專利名稱：致敏細胞療法的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及將利用通過使用細胞因子孵育而致敏的細胞以用于體細胞治療。
背景技術：
在骨科領域，退行性關節(jié)炎或骨關節(jié)炎是最常遇到的與軟骨損傷相關的疾病。體內的幾乎每個關節(jié)，如膝關節(jié)、髖關節(jié)、肩關節(jié)，甚至是腕關節(jié)，都會受到影響。該病的發(fā)病機制是透明關節(jié)軟骨的變性(Mankin等人，J Bone Joint Surg，52A :460_466，1982)。關節(jié)的透明軟骨發(fā)生變形，原纖維化，并最終凹陷。如果退化的軟骨能夠以某種方式再生，那么大部分患者將能夠在沒有令人虛弱的疼痛的情況下享受生活。傳統(tǒng)的藥物遞送途徑，如口服、靜脈或肌肉注射給予，將藥物遞送至關節(jié)的效率較低。關節(jié)內注射的藥物的半衰期通常很短。關節(jié)內注射藥物的另一個缺點是在治療諸如關節(jié)炎的慢性疾病時需要在關節(jié)間隙處頻繁重復注射以達到可接受的藥物水平。由于迄今為止的治療藥物不能選擇性靶向于關節(jié)，因此有必要將哺乳動物宿主暴露于全身性的高濃度藥物中，以實現(xiàn)持續(xù)的關節(jié)內治療劑量。以這種方式的非靶器官的暴露會加劇抗關節(jié)炎藥物產(chǎn)生嚴重副作用的趨勢，例如哺乳動物宿主的胃腸不適以及血液、心血管、肝臟和腎臟系統(tǒng)的變化。在骨科領域，某些細胞因子已被認為是用于治療骨科疾病的候選物。骨形態(tài)發(fā)生蛋白已被認為是骨形成的一種有效刺激物(Ozkaynak等人，EMBO J，9 =2085-2093,1990 ； Sampath 和 Rueger，Complications in Ortho，101-107，1994)，并且已報導了 TGF-β 作為骨形成和軟骨形成的刺激物(Joyce等人，J Cell Biology, 110 :2195-2207,1990)。轉化生長因子-β (TGF- β )被認為是一種多功能的細胞因子(Sporn和Roberts， Nature (London)，332 :217-219,1988)，并且在細胞生長、分化和細胞外基質蛋白合成中起調節(jié)作用(Madri 等人，J Cell Biology，106 1375-1384，1988)。TGF-β 在體外抑制上皮細胞和破骨細胞樣細胞的生長(Chenu等人，Proc Natl Acad Sci，85 :5683_5687，1988)，但其在體內刺激軟骨內成骨并最終刺激骨形成(Critchlow等人，Bone, 521-527,1995 ；Lind 等人，A Orthop Scand,64(5) :553_556，1993 ；和 Matsumoto 等人，In vivo,8 :215-220, 1994) 0TGF-β誘導的骨形成由其刺激的骨膜下多能細胞介導，該骨膜下多能細胞最終分化成軟骨形成細胞(Joyce 等人，J Cell Biology，110 :2195_2207，1990 ；和 Miettinen 等人， J Cell Biology, 127-6 :2021-2036,1994)。已經(jīng)報導了 TGF-β在骨科中的生物學作用(Andrew等人，CalcifTissue In. 52 74-78,1993 ；Borque ^ A, Int J Dev Biol. ,37 :573-579,1993 ；Carrington ^ 人，J Cell Biology,107 :1969-1975,1988 ；Lind 等人，A OrthopScand. 64(5) :553-556,1993 ； Matsumoto等人，In vivo,8 =215-220,1994) 在小鼠胚胎中，染色法顯示出TGF-β與來自間葉細胞的組織(例如結締組織)、軟骨組織和骨組織密切相關。除了胚胎學的發(fā)現(xiàn)， TGF-β存在于骨形成和軟骨形成的部位。其也能夠提高兔脛骨骨折的愈合。最近，報導了 TGF-β 的治療價值(Critchlow 等人，Bone, 521-527,1995 ；和 Lind 等人，AOrthop Scand,64 (5) =553-556,1993)，但其短期效果和高治療費用限制了其廣泛臨床應用。在培養(yǎng)時通過重復傳代而增殖的過程中，軟骨細胞不可避免地喪失其產(chǎn)生軟骨基質如氨基葡聚糖(GAG)和II型膠原(C0L2)的能力，并開始產(chǎn)生I型膠原(C0L1)，這被稱為脫分化(dedifferentiation)。一直以來人們就知道人類關節(jié)軟骨細胞在體外僅能夠經(jīng)歷有限次的細胞分裂，并且其增殖能力會隨著年齡的增長而降低。申請人:已證明擴充人類關節(jié)軟骨細胞的條件能夠在體外調節(jié)細胞重新進入分化程序并增加生長潛能的能力。美國專利5，858，355和5，766，585公開了制備IRAP (白細胞介素-1受體拮抗劑蛋白)基因的病毒或質粒構建體；用該構建體轉染滑膜細胞(5，858，355)和骨髓細胞 (5，766，585)；并將轉染的細胞注射到兔關節(jié)中，但未公開利用致敏的軟骨細胞使結締組織再生。美國專利5，846，931和5，700，774公開了將包括屬于TGFii “超家族”的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)與截短的甲狀旁腺素相關蛋白的組合物一起注射以影響軟骨組織形成的維持，和軟骨組織的誘導。然而，其并未公開使用BMP基因的基因療法，也未公開使用致敏的軟骨細胞。美國專利5，842，477公開了將支架、骨膜/軟骨膜組織和包括軟骨細胞的基質細胞的組合植入到軟骨缺損的區(qū)域。由于該專利公開內容要求所植入的系統(tǒng)中存在全部三個元素，而參考資料并未公開或暗示無需植入支架或骨膜/軟骨膜組織的本發(fā)明的簡單細胞療法。盡管存在這些現(xiàn)有技術的公開內容，然而仍然非?，F(xiàn)實和實質性地需要更加有效和強效的治療方法，其不僅在哺乳動物宿主中使結締組織再生，而且也是更好和更有效的體細胞基因治療方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明已滿足此前所述的需要。在一個方面中，本發(fā)明涉及細胞因子或細胞因子的組合，其誘導已喪失產(chǎn)生軟骨基質的軟骨細胞的再分化。本發(fā)明涉及能夠在體外促進原代軟骨細胞的細胞生長的細胞因子。此外，可利用再分化的軟骨細胞形成軟骨組織，而無需利用三維基質。申請人還發(fā)現(xiàn)使用具有促進生長和再分化的細胞因子的細胞進行序貫治療可使軟骨組織再生最大化。在一個方面中，本發(fā)明涉及一種包含致敏的(primed)結締組織細胞及其藥學上可接受的載體的組合物。細胞可以是成纖維細胞、軟骨細胞或成纖維軟骨細胞。細胞可以是人類細胞。細胞可以是可注射的。細胞可被容納在用于在約_70°C至約_196°C的溫度下儲存細胞的儲存容器中。在另一個方面中，本發(fā)明涉及一種刺激哺乳動物中靶部位處軟骨再生的方法，包括(i)用包含細胞因子的組合物孵育結締組織細胞以產(chǎn)生致敏細胞；(ii)可選地從結締組織細胞中分離細胞因子；和(iii)將治療有效量的致敏細胞注射到希望生成軟骨的靶關節(jié)部位中，其中該靶部位處的結締組織細胞的內源性存在形式減少，并且其中該靶部位處致敏細胞的存在刺激軟骨的再生。結締組織細胞可以是成纖維細胞、軟骨細胞或成纖維軟骨細胞。軟骨細胞可以是原代人軟骨細胞。細胞因子可以是屬于TGF-β超家族的成員。可將該結締組織細胞孵育約1小時至約2周以產(chǎn)生致敏細胞。細胞因子可以是TGF-β。細胞因子的存在量可以為至少lng/ml。在另一個方面中，本發(fā)明涉及除致敏細胞以外的由希望被表達的基因轉染或轉導的第二群哺乳動物細胞。在又一個方面中，本發(fā)明涉及一種混合細胞組合物，包含產(chǎn)生透明軟骨的有效量的(a)第一群致敏的軟骨細胞或成纖維細胞；(b)第二群成纖維細胞或軟骨細胞，其已被編碼TGF-β超家族成員的基因轉染或轉導；和(c)它們的藥學上可接受的載體。該基因可以是 TGF- β 1、TGF- β 2、TGF- β 3、ΒΜΡ-2、ΒΜΡ-3、ΒΜΡ-4、ΒΜΡ-5、ΒΜΡ-6、ΒΜΡ-7 或 ΒΜΡ-9。在該組合物中，第一群致敏細胞和已被編碼TGF-β超家族成員的基因轉染或轉導的第二群成纖維細胞或軟骨細胞的比例為約1-20 1;約1-10 1;或約1-3 1?？蓪蜣D染或轉導的第二群細胞進行輻照。在本發(fā)明的組合物中，第一細胞群和第二細胞群可來自相同來源的生物體或不同來源的生物體。在再一個方面中，本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生混合細胞組合物的方法，包括(A)產(chǎn)生第一細胞群，包括以下步驟(i)用包含細胞因子的組合物孵育結締組織細胞以產(chǎn)生第一群致敏細胞；和(ii)可選地從結締組織細胞中分離細胞因子；(B)產(chǎn)生第二細胞群，包括以下步驟(i)產(chǎn)生包含可操作地連接于啟動子的編碼治療蛋白的DNA序列的重組載體；(ii) 用所述重組載體對細胞群進行體外轉染或轉導以產(chǎn)生第二細胞群；和(C)將第一細胞群和第二細胞群混合在一起以產(chǎn)生混合細胞組合物。在再一個方面，本發(fā)明涉及一種刺激哺乳動物中靶部位處軟骨再生的方法，包括 (A)產(chǎn)生第一細胞群，包括以下步驟(i)用包含細胞因子的組合物孵育結締組織細胞以產(chǎn)生第一群致敏細胞；和(ii)可選地從結締組織細胞中分離細胞因子；(B)產(chǎn)生第二細胞群， 包括以下步驟(i)產(chǎn)生包含可操作地連接于啟動子的編碼治療蛋白的DNA序列的重組載體；(ii)用所述重組載體對細胞群進行體外轉染或轉導以產(chǎn)生第二細胞群；和(C)將治療有效量的第一細胞群和第二細胞群的混合物注射入希望生成軟骨的靶關節(jié)部位中，其中該靶部位處的結締組織細胞的內源性存在形式減少，并且其中該靶部位處的細胞混合物的存在刺激軟骨的再生。在該方法中，基因可以是TGF-β 1、TGF-β 2、TGF-β 3、ΒΜΡ-2、ΒΜΡ-3、 ΒΜΡ-4、ΒΜΡ-5、ΒΜΡ-6或ΒΜΡ-7。在該方法中，第一和第二細胞群與宿主受體可以是同源、異源(同種異體)或異種的。重組載體可以是病毒載體或質粒。細胞可在注射前可選地冷凍儲存。在再一個方面中，本發(fā)明涉及一種治療骨關節(jié)炎的方法，包括(A)產(chǎn)生第一細胞群，包括以下步驟(i)用包含細胞因子的組合物孵育結締組織細胞以產(chǎn)生第一群致敏細胞；和(ii)可選地從結締組織細胞中分離細胞因子；(B)產(chǎn)生第二細胞群，包括以下步驟 (i)產(chǎn)生包含可操作地連接于啟動子的編碼治療蛋白的DNA序列的重組載體；(ii)用所述重組載體對細胞群進行體外轉染或轉導以產(chǎn)生第二細胞群；和(C)將治療有效量的第一和第二細胞群的混合物及其藥學上可接受的、不是無生命的三維結構的載體注射到哺乳動物的關節(jié)間隙中以進入希望生成軟骨的靶關節(jié)部位中，其中該靶部位處的結締組織細胞的內源性存在形式減少，并且其中該靶部位處的細胞混合物的存在刺激軟骨的再生以治療骨關節(jié)炎。在又一種實施方式中，本發(fā)明涉及一種縮短結締組織細胞倍增時間的方法，包括用包含細胞因子的組合物孵育結締組織細胞以產(chǎn)生致敏細胞。該結締組織細胞可以是成纖維細胞、軟骨細胞或成纖維軟骨細胞。軟骨細胞可以是原代人軟骨細胞。細胞因子可以是屬于TGF-β超家族的成員。可用細胞因子孵育細胞約1小時至約2周以產(chǎn)生致敏細胞。倍增時間可以是未孵育的對照細胞的大約一半。細胞因子可以是FGF和TGF-βΙ的組合。組合物可包括3，3'，5-三碘-L-甲狀腺原氨酸(3，3'，5-Triiodo-L-thyronine)。通過對本發(fā)明的以下描述、附圖和所附權利要求，將更加充分地了解本發(fā)明的這些和其他目的。


通過對本發(fā)明的以下詳細描述，以及僅以圖示說明的方式提供而不是意在限制本發(fā)明的附圖，將更加充分地了解本發(fā)明，其中圖1示出了在用TGFi3 1孵育成纖維軟骨細胞后的不同時間(周)，細胞阿爾新藍染色(Alcian blue staining)的結果。1.用 10ng/mL TGFβ 1 孵育 18hr ；2.用 50ng/mL TGF β 1 孵育 18hr ；3.用 10ng/mL TGF β 1 孵育 6hr ；4.用 50ng/mL TGF β 1 孵育 6hr ；5.用 Ing/mL TGFβ 1孵育；6.用lOng/mLTGFi 1孵育，不分離細胞因子；7.未經(jīng)處理的對照成纖維軟骨細胞。圖2示出了經(jīng)細胞因子處理的二維培養(yǎng)物中的細胞生長速率。在T-75燒瓶中培養(yǎng)的來自每個細胞因子處理組的細胞在匯合時收獲并計數(shù)，以根據(jù)最初的細胞接種數(shù)量來確定細胞的生長速率。圖3示出了微團的形成。在不存在培養(yǎng)基的情況下，將微團以1.5X105細胞 /20 μ 1/團直接接種于培養(yǎng)皿的表面上。將細胞孵育1. 5小時以產(chǎn)生足夠的細胞附著，并加入0.5mL/孔的完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)細胞7天，在3-4天時完全更換生長培養(yǎng)基。在7天孵育期末，用ImL dPBS/孔洗滌微團兩次并用10%福爾馬林溶液固定30分鐘。除去固定液并用 IN HCl中的1. O %阿爾新藍8GX以500 μ L/孔在4°C下將微團染色過夜。阿爾新藍染色示出了暴露于不同細胞因子條件下的軟骨細胞的微團培養(yǎng)中的氨基葡聚糖(GAG)分布。圖4示出了微團的GAG定量分析。氨基葡聚糖的定量分析可通過加入鹽酸胍 (Gu-HCl)來進行，其使得與阿爾新藍結合的蛋白聚糖分子的GAG鏈形成沉淀。用250μ1/ 孔的4Μ Gu-HCl對經(jīng)阿爾新藍染色的微團進行孵育。當大部分染色劑從微團中提取出來時， 除去溶液并在560nm下測量光密度。圖5示出了經(jīng)細胞因子處理的二維培養(yǎng)物中的細胞形態(tài)。在顯示約30-50%細胞匯合的時間點(接種后3天)采集軟骨細胞生長的數(shù)字圖像。觀察到的細胞因子處理組之間細胞分布、細胞大小和形態(tài)有所不同。以IOOx的放大倍率采集圖像。圖6示出了經(jīng)細胞因子處理的二維培養(yǎng)物中的細胞形態(tài)。在顯示約80-100%細胞匯合的時間點(接種后8天)采集軟骨細胞生長的數(shù)字圖像，之后立即收獲細胞以用于制備RNA、提取蛋白和進行微團培養(yǎng)。以IOOx的放大倍率采集圖像。
具體實施例方式如本文中所使用的，關于核酸、蛋白、蛋白片段或其衍生物的術語“生物活性”被定義為核酸或氨基酸序列模擬由該核酸或蛋白的野生型形式所引起的已知生物功能的能力。
如本文中所使用的，術語“結締組織”是連接和支持其他組織或器官的任何組織， 并且包括但不限于哺乳動物宿主的韌帶、軟骨、肌腱、骨和滑膜。如本文中所使用的，術語“結締組織細胞”和“結締組織的細胞”包括在結締組織中發(fā)現(xiàn)的分泌膠原細胞外基質的細胞，例如成纖維細胞、軟骨細胞(軟骨性細胞)和骨細胞 (成骨細胞/骨細胞)，以及脂肪細胞(脂細胞)和平滑肌細胞。優(yōu)選地，結締組織細胞為成纖維細胞、軟骨細胞和骨細胞。應認識到本發(fā)明能夠通過結締組織細胞的混合培養(yǎng)物以及單一類型的細胞來實施。還應認識到在將組織細胞注射到關節(jié)間隙中之前，可利用化合物或輻照對組織細胞進行預處理，以使得細胞在宿主生物體內穩(wěn)定表達所關注的基因。優(yōu)選地，當注射到受體生物體內時，結締組織細胞不會引起負免疫應答。應該理解，出于這方面的考慮可使用異源細胞，以及同源細胞以進行細胞介導的基因治療或體細胞治療。如在本文中所使用的，“結締組織細胞系”包括來自共同親代細胞的多種結締組織細胞。如在本文中所使用的，細胞的“減少”是指與在該部位發(fā)現(xiàn)的正常數(shù)量相比，細胞群減少。這意味著與該部位的正常細胞群相比，細胞群下降的百分比為例如至少10%、 20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %或90 %，或意味著該部位細胞的損傷或損耗。如在本文中所使用的，供體細胞和受體宿主的“組織相容性”是指它們共享足夠數(shù)量的組織相容性因子，以便于在宿主哺乳動物中接受移植并保持功能。尤其是，對于人類白細胞抗原(HLA)，例如A型、B型和C型HLA (I類)和DR型HLA (II類)而言，供體和受體應匹配。如在本文中所使用的，“透明軟骨”是指覆蓋關節(jié)表面的結締組織。僅通過舉例方式，透明軟骨包括但不限于關節(jié)軟骨、肋軟骨和鼻軟骨。特別是已知透明軟骨能夠自我更新、順應變化、并提供具有較小摩擦的穩(wěn)定運動。 發(fā)現(xiàn)即使透明軟骨在相同的關節(jié)內或在厚度、細胞密度、基質組成和力學性質不同的關節(jié)之間，也能保持相同的一般結構和功能。透明軟骨的一些功能包括對壓縮的驚人剛度、回彈性、和獨特的分配重量負荷的能力、使得對軟骨下骨的峰值應力最小的能力、以及優(yōu)異的耐久性?？傮w上和組織學上，透明軟骨呈抗變形的光滑堅固表面。軟骨的細胞外基質包含軟骨細胞，但缺少血管、淋巴管或神經(jīng)。保持軟骨細胞和基質間相互作用的復雜的、高度有序的結構在保持低水平代謝活動的同時，起到保持透明軟骨的結構和功能的作用。參考文獻 0' Driscoll, J. Bone JointSurg.，80A :1795_1812，1998 詳細描述了透明軟骨的結構和功能，其全部內容以引用方式結合于本文作為參考。如在本文中所使用的，“可注射的”組合物是指不包括各種三維支架、框架、網(wǎng)格或氈結構(felt structure)的組合物，該三維支架、框架、網(wǎng)格或氈結構可由任意材料制得或為允許細胞附著并允許細胞以多于一層生長的形狀，并且該結構通常被植入而非注射。在一種實施方式中，本發(fā)明的注射方法通常通過注射器來實施。然而?？墒褂萌我夥绞阶⑸渌P注的組合物。例如，也可以使用導管、噴霧器或溫度依賴性聚合物凝膠。如在本文中所使用的，術語“哺乳動物宿主”包括動物界的成員，包括但不限于人類。如在本文中所使用的，“混合的細胞”或“細胞的混合物”或“細胞混合物”是指多個細胞的組合，包括被所關注的被表達的基因轉染或轉導的細胞群和包括致敏細胞的至少一個其他細胞群。在本發(fā)明的一種實施方式中，混合的細胞可以是指多種結締組織細胞的組合，包括被編碼轉化生長因子β超家族成員的基因或DNA轉染或轉導的細胞，和未被編碼轉化生長因子β超家族成員的基因轉染或轉導的致敏細胞。通常，未被編碼轉化生長因子β超家族成員的基因轉染或轉導的致敏細胞與被TGF超家族基因轉染或轉導的細胞之比在約 3-20 1的范圍內。該范圍可包括約3-10 1。特別地，根據(jù)細胞的數(shù)量，該范圍可為約 10 1。然而，應該理解，不必將這些細胞的比例固定在任意特定范圍，只要這些細胞的組合在部分或完全缺損的關節(jié)中有效地產(chǎn)生透明軟骨即可。如在本文中所使用的，術語“患者”包括動物界的成員，包括但不限于人類。如在本文中所使用的，“藥學上可接受的載體”是指現(xiàn)有技術中已知的促進本發(fā)明的組合物的轉運效率并延長組合物的功效的任何載體。如在本文中所使用的，術語“致敏的”細胞是指已被活化或改變以表達特定基因的細胞。如在本文中所使用的，“體細胞”或“細胞”通常是指除卵細胞和精子以外的體內細胞。如在本文中所使用的，“儲存的”細胞是指混合細胞群的致敏細胞的組合物，包括給予至關節(jié)間隙之前單獨或共同儲存的致敏細胞。細胞可儲存于冷藏設備中?？商娲?， 可在約-70°C至約-196°C將細胞冷凍在液氮罐或等同的儲存設備中，以便保存細胞以供隨后給予至關節(jié)間隙?？衫靡阎桨笇毎M行解凍?？赏ㄟ^任意方式實施冷凍和解凍過程，只要細胞的活力和效能能夠得到優(yōu)化即可。如在本文中所使用的，術語“轉染”和“轉導”作為將DNA轉移至宿主細胞并隨后整合入受體細胞的染色體DNA中的特定方法被提及。實施本發(fā)明時，可使用任何方法將外源 DNA轉移至宿主細胞中，包括非病毒或病毒基因轉移方法，只要將外源基因引入到宿主細胞中并且該外源基因在宿主細胞中穩(wěn)定表達即可。因此，如本文中所使用的，術語“轉染的或轉導的”包括將基因遞送至細胞的任何方法，如磷酸鈣沉淀、DEAE葡聚糖、電穿孔、脂質體、 病毒介導等。如在本文中所使用的，“轉化生長因子-β (TGF-β)超家族”包括一組結構相關的蛋白質，其廣泛影響胚胎發(fā)育過程中的分化過程。該家族包括正常雄性發(fā)育所需的血 青苗勒 Φ 制物(Mullerian inhibiting substance, MIS) (Behringer 等人，Nature, 345 167，1990)、背腹軸形成和成蟲盤的形態(tài)發(fā)生所需的果蠅生存因子(drosophiIa decapentaplegic，DPP)基因產(chǎn)物(Padgett 等人，Nature，325 :81_84，1987)、位于卵(母細胞)的植物極的爪蟾Vg-I基因產(chǎn)物(Weeks等人，Cell，51 :861-867，1987)、能夠在爪蟾胚胎中誘導中胚層和早期結構形成(Thomsen等人，Cell,63 =485,1990)的活化素(Mason等人，Biochem, Biophys. Res. Commun.，135 :957-964,1986)、以及能夠誘導軟骨和骨重新形成 (Sampath等人，J. Biol. Chem.，265 :13198,1990)的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP，如 BMP_2、3、4、5、 6和7，成骨素，0P-1)。TGF-β基因產(chǎn)物能夠影響多種分化過程，包括脂肪生成、肌生成、軟骨生成、血細胞生成和上皮細胞分化。綜述請參見MaSSague，Cell 49 :437，1987，其全部內容以引用方式結合于本文作為參考。
TGF-β家族的蛋白最初作為大的前體蛋白合成，隨后在距C末端約110-140個氨基酸的一組殘基經(jīng)歷了蛋白酶切。蛋白的C末端區(qū)域均為結構上相關的，并且基于它們的同源性程度，可將不同的家族成員分類為不同的亞組。雖然在特定的亞組中同源性的范圍為70%至90%的氨基酸序列同一性，但亞組之間的同源性顯著較低，范圍通常僅為20%至 50%。在每種情況下，活性物質似乎都是C末端片段的二硫鍵連接的二聚體。對于大部分已研究過的家族成員，發(fā)現(xiàn)同源二聚體物質具有生物活性，但對于其他家族成員，如抑制素 (Ung 等人，Nature，321 :779,1986)和 TGF-β ‘ s (Cheifetz 等人，Cell，48 :409，1987)，也檢測到異源二聚體，并且這些似乎具有與各自的同源二聚體不同的生物學性質。TGF- β 基因超家族的成員包括 TGF- β 3、TGF- β 2、TGF- β 4 ( )、TGF- β 1、 TGF- β 5 (爪蟾)、ΒΜΡ-2、ΒΜΡ-4、果蠅 DPP、BMP-5、BMP-6、Vgrl、0P_l/BMP-7、果蠅 60A、GDF_1、 爪蟾 Vgf、BMP-3、抑制素-β Α、抑制素-β B、抑制素-α 和 MIS。在 Massague，Ann. Rev. Biochem. 67 :753-791,1998中討論了這些基因，其全部內容以引用方式結合于本文作為參考。優(yōu)選地，TGF-β基因超家族的成員為TGF-β或BMP。更優(yōu)選地，該成員為TGF-β 1、 TGF- β 2、TGF- β 3、ΒΜΡ-2、ΒΜΡ-3、ΒΜΡ-4、ΒΜΡ-5、ΒΜΡ-6 或 ΒΜΡ-7。最優(yōu)選地，該成員為人或豬 TGF-β 1 或 ΒΜΡ-2。致敏細胞療法本發(fā)明包括將致敏的細胞給予至哺乳動物所需的部位，以產(chǎn)生膠原或透明軟骨。 致敏的細胞通常為結締組織細胞，包括軟骨細胞或成纖維細胞。舉例來說，當原代軟骨細胞群傳代約3或4次時，其形態(tài)學通常變?yōu)槌衫w維軟骨細胞。隨著原代軟骨細胞的傳代，它們開始喪失其某些軟骨細胞的性質并開始出現(xiàn)成纖維軟骨細胞的性質。發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)當使用細胞因子例如來自TGF-β超家族的蛋白來孵育或“致敏”這些成纖維軟骨細胞時，細胞重新獲得其軟骨細胞的性質，包括產(chǎn)生膠原。這樣的致敏細胞包括成纖維軟骨細胞，已用TGFi3 1對其進行孵育，結果回復為II 型膠原生成軟骨細胞。在治療骨關節(jié)炎或軟骨再生時使用致敏細胞的一個優(yōu)點是容易產(chǎn)生可用的軟骨細胞以引入到需要生成軟骨的關節(jié)中或體內的其他部位，例如在脊柱的椎間盤中以產(chǎn)生膠原并另外維持軟骨基質。細胞可包括但不限于原代細胞或經(jīng)歷了約一至二十次傳代的細胞。細胞可以是結締組織細胞。細胞可包括經(jīng)歷了形態(tài)發(fā)生變化的細胞，其中致敏導致其恢復為原來細胞的性質。細胞可包括但不限于軟骨細胞、成纖維細胞或成纖維軟骨細胞。通過用細胞因子孵育細胞至少Ihr可發(fā)生致敏，優(yōu)選Ihr至兩周；1天至10天，5天至10天或5天至7天，然后可選地將細胞因子從細胞中分離，并將致敏的細胞注射到所關注的軟骨缺損部位這以再生軟骨，優(yōu)選透明軟骨。在一個方面，該細胞因子可以是TGF-β超家族的成員。尤其是，該細胞因子可以是TGF-β，并且尤其是TGF-β 1。存在于孵育混合物中的細胞因子的量可以為至少約lng/ml，約1至lOOOng/ml，約 1 至 750ng/ml，約 1 至 500ng/ml，約 1 至 400ng/ml，約 1 至 300ng/ml，約 1 至 250ng/ml，約 1 至 200ng/ml，約 1 至 150ng/ml，約 1 至 100ng/ml，約 1 至 75ng/ml，約 1 至 50ng/ml，約 10 至 500ng/ml，約 10 至 400ng/ml，約 10 至 300ng/ml，約 10 至 250ng/ml，約 10 至 200ng/ml, 約 10 至 150ng/ml，約 10 至 100ng/ml，約 10 至 75ng/ml，約 10 至 50ng/ml，約 15 至 500ng/ml,約 15 至 400ng/ml,約 15 至 300ng/ml,約 15 至 250ng/ml,約 15 至 200ng/ml,約 15 至 150ng/ml，約 15 至 100ng/ml，約 15 至 75ng/ml，約 15 至 50ng/ml，約 20 至 500ng/ml，約 20 至 400ng/ml，約 20 至 300ng/ml，約 20 至 250ng/ml，約 20 至 200ng/ml，約 20 至 150ng/ml, 約 20 至 100ng/ml，約 20 至 75ng/ml，約 20 至 50ng/ml，約 25 至 500ng/ml，約 25 至 400ng/ ml,約 25 至 300ng/ml,約 25 至 250ng/ml,約 25 至 200ng/ml,約 25 至 150ng/ml,約 25 至 100ng/ml，約 25 至 75ng/ml，約 25 至 50ng/ml，約 30 至 500ng/ml，約 30 至 400ng/ml，約 30 至 300ng/ml，約 30 至 250ng/ml，約 30 至 200ng/ml，約 30 至 150ng/ml，約 30 至 100ng/ml, 約 30 至 75ng/ml，約 30 至 50ng/ml，約 35 至 500ng/ml，約 35 至 400ng/ml，約 35 至 300ng/ ml,約 35 至 250ng/ml,約 35 至 200ng/ml,約 35 至 150ng/ml,約 35 至 100ng/ml,約 35 至 75ng/ml，約 35 至 50ng/ml，約 40 至 500ng/ml，約 40 至 400ng/ml，約 40 至 300ng/ml，約 40 至 250ng/ml ,約 40 至 200ng/ml ,約 40 至 150ng/ml ,約 40 至 100ng/ml ,約 40 至 75ng/ml，或約 40 至 50ng/ml。實施本發(fā)明的一種方法可包括用細胞因子孵育細胞特定的一段時間以產(chǎn)生致敏細胞并可選地將細胞因子從細胞中分離，并且將致敏的細胞注射到所關注的結締組織缺損部位中?？商娲?，可使用所關注的細胞因子孵育細胞一段時間，并將該組合給予至結締組織缺損部位而無需分離出細胞因子。應當理解，雖然在本發(fā)明的致敏細胞治療方案中，例如可將支架或框架以及各種外來組織的物質一起植入，但在本發(fā)明的注射系統(tǒng)中也可以不包括這些支架或組織。在一種優(yōu)選的實施方式中，在本發(fā)明的體細胞療法中，本發(fā)明涉及一種將致敏的結締組織細胞群注射到關節(jié)間隙中的簡單方法。本領域普通技術人員應當理解，用于治療人類患者的細胞來源可以是患者自身的結締組織細胞，如同源的成纖維細胞或軟骨細胞，但也可以使用異源細胞以及異種細胞而不考慮細胞的組織相容性?？商娲?，在本發(fā)明的一種實施方式中，可利用與哺乳動物宿主進行了組織相容性匹配的異源細胞。為了進一步詳細描述，確定供體和患者的組織相容性， 以便于將組織相容的細胞給予哺乳動物宿主。出乎意料的是，與未經(jīng)處理的細胞相比，細胞因子處理的細胞的倍增時間有所降低。參見圖2。經(jīng)過處理的細胞的壽命也有所增加。經(jīng)過處理的細胞比未經(jīng)處理的細胞存活時間更長，倍增時間更快。經(jīng)處理的細胞在包被和未包被膠原的燒瓶中增殖超過8代；然而在無膠原包被的燒瓶中，未經(jīng)處理的細胞的生長在第7代(p7)停止。無論如何，容納經(jīng) FGF-TGFii 1處理的細胞的膠原包被的燒瓶顯示出最強的生長。即使在8代之后，也沒有跡象表明細胞的生長減緩。從包被和未包被膠原的燒瓶中收獲細胞后，將這些細胞轉移至多孔板以制備微團，直接用阿爾新藍對其進行染色。致敏細胞的倍增時間可減少約0. 8至約0. 2倍；約0. 7至約0. 3倍；約0. 6至約 0. 4倍；或約0. 5倍。當減少0. 5倍時，意味著經(jīng)細胞因子處理的細胞的倍增時間是未孵育的對照細胞的一半。在這方面，細胞因子如僅僅TGF-β 1、僅TGF-β 3、ΒΜΡ2以及胰島素或ΒΜΡ2-胰島素和Τ3 —起或FGF-TGF-β 1組合導致致敏細胞的倍增時間顯著減少。對于某些細胞因子孵育，包被和未包被膠原的燒瓶也提供了明顯不同的結果。參見圖2。
混合細胞的替代療法本發(fā)明還包括將細胞混合物給予哺乳動物的對其有需要的部位，以產(chǎn)生膠原或透明軟骨，其中第一細胞群用所關注的基因進行轉染或轉導，該基因在哺乳動物中所關注的部位進行表達。由于嘗試了體細胞基因治療，本發(fā)明提供包括第二細胞群，其為未經(jīng)所關注基因轉染或轉導的致敏細胞，并且該細胞在受傷或患病或其他所關注的虛弱的部位發(fā)生內源性減少。尤其是，在使用致敏細胞的混合細胞治療方法中，本發(fā)明公開了用于將所關注的 DNA序列遞送至哺乳動物宿主的結締組織細胞的體外和體內技術。體外技術涉及靶結締組織細胞的培養(yǎng)，將所關注的DNA序列、DNA載體或其他遞送載體的體外轉染或轉導到結締組織細胞中，隨后將修飾的結締組織細胞移植入哺乳動物宿主的靶關節(jié)中，從而影響所關注的基因產(chǎn)物的體內表達。應當理解，雖然在本發(fā)明的基因治療方案中，例如可將支架或框架以及各種外來組織的物質共同植入，但本發(fā)明的注射系統(tǒng)中也可以不包括這些支架或組織。在一種優(yōu)選的實施方式中，在細胞介導的基因療法或體細胞療法中，本發(fā)明涉及一種將轉染或轉導的結締組織細胞群注射至關節(jié)間隙中，以使外源性TGF超家族蛋白在關節(jié)間隙中表達的簡單方法。在說明書全文中所公開的使用致敏細胞的混合細胞方法治療結締組織病的體外方法包括最初產(chǎn)生含有編碼蛋白或其生物活性的片段的重組病毒或質粒載體。然后使用該重組載體來感染或轉染體外培養(yǎng)的結締組織細胞群，導致產(chǎn)生包含該載體的結締組織細胞群。然后以與致敏結締組織細胞的混合物一起或單獨將這些結締組織細胞移植到哺乳動物宿主的靶關節(jié)間隙中以在關節(jié)內形成混合物，從而影響關節(jié)間隙內蛋白或蛋白片段的隨后表達。所關注的DNA序列的表達對于大幅降低與結締組織病相關的至少一種有害關節(jié)病變是有用的。在混合細胞方法中，在使用基因轉染的細胞的情況下，本發(fā)明的方法包括采用能夠編碼轉化生長因子β超家族成員的基因，或其生物學活性衍生物或片段以及可選擇的標記，或其生物學活性衍生物或片段作為基因。本發(fā)明的又一種實施方式包括采用能夠編碼至少一種轉化生長因子β超家族成員的基因或其生物學活性衍生物或片段作為基因，并采用本領域技術人員已知的、遞送后能夠在靶細胞或組織中穩(wěn)定保持的任何DNA質粒載體作為載體，而與所使用的遞送方法無關。本發(fā)明的另一種實施方式提供了一種將編碼產(chǎn)物的至少一個基因引入到至少一種結締組織細胞中以用于對哺乳動物宿主進行治療的方法。該方法包括采用非病毒方式將編碼該產(chǎn)物的基因引入結締組織細胞。更具體地，該方法包括脂質體包封、磷酸鈣共沉淀、 電穿孔、或DEAE-葡聚糖介導，并且包括采用能夠編碼轉化生長因子超家族成員的基因或其生物學活性衍生物或片段，以及可選的標記或其生物學活性衍生物或片段作為基因。本發(fā)明的另一種實施方式提供了另一種將編碼產(chǎn)物的至少一個基因引入到少一種結締組織細胞中以用于對哺乳動物宿主進行治療的方法。該另一種方法包括采用利用病毒將DNA載體分子遞送至靶細胞或組織的生物學方法。優(yōu)選地，病毒是假病毒，已對基因組進行改變以使假病毒僅能夠遞送和在靶細胞中穩(wěn)定保持，但不保留其在靶細胞或組織中復制的能力。該改變的病毒基因組進一步通過重組DNA技術來操縱，以使得該病毒基因組起到包含將在靶細胞或組織中表達的所關注的異源基因的DNA載體分子的作用。本發(fā)明的另一種優(yōu)選方法涉及在體內將TGF-β超家族基因直接遞送與通過使用逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒(AAV)載體或單純皰疹病毒(HSV)載體而致敏的細胞共同遞送至哺乳動物宿主的結締組織。換言之，所關注的編碼功能性TGF-β或BMP蛋白或蛋白片段的DNA序列亞被克隆到各病毒載體中。然后，使含有TGF-β或BMP的重組病毒生長至足夠的效價并將其引入到關節(jié)間隙中，優(yōu)選通過關節(jié)內注射引入。將DNA分子呈遞至關節(jié)的靶結締組織細胞的方法包括但不限于，將DNA分子包封在陽離子脂質體中、在逆轉錄病毒或質粒載體中對所關注的DNA序列進行亞克隆、或將DNA 分子本身直接注射至關節(jié)中。DNA分子，無論以何種形式呈遞至膝關節(jié)，優(yōu)選作為DNA載體分子，或作為重組病毒DNA載體分子或重組DNA質粒載體分子進行呈遞。所關注的異源基因的表達通過直接在異源基因的編碼區(qū)域的上游插入在真核細胞中具有活性的啟動子片段來確保。本領域普通技術人員可利用已知的載體構建策略和技術來確保DNA分子進入結締組織后進行適當水平的表達。在一種優(yōu)選實施方式中，將未致敏的成纖維細胞和軟骨細胞在體外培養(yǎng)，以便隨后利用其與致敏細胞一起作為基因治療的遞送系統(tǒng)。本申請不限于使用所公開的具體結締組織是顯而易見的?？梢岳闷渌w外培養(yǎng)技術的組織來源?？稍陬A防性和治療性處理骨關節(jié)炎和創(chuàng)傷愈合中采用本發(fā)明的使用基因或細胞因子的方法。本發(fā)明不限于僅用于治療膝關節(jié)的預防性和治療性應用是顯而易見的?？衫帽景l(fā)明的預防性和治療性的處理在由軟骨的撕裂或退化引起的損傷而導致的任何易患病的關節(jié)或任何損傷中的骨關節(jié)炎。在本發(fā)明的又一種實施方式中，在給予至關節(jié)間隙之前需要儲存致敏的細胞。此外，轉染或轉導的細胞可單獨儲存，或以混合物形式儲存，但不必同時進行。此外，儲存的持續(xù)時間不必為相同時間段。因此，單獨儲存的細胞可在注射之前進行混合?？商娲?，細胞可單獨儲存和注射以在關節(jié)間隙中形成混合物。本領域技術人員應知曉，這些細胞可冷凍儲存于冷凍劑中，例如但不限于液氮中約百分之十的DMSO或等同的儲存介質。結締組織是難以進行靶向治療的器官。本領域中已知靜脈及口服途徑給藥提供的進入這些結締組織的效果較差，并且具有將哺乳動物宿主全身性的暴露在治療藥物中的缺點。更具體而言，已知的將蛋白通過關節(jié)內注射至關節(jié)提供了直接進入關節(jié)的效果。然而， 大部分以包封蛋白形式存在的所注射藥物在關節(jié)內具有較短的半衰期。本發(fā)明通過將致敏細胞引入哺乳動物宿主的結締組織而解決了這些問題，該致敏細胞可包括軟骨細胞或成纖維細胞和/或編碼用于治療哺乳動物宿主的蛋白的基因?？墒褂镁哂锌龟P節(jié)炎特性的編碼蛋白的基因。致敏的細胞可用于治療骨關節(jié)炎，骨關節(jié)炎是一種由損壞并最終失去一個或多個關節(jié)的軟骨所導致的一種關節(jié)炎類型。如果僅通過將致敏細胞而不包括各種物理裝置例如支架或任意其他三維結構注射至關節(jié)就能夠治愈退化性關節(jié)炎或骨關節(jié)炎或任意軟骨損傷，那么就可以對患者進行便利的治療而無需接受大手術。椎間盤致敏細胞也可用于再生椎間盤。椎間盤組成脊柱長度的四分之一。在寰椎(Cl)、 樞椎(以)和尾骨間沒有椎間盤。椎間盤沒有血管，因此其依賴終板來擴散所需的營養(yǎng)。終板的軟骨層將椎間盤固定在適當?shù)奈恢蒙?。椎間盤是纖維軟骨的緩沖，作為脊柱的減震系統(tǒng)，其可起到保護椎骨、大腦和其他結構(即神經(jīng))的作用。椎間盤允許某些脊椎的運動伸展和彎曲。單個椎間盤的運動十分有限-然而當若干椎間盤產(chǎn)生合力時，可產(chǎn)生相當大的運動。椎間盤由纖維環(huán)和髓核組成。纖維環(huán)是一種堅固的由薄板(lamellae)組成的輻射狀輪狀結構；同心的薄層膠原纖維與脊椎終板相連。薄層的取向具有不同的角度。纖維環(huán)包圍著髓核。雖然纖維環(huán)和髓核均由水、膠原和蛋白聚糖(PG)組成，但髓核中液體(水和PG) 的量是最大的。PG分子是很重要的，因為其吸引并保持水分。髓核含有水合凝膠樣物質，能抵抗壓縮。一天中髓核中水的含量取決于活動情況。隨著人們年齡的增長，髓核開始脫水， 這限制了它的減震能力。纖維環(huán)隨年齡增大而變弱并損傷。雖然在一些人中這可能不會引起疼痛，但是在其他人中這些原因中的一種或兩種會引起慢性疼痛。由于脫水的髓核不能起到減震作用而造成的疼痛稱為軸向疼痛或椎間盤間隙疼痛。它一般是指由于退行性椎間盤疾病而導致的髓核逐漸脫水。當纖維環(huán)由于受傷或老化過程而損傷時，髓核就開始從纖維環(huán)的損傷部位被擠壓出去。這稱為椎間盤突出。在每個椎間盤的背面，主要脊神經(jīng)沿著脊柱延伸至不同器官、組織、四肢等。通常椎間盤脫出會擠壓這些神經(jīng)(神經(jīng)挾捏)，引起放射性痛、麻木、刺痛和力量和/或運動范圍的減小。此外， 包含炎性蛋白的內核凝膠與神經(jīng)接觸也會引起明顯疼痛。神經(jīng)相關的疼痛稱為神經(jīng)根痛。椎間盤脫出有許多名稱，并且這些名稱對于不同醫(yī)學專業(yè)人員而言意味著不同的事件。椎間盤脫出、椎間盤破裂或椎間盤膨出都可以指相同的疾病。椎間盤突出至相鄰椎骨被稱為施莫耳(氏)結(schmorl ‘ s node)。以下實施例以對本發(fā)明說明的方式而并非以限制的方式提供。實施例實施例1-致敏軟骨細胞的制備實施例1. 1-細胞培養(yǎng)和處理本研究中所使用的細胞來自在體外長時間培養(yǎng)的原代人軟骨細胞。不管它們的來源而假定這些細胞具有成纖維細胞的形態(tài)和表型。在培養(yǎng)至大約第七次傳代時進行實驗。 細胞以兩種不同的培養(yǎng)形式接種單層和微團。培養(yǎng)基由含4. 5g/L葡萄糖，并輔以10%胎牛血清(Lonza)和L-谷氨酰胺的DMED(Lonza)組成。在37°C，5% CO2的環(huán)境下孵育以持續(xù)處理。對于幾種孵育時間的長度，在培養(yǎng)過程的不同時間點將細胞暴露于多個濃度的 TGF- β 1 中(R&D Systems)。實施例1. 2-單層培養(yǎng)將軟骨細胞以5X IO4細胞/孔接種至6-孔膠原包被板中(BioCoat， BDBiosciences)。在接種前用濃度為100ng/mL的TGF-β 1對細胞致敏6小時或者在研究過程中用濃度為Ing/mL的TGF-β 1進行孵育。除了這兩種處理，以1 3的比例制備TGF-βΙ 產(chǎn)生細胞和人軟骨細胞的共培養(yǎng)物，以5Χ IO4細胞/孔接種并在三周的研究過程中進行類似的檢查。可每周收獲細胞以制備RNA及染色。還進行了一個更短的為期一周研究。以3Χ IO3細胞/cm2將軟骨細胞接種至膠原包被的6-孔板的每個孔中。四個處理組代表在不同時間點添加TGF-β 1 : 小時、48小時、72小時，以及在為期一周的研究末期收獲細胞之前的兩個36小時的間隔。實施例1. 3-微團培養(yǎng)制備細胞懸液以使接種密度為3X IO5細胞/15 μ L液滴。細胞液滴置于24-孔膠原包被板的孔中心(BioCoat)。一旦確定微團，將細胞團在37°C孵育1. 5小時并補充ImL 完全培養(yǎng)基。在接種微團之前，通過用lOng/mL或50ng/mL的TGF-β 1持續(xù)處理6小時或 18小時來致敏細胞。除了這四個處理組，在研究持續(xù)過程中，將兩組軟骨細胞暴露于濃度為Ing/mL或lOng/mL的TGF-β 1中。最后的實驗組由比例為3 1的TGF-β 1產(chǎn)生細胞與未處理的軟骨細胞組成。培養(yǎng)微團達四周。實施例1. 4-阿爾新藍染色阿爾新藍(AB)，也稱為阿爾新藍8GX (Alcian blue 8GX)、國固藍1 Qngrain blue 1)和C. I. 74240,是一種含銅的酞菁染料。該染料可將酸性粘多糖和氨基葡聚糖染色，因此是最廣泛使用的陽離子染料之一；染色的部分為藍色至藍綠色。它能夠與H&E染色法和van Gieson染色法結合。它通過靜電引力與負電荷的大分子結合。用于洗滌結合染料的電解質濃度的逐漸增加可選擇性的鑒定中性、硫酸化和磷酸化粘多糖。阿爾新藍染色與每周細胞收獲相結合，以確定在培養(yǎng)過程中GAG聚集的水平。將所有培養(yǎng)基從孔中吸出，然后以4mL PBS/孔(CellgroJediatech)洗滌兩次。然后用10% 的福爾馬林(Sigma)對培養(yǎng)物固定15分鐘，24-孔板為500 μ 1/孔，6-孔板為800 μ 1/孔。 lmL-2mL過濾的阿爾新藍8-GX(Sigma，1.0%，在3%乙酸中，ρΗ 1.0)加入每個孔中，室溫下染色過夜。染色之后用3%的乙酸2-4mL/孔對每個孔漂洗兩次，用PBS 2_4mL/孔對每個孔漂洗兩次，每次洗滌之間均將漂洗液完全抽出。觀察細胞染色強度和細胞形態(tài)。結果如圖 1所示。實施例1. 5-RT-PCR利用TRIzol (Invitrogen)的苯酚氯仿萃取程序從每周收獲的細胞中分離RNA。使用SuperscriptTM逆轉錄酶(Invitrogen)對分離出的RNA進行逆轉錄，以獲得每個細胞樣品的cDNA結構。使用由IDT合成的下列引物進行聚合酶鏈反應膠原II α 1 正向引物 5‘ -GACCTCGTGGCAGAGATGGAG-3‘ (SEQ IDNO 1)，膠原II α 1 反向引物 5‘ -AACCTCTGTGACCTTTGACACCAG-3‘ (SEQID NO 2)，膠原I α 1 正向引物 5 ‘ -TGTGGCCCAGAAGAACTGGTACAT-3 ‘ (SEQID NO 3)，膠原I α 1 反向引物 5 ‘ -AAAGGAGCAGAAAGGGCAGCATTG-3 ‘ (SEQID NO 4)，聚集蛋白聚糖正向引物5' -TTCAGTGGCCTACCAAGTGGCATA-3‘ (SEQ ID NO 5)，聚集蛋白聚糖反向引物5' -ACATCACTGGTGGTGGTGGATTCT-3‘ (SEQ ID NO 6),β-鈣粘蛋白正向引物 5' -TGGCCATCTTTAAGTCTGGAGGCA-3 ‘ (SEQ ID NO 7),β -鈣粘蛋白反向引物 5 ‘ -GATTTGCGGGACAAAGGGCAAGAT-3 ‘ (SEQ ID NO :8)。以下條件用于在溫度循環(huán)器中進行PCR 在95°C下預變性2分鐘，接著在95°C下進行為期45秒的35個循環(huán)，在62. 5°C下退火1分鐘，在72°C下延伸1分鐘。在結束所有循環(huán)時將最終延伸期設定為在72°C下進行5分鐘。最終PCR產(chǎn)物的凝膠電泳以β-肌動蛋白為對照進行，以確定TGF-β 1處理的軟骨細胞的相對表型基因水平。實施例2-致敏細胞的進一步制備實施例2. 1-單層細胞培養(yǎng)
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將兩瓶hChonJ第五代(p5)軟骨細胞QX IO6細胞/瓶)解凍并以細胞接種密度為 5 X IO3細胞/cm2接種于偶數(shù)個膠原包被和無膠原包被的T-75燒瓶中。最初用完全培養(yǎng)基 DMEM(Lonza cat. no.)，輔以 10% FBS (Lonza, cat. no. 14-507F)和 L-谷氨酰胺(Lonza， cat. no. 17-605E)進行細胞培養(yǎng)。實施例2. 2-細胞因子處理在本研究中使用七個不同的細胞因子處理組。細胞接種后對小時，用12mL 添加了細胞因子的培養(yǎng)基替換所有燒瓶中的培養(yǎng)基。細胞因子處理組(表1)如下 50ng/mL TGF β 1(eBioscience 或 Promogen),200ng/mLBMP_2(eBioscience)禾口 15 μ g/ mL 胰島素(Sigma Aldrich)，200ng/mLBMP_2(eBioscience)，15 μ g/mL 胰島素(Sigma Aldrich)，和 IOOnM 3,3 ‘，5-三碘-L-甲狀腺原氨酸(T3) (Sigma Aldrich)，IOng/ mL FGF (eBioscience)禾口 TGF β 1 (eBioscience 或 Promogen),禾口 20ng/mL TGF β 3 (Sigma Aldrich)。兩個膠原包被細胞的T-75燒瓶和兩個未包被的T-75燒瓶用作陰性處理對照， 12mL的完全DMEM。每個處理組的細胞培養(yǎng)基每3_4天進行更換。圖2也示出了經(jīng)細胞因子處理的二維培養(yǎng)基的細胞生長率。在匯合時收獲來自每個細胞因子處理組的T-75燒瓶中培養(yǎng)的細胞并計數(shù)，以根據(jù)最初接種數(shù)量確定細胞生長速率。表1細胞因子研究的處理條件比較
細胞因子組縮寫成分濃度TGF β 1TGF-bl eTGF3150 ng/mLTGF β 1TGF-bl ρTGF3150 ng/mLΒΜΡ2&胰島素BIBMP2200 ng/mL胰島素15 pg/mL·ΒΜΡ2、胰島素&Τ3BITBMP2200 ng/mL胰島素15 pg/mL·T3100 nMFGF&TGFpiFGF-TGF-bl—eFGF10 ng/mLTGF3150 ng/mLFGF&TGFpiFGF-TGF-bl_pFGF10 ng/mLTGFpi50 ng/mLTGF β3TGF-b3TGF3320 ng/mL陰性對照0————圖5示出了經(jīng)細胞因子處理的二維培養(yǎng)基中的細胞形態(tài)。在顯示約30-50%細胞匯合的時間點(接種后3天)，采集軟骨細胞生長的數(shù)字圖像。對細胞分布、細胞大小和形態(tài)學的觀察數(shù)據(jù)在細胞因子處理的組間有所不同。在IOOx放大倍率下采集圖像。圖6示出了經(jīng)細胞因子處理的二維培養(yǎng)基中的細胞形態(tài)。收獲細胞以制備RNA、提取蛋白和進行微團培養(yǎng)之前，在顯示約80-100%細胞匯合的時間點(接種后8天)，采集軟骨細胞生長的數(shù)字圖像。在IOOx放大倍率下采集圖像。實施例2. 3-第二單層擴增培養(yǎng)的亞培養(yǎng)當達到匯合后，由實施例2. 2獲得的一部分細胞用2mL/燒瓶的Ix胰蛋白酶-維爾烯(EDTA)在37°C下處理3-4分鐘。在IOOx的顯微鏡下檢查細胞以確定完全附著。每個燒瓶中加入8mL完全培養(yǎng)基以使胰蛋白酶失活。從總細胞懸液中除去30 μ L的細胞并加入30 μ L臺盼藍以用于細胞計數(shù)。計算細胞濃度后，將2. 25X IO5個細胞加入至每個燒瓶以使第二次擴培的最終細胞接種密度為3Χ IO3個細胞/cm2。亞培養(yǎng)的細胞經(jīng)歷與在實施例 2. 2中相同的細胞因子處理，以確定在從實施例2. 2獲得的單層培養(yǎng)物中，細胞因子對結締組織細胞的影響(數(shù)據(jù)未示出)。實施例2. 4-以微團培養(yǎng)形式的細胞接種根據(jù)之前在實施例2. 2中提出的細胞因子處理方案，從實施例2. 2獲得的一部分細胞接種至M孔膠原包被或無膠原包被的培養(yǎng)板。允許每個細胞懸液中有一定數(shù)量的微團，并且確定為10到對個微團。當計算出每個微團為1.5X IO5個細胞時，將該體積從細胞懸液中移至新離心管中。細胞在1500rpm，10°C下離心7分鐘。抽出上清液，以允許20 μ L/ 微團的體積將剩下的細胞沉淀重懸浮在完全培養(yǎng)基中。以20yL體積( 1.5X105個細胞)直接將微團移至孔的裸露表面，并在37°C，5% C02下孵育約1小時。在1小時孵育期后，向每個孔中加入500 μ L的培養(yǎng)基、細胞因子條件化培養(yǎng)基或陰性對照完全培養(yǎng)基。將微團培養(yǎng)7天后，收獲以得到RNA和蛋白含量及阿爾新藍染色并隨后進行GAG定量分析。圖3示出了微團的形成。在無培養(yǎng)基存在下，將微團以1. 5X IO5細胞/20 μ 1/微團直接接種于培養(yǎng)皿的表面。細胞孵育1. 5小時以發(fā)生足夠的細胞附著，并以0. 5mL/孔加入完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)細胞7天，在3-4天時完全培養(yǎng)基替換生長培養(yǎng)基。在7天孵育期末， 用ImL dPBS/孔將微團洗滌兩次并用10%福爾馬林溶液固定30分鐘。除去固定液并用IN HCl中的1. 0%阿爾新藍8GX以500 μ L/孔在4°C下將微團染色過夜。阿爾新藍染色表明當暴露于不同細胞因子條件下，軟骨細胞的微團培養(yǎng)中氨基葡聚糖(GAG)的分布。實施例2. 5-細胞懸液的RNA制備和蛋白提取將在實施例2. 2中獲得的細胞的剩余細胞懸液等分，使用所測量的體積，可計算每份預備體積中的細胞數(shù)。細胞預備懸液在1500rpm，l(TC下離心7分鐘。用4mL PBS介質洗滌沉淀并再次離心。抽出最終洗滌的液體，用于RNA和蛋白提取細胞沉淀。對于RNA制備，采用標準的苯酚-氯仿提取技術。對于蛋白提取，使用RIPA緩沖液(Sigma Aldrich)使細胞溶解，并在液氮中迅速冷凍。使用來自實施例2. 3所述的亞培養(yǎng)的細胞，重復進行RNA 的制備以及蛋白的提取和分析。實施例2. 6-微團RNA的制備和蛋白的提取在一周的培養(yǎng)期后，將微團培養(yǎng)皿從孵育器中取出，并同時進行RNA、蛋白和阿爾新藍染色處理。用ImL dPBS將每個孔溫和洗滌兩次。使用標準苯酚氯仿提取法對留下的一半微團進行RNA制備。其余的微團用于利用RIPA裂解緩沖液以進行蛋白提取并將樣品在液氮中迅速冷凍并長期儲存于-80°C。也可使用實施例2. 3的亞培養(yǎng)細胞進行微團接種。 也使用這些微團重復進行RNA和蛋白的提取和分析，并且結果證實了與從實施例2. 2中獲得的單層細胞接種的微團的結果。實施例2. 7-阿爾新藍染色在IN HCl溶液中制備1. 0%的阿爾新藍-8GX染色劑并過濾以除去顆粒碎片。僅保留3-4個微團用于染色。以ImL dPBS對每個孔的微團溫和洗滌兩次。將最終洗滌溶液從每個孔中完全除去。以250yL/孔加入10%的福爾馬林以固定每個微團，將板在室溫下孵育15-30分鐘。將固定液從每個孔中完全吸出，并以50(^17孔加入1%阿爾新藍-86父染色劑，4°C下孵育過夜。孵育期后除去染色溶液并以ImL dPBS/孔洗滌微團兩次。采集微團的數(shù)字圖像。以記錄每個孔中染色的分布。實施例2. 8-GAG定量分析以250 μ L/孔加入4M鹽酸胍(Gu-HCl)并在4°C下孵育最短Ihr至18hr過夜，以確保完全提取出染色劑。從每個孔中將100 μ L的溶液移出并轉移至96孔測定板以在560nm 下觀察。用IOOyL的4M Gu-HCl作為空白。圖4示出了了微團的GAG定量分析。氨基葡聚糖的定量分析可通過加入鹽酸胍(Gu-HCl)進行，其與阿爾新藍結合的蛋白聚糖分子的GAG 鏈形成沉淀。用250μ1/孔的4M Gu-HCl對阿爾新藍染色的微團進行孵育。當大部分染色劑從微團中提取出來時，移去溶液并在560nm下測量光密度。實施例2. 9-基因表達分析通過寡核苷酸dT作為引物的mRNA (0. 5-1 μ g，根據(jù)RNA濃度)的逆轉錄獲得互補 DNA(CDNA)0在溫度循環(huán)器中以20 μ L的體積進行逆轉錄反應。對若干軟骨型基因的表達水平(表幻進行分析。對單層細胞和微團以及亞培養(yǎng)的單層細胞和來自亞培養(yǎng)細胞的微團均進行基因表達分析，結果彼此印證。表2所關注基因的引物
權利要求
1.一種組合物，包含致敏的結締組織細胞及其藥學上可接受的載體。
2.根據(jù)權利要求1所述的組合物，其中，所述細胞為成纖維細胞、軟骨細胞或成纖維軟骨細胞。
3.根據(jù)權利要求2所述的組合物，其中，所述細胞為人類細胞。
4.根據(jù)權利要求1所述的組合物，所述組合物是可注射的。
5.一種用于在約-70°C至約_196°C的溫度下儲存細胞的儲存容器，其中包含如權利要求1所述的組合物。
6.一種刺激哺乳動物中靶部位處軟骨再生的方法，包括(i)用包含細胞因子的組合物孵育結締組織細胞以產(chǎn)生致敏細胞；(ii)可選地從所述結締組織細胞中分離所述細胞因子；和(iii)將治療有效量的所述致敏細胞注射到希望生成軟骨的靶關節(jié)部位中，其中所述靶部位處的所述結締組織細胞的內源性存在形式減少，并且其中所述靶部位處的所述致敏細胞的存在刺激軟骨的再生。
7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中，所述結締組織細胞為成纖維細胞、軟骨細胞或成纖維軟骨細胞。
8.根據(jù)權利要求7所述的方法，其中，所述軟骨細胞為原代人軟骨細胞。
9.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中，所述細胞因子是屬于TGF-β超家族的成員。
10.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中，所述結締組織細胞孵育約1小時至約40小時。
11.根據(jù)權利要求9所述的方法，其中，所述細胞因子為TGF-β。
12.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中，所述細胞因子的存在量為至少lng/ml。
13.根據(jù)權利要求1所述的組合物，進一步包含由希望被表達的基因轉染或轉導的第二群哺乳動物細胞。
14.一種混合的細胞組合物，包含產(chǎn)生透明軟骨的有效量的(a)第一群致敏的軟骨細胞或成纖維細胞；(b)第二群成纖維細胞或軟骨細胞，其已被編碼所述TGF-β超家族成員的基因轉染或轉導；和(c)其藥學上可接受的載體。
15.根據(jù)權利要求14所述的組合物，其中，所述基因為TGF-β1、TGF-β 2、TGF-β 3、 ΒΜΡ-2、ΒΜΡ-3、ΒΜΡ-4、ΒΜΡ-5、ΒΜΡ-6、ΒΜΡ-7 或 ΒΜΡ-9。
16.根據(jù)權利要求14所述的組合物，其中，所述第一群致敏細胞和已被編碼TGF-β超家族成員的基因轉染或轉導的所述第二群成纖維細胞或軟骨細胞的比例為約1-20 1。
17.根據(jù)權利要求16所述的組合物，其中，所述比例約為1-10 1。
18.根據(jù)權利要求16所述的組合物，其中，所述比例約為1-3 1。
19.根據(jù)權利要求14所述的組合物，其中，對由基因轉染或轉導的所述第二細胞群進行輻照。
20.根據(jù)權利要求14所述的組合物，其中，所述第一細胞群和所述第二細胞群來自相同來源的生物體。
21.根據(jù)權利要求14所述的組合物，其中，所述第一細胞群和所述第二細胞群來自不同來源的生物體。
22.—種產(chǎn)生混合細胞組合物的方法，包括(A)產(chǎn)生第一細胞群，包括以下步驟(i)用包含細胞因子的組合物孵育結締組織細胞以產(chǎn)生第一群致敏細胞；和 ( )可選地從所述結締組織細胞中分離所述細胞因子；(B)產(chǎn)生第二細胞群，包括以下步驟(i)產(chǎn)生重組載體，其包含可操作地連接于啟動子的編碼治療蛋白的DNA序列； ( )用所述重組載體對細胞群進行體外轉染或轉導以產(chǎn)生所述第二細胞群；和(C)將所述第一細胞群和所述第二細胞群混合在一起以產(chǎn)生混合細胞組合物。
23.一種刺激哺乳動物中靶部位處的軟骨再生的方法，包括(A)產(chǎn)生第一細胞群，包括以下步驟(i)用包含細胞因子的組合物孵育結締組織細胞以產(chǎn)生第一群致敏細胞；和 ( )可選地從所述結締組織細胞中分離所述細胞因子；(B)產(chǎn)生第二細胞群，包括以下步驟(i)產(chǎn)生重組載體，其包含可操作地連接于啟動子的編碼治療蛋白的DNA序列； ( )用所述重組載體對細胞群進行體外轉染或轉導以產(chǎn)生所述第二細胞群；和(C)將治療有效量的所述第一細胞群和所述第二細胞群的混合物注射到希望生成軟骨的靶關節(jié)部位中，其中所述靶部位處的所述結締組織細胞的內源性存在形式減少，并且其中所述靶部位處的細胞混合物的存在刺激軟骨的再生。
24.根據(jù)權利要求23所述的方法，其中，所述基因為TGF-β1、TGF-β 2, TGF-β 3, ΒΜΡ-2、ΒΜΡ-3、ΒΜΡ-4、ΒΜΡ-5、ΒΜΡ-6 或 ΒΜΡ-7。
25.根據(jù)權利要求23所述的方法，其中，所述第一細胞群和所述第二細胞群與所述宿主受體同源。
26.根據(jù)權利要求23所述的方法，其中，所述第一細胞群和所述第二細胞群與所述宿主受體異源。
27.根據(jù)權利要求23所述的方法，其中，所述第一細胞群和所述第二細胞群與所述宿主受體異種。
28.根據(jù)權利要求23所述的方法，其中，所述重組載體為病毒載體。
29.根據(jù)權利要求23所述的方法，其中，所述重組載體為質粒載體。
30.根據(jù)權利要求23所述的方法，其中，所述細胞在移植前被儲存起來。
31.根據(jù)權利要求30所述的方法，其中，所述細胞在移植前冷凍儲存。
32.—種治療骨關節(jié)炎的方法，包括(A)產(chǎn)生第一細胞群，包括以下步驟(i)用包括細胞因子的組合物孵育結締組織細胞以產(chǎn)生第一群致敏細胞；和 ( )可選地從所述結締組織細胞中分離所述細胞因子；(B)產(chǎn)生第二細胞群，包括以下步驟(i)生成重組載體，其包括可操作地連接于啟動子的編碼治療蛋白的DNA序列； ( )用所述重組載體對細胞群進行體外轉染或轉導以產(chǎn)生所述第二細胞群；和(C)將治療有效量的所述第一細胞群和所述第二細胞群的混合物及其藥學上可接受的、不是無生命的三維結構的載體注射到哺乳動物的關節(jié)間隙中以進入希望生成軟骨的靶關節(jié)部位，其中所述靶部位處的所述結締組織細胞的內源性存在形式減少，并且其中所述靶部位處的細胞混合物的存在刺激軟骨的再生以治療骨關節(jié)炎。
33.一種用于在約-70°C至約_196°C的溫度下儲存細胞的儲存容器，其中包含如權利要求14所述的混合細胞組合物。
34.一種縮短結締組織細胞倍增時間的方法，包括用包含細胞因子的組合物孵育結締組織細胞以產(chǎn)生致敏細胞。
35.根據(jù)權利要求34所述的方法，其中，所述結締組織細胞為成纖維細胞、軟骨細胞或成纖維軟骨細胞。
36.根據(jù)權利要求35所述的方法，其中，所述軟骨細胞為原代人軟骨細胞。
37.根據(jù)權利要求34所述的方法，其中，所述細胞因子是屬于TGF-β超家族的成員。
38.根據(jù)權利要求34所述的方法，其中，用所述細胞因子孵育所述細胞約1小時至約 40小時。
39.根據(jù)權利要求34所述的方法，其中，所述倍增時間約為未孵育對照細胞的一半。
40.根據(jù)權利要求34所述的方法，其中，所述細胞因子是TOF和TGF-β 1的組合。
41.根據(jù)權利要求40所述的方法，其中，所述組合物進一步包含3，3'，5-三碘-L-甲狀腺原氨酸。
42.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中，所述受試者患有退行性關節(jié)炎。
43.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中，所述靶部位是脊髓。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種包含致敏的結締組織細胞的組合物及其藥學上可接受的載體的組合物。
文檔編號A61K48/00GK102292092SQ200980155331
公開日2011年12月21日 申請日期2009年11月25日 優(yōu)先權日2008年11月25日
發(fā)明者盧文鐘, 李寬熙, 李泳錫 申請人:組織基因公司