專利名稱：利用磁性納米顆粒和超聲技術(shù)實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)染的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
此發(fā)明是有關(guān)于設(shè)計(jì)用納米結(jié)構(gòu)組成的運(yùn)載系統(tǒng)將生物分子傳遞到指定部位，以及在外加磁場(chǎng)和超聲的輔助下將所設(shè)計(jì)的納米結(jié)構(gòu)運(yùn)載系統(tǒng)通過(guò)生物膜運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)的方法。
背景技術(shù)：
基因轉(zhuǎn)染是用傳染媒介轉(zhuǎn)染媒介傳染媒介作為傳送方式將外來(lái)基因物質(zhì)引入真核細(xì)胞?；蜣D(zhuǎn)染常常是針對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞而言，而基因轉(zhuǎn)化則常用于描述DNA植入到細(xì)菌和非動(dòng)物真核細(xì)胞，如真菌、海藻和植物中?，F(xiàn)存的基因轉(zhuǎn)染手段必須要克服細(xì)胞膜滲透性和轉(zhuǎn)染顆粒溶解性的問(wèn)題。藥物傳送通常涉及到將藥物通過(guò)細(xì)胞膜傳輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)。最基本的體內(nèi)藥物運(yùn)載方法是通過(guò)口服或靜脈注射將藥物引入血液，然后期待藥物能被正確的細(xì)胞吸收。這種無(wú)差別釋放技術(shù)需要相對(duì)大的藥物劑量，但是這種單劑量藥物運(yùn)載方法無(wú)法用于對(duì)基因治療中所需傳遞的生物分子比如DNA?，F(xiàn)在的基因轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞的方法可分為兩類病毒性和非病毒性基因轉(zhuǎn)染。用病毒來(lái)將基因轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞被證明是極其有效的；然而，對(duì)進(jìn)入身體的病毒和誘變物質(zhì)的免疫反應(yīng)所引起的后果/副作用特別是臨床試驗(yàn)中必須認(rèn)真考慮，謹(jǐn)慎使用。非病毒藥物送達(dá)方法包括裸DNA注射和電激發(fā)法。但是裸DNA注射的基因轉(zhuǎn)染的效率非常低，而電激法又會(huì)導(dǎo)致組織損傷。顯微注射是另一種用精確工具直接將分子注入細(xì)胞的機(jī)械性方法。對(duì)DNA非常管用，但在很多情況下，此方法并不能被大規(guī)模使用因?yàn)樗淮沃荒苻D(zhuǎn)染一個(gè)細(xì)胞。基因槍是一個(gè)機(jī)械設(shè)備能將捆綁有生物分子的顆粒通過(guò)高壓射入細(xì)胞。由于這些顆粒的粒徑相對(duì)較大，所以常常損壞細(xì)胞。并且這種方法需要大量注射才有一小部分達(dá)到轉(zhuǎn)染效果。電激法是一種物理方法，它通過(guò)電擊細(xì)胞在細(xì)胞膜上產(chǎn)生孔隙。這些孔隙增加了物質(zhì)擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞的幾率。使得基因比較容易進(jìn)入細(xì)胞。超聲穿孔法與電激法頗為類似，只是超聲穿孔法利用超聲來(lái)刺激細(xì)胞膜。超聲對(duì)細(xì)胞周圍的液體產(chǎn)生擾動(dòng)，從而增加了外界物質(zhì)通過(guò)細(xì)胞膜的擴(kuò)散幾率。磷酸鈣轉(zhuǎn)染是另一種基因轉(zhuǎn)染的化學(xué)方法，它很便宜。基本原理是用磷酸鈣綁在 DNA上。這個(gè)混合分子能通過(guò)細(xì)胞膜上的鈣離子通道進(jìn)入細(xì)胞；然而這種轉(zhuǎn)染方法的效率通常是不高并且有很大局限性。病毒傳遞是一種較有效的方法，因?yàn)椴《颈旧硎且环N基因信息載體并且擅于進(jìn)入細(xì)胞。這些特點(diǎn)使它們被選擇來(lái)幫助將DNA分子輸入細(xì)胞。然而有時(shí)病毒載體的應(yīng)用并不適宜，因?yàn)槠渲旅粼阅軐?dǎo)致免疫性疾病并有潛在誘導(dǎo)基因突變的危險(xiǎn)。更進(jìn)一步，病毒傳遞是一種非特定的轉(zhuǎn)染方法并能在宿主身上產(chǎn)生負(fù)作用。另一種方法是用磁場(chǎng)力和分子載體通過(guò)細(xì)胞膜。此方法已申請(qǐng)美國(guó)專利(專利號(hào)2007/0231908A1)，此方法需要在穿過(guò)生物膜之前將分子載體定向。對(duì)上述大多數(shù)方法，基因轉(zhuǎn)染的效果很大程度上取決于被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型。有些細(xì)胞比其他細(xì)胞更難轉(zhuǎn)染，但這些難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，比如干細(xì)胞和植物細(xì)胞，但通常它們的商用價(jià)值很大。因此，有必要尋找新的手段來(lái)傳遞生物分子或其他有興趣的分子進(jìn)入細(xì)胞，以克服舊方法所面臨的困難。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種用磁性納米顆粒在外磁場(chǎng)操控下穿過(guò)細(xì)胞壁/細(xì)胞膜實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)化的方法。在一個(gè)實(shí)例中，納米顆粒被定向通過(guò)細(xì)胞膜、細(xì)胞核膜、或體內(nèi)細(xì)胞膜如血腦屏障。在一實(shí)例中，此發(fā)明進(jìn)一步發(fā)展是結(jié)合超聲技術(shù)來(lái)增加生物膜的滲透性。這種組合的方法能達(dá)到更好的生物分子傳遞或細(xì)胞轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)化效率。本發(fā)明包括如下方面(a) —種產(chǎn)生無(wú)毒，磁性納米顆粒的方法；(b)將納米顆粒捆綁在生物分子或其他感興趣的分子上；(c)在外磁場(chǎng)的作用下，使這些納米顆粒穿過(guò)細(xì)胞薄膜。在一實(shí)例中，我們用低強(qiáng)度脈沖超聲(LIPUQ用于增加薄膜滲透性。一方面，此發(fā)明利用磁性顆粒作為傳遞載體將特定分子穿透細(xì)胞膜帶入細(xì)胞，此方法包含以下步驟(a)將生物分子固定在納米顆粒上；(b)將納米顆粒定位于細(xì)胞膜緊鄰區(qū)域；(c)對(duì)納米顆粒和細(xì)胞膜施加磁場(chǎng)；(d)并同時(shí)對(duì)納米顆粒和細(xì)胞膜施加超聲。納米顆粒表面經(jīng)過(guò)修飾以便于分子附著其上。反應(yīng)位點(diǎn)的數(shù)量隨反應(yīng)位點(diǎn)間距不同而改變。另外，外加分子和納米顆粒的聯(lián)接可以是共價(jià)鍵、離子鍵或其他能將分子固定于納米顆粒的鍵合方式。在一實(shí)例中，外加分子可以是基因材料如DNA或RNA、蛋白質(zhì)、或任何其他生物分子。納米顆?？砂鼣U(kuò)納米管，如碳納米管，或單壁碳納米管。在一實(shí)例中，納米顆?？梢允巧锟山到饣蛏锟上嗳莸募{米材料，比如二氧化硅。這些納米顆粒應(yīng)對(duì)體內(nèi)或體外細(xì)胞表現(xiàn)為低毒性或無(wú)毒性。在宏觀尺度，磁場(chǎng)力用于控制分子載體向身體的特定部位移動(dòng)的方向。在微觀至納米尺度，此磁力能迫使分子載體穿過(guò)生物膜。如果有必要，分子載體能進(jìn)一步在磁力作用下進(jìn)入細(xì)胞核。薄膜可以是細(xì)胞壁或細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞核壁，或其他生物膜如線粒體雙層生物膜。此膜也可以是血腦屏障。因此，此方法也可將分子運(yùn)送進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)?？傊ㄟ^(guò)此方法生物分子能被傳遞到特定目標(biāo)。在一實(shí)例中，此發(fā)明包含的分子載體是具有磁性的納米結(jié)構(gòu)，并且其上有生物分子能附著的位點(diǎn)。結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量隨位點(diǎn)間的距離不同而不同。另外，鍵合類型可以是共價(jià)鍵、離子鍵或其他能固定住外加分子的鍵合方式。磁性納米顆?？稍诖艌?chǎng)力作用下通過(guò)各種方式被操控。在一實(shí)例中，載體可用磁場(chǎng)力吸引下聚集到器官或體內(nèi)組織的某一位置。在一方面，本發(fā)明包涵利用分子載體將分子傳遞到體內(nèi)或體外細(xì)胞。在體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)，靶向細(xì)胞可以是在固體或液體細(xì)胞培養(yǎng)液中。


為理解本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)和特色，在此我們結(jié)合圖表給出更詳盡的說(shuō)明。特定的例子， 我們會(huì)給出明確的細(xì)節(jié)，并且其結(jié)果會(huì)用附錄中的圖表闡明。任何例子只是此發(fā)明的單一實(shí)例，不可理解為對(duì)其適用范圍的局限。在如下圖表中圖IA是一磁性單壁納米管的示意圖，圖IB是一功能化的球形納米顆粒的示意圖。圖2顯示載體被推過(guò)細(xì)胞膜。箭頭表示磁場(chǎng)方向。在此圖中我們用碳納米管來(lái)代表載體。圖3顯示用磁鐵聚集納米顆粒于身體的特定位置。此例中顆粒被聚集于患者左臂上部。圖4A、4B、4C、和4D顯示功能化單壁納米管的形成過(guò)程。圖5A和5B顯示羧酸化的單壁納米管的X射線和紅外譜的圖譜。圖6A和6B是異硫氰酸熒光素標(biāo)記的單壁碳納米管的紅外和紫外-可見(jiàn)光譜?？v坐標(biāo)A顯示吸收量。圖7A為激光共聚焦顯微圖像顯示的對(duì)照細(xì)胞。圖7B為激光共焦顯微圖像，圖中顯示了異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記在細(xì)胞質(zhì)中的納米顆粒。圖7C和7D顯示了乳腺癌細(xì)胞線(MCF-7對(duì)照細(xì)胞)和MCF細(xì)胞在被納米顆粒捆綁綠色熒光蛋白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的激光共聚焦顯微照片。圖8A顯示了乳腺癌細(xì)胞(MCF-7細(xì)胞)被FITC標(biāo)記后納米顆粒的分布；圖8B顯示了乳腺癌細(xì)胞系(MCF-7細(xì)胞)被FITC標(biāo)記的磁性納米顆粒在外磁場(chǎng)誘導(dǎo)后納米顆粒的分布。圖9為乳腺癌細(xì)胞(MCF-7細(xì)胞)攝入磁性納米管，F(xiàn)ITC標(biāo)記的磁性納米管百分比在不同時(shí)間點(diǎn)的比較。圖lOAUOBjP IOC顯示了對(duì)照組，F(xiàn)ITC標(biāo)記的磁性納米管進(jìn)入造血干細(xì)胞3小時(shí)后和6小時(shí)后的照片。圖11為乳腺癌細(xì)胞(MCF-7細(xì)胞)經(jīng)過(guò)FITC標(biāo)記的納米顆粒攝入與對(duì)照細(xì)胞的對(duì)比。圖12A顯示不含綠色熒光蛋白質(zhì)粒，無(wú)微泡(Definity)，無(wú)超聲處理的陰性對(duì)照樣品的流式細(xì)胞儀結(jié)果。流式細(xì)胞儀結(jié)果標(biāo)記為M1，門控百分比為0.16。我們觀察到極高的細(xì)胞存活率。圖12B顯示對(duì)照樣品的流式細(xì)胞儀結(jié)果，其中包含2微克綠色熒光蛋白質(zhì)粒，無(wú)微泡(Definity)，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑為PEI，無(wú)超聲處理。流式細(xì)胞儀結(jié)果標(biāo)記為M1，門控百分比為33. 12%。觀察到極低的細(xì)胞存活率。圖13顯示了超聲處理過(guò)樣品的流式細(xì)胞儀結(jié)果，這里超聲強(qiáng)度為0. 5W/cm2，脈沖超聲工作周期為20%，時(shí)間為60秒QOO微秒超聲開(kāi)啟，800微秒超聲關(guān)閉)。在實(shí)驗(yàn)中所使用的DNA濃度也不同。圖13A，DNA質(zhì)粒濃度是2μ g/mL，標(biāo)記為M1，門控百分比為16. 20。 圖13B，DNA質(zhì)粒濃度是15 μ g/mL，標(biāo)記為Ml，門控百分比為26. 93。圖13C，DNA質(zhì)粒濃度是30μ g/mL，標(biāo)記為M1，門控百分比為32. 51。在所有的情形下都觀察到了高數(shù)量的細(xì)胞存活。圖14顯示了超聲處理過(guò)樣品的流式細(xì)胞儀結(jié)果，實(shí)驗(yàn)中使用超聲的強(qiáng)度為0. 3W/ cm2,超聲刺激60秒，工作周期為100%。DNA質(zhì)粒濃度是30 μ g/mL。流式細(xì)胞儀結(jié)果標(biāo)記為M1，門控百分比為14. 67。觀察到細(xì)胞存活率降低。圖15顯示了超聲處理過(guò)的樣品的流式細(xì)胞儀結(jié)果，實(shí)驗(yàn)中使用超聲的強(qiáng)度為 0. 5W/cm2，超聲刺激60秒，工作周期為100%。DNA質(zhì)粒濃度是30 μ g/mL。流式細(xì)胞儀結(jié)果標(biāo)記為M1，門控百分比為32. 12。觀察到細(xì)胞存活率較低。圖16顯示一個(gè)生物相容的硅納米管的圖片。圖17顯示了硅納米管(Si-NT)經(jīng)過(guò)管末羧酸化后的紅外光譜。圖18顯示了用綠色熒光蛋白質(zhì)粒(Si-NT-GFP plasmid)標(biāo)記的硅納米管轉(zhuǎn)染后人類宮頸癌HeLa細(xì)胞，以及對(duì)照細(xì)胞的照片。圖19顯示經(jīng)過(guò)48小時(shí)和72小時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)，硅納米管對(duì)細(xì)胞基本沒(méi)毒性。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明包含用一分子運(yùn)載工具將生物分子或其他感興趣的分子傳遞進(jìn)入細(xì)胞的方法，運(yùn)載工具是用磁場(chǎng)驅(qū)動(dòng)并帶有至少一個(gè)生物分子。在外加磁場(chǎng)力的幫助下此分子載體可通過(guò)細(xì)胞壁?！吧锓肿印笔侵改切┚哂猩锕δ懿⒛苡绊懮锵到y(tǒng)的行為或性質(zhì)的一些生物學(xué)分子。“磁性顆?！笔侵溉魏渭{米尺度的顆粒(其一維尺度小于100納米)，其運(yùn)動(dòng)受外磁場(chǎng)影響?！凹{米尺度”是指長(zhǎng)度范圍，用于測(cè)量從0. 1納米至1000納米的物體，這里1納米為10-9米?！稗D(zhuǎn)染”是指將外源基因物質(zhì)引入細(xì)胞的過(guò)程。本發(fā)明是有關(guān)于用磁性顆粒傳遞生物分子和其他感興趣的分子穿過(guò)細(xì)胞膜。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，磁性顆粒為一金屬核被例如碳的材料所包裹如圖IB所示。這些納米顆粒實(shí)現(xiàn)其功能化隨后標(biāo)記上生物分子。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，磁性顆粒為碳納米管，如單壁碳納米管嵌入磁性金屬原子(圖1A)。在一實(shí)例中，磁性金屬原子包含鎳，鐵或鈷。單壁碳納米管已為眾所周知。它可以通過(guò)適當(dāng)?shù)募夹g(shù)，如化學(xué)氣相沉積的方法，來(lái)合成。這些碳納米管可在鎳或釔或鎳釔為催化劑為種子的基礎(chǔ)上從表面上生長(zhǎng)出來(lái)。在一實(shí)例中，鎳和/或釔至少被包入碳納米管的頂端。在一實(shí)例中，合適的單壁納米管的直徑在 1.2到1.5納米之間，長(zhǎng)度在2至5微米間。單壁納米管可有不同手性(座椅式納米管或旋轉(zhuǎn)式納米管)。在一實(shí)例中所用的單壁納米管為座椅式手性為(5，5)納米管。磁性納米顆?；蛱技{米管表面經(jīng)過(guò)修飾后可通過(guò)功能團(tuán)與生物分子聯(lián)接。這些功能團(tuán)可作為結(jié)合位點(diǎn)用于將生物分子固定在納米顆?；蛱技{米管上。另外，功能化至關(guān)重要，因?yàn)樵S多納米顆?；蛱技{米管，特別是單壁納米管，是不溶于水的。功能化能增加它們的水溶性。在一實(shí)例中，如示意圖4A和4B所示，功能化是通過(guò)碳納米管表面化學(xué)改性來(lái)實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)例子中，磁性碳納米管的表面被管末羧酸化而羧酸并與亞硫酰二氯反應(yīng)生成酸性氯化物。此酸性氯化物與tert-butyl-12-aminododecylcarbamate，or tert-butyl (2-aminoethyl) carbamate耦合，隨后Boc官能團(tuán)脫保護(hù)以生成胺衍生物。在一替代實(shí)例中，如圖4C所示，胺衍生物納米管通過(guò)酸性氯化物納米管與 2' -(ethylenedioxy)bis (ethylamine)反應(yīng)來(lái)生成。在進(jìn)一步替代實(shí)例中，如圖4D所示， 胺衍生物可用ethane_l，2 diamine合成。在一個(gè)例子中，胺衍生物與異硫氰酸熒光素(FITC)反應(yīng)生成FITC衍生的磁性碳納米管。這些生物分子標(biāo)記的磁性碳納米管隨后被置于磁場(chǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)基中，如下面所述。生物分子如DNA或RNA可附于納米顆?；蛱技{米管表面的羧基官能團(tuán)上。在一例子中，DNA質(zhì)粒體載體和羧基化的單壁碳納米管連接，這種連接是通過(guò)l-ethyl-3-(3-dime thylaminopropyl)earbodiimide(EDC)在 2-[N_morpholino]ethane sulfonic acid (MES) 或磷酸溶液(PH值為4. 5)作用下的DNA上的氨基官能團(tuán)和納米管上的羧基官能團(tuán)的氨基化結(jié)合。DNA或RNA也可通過(guò)用靜電作用捆綁在納米顆粒表面的上。納米顆?？砂趸杌蚱渌稍诩?xì)胞中生物降解或生物相容的材料，比如 (但不局限于)納米纖維素或纖維素納米晶體。這里“可生物降解”是指可在活體作用下分解為無(wú)害產(chǎn)物的物質(zhì)。而“生物相容”指無(wú)論是在體外或體內(nèi)對(duì)生物無(wú)毒性或無(wú)害的物質(zhì)。 在一實(shí)例中，碳納米管被二氧化硅包裹，碳納米管在隨后的材料過(guò)程中被除去或燒盡，留下在碳納米管模板上生長(zhǎng)的硅納米管。硅納米管隨后被用類似前述碳納米管的技術(shù)功能化。一旦生物分子或其他感興趣的分子被標(biāo)記在磁性納米顆粒上，磁納米顆粒和將要轉(zhuǎn)染的細(xì)胞放入細(xì)胞培養(yǎng)液中，然后在外磁場(chǎng)作用下，磁納米顆粒在培養(yǎng)液中加速碰撞到細(xì)胞，必然有一部分磁納米顆粒穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，如圖2所示。如果顆粒沒(méi)有進(jìn)入細(xì)胞，它將被重新加速以期進(jìn)入另外細(xì)胞。在觀察中發(fā)現(xiàn)，相當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞能在相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)被轉(zhuǎn)染。用于驅(qū)動(dòng)分子載體的磁場(chǎng)可被調(diào)適，使得磁場(chǎng)力在一定方向上和強(qiáng)度上是固定或可調(diào)的。在一個(gè)實(shí)例中，根據(jù)需要，在不同階段，磁場(chǎng)的磁力可以被調(diào)節(jié)為可變的或固定的。 在一實(shí)例中，磁性顆粒在不斷改變方向和力度的磁力作用下以復(fù)雜的路徑移動(dòng)。在另一實(shí)例中，載體以變化的速度和加速度在復(fù)雜的路徑上移動(dòng)。在一實(shí)例中，被轉(zhuǎn)染過(guò)程中，通過(guò)施加超聲，比如低強(qiáng)度脈沖超聲(LIPUS)，于細(xì)胞培養(yǎng)液，使得細(xì)胞膜更易于穿透。此時(shí)運(yùn)用的超聲波頻率比用來(lái)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的超聲波頻率更高。通常低強(qiáng)度脈沖超聲的使用頻率低于約1MHz，然而在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中所使用的超聲頻率是在IMHz到2MHz之間，如1. 5MHz。超聲可使用傳統(tǒng)的或稍加改變的醫(yī)用超聲治療儀。超聲強(qiáng)度在每平方厘米0. 1瓦至1.0瓦之間變化。在一實(shí)例中，強(qiáng)度約在每平方厘米0.3瓦至0.5瓦之間。工作周期和重復(fù)脈沖也被調(diào)節(jié)使用，如工作周期在20%至100%之間而重復(fù)頻率為100Hz。通常，高強(qiáng)度和長(zhǎng)工作周期將增加穿過(guò)細(xì)胞膜的幾率，但這是以犧牲細(xì)胞存活率為代價(jià)。我們可以用如下的公式計(jì)算超聲總能量，超聲能量不應(yīng)超過(guò)會(huì)引起大量細(xì)胞損傷的能量。能量(J)=強(qiáng)度*工作周期*時(shí)間
在一實(shí)例中，總能量在優(yōu)化情況下是18000毫焦耳。合適的超聲成像對(duì)照試劑，如施貴寶公司的Def inity 可用于促進(jìn)在細(xì)胞附近產(chǎn)生微孔以便細(xì)胞轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)化。在一實(shí)例中，磁性納米顆?？捎糜隗w內(nèi)傳遞，將治療藥劑如藥物或生物分子送達(dá)體內(nèi)特定位置。如圖3所示磁鐵可置于身體上特定部位以便聚集磁性納米顆粒。隨著磁性顆粒在體內(nèi)的循環(huán)，它們會(huì)在磁鐵所放置的部位聚集。因此，通過(guò)這種方法，納米顆?？蓪⑸锓肿觽鬟f到特定目標(biāo)區(qū)域。在一實(shí)例中，這種靶向傳輸?shù)姆椒蓪⒎肿觽魉偷酵ǔｋy以進(jìn)入的地方，比如穿過(guò)血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。用磁場(chǎng)方式可將磁性納米顆粒收集于血腦屏障的特定地點(diǎn)。然后，在外磁力作用下，迫使磁性納米顆粒穿越血腦屏障。一旦納米顆粒聚集在特定點(diǎn)或區(qū)域，納米顆粒可在快速變換方向的外磁力作用下迫使顆粒進(jìn)入細(xì)胞?？焖僮儞Q方向的外磁力，會(huì)使顆?？焖偾斑M(jìn)和后退。這種方向的改變是使顆粒有根多機(jī)會(huì)和速度撞擊細(xì)胞膜，最后至少有一部分顆粒會(huì)穿過(guò)細(xì)胞膜而進(jìn)入細(xì)胞。 在一實(shí)例中，使用超聲和磁力能增強(qiáng)顆粒在體內(nèi)的這種運(yùn)動(dòng)。超聲波發(fā)生儀將超聲能量施于人體，廣為人知的是超聲在成像中的應(yīng)用。此類儀器也可在稍加改變或不改變的情況下， 應(yīng)用于靶向分子傳遞系統(tǒng)。正如在這里的描述和以后隨之而來(lái)的申報(bào)，本發(fā)明可具體實(shí)現(xiàn)于其他特定形式， 而不偏離其結(jié)構(gòu)、方法、或其它基本特性。正如附錄的申報(bào)所指，所有被描述的例子在每一方面都被認(rèn)為是就其所是的具體實(shí)例，因此，而不僅僅是之前的描述。任何在申報(bào)中的含義上的變化和等同的改變將都包含在其范圍內(nèi)。例子除非特別說(shuō)明，以下例子意在描述所指的發(fā)明而不以任何形式限制所指的發(fā)明。
例一，F(xiàn)ITC標(biāo)記的碳單壁納米管的合成(如圖4B所示)含鎳的碳納米管用3當(dāng)量的硝酸處理45小時(shí)以引入羧酸基團(tuán)。處理完成后，溶液用去離子水稀釋，然后用去離子水過(guò)濾和清洗數(shù)次。用酸處理的單壁納米管被收集并在真空中晾干。IOOmg的單壁納米管(SWNTs)在20mL的亞硫酸氯(含ImL的二甲基甲酰胺)中在 70oC攪拌M小時(shí)。離心后，棕色的上清液被倒出而剩下的固體用無(wú)水四氫呋喃清洗。離心以后，白色的上清液被倒出。剩下的固體在真空中晾干。混合的 SWNTs 禾Π Ig 的 tert-butyl-2-aminoethylcarbamate 在氬氣氛 IOOoC 加熱 100小時(shí)。冷卻到室溫后，多余的tert-butyl-2-aminoethylcarbamate用甲醇洗除。剩下的黑色固體在真空晾干。SffNTs 和 tert-butyl-2-aminoethylcarbamate 的耦合物懸浮在 MeOH 中并加入二氧雜環(huán)乙烷GN)的鹽酸溶液，所得的混合物在室溫下攪拌4小時(shí)。然后加入無(wú)水乙醚，收集所得的沉降物并在真空晾干。包含胺官能團(tuán)的SWNTs懸浮在DMF和diisopropylethylamine的混合物中，加入 FITC在DMF的溶液中。所得混合物在暗室室溫下攪拌4小時(shí)。然后加入無(wú)水乙醚，將沉淀物用離心方法收集并用乙醚和甲醇徹底清洗，在真空晾干就是FITC標(biāo)記的單壁納米管。在另一方法中，如圖4C所示，從Aldrich公司購(gòu)買的單壁納米管氧化并在表面形成羧酸組。這些納米管與亞硫酰二氯反應(yīng)然后與2，-(ethylenedi0Xy)biS(ethylamine)反應(yīng)生成胺終結(jié)的納米管。胺隨后與FITC反應(yīng)使得FITC附著在單壁納米管上。例2，紅外、X射線和紫外-可見(jiàn)光譜特性為確認(rèn)合成確實(shí)發(fā)生，所有圖4C所示的中間產(chǎn)物和最終產(chǎn)物(SWNT-FITC)都用紅外、X射線電子光譜和紫外-可見(jiàn)光譜表明特征，結(jié)果如圖5和圖6所示。紅外數(shù)據(jù)清楚表明單壁納米管成功的羧基組功能化了，而X射線電子光譜數(shù)據(jù)顯示約6. 的碳原子在羧基組中出現(xiàn)。水中的異硫氰酸熒光素標(biāo)記的單壁納米管的紫外-可見(jiàn)光譜如圖8所示，作為對(duì)比，水中的異硫氰酸熒光素的紫外-可見(jiàn)光譜也在圖中顯示。例3，熒光著色和成像FITC標(biāo)記的單壁納米管(CNT-FITC)用例一(圖4B)的方式制備，用于乳腺癌細(xì)胞的標(biāo)記和成像。材料 乳腺癌MCF-7細(xì)胞 細(xì)胞培養(yǎng)基-GIBCO 11330，DMEM/F12(1 1)20·福爾馬林溶液(w/v) 16%, Methanol-free, Pierce, Cat#28906· Hoechst-Invitrogen Cat#33342· Rhodamine Phalloidin-Invitrogen Cat#R_415(Rhodamine Phalloidin 300U 溶解于 1. 5ml 的甲醇以形成 200units/ml 的濃度， 分裝成IOul的小瓶，保存在零下20度)· PBS 緩沖液·封閉緩沖液-PBS/0. 5% BSA·提供磁場(chǎng)的磁鐵 Cat#ND075 (www magnet4Iess. com) 2X1 的厚園片，級(jí)別 N42，稀土釹超強(qiáng)磁鐵(拉力176磅)圓形覆蓋紙片放入6孔或M孔盤，一個(gè)覆蓋片蓋一個(gè)孔而人乳腺癌細(xì)胞系 (MCF-7)細(xì)胞放入每個(gè)孔，細(xì)胞數(shù)lxl05/ml，在37oC隔夜孵化。每孔加入Boechst (Iul Hoechst inlml medium)并在37oC孵化1小時(shí)。Iml的異硫氰酸熒光素標(biāo)記的單壁納米管 (CNT-FITC)加入盤的每個(gè)孔(除了對(duì)照)并在37oC孵化1小時(shí)。每孔用PBS清洗3次。用鑷子從一個(gè)孔中取出覆蓋片，垂直放入裝有IOml添加了 CNT-FITCdO 1， medium =CNT-FITC)的無(wú)血清培養(yǎng)基的燒杯，放在電爐(磁力攪拌器)上細(xì)胞面對(duì)進(jìn)入的納米管3分鐘。攪拌速度設(shè)為1200rpm。覆蓋片鋪放在裝有不含CNT-FITC的無(wú)血清培養(yǎng)基的碟中，將碟放在磁鐵上7分鐘。用PBS清洗覆蓋片3次并放入另一個(gè)M孔盤，也放入未磁化處理的覆蓋片。細(xì)胞用4%的甲醛溶液固定10分鐘(或在4oC隔夜)。甲醛溶液然后被去除并將細(xì)胞用PBS洗3次。250ul的PBS/0. 2 TX-100加在孔中的覆蓋片上并在室溫保持10分鐘。 再將細(xì)胞用 PBS 洗 3 次，并用 250ul 的 PBS/0. 5% BSAblocked20 分鐘。2. 5ul 的 Rhodamine Phalloidin 力卩入 50ul 的 block buffer 然后 the mix pipetted on parafilm。覆蓋片放入溶液30分鐘。覆蓋片然后放回盤中并用PBS洗3次。覆蓋片然后放置在載玻片上并送去做共聚焦顯微。樣品用激光掃描共聚焦顯微做成像，510 (Carl Zeiss) equipped with AxiovertlOOMmicroscopy(Zeiss),a F-Fluar 40X-1. 3 NA oil lens and 3 different lasers(Uv, Argon/2and HeNel)。如圖7A和7B所示，由于hvitrogen雙鏈DNA著色的結(jié)果，細(xì)胞核發(fā)出強(qiáng)烈熒光。 圖8B中，F(xiàn)ITC moities的熒光可在細(xì)胞質(zhì)中清楚可見(jiàn)，說(shuō)明CNT-FITC穿過(guò)了細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。另一個(gè)例子中，SffNT與GFP質(zhì)粒(pDRIVE5_0FP)用EDC和磷酸緩沖液的共價(jià)鍵形成共軛。SWNT-GFP質(zhì)粒與MCF-7細(xì)胞孵化3分鐘，然后用磁力攪拌器加磁場(chǎng)7分鐘。細(xì)胞隨后孵化M小時(shí)，用共聚焦顯微確認(rèn)GFP表達(dá)。圖7D顯示細(xì)胞中GFP熒光結(jié)果，與圖7C 中的對(duì)照細(xì)胞做對(duì)比。例4，細(xì)胞攝入效率FITC標(biāo)記的SWNT傳遞入貼壁MCF-7乳腺癌細(xì)胞。傳遞和恢復(fù)階段后，熒光標(biāo)記的SWNT被共聚焦顯微探測(cè)到。結(jié)果如圖8A和8B所示。數(shù)據(jù)清楚顯示SWNT穿過(guò)了細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)甚至進(jìn)入細(xì)胞核(如圖8B中的綠點(diǎn)；有些用箭頭指出)。攝入比在圖9中約為 90%。除了將FITC傳遞進(jìn)入貼壁細(xì)胞，如MCF-7細(xì)胞，我們也成功將FITC傳遞進(jìn)入難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，或懸浮細(xì)胞，如造血干細(xì)胞(HSCs)。圖10顯示了傳遞結(jié)果。結(jié)果顯示SWNT可將FITC傳遞進(jìn)入HSCs。隨著時(shí)間增加到3到6小時(shí)，更多的FITC進(jìn)入了細(xì)胞(FITC顯為綠色熒光)。對(duì)照樣品顯示沒(méi)有內(nèi)部熒光。例5，細(xì)胞存活率值得一提的是細(xì)胞存活率與對(duì)照相比沒(méi)有因SWNT的攝入而受損害，如圖11。經(jīng)過(guò)FITC-SWNT攝入并用磁場(chǎng)作用的MCF-7細(xì)胞的存活率與對(duì)照細(xì)胞和僅攝入SWNT而無(wú)磁場(chǎng)作用的細(xì)胞作了對(duì)比。6小時(shí)后的攝入SWNT的細(xì)胞與對(duì)照相比其存活率基本相似。例6，超聲傳遞(USD)-細(xì)胞制備和DNAUSD和轉(zhuǎn)染用人體乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)做評(píng)估。細(xì)胞保存在10%胎牛血清的IMDM 培養(yǎng)基中。實(shí)驗(yàn)前一天在培養(yǎng)燒瓶中加入0.25% Trypsin以收集細(xì)胞并等待分離。ImL 的細(xì)胞加入10mmx35mm的含有ImL培養(yǎng)基的碟中。細(xì)胞濃度約為1. ^cl05cells/mL。為確認(rèn)轉(zhuǎn)染，綠色熒光蛋白質(zhì)粒(GFP plasmid-pDRIVE5-GFP)在超聲之前15分鐘加入培養(yǎng)基。 使用了不同的GFP濃度2 μ g/mL, 15 μ g/mL,及30 μ g/mL。超聲對(duì)照試劑Definity，購(gòu)于 Lantheus Medical，用于制造微孔。UCA體積為140 μ L0USD用Excel UltraMax治療超聲儀來(lái)進(jìn)行，探頭半徑2. 5cm。用超聲膠將超聲探頭連接在細(xì)胞培養(yǎng)皿底部。超聲作用60秒，IMHz頻率，不同的輸出強(qiáng)度0. 3ff/cm2和0. 5W/ cm2。工作周期試驗(yàn)了 100%和20%的情況，用了固定的脈沖重復(fù)頻率100Hz。做為對(duì)照，我們超聲了無(wú)UCAs或GFP的空白樣品，和有GFP但無(wú)UCAs的樣品。并且，我們用PEI，一個(gè)脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑，做了正對(duì)照。最后，我們制備了未被超聲處理但含有Definity和GFP的樣品。細(xì)胞數(shù)用流式細(xì)胞儀(FACS)來(lái)計(jì)數(shù)。USD后M小時(shí)，細(xì)胞用含0.25% trypsin 的FACS試管收集并用1小PBS洗一次。之后，細(xì)胞在200uL 1 %的多聚甲醛中重懸浮并用流式細(xì)胞儀測(cè)試。細(xì)胞存活率用血球儀計(jì)數(shù)來(lái)核定。用FACS試管收集細(xì)胞后，轉(zhuǎn)移20 μ 1的每一樣品進(jìn)入小離心管并用0.4% trypan blue稀釋。將10 μ 1放入血球儀數(shù)細(xì)胞。最后用如下公式計(jì)算細(xì)胞濃度所有格子中的細(xì)胞數(shù)/格子總數(shù)*稀釋因子*lxl04。所有FACs測(cè)試結(jié)果如圖12至15所示。我們的負(fù)對(duì)照樣品沒(méi)有產(chǎn)生任何轉(zhuǎn)染，但維持很好的細(xì)胞存活率，正如FACs的結(jié)果。PEI脂質(zhì)轉(zhuǎn)染正對(duì)照顯示了 GFP表達(dá)，和極度的細(xì)胞死亡。
權(quán)利要求
1.用含磁性納米顆粒作為運(yùn)載手段將分子運(yùn)送穿過(guò)細(xì)胞膜的方法，此方法的步驟如下(a)固定分子于納米顆粒之上；(b)將納米顆粒定位于緊鄰細(xì)胞膜的區(qū)域；(c)對(duì)納米顆粒和細(xì)胞膜施加磁場(chǎng)；且(d)同時(shí)對(duì)納米顆粒和細(xì)胞膜施加超聲。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，超聲包括低強(qiáng)度脈沖超聲。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，納米顆粒包括單壁碳納米管。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，納米顆粒包含可生物降解或生物相容的材料。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，納米顆粒包括二氧化硅。
6.如權(quán)利要求1至5中任一權(quán)利要求所述的方法，分子包含DNA或RNA分子。
7.如權(quán)利要求1至5之中任一權(quán)利要求所述的方法，應(yīng)用于體內(nèi)，用磁力放在近鄰特定區(qū)域的方法將運(yùn)送載體集中在特定區(qū)域，并用磁場(chǎng)使之穿過(guò)細(xì)胞膜。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，集中運(yùn)送載體后作用在特定區(qū)域的磁場(chǎng)不斷變換方向。
9.如權(quán)利要求7或8所述的方法，特定區(qū)域在血腦屏障之后或與之相聯(lián)。
全文摘要
此發(fā)明包括磁性納米顆粒的分子運(yùn)送載體用于轉(zhuǎn)染和將藥物分子運(yùn)送穿過(guò)細(xì)胞膜到達(dá)體內(nèi)特定地點(diǎn)，使用磁場(chǎng)和超聲的方法。
文檔編號(hào)A61K48/00GK102272312SQ200980153661
公開(kāi)日2011年12月7日 申請(qǐng)日期2009年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月7日
發(fā)明者盧衛(wèi)兵, 邢贊 申請(qǐng)人:智能納米公司