專利名稱：用于治療阿爾茨海默病的載體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及以高效率地誘導抗Αβ抗體以及預防和治療阿爾茨海默病為目的的新的基因導入載體和包含該載體的主動免疫用疫苗等。
背景技術：
伴隨著進入所謂老齡化社會，神經變性疾病患者的人數逐漸增加，例如人數據稱日本為100萬人、美國為450萬人。全世界阿爾茨海默病患者估計為1500萬人以上，而且可以預想，今后20年間患者人數將達到上述的2倍以上。雖然存在數種治療藥物，但仍然希望開發(fā)可適用于病情進展階段的治療方法、或者能在早期有效阻斷其進展的治療方法、 以及預防發(fā)病本身的方法等，對新的治療方法的社會性需求非常高。作為阿爾茨海默病的發(fā)病機制的一種主要假說是“淀粉樣蛋白級聯假說”，其將淀粉樣蛋白β (Αβ)的聚集和沉積引起的老年斑形成作為原因。以該假說為基礎，以Αβ為靶標的疫苗療法作為針對阿爾茨海默病的新治療方法受到了關注，并且人們認為為了其有效性，體液免疫(抗Αβ抗體)的誘導是重要的。實際上，有報導稱，通過將經聚集的Αβ 肽與佐劑一起施用時，模型小鼠中腦的淀粉樣蛋白沉積減少(Schenk D，等，Nature 400 173-177，1999)。以上述這些結果為基礎，Elan公司和Wyeth公司進行了將合成A β肽(ΑΝ-1792 Aβ 42)與佐劑01S21) —起施用的臨床試驗，并確認約20%受試者中血清中的抗Αβ抗體水平提高(Hock C，等，Nat. Med. 8 :1270-1275, 2002)，還報導了高級腦功能的改善(Hock C， 等，Neuron 38力47-554，2003)，而且還有報導稱，在長期觀察中也能夠確認有效性(Gilman S.等，Neurology 64，1553-1562，2005)。但是，有報導稱，在將合成A β肽與佐劑組合的疫苗療法中，有發(fā)生腦膜腦炎的情況(Orgogozo JM，等，Neurology 61 :46_54，2003)，而根據具有腦膜腦炎的腦的病理學組織分析可見，在少數病例中，在新皮質中的老年斑后，觀察到星形膠質細胞的增殖和變性軸索的消失。關于腦膜腦炎的發(fā)病原因，可以推測如下在一部分患者中，疫苗療法中所需的佐劑誘導了細胞免疫，結果與Αβ或APP反應的Thl型CD4陽性T細胞浸潤至腦內，由此引起實驗性變態(tài)反應性腦脊髓炎樣的腦膜腦炎。疫苗療法本身被認定是有效的。因此希望開發(fā)不導致腦膜腦炎的更安全的接種技術。作為抑制腦膜腦炎(副作用)的方法之一，提出了僅利用預計不含T細胞表位的Αβ肽的N末端部分的方法，并進行了評價。已經開發(fā)出將Αβ1-7肽與Th2型的佐劑(CRM197 非毒性白喉毒素變體)一起使用的免疫方法，且驗證了其有效性(Vaccine ACC-OO1, Wyeth公司)。此外，關于A β 1_15肽的評價也有報導，顯示A β 1_15肽作為免疫原比 Αβ42 要弱(Leverone JF 等，Vaccine. 21，2197-206，2003)。但證明使用 Αβ1_15 的樹狀聚體能夠提高抗 A β 抗體效價(Seabrook TJ 等，J Neuroinf lammation. 3，14，2006、 Seabrook TJ 等，Neurobiol Aging. 28，813-23，2007)。此外還顯示 A β 1-15 的 2 重串聯型可稍微提高抗Αβ抗體效價，而且在模型小鼠中有效(Maier M等，J Neurosci. 26, 4717-4728，2006)。
如上所述，作為用于提高安全性的方法之一，可以認為僅利用Αβ肽的N末端部分是有效的。但其作為免疫原的功能弱。需要將對結構、佐劑、施用方法的改進結合起來加以利用。此外，還實施了基于直接施用針對A β的抗體的被動免疫法(Bard F，Cannon C， Barbour R 等，Nat. Med. 6 :916-919,2000)的臨床試驗(bapineuzumab = AAB-001，Elan 和 Wyeth 公司；RN-1219, Rinat/Pfizer 公司；LY-2062430, Eli Lilly 公司)。該方法中理論上不會誘導T細胞的反應。因此，不會像AN1792中觀察到的那樣導致腦膜腦炎。但是，在被動免疫中，因長時間施用大量抗體而引起的抗獨特型抗體的出現、以及淀粉樣蛋白沉積于血管而引起的出血傾向令人擔心。另一方面，還進行了基因免疫接種的研究。已經報導了利用質粒(Qu B,Boyer PJ, Johnston SA 等，JNeurol Sci. 244 :151-158,2006, Okura Y, Miyakoshi A, Kohyama K 等， Proc. Natl. Acad. ki.USA，103 :9619-9624，2006)、腺病毒載體(Kim HD, Cao Y, Kong FK等， Vaccine 23 :2977-2986,2005, Kim HD, Tahara K, Maxwell JA 等，J Gene Med. 9 :88-98, 2007)、腺伴隨病毒載體(Zhang J, Wu X, Qin C 等，Neurobiol Dis. 14 :365-379, 2003,Hara H, Monsonego A, Yuasa K 等，J Alzheimers Dis. 6 :483-488,2004)等的例子。但是，其在效果上尚有不足。如上所述，雖然疫苗療法本身被認定為是有效的，但未見能提供更安全有效的疫苗技術的例子，目前的狀況是仍然強烈希望進行其開發(fā)?，F有技術文獻非專利文獻非專利文獻1 =Schenk D.等，Nature 400 173-177，1999非專利文獻2:Hock C.等，Nat. Med. 8 :1270-1275,2002非專利文獻3:Hock C.等，Neuron 38 :547-554,2003非專利文獻4 :Gilman S.等，Neurology 64，1553-1562，2005非專利文獻 5 :0rgogozo JM.等，Neurology 61 :46-54,2003非專利文獻6 :Leverone JF.等，Vaccine. 21，2197-206，2003非專利文獻7 =Seabrook TJ.等，J Neuroinflammation. 3，14,2006非專利文獻8 :Seabrook TJ.等，Neurobiol Aging. 28，813-23，2007非專利文獻9 =Maier M.等，JNeurosci. 26,4717-4728, 2006非專利文獻10 =Bard F.等，Nat. Med. 6 :916-919,2000
非專利文獻11 =Qu B.等，JNeurol Sci. 244 151-158，2006非專利文獻12 =Okura Y.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103 :9619-9624, 2006非專利文獻13 :Kim HD.等，Vaccine 23 :2977-2986,2005非專利文獻14 :Kim HD.等，J Gene Med. 9 :88-98,2007非專利文獻15 =Zhang J.等，Neurobiol Dis. 14 :365-379,2003非專利文獻16 =Hara H.等，J Alzheimers Dis. 6 :483-488,200
發(fā)明內容
發(fā)明所要解決的問題
本發(fā)明正是鑒于上述狀況而提出的，本發(fā)明所要解決的問題提供高效率地誘導抗 Αβ抗體的方法、以及以治療或者預防阿爾茨海默病為目的的更安全有效的免疫療法。解決問題的方法本發(fā)明人為解決上述問題進行了深入的努力，旨在開發(fā)使用表達Αβ的RNA病毒載體的疫苗療法。在該過程中本發(fā)明人發(fā)現，通過組合使用表達ΑΒ5毒素B亞基與淀粉樣蛋白β肽的融合蛋白質的核酸與RNA病毒載體的疫苗療法，能夠誘導顯著高效價的針對Αβ 的抗體。特別是，與傳統(tǒng)的治療方法相比，表達含淀粉樣蛋白β肽Αβ 1-15的融合蛋白質的RNA病毒載體顯示出顯著有效的治療效果。與本發(fā)明人先前報導的淀粉樣蛋白β表達載體相比(102006/112553)，該病毒載體能夠實現々0表達水平的顯著提高、并且保證作為有效性的指標之一的抗Αβ抗體的表達。此外，所開發(fā)的治療方法未觀察到采用傳統(tǒng)的Aβ 肽和佐劑的組合進行免疫時造成問題的腦膜腦炎。這提示該治療方法能夠保證安全性。S卩，本發(fā)明涉及編碼ΑΒ5毒素B亞基與淀粉樣蛋白β抗原肽之間的融合蛋白質的 RNA病毒載體、利用該載體進行抗A β抗體(體液免疫)的誘導、和使用該載體預防和治療阿爾茨海默病等。更具體地，本發(fā)明涉及〔1〕編碼ΑΒ5毒素B亞基與淀粉樣蛋白β抗原肽之間的融合蛋白質的RNA病毒載體。〔2〕〔1〕所述的載體，其中，ΑΒ5毒素B亞基是霍亂毒素B(CTB)?！?〕〔1〕或〔2〕所述的載體，其中，淀粉樣蛋白β抗原肽包含1個或多個拷貝的 Αβ 1-15或其片段?！?〕〔3〕所述的載體，其中，淀粉樣蛋白β抗原肽具有1 8個拷貝的Αβ 1-15或其片段連接在一起的結構?！?〕〔4〕所述的載體，其中，淀粉樣蛋白β抗原肽具有4 8個拷貝的Αβ 1-15連接在一起的結構?！?〕〔1〕 〔5〕中任一項所述的載體，其中，RNA病毒載體是負鏈RNA病毒載體?！?〕〔6〕所述的載體，其中，負鏈RNA病毒載體是副粘病毒載體?！?〕〔7〕所述的載體，其中，副粘病毒載體是仙臺病毒載體?！?〕包含〔1〕 〔8〕中任一項所述的載體和藥學上可接受的擔載體的組合物?！?0〕用于抗Αβ抗體的誘導的〔9〕所述的組合物?！?1〕用于預防或治療阿爾茨海默病的〔9〕或〔10〕所述的組合物。〔12〕用于預防或治療阿爾茨海默病的藥物，其包括〔1〕 〔8〕中任一項所述的載體。〔13〕〔1〕 〔8〕中任一項所述的載體在制造用于誘導抗Αβ抗體的組合物中的用途。〔14〕〔1〕 〔8〕中任一項所述的載體在制造用于預防或治療阿爾茨海默病的組合物中的用途。〔15〕〔13〕或〔14〕所述的用途，其中，利用包含淀粉樣蛋白β抗原的蛋白質或編碼該蛋白質的載體進行加強免疫?！?6〕〔15〕所述的用途，其中，包含淀粉樣蛋白β抗原的蛋白質是ΑΒ5毒素B亞基與淀粉樣蛋白β抗原肽的融合蛋白質。
〔17〕誘導抗A β抗體的方法，其包括施用包含〔1〕 〔8〕中任一項所述的載體或包含該載體和藥學上可接受的擔載體的組合物的步驟。〔18〕預防或治療阿爾茨海默病的方法，其包括施用〔1〕 〔8〕中任一項所述的載體或包含該載體和藥學上可接受的擔載體的組合物的步驟。〔19〕〔17〕或〔18〕所述的方法，其還包括施用包含淀粉樣蛋白β抗原的蛋白質或編碼該蛋白質的載體進行加強免疫的步驟?！?0〕〔19〕所述的方法，其中，包含淀粉樣蛋白β抗原的蛋白質是ΑΒ5毒素B亞基與淀粉樣蛋白β抗原肽之間的融合蛋白質?！?1〕一種提高針對抗原蛋白質的抗體效價的方法，包括施用編碼抗原的RNA病毒載體2次以上的步驟?！?2〕一種用于通過包括施用編碼抗原的RNA病毒載體載體2次以上的步驟的方法來提高針對該抗原蛋白質的抗體的效價的組合物，其包含所述RNA病毒載體和藥學上可接受的擔載體?！?3〕編碼抗原蛋白質的RNA病毒載體在制造用于通過包括施用該載體2次以上的步驟的方法來提高針對該抗原的抗體效價的藥物的中的用途?！?4〕包含〔1〕 〔8〕中任一項所述的載體的病毒樣粒子。而且，將在上述各項中的引用同一項的各項所述的發(fā)明2個或2個以上任意組合而得到的發(fā)明，在它們所引用的上位項所述的發(fā)明中已經意圖。此外，本說明書中記載的任意發(fā)明要素、技術要素及其任意組合，均是本說明書所意圖的。此外，在這些發(fā)明中，除本說明書所述的任意要素或其任意組合以外的發(fā)明，也是本說明書所意圖的。此外，對本說明書而言，在說明書中以優(yōu)選的形式記載了某特定實施方式的情況下，不僅公開了其本身，還公開了本說明書中公開的包含該實施方式的更上位的發(fā)明中的除該實施方式以外的發(fā)明。發(fā)明效果實施使用本發(fā)明載體的阿爾茨海默病的疫苗療法不但能夠幫助目前還沒有有效治療方法的阿爾茨海默病型癡呆患者，還可望產生提高老年人生活品質、大幅改善護理問題、削減醫(yī)療費用等諸多社會貢獻。而且，最近利用PET (正電子CT)或者MRI (核磁共振成像裝置)進行阿爾茨海默病的早期診斷的技術開發(fā)盛行，還有的已經進入臨床研究階段。 將本發(fā)明的高效疫苗療法與早期診斷相組合來在發(fā)病初期提供根本性治療，可以期待能夠大幅減輕本人、家庭及社會的負擔。


[圖l]Ai342NotI片段結構示意圖。[圖2]Ai342NotI片段構建示意圖。[圖3]σΓΒ-Αβ42NotI片段結構示意圖。[圖4]顯示BHK21細胞的細胞裂解物和培養(yǎng)上清中Aβ 42、IL_4_A β 42、 PEDI-A β 42、CTB-A β 42 的表達量的圖。[圖5]CTB-A β 15NotI片段的構建的示意圖。[圖 6]CTB-Aβ 15x2，CTB-Aβ 15x4，CTB-Aβ 15x8NotI 片段構建圖。[圖 7]顯示攜帶 CTB-A β 42、CTB-A β 15、CTB-A β 15x2、CTB-A β 15x4、或CTB-A β 15x8基因的SeV載體感染的BHK細胞的細胞裂解物和培養(yǎng)上清中的A β抗原量的 Western印跡照片。[圖 8]顯示攜帶 CTB-A β 42、CTB-A β 15、CTB-A β 15x2、CTB-A β 15x4、或 CTB-A β 15x8基因的SeV載體感染的BHK細胞的細胞裂解物和培養(yǎng)上清中的針對GMl的結合活性的圖。[圖9]顯示肌肉內施用了攜帶CTB-Aβ 42、CTB-A β 15x8、或GFP基因的SeV載體的C57BL/6N小鼠的抗A β抗體效價的圖。[圖10]顯示肌肉內、皮內、或鼻腔內施用了攜帶CTB-Aβ 15x8基因的SeV載體的 C57BL/6N小鼠的抗A β抗體效價的圖。[圖11]顯示鼻腔內施用了攜帶CTB-Aβ15、CTB-Aβ 1切2、CTB-Aβ 1切4、或 CTB-A β 15x8基因的SeV載體的C57BL/6N小鼠的抗A β抗體效價的圖。[圖12]顯示肌肉內施用了攜帶CTB-Αβ42基因的SeV載體、并用從大腸桿菌中純化的CTB-Αβ 42蛋白進行了加強免疫的C57BL/6N小鼠的抗Αβ抗體效價的圖。[圖13]顯示肌肉內施用了攜帶CTB-Aβ 15x8基因的SeV載體、并用同一 SeV載體進行了加強免疫的C57BL/6N小鼠的抗A β抗體效價的圖。[圖14]顯示肌肉內施用了攜帶CTB-Aβ 42或CTB-A β 15x8基因的SeV載體、并用同一SeV載體進行了加強免疫的C57BL/6N小鼠的抗Aβ抗體效價的圖。小圖B中僅顯示了小圖A的攜帶CTB-Αβ 42基因的SeV載體獲得的結果。[圖15]顯示鼻腔內施用了攜帶CTB-Aβ 15x8基因的SeV載體、并用同一 SeV載體進行了加強免疫的C57BL/6N小鼠的Αβ抗體抗效價的圖。[圖16]顯示肌肉內施用了攜帶CTB-Aβ 15x8, CTB-A β 42、或GFP基因的SeV載體、并用CTB-Αβ 42蛋白進行了加強免疫的Tg2576小鼠的抗Αβ抗體效價的圖。[圖17]顯示肌肉內施用了攜帶CTB-Aβ 15x8, CTB-A β 42、或GFP基因的SeV載體、并用CTB-Αβ 42蛋白進行了加強免疫的Tg2576小鼠的腦內Αβ量的圖。[圖18]顯示腦組織病理標本上的6Ε10免疫染色陽性部位的分布的照片。對于對照的kV18+GFP/AF組(A)，在嗅球、海馬、和大腦新皮質發(fā)現了散在的數量眾多的6E10染色陽性的A β沉積(棕色)，與此相對，對于SeV18+CTB-A β 15x8/ Δ F施用組(B)，A β沉積數明顯較少。[圖19]6Ε10免疫染色標本的圖像分析圖表。與對照的％V18+GFP/AF組(左欄) 相比，0 lhS/AF施用組(右欄)中，在腦的各部位中可見明顯的面積百分比減少的傾向，特別是在海馬中差異巨大。[圖20]使用蛋白質在正常小鼠中誘導抗Αβ抗體的圖。組Α(6只)肌肉注射施用5xl07CIU/200y 1/只的SeV18+GFP/AF，8周后以相同方式施用相同載體。組B (6只) 肌肉注射施用hlOtlU/^OO μ 1/只的SeV18+CTB-A β 15χ4ΚΚ/ Δ F，8周后以相同方式施用相同載體。組C(6只)在肌肉注射施用5xl(fCIU/200y 1/只的SeV18+CTB-A^ 15x4KK/AF 后，皮下施用100 μ g/100 μ 1/只的CTB-A β 15χ4ΚΚ蛋白，每兩周一次共5次。組D (6只) 在皮下施用100 μ g/100 μ 1/只的CTB-A β 15χ4ΚΚ蛋白后，皮下施用100 μ g/100 μ 1/只的 CTB-A β 15χ4ΚΚ蛋白，每兩周一次共5次。[圖21]使用蛋白質在PDGF-hAPPV717I小鼠中誘導抗Αβ抗體的圖。組A是未處理組。組B中鼻腔內施用5xl07CIU/10y 1/只的SeV18+CTB-A3 15x4KK/AF。8周后以相同方式施用同一載體。組C中鼻腔內施用5xl07CIU/10y 1/只的SeV18+CTB-A3 15x4KK/AF 后，每兩周一次共7次鼻腔內施用100μ g/15x2y 1/只的CTB-A β 15χ4ΚΚ蛋白(由大腸桿菌生產)。在組D中，在鼻腔內施用100μβ/15Χ2μ 1/只的CTB-Αβ 15χ4ΚΚ蛋白后，每兩周一次共7次鼻腔內施用100μ g/15x2l·! 1/只的CTB-Aβ 15χ4ΚΚ蛋白。[圖22]通過組合使用SeV與蛋白質在Tg2576小鼠中誘導抗Αβ抗體的圖。組A 是未處理組。在組B中，鼻腔內施用hl(fCIU/200 μ 1/只的&V18+GFP/ Δ F，12周后以相同方式施用相同載體。在組C中，鼻腔內施用5xl07CIU/10y 1/只的SeV18+CTB-A^ 15x4KK/ AF，然后每一周一次共4次、然后每兩周一次共5次皮下施用100yg/100y 1/只的 CTB-Aβ 15χ4ΚΚ 蛋白。[圖23]通過組合使用SeV與蛋白質導致Tg2576小鼠中的腦內老年斑的減少的圖。組A是未處理組。組B中鼻腔內施用hl(fCIU/200 μ 1/只的SeV18+GFP/ AF，12周后以相同方式施用相同載體。在組C中，鼻腔內施用5X107CIU/10y 1/只的 SeV18+CTB-A^ 15χ4ΚΚ/Δ F，然后每一周一次共4次、然后每兩周一次共5次皮下施用 100μ g/ΙΟΟμ 1/ 只的 CTB-Aβ 15χ4ΚΚ 蛋白。[圖24]通過組合使用SeV與蛋白質導致Tg2576小鼠中的腦內Αβ(不溶性 Aβ 42)量的減少。組A是未處理組。組B中鼻腔內施用hl(fCIU/200y 1/只的&V18+GFP/ AF，12周后以相同方式施用相同載體。組C中在鼻腔內施用5X107CIU/10y 1/只的 SeV18+CTB-A^ 15χ4ΚΚ/Δ F，然后每一周一次共4次、然后每兩周一次共5次皮下施用 100μ g/ΙΟΟμ 1/ 只的 CTB-Aβ 15χ4ΚΚ 蛋白。[圖25]利用各種載體在PDGF_hAPPV717I小鼠中誘導抗Αβ抗體的圖。組A中， 在肌肉內施用^101°粒子/200 μ 1/只的AAV-GFP后第8周時以相同方式施用相同載體。 在組B中，肌肉內施用^cIOki粒子Λ00 μ 1/只的AAV-CTBA β 42，8周后以相同方式施用相同載體。在組C中，肌肉內施用hl(fCIU/200 μ 1/只的&V18+GFP/ Δ F，8周后以相同方式施用相同載體。在組D中，在肌肉內施用^cl(fCIU/200l·! 1/只的％V18+(CTB-Ai3 42)/ AF，8周后以相同方式施用相同載體。在組E中，肌肉內施用hl(fCIU/200 μ 1/只的 SeV18+CTB-A^ 15x4KK/AF,8周后以相同方式施用相同載體。在組F中，鼻腔內施用
1/只的SeV18+CTB-A3 15χ4ΚΚ/Δ F，8周后以相同方式施用相同載體。[圖26]利用非感染性粒子(VLP)在正常小鼠中誘導抗Αβ抗體的圖。在組Α(6 只)中，肌肉內施用&1(Λπυ/200μ 1/只的SeV18+GFP/AF后，每一周一次共4次、然后每兩周一次以相同方式施用相同載體。組B(6只)是在肌肉注射施用150yg/200yl/只的作為非感染性粒子的SeV18+(NP-Ai3 15x8) / Δ F-VLP后，每一周一次共4次、然后每兩周一次以相同方式施用相同載體。發(fā)明的
具體實施例方式本發(fā)明涉及編碼ΑΒ5毒素B亞基(ΑΒ5Β)與淀粉樣蛋白β (Αβ )來源的抗原肽之間的融合蛋白質的RNA病毒載體、包含該載體的抗Αβ抗體誘導劑、用于阿爾茨海默病預防或治療的組合物、使用該載體抗誘導Αβ抗體的方法和預防或治療阿爾茨海默病的方法等。 本發(fā)明人發(fā)現，通過將編碼ΑΒ5Β與Αβ的融合蛋白質的核酸與RNA病毒載體組合使用，能夠顯著地提高針對阿爾茨海默病的接種效果。即，通過使用編碼ΑΒ5Β與Αβ肽的融合蛋白
9質的RNA病毒載體，能夠大大提高抗A β抗體的產生。這樣使得對阿爾茨海默病的有效預防和/或治療成為可能。本發(fā)明中，病毒載體是指具有來源于病毒的基因組核酸，用于表達插入該基因組核酸中的基因的載體(運載體)。此外，本發(fā)明的病毒載體還包括感染性病毒粒子、病毒核心、病毒基因組與蛋白質的復合體、以及非感染性病毒粒子(非感染性病毒粒子或病毒樣粒子)等復合體，這些復合體具有在導入細胞中后表達其插入的基因的能力。例如，在RNA 病毒中，由病毒基因組及與之結合的病毒蛋白質構成的核糖核蛋白(病毒核心)能夠在被導入細胞中后在細胞內表達插入基因(W000/70055)。本發(fā)明的病毒載體也包括這樣的核糖核蛋白(RNP)。載體對細胞的導入可以使用適當的轉染試劑等來進行。導入的RNP能夠按照與本來的病毒相同的機制表達基因組RNA中插入的基因。本發(fā)明中，RNA病毒是指具有RNA基因組、且在其生命周期中不具有DNA階段的病毒。本發(fā)明的RNA病毒不具有逆轉錄酶(即，RNA病毒不包括逆轉錄病毒)。S卩，病毒的增殖通過病毒基因組的RNA依賴性RNA聚合酶復制來實現，而不通過DNA介導。RNA病毒包括單鏈RNA病毒(包含正鏈RNA病毒和負鏈RNA病毒)和雙鏈RNA病毒。此外，包括具有包膜的病毒(有包膜病毒；enveloped viruses)和不具有包膜的病毒(無包膜病毒； non-enveloped viruses)，優(yōu)選使用源自有包膜病毒的載體。本發(fā)明中，RNA病毒具體包括屬于以下的科的病毒。包括拉沙病毒等的沙粒病毒科(Arenaviridae)包括流感病毒等的正粘病毒科(Orthomyxoviridae ；包括甲型、乙型、丙型流感病毒和索戈托樣病毒等)包括SARS病毒等的冠狀病毒科(Coronaviridae)包括風疹病毒等的披膜病毒科(Togaviridae)包括腮腺炎病毒、麻疹病毒、仙臺病毒、RS病毒等的副粘病毒科 (Paramyxoviridae)包括小核糖核酸病毒、柯薩奇病毒、艾可病毒等的微小核糖核酸病毒科 (Picornaviridae)包括馬爾堡病毒、埃博拉出血熱病毒等的纖維病毒科(Filoviridae)包括黃熱病病毒、登革熱病毒、丙型肝炎病毒、庚型肝炎病毒等的黃病毒科 (Flaviviridae)布尼亞病毒科(Bunyaviridae ；包括布尼亞病毒屬、漢坦病毒屬、內羅病毒屬和白蛉病毒屬等)包括狂犬病病毒等的彈狀病毒科(lihabdoviridae)呼腸孤病毒科(Reoviridae)。本發(fā)明優(yōu)選的RNA病毒載體包括例如負鏈RNA病毒載體。負鏈RNA病毒載體是指來源于包含負鏈(編碼病毒蛋白質的反義鏈)的RNA作為基因組的病毒的病毒載體。負鏈 RNA也稱作陰性鏈RNA。本發(fā)明的負鏈RNA病毒具體包括單鏈負鏈RNA病毒(也稱非分節(jié)型(non-segmented)負鏈RNA病毒)。“單鏈陰性鏈RNA病毒”是指具有單鏈陰性鏈[即負鏈]RNA作為基因組的病毒。作為這樣的病毒，包括屬于副粘病毒科(Paramyxoviridae ；包括副粘病毒屬、麻疹病毒屬、腮腺炎病毒屬和肺病毒屬等)、彈狀病毒科(Miabdoviridae ；
10包括水皰病毒屬、狂犬病毒屬和短暫熱病毒屬等)、纖絲病毒科(Filoviridae)等科的病毒，其在分類學上屬于單分子負鏈RNA病毒目(Mononegavirales) (Virus第57卷第1期 pp29-36>2007 ；Annu.Rev.Genet. 32,123-162,1998 ；Fields virology fourth edition, Philadelphia, Lippincott-Raven,1305-1340,2001 ；Microbiol. Immunol. 43,613-624, 1999 ；Field Virology, Third edition pp.1205-1241,1996)。本發(fā)明中，作為負鏈RNA病毒載體，特別可以列舉出副粘病毒載體。副粘病毒載體是來源于屬于副粘病毒科(Paramyxoviridae)的病毒的病毒載體。這樣的病毒可以列舉出例如屬于副粘病毒科(Paramyxoviridae)病毒的仙臺病毒(Sendai virus)。這樣的病毒還包括例如新城疫病毒(Newcastle disease virus)、腮腺炎病毒(Mumps virus)、麻疹病 # (Measles virus) > Uf(RS) ^ (Respiratory syncytial virus) ^41 ^ (rinderpest virus)、瘟熱病毒(distemper virus)、猴副流感病毒(SV5)、人副流感病毒1， 2，3型、屬于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的流感病毒(Influenza virus)、和屬于彈狀病毒科(Rhabdoviridae)的水皰性口腔炎病毒(Vesicular stomatitis virus)及狂犬病病毒(Rabies virus)等?？稍诒景l(fā)明中使用的病毒還包括例如仙臺病毒、人副流感病毒-1 (HPIV-I)、人副流感病毒-3 (HPIV-3)、海豹瘟熱病毒(PDV)、犬瘟熱病毒(⑶V)、海豚麻疹病毒(DMV)、小反芻動物瘟疫病毒(PDPR)、麻疹病毒(MV)、牛瘟病毒(RPV)、亨德拉病毒 (Hendra)、尼帕病毒(Nipah)、人副流感病毒_2(HPIV_2)、猴副流感病毒5 (SV5)、人副流感病毒-4a(HPIV-4a)、人副流感病毒_4b (HPIV_4b)、腮腺炎病毒(Mumps)和新城疫病毒(NDV) 等。更優(yōu)選地，本發(fā)明的病毒包括選自仙臺病毒(SeV)、人副流感病毒-I(HPIV-I)、人副流感病毒-3(HPIV-3)、海豹瘟熱病毒(PDV)、犬瘟熱病毒(CDV)、海豚麻疹病毒(DMV)、小反芻動物瘟疫病毒(PDPR)、麻疹病毒(MV)、牛瘟病毒(RPV)、亨德拉病毒(Hendra)和尼帕病毒 (Nipah)中的病毒。本發(fā)明中使用的載體包括屬于副粘病毒亞科(包括呼吸道病毒屬、腮腺炎病毒屬和麻疹病毒屬)的病毒或其衍生物，例如屬于呼吸道病毒屬(genus Respirovirus)(也稱副粘病毒屬(genus paramyxovirus))的病毒或其衍生物。衍生物包括被遺傳修飾或化學修飾的病毒，但這些修飾不損害病毒的基因轉移能力。作為可適用于本發(fā)明的呼吸道病毒屬病毒，包括例如人副流感病毒1型(HPIV-I)、人副流感病毒3型(HPIV-3)、牛副流感病毒3型(BPIV-3)、仙臺病毒(仙臺病毒；也稱小鼠副流感病毒1型)和猴副流感病毒10型 (SPIV-IO)等。本發(fā)明的病毒載體可以來源于天然株、野生型株、突變株、實驗室傳代株和人工構建株等。此外，本發(fā)明的病毒載體可以具有傳染性，也可以不具有傳染性。這里，傳染性是指當病毒載體感染宿主細胞時，在該細胞中復制病毒、產生感染性病毒粒子的能力。病毒載體可以是具有與從自然界分離的病毒相同的結構的病毒載體，也可以是通過基因重組進行人工修飾而得到的病毒載體。例如，這樣的病毒載體可以是野生型病毒所具有的任何基因中存在突變、缺損的病毒。此外，還可以使用不完全病毒如DI粒子(J. Virol. 68 :8413-8417， 1994)等。例如，優(yōu)選使用編碼病毒的包膜蛋白質或外殼蛋白質的基因中的至少1個中具有突變或缺損的病毒。這樣的病毒載體能夠復制其基因組，例如在感染細胞中，但不能形成感染性病毒粒子。這樣的復制能力缺損型病毒載體沒有將感染擴散的風險，因而安全性高。例如，可以使用缺失編碼包膜蛋白質(如F、H、HN、G、M、或Ml等)或突刺蛋白質的基因中的至少1個，或2個以上、3個以上或者4個以上的任意組合的負鏈RNA病毒載體(W000/70055 和 W000/70070 ；Li, H. -0.等，J. Virol. 74 (14) 6564-6569 (2000)) 如果基因組 RNA 編碼基因組復制所必需的蛋白質(例如N、P、和L蛋白質)，則基因組能夠在感染細胞中擴增。為了制造缺損型病毒，例如可以將病毒基因組中的某些基因缺損，并外源性地對病毒產生細胞供給缺損的基因產物或能夠補償該基因產物的蛋白質(W000/70055和W000/70070 ；Li, H. -0.等，J.Virol. 74 (14) 6564-6569 (2000))。此外，不需完全補償缺損的病毒蛋白質、而以非感染性病毒粒子(VLP)的形式回收病毒載體的方法也是已知的(W000/70070)。此外， 通過以RNP(例如由N、L、P蛋白質和基因組RNA構成的RNP)的形式回收病毒載體，能夠制造載體而無需補償包膜蛋白質。此外，在制作包膜病毒來源的病毒載體的情況下，可以制作包膜中包含與病毒原有的包膜蛋白質不同的蛋白質的病毒載體。例如，通過在制造病毒時使病毒產生細胞表達希望的外源性包膜蛋白質，能夠制造出含該外源性包膜蛋白質的病毒。對于這樣的蛋白質沒有特殊限制，可以使用對哺乳動物細胞賦予感染能力的希望的粘附因子、配體、受體等蛋白質。具體地，可以列舉出例如水皰性口腔炎病毒(Vesicular stomatitis virus ；VSV) 的G蛋白(VSV-G)。VSV-G蛋白可以來源于任意的VSV株，例如可以使用^idiana血清型株 (J. Virology 39 :519-528(1981))來源的 VSV-G 蛋白，但不限于此。本發(fā)明的病毒載體以與AB5毒素B亞基的融合蛋白質的形式編碼Αβ抗原肽。這里，Αβ抗原肽是指來源于Αβ的抗原肽。該肽包含Αβ或其具有抗原性的片段。本發(fā)明的Αβ抗原肽包括但不限于天然的Aβ、其抗原性片段(具有6、7、8、9、10、11、12、13、14或 15個氨基酸以上的片段)、在它們之上添加其它氨基酸序列或將它們任意連接組合而得到的合成肽等，但不限于此(Harlow, Antibodies :A laboratory Manual, 1998 ；第 5 章第 76 頁)。Αβ抗原肽優(yōu)選是具有1個以上的Aβ的B細胞表位的肽。對于Aβ的來源沒有特殊限制，優(yōu)選使用人A β (Αβ40、Αβ42、Αβ43等)來源的A β肽(舉例而言，A β 43的序列如 SEQ ID N0:69所示)。更具體地，Aβ 肽包括Aβ 1_39、Αβ 1_40、Αβ 1_41、Αβ 1_42、Αβ 1-43、 Αβ 17-40,A β 17-42,A β 1-5,Αβ 1_6、Αβ 1-7,Αβ 1-8,Αβ 1_9、Αβ 1-10,Αβ 1_11、Αβ 1-12, Αβ 1-13, Αβ 1-14、A β 1-15, A β 1-16, Αβ 1-17, Αβ 1-18, A β 1-19, A β 卜20、Αβ 卜21、 A β 1-33、A β 3-7、A β 4_10，以及它們中的一種或多種的一個或多個拷貝任意組合如串聯起來而得到的肽(各編號表示從Αβ的N末端起算的位置)(日本專利申請?zhí)亻_2005-21149)。 此外，有報導稱，公知具有抑制淀粉樣蛋白纖維形成和保護神經元的能力的抗Αβ單克隆抗體10D5和6C6識別相當于A β 42的3位 6位的氨基酸的4氨基酸表位(EFRH) (Frenkel, D.等，J. Neuroimmunol. 88 :85-90,1998 ；Frenkel, D.等，J. Neuroimmunol. 95 :136-142, 1999)。識別相同表位的單克隆抗體508F也抑制Αβ引起的神經毒性(Frenkel，D.等， J. Neuroimmunol. 106 :23_31，2000)。因此，可以適宜使用包含該序列(EFRH)的、具有A β序列中的6 8氨基酸以上的多肽。細胞免疫的相應表位集中于Aβ的C末端區(qū)域。因此，通過表達包含N末端片段(如Αβ 1-21等)、但不包含Αβ的C末端附近的序列(如Αβ 22-43 等)的片段，能夠使體液免疫相對于細胞免疫處于優(yōu)勢地位。特別優(yōu)選的Αβ肽包括這樣的肽，其包含1個或多個拷貝的天然Αβ的相對于 N末端的1 3位起到10 20位止的片段(Αβ 1-10 Αβ 1-20, Aβ 2-10 Αβ 2-20或Αβ3-10 Αβ3-20)。具體地，可以列舉出包含1個或多個拷貝的Αβ 1-10, Αβ 1-11、 Αβ 1-12, A β 1-13、A β 卜 14、A β 1-15, Αβ 1-16, Αβ 1-17, A β 1-18, A β 1-19, Αβ 卜20、 A β 2-10、A β 2-11、A β 2-12、A β 2-13、A β 2-14、A β 2-15、A β 2-16、A β 2-17、A β 2-18、 Αβ 2-19、Αβ 2-20、Αβ 3-10, Αβ 3-11, Αβ 3-12, Αβ 3-13, Αβ 3-14, Αβ 3-15, Αβ 3-16, A β 3-17、Α β 3-18、Α β 3-19或A β 3-20的序列的肽。由于A β 42的B細胞表位大部分集中在相對于N末端的1 15位的氨基酸的區(qū)域(Cribbs，D. H.等，Int. Immunol. 15(4) =505-14, 2003)，因此，舉例而言，可以適宜地使用包含Αβ 1-15(SEQ ID NO :1的1 15)或其片段的多肽作為A β肽。對片段的長度沒有特殊限制，只要該片段包含這樣的表位即可。長度可以是例如6、7、8、9、10或更長。例如，包含A β 3-6 (EFRH)的片段是合適的。更優(yōu)選地， 可以使用包含1個或多個Αβ 1-15或其片段的肽，例如可以使用包含1 12個拷貝、優(yōu)選 2 10個、更優(yōu)選2 8個、3 8個、4 8個拷貝的肽。多個拷貝的Αβ 1_15或其片段優(yōu)選通過接頭串聯起來。對于接頭的序列沒有特殊限制，可以是例如1 15個氨基酸、優(yōu)選 1 8個氨基酸、例如1 6個氨基酸的序列。具體地，接頭可以列舉出例如Κ(賴氨酸)、 KK或KKK、GP (甘氨酸-脯氨酸)、GPGP, GGS (甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸)、GGGS, GGGGS、它們的重復、或者它們的各種組合等，但不限于此。本發(fā)明中，ΑΒ5毒素是指一種許多病原性細菌共有的毒素，該毒素由1個拷貝的A 亞基和 5 個拷貝的 B 亞基組成(Merritt E, and Hol W (1995) “ AB5toxins〃 , Curr Opin Struct Biol 5(2) :165-71 ；Lencer W, and Saslowsky D (2005) “ Raft trafficking of AB5 subunit bacterial toxins" ， Biochim Biophys Acta 1746(3) :314_21)。 AB5 毒素包括例如空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)的腸毒素(enterotoxin)、霍亂毒素(霍亂弧菌)、不耐熱腸毒素(heat-labile enterotoxins)(例如LT和LT-II)(大腸桿菌)、百日咳毒素(pertussis toxin)(百日咳博德特氏菌)、志賀毒素(shiga toxin)(痢疾志賀氏菌)以及其它的腸道出血性細菌產生的志賀樣毒素或Vero毒素(verotoxin)。一般認為，這些毒素的毒性由A亞基承擔，而B亞基形成五聚體，參與對細胞的粘附。本發(fā)明中特別優(yōu)選的AB5毒素包括霍亂毒素和大腸桿菌不耐熱腸毒素，兩者在結構上和功能上均極為類似(Hovey BT 等，J Mol Biol. ,1999,285(3) =1169-78 ；Ricci S.等，Infect Immun. 2000,68(2) :760-766 ；Tinker J. K.等，Infect Immun. 2005,73(6) 3627-3635)。作為霍亂毒素和大腸桿菌不耐熱腸毒素的具體的B亞基，可以列舉出包含登錄號 ΖΡ_01954889. 1，ZP_01976878. 1，NP_231099. 1，P13811. 1，ABV01319. 1，P32890 以及 SEQ ID NO :14、或者它們的成熟型蛋白質(除去N末端的21個氨基酸的；例如22 IM 位氨基酸)的蛋白質等。作為編碼這樣的蛋白質的核苷酸序列，可以列舉出包含核苷酸序列 NZ_AAWE01000267. 1、NC_002505. UM17874. UEU113246. 1 和 M17873. 1，或者它們的成熟型蛋白質的序列(例如除去最5'端的63個核苷酸而得到的)的序列等。作為本發(fā)明優(yōu)選的AB5毒素B亞基，可以列舉出包含如上所述的氨基酸序列或由如上所述的核苷酸序列編碼的氨基酸序列者，或者與上述的氨基酸序列具有高相似性者。而且，AB5毒素B亞基不僅可以包括天然序列，還可以包括突變?？梢允褂美缣砑印⑷笔?、取代、和/或插入了 1個或少數個氨基酸(例如數個、3個以內、5個以內、10個以內、15個以內、或20個以內的氨基酸)而得到的氨基酸序列的B亞基，只要與使用天然型的 B亞基的情況相比，不會顯著地降低融合蛋白質的表達量、抗Αβ抗體的誘導能力和/或阿爾茨海默病的至少一種癥狀的緩解效果。此外，也可以使用N末端和/或C末端具有1個 數個殘基(例如2、3、4、5、6、10、15或20個殘基)的氨基酸缺失或添加而得到的多肽、以及具有1個 數個殘基(例如2、3、4、5、6、10、15或20個殘基)的氨基酸取代而得到的多肽等。作為可以使用的變體，包括例如天然的蛋白質的片段、類似物、衍生物以及天然蛋白質與其它多肽(例如含有額外的異源信號肽或抗體片段的多肽)的融合蛋白質。具體地，包含在野生型B亞基的氨基酸序列中取代、缺失、以及/或添加1個或多個氨基酸而得到的序列，且與A β抗原肽單獨表達的情況相比，具有與野生型B亞基相當的或較之更強的提高與 Αβ抗原肽的融合蛋白質的表達水平、誘導抗Αβ抗體的和/或緩解阿爾茨海默病的至少一種癥狀的活性的多肽，可以作為本發(fā)明的ΑΒ5毒素B亞基使用。這樣的修飾型ΑΒ5毒素B 亞基的優(yōu)選保持形成五聚體的活性。在使用野生型蛋白質的片段的情況下，通常包含野生型多肽(分泌蛋白質的情況下為成熟型的形式)的70%以上、優(yōu)選80%以上、更優(yōu)選90% 以上(或95%以上)的連續(xù)區(qū)域。氨基酸序列的變體例如可以通過在編碼天然多肽的DNA中導入突變來制備 (Walker and Gaastra, eds.Techniques in Molecular Biology(MacMillan Publishing Company, New York,1983) ；Kunke1, Proc. Natl. Acad. Sci. USA82 :488-492,1985 ；Kunkel 等，Methods Enzymo1. 154 :367-382,1987 ；Sambrook等,MoIecuIar Cloning :A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N. Y. ),1989 ；U. S. Pat. No. 4，873，192)。關于如何進行氨基酸取代而不影響生物學活性的指導，可以列舉出 Dayhoff 等(Dayhoff 等，in Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl. Biomed. Res. Found.，Washington, D. C.)，1978)。作為 AB5B,包括例如大腸桿菌腸毒素 LT 的 R192G 突變體(Lemere 等，Neurobiol. Aging 2002,23 :991-1000 ；Seabrook 等，Neurobiol. Aging， 2004,25 :1141-1151 Jeabrook 等，Vaccine, 2004, 22 :4075-7083)。對于進行修飾的氨基酸的數目沒有特殊限制，例如是天然多肽的成熟型的全部氨基酸的30%以內、優(yōu)選25%以內、更優(yōu)選20%以內、更優(yōu)選15%以內、更優(yōu)選10%以內、 5%以內、3%以內或以內，例如15個氨基酸以內、優(yōu)選10個氨基酸以內、更優(yōu)選8個氨基酸以內、更優(yōu)選5個氨基酸以內、更優(yōu)選3個氨基酸以內。在對氨基酸氨基酸進行取代時，通過取代成側鏈性質相似的氨基酸可以期待保持蛋白質的原活性。這樣的取代在本發(fā)明中稱作保守取代。保守取代包括例如下列各組內的氨基酸之間的取代例如堿基性氨基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電極性氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性氨基酸 (例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β支鏈氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)以及芳香族氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)等。此外，保守性取代還可以包括例如，BL0SUM62取代矩陣(S. HenikofT and J. G. Henikoff, Proc. Acad. Natl. Sci. USA 89 :10915-10919，1992)中給出正值(例如+1 以上、+2以上、+3以上或+4以上)的氨基酸之間的取代。經修飾的蛋白質與野生型蛋白質的氨基酸序列之間顯示高同源性。高同源性的氨基酸序列包括具有例如70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、93%以上、95%以上或96%以上的同一性的氨基酸序列。氨基酸序列的同一性可以使用例如 BLASTP 程序(Altschul, S. F.等，J. Mol. Biol. 215 :403_410，1990)來確定。例如，可以在NCBI (National Center for Biothchnology ^formation)的BLAST 的網頁上，使用默認參數來進行檢索(Altschul S. F.等，Nature Genet. 3 :266-272,1993 ；Madden, Τ. L.等，Meth. Enzymo1. 266 :131-141,1996 ；Altschul S. F.等，Nucleic Acids Res. 25 :3389-3402,1997 ； Zhang J. Madden Τ. L. , Genome Res. 7 :649_656，1997)。例如，通過 blast2sequences 程序(Tatiana A 等，FEMS Microbiol Lett. 174 :247-250,1999)進行 2 個序列的比較，制作 2個序列的比對，可以確定序列的同一性?？瘴话村e配對待。例如，計算天然型蛋白質(分泌后的成熟型的形式)的比對區(qū)域內的整個氨基酸序列上的同一性的值。具體地，通過計算出野生型蛋白質(對分泌蛋白質而言為成熟型)的全部氨基酸數中的相同氨基酸數的比例來確定同一性。此外，AB5毒素B亞基包括與編碼野生型蛋白質的基因的編碼區(qū)域的一部分或全部在嚴格條件下雜交的核酸所編碼的、具有與野生型蛋白質相當的活性(與Αβ抗原肽的融合蛋白質的表達水平、抗Αβ抗體的誘導和/或阿爾茨海默病的至少一種癥狀的緩解) 的蛋白質。該蛋白質優(yōu)選形成五聚體。在雜交中，例如，可以從包含野生型蛋白質基因的編碼序列或其互補序列的核酸、或作為雜交對象的核酸制備探針。可以通過檢測探針是否與其他核酸雜交來進行鑒定。嚴格雜交的條件包括例如在含切33(、7(% (ff/V) SDSUOO μ g/ml 變性鮭魚精子DNA、5xDenhardt液(IxDenhardt溶液含0. 2%聚乙烯基吡咯烷酮、0. 2%牛血清白蛋白以及0.2% Ficoll)的溶液中，于50°C、優(yōu)選60°C、更優(yōu)選65°C進行雜交，然后在與雜交相同的溫度下，于&SSC中、優(yōu)選IxSSC中、更優(yōu)選0. ^cSSC中、更優(yōu)選0. IxSSC中振蕩洗滌2小時的條件。AB5毒素B亞基本來具有的信號肽(典型地是最初的21個氨基酸)可以完整地與重組蛋白質融合。或者也可以將其除去，例如在N末端添加真核細胞來源的蛋白質的信號肽，或者替換原有的信號肽(參照實施例)。具體地，可以使用免疫球蛋白kappa輕鏈、白細胞介素(IL)_2、組織纖維蛋白溶酶原激活劑(tPA)、或淀粉樣蛋白前體蛋白質(APP)等希望的分泌蛋白質的信號序列，但所述信號肽序列不限于此(參照Accession NP 958817 ；NM 201414的信號序列)。此外，融合蛋白質可以還包含標簽、接頭、和間隔序列。例如，Αβ抗原肽與ΑΒ5毒素B亞基可以直接結合，也可以通過接頭(或間隔序列)結合。對接頭/間隔序列的序列沒有特殊限制，但所述序列可以由例如1 15個氨基酸、優(yōu)選1 8個氨基酸、例如2 6個氨基酸、例如約4個氨基酸組成，具體地說，所述序列包括但不限于ΚΚ(賴氨酸-賴氨酸)、GP(甘氨酸-脯氨酸)、GPGP(甘氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸)、GGS(甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸)、6663、66663、它們的重復、或者它們的任意組合等。Αβ肽與ΑΒ5Β的融合通常使得ΑΒ5Β位于Αβ抗原肽的N末端側，亦即Αβ抗原肽位于ΑΒ5Β的C末端側。在從例如負鏈RNA病毒載體表達融合蛋白質的基因的情況下，例如，基因的表達水平可以基于添加在該基因的上游(負鏈的3'側)的轉錄起始序列的種類來調節(jié)(W0 01/18223)。表達水平可以基于外源基因插入基因組內的位置加以控制，插入位置越靠近負鏈3，末端則表達水平越高；反之越靠近5，末端則表達水平越低。這樣，編碼融合蛋白質的基因的插入位置可以適當調節(jié)，以獲得融合蛋白質的希望的表達水平，或者使得與插入的基因的附近的編碼病毒蛋白質的基因的組合最為合適。一般來說，獲得ΑΒ5Β-Αβ抗原肽融合蛋白質的高表達水平是有利的，故優(yōu)選將編碼融合蛋白質的核酸與高效轉錄起始序列相連，并將其插入負鏈基因組的3’末端附近。具體來說，將編碼融合蛋白質的基因插入3’_前導區(qū)和最靠近3’末端的病毒蛋白質ORF之間。或者，也可以將該基因插入最靠近3’-末端的病毒基因和下一個基因的ORF之間。在野生型副粘病毒中，最靠近基因組的3’末端的病毒蛋白質基因是N基因，第二靠近的基因是P基因?；蛘?，在不希望導入基因的高表達水平時，為獲得適當的效果，可以例如通過將外源基因插入載體中盡可能靠近負鏈基因組的5’ 側的位置、或者通過選擇效率低的轉錄起始序列來抑制病毒載體的基因表達水平。此外，本發(fā)明的載體還可以在插入編碼ΑΒ5Β_Αβ抗原肽融合蛋白質的基因的插入位置以外的位置上攜帶其它外源基因。對于這樣的外源基因沒有限制。外源基因例如可以是用于監(jiān)測載體的感染的標記基因，或者也可以是調節(jié)免疫系統(tǒng)的細胞因子、激素、受體、抗體、它們的片段、或其它基因。本發(fā)明的載體通過對生物體的靶標部位的直接(體內) 施用，或者通過間接(回體)施用即將載體導入患者來源的細胞或其他細胞，再將該細胞注入靶標部位，來導入基因。本發(fā)明的載體可以用作有效誘導抗Αβ抗體，治療阿爾茨海默病、或防止或抑制該疾病進行的極好手段。重組RNA病毒載體可以利用公知方法來重構。具體地，載體可以通過下述步驟來制造(a)在構成包含病毒基因組RNA的RNP的病毒蛋白質的存在下，將編碼AB5毒素B亞基與A β抗原肽的之間的融合蛋白質的RNA病毒的基因組RNA或編碼其互補鏈的RNA導入細胞或者使其在細胞中轉錄的步驟；和(b)回收生成的病毒或包含該基因組RNA的RNP的步驟。上述“構成RNP的病毒蛋白質”典型地是指與病毒基因組RNA —起形成RNP，并構成核殼的蛋白質。它們是基因組的復制和基因表達所必需的一組蛋白質，對負鏈RNA病毒而言，它們典型地是N(核殼，又稱核蛋白(NP))、P(磷)和L(大)蛋白質。其表記因病毒種類而異，但相應的各組蛋白質是本領域技術人員所公知的(Anjeanette Robert等，Virology 247 :1-6(1998))。病毒載體的產生可以使用希望的哺乳動物細胞和鳥類細胞等，具體地可以列舉出例如猴腎來源的LLC-MK2細胞(ATCC CCL-7)、CV-1細胞(例如ATCC CCL-70)、倉鼠腎來源的BHK細胞(例如ATCC CCL-10)等培養(yǎng)細胞、以及人來源細胞等。此外，在能夠用雞蛋擴增病毒的情況下，可以考慮用從上述宿主得到的病毒載體感染雞胚胎蛋來大規(guī)模地制備病毒載體。使用雞蛋制造病毒載體的方法已經建立起來(Nakanishi，et al.，ed. (1993)， “State-of-the-Art Technology Protocol in Neuroscience Research III, Molecular Neuron Physiology”，Koseisha，Osaka，pp. 153-172)。具體來說，例如，將受精卵放入孵化器中，在37-38°C的條件下，培養(yǎng)9-12天，使胚胎成長。將病毒載體接種到尿囊腔中，進一步將雞蛋培養(yǎng)數日(例如3天)使病毒載體繁殖，回收包含病毒的尿液?？捎贸Ｒ?guī)方法從尿
1 >(Tashiro, Μ. ,"Virus Experiment Protocol", Nagai, Ishihama, ed.，Medical View Co.，Ltd.，pp. 68—73 (1995))。粒子形成所必需的病毒蛋白質可以由轉錄后的病毒基因組RNA表達，也可以從基因組RNA以外的來源反式供給。例如，為了重構負鏈RNA病毒載體，可以通過將表達N、P和 L蛋白質的質粒導入細胞等方法來供給N、P和L蛋白質。讓轉錄出的基因組RNA在這些病毒蛋白質的存在下復制，形成功能性RNP或病毒粒子。為了在細胞內表達病毒蛋白質和RNA 基因組，將在適當的啟動子的下游連接編碼該蛋白質或基因組的DNA而得到的載體導入宿主細胞。作為啟動子，可以使用例如CMV啟動子(Foecking，Μ. K，and Hofstetter H. Gene
161986 ；45 :101-105)、逆轉錄病毒 LTR(Shinnik, Τ. Μ.，Lerner, R. Α. & Sutcliffe (1981) Nature，293，543-548)、EFl-α 啟動子、CAG 啟動子(Niwa, H. et al. (1991) Gene. 108 193-199、特開平 3-168087)等。在制造缺損包膜蛋白質等的基因的缺損型病毒的情況下，可以通過在病毒產生細胞中表達所缺損的蛋白質和/或其它能夠補償其功能的病毒蛋白質等，來補償所產生的病毒的感染性(W000/70055、W000/70070、和 W003/025570 ；Li, H. -0.等， J. Virol. 74 (14) 6564-6569 (2000))。例如，也可以使用與病毒載體的基因組來源病毒不同的來源的病毒的包膜蛋白質來將病毒進行假型化。作為這樣的包膜蛋白質，可以使用例如水泡性口腔炎病毒(Vesicular stomatitis virus ；VSV)的 G 蛋白質(VSV-G) (J. Virology 39 :519-528,1981) (Hirata，Τ.等，J. Virol. Methods, 104 :125-133,2002 ；Inoue, Μ.等， J. Virol. 77 :6419-6429, 2003 ；Inoue Μ.等，J Gene Med. 6 :1069-1081，2004)。對于負鏈 RNA病毒載體而言，要從基因組中缺損的基因包括例如F、HN、H、G等刺突蛋白質基因、M等包膜襯里蛋白質基因、或它們的任意組合。刺突蛋白質基因的缺失可有效使得負鏈RNA病毒載體成為非傳染性，M蛋白等包膜襯里蛋白質基因的缺失則可有效地使感染細胞不能形成粒子。例如，優(yōu)選使用F基因缺陷型負鏈RNA病毒載體(Li，H.-0.等，J.Virol. 74, 6564-6569(2000)), M 基因缺陷型負鏈 RNA 病毒載體 Gnoue，Μ.等，J. Virol. 77， 6419-6429(2003))等。此外，缺損F、HN(或H)以及M中的至少2個基因的任意組合的載體的安全性更能得到保障。例如，M和F基因雙缺失型的載體沒有傳染性且病毒粒子形成缺陷，同時保持高水平的感染性及基因表達能力。例如，作為F基因缺失型重組病毒的制造的一個例子，將表達F基因缺損的負鏈 RNA病毒基因組或其互補鏈的質粒與表達F蛋白質的表達載體、以及N、P、和L蛋白質的表達載體一起轉染到宿主細胞中?；蛘撸褂肍基因已經整合入其染色體的宿主細胞，能夠更有效率地制造病毒(W000/70070)。這種情況下，優(yōu)選使用Cre/loxP、FLP/FRT等序列特異性重組酶及其靶標序列，以使得F基因能夠被誘導表達(參照W000/70055和W000/70070 ； Hasan, Μ. K.等，1997，J. General Virology 78:2813-2820)。具體地，例如，將包膜蛋白質基因整合到具有重組酶靶標序列的載體，如Cre/loxP誘導型表達質粒pCALNdlw(Arai， Τ.等，J. Virology 72，1998，plll5_1121)中。通過例如以 MOI 3 5 感染腺病毒 AxCANCre 來誘導表達(Saito 等，Nucl. Acids Res. 23 :3816-3821 (1995) ；Arai, T.等，J.Virol 72， 1115-1121(1998))。此外，對于本發(fā)明的載體而言，載體中包含的任意病毒基因均可以在野生型基因的基礎上進行改變，例如為了降低病毒蛋白質的免疫原性、或者為了提高RNA的轉錄效率或復制效率。具體地，例如，可以通過對復制因子基因N、P和L中的至少一個進行修飾，來提高負鏈RNA病毒載體的轉錄或復制的功能。此外，作為包膜蛋白質之一的HN蛋白質具有血凝素(hemagglutinin)活性與神經氨酸酶(neuraminidase)活性。例如，減弱血凝素的活性能夠提高血液中的病毒的穩(wěn)定性，而通過對神經氨酸酶的活性進行修飾，則能夠調節(jié)感染能力。此外，通過對F蛋白質進行改變，能夠調節(jié)膜融合能力。此外，例如，對可以充當細胞表面抗原分子的F蛋白質或HN蛋白質的抗原呈遞表位等進行解析，而該信息可以用來制作這些蛋白質的抗原性減弱的病毒載體。而且，可以在病毒基因中導入溫度敏感性突變， 以抑制二次釋放粒子(或VLP，病毒樣粒子)的釋放(W02003/025570)。
病毒蛋白質的突變的具體實例包括P蛋白質的86位的Glu (E86)的突變、SeV P蛋白質的511位的Leu (L511)到其它氨基酸的取代、或其它負鏈RNA病毒的P蛋白的同源位點的取代。具體例子包括86位的Lys取代、511位的Phe取代等。此外，對于L蛋白， 例子包括^^ L蛋白的1197位的Asn(N1197)和/或1795位的Lys (K1795)到其它氨基酸的取代、或其它負鏈RNA病毒的L蛋白中的同源位點的取代，具體的例子包括1197位的氨基酸到kr的取代和1795位的氨基酸到Glu的取代等。P基因和L基因的突變能夠顯著地提高持續(xù)感染性、次級病毒粒子釋放的抑制、或細胞毒性的抑制的效果。例如，可以導入下列突變對M基因，可導入G69E、T116A、和A183S突變，對HN基因，可導入A262T、G264, K461G突變，但可導入的突變不限于此(具體情況參照W02003/025570)。負鏈RNA病毒的制造可以例如利用以下的公知方法來實施(W097/16539 ； W097/16538 ；W000/70055 ；W000/70070 ；W001/18223 ；W003/025570 ；W02005/071092 ； W02006/137517 ；W02007/083644 ；W02008/007581 ；Hasan, Μ. K.等，J.Gen. Virol. 78 2813-2820,1997、Kato, Α.等，1997，EMBO J. 16 :578-587 以及 Yu, D.等，1997，Genes Cells 2 :457-466 ；Durbin, Α. P.等，1997，Virology 235:323-332 ；ffhelan, S. P.等，1995， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 :8388-8392 ；Schnell. Μ. J.等，1994，EMBO J. 13 :4195-4203 ； Radecke, F.等，1995，EMBO J. 14 :5773-5784 ；Lawson, N. D.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 :4477-4481 ；Garcin, D.等，1995，EMBO J. 14 :6087-6094 ；Kato, Α.等，1996，Genes Cells 1 :569-579 ；Baron, Μ. D. and Barrett, Τ.，1997，J. Virol. 71 :1265-1271 ；Bridgen, A. and Elliott, R. Μ. ，1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 :15400-15404 ；Tokusumi, Τ. et al. Virus Res. 2002 :86 ；33-38、Li, H. -0.等，J. Virol. 2000 :74 ；6564-6569)。通過這些方法，可以從DNA重構包括副流感病毒、水皰性口腔炎病毒、狂犬病病毒、麻疹病毒、牛瘟病毒、仙臺病毒等在內的負鏈RNA病毒。作為正⑴鏈RNA病毒的制造方法，可以列舉出以下的例子。1)冠狀病毒Enjuanes L, Sola I, Alonso S, Escors D, Zuniga S.Coronavirus reverse genetics and development of vectors for gene expression.Curr Top Microbiol Immunol. 2005 ；287 :161-97.綜述.2)披膜病毒Yamanaka R,Zullo SA,Ramsey J,Onodera Μ,Tanaka R,Blaese Μ,Xanthopoulos KG.Induction of therapeutic antitumor antiangiogenesis by intratumoral injection of genetically engineered endostatin-producing Semliki Forest virus.Cancer Gene Ther.2001 Oct ；8 (10) :796-802.Datwyler DA,Eppenberger HM, Roller D,B ailey JE, Magyar JP.Efficient gene delivery into adult cardiomyocytes by recombinant Sindbis virus.J Mol Med. 1999Dec ；77(12) :859-64.3)微小核糖核酸病毒
Lee SG, Kim DY，Hyun BH, Bae YS.Novel design architecture for genetic stability of recombinant poliovirus :the manipulation of G/C contents and their distribution patterns increases the genetic stability of inserts in a poliovirus-based RPS-Vax vector system.J Virol. 2002 Feb ；76 (4) :1649-62.Mueller S, Wimmer E.Expression of foreign proteins by poliovirus polyprotein fusion analysis of genetic stability reveals rapid deletions and formation of cardioviruslike open reading frames.J Virol. 1998 Jan ；72(1) :20-31.4)黃病毒Yun Si，Kim SY，Rice CM，Lee YM.Development and application of a reverse genetics system for Japanese encephalitis virus.J Virol. 2003 Jun ；77 (11) :6450-65.Arroyo J，Guirakhoo F，Fenner S，Zhang ZX，Monath TP，Chambers TJ.Molecular basis for attenuation of neurovirulence of a yellow fever Virus/Japanese encephalitis virus chimera vaccine (ChimeriVax-JE).J Virol. 2001 Jan ；75 (2) :934-42.5)呼腸孤病毒Roner MR，Joklik WK.Reovirus reverse genetics Incorporation of the CAT gene into the reovirus genome.Proc Natl Acad Sci U S A. 2001Jul 3 ；98 (14) :8036-41. Epub 2001 Jun 26.關于其它的RNA病毒的增殖方法和重組病毒的制造方法，可以參照hperimental Virology, Detailed Discussion，2nd Edition(Ed. Students' Association of the National Institute of Health ；Maruzen，1982)。此外，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的載體的組合物。本發(fā)明的組合物包括藥物(藥物組合物)和試劑。該組合物也可以是包含導入了本發(fā)明的載體的細胞的組合物。在本發(fā)明的組合物的制造中，載體或細胞視需要可以與藥理學可接受的希望的擔載體(carrier)或介質組合。藥學上可接受的擔載體或介質包括能夠懸浮載體或細胞的希望的溶液，例如磷酸緩沖生理食鹽水(PBS)、氯化鈉溶液、Ringer’ s溶液、培養(yǎng)液等。在用雞蛋增殖載體等情況下，可以包含尿囊液。此外，本發(fā)明的組合物可以包含去離子水、5 %葡萄糖水溶液等載體或介質。而且，除此之外還可以含有植物油、懸浮劑、表面活性劑、穩(wěn)定劑、殺生物劑等。此外，可以添加防腐劑或其它添加劑。此外，本發(fā)明的組合物還可以組合生物聚合物等有機物、或羥基磷灰石等無機物作為載體，具體包括膠原基質、聚乳酸聚合物或共聚物、聚乙二醇聚合物或共聚物及其化學衍生物等。
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本發(fā)明的載體、導入了該載體的細胞以及包含它們中的任何一個的組合物，可以用于高效表達A β抗原肽的和誘導抗A β抗體(針對A β的體液免疫)，此外，可用于阿爾茨海默病的預防和/或治療?？梢詫⒈景l(fā)明的載體或本發(fā)明的組合物直接或間接地(例如經由細胞)施用于生物個體，來誘導抗A β抗體(針對A β的體液免疫)，或者治療和/或預防阿爾茨海默病。本發(fā)明涉及誘導抗Αβ抗體(針對Αβ的體液免疫)的方法，其包括直接或間接施用本發(fā)明的載體或本發(fā)明的組合物的步驟。此外，本發(fā)明涉及治療和/或預防阿爾茨海默病的方法，其包含直接或間接施用本發(fā)明的載體或本發(fā)明的組合物的步驟。此外，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的載體、導入了該載體的細胞或本發(fā)明的組合物的抗Αβ抗體誘導劑、以及包含本發(fā)明的載體、導入了該載體的細胞或本發(fā)明的組合物的針對Αβ的體液免疫誘導劑。此外，本發(fā)明提供該載體、該細胞和該組合物用于誘導抗A β抗體的用途、 和用于誘導針對Αβ的體液免疫的用途。此外，本發(fā)明提供本發(fā)明的載體、導入了該載體的細胞和本發(fā)明的組合物用于預防和/或治療阿爾茨海默病的用途。此外，本發(fā)明提供本發(fā)明的載體、導入了該載體的細胞和本發(fā)明的組合物在制造用于誘導抗Αβ抗體(針對Αβ 的體液免疫)的藥物中的用途。此外，本發(fā)明提供本發(fā)明的載體、導入了該載體的細胞和本發(fā)明的組合物在制造用于預防和/或治療阿爾茨海默病的藥物中的用途。此外，本發(fā)明涉及制造用于誘導抗A β抗體(針對A β的體液免疫)的藥物的方法，包括制造包含本發(fā)明的載體或導入了該載體的細胞、以及與之組合的藥學上可接受的擔載體或介質的組合物的步驟。此外，本發(fā)明涉及制造阿爾茨海默病的治療藥物和/或預防藥物的方法，包括制造包含本發(fā)明的載體或導入了該載體的細胞、以及與之組合的藥學上可接受的擔載體或介質的組合物的步驟。此外，本發(fā)明涉及用于預防和/或治療阿爾茨海默病的藥物，其包含本發(fā)明的載體或導入了該載體的細胞。此外，本發(fā)明涉及用于預防和/或治療阿爾茨海默病的藥物組合物，其包含本發(fā)明的組合物。此外，本發(fā)明涉及編碼ΑΒ5毒素B亞基與Aβ肽的融合蛋白質的RNA病毒的基因組RNA、或其互補鏈(反義基因組RNA)、或者編碼它們中的至少之一的DNA在制造用于抗A β抗體(針對A β的體液免疫)的誘導的藥物中的用途。此外， 本發(fā)明涉及編碼ΑΒ5毒素B亞基和A β肽的融合蛋白質的RNA病毒的基因組RNA或其互補鏈(反義基因組RNA)、或者編碼它們中的至少之一的DNA在制造用于預防和/或治療阿爾茨海默病的藥物中的用途。這里，“治療阿爾茨海默病”是指改善阿爾茨海默病的至少一種癥狀；“預防阿爾茨海默病”是指降低阿爾茨海默病的至少一種癥狀的發(fā)病率、和/或減輕已經發(fā)生的癥狀的程度。這樣的效果并不是一定產生在每個個體身上，也可以是統(tǒng)計學上顯著效果。這樣的效果包括例如，減少血中的Αβ水平、腦組織等中的Αβ蓄積、或者老年斑的數量或腦組織內老年斑面積的比例等。本發(fā)明的載體和組合物作為Aβ的蓄積抑制劑，特別是作為與未施用本發(fā)明的組合物的情況相比、抑制腦組織或血中等的Αβ蓄積的藥物是有用的。此外， 本發(fā)明的載體和組合物作為老年斑抑制劑，特別是作為與未施用本發(fā)明的組合物的情況相比、減少老年斑的數量和/或面積的合計的藥物是有用的。如上述，本發(fā)明的載體可以通過體內(in vivo)施用和細胞介導的回體(ex vivo) 施用來使用。在藉由細胞施用載體的情況下，將載體導入適當的培養(yǎng)細胞或從接種對象動物采集的細胞等中。在體外(例如試管或平皿內)將載體導入細胞的情況下，在例如培養(yǎng)液、生理食鹽水、血液、血漿、血清、體液等希望的生理性水溶液中體外(in vitro)(或回體(ex vivo))進行。此時，優(yōu)選使MOI (感染復數；平均每個細胞的感染病毒數)在1 1000 之間，更優(yōu)選2 500、更優(yōu)選3 300、更優(yōu)選5 100。所得細胞可以直接接種或以細胞破碎物(溶胞產物)的形式接種。優(yōu)選將從本發(fā)明的載體表達ΑΒ5Β-Αβ抗原肽融合蛋白質的細胞用于接種?？梢詮妮d體表達具有信號肽的融合蛋白質，并將其分泌至細胞外。此外，細胞可以通過放射線照射、紫外線照射或藥物處理等使其喪失增殖能力。導入了載體的細胞可以采用使用表面活性劑溶解細胞膜法、反復凍融法等來獲得溶胞產物。表面活性劑可以使用例如非離子型的Triton Χ-100, Nonidet Ρ-40等。更具體地，導入了載體的細胞可以通過用表面活性劑溶解細胞膜的操作、或者包含反復凍融循環(huán)的操作來制備溶胞產物。非離子型表面活性劑如iTriton Χ-100和Nonidet Ρ-40等可以在0. 1 1 %的濃度范圍使用。例如，可以通過用PBS洗滌后、通過離心回收細胞塊，重懸于TNE緩沖液[25mM Tris-HCl (pH7. 5) U50mM NaClUmM EDTAU % Nonidet P-40]中，并將懸浮液在冰上溫育 10 30分鐘來獲得。當作為抗原使用的蛋白質可溶于細胞質時，可對制備的溶胞產物進行離心(10，OOOXgUO分鐘)、以沉淀的形式除去不需要的不溶性級分，所得上清液可以用于免疫。當在不希望有表面活性劑的部位施用溶胞產物時，可以通過洗滌后將細胞重懸于 PBS,并重復進行5 6次的凍融循環(huán)來破壞細胞，來制備溶胞產物。或者，也可以從一開始就不使用表面活性劑，而是采用超聲法(sonication)來制備。溶胞產物中可以包含本發(fā)明的RNA病毒載體和/或由其基因組和病毒蛋白質構成的RNP。將細胞溶解物、包含病毒基因組RNA的RNP、或非感染性病毒粒子(病毒樣粒子(VLP))等通過轉染導入細胞、個體中的具體方法，包括例如使用磷酸鈣(Chen，C. & Okayama, H. (1988)BioTechniques 6:632-638；Chen,C.and Okayama, H. ,1987, Mol.Cell. Biol. 7 :2745)、DEAE-葡聚糖(Rosenthal，N. (1987)Methods Enzymol. 152 :704-709)、脂質體或其它各種轉染試劑(Sambrook，J. et al. (1989)Molecular Cloning :A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY))、電穿孑 L (Ausubel, F. et al. (1994)In Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons, NY), Vol. 1，Ch. 5和9)等本領域技術人員知曉的各種方法。為了抑制在內體中的分解， 可以在轉染中加入氯喹(Calos，M. P.，1983，Proc. Natl. Acad. Sci. USA80 :3015) 作為轉染試劑中的幾種，可以列舉出 DOTMA(Roche)、Superfect Transfection Ragent (QIAGEN, Cat No. 301305)、D0TAP、DOPE、DOSPER (Roche #1811169)、TransIT-LT 1 (Mirus, Product No. MIR 2300)> CalPhos Mammalian Transfection Kit(Clontech#K2051_l)、 CL0Nfectin (Clontech #8020-1)等。已知包膜病毒在形成病毒粒子時會攝入宿主細胞來源的蛋白質，這樣的蛋白質在導入細胞時可能導致抗原性和細胞毒性(J. Biol. Chem. (1997) 272，16578-16584)。因此，使用沒有包膜的RNP是有優(yōu)勢的(W000/70055)。此外，也可以通過將轉錄編碼ΑΒ5Β_Αβ抗原肽融合蛋白質的病毒基因組RNA的表達載體、與編碼該基因組RNA的復制所必需的病毒蛋白質(Ν、Ρ和L蛋白質)的表達載體導入細胞，而在細胞內直接形成病毒RNP。導入了病毒載體的細胞也可以這樣制作。本發(fā)明的載體的劑量因疾病種類、患者體重、年齡、性別和癥狀、施用目的、導入的組合物的施用形式、施用方法、導入的基因等而異，本領域技術人員可以確定合適的施用量。施用途徑可以適當選擇，包括例如經皮、鼻內、經支氣管、肌肉內、腹腔內和皮下這些途徑，但施用途徑不限于這些例子。特別地，優(yōu)選肌肉內施用、皮下施用、鼻內施用(包括利用滴鼻、噴霧、導管進行的施用等)、手掌或足背皮內施用、脾臟直接施用、腹膜內施用等。接種部位可以是一處或多處、例如2 15處。接種劑量可以根據對象動物、接種部位和接種次數等適宜調整。載體優(yōu)選以約IO5 約IOiiCIUAiL更優(yōu)選約IO7 約lOtlU/ml、最優(yōu)選約 IXlO8 約5Xl(fCIU/ml的范圍內的量與藥學上可接受的擔載體組合施用。針對人的單個劑量換算成病毒效價為IX IO4CIU 5 X IOllCIU (細胞感染單位)、且優(yōu)選2 X IOtIU 2X101(ICIU。在利用細胞進行接種(回體施用)的情況下，可以向例如人細胞、優(yōu)選自身的細胞導入載體，可以使用IO4 IO9個細胞，優(yōu)選IO5 IO8個細胞、或其溶胞產物。在給非人動物接種載體的情況下，劑量可以基于例如目的動物與人的體重比或施用靶標部位的體積比(例如平均值)從上述的劑量來換算。施用次數可以是1次或者多次、只要副作用在臨床上可接受的范圍內。每天的施用頻率也是如此。雖然單次施用也可以發(fā)揮顯著效果，但導入載體2次以上能夠獲得更強的效果。此外，可以施用其它Αβ抗原或表達該抗原的載體。在多次施用的情況下，可以適宜調整施用的間隔?？梢砸岳?周 數十個月的間隔進行接種。更具體地，可以以1 60周、2 60周、3 30周、4 20周、5 10周的間隔進行接種。此外，當進行多次接種時，例如可以將本發(fā)明的載體、希望的Αβ抗原肽或表達該肽的載體等任意組合，且可以通過例如肌肉注射、鼻內、皮內、或皮下施用等希望的接種途徑進行加強免疫。在進行多次接種的情況下，本發(fā)明的載體可以在其中的任意次接種中施用至少1次。優(yōu)選地，在初次免疫或第2次免疫中施用本發(fā)明的載體，但在第一次和第二次免疫以外的施用中也可以施用本發(fā)明的載體。此外，本發(fā)明的載體的施用可以與例如純化或粗制Αβ肽、ΑΒ5Β-Αβ抗原肽融合蛋白質、編碼它們的希望的載體、或導入了該載體的細胞或其勻漿物等的施用任意組合。特別是，優(yōu)選多次施用本發(fā)明的載體，或者將本發(fā)明的載體與ΑΒ5Β-Αβ抗原肽融合蛋白質組合施用。融合蛋白質可以作為例如導入了本發(fā)明的載體的細胞的溶胞產物來施用。例如，優(yōu)選在初次免疫中接種本發(fā)明的載體，而第2次免疫中接種本發(fā)明的載體或Αβ抗原肽(Αβ或其片段、或包含其的融合蛋白質等)。此外，也可以在初次免疫中接種 Αβ抗原肽(Αβ或其片段、或包含其的融合蛋白質等)，而在第2次免疫中接種本發(fā)明的載體。作為加強免疫中使用的Αβ抗原肽，可以使用例如利用本發(fā)明的載體產生的、使用大腸桿菌等細菌產生的、使用動物細胞產生的或者合成肽等(參照實施例)。施用對象包括具有免疫系統(tǒng)的希望的脊椎動物(人和非人脊椎動物)；優(yōu)選鳥類和哺乳動物，更優(yōu)選哺乳動物(包括人和非人哺乳動物)。具體地，所述哺乳動物包括人、 猴等非人靈長類、小鼠和大鼠等嚙齒類、以及如兔、山羊、綿羊、豬、牛、貓、和犬等其它所有的哺乳動物。這些動物在例如抗Αβ抗體的高效率生產中是有用的。此外，阿爾茨海默病模型動物在評價本發(fā)明的載體的治療效果方面也是有用的。在以阿爾茨海默病的治療和/ 或預防作為目的時，施用對象包括例如具有阿爾茨海默病的至少一種因素、阿爾茨海默病的至少一種癥狀、或高于健康個體的風險的動物或患者，或來源于它們的組織、細胞，包括例如罹患阿爾茨海默病的個體、Αβ水平增高的個體、Αβ沉積增強的個體、具有阿爾茨海默病型突變基因的個體、阿爾茨海默病模型動物、或者其來源的組織、細胞等。例如，可以適宜使用表達APP、PS-I和/或PS-2等阿爾茨海默病型突變體的動物。具體地，可以使用表達具有London型突變(V717I等)、Sweden型突變(K670N, M671L)等FAD突變的APP的轉基因動物等(Hsiao K 等，Science. 1996 ；274 :99-102 ；Irizarry M 等，JNeuropath Exper Neurol. 1997 ；56 :965-973 ；Sturchler-Pierrat C 等，Proc NatlAcad Sci USA. 1997 ； 94(24) :13287-13292 ；Proc Natl Acad Sci USA 92 :2041-2045,1995)
當施用本發(fā)明的載體時，包含A β抗原肽的融合蛋白質高水平表達，誘導針對A β 的體液免疫(抗Αβ抗體)。由此，可以期待改善阿爾茨海默病的至少一種癥狀。阿爾茨海默病的癥狀包括例如腦組織內或血中的Αβ蓄積和/或沉積、老年斑的數量或腦內占有面積的比例的增加、小膠質活性的亢進、小膠質對腦、特別是老年斑的浸潤和/或蓄積、 炎癥時被活化的物質例如補體的腦內蓄積、學習和/或記憶障礙等。特別是，通過本發(fā)明的載體的施用，可以期待血中抗Αβ抗體水平的提高、和/或腦組織中的Αβ的減少。已知抗 Αβ抗體本身對阿爾茨海默病具有治療效果，因此，血中的抗Αβ抗體的提高可以作為治療效果的指標。針對Αβ的體液免疫的誘導可以通過血漿中的抗Αβ抗體的測定來進行確認。抗體水平可以采用ELISA(酶聯免疫吸附測定)和奧脫洛尼(Ouchterlony)法來測定。ELISA 法例如可以這樣實施抗原附接在微量滴定板上，制備抗血清，將制成的抗血清進行2倍梯度稀釋(起始溶液1 1000)，將稀釋的抗血清加到平板上進行抗原抗體反應。然后，為了生色，使經免疫的動物的抗體與作為第二抗體的過氧化物酶酶標記的異種抗體反應?？梢曰诋斘舛葹樽畲笊舛鹊?/2時抗體的稀釋倍率計算出抗體效價?；蛘?，在奧脫洛尼法中，抗原和抗體在瓊脂凝膠內擴散，作為免疫沉降反應的結果，形成白色的沉降線。 沉降線可以用于測定抗體效價，即發(fā)生免疫沉降反應時抗血清的稀釋倍率。腦組織中的Αβ 水平例如可以使用腦組織的抽提物，通過Biosource ELISA試劑盒等來測定。此外，本發(fā)明涉及評估對阿爾茨海默病的預防或治療效果的方法，所述方法包括下列步驟將包含本發(fā)明的載體或導入了該載體的細胞的組合物施用于個體，并檢測該個體中的阿爾茨海默病的至少一種癥狀。施用對象包括例如具有阿爾茨海默病的至少一種因子，或表現出阿爾茨海默病的至少一種癥狀，或其風險高于健康正常個體的個體，例如罹患阿爾茨海默病的個體、阿爾茨海默病模型動物、Αβ水平增加的個體、Αβ沉積增加的個體、具有阿爾茨海默病型突變基因的個體、還有已發(fā)生阿爾茨海默病的至少一種癥狀、或者雖尚未發(fā)病但阿爾茨海默病的至少一種癥狀的發(fā)生率高于正常個體的個體。比較的對照可以是未被施用本發(fā)明的載體或組合物的個體。當施用于阿爾茨海默病發(fā)病前的個體時，可以等待未施用的對照個體出現阿爾茨海默病的至少一種癥狀后，比較施用的有無導致的效^ ο作為阿爾茨海默病的癥狀，可以測定腦內的Αβ量的提高、Αβ的蓄積和沉積、老年斑的形成、老年斑的數量、老年斑在腦組織內的面積百分比、學習和/或記憶力等。這些方法可以用于進行阿爾茨海默病的治療和預防效果的監(jiān)測。A β沉積(老年斑)的減少效果可以按照例如以下規(guī)程來測定將腦組織切片用 70%甲酸進行處理，用5%Η202使內源性的過氧化物酶失活后，使切片與抗Αβ抗體(例如 6E10(Kim KS，et al. Neurosci. Res. Comm. 7 :113,1988))反應，使用過氧化物酶標記的第二抗體進行DAB生色。染色后，可以通過顯微鏡下觀察，測定Αβ蓄積部分的面積。與未施用本發(fā)明的載體的情況相比，如果蓄積部分的面積的比例減少，則可以判斷為Αβ沉積水平減少?；蛘撸瑢τ诨铙w受試者體內的老年斑，可以在靜注施用如1-氟-2，5-雙(3-羥基羰基-4-羥基)苯乙烯基苯(FSB)等對淀粉樣蛋白有親和性的化合物后，利用MRI進行觀察 (Higuchi M 等，Nat. Neurosci. 8 (4) :527-33, 2005 ；Sato, K.等，Eur. J. Med. Chem. 39 :573， 2004 ；Klunk, W. E.等，Ann. Neurol. 55 (3) :306-19, 2004)。利用這樣的非侵入性淀粉樣蛋白影像技術，能夠確認本發(fā)明的載體的效果。此外，本發(fā)明還涉及測定針對Αβ的免疫反應的方法，其包含以下步驟將本發(fā)明的載體、導入了該載體的細胞、或包含上述中的任何一個的組合物導入具有Αβ的蓄積和/ 或沉積或者具有發(fā)生Αβ的蓄積和/或沉積的傾向性的受試者，和檢測受試者中的抗Αβ 抗體。具有發(fā)生Αβ的蓄積和/或沉積的傾向性的受試者，是指Αβ的蓄積和/或沉積的發(fā)生率在統(tǒng)計學上顯著地高于正常型個體的個體。這樣的受試者包括例如阿爾茨海默病模型動物、和具有阿爾茨海默型突變基因的個體。此外，本發(fā)明還涉及測定Αβ的蓄積和/或沉積的方法，包括以下步驟將本發(fā)明的載體、導入了該載體的細胞、或包含上述中的任何一個的組合物施用于具有Αβ蓄積和/或沉積或者具有發(fā)生Aβ蓄積和/或沉積的傾向性的受試者，和檢測受試者中的Αβ蓄積和/或沉積的水平。如果需要，與非施用個體進行比較來確定載體施用的效果。通過這些方法，能夠監(jiān)測針對Aβ的免疫應答和/或減少Αβ 蓄積/沉積的效果。此外，本發(fā)明還涉及誘導、檢測或制造抗Αβ抗體的方法，所述方法包括將本發(fā)明的載體、導入了該載體的細胞、或包含上述中的任何一個的組合物施用于個體的步驟。在進行抗Αβ抗體的檢測時，所述方法還包括檢測該動物產生的抗Αβ抗體的步驟。此外，抗 Aβ抗體的制造方法包括回收該動物產生的抗Aβ抗體的步驟。要進行施用的個體包括具有免疫系統(tǒng)的的動物，并且不限于患有阿爾茨海默病及發(fā)病率提高的動物。例如，還可以通過對經修飾而產生人源化抗體的動物(小鼠)等施用本發(fā)明的載體，來制造針對Αβ的人抗體。本發(fā)明的載體能夠強力地誘導抗Αβ抗體，因此能夠有效率地生產抗Aβ抗體。制得的抗體可以用于Αβ的檢測、分離、純化、以及作為抑制Αβ的蓄積的治療劑(被動免疫藥)。此外，本發(fā)明揭示，利用RNA病毒載體進行加強免疫能夠顯著地提高抗體效價(實施例11)。目前為止認為，多次施用RNA病毒載體難以實現導入基因的高表達。原因是這樣的施用可引起宿主的免疫應答。但是，本發(fā)明人已經查明，在利用表達抗原蛋白質的RNA病毒載體進行初次免疫后，再次接種表達抗原蛋白質的RNA病毒載體時，抗體效價明顯提高。 這提示，與基于導入基因的表達效率預測的結果相反，多次O次以上)施用編碼抗原蛋白質的RNA病毒載體對提高針對抗原的抗體效價是極其有用的。即，本發(fā)明還涉及以下發(fā)明。(1)提高針對抗原的抗體效價的方法，包括施用編碼該抗原蛋白質的RNA病毒載體2次以上的步驟。(2) (1)所述的方法，其中，抗原是與ΑΒ5毒素B亞基的融合蛋白質。(3) (2)所述的方法，其中，ΑΒ5毒素B亞基是霍亂毒素B(CTB)。(4) (1) (3)中任一項所述的方法，其中，抗原是感染性病毒或微生物的抗原、癌相關抗原、或阿爾茨海默病相關抗原。(5) (4)所述的方法，其中，抗原包含淀粉樣蛋白β抗原肽。(6) (5)所述的方法，其中，淀粉樣蛋白β抗原肽包含1個或多個拷貝的Αβ 1-15 或其片段。
(7) (5)所述的方法，其中淀粉樣蛋白β抗原肽具有1 8個拷貝的Aβ 1-15或其片段連接在一起而成的結構。(8) (5)所述的方法，其中淀粉樣蛋白β抗原肽具有4 8個拷貝的Aβ 1-15連接在一起而成的結構、。(9) (1) (7)中任一項所述的方法，其中，RNA病毒載體為負鏈RNA病毒載體。(10) (9)所述的方法，其中，負鏈RNA病毒載體為副粘病毒載體。(11) (9)所述的方法，其中，負鏈RNA病毒載體為副粘病毒載體。(12) (1) (11)中任一項所述的方法，其中，至少1次施用為肌肉內施用。(13) (1) (12)中任一項所述的方法，其中，至少1次施用為鼻內施用。(14) (1) (13)中任一項所述的方法，其用于治療疾病。(15) (14)所述的方法，其中，疾病是感染、癌癥或阿爾茨海默病。(16)—種用于通過包括施用編碼抗原蛋白質的RNA病毒載體2次以上的步驟的方法來提高針對該抗原的抗體效價的組合物，其包含所述RNA病毒載體和藥學上可接受的擔載體。(17) (16)所述的組合物，其用于在上述(1) (15)中任一項所述的方法中使用。(18) (16)或(17)所述的組合物，其用于治療感染、癌癥或阿爾茨海默病。(19)編碼抗原蛋白質的RNA病毒載體在制造用于通過包括施用該載體2次以上的步驟的方法提高針對該抗原的抗體效價的藥物中的用途。(20) (19)所述的用途，其是在制造在上述⑴ (15)中任一項所述的方法中使用的藥物中的用途。(21) (19)或00)所述的用途，其是在制造在感染、癌癥或阿爾茨海默病的治療中使用的藥物中的用途。載體的施用途徑、劑量、施用間隔等可以適宜選擇，例如如本說明書中的具體記載所述。對于抗原沒有特殊限制，可以列舉出感染性病原微生物或病毒等來源的抗原、癌癥抗原、阿爾茨海默病抗原(Αβ、其片段)等。多次施用可以是2次、3次、4次或更多次。此外， 只要至少一部分抗原是共有的，多次施用中可以施用編碼并非完全相同的抗原的載體。例如，初次免疫中施用編碼與ΑΒ5毒素B亞基融合的抗原蛋白質的載體，而在加強免疫時施用編碼未與ΑΒ5毒素B亞基融合的單獨的抗原蛋白質的載體，或者反之。此外，各次施用中使用的載體的種類是可變的，只要是RNA病毒載體即可。優(yōu)選使用副粘病毒載體、更優(yōu)選仙臺病毒載體。對施用間隔沒有特殊限制，可以在例如1周 6個月、2周 4個月、或者3周 3個月之間適宜調整。通過多次施用，抗體效價可以提高至例如1. 2倍以上、1. 3倍以上、1. 4 倍以上、1.5倍以上、1.6倍以上、1.7倍以上、1.8倍以上、1.9倍以上或2倍以上。抗體效價可以采用ELISA等公知方法進行測定。這樣，本發(fā)明的載體可以用作阿爾茨海默病的預防或治療用藥物。此外，本發(fā)明的載體也可以優(yōu)選以病毒樣粒子(VLP)的形式使用，或者也可以像通常所知的病毒粒子那樣使用。
實施例以下，通過實施例對本發(fā)明進行更具體的說明，但本發(fā)明不受這些實施例的限制。
25而且，本說明書中引用的文獻全部并入作為本說明書的一部分。[實施例1]攜帶Aβ 42基因的SeV載體的構建(1)Αβ42基因的Not I片段的構建對于A β 42基因，使用覆蓋人淀粉樣蛋白β肽序列(1-42) (SEQ ID NO 1)全長的多個引物，利用PCR進行組裝。Αβ 42的核苷酸序列在考慮人密碼子選擇的基礎上進行了最優(yōu)化。所得的序列具有如下結構在N端側結合有IgK分泌信號，在C端側添加仙臺病毒的轉錄信號(圖1，SEQ ID NO :2)。構建方法如圖2所示。首先，將覆蓋IgK信號與Αβ42的全區(qū)域的6種長引物 Fl (SEQ ID NO 4), F2 (SEQ ID NO 5), Rl(SEQ ID NO 6), R2(SEQ ID NO 7), R3(SEQ ID N0:8)，R4(SEQ ID NO 9)混合。使用該引物化合物不加入模板而進行PCR。然后，以其PCR 產物作為模板，使用導入了限制酶EcoRI的識別序列的2種引物Fl-I (SEQ ID N0:10)禾口 R4-1 (SEQ ID NO 11)再進行PCR。然后，將所得的PCR產物用限制酶EcoRI切割，亞克隆至 PCI表達質粒(Promega公司)的EcoRI位點，通過測序選擇出正確序列的克隆。以選擇出的質粒作為模板，用添加了 NotI識別序列的引物Notl-Αβ _F(SEQ ID NO 12)和添加了仙臺病毒轉錄信號和NotI識別序列的引物NotI-polyA-R(SEQ ID NO :13) 進行PCR，所得的PCR產物用限制酶NotI消化，構建了目的Ai342NotI片段(圖1，SEQ ID NO 2)。(2)攜帶A β 42基因的仙臺病毒cDNA的構建將F 基因缺失型 kV 載體(W000/70070)的 cDNA (pkV18+NotI/Δ F)用 NotI 消化，在其NotI位點插入Ai3 42NotI片段，構建了攜帶Aβ 42基因的F基因缺失型 cDNA(pSeV18+A^ 42/AF)。[實施例2]攜帶了A β 42與CTB的融合基因(CTB-A β 42)的SeV載體的構建(I)CTB-A β 42基因的NotI片段的構建CTB-A β 42的NotI片段具有下述結構將人淀粉樣蛋白β序列(1_42)的序列的 N末端側經由GPGP氨基酸接頭與包含分泌信號的霍亂毒素B亞基序列(SEQ ID NO 14)連接，并在其C末端側添加仙臺病毒的轉錄信號(圖3，SEQ ID N0:15)。而且，為了增加表達效率，按照人的密碼子用法變更了 CTB和Αβ的核苷酸序列，但氨基酸序列不變。該基因的構建通過使用覆蓋該基因全長的多個長引物進行PCR，來合成其全長。具體地，合成了 8種覆蓋CTB-A β區(qū)域的全長的長引物[CTB-A β F-I (SEQ ID NO 17)，F_2 (SEQ ID NO 18),F-3(SEQ ID NO :19)，F_4(SEQ ID NO :20)，R-I(SEQ ID NO :21)，R-2(SEQ ID NO: 22), R-3 (SEQ ID NO :23)，R-4 (SEQ ID NO :24)]，使用這8種引物的混合物進行PCR，從而得到了對應于從N端到Αβ 42的片段。為了制備含仙臺病毒轉錄信號的C端側片段，以pCI質粒(Promega 公司)為模板、用 2 種引物 CTB-A β Fl-2 (SEQ ID NO :25)和 CTB-A β R5-2 (SEQ ID NO 26)進行PCR。PCR產生了覆蓋CTB-A β全長的PCR片段。將該PCR片段通過TA克隆亞克隆至pGEM-T fesy質粒(Promega公司)中。確認堿基序列后，擴增質粒，將該質粒用限制酶NotI進行消化，構建了目的CTB-Αβ 42NotI片段(SEQ ID NO 15)。(2)攜帶CTB-A β 42基因的仙臺病毒cDNA的構建將F 基因缺失型 kV 載體(W000/70070)的 cDNA (pkV18+NotI/Δ F)用 NotI 消化， 在其NotI位點插入CTB-A β 42NotI片段，構建了攜帶CTB-A β 42基因的F基因缺失型SeVcDNA(pSeV18+CTB-Aβ 42/Δ F)。[實施例3]攜帶了Aβ 42與IL_4的融合基因的SeV載體的構建(I)A β 42與IL-4的融合基因的NotI片段的構建Αβ 42基因與小鼠IL-4的融合采用部分重疊并用PCR組裝的方法進行。Αβ42基因利用含有Ai3 42EcoRI片段(實施例1 圖2)的質粒制備。同時，小鼠 IL-4基因(SEQ ID NO ,21)是通過下列程序制備為cDNA。從小鼠(BALB/cA)的脾臟抽提 mRNA，使用IL-4特異性引物進行逆轉錄，用PCR進行擴增，并亞克隆至克隆質粒。將所得的具有小鼠IL-4cDNA作為插入序列的質粒用于構建。具體地，以小鼠IL-4質粒為模板，用2種引物NotI-IL4-F(SEQ ID NO :29)和 IL4-R(SEQ ID NO :30)進行PCR。另一方面，以Αβ 42質粒為模板，用引物Αβ 42_F(SEQ ID NO 31)和 Notl-Αβ 42-R(SEQ ID NO :32)進行 PCR，得到了 IL-4 與 A β 42 的 PCR 片段。引物IL4-R和A β 42-F被設計成一部分重疊。因而通過將IL-4與A β 42的PCR片段混合作為模板，并用引物NotI-IL4-F和引物NotI-A β 42-R進行PCR，使2個基因結合為一個融合基因。將該PCR片段亞克隆至克隆質粒中。確認核苷酸序列后，用限制酶NotI進行切割， 從而構建了目的的含有A β 42與IL-4的融合基因的NotI片段(SEQ ID NO 33)。O) A β 42基因攜帶仙臺病毒cDNA的構建將F 基因缺失型 SeV 載體(TO00/70070)的 cDNA (pSeV18+NotI/Δ F)用 NotI 消化， 在其NotI位點中插入如上述制備的mIL4-Aβ 42NotI片段，構建了攜帶Aβ 42基因的F基因缺失型 SeV cDNA (pSeV18+mIL4_A β 42/ Δ F)。[實施例4]仙臺病毒載體的重建與擴增重建的重構和擴增按照Li等的報道(Li，H. -0.等，J. Virology 74. 6564-6569 (2000) ,W000/70070)及其改進方法(W02005/07109》進行。使用的載體為F 基因缺失型，因此利用了 F蛋白輔助細胞，其中通過Cre/loxP表達誘導系統(tǒng)表達F蛋白質。 該系統(tǒng)利用了質粒 pCALNdLw(Arai，Τ.等，J. Virol. 72 1115-1121 (1988))，該質粒設計為使得基因產物的表達被Cre DNA重組酶所誘導。按照Mito等的方法(Saito，I.等，Nucl. Acid Res. 23,3816-3821 (1995), Arai, Τ.等，J. Virol. 72，1115-1121 (1998))，用表達 Cre DNA重組酶的重組腺病毒(AxCANCre)感染帶有該質粒的轉化體，來表達插入基因。采用上述方法，制備了分別攜帶CTB-mCRF、CTB-mETl、CTB-mPYY、CTB-mGLP2、mCRF、 mET 1、1^￥丫、11161^2、六3 42、0^-六3 42、或11111^4-六3 42基因的？基因缺失型56￥載體(分別為 SeV18+CTB-mCRF/ Δ F, SeV18+CTB_mETl/ Δ F, SeV18+CTB_mPYY/ Δ F, SeV18+CTB_mGLP2/ Δ F, SeV18+mCRF/AF, SeV18+mET 1/Δ F, SeV18+mPYY/Δ F, SeV18+mGLP2/Δ F, SeV18+A β 42/ Δ F, SeV18+CTB_A β 42/ Δ F, SeV18+mIL4_A β 42/ Δ F)。[實施例5]攜帶了Aβ 42與PEDI的融合基因的SeV載體的構建(1)攜帶A β 42-PEDI融合基因的SeV載體cDNA的構建通過使用10 種弓丨物PEDI-1F(SEQ ID NO :35)、PEDI_2R(SEQ ID NO :36)、 PEDI-3F(SEQ ID NO :37)、PEDI_4R(SEQ ID NO :38)、PEDI-5F(SEQ IDNO :39)、PEDI-6R(SEQ ID NO 40)、PEDI-7F(SEQ ID NO :41)、PEDI_8R(SEQID NO :42)、PEDI_9F(SEQ ID NO :43)和 PEDI-IOR(SEQ ID NO :44)進行PCR擴增了 PEDI基因。按照下述程序將PEDI基因和A β 42融合在一起并插載體。以攜帶載體作為模板、使用引物％VF6(SEQ ID NO45)和S-PEDI-C(SEQ ID NO :46)進行PCR得到片段1，以同一模板使用引物PEDI-Ab-N(SEQ ID NO 47) ^P SEVR280 (SEQ ID NO 48)進行PCR得到片段3。以PEDI基因為模板、使用引物 PEDI-N(SEQ ID NO :49) ^P PEDI-C(SEQ ID NO :50)進行 PCR 得到片段 2。使用這些片段作為模板進行重疊PCR，制備PEDI-Ai3 42NotI片段(SEQ ID NO :51)。將獲得的片段插入 pSeV18+/AF的NotI位點，制備攜帶PEDI-Αβ 42融合基因的F缺失型SeV載體的cDNA。(2)攜帶PEDI-A β 42的F缺失型SeV載體的重建如實施例4所述那樣，采用Li等的方法(Li，H. -0.等，J. Virology 74. 6564-6569(2000), W000/70070)及其改進方法(W02005/071092)重建了攜帶 PEDI-A β 42 基因的 SeV 載體(SeV18+PEDI_A β 42/Δ F)。[實施例6]CTB融合、PEDI融合、和IL_4融合對Αβ42表達的效果的比較用于 CTB-A β 42融合蛋白表達的SeV載體、用于PEDI-A β 42融合蛋白表達的SeV載體、和用于 IL-4-Αβ 42融合蛋白表達的SeV載體的表達能力的比較(1)將 ΒΗΚ21 細胞用 SeV18+A β 42/Δ F、SeV18 + IL_4_A β 42/Δ F、 SeV18+PEDI-A β 42/ Δ F、和 & V18+CTB-A β 42/Δ F 感染，以評價 A β 42 抗原的水平。將 ΒΗΚ21 細胞以IxlO6個/孔播種于膠原包被的6孔板，以使用無血清培養(yǎng)基(VPSFM)稀釋成MOI 10 的各SeV載體進行感染。1小時后向板中加入含10% FBS的GMEM，24小時后更換為無血清培養(yǎng)基(VPSFM)，48小時后回收培養(yǎng)上清液和細胞，制備了細胞裂解液。(2)利用ELISA進行定量使用人Αβ 42ELISA試劑盒(和光純藥工業(yè))定量A β 42。通過使用讀板器進行吸光度測定(O.D. 450)來評價表達量。結果如圖4所示。Aβ42表達水平可忽略，而IL-4-Aβ42、PEDI-Aβ42、CTB-Aβ42 表達水平增加。細胞內的表達水平分別是kkAi3 42的1395倍、171. 5倍、1沈08倍。[實施例7]CTB融合對A β 42表達的效果SeV載體單獨表達A β 42和SeV載體表達CTB-A β 42融合蛋白的能力的比較將匯合的前一天播種的ΒΗΚ-21細胞(以3χ105個細胞/孔播種，12-孔板)用 A β 42單獨攜帶SeV載體和CTB-A β 42攜帶SeV載體以MOI 10進行感染，然后用VP-SFM 培養(yǎng)基(lml/孔)以371、5%0)2進行培養(yǎng)，在第4天回收培養(yǎng)上清并制備細胞溶胞產物。 通過丙酮沉淀將培養(yǎng)上清濃縮10倍，用IxSDS上樣緩沖液制備了樣品。細胞溶胞產物使用150 μ 1/孔的Ix SDS上樣緩沖液進行了制備。將制備好的培養(yǎng)上清和細胞溶胞產物于 98°C處理10分鐘后，將Αβ42肽以1,0. 5,0. 25,0. 125ng/泳道作為對照，進行SDS-PAGE(使用15% Wako凝膠VWestern印跡(使用6E10抗體)，進行蛋白定量。單獨攜帶A β 42的 SeV載體的A β的表達水平在細胞溶胞產物中和上清中分別只有4. 4ng/孔和7. hl0_3ng/ 孔。另一方面，攜帶Ai342-CTB融合基因的SeV載體的Αβ表達水平在細胞溶胞產物中是 2500ng/孔、在上清中是200ng/孔。即在溶胞產物中和上清中分別大幅提高至568倍和 27778 倍。[實施例8]攜帶Aβ 15-CTB的融合基因(CTB-Αβ 15)、或A β 15的串聯重復與CTB 的融合基因(CTB-Αβ 15x2, CTB-A β 1切4、或者CTB-A β 15x8)的SeV載體的構建(I)CTB-A β 15基因的NotI片段的構建以CTB-A β 42基因為基礎構建CTB-A β 15基因的NotI片段(圖5)。
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以含有CTB-A β 42基因NotI片段的質粒作為模板，使用添加了 EcoRV限制位點的 2 種引物 Aβ 15-EcoR-R(SEQ ID NO 53)和 Αβ 15-EcoR-F(SEQ IDNO 54)進行反向 PCR。將所得的PCR產物用限制酶EcoRV進行切割。然后，使產物自連接制備含有CTB-A β 15片段的質粒。通過將該質粒用限制酶NotI進行切割，得到了感興趣的CTB-Αβ 15基因的NotI 片段(SEQ ID NO 55)。 (2) CTB-A β 15 串聯型(CTB-A β 15x2, CTB-A β 15x4、或者 CTB-A β 15x8)基因的 NotI片段的構建利用2種基因構建CTB-串聯A β 15基因的NotI片段(圖6)。方法如下除去含有CTB_Ai3 42的質粒的Αβ 42區(qū)域，并向質粒中導入限制酶位點。然后通過PCR在該位點中插入添加有限制酶位點的Αβ 15串聯的片段。具體地，以含有CTB-A β 42的NotI片段(實施例2 =SEQ ID NO 15)的質粒作為模板，使用添加有限制酶SmaI位點的2種引物CTB-SmaI-R(SEQ IDNO 57)和CTB-SmaI-F (SEQ ID NO 58)進行反向PCR，將所得的PCR產物用SmaI進行切割，然后通過自連接得到A β 42 缺失的質粒。然后，在該質粒的SmaI位點中插入A β 15串聯片段。以含有A β 15的8串聯NotI片段(SEQ ID NO 59)的質粒為基礎，通過下述方法制備Αβ 15串聯片段。以該質粒為模板，使用添加限制酶位點的2種引物Αβ 15-SmaI-F(SEQ ID NO 61)和 Αβ 15-EcoRV-R(SEQ ID NO 62)進行 PCR。得至Ij Aβ 15 的重復數不同的 PCR 產物。對這些產物進行TA克隆，確認核苷酸序列后，用2種限制酶SmaI和EcoRI進行切割， 得到平末端的Αβ 15串聯片段。將這些片段分別插入Aβ 42缺失質粒的SmaI位點。擴增得到的質粒，并用限制酶NotI進行切割，得到了目的片段CTB-Ai3 15x2NotI片段(SEQ ID NO 63)，CTB-A β 15x4NotI 片段(SEQ ID NO 65)和 CTB-A β 15x8NotI 片段(SEQ ID NO 67)。(3)攜帶 CTB-A β 15,CTB-A β 15x2,CTB-A β 15x4、或 CTB-Αβ 15x8 基因的仙臺病毒 cDNA的構建將F 基因缺失型 SeV 載體(W000/70070)的 cDNA(pSeV18+NotI/ΔF)用 NotI 消化，并在其 NotI 位點分別插入 CTB-A β 15、CTB-A β 15x2、CTB-A β 15x4、CTB-A β 15x8 片段， 構建了攜帶 CTB-Αβ 15、CTB-A β 15x2、CTB-A β 15x4、CTB-A β 15x8 基因的 F 基因缺失型 SeV cDNA (pSeV18+CTB-A β 15/ Δ F、pSeV18+CTB_A β 15x2/ Δ F、pSeV18+CTB_A β 15x4/ Δ F、 和 pSeV18+CTB-Aβ 15x8/Δ F)。[實施例9]A β肽表達能力的比較(I)Western Ερ 通過Western印跡法評價了構建的載體的感染力和表達。將感染了 SeV載體的細胞的勻漿液和培養(yǎng)上清與等體積的SDS-PAGE用樣品緩沖液混合，于98°C加熱熱變性5分鐘。用15%的丙烯酰胺凝膠對混合物進行SDS-PAGE， 然后采用半干轉印法轉印到PVDF膜上。用5%牛乳/TBS-T封閉后，將膜與抗Αβ抗體 (6Ε10) 一起溫育，然后與作為第二抗體的HRP標記抗小鼠IgG進行反應，使用化學發(fā)光底物 SuperSignal West Femto通過CCD照相機進行檢測。結果顯示CTB-A β 42、CTB-A β 15,CTB-A β 15x2,CTB-A β 15x4,CTB-A β 15x8 在 BHK 細胞內表達，并被分泌到培養(yǎng)基中。還顯示CTB-Ai3 15x8的表達水平比CTB-Aβ 42的表達水平高，CTB-A β 15x8向培養(yǎng)基中的分泌的量也明顯大于CTB-A β 42 (圖7)。(2)GM1-ELISA使用固定化有神經節(jié)苷脂GMl的平板評價了 CTB對GMl的結合。將神經節(jié)苷脂GMl (5 μ g/mL)固定化于96孔板(Nunc，MaxiSorp plate)的各孔， 用20% BlockingOne (NACALAI TESQUE)封閉后，向孔中加入感染了 SeV載體的細胞的培養(yǎng)上清(20倍 2，000, 000倍稀釋)。與HRP標記的6E10抗體溫育后，使用TMB生色底物進行檢測。結合量的評價通過使用讀板器進行吸光度測定(0.D.450)來進行。結果顯示，向培養(yǎng)基中分泌的CTB-A β 42、CTB-A β 15,CTB-A β 15x2,CTB-A β 15x4、 CTB-A β 15x8 與 GMl 結合。CTB-A β 15x8 的結合量為 CTB-A β 42 的 10 倍，CTB-A β 15 的結合量為CTB-A β 15x8的100倍。這提示隨著A β 15的重復數目增力卩，對GMl的結合能力降低(圖8)。[實施例10]構建的各種SeV載體在正常小鼠中誘導抗Αβ抗體的能力的評價(1)正常小鼠(肌肉內施用CTB-A β 42與CTB-A β 15x8的比較)對于C57BL/6N小鼠以5xl07CIU/只的滴度肌肉內施用(右后肢)攜帶了 CTB-A β 42基因、CTB-A β 15x8基因、GFP基因的SeV載體，以評價抗體的效價。上述處置14 天后，從小鼠采集血液，測定了血漿中的抗Αβ抗體水平。將Αβ 1-42肽(5yg/mL)固定化于 96 孔板(Nunc, MaxiSorp plate)的各孔，用 20% BlockingOne (NACALAI TESQUE)進行封閉后，向孔中加入小鼠血漿(300 300，000倍稀釋)，與過氧化物酶標記的小鼠IgG抗體一起溫育后，使用TMB生色底物進行檢測。通過使用讀板器進行吸光度測定(0.D.450)來評價抗Αβ抗體效價。使用了抗Αβ抗體作為標準抗體(6Ε10)。結果顯示，在CTB-A β 42基因施用組(η = 6)和CTB-Αβ 15x8基因施用組(η = 6) 中抗Αβ抗體效價提高，而作為對照的GFP基因施用組(η = 6)中未見抗Αβ抗體效價的提高(圖9)。CTB-A β 15x8基因施用組的抗體效價為CTB-A β 42基因施用組的12. 23倍。(2)正常小鼠(肌肉內、皮內、鼻內施用)對于C57BL/6N小鼠，以5xl06CIU/只或5xl07CIU/只的滴度通過鼻內、皮內、和肌肉內(右后肢)施用攜帶了 CTB-A β 15x8基因的SeV載體；作為對照組，以5xl07CIU/只的滴度肌肉內施用(右后肢)攜帶了 GFP基因的SeV載體，進行了抗體效價的評價。上述處置14天后，從小鼠采集血液，測定了血漿中的抗Αβ抗體水平。其結果顯示，除對照組外，全部的施用組中Αβ抗體效價均提高。皮內施用組與其它施用組相比，抗體效價較低，鼻內施用組與同滴度的肌肉內施用組相比，抗體效價更高 (圖 10)。(3)正常小鼠(鼻內施用)對于C57BL/6N小鼠，以5xl07CIU/只的滴度鼻內施用攜帶了 CTB-Aβ 15、 CTB-A β 15x2、CTB-A β 15x4、CTB-A β 15x8、GFP 基因(作為對照組)的 SeV 載體，進行了抗體效價的評價。結果顯示，在所有施用組中，與對照組相比，抗體效價顯著地提高。與CTB-A β 15x8 施用組相比，在CTB-Αβ 15XTB-Aβ 15x4施用組中獲得了更高的抗Aβ抗體效價(圖11)。[實施例11]構建的各種SeV載體對正常小鼠的抗Αβ抗體誘導的增強效果的評價
(1)正常小鼠(肌肉注射)利用純化CTB-Αβ 42蛋白進行加強免疫 對于C57BL/6N小鼠，以各5xl07CIU/只的滴度肌肉內施用(右后肢)攜帶了 CTB-A β 42基因的SeV載體，在14天和28天后，分別以20 μ g/PBS/只、100 μ g/PBS/只、或 100 μ g/IFA (弗氏不完全佐劑)/只肌肉內施用(右后肢)大腸桿菌生產的CTB-A β 42蛋白，以評價抗體效價。上述處置后每14天一次從小鼠采集血液，測定血漿中的抗Αβ抗體水平。結果顯示，在用CTB-A β 42基因進行免疫、并用CTB-A β 42蛋白加強免疫的組中獲得了顯著的抗Αβ抗體的提高(圖12)。2次加強免疫后，Αβ抗體效價在20yg加強免疫組中為32μ g/ml、在100 μ g加強免疫組中為107μ g/ml、在100 μ g+IFA加強免疫組中為 25. 9μ g/ml。(2)正常小鼠(肌肉注射)利用SeV載體進行的加強免疫[1]對于C57BL/6N小鼠以5xl07CIU/只的滴度肌肉內施用(右后肢)攜帶了 CTB-A β 42基因和CTB-A β 15x8基因的SeV載體，56天后以相同滴度肌肉內施用(右后肢) 相同SeV載體，以評價抗體效價。在上述處置14天和28天后，從小鼠采集血液，測定了血漿中的抗A β抗體水平。結果顯示，在CTB-Αβ 15x8基因加強免疫組中得到了顯著的抗Αβ抗體效價的提高(圖13)。另一方面，在CTB-Ai3 42基因加強免疫組中，抗Αβ抗體效價的提高較上述的 CTB-A β 15x8基因加強免疫組為少。(3)正常小鼠(肌肉注射)利用SeV載體進行加強免疫[2]對于C57BL/6N小鼠以5xl06CIU/只或5xl07CIU/只的滴度肌肉內施用(右后肢) 攜帶了 CTB-A β 15x8基因或CTB-A β 42基因的SeV載體，56天后以相同滴度肌肉內施用(右后肢)相同SeV載體，進行了抗體效價的評價。在上述處置14天和28天后，從小鼠采集血液，測定血漿中的抗A β抗體水平。結果顯示，兩載體均明顯顯示了加強免疫的效果，特別是在CTB-Αβ 15x8基因加強免疫組中抗Αβ抗體效價的提高更為顯著(圖14)。(4)正常小鼠(鼻內施用)利用SeV載體進行的加強免疫 對于C57BL/6N小鼠以5xl06CIU/只和5xl07CIU/只的滴度鼻內施用攜帶了 CTB-A β 15x8基因的SeV載體，56天后以相同滴度鼻內施用相同SeV載體，以評價抗體效價。在上述處置14天和28天后，從小鼠采集血液，測定血漿中的抗A β抗體水平。結果顯示，在CTB-A β 15x8基因加強免疫組中，以3/3的比例得到了抗A β抗體效價的顯著提高(圖15Α)。(5)正常小鼠(鼻內施用)利用SeV載體進行的多次加強免疫和抗體效價的長期監(jiān)測(1年間)對于C57BL/6N小鼠以5xl06CIU/只和5xl07CIU/只的滴度鼻內施用攜帶了 CTB-A β 15x8基因的SeV載體，在84天后、168天后、和371天后以相同滴度鼻內施用相同的SeV載體，進行了抗體效價的評價。在上述處置14天和28天后、從小鼠采集血液，測定了血漿中的抗A β抗體水平。結果顯示，在CTB-A β 15x8基因加強免疫組中以3/3的比例抗A β抗體效價得到了顯著的提高?？贵w效價在試驗開始1年后仍維持20 μ g/mL以上。通過在1年后進行加強免疫也得到了顯著的Αβ抗體效價的提高(圖15Β)。[實施例12]構建的各種SeV載體進行的在APP模型小鼠中的有效性評價肌肉
注射(1)抗Αβ抗體效價對于作為阿爾茨海默病模型小鼠的APP轉基因小鼠(Tg2576) (13個月齡)， 以 5x107CIU/ 只肌肉內施用(右后肢)SeV18+CTB-A3 18x5/ΔF(也稱為 CTB-Aβ 15x8)、 或SeV18+CTB-A β 42/ Δ F (也稱為CTB-A β 42)、或作為對照的攜帶GFP基因的SeV載體 (SeV18+GFP/ Δ F ；以下也稱為“GFP”)。在14天和28天后，對于CTB-A β 42基因施用組中的一半小鼠肌肉內施用(右后肢)大腸桿菌生產的CTB-A β 42蛋白。在SeV載體施用后第 14、28、42、56天，測定了血漿中的抗A β抗體效價。結果顯示，在CTB-A β 15x8基因施用組中抗A β抗體效價顯著提高。在CTB-A β 42 基因施用組中，一半的小鼠中抗Αβ抗體效價幾乎沒有提高。且抗Αβ抗體效價的提高也比CTB-A β 15x8基因施用組少。在CTB-A β 42蛋白加強免疫組中，加強免疫未提高抗A β 抗體的效價(圖16)。(2)腦內 Αβ 量ELISASeV載體施用開始56天后，從上述APP小鼠收集腦組織，通過ELISA測定左半球腦組織中的Αβ水平。將腦組織在TBS中進行超聲波勻漿，35，OOOg離心1小時后，采集上清作為可溶性Αβ級分。將沉淀在10%甲酸中進行超聲波勻漿，然后用IM Tris進行中和。將所得的樣品保存作為不溶性Αβ級分。使用和光純藥工業(yè)的Ai3 42ELISA試劑盒和 Ai340ELISA試劑盒，測定了腦內Αβ的水平。其結果顯示，與GFP基因施用組中相比，在 CTB-Aβ 15x8基因施用組中，不溶性級分中的Aβ水平降低至80%左右。在CTB_Ai3 42基因施用組中未見Αβ水平的降低。在CTB-Ai3 42蛋白加強免疫組中Αβ水平僅稍稍降低。 與GFP基因施用組相比，CTB-Aβ 15x8基因施用組中可溶性級分中的Aβ水平降低至50% 左右。CTB-A β 42基因施用組中未見A β水平的降低。CTB-A β 42蛋白加強免疫組中的A β 水平降低至60 70% (圖17)。(3) SeV18+CTB-A β 15x8/ Δ F 的消除老年斑的效果將仙臺病毒載體通過肌肉注射施用給小鼠。在施用后8周(15個月齡)時將各組解剖。為了進行病理組織檢查，將右腦半球浸漬固定于10%中性緩沖福爾馬林液中，石蠟包埋后，從距腦正中裂約2mm的部位的腦組織制備縱剖切片。為了檢測上述切片組織中的 Αβ蛋白和老年斑，用70%甲酸進行處理切片組織。用5% H2O2滅活內源性過氧化物酶活性。與抗A β抗體(6Ε10抗體、1000倍稀釋)進行溫育后，加入過氧化物酶標記的第二抗體，進行了 DAB顯色。此外，使用與顯微鏡相連接的3CCD照相機進行拍攝。對于每個樣品， 組合20-30個圖像文件(圖18)。使用圖像解析軟件NIH image，對于全部樣品采用同一條件測定了在嗅球、大腦新皮質和海馬各區(qū)域中Αβ蓄積部分所占的面積，以計算出Αβ蓄積部分在各測定區(qū)域中所占的面積的比例。此外，還對測定中使用的老年斑的個數進 行了比較。其結果如圖19所示，老年斑的面積百分比顯示出減少的傾向，特別是在海馬中。(4)施用 SeV18+CTB_A β 15x8/ Δ F 的安全性評估像上述(3)那樣，對于施用后經過8周時(15個月齡)從治療組和對照組獲得的石蠟切片的HE染色標本和抗Iba-I抗體(小膠質)染色標本評價了中樞神經系統(tǒng)中炎癥細胞浸潤和小膠質活化的有無。結果顯示，對于對照組和治療組，在腦的任何部位均完全未檢測到浸潤的炎癥細胞。這證實了本發(fā)明的載體不會誘發(fā)中樞神經系統(tǒng)的炎癥。此外，在兩組動物的老年斑周圍均觀察到了小膠質的活化。但是在載體施用組的動物中，存在老年斑數目減少的傾向，與之平行地，也存在小膠質所占面積率減少的傾向。[實施例13]攜帶NP-Aβ融合蛋白的SeV載體cDNA的構建通過下述步驟，構建了編碼N末端側具有仙臺病毒的NP蛋白質、C末端側具有A β 肽(由8個拷貝的Αβ 15串聯連接而成(Αβ15χ8))的融合蛋白質的仙臺病毒載體。以 pSeV18+CTB-A0 15x8/AF 作為模板，使用引物 SeVF6(SEQ ID NO 45)禾口 ΝΡ/Αβ 15_R(SEQ ID N0:72)進行PCR，得到了 NP片段。使用引物ΝΡ/Αβ 15_F(SEQ ID NO :71)和引物 NotI-EIS-R(SEQ ID NO 70)進行 PCR，得至Ij 了 Αβ 15x8 片段。引物 ΝΡ/Αβ 15-F 與 NP/ Αβ 15-R被設計成彼此部分重疊。因此，將NP片段和Αβ 15x8的PCR片段混合作為模板，使用引物SeVF6和引物NotI-EIS-R進行PCR，使這2個基因融合成一個融合基因。將所得的 PCR片段亞克隆至克隆質粒中。確認了核苷酸序列后，用限制酶NotI切割該質粒。 將切割得到含有NP-A β 15x8的融合基因NotI片段插入pSeV18+/ Δ F的NotI位點，得到了含有目的 NP-A β 融合蛋白的 SeV 載體 cDNA (p SeV 18+ (ΝΡ-Α β 15x8) / Δ F)。NotI-EIS-R 5‘-ACCTGCGGCCGCGAACTTTCACCCTAAGTTTTTC(34mer) (SEQ ID NO 70)N Ρ/Α β 15-F :5，_GM T CGGCCCCGGCCCCGACGCCGAGTTCAGACAC (35mer) (SEQ ID NO
71)ΝΡ/Αβ 15-R :5，-GCGTCGGGGCCGGGGCCGATTCCTCCTATCCCAGC(35mer) (SEQ ID NO
72)[實施例14]CTB_Ai3蛋白的使用效果(單獨使用或與SeV載體組合使用)(1)正常小鼠中抗Αβ抗體效價的誘導使用C57BL/6N小鼠(8w、雌性)對CTB-A β蛋白引起的抗A β抗體效價的誘導進行了研究。將編碼N末端側具有CTB、C末端側具有4個拷貝的Αβ 15通過KK(賴氨酸-賴氨酸)接頭串聯而成的肽的融合蛋白質(CTB-Ai3 15x4KK)的基因片段插入 pSeV18+/ Δ F的NotI位點，構建了 SeV18+CTB_A β 15χ4ΚΚ/ Δ F。此外，在大腸桿菌中合成了 CTB-Ai3 15x4KK。使用該載體和融合蛋白質進行了實驗。對于組A(6只)，以 5xl07CIU/200l·! 1/只肌肉內施用SeV18+GFP/AF，8周后以相同方式施用相同載體。對于組 B (6只)，以5x107CIU/200 μ 1/只肌肉內施用SeV18+CTB_A β 15χ4ΚΚ/ Δ F，8周后以相同方式施用相同載體。對于組C(6只)，以5xl07CIU/200y 1/只肌肉內施用SeV18+CTB_A3 15x4KK/ Δ F后，每兩周一次以100 μ g/100 μ 1/只皮內施用CTB-A β 15χ4ΚΚ蛋白共5次。對于組D(6只)，以lOOyg/lOOy 1/只皮內施用CTB-A β 15χ4ΚΚ蛋白后，每兩周一次以 100 μ g/100 μ 1/只皮內施用了 CTB-A β 15χ4ΚΚ蛋白共5次。在最初施用前(OW)和施用后每2周(2W-4W-6W-8W-10W-12W)從小鼠采血，使用采集的血樣的血清測定了抗A β抗體效價。如圖20所示，其結果顯示在將CTB-A β 15x4kk蛋白與SeV組合使用(組C)的情況下，與單獨的SeV(組B)相比，誘導了非常高的抗Αβ抗體效價。此外，單獨使用蛋白(組 D)也能夠誘導高的抗A β抗體效價。
(2) PDGF-APPV717I模型小鼠中的抗A β抗體的誘導使用阿爾茨海默病模型小鼠PDGF_hAPPV717I (中國醫(yī)科學院實驗動物研究所提供、雌性、12個月齡、7 9只/組)進行，組A的小鼠不做處置，對于組B，以 5x107CIU/10 μ 1/只鼻內施用SeV18+CTB-A β 15χ4ΚΚ/ △ F，8周后以相同方式施用相同載體。對于組C，以5xl07CIU/10y 1/只鼻內施用SeV18+CTB-A3 15x4KK/AF后，每兩bv 周一次以100μβ/15Χ2μ 1/只鼻內施用CTB-Αβ 15x4KK蛋白(大腸桿菌生產的)共7 次。對于組D，以100yg/15x2y 1/只鼻內施用CTB-Aβ 15χ4ΚΚ蛋白后，每兩周一次共7 次以100μβ/15Χ2μ 1/只鼻內施用CTB-Aβ 15χ4ΚΚ蛋白。在最初施用前(OW)和施用后 (2W-8W-12W-16W)從小鼠采血，使用采集的血樣的血清測定抗A β抗體的效價。如圖21所示，結果顯示用CTB-A β 15χ4ΚΚ蛋白加強免疫(組C)引起了抗A β抗體的誘導。此外，單獨使用蛋白(組D)也能夠誘導抗Αβ抗體。 (3)使用Tg2576小鼠進行評價使用阿爾茨海默病模型小鼠Tg2576 (TAC0NIC公司提供、雌性、12個月齡、 14 16只/組)進行，組A不進行處置，對于組B，以5X107CIU/200y 1/只鼻內施用 SeV18+GFP/ Δ F，12周后以相同方式施用相同載體。對于組C，以5xl07CIU/10 μ 1/只鼻內施用SeV18+CTB-A β 15χ4ΚΚ/ Δ F，然后每一周一次以100 μ g/100 μ 1/只皮內施用CTB-Ai3 15x4KK蛋白共4次、然后每兩周一次共5次。在最初施用前(OW)和施用后 (4W-8W-12W-16W)從小鼠采血，使用采集的血樣的血清測定了抗A β抗體效價。最后，解剖小鼠，將左腦用10%福爾馬林固定液固定，將腦切片進行免疫染色(FSB染色和6Ε10染色)。此外，將右腦冷凍保存，然后抽提腦內Αβ，采用ELISA對腦內Αβ進行了定量。如圖22所示，結果顯示與未處置組A和對照載體施用組B相比，在施用疫苗(SeV+ 蛋白)的組C中誘導了高效價的抗Αβ抗體。此外，如圖23所示的免疫染色結果顯示，與未處置組(組Α)或對照載體施用組(組B)相比，在疫苗施用組C中老年斑面積顯著減少。 最后，如圖24所示的腦內A β定量ELISA結果顯示，與未處置組相比，疫苗施用組C中不溶性Αβ 42級分顯著減少。[實施例15]各種載體引起的抗Αβ抗體的誘導使用PDGF_hAPPV717I模型小鼠(中國醫(yī)科學院實驗動物研究所提供、雄性、12個月齡、8 9只/組)進行，對于組A，以5X10"1個粒子/200 μ 1/只肌肉內施用表達GFP的腺伴隨病毒(AAV)載體AAV-GFP，8周后以相同方式施用相同載體。對于組B，以5xl01(l個粒子Λ00 μ 1/只肌肉內施用表達CTB-A β融合蛋白質的AAV載體AAV-CTBA β 42，8周后以相同方式施用相同的載體。對于組C，以5X107CIU/200y 1/只肌肉內施用SeV18+GFP/ AF，8周后以相同方式施用相同載體。對于組D，以5x107CIU/200 μ 1/只肌肉內施用 SeV18+(CTB-A0 42)/AF，8周后以相同方式施用相同載體。對于組E，以5xl07CIU/200 μ 1/ 只肌肉內施用SeV18+CTB-Ai3 15χ4ΚΚ/ΔF，8周后以相同方式施用相同載體。對于組F，以 5xl07CIU/10y 1/只鼻內施用SeV18+CTB-A3 15χ4ΚΚ/ΔF，8周后以相同方式施用相同載體。 在施用前(OW)和施用后(2W-8W-12W-16W)從小鼠采血，使用采集的血樣的血清測定了抗 A β抗體效價。如圖25所示，其結果顯示CTB-A β 42攜帶的SeV載體與攜帶了相同CTB-A β 42的 AAV載體相比，誘導了稍微更高的抗Αβ抗體效價，而對于攜帶CTB-Aβ 15χ4ΚΚ的SeV載體(組E和組F)，與前述兩者(組B和組D)相比，能夠誘導令人吃驚的高的抗Αβ抗體效價。[實施例16]非感染性病毒載體(VLP)引起的抗Αβ抗體的誘導使用C57BL/6N小鼠(8w、雌性)，對非感染性病毒載體(VLP)引起的抗A β抗體的誘導進行了研究。對于組Α(6只)，以5xl07CIU/200l·! 1/只肌肉內施用SeV18+GFP/ AF，每一周一次共4次、然后每兩周一次以相同方式施用相同載體。對于組B(6只)，以 150μ g/200y 1/只肌肉內施用非感染性粒子SeV18+(NP_A0 15x8) / Δ F-VLP，每一周一次共4次，然后每兩周一次以相同方式施用相同載體。在施用前(OW)和施用后(2W-4W-6W-8W) 從小鼠采血，使用采集的血樣的血清測定了抗Αβ抗體效價。如圖26所示，結果顯示施用VLP (組B)可以誘導抗A β抗體。工業(yè)實用件 本發(fā)明為更有效地誘導抗Αβ抗體提供了可能。阿爾茨海默病的疫苗療法不僅可望有助于對尚無有效治療方法的阿爾茨海默病型癡呆患者，還可以期待提高老齡人生活品質、顯著改善護理問題、削減醫(yī)療費用等諸多社會貢獻。而且，通過將本發(fā)明高效的疫苗療法與早期診斷結合起來，在發(fā)病初期提供根治，可以期待能夠大幅減輕患者、患者家庭及社會的負擔。
權利要求
1.一種RNA病毒載體，其編碼AB5毒素B亞基與淀粉樣蛋白β抗原肽之間的融合蛋白質。
2.權利要求1所述的載體，其中，所述ΑΒ5毒素B亞基是霍亂毒素B(CTB)。
3.權利要求1或2所述的載體，其中，所述淀粉樣蛋白β抗原肽包含1個或多個拷貝的Αβ 1-15或其片段。
4.權利要求3所述的載體，其中，所述淀粉樣蛋白β抗原肽具有1 8個拷貝的 Αβ 1-15或其片段連接在一起的結構。
5.權利要求4所述的載體，其中，所述淀粉樣蛋白β抗原肽具有4 8個拷貝的 A β 1-15連接在一起的結構。
6.權利要求1 5中任一項所述的載體，其中，所述RNA病毒載體為負鏈RNA病毒載體。
7.權利要求6所述的載體，其中，所述負鏈RNA病毒載體是副粘病毒載體。
8.權利要求7所述的載體，其中，所述副粘病毒載體是仙臺病毒載體。
9.一種組合物，其包含權利要求1 8中任一項所述的載體和藥學上可接受的擔載體。
10.權利要求9所述的組合物，其用于誘導抗Aβ抗體。
11.根據權利要求9或10所述的組合物，其用于預防或治療阿爾茨海默病。
12.用于預防或治療阿爾茨海默病的藥物，其包含權利要求1 8中任一項所述的載體。
13.權利要求1 8中任一項所述的載體在制造用于誘導抗Aβ抗體的組合物中的用途。
14.權利要求1 8中任一項所述的載體在制造用于預防或治療阿爾茨海默病的藥物組合物中的用途。
15.權利要求13或14所述的用途，其中，利用包含淀粉樣蛋白β抗原的蛋白質或編碼該蛋白質的載體進行加強免疫。
16.權利要求15所述的用途，其中，所述包含淀粉樣蛋白β抗原的蛋白質是ΑΒ5毒素 B亞基與淀粉樣蛋白β抗原肽之間的融合蛋白質。
17.一種誘導抗A β抗體的方法，其包括施用包含權利要求1 8中任一項所述的載體或包含該載體和藥學上可接受的擔載體的組合物的步驟。
18.一種預防或治療阿爾茨海默病的方法，其包括施用權利要求1 8中任一項所述的載體或包含該載體和藥學上可接受的擔載體的組合物的步驟。
19.權利要求17或18所述的方法，其還包括施用包含淀粉樣蛋白β抗原的蛋白質或編碼該蛋白質的載體以進行加強免疫的步驟。
20.權利要求19所述的方法，其中，所述包含淀粉樣蛋白β抗原的蛋白質是ΑΒ5毒素 B亞基與淀粉樣蛋白β抗原肽之間的融合蛋白質。
21.一種提高針對抗原蛋白質的抗體的效價的方法，其包括施用編碼該抗原的RNA病毒載體2次以上的步驟。
22.一種用于通過包括施用編碼抗原的RNA病毒載體2次以上的步驟的方法來提高針對該抗原蛋白質的抗體的效價的組合物，其包含所述RNA病毒載體和藥學上可接受的擔載體。
23.編碼抗原蛋白質的RNA病毒載體在制造用于通過包括施用該載體2次以上的步驟的方法來提高針對該抗原的抗體的效價的藥物中的用途。
24.一種病毒樣粒子，其包含權利要求1 8中任一項所述的載體。
全文摘要
本發(fā)明提供用于高效誘導抗Aβ抗體以及預防和治療阿爾茨海默病的方法。通過施用表達AB5毒素B亞基與Aβ抗原肽的融合蛋白質的RNA病毒載體，成功地以非常高的效率誘導了抗Aβ抗體。通過該載體的施用，血漿中的抗Aβ抗體顯著提高，腦組織中Aβ量和抗Aβ抗體陽性的占有面積降低。根據本發(fā)明，能夠提供以阿爾茨海默病的預防和治療為目的的有效率的基因疫苗療法。
文檔編號A61K39/00GK102272301SQ20098015325
公開日2011年12月7日 申請日期2009年10月30日 優(yōu)先權日2008年10月31日
發(fā)明者井上誠, 佐伯晃一, 巖崎仁, 朱亞峰, 游軍, 田畑壽晃, 長谷川護 申請人:生物載體株式會社