專利名稱：?jiǎn)沃亟M體系及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種單重組體系，其通過(guò)在經(jīng)修飾的痘病毒載體中的單重組事件而克隆重組痘病毒(poxvirus)。本發(fā)明還涉及經(jīng)修飾的痘病毒載體及其用途，以及制備重組痘病毒的方法。
背景技術(shù)：
近來(lái)，人們致力于發(fā)展和改良基于重組痘病毒的技術(shù)。目前認(rèn)為基于痘病毒的載體在許多用途中是有益的，這些用途例如為通過(guò)疫苗產(chǎn)生免疫應(yīng)答、用于研制新疫苗療法， 以及在基因治療應(yīng)用中的用途。重組痘病毒載體的優(yōu)點(diǎn)是眾所周知的，其包括將遺傳物質(zhì)高效運(yùn)載至多種細(xì)胞類型中；高水平表達(dá)蛋白；以及具有誘發(fā)除了基于抗體的應(yīng)答之外的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的能力。眾所周知痘病毒為細(xì)胞質(zhì)病毒，因此通過(guò)該病毒載體攜帶的任何遺傳物質(zhì)通常留在細(xì)胞質(zhì)中，并且不具有非特異性整合入寄主細(xì)胞基因組的缺點(diǎn)。使用(例如)克隆技術(shù) (如同源重組)，能夠容易地對(duì)痘病毒進(jìn)行遺傳工程處理，使其包含和表達(dá)插入其基因組的外源基因。這些外源基因可編碼許多種類的蛋白質(zhì)，例如，可誘發(fā)針對(duì)一種或多種致病原 (infectious agents)的保護(hù)機(jī)制的抗原、免疫調(diào)節(jié)蛋白(如協(xié)同刺激分子)、或酶蛋白。例如，已對(duì)重組痘病毒進(jìn)行了遺傳工程處理，以使其表達(dá)皰疹病毒、流感病毒和人免疫缺陷病毒(HIV)的免疫抗原。痘病毒作為載體的主要優(yōu)點(diǎn)之一在于它們的基因組規(guī)模龐大，能插入包括(例如)多基因(即作為多價(jià)載體)在內(nèi)的大量的異源遺傳物質(zhì)。但是，必須將異源遺傳物質(zhì)插入到痘病毒基因組中的合適位點(diǎn)，才能使重組病毒仍能保持活性。因此，必須將遺傳物質(zhì)插入到病毒DNA中的非必需位點(diǎn)上?？寺≈亟M痘病毒的已確立的方法是基于2個(gè)獨(dú)立的重組事件的。在第一重組步驟中，將目的基因以及報(bào)告基因和/或標(biāo)記盒整合到病毒基因組中。在篩選過(guò)程中，通常使用的是抗生素抗性基因。在隨后進(jìn)行的使用篩選/標(biāo)記盒將重組痘病毒從重組和非重組病毒池中分離之后，如果意欲將重組痘病毒用于(例如)人類疫苗中時(shí)，應(yīng)當(dāng)刪除篩選和標(biāo)記盒。為此必須進(jìn)行第二重組事件，其包括對(duì)痘病毒進(jìn)行進(jìn)一步傳代和噬斑純化。因此，目前已知的用于克隆重組痘病毒的技術(shù)通常是費(fèi)時(shí)費(fèi)力的，當(dāng)與通常用于克隆其它類型的重組表達(dá)載體的那些步驟相比較時(shí)尤其如此。因此，在現(xiàn)有技術(shù)中，需要對(duì)克隆體系和方法進(jìn)行改進(jìn)，以有效地產(chǎn)生重組痘病發(fā)明概述本發(fā)明基于一種經(jīng)修飾的痘病毒載體，其通過(guò)單重組事件允許產(chǎn)生重組痘病毒。 本發(fā)明所述的經(jīng)修飾的病毒載體包含報(bào)告基因，其中當(dāng)與目的插入物的重組成功發(fā)生后， 所述報(bào)告基因就被刪除。本發(fā)明的第一方面涉及一種經(jīng)修飾的痘病毒載體，其包含至少一個(gè)報(bào)告基因，其中所述報(bào)告基因位于用于同源重組的兩個(gè)側(cè)翼序列之間。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述經(jīng)修飾的痘病毒載體還包括至少一個(gè)篩選組件(selection component)，其中所述篩選組件在許可性寄主細(xì)胞中位于用于同源重組的兩個(gè)側(cè)翼序列之間。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述篩選組件包含篩選基因，其中所述篩選基因抑制或減緩痘病毒在寄主細(xì)胞中的復(fù)制，或?qū)闹骷?xì)胞具有細(xì)胞毒性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述報(bào)告基因和篩選組件位于用于同源重組的單一一對(duì)側(cè)翼序列之間。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述報(bào)告基因和篩選組件位于用于同源重組的多于一對(duì)的側(cè)翼序列之間。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述篩選組件包含可被誘導(dǎo)表達(dá)的篩選基因。在具體實(shí)施方案中，所述報(bào)告基因編碼熒光蛋白，例如綠色熒光蛋白。在進(jìn)一步的具體實(shí)施方案中，所述篩選組件包含篩選基因，所述篩選基因選自編碼DNA酶、RNA酶或蛋白酶的基因。在進(jìn)一步的具體實(shí)施方案中，篩選基因的表達(dá)是由調(diào)控序列控制的，所述調(diào)控序列優(yōu)選為啟動(dòng)子。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，篩選基因由誘導(dǎo)表達(dá)體系調(diào)節(jié)，例如四環(huán)素操縱子/阻遏子體系(Tet02/TetR)。本發(fā)明的另一方面涉及一種使用本發(fā)明的經(jīng)修飾的痘病毒載體而產(chǎn)生的重組痘病毒。本發(fā)明的另一方面涉及一種含有本發(fā)明的經(jīng)修飾的痘病毒載體的寄主細(xì)胞。本發(fā)明另一方面涉及一種含有重組痘病毒的寄主細(xì)胞，其中所述重組痘病毒是使用本發(fā)明的經(jīng)修飾的痘病毒載體而產(chǎn)生的。本發(fā)明的另一方面提供了一種使用經(jīng)修飾的痘病毒載體產(chǎn)生重組痘病毒的方法。 本發(fā)明另一方面涉及一種產(chǎn)生重組痘病毒的方法，其包括用根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)修飾的痘病毒載體感染許可性寄主細(xì)胞，然后在能夠發(fā)生載體和質(zhì)粒間的同源重組的條件下，用含有異源目的遺傳物質(zhì)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染許可性寄主細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括誘導(dǎo)篩選基因的表達(dá)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述方法包括將含有重組痘病毒的寄主細(xì)胞與含有非重組痘病毒的寄主細(xì)胞分離。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述方法包括使用含有重組痘病毒的許可性寄主細(xì)胞，用于在之前未被感染的許可性寄主細(xì)胞中至少傳代一次。本發(fā)明的另一方面涉及根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)修飾的痘病毒載體在重組痘病毒的增殖中的用途。在具體實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)修飾的痘病毒載體為痘苗病毒(vaccinia virus)。在進(jìn)一步的具體實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)修飾的痘病毒載體為經(jīng)修飾的安卡拉痘苗病毒(Modified Vaccinia Ankara virus) (MVA)。本發(fā)明的另一方面涉及用作藥物的根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)修飾的痘病毒、根據(jù)本發(fā)明的重組痘病毒、以及根據(jù)本發(fā)明的含有經(jīng)修飾或重組痘病毒的細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用作治療性或預(yù)防性疫苗的根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)修飾的痘病毒、根據(jù)本發(fā)明的重組痘病毒、以及根據(jù)本發(fā)明的含有經(jīng)修飾或重組痘病毒的細(xì)胞，所述治療性或預(yù)防性疫苗用于治療或預(yù)防以下疾病癌癥、流感、肝炎、艾滋病、流行性腮腺炎、狂犬病、腦炎、胃或十二指腸潰瘍、瘧疾、昏睡病、萊姆病、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、肺炎、麻風(fēng)病、白喉、念珠菌病和/或弓形體病。在具體實(shí)施方案中，所述藥物為治療性或預(yù)防性疫苗。在另一具體實(shí)施方案中，所述藥物為用于治療癌癥的治療性或預(yù)防性疫苗。將通過(guò)發(fā)明詳述、實(shí)施例和隨附的權(quán)利要求書(shū)提供本發(fā)明的其它實(shí)施方案。附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1示出了根據(jù)本發(fā)明的示例性的經(jīng)修飾的痘病毒載體的報(bào)告基因/篩選盒。所述載體基于MVA基因組(參見(jiàn)Gene Bank登記號(hào)U94848 ；文獻(xiàn)Antoine，G. , Scheif linger, F. , Dorner, F.禾口 Falkner, F. G. “The complete genomic sequence of the modified vaccinia Ankara strain !comparison with other orthopoxviruses",Virology 244(2), 365-396 (1998))，其中將報(bào)告基因/篩選盒引入至插入位點(diǎn)(Deletion III)。Flankl Del3 =MVA基因組中的Deletion III位點(diǎn)上游的側(cè)翼序列:Ps啟動(dòng)子=強(qiáng)合成啟動(dòng)子:Tet02 =四環(huán)素操縱子(TetR的結(jié)合位點(diǎn))；:ME =四環(huán)素阻遏子:Flank2 Del3 = MVA基因組中的Deletion III位點(diǎn)下游的側(cè)翼序列。圖2為示出了在用于痘病毒的許可性寄主細(xì)胞中同源重組過(guò)程的示意圖。對(duì)于 MVA痘病毒，這樣的寄主細(xì)胞包括(例如)雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)。用本發(fā)明的經(jīng)修飾的痘病毒載體感染細(xì)胞后，再用含有目的遺傳物質(zhì)的質(zhì)粒(如LacZ)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，所述目的遺傳物質(zhì)位于用于同源重組的兩個(gè)側(cè)翼序列(Flank 1/2 Del3)之間。當(dāng)同源側(cè)翼重組導(dǎo)致了目的遺傳物質(zhì)的整合并刪除了報(bào)告基因/篩選盒時(shí)，產(chǎn)生了重組痘病毒。圖3提供了用于將目的遺傳物質(zhì)插入MVA基因組中的示例性的質(zhì)粒(VEM07 ；SEQ ID NO 1)圖譜，其原理如圖2所示。LacZ=編碼β -半乳糖苷酶的細(xì)菌基因。圖4示意性示出了通過(guò)PCR實(shí)現(xiàn)的四環(huán)素操縱子(Tet02)和DNAse基因的融合。圖5示意性示出了 I^s啟動(dòng)子和Tet02_DNA酶片段的融合。圖6示出了用于克隆重組MVA的標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒vEMll的圖譜。圖7示出了重組質(zhì)粒vEM12的圖譜。通過(guò)&icl和SpeI限制位點(diǎn)將I3s-TetC^-DNA 酶盒克隆到質(zhì)粒vEMll中。BsdR =殺稻瘟素抗性基因。圖8示意性示出了 I^s啟動(dòng)子與四環(huán)素阻遏子編碼區(qū)域(TetR)的融合。圖9示出了重組質(zhì)粒VEM31的圖譜。通過(guò)^icI和NheI限制性酶切位點(diǎn)將I3S-TetR 盒克隆到質(zhì)粒vEM12中。圖10示出了誘導(dǎo)性表達(dá)DNA酶對(duì)MVA復(fù)制過(guò)程的影響。用重組MVA mEM07 (7. 5 =7. 5啟動(dòng)子)、πιΕΜ06α^ = Ps啟動(dòng)子)、mEM08(H5 = H5啟動(dòng)子)轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞，然后用含有不同濃度的四環(huán)素(Tet 0 =無(wú)四環(huán)素；Tet 25 = 25 μ四環(huán)素/ml)的培養(yǎng)基培養(yǎng)。對(duì)照組中用MVA空載體(MVA)轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞。依次用vEM12 (MVA+DNA酶)轉(zhuǎn)染一組樣品。在 37°C、5% CO2下培養(yǎng)48小時(shí)后收獲細(xì)胞，并測(cè)定病毒滴度。也用四環(huán)素(MVA+Tet)培養(yǎng)MVA 空載體轉(zhuǎn)染的CEF細(xì)胞。TCID5tl =半數(shù)組織培養(yǎng)感染量。圖11示出了 Deletion III位點(diǎn)的PCR分析結(jié)果。采用PCR研究在MVA基因組中的用于外源基因的插入位點(diǎn)(deletion 3)。發(fā)明詳述本發(fā)明基于源于痘病毒的經(jīng)修飾的載體，其中所述痘病毒可通過(guò)單重組事件產(chǎn)生重組痘病毒。本發(fā)明的經(jīng)修飾的病毒載體包含報(bào)告基因，其中當(dāng)成功發(fā)生與目的插入物的重組后，所述報(bào)告基因就被刪除。因此，本發(fā)明的經(jīng)修飾的病毒載體提供用于單重組事件的檢測(cè)，所述單重組事件在重組病毒載體中刪除報(bào)告基因/篩選盒的同時(shí)插入異源目的遺傳物質(zhì)。^X本文中所用的術(shù)語(yǔ)“載體”指的是含有足夠的遺傳信息從而能夠使痘病毒在許可性寄主細(xì)胞中復(fù)制的痘病毒的任意基因組或其部分或其片段。根據(jù)本發(fā)明的載體可以為基因工程載體，以便它可只含有其所源自的痘病毒的部分或全部元素、和/或其它遺傳元素。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的載體為經(jīng)修飾的安卡拉痘苗(MVA)病毒基因組或其部分或其片段。在另一具體實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的載體為MVA病毒基因組或其部分或其片段，所述MVA病毒選自由以下物質(zhì)所組成的組中MVA-F6 (如文獻(xiàn)Lotz et al. "Partial tyrosinase-specific self tolerance by HLA_A*0201 restricted cytotoxic T lymphocytes in mice and man，，，Intern. J. of Cancer 2003 ； 108 (4) 571-79)、MVA575(ECACC 保藏號(hào) V00120707)、MVA-M4(文獻(xiàn) Ober et al. " Immunogenicity and safety of defective Vaccinia virus lister Comparison with modified Vaccinia virus Ankara",J Virol 2002 ；76 (15) :7713-23)、Acam3000 (登記號(hào) AY603355)、 MVA-ATCC (ATCC VR-1508)、MVATGN33. 1 (登記號(hào) EF675191)、MVA-1721 (登記號(hào) DQ983236)。在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的載體為選自以下物質(zhì)所組成的組中的痘病毒的基因組或其部分西保留地痘苗病毒(Vaccinia virus Western Reserve)(登記號(hào) NC006998)、惠氏痘苗病毒(Vaccinia virus Wyeth)(如文獻(xiàn) Fogg et al, "Virus induced by Vaccination with multiple recombinant outer membrane proteins of intracellular and extracellular virions", J. Virol. 2004 ；78 (19) :10230-37)、李斯特痘苗病毒(Vaccinia virus Lister)(登記號(hào)DQ191324)、NYCBH(紐約市衛(wèi)生局)；CDC(疾病控制和預(yù)防中心)、免疫實(shí)踐顧問(wèn)委員會(huì)(ACIP)推薦的牛痘(天花)疫苗、文獻(xiàn)Morbidity and mortality weekly Report 40 (R14) : 1-10，1991.)、金絲雀痘病毒(登記號(hào) 005309 和 AY318871)、禽痘病毒(登記號(hào)581527)、哥本哈根痘苗病毒(登記號(hào)M35027) NYVAC、ALVAC、 TROVAC ( ^lK Paoletti et al. "Highly attenuated poxvirus vectors :NYVAC> ALVAC> TROVACDev. Biol. Stand. 1995,84 :159-63)。本文中所用的術(shù)語(yǔ)“報(bào)告基因”指的是可賦予表達(dá)它們的細(xì)胞或生物某種可被容易地檢測(cè)、鑒定或測(cè)量的特性的基因。報(bào)告基因通常用于確定目的基因是否已經(jīng)被整合，或是否被細(xì)胞或微生物種群表達(dá)。在本發(fā)明的上下文中，檢測(cè)到報(bào)告基因的表達(dá)產(chǎn)物表明沒(méi)有發(fā)生同源重組，并且目的基因插入物沒(méi)有成功插入到病毒載體中。通常而言，可以采用允許將含有本發(fā)明的初始載體的細(xì)胞和含有已發(fā)生同源重組的載體的細(xì)胞分離的任意報(bào)告基因。適合用于本發(fā)明的報(bào)告基因的非限定性的例子包括可誘導(dǎo)肉眼可辨的特性(例如，包括熒光)的報(bào)告基因，其使得可通過(guò)(例如)FACS和發(fā)光蛋白進(jìn)行分離；例如，編碼水母綠色熒光蛋白(GFP)的基因、編碼增強(qiáng)型GFP(eGFP)的基因、mPlum、mCherry、tdTomato、 mStrawberry、mRaspberry、mRFPl、mTangerine、mYFP (Tsien)、J-RecU AceGFP> CopGFP> HcRed-tandem、PbiYFP (Evrogen 公司)、DsRecU DsRed2、DsRed-Express、DsRed-monomer、 EGFPAcGFPl、AmCyanU AsRed2、EBFP, HcRedU ZsYellowl (Clontech 公司)、mKO、Azami Green、mAG、Kaede> MiCy (MBL Intl.公司)、Venus (Miyawaki)、Ypet、CyPer (Dougherty)、 EYFP、Emerald (Invitrogen 公司)、Cerulean (Priston)、T-Sapphire (Griesbeck)、 AQ143 (Lukyanov) >c0FP (Stratagene 公司)>eqFP611 (Weidenmann) >Renilla GFPs (
供商，如Mratagene公司)、熒光素酶基因或IacZ基因。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述報(bào)告基因?yàn)闊晒饩幋a基因。報(bào)告基因的非限定性的例子還包括編碼具有特定抗體并可表達(dá)在寄主細(xì)胞表面的蛋白的基因。這類報(bào)告基因允許通過(guò)親合純化，例如，通過(guò)含有抗體包被的樹(shù)脂的柱子或所述抗體包被的磁珠，將含有本發(fā)明的初始載體的細(xì)胞和含有已發(fā)生同源重組的載體的細(xì)胞分離，其中所述抗體為報(bào)告基因編碼蛋白的特異性抗體。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，報(bào)告基因編碼細(xì)胞表面受體和親和標(biāo)記物的融合基因，從而將親和標(biāo)記物表達(dá)在細(xì)胞表面。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解各種常用的親和標(biāo)記物及相應(yīng)配體。在進(jìn)一步的具體實(shí)施方案中， 所述基因編碼細(xì)胞表面受體的融合基因，且融合的親和標(biāo)記物選自由下列物質(zhì)所組成的組中FLAG-標(biāo)記物(NDYKDDDDK-C)、附加表位、V5-標(biāo)記物、c-myc-標(biāo)記物、His-標(biāo)記物和/ 或HA-標(biāo)記物。在另一實(shí)施方案中，報(bào)告基因編碼小病毒表面蛋白，其選自由下列物質(zhì)組成的組甲病毒El和E2 ；黃病毒El和E2 ；冠狀病毒S、HE、M和E ；動(dòng)脈炎病毒GP ；彈狀病毒 G ；線狀病毒GP ；副粘病毒F、HN、H和G ；正粘病毒M2、NA、HA和HEF ；布尼亞病毒Gn和Gc ； 沙粒病毒GP ；博爾納病毒G ；逆轉(zhuǎn)錄酶病毒Env ；嗜肝DNA病毒S、M和L。本文中所用的術(shù)語(yǔ)“篩選組件”是指可被用于對(duì)含有該篩選組件的寄主細(xì)胞施加選擇壓力的任意核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)在寄主細(xì)胞中表達(dá)抑制或阻礙病毒復(fù)制的篩選基因而施加選擇壓力。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)表達(dá)導(dǎo)致寄主細(xì)胞的死亡的篩選基因而施加選擇壓力。在一個(gè)實(shí)施方案中，篩選組件含有至少一個(gè)可誘導(dǎo)表達(dá)的篩選基因。 在一個(gè)具體實(shí)施方案中，誘導(dǎo)表達(dá)是通過(guò)調(diào)控序列(如啟動(dòng)子)控制的。在另一實(shí)施方案中，篩選組件還包括調(diào)控篩選基因表達(dá)的細(xì)菌誘導(dǎo)體系。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，細(xì)菌誘導(dǎo)體系的特征為篩選基因受到啟動(dòng)子(其與阻遏子結(jié)合位點(diǎn)相融合)的控制，其中篩選組件還包含阻遏子(其結(jié)合到阻遏子結(jié)合位點(diǎn)上)的編碼基因。在另一具體實(shí)施方案中，阻遏子結(jié)合位點(diǎn)為四環(huán)素阻遏子結(jié)合位點(diǎn)/操縱子(Tet02)，且阻遏子的編碼基因?yàn)樗沫h(huán)素阻遏子基因(TetR)，其中所述四環(huán)素阻遏子基因可從pcDNA6TR質(zhì)粒(可得自hvitrogen公司)中分離得到。在另一實(shí)施方案中，篩選組件還包括可調(diào)控篩選基因的表達(dá)的哺乳動(dòng)物誘導(dǎo)體系。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物誘導(dǎo)體系為MieoSwitch(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室公司)體系。在另一具體實(shí)施方案中，誘導(dǎo)體系選自由下列體系所組成的組中=LentiX體系(Clontech 公司)、Q-mate 體系(Krackeler Scientific 公司)、Cumate 誘導(dǎo)表達(dá)體系 (NRC Canada 公司)、禾口 / 或 Genostat 體系(Upstate 公司)。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，篩選基因?yàn)榧?xì)胞毒性基因。本文中所用的術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞毒性基因”是指在表達(dá)時(shí)將導(dǎo)致寄主細(xì)胞的損傷或完全凋亡的任意基因，其中所述寄主細(xì)胞的損傷或完全凋亡是由其自身表達(dá)的基因產(chǎn)物導(dǎo)致的，并僅涉及所表達(dá)的基因產(chǎn)物和寄主細(xì)胞天然產(chǎn)生的組分(例如寄主細(xì)胞的DNA、RNA、蛋白體、膜或代謝物)之間發(fā)生的直接相互作用。在具體實(shí)施方案中，細(xì)胞毒性基因編碼DNA酶(如可購(gòu)自^witrogen公司；ORF 克隆PENTR221，克隆ID I0H23149)、RNA酶、蛋白酶、離子通道或細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)物(如半胱天冬酶和/或ROS)。本文中所用的術(shù)語(yǔ)“插入物”或“目的插入物”是指通過(guò)同源重組引入到本發(fā)明載體中的任意核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述插入物包含至少一個(gè)位于側(cè)翼序列側(cè)面的異源基因，其中所述側(cè)翼序列能與本發(fā)明的載體發(fā)生同源重組。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，調(diào)控序列控制至少一個(gè)異源基因，調(diào)控序列優(yōu)選為啟動(dòng)子。目的插入物的例子如圖2所示。在此，插入物包含用于轉(zhuǎn)染寄主細(xì)胞的質(zhì)粒載體以及2個(gè)側(cè)翼區(qū)域和Iac啟動(dòng)子控制下的LacZ基因。在具體實(shí)施方案中，異源基因編碼至少一個(gè)抗原，優(yōu)選的是能在患者體內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的抗原。在具體實(shí)施方案中，異源基因編碼選自由下列物質(zhì)所組成的組中的抗原異源病毒抗原、細(xì)菌抗原、原核生物抗原、真菌抗原和/或蠕蟲(chóng)抗原。在特定實(shí)施方案中，異源基因編碼一種物種的抗原，所述物種選自由下列組成的組中流感病毒A、B、C ；肝炎病毒A、B、C、E ；人類免疫缺陷病毒；風(fēng)疹病毒；流行性腮腺炎病毒；狂犬病病毒；人乳頭狀瘤病毒；EB病毒；蜱媒病毒；克里米亞金剛熱病毒； 埃博拉病毒；尼帕病毒；登革熱病毒；屈曲病毒；腸病毒；西尼羅河病毒；裂谷熱病毒；日本腦炎病毒；漢坦病毒；輪狀病毒；SARS冠狀病毒；新出現(xiàn)病毒；沙眼衣原體；肉毒桿菌；破傷風(fēng)桿菌；炭疽桿菌；嗜肺軍團(tuán)菌；腦膜炎奈瑟氏菌(Menigococcus)；鼠疫耶爾森氏菌；結(jié)核分枝桿菌；麻風(fēng)分枝桿菌；傷寒沙門氏菌；單核細(xì)胞增多性李斯特氏菌；霍亂弧菌；流感嗜血桿菌；百日咳桿菌；幽門螺旋桿菌；疏螺旋體屬(recurrentis ；hispanica ；parkeri ； burgdorferi)；鉤端螺旋體；立克次氏體屬；貝納特考克斯體；肺炎支原體；白喉棒狀桿菌； 梅毒螺旋體；惡性瘧原蟲(chóng)；間日瘧原蟲(chóng)；卵形瘧原蟲(chóng)；三日瘧原蟲(chóng)；阿米巴原蟲(chóng)；籃氏賈第鞭毛蟲(chóng)；布氏錐蟲(chóng)；利什曼原蟲(chóng)屬；莢膜組織胞漿菌；曲霉屬；白色念珠菌；新型隱球菌；卡氏肺孢子蟲(chóng)；班氏絲蟲(chóng)；曼氏血吸蟲(chóng)和/或剛地弓形蟲(chóng)。在另一具體實(shí)施方案中，異源基因編碼至少一個(gè)抗原，所述抗原誘導(dǎo)針對(duì)傳染性疾病的保護(hù)性或治療性免疫應(yīng)答(如病毒和細(xì)菌表面蛋白)，誘導(dǎo)針對(duì)癌細(xì)胞(如宮頸癌細(xì)胞，黑色素瘤細(xì)胞，多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞，乳腺癌細(xì)胞，前列腺癌細(xì)胞，濾泡B細(xì)胞非霍奇金氏淋巴瘤細(xì)胞和/或腎癌細(xì)胞)的保護(hù)性或治療性免疫應(yīng)答。本發(fā)明所用的載體本發(fā)明的第一方面涉及經(jīng)修飾的痘病毒載體，其包含至少一個(gè)位于用于同源重組的兩個(gè)側(cè)翼序列之間的報(bào)告基因。可通過(guò)在經(jīng)修飾痘病毒載體感染的寄主細(xì)胞中的同源重組，將報(bào)告基因置換為目的插入物。因此，發(fā)生了同源重組的含有本發(fā)明的經(jīng)修飾的痘病毒載體的寄主細(xì)胞，可區(qū)別于未發(fā)生同源重組的含有經(jīng)修飾的痘病毒載體的寄主細(xì)胞。可通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因編碼的蛋白區(qū)分上述兩種細(xì)胞。例如，如果報(bào)告基因編碼GFP或azami綠色蛋白，那么已經(jīng)發(fā)生同源重組的含有本發(fā)明的經(jīng)修飾的痘病毒載體的寄主細(xì)胞將不會(huì)產(chǎn)生GFP或azami綠色蛋白，這是由于GFP或azami綠色蛋白的遺傳信息通過(guò)同源重組事件從載體中移除，并被置換為目的插入物。相應(yīng)地，該寄主細(xì)胞不會(huì)在受激發(fā)時(shí)表現(xiàn)出熒光， 并且能夠(例如)通過(guò)熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)，將該寄主細(xì)胞與那些發(fā)出熒光的細(xì)胞分離。在一個(gè)實(shí)施方案中，報(bào)告基因受到啟動(dòng)子的控制，所述啟動(dòng)子優(yōu)選為病毒啟動(dòng)子，更優(yōu)選為痘苗病毒啟動(dòng)子或合成啟動(dòng)子。在另一實(shí)施方案中，啟動(dòng)子為強(qiáng)啟動(dòng)子，優(yōu)選為強(qiáng)合成啟動(dòng)子。在具體實(shí)施方案中，啟動(dòng)子為具有如下序列的I3S啟動(dòng)子AAAAATTGA AATTTTATTTTTTTTTTTTGGAATATAAATA (參見(jiàn)文獻(xiàn) kWiar Chakrabarti, Jerry R. Sisler 和 Bernard Moss Compact, synthetic, Vaccmia Virus Early/Late Protomer for Protein Expression. Biotechniques 23:1094-1097,1997)。在另一具體實(shí)施方案中，啟動(dòng)子為具有如下序列的經(jīng)修飾的 H5 啟動(dòng)子AAAAAATGAAAATAAATACAAAGGTTCTTGAGGGTTGTGTTAAATT GAAAGCGAGAAATAATCATAAATT ；參見(jiàn)文獻(xiàn) Rosel JL, Earl PL, Weir JP, Moss B, "Conserved TAAATG sequence at the transcriptional and translational initiation sites of vaccinia virus late genes deduced by structural and functional analysis of the HindIII H genome fragment", J.Virol. 60(2) :236-249,1986)。
在另一實(shí)施方案中，報(bào)告基因編碼熒光蛋白?！翱铡陛d體(即未發(fā)生重組事件的載體)表達(dá)報(bào)告基因，因此含有該載體的細(xì)胞可以發(fā)出熒光。許可性細(xì)胞中的同源重組導(dǎo)致報(bào)告基因被敲除，其結(jié)果產(chǎn)生了不能使寄主細(xì)胞發(fā)出熒光的含有目的插入物的重組載體。 在具體實(shí)施方案中，熒光蛋白為GFP、增強(qiáng)型GFP (eGFP)、或azami綠色蛋白(可得自位于美國(guó)馬薩諸塞州沃本市的MEL International公司并由位于德國(guó)哥廷根的MoBiTec股份有限公司分銷)。另一方面，本發(fā)明的載體還包含至少一個(gè)篩選組件，所述篩選組件同樣位于用于同源重組的兩個(gè)側(cè)翼序列之間。在一個(gè)實(shí)施方案中，報(bào)告基因和篩選組件位于用于同源重組的多于一對(duì)側(cè)翼序列之間。在另一實(shí)施方案中，篩選組件包含可誘導(dǎo)表達(dá)的篩選基因。在另一實(shí)施方案中，篩選組件還包含可以調(diào)控篩選基因的表達(dá)的細(xì)菌誘導(dǎo)體系。在具體實(shí)施方案中，細(xì)菌誘導(dǎo)體系的特征為篩選基因受到融合到阻遏子結(jié)合位點(diǎn)上的啟動(dòng)子的控制，其中篩選組件還包含編碼結(jié)合到阻遏子結(jié)合位點(diǎn)上的阻遏子的基因。在另一具體實(shí)施方案中，阻遏子結(jié)合位點(diǎn)為四環(huán)素阻遏子結(jié)合位點(diǎn)/操縱子(Tet02)，并且阻遏子的編碼基因?yàn)樗沫h(huán)素阻遏子基因(TetR)，所述四環(huán)素阻遏子基因可從pcDNA6TR質(zhì)粒(可得自 Invitrogen公司)分離得到。轉(zhuǎn)染寄主細(xì)胞后，阻遏子在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，并結(jié)合到位于篩選基因上游的篩選組件的阻遏子結(jié)合位點(diǎn)上，從而抑制篩選基因的表達(dá)。一旦向該體系中加入四環(huán)素，四環(huán)素可與四環(huán)素阻遏子相結(jié)合，并立即從DNA的結(jié)合位點(diǎn)上脫離，從而反過(guò)來(lái)導(dǎo)致篩選基因的表達(dá)。因此，篩選基因的表達(dá)取決于是否添加四環(huán)素，因此篩選基因的表達(dá)被認(rèn)為是可誘導(dǎo)的。在另一實(shí)施方案中，控制篩選基因以及阻遏子的編碼基因的表達(dá)的啟動(dòng)子，為病毒啟動(dòng)子、痘苗病毒啟動(dòng)子，或者更優(yōu)選的是強(qiáng)合成啟動(dòng)子，例如I3S啟動(dòng)子或經(jīng)修飾的H5啟動(dòng)子。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，篩選組件包含表達(dá)時(shí)能抑制或阻礙寄主細(xì)胞中的病毒復(fù)制的篩選基因。當(dāng)誘導(dǎo)篩選基因時(shí)，會(huì)對(duì)發(fā)生了同源重組的含有本發(fā)明的載體的病毒進(jìn)行改進(jìn)性地篩選，并且目的插入物置換了篩選組件和報(bào)告基因。因此相對(duì)于未發(fā)生同源重組的細(xì)胞，已發(fā)生同源重組的含有載體的寄主細(xì)胞具有更多的復(fù)制的重組病毒。此外，病毒復(fù)制的抑制子的表達(dá)，導(dǎo)致了病毒復(fù)制的降低或完全抑制。因此，所生成的具有含目的插入物的基因組的病毒與那些具有不含目的插入物的基因組的病毒間的比率顯著地向前者的方向偏移。相應(yīng)地，作為該比率，可以控制體系以提高含有目的插入物的病毒的產(chǎn)量。在具體實(shí)施方案中，篩選基因?yàn)镽NA酶、離子通道或DNA酶(可得自^witrogen公司；ORF克隆 PENTR221，克隆 ID I0H23149)。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，篩選組件為細(xì)胞毒性基因，即在表達(dá)時(shí)能導(dǎo)致寄主細(xì)胞的損傷或完全凋亡的任意基因。在具體實(shí)施方案中，細(xì)胞毒性基因編碼DNA酶、RNA酶、 蛋白酶、離子通道或細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑。根據(jù)本發(fā)明，由于僅通過(guò)報(bào)告基因即能夠篩選與分離含有本發(fā)明的重組載體(含有目的插入物)的寄主細(xì)胞，因此篩選組件為任選的實(shí)施方案。當(dāng)報(bào)告基因?qū)τ谥亟M載體的檢測(cè)和/或篩選是必要的時(shí)，篩選組件的可選擇的誘導(dǎo)表達(dá)可用于(例如)載體生產(chǎn)的單次或多次傳代。在具體實(shí)施方案中，篩選組件可(例如)顯著地加快含有目的插入物的重組痘病毒的產(chǎn)生，因?yàn)樵诤Y選組件的誘導(dǎo)下，不含有本發(fā)明的重組載體(其包含所述目的插入物)的寄主細(xì)胞產(chǎn)生很少的病毒或不產(chǎn)生病毒(或被徹底殺死)。在這種情況下，本發(fā)明的含有報(bào)告基因以及篩選組件的重組載體產(chǎn)生對(duì)四環(huán)素敏感的發(fā)出熒光的“空”載體，以及對(duì)四環(huán)素不敏感的不發(fā)出任何熒光的重組載體。換句話說(shuō)，只有含有空載體的細(xì)胞顯示出熒光特性，因此能夠通過(guò)包括噬菌斑篩選或FACS分選術(shù)在內(nèi)的技術(shù)，將非重組成分分離出來(lái)。當(dāng)提前誘導(dǎo)表達(dá)篩選組件時(shí)，由于含有“空”載體的細(xì)胞數(shù)目在分離前急劇而有利地下降，所以能夠顯著改進(jìn)分離。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，側(cè)翼區(qū)域能夠發(fā)生同源重組。同源重組通常包括相似序列的排列、霍利迪(Holliday)連接體的形成，以及核酸的斷裂和修復(fù)(也稱為拆分)， 從而導(dǎo)致核酸鏈間的物質(zhì)發(fā)生交換。因此，本發(fā)明包含足夠相似從而能夠?qū)е峦粗亟M的任意側(cè)翼區(qū)域。在具體實(shí)施方案中，側(cè)翼區(qū)域是相同的。在另一具體實(shí)施方案中，側(cè)翼區(qū)域的大小為50至lOOObp，優(yōu)選為100至IOOObp0在具體實(shí)施方案中，重組痘病毒載體的側(cè)翼區(qū)域?yàn)槲挥贛VA基因組的刪除位點(diǎn)的上下游的側(cè)翼區(qū)域。在具體實(shí)施方案中，側(cè)翼區(qū)域?yàn)槲挥贛VA基因組的刪除位點(diǎn)I、II、III、 IV、V或VI上下游的50至IOOObp的側(cè)翼區(qū)域，優(yōu)選為100至IOOObp的側(cè)翼區(qū)域(MVA基因組位置Del I :7608/7609 ；Del II :20718/20719 ；Del III :149341/149342 ；Del IV :170480 ； Del V :19754/19755 ；Del VI :9831/9832)。SEQ ID NOs :2_7 分別顯示的是刪除位點(diǎn) I-VI 的側(cè)翼區(qū)域，各自以本發(fā)明可用的刪除位點(diǎn)為中心。例如，SEQ ID NO. :2為2002bp的序列， 其以MVA基因組的刪除位點(diǎn)I (7608/7609位)為中心。因此SEQ ID NO. :2的1001/1002 位與MVA基因組的7608/7609位相對(duì)應(yīng)。相應(yīng)地，在本發(fā)明一個(gè)具體實(shí)施方案中，側(cè)翼區(qū)域?yàn)镾EQID NO :2的1001位上游的50至lOOObp，以及SEQ ID NO 2的1002位下游的50至 IOOObp0在另一具體實(shí)施方案中，是通過(guò)使插入位點(diǎn)位于痘病毒的非編碼區(qū)域的方式，而對(duì)重組痘病毒載體的側(cè)翼區(qū)域進(jìn)行選擇的。痘病毒非編碼區(qū)域的長(zhǎng)度不同，并且長(zhǎng)度可為從約100至大于lOOObp。該非編碼區(qū)域的每個(gè)核苷酸均可選作插入位點(diǎn)。根據(jù)本發(fā)明的側(cè)翼區(qū)域?yàn)槲挥诜蔷幋a區(qū)域內(nèi)的所選插入位點(diǎn)上下游的50至lOOObp，優(yōu)選為100至lOOObp。 如果(例如)非編碼區(qū)域長(zhǎng)度為lOOObp，并且將插入位點(diǎn)選定在500和501位之間，則根據(jù)本發(fā)明的側(cè)翼區(qū)域?yàn)?00位上游的50至lOOObp，以及501位下游的50至lOOObp。在具體實(shí)施方案中，非編碼區(qū)域?yàn)镸VA的非編碼區(qū)域。在另一具體實(shí)施方案中，非編碼區(qū)域?yàn)镸VA (Gen Bank登記號(hào)U94848)的任意下列基因間的核苷酸序列001L-002L、002L-003L、 005R-006L、006L-007R、007R-008L、017L-018L、018L-019L、020L-021L、023L-024L、 024L-025L、025L-026L、028R-029L、030L-031L、031L-032L、032L-033L、035L-036L、 036L-037L、037L-038L、039L-042L、043L-044L、044L-045L、046L-047L、049L-050L、 050L-051L、051L-052L、052R-053R、053R-054R、054R-055R、055R-056L、056L-057R、 061L-062L、064L-065L、065L-066L、066L-067L、077L-078R、078R-079L、080R-081L、 085R-086R、086R-087R、088R-089L、089L-090R、094L-095R、096R-097R、097R-098R、 101R-102R、103R-104R、105L-106R、108L-109L、109L-110L、110L-111L、113L-114L、 114L-115L、115L-116R、117L-118L、118L-119R、123L-124L、124L-125L、125L-126L、 133R-134R、134R-135R、137L-138L、141L-142R、143L-144R、144R-145R、145R-146R、 146R-147R、147R-148R、148R-149L、152R-153L、153L-154R、154R-155R、156R-157L、157L-158R、159R-160L、160L-161R、161R-162R、165R-166R、166R-167R、170R-173R、 173R-174R、174R-175R、175R-176R、176R-177R、178R-179R、179R-180R、180R-181R、 183R-184R、184R-185L、185L-186R、186R-187R、187R-188R和 / 或 188R-189R。在另一實(shí)施方案中，是通過(guò)使插入位點(diǎn)位于痘病毒非必需基因中的方式，而對(duì)重組痘病毒載體的側(cè)翼區(qū)域進(jìn)行選擇的。如果一個(gè)基因是給定痘病毒的增殖性復(fù)制所不需要的，那么該基因即被認(rèn)為是非必需基因。在具體實(shí)施方案中，非必需基因選自下列基因所組成的組中胸苷激酶基因(=Tk ；參見(jiàn)文獻(xiàn)kheiflinger F. et al. "Evaluation of the thymidine kinase (tk)locus as an insertion site in the highly attenuated vaccinia MVA strain”，Arch. Virol. 1996，141 (3-4) :663-9.)、血凝素基因(=HA ；參見(jiàn)文獻(xiàn) Antoine G. et al. "Characterization of the vaccinia MVA hemagglutinin gene locus and its evaluation as an insertion site for foreign gene，，，Gene, 1996 Oct 24 ；177 (1-2) :43-6)、編碼核糖核苷酸還原酶的I4L (參見(jiàn)文獻(xiàn)Howley PM et al. "A Vaccinia Virus transfer vector using a GUS reporter gene inserted into the I4L locus ",Gene, 1996Jun 26 ； 172 (2) :233-7)、E3L (參見(jiàn)文獻(xiàn) Langland JO & Jacobs BL, "The role of the PKR-inhibitory genes, E3L and K3L, in determining Vaccinia Virus host range", Virology, 2002 Jul 20 ；299(1) :133-41)、K1L (參見(jiàn)文獻(xiàn) Maib C. et al. “ Recombinant MVA and method for generation thereof" EP1594970, 2005November 16)禾口 ATI 基因(參見(jiàn)文獻(xiàn) Wintersperger S. et al. "Vector for integration of heterologous sequences into poxviral genomes 2002Feb 20)。在另一具體實(shí)施方案中，非必需基因?yàn)檫x自MVA的基因并選自032L(核糖核苷酸還原酶)、137L(功能未知)、 166R(鳥(niǎo)苷酸激酶片段)、170(功能未知)、188R(功能未知)和189R(功能未知)。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，痘病毒為痘苗病毒。在另一實(shí)施方案中，痘病毒為 MVA。另一方面，本發(fā)明涉及含有本發(fā)明的經(jīng)修飾的痘病毒載體的細(xì)胞。通常包括各種能接收本發(fā)明的經(jīng)修飾的痘病毒載體的細(xì)胞。所述細(xì)胞優(yōu)選為真核細(xì)胞。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞或鳥(niǎo)類細(xì)胞。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，細(xì)胞為雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)。在另一實(shí)施方案中，細(xì)胞為分離的人類細(xì)胞。本發(fā)明的另一方面涉及一種用于產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)修飾痘病毒載體的新的質(zhì)粒和載體。因此，本發(fā)明也包括一種選自以下序列所組成的組中的核酸或其互補(bǔ)序列SEQ ID NOs 15-23、或具有至少 40 %、50 %、55 %、60 %、65 %、70 %、75 %、80 %、 95%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,98. 5%,99%,99. 5%,99. 7%, 99.8%、99.9%的序列同源性的其片段或同源核酸，其中所述片段的長(zhǎng)度為選自SEQ ID NOs 15-23 所組成的組中的各核酸的至少 40%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%, 95%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,98. 5%,99%,99. 5%,99. 7%, 99. 8%,99. 9%。本發(fā)明的方法本發(fā)明另一方面涉及一種產(chǎn)生重組痘病毒的方法，其中，寄主細(xì)胞為本發(fā)明經(jīng)修飾的痘病毒載體的許可性寄主細(xì)胞，在能使得載體和質(zhì)粒之間在寄主細(xì)胞內(nèi)發(fā)生同源重組的條件下，用所述載體、進(jìn)而用含有異源的目的遺傳物質(zhì)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染寄主細(xì)胞。經(jīng)修飾的痘病毒載體和含有側(cè)翼序列的質(zhì)粒必須足夠相似從而能夠發(fā)生所述的同源重組。另外，經(jīng)修飾的痘病毒載體在所述側(cè)翼區(qū)域之間攜帶有報(bào)告基因和上述篩選組件(在某些實(shí)施方案中)，而質(zhì)粒在所述側(cè)翼區(qū)域間攜帶有異源的目的遺傳物質(zhì)。相應(yīng)地，經(jīng)修飾的痘病毒載體和質(zhì)粒間所發(fā)生的同源重組，通過(guò)將報(bào)告基因(以及篩選組件，如果有的話)置換為異源的目的遺傳物質(zhì)，而形成了本發(fā)明的重組載體。在某些實(shí)施方案中，本方法使用的是包含篩選組件的本發(fā)明的經(jīng)修飾的痘病毒載體，并進(jìn)一步包括以下附加步驟誘導(dǎo)篩選基因在寄主細(xì)胞中表達(dá)。篩選基因的誘導(dǎo)取決于所采用的誘導(dǎo)性的篩選組件。作為一個(gè)例子并在具體實(shí)施方案中，所述篩選組件含有編碼 DNA酶蛋白的篩選基因，其中所述DNA酶蛋白的表達(dá)受到前述的細(xì)菌可誘導(dǎo)四環(huán)素阻遏子結(jié)合位點(diǎn)/操縱子(Tet02)的調(diào)控。通過(guò)添加四環(huán)素而進(jìn)行誘導(dǎo)，其中四環(huán)素結(jié)合到四環(huán)素阻遏子上，四環(huán)素阻遏子立即從DNA上的結(jié)合位點(diǎn)上脫離下來(lái)，轉(zhuǎn)而允許表達(dá)DNA酶，而 DNA酶抑制了病毒的復(fù)制。該誘導(dǎo)導(dǎo)致了對(duì)含有重組載體的寄主細(xì)胞和含經(jīng)修飾的痘病毒載體(其中不含目的插入基因)的寄主細(xì)胞進(jìn)行所需的篩選。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法還包括以下附加步驟將含有重組載體的寄主細(xì)胞與含有未重組的經(jīng)修飾的痘病毒載體的寄主細(xì)胞分離。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，該分離是通過(guò)報(bào)告基因表達(dá)的基因產(chǎn)物進(jìn)行的。在一個(gè)實(shí)施方案中，報(bào)告基因編碼熒光蛋白并且通過(guò)FACS及貼壁細(xì)胞分選器進(jìn)行所述分離。在另一實(shí)施方案中，報(bào)告基因?yàn)楸磉_(dá)于細(xì)胞表面的并存在其抗體的任意蛋白質(zhì)。之后通過(guò)用所述抗體包被磁珠，并將所述細(xì)胞與磁珠接觸以分離2種細(xì)胞群，從而實(shí)現(xiàn)分離。在另一實(shí)施方案中，將所述抗體附著到樹(shù)脂上，并用于層析柱中以分離2種細(xì)胞群。在另一實(shí)施方案中，使用分離得到的含重組載體的寄主細(xì)胞在新鮮寄主細(xì)胞中至少進(jìn)行一次額外的傳代。相應(yīng)地，含有重組載體的細(xì)胞數(shù)量以及因此產(chǎn)生的重組痘病毒顆粒的數(shù)量顯著地增加。在特定實(shí)施方案中，對(duì)重組痘病毒進(jìn)行至少2、3、4、5、6、7、8、9或10 次進(jìn)一步傳代。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，對(duì)重組痘病毒進(jìn)行了 6次進(jìn)一步傳代。在另一實(shí)施方案中，所述方法包括誘導(dǎo)表達(dá)篩選基因的步驟。在本發(fā)明的方法的另一實(shí)施方案中，痘病毒為痘苗病毒或MVA?？刹捎帽绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任意適當(dāng)?shù)募夹g(shù)，例如通過(guò)離心，分離所生成的重組痘病毒。本發(fā)明的醫(yī)學(xué)用途本發(fā)明的另一方面涉及根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)修飾的痘病毒、根據(jù)本發(fā)明的重組痘病毒、或根據(jù)本發(fā)明的含有經(jīng)修飾的或重組痘病毒的細(xì)胞作為藥物的用途。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物用作治療性或預(yù)防性疫苗是有益的。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)修飾的痘病毒、根據(jù)本發(fā)明的重組痘病毒、或根據(jù)本發(fā)明的含有經(jīng)修飾的或重組痘病毒的細(xì)胞在作為用于治療或預(yù)防物種中的感染的藥物中的用途，其中所述物種選自由下列組成的組中流感病毒A、B、C;肝炎病毒A、B、C、E ；人類免疫缺陷病毒；風(fēng)疹病毒；流行性腮腺炎病毒；狂犬病病毒；人乳頭狀瘤病毒；EB病毒；蜱媒病毒；克里米亞金剛熱病毒；埃博拉病毒；尼帕病毒；登革熱病毒；屈曲病毒；腸病毒；西尼羅河病毒；裂谷熱病毒；日本腦炎病毒；漢坦病毒；輪狀病毒；SARS冠狀病毒；新出現(xiàn)病毒；沙眼衣原體；肉毒桿菌；破傷風(fēng)桿菌；炭疽桿菌；嗜肺軍團(tuán)菌；腦膜炎奈瑟氏菌(Menigococcus)；鼠疫耶爾森氏菌；結(jié)核分枝桿菌；麻風(fēng)分枝桿菌；傷寒沙門氏菌； 單核細(xì)胞增多性李斯特氏菌；霍亂弧菌；流感嗜血桿菌；百日咳桿菌；幽門螺旋桿菌；疏螺方 體屬(recurrentis, hispanica, parkeri, burgdorferi)；鉤端螺方 體；立克次氏體屬；貝納特考克斯體；肺炎支原體；白喉棒狀桿菌；梅毒螺旋體；惡性瘧原蟲(chóng)；間日瘧原蟲(chóng)；卵形瘧原蟲(chóng)；三日瘧原蟲(chóng)；阿米巴原蟲(chóng)；籃氏賈第鞭毛蟲(chóng)；布氏錐蟲(chóng)；利什曼原蟲(chóng)屬；莢膜組織胞漿菌；曲霉屬；白色念珠菌；新型隱球菌；卡氏肺孢子蟲(chóng)；班氏絲蟲(chóng)；曼氏血吸蟲(chóng)和/或剛地弓形蟲(chóng)。在另一具體實(shí)施方案中，所述藥物用于治療任意上述物種起的疾病或癥狀。在特定實(shí)施方案中，所述疾病為流感、肝炎、艾滋病、流行性腮腺炎、狂犬病、腦炎、胃或十二指腸潰瘍、瘧疾、昏睡病、萊姆病、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、肺炎、麻風(fēng)病、白喉、念珠菌病和/或弓形體病。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)修飾的痘病毒、根據(jù)本發(fā)明的重組痘病毒、或根據(jù)本發(fā)明的含經(jīng)修飾的或重組的痘病毒的細(xì)胞在作為治療或預(yù)防癌癥中的藥物中的用途。在具體實(shí)施方案中，所述癌癥選自下列癌癥組成的組中宮頸癌、黑素瘤、多發(fā)性骨髓瘤、乳腺癌、前列腺癌、濾泡B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤和/或腎癌。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物用于治療需要接種疫苗的患者。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組痘病毒或含有所述重組痘病毒的細(xì)胞包含至少一個(gè)編碼抗原的基因，所述抗原能在需接種疫苗的患者體內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。在具體實(shí)施方案中，所述抗原選自下列抗原所組成的組中異源病毒抗原、細(xì)菌抗原、原核生物抗原、真菌抗原和/ 或蠕蟲(chóng)抗原。在特定實(shí)施方案中，所述抗原為物種中的抗原，所述物種選自由下列所組成的組中流感病毒A、B、C ；肝炎病毒A、B、C、E ；人類免疫缺陷病毒；風(fēng)疹病毒；流行性腮腺炎病毒；狂犬病病毒；人乳頭狀瘤病毒EB病毒；蜱媒病毒；克里米亞金剛熱病毒；埃博拉病毒； 尼帕病毒；登革熱病毒；屈曲病毒；腸病毒；西尼羅河病毒；裂谷熱病毒；日本腦炎病毒；漢坦病毒；輪狀病毒；SARS冠狀病毒；新出現(xiàn)病毒；沙眼衣原體；肉毒桿菌；破傷風(fēng)桿菌；炭疽桿菌；嗜肺軍團(tuán)菌；腦膜炎奈瑟氏菌(Menigococcus)鼠疫耶爾森氏菌；結(jié)核分枝桿菌；麻風(fēng)分枝桿菌；傷寒沙門氏菌；單核細(xì)胞增多性李斯特氏菌；霍亂弧菌；流感嗜血桿菌；百日咳桿菌；幽l、lil旋桿菌；疏il旋體屬(recurrentis, hispanica, parkeri, burgdorferi)；鉤端螺旋體；立克次氏體屬；貝納特考克斯體；肺炎支原體；白喉棒狀桿菌；梅毒螺旋體 ’惡性瘧原蟲(chóng)；間日瘧原蟲(chóng)；卵形瘧原蟲(chóng)；三日瘧原蟲(chóng)；阿米巴原蟲(chóng)；籃氏賈第鞭毛蟲(chóng)；布氏錐蟲(chóng)；利什曼原蟲(chóng)屬；莢膜組織胞漿菌；曲霉屬；白色念珠菌；新型隱球菌；卡氏肺孢子蟲(chóng)；班氏絲蟲(chóng)；曼氏血吸蟲(chóng)和/或剛地弓形蟲(chóng)。在另一具體實(shí)施方案中，所述抗原為癌細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì)。在另一具體實(shí)施方案中，所述抗原為癌細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì)并且表達(dá)在在癌細(xì)胞表在進(jìn)一步的具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組痘病毒或含有所述重組痘病毒的細(xì)胞包含癌細(xì)胞表達(dá)的抗原。所述的癌細(xì)胞表達(dá)的抗原的例子包括但不限于α-胎蛋白 (AFP)；前列腺特異抗原(PSA)；癌胚抗原(CEA) ；disialosyl LEA抗原；黑素-A/MART-1 ； SART3;多藥耐藥相關(guān)蛋白3(MRP3) ；zeste同源蛋白2的多梳組的蛋白增強(qiáng)子(ES12)； ALDHl ；Her-2 ；Nectin-4 ；gp96 熱休克蛋白 gplOO ；酪氨激酶；GM2 ；MAGE-A3 和 NY-ES0-1。 在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組痘病毒或含有所述重組痘病毒的細(xì)胞包含抗體的編碼基因。在具體實(shí)施方案中，所述抗體對(duì)于在腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的細(xì)胞標(biāo)記是特異性的。可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法對(duì)患者施予本發(fā)明的藥物。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，是通過(guò)注射施予所述藥物的。 實(shí)施例為了評(píng)價(jià)本發(fā)明的經(jīng)修飾的痘病毒載體的效價(jià)，構(gòu)建了一些基本的MVA載體。這些MVA載體包含編碼熒光的報(bào)告基因、含有DNA酶篩選基因的篩選組件、以及處于不同啟動(dòng)子控制下的四環(huán)素阻遏子(TetR)編碼基因，其中所述報(bào)告基因處于痘苗病毒強(qiáng)啟動(dòng)子控制下，而所述篩選基因則處于痘苗病毒強(qiáng)啟動(dòng)子和四環(huán)素操縱子(TetC^)元件的控制下。如圖1所示，通過(guò)將報(bào)告基因/篩選組件盒引入至MVA基因組的插入位點(diǎn) (Deletion III或Del3)，而對(duì)基本的MVA基因組進(jìn)行修飾在與Deletion III(Flankl Del3)的上游側(cè)翼區(qū)域相鄰的位置插入報(bào)告基因(例如，綠色熒光蛋白(GFP)基因)，其處于痘苗病毒強(qiáng)合成啟動(dòng)子(Ps)的控制，以作為報(bào)告基因體系。該報(bào)告基因(例如GFP)以最佳方式允許檢測(cè)到含有插入盒的MVA。將篩選組件在報(bào)告基因的下游(與Flank2 Del3 相鄰)插入至基因組中。其是由(例如)處于痘苗病毒強(qiáng)合成啟動(dòng)子(Ps)控制下的DNA 酶基因組成，所述痘苗病毒強(qiáng)合成啟動(dòng)子由細(xì)菌操縱子元件(TetC^)控制，而細(xì)菌操縱子元件與阻遏子(TetR)相互作用。阻遏子的互相作用反過(guò)來(lái)又受到四環(huán)素的控制。在缺乏四環(huán)素的情況下，TetR結(jié)合到Tet02控制序列上從而抑制DNA酶基因的表達(dá)。然而，在存在四環(huán)素的情況下，TetR從Tet02位點(diǎn)上釋放從而使得DNA酶基因能夠表達(dá)。之后所表達(dá)的DNA酶蛋白抑制了病毒DNA在被感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的擴(kuò)增。通過(guò)同源重組刪除報(bào)告基因/篩選組件盒，從而分離含有異源的目的遺傳物質(zhì)的重組MVA。隨后在四環(huán)素的存在下將所得的病毒進(jìn)行傳代?？赏ㄟ^(guò)熒光檢測(cè)出含有未重組的經(jīng)修飾的MVA的細(xì)胞，并且DNA酶的表達(dá)抑制了 MVA的生長(zhǎng)。由于含有重組MVA的細(xì)胞不具有報(bào)告基因/篩選組件盒，因此它們不能顯示出熒光，以及由于不發(fā)生DNA酶的表達(dá)， MVA的生長(zhǎng)不會(huì)受到抑制?？赏ㄟ^(guò)分離熒光和非熒光細(xì)胞而實(shí)現(xiàn)重組和未重組MVA的分離。采用含有MVA Deletion III的側(cè)翼序列的細(xì)菌質(zhì)粒(圖2和3)作為將異源的目的遺傳物質(zhì)插入到經(jīng)修飾的MVA載體中的穿梭質(zhì)粒。所述質(zhì)粒還包含多個(gè)限制性單酶切位點(diǎn)處于其側(cè)翼的LacZ表達(dá)盒。通過(guò)一個(gè)或多個(gè)限制性單酶切位點(diǎn)，把將要插入至經(jīng)修飾的 MVA載體中的異源的目的遺傳物質(zhì)克隆到細(xì)菌載體vEM07 (SEQ ID NO: 1)中。將LacZ基因刪除，并且可通過(guò)使用X-Gal的藍(lán)白斑試驗(yàn)，檢測(cè)出含有異源的目的遺傳物質(zhì)的質(zhì)粒。之后通過(guò)同源重組，將所得的質(zhì)粒用于將異源的目的物質(zhì)插入至經(jīng)修飾的MVA載體中。實(shí)施例1 經(jīng)修飾的MVA載體篩選組件的克隆通過(guò)同源重組將報(bào)告基因/篩選組件盒插入MVA基因組中。為此，將(i)報(bào)告基因、(ii)I^-Tet02-DNA酶和(iii)TetR中各組分逐一克隆到細(xì)菌質(zhì)粒中。DNA酶基因的克隆通過(guò)兩步PCR過(guò)程合成DNA酶片段(Spel-Ps-I^tC^-DNA酶-SacI)，并將其克隆到載體 vEMll(SpeI/SacI) (SEQ ID NO :15)中，從而得到 νΕΜ 12 (SEQ ID NO :16)。對(duì)于第一步PCR，采用的是以下寡聚核苷酸1) oEM167 :Tet02_DNA 酶起始；TCCCTATCAGTGATAGAGATCTCCCTATCAGTGATAGAGATAT GAGGGGCATGAAGCTGCTG(SEQ ID NO 8)
2)oEM 168 :DNA 酶末端-SacI ；GAGCTCCTACTTCAGCATCACC (SEQ ID NO 9)該P(yáng)CR過(guò)程的模板為含有人DNA酶開(kāi)放閱讀框的pENTR-DNA酶質(zhì)粒Qnvitrogen 公司的ORF Clone collection，克隆ID I0H23149)。第一步PCR得到如圖4所示的片段。對(duì)于第二步PCR，采用的是第一步PCR的PCR純化產(chǎn)物以及以下的寡聚核苷酸1)οΕΜ169 Spel-Ps-Tet02 ；GACTAGTAAAAATTGAAATTTTATTTTTTTTTTTTGGAATATAAATATCCCTATC AGTGATAGAG(SEQ ID NO: 10)2)oEM168 :DNA 酶末端-SacI ；GAGCTCCTACTTCAGCATCACC (SEQ ID NO :9)第二步PCR得到如圖5所示的片段。之后通過(guò)利用SpeI和McI限制性位點(diǎn)，將所得的片段克隆到重組載體vEM 11上 (圖6)。該克隆步驟得到載體vEM 12 (圖7)。TetR 的克降在接下來(lái)的克隆步驟中，將TetR編碼區(qū)域插入載體VEM12中。TetR的表達(dá)量是一個(gè)非常重要的實(shí)驗(yàn)參數(shù)，這是因?yàn)?，既需要充分表達(dá)TetR，以覆蓋細(xì)胞內(nèi)存在的所有Tet02 序列(每個(gè)細(xì)胞約200拷貝)，但是又不能過(guò)量表達(dá)TetR，因?yàn)檫@將需要過(guò)量的四環(huán)素以誘導(dǎo)DNA酶的表達(dá)。因此，在三個(gè)不同啟動(dòng)子Ps (強(qiáng)表達(dá))、H5(中度表達(dá))以及p7.5(低表達(dá))的控制下，評(píng)定TetR的表達(dá)量。具有Ps啟動(dòng)子的TetR克隆的克隆通過(guò)PCR合成Ps-四環(huán)素阻遏子(TetR)盒。模板為pcDNA6/TR質(zhì)粒(Invitrogen)， 將下列寡聚核苷酸用于I3S啟動(dòng)子的融合和擴(kuò)增1)οΕΜ163 SacI-Ps-TetR 起始；GGGAGCTCAAAAATTGAAATTTTATTTTTTTTTTTTGGAATATAAATAATG TCTAGATTAGATAAAAG(SEQ ID N0:11)2)oEM164 TetR 末端-NheI ；GCTAGCTTAATAAGATCTGAATTCC (SEQ ID NO 12)采用McI和NheI將所得的PCR片段(圖8)克隆到載體νΕΜ 12中。該克隆步驟得到載體 νΕΜ 31，SEQ ID NO :17(圖 9)。具有P7. 5/H5啟動(dòng)子的I~etR的克隆ρ7· 5 和 Η5 啟動(dòng)子存在于質(zhì)粒 pVIV06 (SEQ ID NO :18)和 pVIV07 (SEQ ID NO :19) 中，并且通過(guò)使用下列寡聚核苷酸的PCR，將TetR擴(kuò)增以插入到這些載體中l(wèi))oEM165 =XhoI-iTetR 起始；CTCGAGATGTCTAGATTAGATAAAAG (SEQID NO 13)2)oEM166 =TetR 末端-ApaI ；CCGGGCCCTTAATAAGATCTGAATTCC (SEQ ID NO 14)為了將TetR編碼區(qū)域適當(dāng)?shù)厝谌氲絾?dòng)子中，通過(guò)ApaI和BioI將PCR片段克隆到載體 PVIV06 (ρ7· 5)和載體 pVIV07 (Η5)中。將TetR 克隆到 pVIV06 中，得到的是載體 pEM12(7. 5) (SEQ ID NO :20)，而將 TetR 克隆到pVIV07中，得到的是載體pEM13(H5) (SEQ ID NO :21)。之后采用SacI和ApaI提取 TetR表達(dá)盒并將其克隆到vEM12中。從而得到載體vEM32 (7. 5) (SEQ ID NO :22)和載體 vEM33 (H5) (SEQ ID NO :23)，除了表達(dá)1TetR基因的啟動(dòng)子不同外，它們與載體vEM31 (圖9)
是一樣的。
實(shí)施例2 經(jīng)修飾的MVA載體的克隆分別采用vEM31、32和33構(gòu)建經(jīng)修飾的MVA載體。為此，先用MVA (感染復(fù)數(shù)0. 05) 感染CEF細(xì)胞，然后再分別用vEM31、32或33轉(zhuǎn)染。之后在篩選條件(如含5 μ g/ml的殺稻瘟素的培養(yǎng)基)下，將被感染的CEF細(xì)胞釋放的MVA顆粒用新鮮CEF細(xì)胞傳代3次，這是因?yàn)楹兄亟MMVA(即經(jīng)修飾的MVA載體)的細(xì)胞對(duì)該抗生素有抗性。依次通過(guò)噬斑純化和FACS單元(熒光激發(fā)細(xì)胞分選器)純化重組MVA顆粒。將所得的經(jīng)修飾的MVA載體進(jìn)行擴(kuò)增和鑒定后，采用四環(huán)素/DNA酶體系進(jìn)行檢測(cè)；其中所得的經(jīng)修飾的MVA載體得自MVA與vEM31的重組(mEM06，I3s-TetR)、MVA與vEM32 的重組(mEM07，7. 5-TetR)和 MVA 與 vEM33 的重組(mEM08，H5_TetR)。實(shí)施例3 四環(huán)素/DNA酶體系的評(píng)價(jià)為了檢測(cè)可誘導(dǎo)的反向選擇體系，用經(jīng)修飾的MVA病毒mEM06、07和08分別感染細(xì)胞，并將其培養(yǎng)在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基中。采用不同濃度的四環(huán)素進(jìn)行分析(0-500yg/ ml) ο為了評(píng)價(jià)可誘導(dǎo)DNA酶表達(dá)對(duì)未修飾的MVA的復(fù)制的影響，將MVA感染的細(xì)胞用 (vEM12)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，以促進(jìn)DNA酶的瞬時(shí)表達(dá)。另外，通過(guò)只用四環(huán)素培養(yǎng)MVA感染的細(xì)胞，來(lái)分析四環(huán)素對(duì)未修飾的MVA的復(fù)制的影響。另外，為了監(jiān)測(cè)四環(huán)素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)以及細(xì)胞狀態(tài)的影響，采用與檢測(cè)經(jīng)修飾的病毒載體相同的四環(huán)素濃度培養(yǎng)感染和未感染MVA的 CEF細(xì)胞。簡(jiǎn)單而言，用經(jīng)修飾的MVA病毒mEM07 (7. 5 = 7. 5啟動(dòng)子)、mEM06 O3S = I3S啟動(dòng)子)、mEM08 (H5 = H5啟動(dòng)子)感染CEF細(xì)胞，并將其在含有不同濃度四環(huán)素的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)(Tet 0 =無(wú)四環(huán)素；Tet 25 = 25 yg四環(huán)素/ml)。對(duì)照組中，用未修飾的MVA空載體感染CEF細(xì)胞(MVA)，并隨后也用vEM12轉(zhuǎn)染一些MVA感染細(xì)胞(MVA+DNA酶)。也用四環(huán)素培養(yǎng)感染了未修飾的MVA空載體的CEF細(xì)胞(MVA+kt)。在37°C (5% CO2)培養(yǎng)48小時(shí)后，收獲細(xì)胞并測(cè)定病毒滴度。圖10提供了所得結(jié)果的概要。未修飾的MVA對(duì)照組(圖10，MVA)所得滴度為8. 75E+°6TCID5(1。因此這就是在上述條件下在沒(méi)有任何抑制物質(zhì)存在的情況下用未經(jīng)修飾的MVA進(jìn)行感染所能得到的滴度。 DNA酶的表達(dá)導(dǎo)致滴度減少2個(gè)對(duì)數(shù)值(圖10，MVA+DNA酶，6. 56E+04TCID50/ml)。然而，由于MVA感染是通過(guò)接種1. OOE+05TCID50/ml的未修飾MVA而實(shí)現(xiàn)的，因此該處理不會(huì)導(dǎo)致病毒數(shù)量的增加(即沒(méi)有生產(chǎn)性復(fù)制)，并且從而DNA酶的表達(dá)的確有效抑制了病毒復(fù)制。用未修飾的MVA感染并用四環(huán)素培養(yǎng)的細(xì)胞，表明四環(huán)素本身對(duì)MVA復(fù)制有影響， 很可能是因?yàn)榧?xì)胞毒性效應(yīng)。當(dāng)采用25-50 μ g四環(huán)素/ml時(shí)，則沒(méi)有檢測(cè)到其對(duì)MVA復(fù)制的影響，而當(dāng)采用100 μ g/ml的濃度時(shí)，MVA復(fù)制下降了一個(gè)對(duì)數(shù)值；另外，250 μ g/ml的濃度對(duì)病毒復(fù)制的抑制與所觀測(cè)到的瞬時(shí)表達(dá)DNA酶的效果有可比性(圖10，MVA+Tet)。 用75 μ g/ml的四環(huán)素處理經(jīng)修飾的MVA載體mEM06和mEM08所感染的細(xì)胞，通過(guò)誘導(dǎo)DNA 酶，而導(dǎo)致病毒復(fù)制的降低(圖10，mEM06和mEM08)，由于病毒滴度更顯著地降低，因此不能將其只歸因于直接四環(huán)素作用。使用IOOyg四環(huán)素/ml可觀察到相同的效果。150yg/ ml的濃度導(dǎo)致了非常顯著的四環(huán)素的細(xì)胞毒性效果，以至于經(jīng)修飾的MVA病毒完全不進(jìn)行復(fù)制。相應(yīng)地，為了進(jìn)一步進(jìn)行檢測(cè)，使用了 75至IOOyg四環(huán)素/ml的窄濃度范圍。經(jīng)修飾的MVA載體mEM07通過(guò)p7. 5弱啟動(dòng)子表達(dá)TetR，而顯然p7. 5弱啟動(dòng)子產(chǎn)生的TetR的量不足以抑制DNA酶的任意定量性數(shù)量的表達(dá)。因此在所有實(shí)驗(yàn)安排中病毒的復(fù)制均顯著減少，并且所述病毒自身不適合用作用于用單重組載體克隆重組病毒的基礎(chǔ)病毒。實(shí)施例4 采用單重組體系克隆重組痘病毒載體由于經(jīng)修飾的MVA病毒mEM06和mEM08顯示出相似的復(fù)制模式，因此采用mEM06 進(jìn)行額外的試驗(yàn)。用經(jīng)修飾的MVA病毒mEM06感染細(xì)胞并用vEM07轉(zhuǎn)染細(xì)胞(圖3)。通過(guò)同源重組，將LacZ基因插入到所選定的經(jīng)修飾的MVA病毒基因組中，并且報(bào)告基因/篩選盒被刪除。在含四環(huán)素(100yg/ml)的培養(yǎng)基中，使所釋放的病毒顆粒在新鮮的CEF細(xì)胞中傳代， 然后在非篩選條件下通過(guò)系列稀釋進(jìn)行傳代。用FACS分選感染的細(xì)胞以篩選出非熒光細(xì)胞。一旦分選過(guò)程中的分組被進(jìn)一步優(yōu)化后，所分選的細(xì)胞為同源化并在CEF細(xì)胞中繼續(xù)傳代。分選所感染的細(xì)胞并在新鮮CEF細(xì)胞中對(duì)病毒再次進(jìn)行擴(kuò)增。細(xì)胞確定無(wú)疑地已被感染，并且不會(huì)顯示出熒光，這表明它們含有純化的重組MVA病毒。通過(guò)能夠擴(kuò)增經(jīng)修飾的 MVA載體的插入位點(diǎn)的PCR程序，來(lái)確定重組病毒的純度(圖11)。對(duì)于經(jīng)修飾的MVA載體， PCR產(chǎn)生了 3. Okb的信號(hào)，并且對(duì)于含有IacZ (其通過(guò)同源重組取代了報(bào)告基因/篩選盒) 的重組MVA，產(chǎn)生了更小的0. 76kb的片段。重組MVA病毒樣品在0.761Λ處提供清晰的信號(hào)(圖11，recMVA)，但經(jīng)修飾的 MVA(mEM06)或未經(jīng)修飾的MVA (MVA)卻沒(méi)有信號(hào)。重組載體vEM07也產(chǎn)生了 0. 76kb的預(yù)期信號(hào)(圖11，VEM07)。將在刪除位點(diǎn)內(nèi)含有篩選/報(bào)告基因盒的經(jīng)修飾的MVA用作對(duì)照， 并且其顯示出3. Okb的預(yù)期信號(hào)(mEM06)。未經(jīng)修飾的MVA載體也產(chǎn)生了約200bp的預(yù)期信號(hào)(MVA)。為了確定通過(guò)現(xiàn)有體系所達(dá)到的穩(wěn)定結(jié)果，采用上述步驟重復(fù)克隆過(guò)程。采用所述單重組體系仍然容易地分離重組MVA。實(shí)施例5 采用單重組體系進(jìn)一步克隆重組痘病毒載體采用根據(jù)本發(fā)明的使用經(jīng)修飾的痘病毒載體的單重組體系，克隆重組痘病毒，其中所述經(jīng)修飾的痘病毒載體包含位于用于同源重組的一對(duì)側(cè)翼序列之間的報(bào)告基因。用經(jīng)修飾的MVA病毒感染細(xì)胞，然后用VEM07轉(zhuǎn)染細(xì)胞(圖3)。通過(guò)同源重組，將 LacZ基因插入到所篩選的經(jīng)修飾的MVA病毒基因組中，并導(dǎo)致刪除報(bào)告基因盒。之后在含四環(huán)素(100yg/ml)的培養(yǎng)基中，將所釋放的病毒顆粒在新鮮CEF細(xì)胞中傳代至少一次。然后如上所述，采用FACS分選感染的細(xì)胞，從而篩選出無(wú)熒光的細(xì)胞。感染細(xì)胞分選完成后，將病毒再次在新鮮CEF細(xì)胞中擴(kuò)增。通過(guò)能夠擴(kuò)增經(jīng)修飾的MVA載體的插入位點(diǎn)的PCR程序，確定重組病毒的純度 (圖11)。PCR產(chǎn)生了含IacZ (其通過(guò)同源重組取代了報(bào)告基因盒)的重組MVA片段。
權(quán)利要求
1.一種經(jīng)修飾的痘病毒載體，其包含報(bào)告基因，所述報(bào)告基因位于用于同源重組的一對(duì)側(cè)翼序列之間。
2.權(quán)利要求1所述的經(jīng)修飾的痘病毒載體，其中，所述報(bào)告基因編碼熒光蛋白。
3.權(quán)利要求1所述的經(jīng)修飾的痘病毒載體，其還包含至少一個(gè)篩選組件，所述篩選組件位于用于同源重組的一對(duì)側(cè)翼序列之間。
4.權(quán)利要求3所述的經(jīng)修飾的痘病毒載體，其中，所述篩選組件包含篩選基因，所述篩選基因抑制或減緩痘病毒在寄主細(xì)胞中的復(fù)制、或?qū)闹骷?xì)胞具有細(xì)胞毒性。
5.權(quán)利要求3所述的經(jīng)修飾的痘病毒載體，其中所述報(bào)告基因和所述篩選組件位于用于同源重組的單一一對(duì)側(cè)翼序列之間。
6.權(quán)利要求3所述的經(jīng)修飾的痘病毒載體，其中所述報(bào)告基因和所述篩選組件位于用于同源重組的多于一對(duì)側(cè)翼序列之間。
7.權(quán)利要求1-6所述的經(jīng)修飾的痘病毒載體，其中所述痘病毒為痘苗病毒或經(jīng)修飾的安卡拉痘苗病毒。
8.一種含有權(quán)利要求1-7所述的經(jīng)修飾的痘病毒載體的細(xì)胞。
9.權(quán)利要求1-7所述的經(jīng)修飾的痘病毒載體或權(quán)利要求8所述的細(xì)胞在產(chǎn)生重組痘病毒中的用途。
10.一種用于產(chǎn)生能夠表達(dá)目的基因的重組痘病毒的方法，其包括(1)用權(quán)利要求1-7所述的經(jīng)修飾的痘病毒載體感染許可性寄主細(xì)胞；以及(2)用含有所述目的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染所述許可性寄主細(xì)胞，條件是允許所述載體和所述質(zhì)粒之間發(fā)生同源重組，從而制備得到重組痘病毒。
11.權(quán)利要求10所述的方法，其進(jìn)一步包括以下步驟通過(guò)針對(duì)所述篩選組件的存在進(jìn)行篩選，增強(qiáng)重組痘病毒的復(fù)制。
12.權(quán)利要求10-11所述的方法，其進(jìn)一步包括以下步驟將含有重組痘病毒的許可性寄主細(xì)胞與含有所述的經(jīng)修飾的痘病毒載體的許可性寄主細(xì)胞分離，其中所述經(jīng)修飾的痘病毒載體未與含有所述目的基因的所述載體發(fā)生同源重組。
13.權(quán)利要求10-12所述的方法，其進(jìn)一步包括以下步驟使用含有所述重組病毒的所述許可性寄主細(xì)胞，用于在之前未感染的許可性寄主細(xì)胞中進(jìn)一步傳代至少一次。
14.權(quán)利要求10-13所述的方法，其中，所述痘病毒為痘苗病毒或經(jīng)修飾的安卡拉痘苗病毒。
15.一種包含通過(guò)權(quán)利要求10-14所述的方法產(chǎn)生的重組痘病毒的細(xì)胞。
16.權(quán)利要求10-14所述的方法或權(quán)利要求15所述的細(xì)胞在產(chǎn)生重組痘病毒中的用途。
17.一種通過(guò)使用權(quán)利要求10-14所述的方法或權(quán)利要求15所述的細(xì)胞所產(chǎn)生的重組痘病毒。
18.用作藥物的權(quán)利要求1-7所述的經(jīng)修飾的痘病毒、權(quán)利要求8或15所述的細(xì)胞、或根據(jù)權(quán)利要求17所述的重組痘病毒。
19.用作治療性或預(yù)防性疫苗的權(quán)利要求1-7所述的經(jīng)修飾的痘病毒、權(quán)利要求8或 15所述的細(xì)胞、或根據(jù)權(quán)利要求17所述的重組痘病毒，所述治療性或預(yù)防性疫苗用于治療或預(yù)防下列疾病癌癥、流感、肝炎、艾滋病、流行性腮腺炎、狂犬病、腦炎、胃或十二指腸潰瘍、瘧疾、昏睡病、萊姆病、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、肺炎、麻風(fēng)病、白喉、念珠菌病和/或弓形體病。
20.一種選自由以下序列所組成的組中的核酸或其互補(bǔ)序列SEQ ID NOs. 15-23、或具有至少40%序列同源性的其片段或其同源核酸，其中所述片段的長(zhǎng)度為相應(yīng)核酸的至少 40%。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種經(jīng)修飾的痘病毒載體，其可以通過(guò)單重組事件而產(chǎn)生重組痘病毒。公開(kāi)了一種包括至少一個(gè)報(bào)告基因的經(jīng)修飾的痘病毒載體，其中所述報(bào)告基因位于用于同源重組的2個(gè)側(cè)翼序列之間。此外，還提供了一種含有所述載體的寄主細(xì)胞以及一種使用所述載體產(chǎn)生重組痘病毒的方法。
文檔編號(hào)A61K39/00GK102264909SQ200980152088
公開(kāi)日2011年11月30日 申請(qǐng)日期2009年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月22日
發(fā)明者卡賈·邁爾, 索尼婭·萊雷爾 申請(qǐng)人:新興產(chǎn)品開(kāi)發(fā)德國(guó)有限公司