專利名稱：中間蒼白桿菌的脂多糖及其作為哺乳動(dòng)物免疫刺激劑的用途的制作方法
中間蒼白桿菌的脂多糖及其作為晡乳動(dòng)物免疫刺激劑的用
途本發(fā)明涉及從中間蒼白桿菌(Ochrobactrum intermedium)菌株LMG3306中分離、純化和表征脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)，以及其作為哺乳動(dòng)物免疫剌激劑的用途、制備用于治療和/預(yù)防敗血癥的藥物化合物的方法和用于免疫抑制動(dòng)物中和對(duì)抗利士曼原蟲(Leishmania)的疫苗佐劑。
背景技術(shù)：
蒼白桿菌(Ochrobactrum)屬的成員包括在變形菌(Proteobacteria)域(domain)的α-2亞群中。它們主要存在于土壤中，已知其僅在病情危重或免疫力低下的患者中或在留置導(dǎo)管的患者中具有致病性。雖然在這些情況下蒼白桿菌可引發(fā)腦膜炎、骨髓炎、菌血癥和敗血癥，但這些細(xì)菌本身不能造成慢性感染，并且在導(dǎo)管去除之后從正常宿主中被清除(Cieslak，T. J.，C. J. Drabick 和 M. L Robb. 1996. Pyogenic infections due toOchrobactrum anthropi. Clin. Infect. Dis. 22 :845-847.) 0因?yàn)樗兄嗵?革蘭氏陰性細(xì)菌外膜的主要成分)的組成遵循一般原則，即其包含通過特異性糖(稱為2-酮基-3-脫氧辛酮糖酸(KD0，2-keto-3-deoxyoctulosonicacid))連接至脂質(zhì)組分(稱為脂質(zhì) A)的多糖(Rietschel，E. T.，Schade，U.，Jensen, Μ.，Wollenweber,H. W. ,Luderitz, 0.和Greisman，S. G. 1982. Bacterial endotoxins chemicalstructure，biological activity and role in septicaemia. Scand. J. Infect.Dis.Suppl. 3 8)，因此已假定所有LPS分子都具有相同的生物學(xué)效應(yīng)。然而，這一觀念已經(jīng)被研究所改變，所述研究顯示，幾種LPS產(chǎn)生細(xì)胞因子合成的能力存在很大差異，該作用與其脂質(zhì)A部分的結(jié)構(gòu)特征相關(guān)(Netea，M. G.，van Deuren，Μ.，Kullberg, Β· J.，Cavaillon，J. Μ·和 van der Meer, J. W. M. 2002. Does the shape oflipid A determine the interaction of LPS with Toll-like receptors TrendsImmunol. 23 :135.)。嗜肺軍團(tuán)菌(Legionella pneumophila)是革蘭氏陰性的兼性細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌，就低細(xì)胞內(nèi)毒性和其LPS的化學(xué)結(jié)構(gòu)而言，其也類似于布魯氏菌(Brucella)，并且顯著低于腸桿菌的 LPS 所引起的毒性(Zahhnger，U.，Knirel，Y. A.，Lindner, B.，Helbig,J. H.，Sonesson, A.，Mane, R.和 Rietschel，Ε. Τ. 1995. The lipopolysaccharide ofLegionella pneumophila serogroup I (strain Philadelphia I) chemical structureand biological significance. Prog. Clin. Biol. Res. 392 :113. 26)。人蒼白桿菌(Ochrobactrum anthropi)已知與布魯氏菌親緣關(guān)系最近(Velascoet al. International Journal of Systematic Bacteriology 48(1998)759-768)。盡管其種系進(jìn)化關(guān)聯(lián)性接近，B. abortus與蒼白桿菌在OM特征上顯著不同，并且這些廣泛的差異至少部分是由LPS中的微小變化所引起的(Velasco等Infection and Immunity68(2000)3210-3218)。測(cè)定了來自中間蒼白桿菌LMG 3301的LPS的完整核心脂質(zhì)A主鏈(backbone)和來自人蒼白桿菌 LMG 3331 的 LPS 的 O 鏈(Velasco et al. Carbohydrates Research306(1996) 123-126 ；Velasco et al. Carbohydrates Research 306(1998)283-290;Velasco et al. Infection and Immunity 68(2000)3210-3218)。Velasco 等描述了中間蒼白桿菌的菌株 LMG3306 (International Journal ofSystematic Bacteriology 48 (1998) 759-768)，然而,以前尚無對(duì)來自中間蒼白桿菌LMG3306的LPS的描述。另一方面，僅在美國(guó)每年就有大約900，000例敗血癥病例，引起大約210，000例死亡，并花費(fèi)幾乎170億美元。敗血癥是一種發(fā)生率在上升的常見疾病，死亡率為27 48%。敗血癥性休克(septic shock)是敗血癥的后果，其經(jīng)常是致命的。敗血癥中伴隨感染而發(fā)生的嚴(yán)重炎癥是多種治療性干預(yù)的靶標(biāo)。然而，對(duì)敗血癥的炎癥方面，使用一般抗炎劑超過20年的臨床試驗(yàn)已經(jīng)證明，該方法并不成功。導(dǎo)致敗血癥的病理機(jī)制是復(fù)雜的，且遠(yuǎn)未被理解。敗血癥涉及全身性的炎性應(yīng)答， 繼之以補(bǔ)償性抗炎應(yīng)答。它們之間的平衡對(duì)于宿主的存活是關(guān)鍵的。此外，敗血癥的動(dòng)物模型不容易模擬人類患者中敗血癥的復(fù)雜性。據(jù)認(rèn)為，敗血癥性休克的多數(shù)結(jié)果與循環(huán)內(nèi)毒素(LPS)的大量釋放有關(guān)，因此，最近已經(jīng)進(jìn)行了一些通過Toll樣受體(Toll-like receptor, TLR)拮抗劑來治療該作用的嘗試。因此，正處于II期的作為TLR4拮抗劑而發(fā)揮作用的Eritoran (LPS的脂質(zhì)A部分的結(jié)構(gòu)類似物)在嚴(yán)重?cái)⊙Y患者中顯示出對(duì)死亡率的降低。此外，TAK-242是TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑，其降低促炎細(xì)胞因子的水平，并且還在高IL-6水平的嚴(yán)重?cái)⊙Y患者的亞組中降低死亡率。目前，很多感染性疾病尚無疫苗。這些情況中的一些是因?yàn)槿狈φ_的佐劑來誘導(dǎo)正確和適宜的免疫應(yīng)答。對(duì)于一些感染劑，例如細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌、病毒和多數(shù)原生動(dòng)物，保護(hù)性免疫應(yīng)答為以產(chǎn)生IFN-Y為特征的T輔助細(xì)胞I型(THl)。相反，對(duì)抗多數(shù)寄生蟲的保護(hù)性應(yīng)答是以產(chǎn)生IL-4為特征的類型2(TH2) (Fresno, Μ.，M. Kopf和L. Rivas. 1997.Cytokines and infectious diseases. Tmmunol Today 18:56-58)?？捎糜谌祟愐呙缰苿┑淖魟┖苌伲?yàn)樗鼈冎械暮芏嘤捎诩觿〉腡hl誘導(dǎo)是有毒性的。其實(shí)并非佐劑的明礬(alum)用在多數(shù)人類疫苗制劑中。最近，Toll樣受體(TLR)的激動(dòng)劑已經(jīng)引起了很大關(guān)注(Hoffman,Nature Reviews Drug Discovery 4,879,2005)(Kwissa ；Expert Vaccine Rev.,6，G73，2007)。當(dāng)前正在分析幾種抗原和各種TLR的幾種激動(dòng)劑。最終，任何疫苗制劑(包括已經(jīng)被許可的那些疫苗)的主要問題之一是其在免疫抑制的對(duì)象中基本沒有作用。此外，其中的一些在這些患者中具有繼發(fā)作用(Kwissa，等2007)。Velasco 等 Carbohydrates Research 306 (1998) 283-290 描述了來自中間蒼白桿菌LMG 3301的野生型的深-粗糙(de印-rough) LPS (不存在O鏈并且外核心部分缺乏一些單糖的LPS)的完整核心脂質(zhì)A主鏈；確定了來自人蒼白桿菌LMG 3331 LPS野生型的光滑(smooth) LPS 的 O 鏈(Velasco 等 Carbohydrates Research 306 (1996) 123-126);并且Velasco 等 Infection and Immunity 68 (2000) 3210-3218 發(fā)表了脂質(zhì) A和完整 LPS 的分子量。Velasco 等描述了中間蒼白桿菌 LMG 3306 的菌株(International Journal ofSystematic Bacteriology 48 (1998) 759-768)，然而，以前尚無對(duì)中間蒼白桿菌 LMG 3306的野生型光滑LPS的描述。

發(fā)明內(nèi)容
目前，已經(jīng)證明中間蒼白桿菌菌株LMG3306的脂多糖(頂)可有效用于治療和/或預(yù)防敗血癥，以及在用于免疫抑制動(dòng)物和在對(duì)抗利什曼病的疫苗中用作佐劑。因此，根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，其涉及中間蒼白桿菌菌株LMG 3306的脂多糖(IM)在制備用于治療和/或預(yù)防敗血癥的藥物，以及用于免疫抑制動(dòng)物中和對(duì)抗利什曼病的佐劑疫苗中的用途。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，其提供了中間蒼白桿菌菌株LMG 3306的脂多糖(IM)在制備用于治療和/或預(yù)防敗血癥性休克和內(nèi)毒素性休克的藥物中的用途。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，其提供了中間蒼白桿菌菌株LMG 3306的LPS(IM) 作為用于人類和動(dòng)物的感染性疾病之疫苗佐劑的用途。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案，其提供了 IM在制備用于治療和/或預(yù)防免疫抑制動(dòng)物(包括人)之感染的藥物的用途。根據(jù)本發(fā)明，中間蒼白桿菌菌株LMG 3306的脂多糖中的所述用途適用于人類和動(dòng)物。因此，在整個(gè)本發(fā)明中，所提及的在動(dòng)物中的應(yīng)用也包括在人中的應(yīng)用?？偠灾?，在免疫抑制的動(dòng)物中，治愈和預(yù)防敗血癥和內(nèi)毒素血癥的哺乳動(dòng)物免疫刺激劑具有疫苗佐劑的特性，并且，在足墊利什曼病的實(shí)驗(yàn)性小鼠模型中具有疫苗佐劑的特性以及保護(hù)性和治療性作用。已經(jīng)證明，頂(來自中間蒼白桿菌菌株LMG3306的脂多糖)作為免疫刺激劑，具有廣泛的活性，包括-誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中產(chǎn)生IL-12。-本發(fā)明的LPS所誘導(dǎo)的TNF水平遠(yuǎn)低于腸LPS，不引起病理作用。-本發(fā)明的LPS誘導(dǎo)T輔助細(xì)胞I(THl)刺激和Y -IFN的產(chǎn)生。該化合物與哺乳動(dòng)物中激發(fā)免疫應(yīng)答的能力相關(guān)聯(lián)。因此，本發(fā)明提供免疫刺激劑組合物，其包含中間蒼白桿菌菌株LMG3306的脂多糖，和任選地一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑。優(yōu)選地，免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)在于增強(qiáng)人的免疫功能。本發(fā)明涉及頂(哺乳動(dòng)物的免疫刺激劑)的用途，其用作預(yù)防和治愈敗血癥和內(nèi)毒素血癥的化合物。本發(fā)明特別涉及其作為佐劑改善在正常的和實(shí)驗(yàn)性免疫抑制的動(dòng)物中接種的用途。在這方面，作為其佐劑特征的一個(gè)例子，本發(fā)明特別涉及IM作為疫苗佐劑用于實(shí)驗(yàn)性利什曼病感染和使用碩大利什曼原蟲(Leishmania major)足墊利什曼病的實(shí)驗(yàn)性小鼠模型對(duì)皮膚利什曼病的治療性和保護(hù)性作用。本發(fā)明涉及由中間蒼白桿菌菌株LMG3306制備LPS的方法，所述LPS作為化合物用于醫(yī)藥領(lǐng)域，用作哺乳動(dòng)物的免疫刺激劑。本發(fā)明提供了作為免疫刺激劑在牛、豬、奶牛和小鼠中的實(shí)驗(yàn)領(lǐng)域的試驗(yàn)開發(fā)中的特異性活性-聯(lián)合本發(fā)明進(jìn)行特異性接種之后，在增加針對(duì)IBR病毒的中和抗體中的影響-誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分化
-在巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)TNF-在巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)IL-12-誘導(dǎo)脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IFN-Y-通過TLR4和TLR2受體的免疫刺激作用-以劑量依賴的方式影響T細(xì)胞的刺激因此，本發(fā)明涉及中間蒼白桿菌菌株LMG3306脂多糖(LPS)能夠在哺乳動(dòng)物中激發(fā)免疫應(yīng)答的能力。因此，本發(fā)明提供免疫刺激劑組合物，所述組合物包含中間蒼白桿菌菌株LMG3306的脂多糖和任選地一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑。優(yōu)選地，免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)在于增強(qiáng)哺乳動(dòng)物的免疫活性(immunocompetence)。
本發(fā)明還涉及在哺乳動(dòng)物中調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的方法，包括給哺乳動(dòng)物施用中間蒼白桿菌菌株LMG3306的LPS或含有所述LPS的藥物組合物。因此，本發(fā)明還涉及免疫刺激劑組合物在制備用于在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)一般細(xì)胞免疫的藥物中的用途。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的免疫刺激劑組合物在制備藥物中的用途，所述藥物用于在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分化、產(chǎn)生1即、產(chǎn)生11^-12、脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生正^￥和刺激病毒特異性⑶8和⑶4 T細(xì)胞，其包括給哺乳動(dòng)物施用中間蒼白桿菌LMG3306的LPS。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的免疫刺激劑組合物用作疫苗的佐劑，用于改進(jìn)針對(duì)所述疫苗中含有的特異性病毒或細(xì)菌的免疫。與以低的亞致死劑量或其他較低毒性的LPS預(yù)防內(nèi)毒素性休克相關(guān)的多數(shù)工作已證明，需要事先接種(Hatao, F.,等，The induction of super-resistance usingsynthetic lipopolysaccharide receptor agonist rescues fatal endotoxemia in ratswithout excessive immunosuppression. Shock2005 ；23(4) :365-70.)。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，中間蒼白桿菌菌株LMG 3306的脂多糖不需要在前的脫敏期，而僅連同LPS —起接種中間蒼白桿菌菌株LMG 3306的脂多糖即避免了該毒性作用。此外，大多數(shù)已發(fā)表的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)了體外或細(xì)胞系中TNF抑制與體內(nèi)的脫敏作用之間存在相關(guān)性(參見例如，Lehner, MD，等,Lipopolysaccharide and Highly PurifiedLipoteichoic Acid Via Different Toll-Like Receptors Independent of ParacrineMediators. 2,001. J. Immunol. 166 :5161-5167)。然而,發(fā)明人現(xiàn)已證明中間蒼白桿菌菌株LMG3306的脂多糖雖然在體內(nèi)保護(hù)LPS的作用，但并不降低巨噬細(xì)胞系和腹腔巨噬細(xì)胞或脾臟細(xì)胞中TNF或IL-12的分泌。體內(nèi)的初步結(jié)果還提示中間蒼白桿菌菌株LMG 3306的脂多糖(頂)能夠以某種方式顯著降低LPS所誘導(dǎo)的TNF水平。不論如何，TNF水平和保護(hù)作用之間沒有直接的相關(guān)性。這些結(jié)果是出人意料的。另一些假說給出了 IL-10或TGF- β產(chǎn)量增加產(chǎn)生脫敏作用的原因(Randow，F(xiàn).等，Mechanism of endotoxin desensitization involvement of 35 interleukin 10and transforming growth factor beta. J. Exp. Med 1995. 181,1887-1892)。然而，情況似乎并不是這樣，因?yàn)閷?shí)際上IM在體外幾乎不誘導(dǎo)IL-10，事實(shí)上，似乎有某物抑制了外周巨噬細(xì)胞或脾臟細(xì)胞中IL-10的產(chǎn)生(盡管其不顯著)，并且，除了在C57BL/6小鼠的脾臟細(xì)胞中的情況之外，LPS誘導(dǎo)的IL-10水平并未通過頂而顯著增加。另外一個(gè)有趣的方面是頂調(diào)節(jié)病原體之間免疫應(yīng)答的能力。因此，使用碩大利什曼原蟲感染的系統(tǒng)，顯現(xiàn)出頂促進(jìn)免疫原性利士曼原蟲抗原提取物的作用，其方式與CpG不類似。已知CpG為免疫調(diào)節(jié)劑，其通過與TLR9聯(lián)合而增強(qiáng)Thl應(yīng)答(其對(duì)于諸如利士曼原蟲和許多其他病原體而言是保護(hù)性的)，并且已經(jīng)作為免疫調(diào)節(jié)劑和疫苗佐劑而獲得專利。然而，體內(nèi)頂不像CpG那樣明顯地改變Thl/Th2的比例。這可表明，在體液(Th2)和細(xì)胞(Thl)具有重要保護(hù)作用的感染中，頂可比CpG佐劑更好?；蛟S更重要的是證明了頂不僅可以誘導(dǎo)保護(hù)性應(yīng)答，而且可直接誘導(dǎo)保護(hù)作用，即對(duì)利士曼原蟲感染具有治療性作用。在整個(gè)說明和權(quán)利要求書中，詞語“包含”及該詞的變化形式并不意在排除其他技術(shù)特征、添加物、成分 或步驟。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，經(jīng)過查看本說明書，本發(fā)明的其他目的、優(yōu)點(diǎn)和特征會(huì)變得顯而易見，或可通過實(shí)施本發(fā)明而得知。以下實(shí)施例和附圖通過舉例說明來提供，且其并不意在限制本發(fā)明。此外，本發(fā)明涵蓋了本文中描述的具體實(shí)施方案和優(yōu)選實(shí)施方案的所有可能的組合。附圖簡(jiǎn)述圖I顯示因使用頂而對(duì)大腸桿菌(E.Coli)LPS所引起的毒性作用的預(yù)防。用LPS (I. 75mg)或IM (中間蒼白桿菌的LPS)，以O(shè). 6 μ g/Kg (劑量60)或3 μ g/Kg (劑量300)單獨(dú)或聯(lián)合處理每組5只小鼠的組，并評(píng)價(jià)存活率。圖2顯示對(duì)LPS內(nèi)毒素性休克的治療。以LPS (2mg/動(dòng)物)處理5只動(dòng)物的組。24小時(shí)后，給他們注射IM (中間蒼白桿菌的LPS) O. 6 μ g/Kg (劑量60)或3 μ g/Kg (劑量300)，并評(píng)價(jià)存活率。圖3顯示對(duì)大腸桿菌性腹膜炎的預(yù)防。以大腸桿菌(I X IO7菌落形成單位，CFU)感染每組5只小鼠的組；在此24小時(shí)之前，用IM(中間蒼白桿菌的LPS)O. 6 μ g/Kg(劑量60)或6 μ g/Kg(劑量600)接種動(dòng)物，并評(píng)價(jià)存活率(上圖)和臨床癥狀(下圖)。圖4顯示對(duì)大腸桿菌性腹膜炎的治愈。以大腸桿菌(I X IO8菌落形成單位，CFU)感染每組5只小鼠的組；4小時(shí)之后，用IM(中間蒼白桿菌的LPS)6 μ g/Kg(劑量600)接種動(dòng)物，并評(píng)價(jià)存活率(上圖)和臨床癥狀(下圖)。圖5顯示針對(duì)利什曼病的保護(hù)性免疫和作用過程中免疫模式的一般特征。如該圖所示，寄生蟲與巨噬細(xì)胞的相互作用產(chǎn)生免疫應(yīng)答，所述免疫應(yīng)答如果主要基于Thl淋巴細(xì)胞的刺激，那么所述應(yīng)答對(duì)寄生蟲是有效和成功的，但如果Th2的應(yīng)答是典型的，則會(huì)表現(xiàn)出感染。圖6顯示用于評(píng)價(jià)利什曼病疫苗之潛在佐劑頂25 (中間蒼白桿菌LMG 3306的脂多糖)的免疫接種方案。在第O、15和30天，以單獨(dú)的SLA抗原或與CpG或IM —起接種每組5只小鼠的組。在第60天,給每只動(dòng)物在每個(gè)足墊中接種1000個(gè)前鞭毛體(promastigote),并評(píng)價(jià)損傷的發(fā)展和免疫參數(shù)。圖7顯示以SLA和SLA-CpG(上圖)或以SLA-頂為佐劑接種的動(dòng)物中損傷的發(fā)展。其對(duì)沿著感染的足墊腫脹進(jìn)行定量。圖8顯示相對(duì)于對(duì)照(PBS)而言，以SLA和SLA_CpG、SLA-M接種的動(dòng)物的足墊中損傷的宏觀狀態(tài)。圖中包括感染6周內(nèi)對(duì)照組動(dòng)物、以SLA接種的一只、以SLA-CpG接種的一只和以SLA-IM接種的6只動(dòng)物的照片。圖9顯示對(duì)脾和淋巴結(jié)(DLN)中寄生蟲數(shù)目的定量，其中，與對(duì)照組相比，用SLA免疫接種對(duì)所述器官中計(jì)數(shù)的寄生蟲數(shù)目不產(chǎn)生任何降低，而SLA-CpG可使該計(jì)數(shù)降低大約2個(gè)對(duì)數(shù)(log)的量級(jí)，并且其中SLA-IM組獲得了類似的降低效果。


圖10顯示對(duì)來自被處死動(dòng)物之脾的細(xì)胞中，以及這些分離的細(xì)胞和以SLA體外刺激的細(xì)胞中Thl應(yīng)答(IFN-Y)和/或Th2(IL-4)應(yīng)答之評(píng)價(jià)的圖示結(jié)果。圖11顯示在特異性抗體同種型IgG2a(Thl)和IgGl (Th2)方面，基于對(duì)利士曼原蟲水平的分析而對(duì)Thl/Th2應(yīng)答的評(píng)價(jià)。圖12顯示評(píng)價(jià)IM對(duì)利士曼原蟲實(shí)驗(yàn)性感染的治療效果的實(shí)驗(yàn)方案。圖13(A)顯示以頂接種的動(dòng)物中損傷的發(fā)展。其對(duì)沿著感染的足墊腫脹進(jìn)行量化。(B)顯示與對(duì)照組(PBS)相比，以IM接種的動(dòng)物之足墊損傷的宏觀狀態(tài)。其中包括感染6周內(nèi)屬于對(duì)照組的一只動(dòng)物、以CpG接種的一只動(dòng)物和以SLA-IM接種的全部6只動(dòng)物。(C)顯示7周之后，脾和淋巴結(jié)(DLN)中對(duì)寄生蟲數(shù)目的定量。圖14顯示PBS對(duì)照樣品、CpG和頂之間的IgGl和IgG2a(包括它們之間的比值)的對(duì)比表格。
圖15顯示用于在免疫抑制動(dòng)物中分析佐劑RT之作用的實(shí)驗(yàn)方案的概要。以地塞米松免疫抑制每組5只動(dòng)物的組，并用SLA、SLA-CpG或SLA-頂接種。24小時(shí)后，感染所述動(dòng)物，并隨后在第8天再次感染。在第60天處死后，評(píng)價(jià)損傷的發(fā)展和免疫參數(shù)。圖16顯示以SLA接種之后，M在小鼠脾細(xì)胞中的佐劑作用。用或不用抗原SLA (10g/ml)培養(yǎng)所述脾細(xì)胞72小時(shí)，并通過在72小時(shí)的時(shí)間內(nèi)將trimidina整合進(jìn)DNA來評(píng)價(jià)增殖。結(jié)果顯示三次重復(fù)的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值，每個(gè)實(shí)驗(yàn)中使用6只動(dòng)物。圖17顯示對(duì)接種動(dòng)物的脾細(xì)胞產(chǎn)生IL-4的影響。所述脾細(xì)胞分離自多種動(dòng)物，且用SLA(10g/ml)刺激，并用ELISA分析IL-4的分泌。圖18顯示對(duì)接種的和用地塞米松(DEX, dexamethasone)處理的小鼠脾細(xì)胞的IL-4和IFN-Y的作用。圖19顯示被接種的動(dòng)物中對(duì)SLA的細(xì)胞應(yīng)答。其顯示在體外添加SLA之后17天，對(duì)抗IFN-Y的特異性應(yīng)答和對(duì)SLA的應(yīng)答。其顯示IFN-Y分泌(Thl)/IL_4 (Th2)的比例。圖20顯示與Raw巨噬細(xì)胞中的大腸桿菌LPS相比添加免疫刺激化合物之后J774細(xì)胞的分化。本發(fā)明的免疫刺激化合物誘導(dǎo)對(duì)J774巨噬細(xì)胞之分化的劑量依賴性抑制。該作用比在J774或Raw巨噬細(xì)胞中基于重量/體積使用大腸桿菌LPS所觀察到的作用(未顯示)低約500。圖21顯示未受刺激的巨噬細(xì)胞不合成可通過ELISA檢測(cè)的TNF。在J774巨噬細(xì)胞(圖21a)和在raw細(xì)胞中(未顯示)，本發(fā)明的免疫刺激劑組合物在劑量為O. I 10 μ g/ml時(shí)，以劑量應(yīng)答的方式誘導(dǎo)顯著的TNF產(chǎn)生，反應(yīng)性水平高達(dá)4000pg/ml。本發(fā)明的免疫刺激劑的作用雖然高度地顯著，但比大腸桿菌的LPS弱約500倍(圖21b)。圖22顯示本發(fā)明的免疫刺激劑組合物在來自Balb/c和C57B16品系小鼠的巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)TNF的產(chǎn)生，但是在同等濃度下比大腸桿菌LPS的效能低(圖3)。圖23顯示本發(fā)明的免疫刺激劑在劑量為IOm μ g/ml時(shí)，在來自C57B1/6和Balb/c的腹腔巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)大量的IL-12(圖4)。圖24顯示A刺激誘導(dǎo)來自兩個(gè)品系小鼠的脾細(xì)胞大量分泌IFN-Y，提示激發(fā)了以IFN-Y產(chǎn)生為特征的Thl應(yīng)答。本發(fā)明的免疫刺激劑組合物在劑量為I IOm 口 g/ml時(shí)，誘導(dǎo)來自C57B1/6和Balb/c脾淋巴細(xì)胞的大量IFN-Y。圖25顯示本發(fā)明的免疫刺激劑組合物在來自C57B1/6的腹腔巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)TNF,而TLR-2缺陷僅部分地阻止該活性，并且巨噬細(xì)胞中缺乏TLR4強(qiáng)烈地降低了所述誘導(dǎo)。圖26顯示本發(fā)明的免疫刺激劑組合物在來自C57B1/6的腹腔巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)IL-12，而TLR-2缺陷僅部分地阻止該活性，并且巨噬細(xì)胞中缺乏TLR4強(qiáng)烈地降低了所述誘導(dǎo)。圖27顯示A刺激誘導(dǎo)IFN- Y的分泌，其在來自C57B1/6 tlr2_/_的脾細(xì)胞中被顯著地抑制，并且當(dāng)使用IOmg免疫刺激化合物用于C57B1/6 tlr4_/_細(xì)胞時(shí)，所述分泌幾乎完全消失。圖28顯示在來自B6 C57小鼠的脾細(xì)胞中，用淋巴叢腦膜炎(Lymphochoremeningitis)病毒感染并添加不同的刺激物之后誘導(dǎo)的⑶4(圖28a)或⑶8(圖28b)T細(xì)胞應(yīng)答；從左至右無肽；LCMV NP 396肽(肽NP 396);單獨(dú)的培養(yǎng)基；PMA 加離子霉素(ionomycing);和不同濃度的免疫刺激化合物。
具體實(shí)施方案術(shù)語“免疫刺激劑組合物”在本文中廣義地定義為能夠在接種了該制品的哺乳動(dòng)物中激發(fā)免疫應(yīng)答的可施用形式的任何類型的生物劑。本文中使用的術(shù)語“純化的”，當(dāng)其涉及LPS時(shí)，表示所述LPS已經(jīng)過分級(jí)或純化過程(例如但不限于上文中公開的那些過程)，以除去各種其他成分，并且所述組合物基本保持其所表現(xiàn)的生物活性。在使用術(shù)語“基本純化的”時(shí)，該術(shù)語是指這樣的組合物，其中LPS形成所述組合物的主要非溶劑組分。例如，“基本純化的LPS”表示溶液或組合物中超過約50 %、約60 %、約70 %、約80 %、約90 %、約95 %的非溶劑組分是本發(fā)明的LPS。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，所述免疫刺激劑組合物包含基本純化形式的中間蒼白桿菌菌株LMG3306的LPS，其中非溶劑組分未被超過O. 2%的其他化合物(DNA、RNA、蛋白質(zhì)、葡聚糖、脂質(zhì)……)所污染?！懊庖邔W(xué)有效量”是指在哺乳動(dòng)物中免疫原性足以誘導(dǎo)可檢測(cè)的細(xì)胞或體液免疫應(yīng)答的量。本文中使用的“保護(hù)性免疫應(yīng)答”是指阻止或延緩特異性病原體所引起的感染或疾病的細(xì)胞或體液免疫應(yīng)答?？墒褂没谫x形劑、pH和濃度的常規(guī)制備技術(shù)來制備本發(fā)明的化合物。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，按照以下步驟從中間蒼白桿菌LMG3306中提取脂多糖a)將中間蒼白桿菌LMG3306的滅活培養(yǎng)物離心；b)將所獲得的沉淀物重懸在鹽水懸浮液中；c)用純水和聚乙二醇透析；d)用四體積的甲醇和I %的醋酸鈉飽和甲醇沉淀；e)冷凍干燥以獲得粗制LPS。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，一旦所述粗制LPS已被冰凍干燥，就按照以下步驟對(duì)其進(jìn)行純化I.在緩沖液(IOmM Tris-HCI pH 7.5)中溶解粗制LPS，任選地以超聲輔助；
2.添加蛋白酶K并在室溫下孵育；3.通過超速離心收集純化的LPS4.冷凍干燥該樣品。如下的流程圖中顯示了對(duì)本發(fā)明的免疫刺激化合物之生產(chǎn)方法的優(yōu)選實(shí)施方案的更詳細(xì)描述中間蒼白桿菌LMG 3306 LP提取方法的流程圖
中間蒼白桿菌(Ochrobactrum intermedium )
LMG 3 3 06培養(yǎng)物(靜止期)_
甲 0.4% vA
ψ
連續(xù)離心
ι_ /Xr^
I提取物上清液除去
I
\
重懸(200g/l于 15mM的NaCl中)
I
Ψ
權(quán)利要求
1.一種來自中間蒼白桿菌(Ochrobactrum intermedium)LMG3306的脂多糖,其能在哺乳動(dòng)物中激發(fā)免疫應(yīng)答，用于治療和/或預(yù)防敗血癥。
2.用于制備權(quán)利要求I的脂多糖的方法，其包括用胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)來自中間蒼白桿菌菌株LMG 3306的細(xì)菌
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，還包括按以下步驟提取所述脂多糖 a)將中間蒼白桿菌LMG3306的滅活培養(yǎng)物離心； b)將所獲得的沉淀物重懸在鹽水懸浮液中； c)用純水和聚乙二醇透析； d)用四體積的甲醇和I%的醋酸鈉飽和甲醇沉淀；和 e)冷凍干燥以獲得粗制LPS。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，還包括按以下步驟純化粗制LPS a)在緩沖液(IOmMTris-HCI pH 7.5)中溶解粗制LPS，任選地以超聲輔助； b)添加蛋白酶K并在室溫下孵育； c)通過超速離心收集純化的LPS;和 d)冷凍干燥該樣品。
5.一種免疫刺激劑組合物，其包含權(quán)利要求I的來自中間蒼白桿菌LMG3306的脂多糖和任選地一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的組合物，其特征在于，其包含化學(xué)純的中間蒼白桿菌LMG3306的LPS，其中非溶劑組分未被超過0. 2%的其他化合物所污染。
7.根據(jù)權(quán)利要求5 6中任一項(xiàng)的組合物，其特征在于，其包含0.5 120 u g/ml的來自中間蒼白桿菌菌株LMG3306的LPS。
8.根據(jù)權(quán)利要求5 7中任一項(xiàng)的組合物，其中所述脂多糖處于均勻的懸浮液中，其中膠束相在4°C下穩(wěn)定超過I年。
9.根據(jù)權(quán)利要求5 8中任一項(xiàng)的組合物，其中所述組合物的pH在2 12之間。
10.根據(jù)權(quán)利要求5 9中任一項(xiàng)的組合物在制備用于調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物免疫應(yīng)答的藥物中的用途。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的用途，其中所述調(diào)節(jié)包括在所述哺乳動(dòng)物中增強(qiáng)免疫活性。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的用途，其中所述免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)在于誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分化、產(chǎn)生TNF、產(chǎn)生IL-12、脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IFN- Y和/或刺激病毒特異性的⑶8和⑶4T細(xì)胞。
13.根據(jù)權(quán)利要求11的用途，其中所述調(diào)節(jié)包括在所述對(duì)象中抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。
14.權(quán)利要求13的用途，其中所述促炎細(xì)胞因子為IL-12。
15.根據(jù)權(quán)利要求5 9中任一項(xiàng)的組合物作為疫苗佐劑用于改進(jìn)對(duì)抗所述疫苗中所含有的特異性病毒和/或細(xì)菌之免疫的用途。
16.根據(jù)權(quán)利要求5 9中任一項(xiàng)的組合物在制備用于治療和/或預(yù)防敗血癥的藥物中的用途。
17.根據(jù)權(quán)利要求5 9中任一項(xiàng)的組合物在制備用于治療和/或預(yù)防內(nèi)毒素血癥的藥物中的用途。
18.根據(jù)權(quán)利要求5 9中任一項(xiàng)的組合物在制備用于治療和/或預(yù)防感染性疾病的藥物中的用途。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的組合物在制備用于在免疫抑制的動(dòng)物中治療和/或預(yù)防感染的藥物中的用途。
20.根據(jù)權(quán)利要求18 19中任一項(xiàng)的組合物作為用于對(duì)抗利什曼原蟲感染之疫苗佐劑的用途。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的組合物作為用于對(duì)抗利什曼原蟲皮膚感染之疫苗佐劑的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及從中間蒼白桿菌(Ochrobactrum intermedium)菌株LMG3306中分離、純化和表征脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)，以及其作為哺乳動(dòng)物免疫刺激劑的用途、制備用于治療和/預(yù)防敗血癥的藥物化合物的方法和用于免疫抑制動(dòng)物和對(duì)抗利士曼原蟲(Leishmania)的疫苗的佐劑。
文檔編號(hào)A61K31/739GK102802639SQ200980160301
公開日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2009年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月4日
發(fā)明者胡安·伊格納西奧·奧韋赫羅吉薩索拉, 曼努埃爾·弗雷斯諾埃斯庫德羅 申請(qǐng)人:奧韋赫羅實(shí)驗(yàn)室公司