飽和吸附胞吞作用，在沒(méi)有結(jié)合到其上的情況下，PTDs可以發(fā)揮與陽(yáng)離子轉(zhuǎn)染試劑相似的作用。當(dāng)給予基于疫苗的肽時(shí)，為了實(shí)現(xiàn)或增強(qiáng)CTL應(yīng)答，PTDs通常與蛋白質(zhì)或肽偶聯(lián)(參考綜述Melikov and Chernomordik， Arginine-rich cell penetrating(poly-)peptides s :from endosomal uptake to nuclear delivery, Cell.Mol.Life Sci·2005)。令人遺憾的是，由于肽酶，基于肽的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)典型地在體內(nèi)遭受蛋白質(zhì)水解性降解，導(dǎo)致截短的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(和/或貨物)序列?？蓪⑦@樣的肽酶區(qū)分為外肽酶和內(nèi)肽酶，它們都是能通過(guò)被稱作蛋白水解的過(guò)程催化蛋白質(zhì)分裂成較小的肽部分甚至分裂成單個(gè)氨基酸的酶。在該上下文中，內(nèi)肽酶是典型地蛋白水解肽酶，其破壞非末端氨基酸(即分子內(nèi))的肽鍵。內(nèi)肽酶對(duì)某些氨基酸是典型地特異的。內(nèi)肽酶的例子包括例如胰蛋白酶、糜蛋白酶、彈性蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、胃蛋白酶和內(nèi)肽酶V等。已知胰蛋白酶在Arg或Lys之后切割，除非后面跟著ftx)。已知糜蛋白酶在Phe、Trp或Tyr之后切割，除非后面跟著ftx)。 糜蛋白酶在Asn、His、Met或Leu之后較慢地切割。彈性蛋白酶在Ala、Gly、Ser或Val之后切割，除非后面跟著1^0。嗜熱菌蛋白酶是一種熱穩(wěn)定的內(nèi)切蛋白酶，其在IleJetJhe、Trp, Tyr或Val之前切割，除非前面是ftx)。嗜熱菌蛋白酶有時(shí)在Ala、Asp、His或Thr之后切割。已知胃蛋白酶在Leu、Phe、Trp或Tyr之前切害I]，除非前面是ftx)。最后，已知內(nèi)肽酶V8在Glu之后切割。與內(nèi)肽酶不同，外肽酶是催化將氨基酸從多肽鏈的末端去除并因此切割所述多肽鏈末端的酶?？筛鶕?jù)它們的切割位點(diǎn)將外肽酶區(qū)分為氨肽酶和羧肽酶。氨肽酶是典型地鋅依賴性酶并由小腸的腺體產(chǎn)生。氨肽酶通常切割來(lái)自肽或蛋白質(zhì)序列的氨基末端的單個(gè)氨基酸。羧肽酶是水解肽鍵的羧基末端(C末端)的典型的酶。人類、動(dòng)物和植物含有幾種類型的具有范圍從分解代謝到蛋白質(zhì)成熟的不同功能的羧肽酶，該酶是存在于胰液中的消化酶，將從肽的羧基端切割單個(gè)氨基酸。特定的例子是羧肽酶N(CPN)，由兩個(gè)具有酶活性的小亞基和兩個(gè)保護(hù)酶抵御降解的大亞基組成的血漿鋅金屬蛋白酶。CPN切割來(lái)自生物學(xué)上有活性的肽諸如補(bǔ)體過(guò)敏毒素、激肽和血纖肽的羧基末端氨基酸精氨酸和賴氨酸。為了改變?nèi)缟厦嫠x的基于肽的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)的蛋白酶剪切，基于肽的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)可完全由D-氨基酸組成，因此形成“逆反肽序列(retro-inverso peptide sequences) 術(shù)語(yǔ)“逆反(肽)序列”指線性肽序列的異構(gòu)體，其中序列的方向是反向的， 每個(gè)氨基酸殘基的手性是顛倒的(參見(jiàn)例如Jameson et al.，Nature，368，744-746 (1994)； Brady et al.，Nature，368，692-693 (1994))。組合D-對(duì)映體氨基酸和反向合成的優(yōu)點(diǎn)是交換每個(gè)酰胺鍵的羰基和氨基的位置，而保持側(cè)鏈基團(tuán)在每個(gè)α碳的位置。由于基于肽的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的肽序列天然存在的L-對(duì)映體氨基酸的構(gòu)象改變?yōu)镈-對(duì)映體氨基酸，體內(nèi)蛋白酶剪切的危險(xiǎn)消除了，這對(duì)貨物部分轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞的目的是有利的和高度有效的。相反，術(shù)語(yǔ) “反向序列”指序列的方向是反向的序列(但是每個(gè)氨基酸殘基的手性不是顛倒的(例如D -Arg-L-Arg-L-Arg 一 L-Ar g-L-Ar g-D-Ar g)0然而，盡管作為如上面所定義的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分子有效地工作，但是這樣的基于肽的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的肽序列天然存在的L-對(duì)映體氨基酸的構(gòu)象改變?yōu)镈-對(duì)映體氨基酸使承擔(dān)在細(xì)胞的整個(gè)生命期間這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在細(xì)胞中顯著積累或在更長(zhǎng)時(shí)間里這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在(周圍)組織或器官中顯著積累的危險(xiǎn)。因此，即使期間切割開(kāi)或代謝連接的貨物部分，這樣的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白仍可殘留在細(xì)胞中并參與進(jìn)一步的細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)過(guò)程，導(dǎo)致未知的和不需要的副作用。因此，在本領(lǐng)域中需要提供可選的非病毒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分子，優(yōu)選地是如上面所定義的基于肽的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)，其避免在細(xì)胞或組織中這樣的不需要的積累但仍然允許貨物部分有效地轉(zhuǎn)移進(jìn)細(xì)胞。如所附的權(quán)利要求書(shū)中所定義的主題，特別是如權(quán)利要求書(shū)中所定義的新的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物和其結(jié)合物(轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白貨物結(jié)合分子)解決了上面的目的。利用如權(quán)利要求書(shū)中所定義的新的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物和其結(jié)合物的方法和用途進(jìn)一步解決了上面的目的。根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，通過(guò)包括通式(I) (SEQ ID NO 1)的至少一個(gè)序列的新型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物或由通式(I) (SEQ ID NO 1)的至少一個(gè)序列組成的新型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物解決本發(fā)明的目的D1LLLxDm(LLLyDn)a其中D是D-氨基酸；L是L-氨基酸；
a是0-3，優(yōu)選地0_2，更優(yōu)選地0、1、2或3，甚至更優(yōu)選地0、1或2，最優(yōu)選地1 ；1、m和η相互獨(dú)立地是1或2，優(yōu)選地1 ；χ和y相互獨(dú)立地是0、1或2，優(yōu)選地1。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物”指含有氨基酸的化合物，其能易位跨過(guò)生物膜。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“運(yùn)輸序列”(或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白序列)指提供跨過(guò)生物膜易位的氨基酸序列。因此，根據(jù)本發(fā)明轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物包括允許轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物易位跨過(guò)生物膜的運(yùn)輸序列。因此，根據(jù)通式(I)的新的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物有效地允許并可提供貨物部分，例如蛋白質(zhì)或肽、核酸、小的有機(jī)分子、抗原、細(xì)胞毒性劑等，運(yùn)輸進(jìn)器官、組織、細(xì)胞(例如將被治療的)、細(xì)胞亞區(qū)室和/或細(xì)胞核。有利地，發(fā)明的根據(jù)通式(I)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物足夠穩(wěn)定以防止在將貨物部分運(yùn)輸?shù)狡浒形恢氨坏鞍酌附到?。另一方面，發(fā)明的根據(jù)通式(I)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物不是永久地存在于細(xì)胞中，可在相當(dāng)長(zhǎng)的期限內(nèi)被蛋白酶降解以避免不良副作用諸如新的發(fā)明轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或其結(jié)合物在細(xì)胞中的不需要的積累。如本發(fā)明人所令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，只有通過(guò)上面定義的通式(I)的發(fā)明模式(本文也被描述為D-/L-模式)，可將這樣的有益性質(zhì)給予運(yùn)輸序列，特別是在本領(lǐng)域已知的任何運(yùn)輸序列，用如通式(I)中所定義的L-氨基酸的特定內(nèi)容代替D-氨基酸的特定的內(nèi)容和位置。該發(fā)明的D-/L-模式允許熟練的技術(shù)人員將如上面所定義的本發(fā)明新型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物在細(xì)胞中的體內(nèi)或體外持久性足夠精確地定義為足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以保證在相當(dāng)長(zhǎng)的期限內(nèi)本發(fā)明新型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物被蛋白酶降解之前本發(fā)明新型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物給予到和進(jìn)入細(xì)胞或細(xì)胞核。該細(xì)胞中本發(fā)明新型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物的體內(nèi)或體外持久性實(shí)際上依賴用如通式(I)中所定義的L-氨基酸的特定內(nèi)容代替的D-氨基酸的特定內(nèi)容和位置。此外，顯示發(fā)明的上面定義的通式(I)的D-/L-模式的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物足夠短以避免諸如下面定義的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白貨物結(jié)合分子中本發(fā)明新型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物對(duì)貨物部分的空間位阻。它還允許這樣的本發(fā)明新型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物的有成本效益的制備。另外，可容易地形成上面定義的通式(I)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白肽或蛋白與蛋白質(zhì)或肽、核酸諸如DNA和RNA分子或與細(xì)胞毒性劑或甚至小的有機(jī)分子等的結(jié)合物。根據(jù)上面定義的通式(I)，本發(fā)明新型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物包括根據(jù)如通式(I)所提出的特定D-/L-模式的L-氨基酸和D-氨基酸。在本發(fā)明的背景中，L-氨基酸，也稱作L-對(duì)映體氨基酸，優(yōu)選地是選自天然存在的氨基酸或其衍生物的氨基酸。天然存在的氨基酸典型地選自標(biāo)準(zhǔn)的(蛋白原的)氨基酸丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸、以及選自非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸諸如鳥(niǎo)氨酸、瓜氨酸、同型半胱氨酸、S-腺苷甲硫氨酸、羥脯氨酸、硒代半胱氨酸、吡咯賴氨酸、羊毛硫氨酸、2-氨基異丁酸、脫氫丙氨酸、Y -氨基丁酸等。來(lái)自這樣的L-氨基酸或L-對(duì)映體氨基酸的衍生物典型地包括這些氨基酸的任何天然或非天然存在的衍生物，包括，但不限于如上所定義的氨基酸，其包括翻譯后修飾或合成修飾，包括乙?；饔?在肽序列的N端，在賴氨酸殘基處等)、脫乙酰作用、烷化諸如甲基化、乙基化等(優(yōu)選地在肽序列內(nèi)的賴氨酸或精氨酸殘基處)、脫烷基化諸如脫甲基化、脫乙基作用等、酰胺化(優(yōu)選地在肽序列的C端)、甲酰化、Y-羧化作用、谷氨?；?glutamylation)、糖基化(優(yōu)選地在肽序列內(nèi)的天冬酰胺、賴氨酸、羥賴氨酸、絲氨酸或蘇氨酸殘基處等)、血紅素或血紅素部分的加成、羥基化、碘化作用、類異戊二烯部分諸如法尼基或櫳牛兒基櫳牛兒醇(geranylgeraniol)等的異戊二烯化加成)、硫辛?；?(Iipoylation)((硫辛酸官能團(tuán)的連接)，諸如異戊二烯化、GPI錨的形成，包括豆蔻酰化、 法尼基化、櫳牛兒基忙櫳兒基化(geranylgernaylation)等、氧化、磷酸化(例如對(duì)肽序列內(nèi)的絲氨酸、酪氨酸(tytosine)、蘇氨酸或組氨酸部分等)、硫酸化作用(例如酪氨酸的硫酸化作用)、硒化(selenoylation)、硫酸化作用等。L-氨基酸的衍生物也包括、但不限于修飾的L-氨基酸，其已經(jīng)通過(guò)引入以下標(biāo)記之一被修飾(i)放射性標(biāo)記，即放射性磷酸化或帶有硫、氫、碳、氮等的放射性標(biāo)記；(ii)彩色染料(例如，地高辛配基(digoxygenin)等)；(iii)熒光基團(tuán)(例如，熒光素、羅丹明、如下面所定義的熒光染料蛋白等)；(iv)化學(xué)發(fā)光基團(tuán)；(ν)根據(jù)(i)至(iv)所述的兩種或更多種標(biāo)記的組合。L-氨基酸衍生物的尤其特別的例子包括、但不限于AMC (氨基甲基香豆素)、Dabcyl ( 二甲氨基苯基偶氮卞酉先(dimethylaminophenylazobenzoyl)) > Dansyl (二甲氨基萘磺酰(dimethylaminonaphtalenesulfonyl))、FAM(羧基熒光素 (carboxyfluoroscein)), Mca(甲氧基香豆素乙?；?、Xan (咕噸基)、Abu (氨基丁酸)、 β -Ala ( β -丙氨酸)、E-Ahx (6-氨基己酸)、α -Aib ( α -氨基異丁酸)、Ams (氨基絲氨酸 (aminoserine))、Cha (環(huán)己胺)、Dab ( 二氨基丁酸)、Hse (高絲氨酸)、Hyp (羥脯氨酸)、 Mpr (巰基丙酸)、Nal萘丙氨酸(naphtylalanine) ,Nva (正纈氨酸)、0rn (鳥(niǎo)氨酸)、Phg (苯甘氨酸)、Sar (肌氨酸)、kc (硒代半胱氨酸)、Thi (噻吩丙氨酸)等。此外，針對(duì)如上面所定義的本發(fā)明新型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物選擇的L-對(duì)映體氨基酸可進(jìn)一步選自上面定義的L-對(duì)映體氨基酸或其衍生物的特定組合。這樣的組合可包括1、 2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多個(gè)上面定義的L-對(duì)映體氨基酸或其衍生物。組合還可能是通式(I)或如本文所定義的任何子式的定義之內(nèi)任何上面定義的L-對(duì)映體氨基酸或其衍生物和任何上面定義的D-對(duì)映體氨基酸或其衍生物之間。這樣的氨基酸的特定組合可顯示對(duì)肽酶的較高或較低的穩(wěn)定性，因此可提供另外的可能性以提供如上面所定義的本發(fā)明新型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物對(duì)較高或較低穩(wěn)定性的體內(nèi)或體外穩(wěn)定性。舉例來(lái)說(shuō)，本發(fā)明新型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物可含有以D型和/或L型(即作為D-對(duì)映體氨基酸或作為L(zhǎng)-對(duì)映體氨基酸或混合的D-和L-對(duì)映體氨基酸)，優(yōu)選地以L型的二肽序列Arg-Lys，其顯示對(duì)肽酶的較低的穩(wěn)定性，因此可用于使本發(fā)明新型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物的肽序列不穩(wěn)定，因此進(jìn)一步減少其體內(nèi)半衰期。在本發(fā)明的上下文中，D-氨基酸，也被稱作D-對(duì)映體氨基酸，優(yōu)選地是非天然的 (非蛋白原的)“逆反”氨基酸，其中這些非天然的(非蛋白原的)“逆反”氨基酸優(yōu)選地衍生自如上面所定義的天然存在的L-氨基酸和/或它們的衍生物。在本文中，術(shù)語(yǔ)“逆反” 指如上面所定義的天然存在的L-氨基酸(和從此制備的肽)的異構(gòu)體，其中天然存在的 L-氨基酸殘基的手性在相應(yīng)的D-氨基酸中是反向的(參見(jiàn)，例如Jameson et al. ,Nature, 368,744-746(1994) ；Brady et al.，Nature，368，692-693 (1994))。換言之，在 D-氨基酸的肽鍵中，羰基和氨基基團(tuán)的位置被調(diào)換，同時(shí)在每一個(gè)α碳，側(cè)鏈的位置是保留的。因此，D-氨基酸可被插入到由L-氨基酸組成或包括L-氨基酸的肽序列中，因此可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法將D-氨基酸與如上面所定義的L-氨基酸結(jié)合。本領(lǐng)域已知的這樣的方法包括，例如，但不限于液相肽合成方法或固體肽合成方法，例如根據(jù)Merrifield的固體肽合成方法、t-Boc固相肽合成、Fmoc固相肽合成、基于BOP (苯并三唑-1-基-氧-三-(二甲氨基)_磷六氟磷酸鹽)的固相肽合成等。根據(jù)上面的通式(I)的D-/L-模式，D-氨基酸在本發(fā)明新型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物中的含量另外提供許多種有用的性質(zhì)。例如，這樣的新的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物更有效地進(jìn)入細(xì)胞并是更穩(wěn)定(尤其是體內(nèi))并顯示較相應(yīng)的基于L-氨基酸序列的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物較低的免疫原性。然而，它們不象完全由D-氨基酸制備的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物在細(xì)胞中是持久的，特別是由于幾乎所有的分解酶，象蛋白酶或肽酶，在相鄰的 L-氨基酸之間切割肽鍵的事實(shí)。所以，由D-對(duì)映體氨基酸和L-對(duì)映體氨基酸組成的肽在很大程度上抵抗快速蛋白水解分解，而不導(dǎo)致由于缺少蛋白酶的降解而在細(xì)胞中積累。上面定義的根據(jù)通式(I)的本發(fā)明新型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物，優(yōu)選地包括如上面所定義的L-氨基酸和D-氨基酸或它們的衍生物。這樣的衍生物可以以約0%、約10%、約20%、 約30 %、約40 %、約50 %、約60 %、約70 %、約80 %、約90 %或甚至約100 %的含量包含在整個(gè)本發(fā)明新型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物中。換言之，整個(gè)本發(fā)明轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白肽可含有約1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26 和更多個(gè)這樣的衍生物，其中可能的衍生物的最大數(shù)目當(dāng)然受限于包含在上面定義的根據(jù)通式(I)的本發(fā)明新型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物的氨基酸的最大數(shù)目。根據(jù)上面定義的通式(I)，本發(fā)明新型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物包括L-氨基酸和D-氨基酸的特定的D-/L-模式，其由整數(shù)a、1、m、η、χ和y限定。根據(jù)通式(I)的上面的定義，a是限定如通式(I)D1LLLxDm(LLLyDn)a中所定義的亞組(LLLyD)的重復(fù)數(shù)的決定因子。根據(jù)上面的定義，a可以是選自0-3，優(yōu)選地選自0_2，更優(yōu)選地選自10-1的任何數(shù)，或可選自單個(gè)數(shù)0、1、2或3，更優(yōu)選地選自單個(gè)數(shù)0、1或2，最優(yōu)選地a = 1。根據(jù)a = 0、1、2或3的特定的重復(fù)數(shù)，根據(jù)通式(I)D1LLLxDm(LLLyDn)a的本發(fā)明新型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物可由以下子式(Ia)至(Id)的至少之一組成或包括以下子式(Ia) 至(Id)的至少之一(Ia) =D1LLLxDm (SEQ ID NO 2)；(Ib) =D1LLLxDmLLLyDn (SEQ ID NO 3)；(Ic) =D1LLLxDmLLLyDnLLLyDn(SEQ ID NO 4)或(Id) =D1LLLxDmLLLyDnLLLyDnLLLyDn(SEQ ID NO :5)。此外，根據(jù)通式(I)的上面的定義，l、m和η是限定出現(xiàn)在如本文所定義的通式 (I)和子式(Ia)至(Id)中的D-氨基酸數(shù)的整數(shù)。整數(shù)l、m和η可相互獨(dú)立地選擇。這對(duì)于決定因子η特別如此，其可在如本文所定義的通式(I)或子式(Ia)至(Id)中出現(xiàn)幾次，即如果η出現(xiàn)幾次，每個(gè)η可相互獨(dú)立地選擇。根據(jù)上面的定義，整數(shù)1、m和η相互獨(dú)立地可以是選自1-2的任何數(shù)，或可選自單個(gè)數(shù)1或2，更優(yōu)選地1、m和/或η = 1。另外，根據(jù)通式(I)的上面的定義，χ和y是限定出現(xiàn)在如本文所定義的通式(I) 和子式(Ia)至(Id)中的L-氨基酸數(shù)的整數(shù)。整數(shù)χ和y可相互獨(dú)立地選擇。根據(jù)上面的定義，整數(shù)χ和y相互獨(dú)立地可以是選自0-2的任何數(shù)，優(yōu)選地選自0-1，或可選自單個(gè)數(shù) 0、1或2，更優(yōu)選地選自單個(gè)數(shù)1或2，最優(yōu)選地x和/或y = 1。
根據(jù)一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式，本發(fā)明的目的通過(guò)包括特定子式(Ie)的至少一個(gè)序列或由特定子式(Ie)的至少一個(gè)序列組成的新型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物解決DLLLD (LLLD)a(SEQ ID NO 6)；其中D、L和a是如上面針對(duì)通式⑴或子式(Ia)至(Id)所定義的。根據(jù)另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式，本發(fā)明的目的通過(guò)包括特定子式(If)的至少一個(gè)序列或由特定子式(If)的至少一個(gè)序列組成的新型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物解決DLLLDLLLD(SEQ ID NO 7)；其中D和L是如上面針對(duì)通式(I)或子式(Ia)至(Id)所定義的。根據(jù)通式(I)或根據(jù)任何子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)的本發(fā)明新型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物，特別地是包括新的D-/L-模式轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物，可與本領(lǐng)域已知的任何運(yùn)輸序列一起使用或應(yīng)用于本領(lǐng)域已知的任何運(yùn)輸序列，其中那些運(yùn)輸序列的鄰接的(連續(xù)的)氨基酸的選擇數(shù)目通過(guò)如通式⑴或任何子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If) 所定義的氨基酸數(shù)目確定。這樣的運(yùn)輸序列典型地指導(dǎo)貨物部分運(yùn)輸進(jìn)細(xì)胞或細(xì)胞核或另外的特定靶區(qū)并可包括，但不限于，如上面所定義的易位蛋白，例如衍生自HIVTAT (HIV)，例如天然蛋白諸如例如TAT蛋白(例如美國(guó)專利號(hào)5，804，604和5，674，980中所描述的，這些參考文獻(xiàn)中的每個(gè)通過(guò)引用被并入本文)，例如衍生自HIV tat (HIV) ,HSV VP22 (單純皰疹)(在例如 WO 97/05265 ；Elliott and 0' Hare, Cell 88 :223-233(1997)中被描述)、 非病毒蛋白(Jackson et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :10691-10695 (1992))，運(yùn)輸序列，其衍生自觸角足，特別是衍生自果蠅屬觸角(例如其觸角載體序列)、FGF、乳鐵蛋白等， 或衍生自堿性肽，例如具有長(zhǎng)度為5至15個(gè)氨基酸，優(yōu)選地10至12個(gè)氨基酸，并包括至少 80%，更優(yōu)選地85%或甚至90%的堿性氨基酸，諸如例如精氨酸、賴氨酸和/或組氨酸的肽，或可選自例如富含精氨酸的肽序列，諸如I 9、R8、R7、R6、R5等，衍生VP22，衍生自PTD-4衍生的蛋白或肽，衍生自RGD-K16,衍生自PEPT1/2或PEPT1/2衍生的蛋白或肽，衍生自SynB3 或SynB3衍生的蛋白或肽，衍生自PC抑制劑，衍生自P21衍生的蛋白或肽，或衍生自JNKI 衍生的蛋白或肽。此外，在此公開(kāi)了用作運(yùn)輸序列的天然蛋白之一的變體、片段和衍生物。形成如上面所定義的根據(jù)通式(I)或任何子式(la)、(lb)、(Ic)、(Id)、(Ie)或 (If)的新的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物基礎(chǔ)的運(yùn)輸序列的特定例子可選自，但不限于所謂的TAT細(xì)胞滲透序列，其衍生自HIV-I TAT蛋白的堿性運(yùn)輸序列。優(yōu)選地，HIV-I TAT蛋白的堿性運(yùn)輸序列可包括來(lái)自人免疫缺陷病毒HIV-I TAT蛋白的序列，例如如在例如通過(guò)引用被并入本文的美國(guó)專利號(hào)5，804，604和5，674，980中所描述的。在該上下文中，全長(zhǎng)HIV-I TAT蛋白具有由HIV TAT基因的兩個(gè)外顯子編碼的86個(gè)氨基酸殘基[SEQ ID NO :8]。TAT氨基酸 1-72由外顯子1編碼，而氨基酸73-86由外顯子2編碼。全長(zhǎng)TAT蛋白被表征為含有兩個(gè)賴氨酸和六個(gè)精氨酸(氨基酸49-57)的堿性區(qū)和含有七個(gè)半胱氨酸殘基(氨基酸22-37)的富含半胱氨酸區(qū)。堿性區(qū)(即氨基酸49-57)被認(rèn)為對(duì)核定位是重要的。Ruben，S.et al.， J. Virol. 63 :1-8(1989) ；Hauber, J. et al.，J. Virol. 631181-1187 (1989)。富含半胱氨酸區(qū)介導(dǎo)體外金屬連接的二聚體的形成(Franke 1, A. D. et al, Science 240:70-73(1988)； Frankel，A.D· et al. , Proc. Natl. Acad. Sci USA 85 :6297-6300(1988))并它作為對(duì)反式作用子的活性是必需的(Garcia, J. A. et al.，EMBO J. 7 :3143(1988) ；Sadaie, Μ. R. et al.， J. Virol. 63 :1 (1989))。如在其它調(diào)節(jié)蛋白中，N端區(qū)可參與防護(hù)細(xì)胞內(nèi)蛋白酶(Bachmair，A.et al. ,Cell 56:1019-1032(1989))。利用通式(I)或子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie) 或(If)的任何一個(gè)的優(yōu)選的TAT運(yùn)輸序列，優(yōu)選地被表征為TAT堿性區(qū)氨基酸序列(天然存在的tat蛋白的氨基酸49-57)的存在；TAT富含半胱氨酸區(qū)氨基酸序列(天然存在的TAT 蛋白的氨基酸22-36)的缺失和TAT外顯子2編碼的羧基端結(jié)構(gòu)域(天然存在的TAT蛋白的氨基酸73-86)的缺失。根據(jù)更優(yōu)選的實(shí)施方式，形成如上面所定義的根據(jù)通式(I)或任何子式(Ia)、 (lb)、(Ic), (Id)、(Ie)或(If)的新的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物基礎(chǔ)的運(yùn)輸序列可選自含有TAT殘基48-57或49至57的氨基酸序列，最優(yōu)選地是根據(jù)SEQ ID NOs 8至14任何一個(gè)的TAT 序歹丨J，或選自通用 TAT 序歹Ij NH2-Xnb-RKKRRQRRR-Xnb-C00H (L 類 TAT (s)) [SEQ ID NO 16]和 /或XXXXRKKRRQ RRRXXXX (L類TAT) [SEQ ID NO: 15]。在該上下文中，每個(gè)X典型地代表這樣的氨基酸殘基，其優(yōu)選地選自如本文所定義的任何(天然存在的)氨基酸殘基。此外，每個(gè)Xnb可選自任何如本文所定義的氨基酸殘基，其中n(X的重復(fù)數(shù))是0-5、5-10、 10-15、15-20、20-30或更多。優(yōu)選地，Xnb代表衍生自根據(jù)SEQ ID NO 8 (TAT (1-86))的序列的一段連續(xù)肽殘基。可選地，形成如上面所定義的根據(jù)通式(I)或任何子式(la)、 (lb)、(Ic), (Id)、(Ie)或(If)的新的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物基礎(chǔ)的運(yùn)輸序列可選自，例如， 含有氨基酸序列 NH2-GRKKRRQRRR-C00H(L-TAT (sla)) [SEQ ID NO 17]或氨基酸序列 NH2-RKKRRQRRR-C00H(L-TAT(slb)) [SEQ ID NO :18]的肽。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解這樣的短語(yǔ)，象根據(jù)通式(I)或根據(jù)任何子式(la)、 (lb)、(Ic), (Id)、(Ie)或(If)的序列可與特定的(運(yùn)輸)序列一起使用或應(yīng)用于特定的 (運(yùn)輸)序列，或可形成通式(I)或任何子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)等的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白肽構(gòu)建物的基礎(chǔ)，旨在舉例說(shuō)明請(qǐng)求保護(hù)一個(gè)序列，其顯示關(guān)于以下的某些特征i)表征特定氨基酸實(shí)體的側(cè)鏈殘基序列，和ii)所述的序列中的D和L氨基酸的序列。為了給出示例性的例子如果子式(If)與TAT (1-86) (SEQ ID NO 8) 一起使用或應(yīng)用于TAT(l-86) (SEQ ID NO :8)，那么側(cè)鏈殘基的序列⑴如SEQ ID NO :8中所顯示。然而，該請(qǐng)求保護(hù)的序列不是純的L-氨基酸序列，而是某處包括子式(If)的基序。這樣的實(shí)施方式的例子將是以下序列(以小寫字母表示的D-氨基酸，以大寫字母表示的L氨基酸)MEPVDPRLEP WKHPGSQPKT ACTNCYCKKC CFHCQVCFIT KALGISYGrK KRrQRRrPPQ GSQTHQVSLS KQPTSQSRGD PTGPKEo由于SEQ ID NO 8包括86個(gè)氨基酸，所以當(dāng)然存在將子式(If)的基序放在該序列中別處的幾個(gè)另外的可能性。還可想象在特別的實(shí)施方式中該序列可包括通式和/或子式一個(gè)以上的基序。形成如上面所定義的通式(I)或任何子式(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物基礎(chǔ)的運(yùn)輸序列的特別優(yōu)選的例子可選自，但不限于，根據(jù)以下表1所定義的序列或其部分，或其任何片段或變體或衍生物(只要它保留跨過(guò)生物膜易位的功能)。表 權(quán)利要求
1.轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物，其包括通式(I) (SEQ ID NO 1)的至少一個(gè)序列 D1LLLxDm(LLLyDn)a 其中D是D-氨基酸； L是L-氨基酸； a 是 0-3 ；1.m和η相互獨(dú)立地是1或2； χ和y相互獨(dú)立地是0、1或2。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物，其中所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物包括根據(jù)以下子式 (Ia)至(Id) (SEQ ID NOs :2至5)之一的至少一個(gè)序列(Ia) =D1LLLxDm ；(Ib) =D1LLLxDmLLLyDn ；(Ic) =D1LLLxDmLLLyDnLLLyDn ；或(I d) D1LLLxDmLLLyDnLLLyDnLLLyDn。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物，其中所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物包括根據(jù)以下子式(Ie) (SEQ ID NO 6)的至少一個(gè)序列DLLLD(LLLD)a。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物，其中所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物包括根據(jù)以下子式(If) (SEQ ID NO 7)的至少一個(gè)序列DLLLDLLLD。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物，其中將根據(jù)通式(I)或根據(jù)任何子式(la)、(lb)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)的所述序列與運(yùn)輸序列一起使用，或應(yīng)用于運(yùn)輸序列，所述運(yùn)輸序列衍生自HIV-I TAT蛋白(SEQ ID NO 8)；優(yōu)選衍生自含有HIV-1 TAT 蛋白(SEQ ID NO 8)的TAT殘基48-57或49至57的氨基酸序列；或衍生自HSV VP22 (單純皰疹(Herpes simplex))；或衍生自觸角足載體序列(果蠅屬觸角足(Drosophila antermapedia))、FGF、乳鐵蛋白；或衍生自堿性的肽，該肽的長(zhǎng)度為5至15個(gè)氨基酸，優(yōu)選地10至12個(gè)氨基酸，并包括至少80 %，更優(yōu)選地85 %或甚至90 %的選自精氨酸、賴氨酸和/或組氨酸的堿性氨基酸，或可選自富含精氨酸的肽序列，包括&、R8> r7、R6> R5 ；衍生自 VP22 ；衍生自PTD-4衍生的蛋白或肽；衍生自RGD-Kni ；衍生自PEPT1/2或PEPT1/2衍生的蛋白或肽；衍生自SynB3或SynB3衍生的蛋白或肽；衍生自PC抑制劑；衍生自P21衍生的蛋白或肽；衍生自JNKI衍生的蛋白或肽；或衍生自這些運(yùn)輸序列之一的變體、片段和衍生物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物，其中將根據(jù)通式(I)或根據(jù)任何子式(la)、(lb)、(Ic), (Id)、(Ie)或(If)的所述序列與以下序列之一或其反向序列或這些序列的變體或片段一起使用，或應(yīng)用于下序列之一或其反向序列或這些序列的變體或片段
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物，其中所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物包括根據(jù)rXXXrXXXr (SEQ ID NO :252)的至少一個(gè)序列，其中R代表D-對(duì)映體精氨酸； X是任何L-氨基酸；其中每個(gè)X可單獨(dú)地并獨(dú)立于SEQ ID NO 252內(nèi)的任何其它X而選擇。
8.根據(jù)權(quán)利要求8的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物，其中所述6個(gè)XL-氨基酸的至少4個(gè)單獨(dú)地選自由K或R組成的L氨基酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物，其中所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物包括所述子式(If)DLLLDLLLD (SEQ ID NO :7)，并且其中所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白序列選自以下序列
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物，其中所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物包括所述子式(If)DLLLDLLLD (SEQ ID NO :7)，并且其中將所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白序列與運(yùn)輸序列一起使用或應(yīng)用于運(yùn)輸序列，所述運(yùn)輸序列衍生自HIV-I TAT蛋白，在所述TAT衍生的序列的位置2 具有酪氨酸(Y)，所述序列優(yōu)選地選自序列TAT(s2-91) (SEQ ID NO :116)。
11.根據(jù)權(quán)利要求5至10中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物，其中將根據(jù)通式(I)或根據(jù)任何子式(la)、(lb)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)的所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白序列與權(quán)利要求5至10中列出的任何所述運(yùn)輸序列的變體或片段一起使用或應(yīng)用于權(quán)利要求5至10中列出的任何所述運(yùn)輸序列的變體或片段，其具有權(quán)利要求5至10中列出的任何所述運(yùn)輸序列全長(zhǎng)的至少10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %或85 %，優(yōu)選地至少90 %，更優(yōu)選地至少 95%和最優(yōu)選地至少99%。
12.轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白貨物結(jié)合分子，其包括a)組分(A)，其中組分(A)包括根據(jù)權(quán)利要求1至11任一項(xiàng)的所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物；和b)組分(B)，其包括效應(yīng)分子。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白貨物結(jié)合分子，其中所述效應(yīng)分子選自在治療上有活性的蛋白或肽、蛋白激酶抑制劑、蛋白激酶c-Jum氨基末端激酶的抑制劑、抗原、抗體、凋亡因子、病理狀態(tài)中牽涉的蛋白酶，優(yōu)選地是肽蛋白酶抑制劑、BH3結(jié)構(gòu)域或唯BH3蛋白、編碼這些蛋白的核酸、siRNAs、反義RNAs、細(xì)胞毒性劑和包括蛋白酶抑制劑的小有機(jī)化合物。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白貨物結(jié)合分子，此外包括至少一個(gè)不同于組分 ⑶的另外的組分(C)、⑶和/或(E)，其中所述至少一個(gè)任選的另外的組分(C)、⑶和/ 或(E)相互獨(dú)立地選自如針對(duì)組分(B)所定義的不同的效應(yīng)分子或它們的片段或變體。
15.根據(jù)權(quán)利要求12至14中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白貨物結(jié)合分子，其中組分(A)和(B)與任選的組分(C)、⑶和/或(E)相互共價(jià)連接。
16.根據(jù)權(quán)利要求12至15中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白貨物結(jié)合分子，其中所述至少一個(gè)另外的組分(C)、(D)和/或(E)選自信號(hào)序列或定位序列，其引導(dǎo)所述發(fā)明的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白貨物結(jié)合分子到特定的細(xì)胞內(nèi)靶定位或到特定的細(xì)胞類型。
17.根據(jù)權(quán)利要求12至16中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白貨物結(jié)合分子，其中組分(B)和/或所述至少一個(gè)另外的組分(C)、⑶和/或(E)是蛋白或肽序列并由L-氨基酸、D-氨基酸或二者的混合物組成。
18.根據(jù)權(quán)利要求12至17中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白貨物結(jié)合分子，其中組分(A)位于所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白貨物結(jié)合分子的所述C末端，假設(shè)組分(B)是蛋白或肽序列。
19.根據(jù)權(quán)利要求12至18中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白貨物結(jié)合分子，其用作藥物。
20.藥物組合物，其包括根據(jù)權(quán)利要求12至19中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白貨物結(jié)合分子和任選地藥學(xué)上可接受的載體/或賦形劑。
21.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物用于制備轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白貨物結(jié)合分子的用途。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物的用途，其中所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白貨物結(jié)合分子是如根據(jù)權(quán)利要求12至18中任一項(xiàng)所定義的。
23.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物或根據(jù)權(quán)利要求12至18中任一項(xiàng)所定義的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白貨物結(jié)合分子用于將貨物分子轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)將被治療的患者的細(xì)胞或組織的用途。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的用途，其中所述貨物是如根據(jù)權(quán)利要求12至18中任一項(xiàng)所定義的。
25.根據(jù)權(quán)利要求23或M的用途，其用于將貨物分子轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)白細(xì)胞和/或神經(jīng)元細(xì)胞，特別是將被治療的患者的白細(xì)胞和/或神經(jīng)元細(xì)胞。
26.根據(jù)權(quán)利要求12至18中一項(xiàng)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白貨物結(jié)合分子用于制備藥物的用途，該藥物用于預(yù)防、治療和/或改善癌癥或腫瘤疾病——包括由缺陷型凋亡引起的疾病、炎性疾病、感染疾病、病毒(感染)疾病、與NJK信號(hào)傳導(dǎo)密切相關(guān)的疾病、自身免疫性病癥或疾病、心血管疾病、神經(jīng)元或神經(jīng)變性疾病、肝病、脊柱疾病、子宮疾病、重度抑郁癥、非慢性或慢性炎性消化病、聽(tīng)力喪失、內(nèi)耳疾病，或用在組織移植中。
全文摘要
本發(fā)明涉及通式(I)DlLLLxDm(LLLyDn)a的新轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物和其變體。本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白貨物結(jié)合分子，特別是所述新轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物與貨物部分的結(jié)合物，貨物部分例如蛋白或肽、核酸、細(xì)胞毒性劑、有機(jī)分子等。此外，本發(fā)明公開(kāi)了包括這些結(jié)合物的(藥物)組合物和涉及這樣的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)建物的治療方法和用途。
文檔編號(hào)A61K47/48GK102256998SQ200980151845
公開(kāi)日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2009年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月22日
發(fā)明者C·邦尼 申請(qǐng)人:希根有限責(zé)任公司