專利名稱：含有幾丁質(zhì)或殼聚糖的可降解復(fù)合材料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有至少一種選自幾丁質(zhì)和殼聚糖的多糖的可降解復(fù)合材料。更具體地，本發(fā)明涉及一種可降解復(fù)合材料，其含有至少一種選自幾丁質(zhì)和殼聚糖的多糖并在水分存在的環(huán)境例如生命體中緩慢降解。
背景技術(shù)：
因?yàn)閹锥≠|(zhì)和殼聚糖不會(huì)對(duì)生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生不利影響，其被用于各種醫(yī)用材料(參見專利文件1)。例如，用幾丁質(zhì)和殼聚糖作原材料而制備的片材被用作創(chuàng)傷敷料材料，并且用幾丁質(zhì)和殼聚糖作原材料而制備的纖維被用作醫(yī)用修復(fù)材料。已知當(dāng)幾丁質(zhì)和殼聚糖降解時(shí)，它們變成在體內(nèi)被吸收的可溶性糖類，并且已經(jīng)知道其降解產(chǎn)物是高度生物相容性的。然而，也有一些問題，因?yàn)閹锥≠|(zhì)和殼聚糖不能被人體內(nèi)的酶分解，因此使用這些物質(zhì)作原材料而制備的醫(yī)用材料難以以其留在體內(nèi)的方式來進(jìn)行使用。使用后長時(shí)間留在身體組織內(nèi)的醫(yī)用材料具有安全和使用方便的優(yōu)勢，因?yàn)槿绻湓谑中g(shù)之后組織損傷已愈合到一定程度的階段被體內(nèi)吸收并且消失，就沒有必要將已實(shí)現(xiàn)其目的的醫(yī)用材料移除。因此，如果能夠?qū)锥≠|(zhì)和殼聚糖賦予自降解能力，則可以提供具有更高實(shí)用性的醫(yī)用材料。然而，至今為止，尚未確立出能夠使幾丁質(zhì)和殼聚糖具有這樣的自降解能力的技術(shù)。引用列表專利文獻(xiàn)專利文件1 日本專利申請?zhí)亻_平第2003-265591號(hào)

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的是提供一種可降解的復(fù)合材料，其包含至少一種選自幾丁質(zhì)和殼聚糖的多糖并且具有自降解能力。解決向題的方案發(fā)明人進(jìn)行了密集的研究來解決上述問題，他們發(fā)現(xiàn)，通過將能夠水解幾丁質(zhì)和殼聚糖的酶承載在含有至少一種從中選擇的多糖的成型品上，該多糖可以在水分存在的環(huán)境例如生命體中緩慢降解，由此可提供具有自降解能力的可降解復(fù)合材料。具體而言，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過使用熱穩(wěn)定性酶作為上述的降解酶，其對(duì)多糖的降解活性可在長時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定保持，并且使得復(fù)合材料可以在水分存在的環(huán)境中持續(xù)安全降解。基于這些認(rèn)知，通過進(jìn)一步的改變和改進(jìn)而完成本發(fā)明。更具體地，本發(fā)明提供具有以下特征的可降解復(fù)合材料第1)項(xiàng)一種可降解的復(fù)合材料，其包括能夠水解至少一種選自幾丁質(zhì)和殼聚糖的多糖并承載在含有該多糖的成型品上的降解酶。第2~)項(xiàng)根據(jù)權(quán)利要求1所述的可降解復(fù)合材料，其中含有多糖的成型品為片狀。
第幻項(xiàng)根據(jù)第1)項(xiàng)所述的可降解復(fù)合材料，其中含有上述多糖的成型品為纖維狀。第4)項(xiàng)根據(jù)第1)項(xiàng)所述的可降解復(fù)合材料，其中降解酶是在4°C或更高時(shí)表現(xiàn)出活性并且具有95°C或更高的最適溫度的熱穩(wěn)定性幾丁質(zhì)酶。第幻項(xiàng)根據(jù)第1)項(xiàng)所述的可降解復(fù)合材料，其中降解酶是源于強(qiáng)烈火球菌 (Pyrococcus furiosus)的熱穩(wěn)定性幾丁質(zhì)酶。第6)項(xiàng)根據(jù)第1)項(xiàng)所述的可降解復(fù)合材料，其為醫(yī)用材料。第7)項(xiàng)根據(jù)第1)至幻項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的可降解復(fù)合材料用于制備醫(yī)用材料的用途。第8)項(xiàng)根據(jù)第6)項(xiàng)所述的用途，其中醫(yī)用材料是創(chuàng)傷敷料或醫(yī)用修復(fù)材料。第9)項(xiàng)一種治療創(chuàng)傷的方法，其中患者的受傷部位涂覆有第2、項(xiàng)所述的可降解復(fù)合材料。第10)項(xiàng)一種縫合切口部位或裂傷部位的方法，其中患者的切口部位或裂傷部位用第幻項(xiàng)所述的可降解復(fù)合材料進(jìn)行縫合。發(fā)明的有益效果在水分存在的環(huán)境中，本發(fā)明的幾丁質(zhì)和/或殼聚糖的可降解復(fù)合材料可以自降解成高度生物相容且可溶的糖類。結(jié)果，當(dāng)本發(fā)明的可降解復(fù)合材料作為醫(yī)用材料施用到受傷組織時(shí)，其在受傷組織上保留期望的時(shí)間后消失，從而不需要在術(shù)后對(duì)該醫(yī)用材料進(jìn)行移除，因此可以使患者的負(fù)擔(dān)減輕。此外，通過使用在4°C 100°C的寬范圍溫度下表現(xiàn)出活性的降解酶作為本發(fā)明的可降解復(fù)合材料中的能夠水解幾丁質(zhì)和/或殼聚糖的降解酶，可以在多種溫度條件下于水分存在的環(huán)境中引發(fā)自降解，其使得本發(fā)明能夠用于廣泛的用途。另外，通過使用熱穩(wěn)定性酶作為本發(fā)明的可降解復(fù)合材料中的降解酶，由于該酶的高度穩(wěn)定性，可降解復(fù)合材料的自降解能力可以得到穩(wěn)定保持，由此使得可降解復(fù)合材料可以在水分存在的環(huán)境中持續(xù)穩(wěn)定分解。而且，該特征提供長期的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。


圖1是示出當(dāng)在醋酸緩沖液中于60°C的溫度在包含幾丁質(zhì)的薄片中進(jìn)行崩解評(píng)估的結(jié)果的照片。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的可降解復(fù)合材料的特征在于，能夠水解至少一種選自幾丁質(zhì)和殼聚糖的多糖的降解酶被承載在含有該多糖的成型品(在下文中，有時(shí)簡單表示為“幾丁質(zhì)成型品”)上。實(shí)施本發(fā)明的最佳方式在以下詳細(xì)說明。通常，幾丁質(zhì)是其中N-乙酰葡糖胺結(jié)構(gòu)單元通過β _1，4糖苷鍵連接的多糖，但是在用于本發(fā)明的幾丁質(zhì)中，少于50 %的乙?；梢允敲撘阴；?。此外，殼聚糖是脫乙酰多糖，并且倘若幾丁質(zhì)中50%或更多的乙?；呀?jīng)脫乙?；糜诒景l(fā)明的殼聚糖可以包括還未被脫乙?；牟糠?。用于本發(fā)明可降解復(fù)合材料中的幾丁質(zhì)成型品可以包括幾丁質(zhì)或殼聚糖作為多糖，或者可以包括其組合。此外，用于本發(fā)明可降解復(fù)合材料中的幾丁質(zhì)成型品可以僅由上述多糖組成，或者按照需要，也可以包括其它可降解的樹脂、添加劑等。在使用本發(fā)明的可降解復(fù)合材料的幾丁質(zhì)成型品中，上述多糖的含量比并未具體限定，但從提高可降解復(fù)合材料的自降解能力的角度而言，基于幾丁質(zhì)成型品的總重，多糖的總重優(yōu)選為30wt% IOOwt %，更優(yōu)選為50wt% IOOwt %，甚至更優(yōu)選為70wt% IOOwt %。本發(fā)明可降解復(fù)合材料的幾丁質(zhì)成型品的構(gòu)型可以根據(jù)可降解復(fù)合材料的擬定方式來適當(dāng)確立，并且本文中并未作具體限定。實(shí)例包括片狀、纖維(線)狀、無紡布狀、棉狀、海綿狀等。其中優(yōu)選片狀和纖維狀形式，因?yàn)樗鼈兪侨菀子米麽t(yī)用材料等的構(gòu)型。幾丁質(zhì)成型品可以通過公知的制備方法來生產(chǎn)，或者可以作為商業(yè)產(chǎn)品而獲得。用于本發(fā)明可降解復(fù)合材料的降解酶在本文中未作具體限定，只要其能夠水解多糖并且是藥學(xué)上可接受的。這樣的降解酶的具體實(shí)例包括幾丁質(zhì)酶、殼聚糖酶等。例如，如果多糖是幾丁質(zhì)，則使用幾丁質(zhì)酶，如果多糖是殼聚糖，則使用殼聚糖酶。用于本發(fā)明可降解復(fù)合材料的降解酶可以是單獨(dú)使用的一種酶，或者可以是組合使用的兩種或更多種酶。用于本發(fā)明的降解酶的有效溫度在本文中并未具體限定，只要其在可降解復(fù)合材料將被使用的溫度下和環(huán)境中表現(xiàn)出活性，優(yōu)選該降解酶在4°C 100°C的寬范圍溫度下表現(xiàn)出活性。通過使用在如此高溫度的范圍內(nèi)表現(xiàn)出活性的酶，可以在多種溫度條件下于水分存在的環(huán)境中引發(fā)可降解復(fù)合材料的自降解，由此可降解復(fù)合材料發(fā)明可用于廣泛的應(yīng)用。而且，用于本發(fā)明的降解酶的優(yōu)選實(shí)例是熱穩(wěn)定性酶。使用此種熱穩(wěn)定性酶不僅能在高溫條件下賦予本發(fā)明的可降解復(fù)合材料以自降解能力，而且還可以提高其儲(chǔ)存穩(wěn)定性。該熱穩(wěn)定性酶的例子是一種最適溫度為60°C或更高，且更優(yōu)選為約90°C的酶。 用于本發(fā)明的熱穩(wěn)定性酶的優(yōu)選實(shí)例是在4°C或更高時(shí)表現(xiàn)出活性并且最適溫度為95°C 或更高的熱穩(wěn)定性幾丁質(zhì)酶。該熱穩(wěn)定性幾丁質(zhì)酶的一個(gè)具體實(shí)例是源于強(qiáng)烈火球菌 (Pyrococcus furiosus)的熱穩(wěn)定性幾丁質(zhì)酶。源于強(qiáng)烈火球菌的熱穩(wěn)定性幾丁質(zhì)酶已為公眾所知，且可以通過在日本專利申請?zhí)亻_平第2004-344160中公開的方法來制備。本發(fā)明的可降解復(fù)合材料的優(yōu)選方式是將幾丁質(zhì)酶承載在含幾丁質(zhì)的成型品上； 更優(yōu)選的方式是將幾丁質(zhì)酶承載在含幾丁質(zhì)的片狀或纖維狀成型品上；特別優(yōu)選的方式是將熱穩(wěn)定性幾丁質(zhì)酶承載在含幾丁質(zhì)的片狀或纖維狀成型品上。本發(fā)明的可降解復(fù)合材料中的降解酶可以通過物理吸附或化學(xué)結(jié)合而承載在含多糖的成型品上?？梢?，例如通過將含有降解酶的溶液涂覆至含有多糖的成型品或者用該溶液來浸漬成型品，來制備本發(fā)明的可降解復(fù)合材料。此外，可以通過將降解酶揉捏至含有多糖的成型品中來進(jìn)行制備。在本發(fā)明的可降解復(fù)合材料中，承載在含有多糖的成型品上的降解酶的量在本文中沒有具體限定，并且可以根據(jù)多糖的類型、可降解復(fù)合材料的形式、其用途等等來適當(dāng)設(shè)置。降解酶的承載量的實(shí)例是每1克多糖有100U 100，000U的降解酶，優(yōu)選1，000U 10，000U,并且更優(yōu)選2，000U 5，000U。對(duì)于本文中使用的降解酶的活性單位，將IU定義為在下列條件下于1分鐘內(nèi)釋放1 μ mol N-乙酰葡糖胺或葡糖胺所需要的酶活量。
底物溶液將幾丁質(zhì)粉末或殼聚糖粉末加到200mM醋酸緩沖液(pH 5. 6)中使其為 0. 5wt%然后使其懸浮。降解酶溶液將待測定的降解酶溶解于蒸餾水中，至濃度為0. 8mg/mL。測量規(guī)程(1)首先，將ImL的底物溶液置于測試管中并于37°C培育5min至lOmin。(2)接著，將0.2mL的降解酶溶液加到測試管中，并于37°C在輕柔的攪動(dòng)下培育降解酶1小時(shí)。(3)在混合物冷卻后，加入1000 μ L DMAB (對(duì)-二甲氨基苯甲醛)試劑，并于37°C 加熱20min后，在585nm測量光吸收以確定還原端的增加，從而量化N-乙酰葡糖胺或葡糖胺的釋放量。通過將IOg的DMAB加到含有12. 5襯％的ION鹽酸的IOOmL醋酸中來制備 DMAB試劑，并在使用前即刻用醋酸稀釋10倍。本發(fā)明可降解復(fù)合材料的用途在本文中沒有具體限定，其可以用于很多領(lǐng)域。本發(fā)明可降解復(fù)合材料的用途的優(yōu)選實(shí)例是創(chuàng)傷敷料材料、醫(yī)用修復(fù)材料、或其它醫(yī)用材料。 當(dāng)將本發(fā)明的可降解復(fù)合材料施用到患部時(shí)，其上承載的降解酶通過與患部的水分接觸而活化，從而開始自降解。因此，由于本發(fā)明的可降解復(fù)合材料進(jìn)行自降解并在體內(nèi)被吸收， 其可以用作長時(shí)間留存在體內(nèi)組織中的醫(yī)用材料(例如，創(chuàng)傷輔料或醫(yī)用修復(fù)材料)。在這種情況下，當(dāng)本發(fā)明的可降解復(fù)合材料被用作醫(yī)用材料時(shí)，可將其應(yīng)用到人類醫(yī)療用途或哺乳動(dòng)物(非人類)醫(yī)療用途。如果本發(fā)明的可降解復(fù)合材料以例如片狀使用，其會(huì)非常適合用作創(chuàng)傷敷料材料。如果本發(fā)明的可降解復(fù)合材料將被用作創(chuàng)傷敷料材料，受傷區(qū)域僅需要涂布創(chuàng)傷敷料材料。施用到受傷區(qū)域的創(chuàng)傷敷料材料是有益的，因?yàn)樗鼘⒃趧?chuàng)傷愈合到一定程度的階段降解并在體內(nèi)被吸收，創(chuàng)傷愈合后不需要將其移除。此外，如果本發(fā)明的可降解復(fù)合材料被用作創(chuàng)傷敷料材料，可以通過其在創(chuàng)傷愈合的過程中逐漸降解而使對(duì)于創(chuàng)傷的療效增加。此外，如果本發(fā)明的可降解復(fù)合材料以例如纖維的形式進(jìn)行使用，其會(huì)非常適合用作醫(yī)用修復(fù)材料。如果將本發(fā)明的可降解復(fù)合材料用作醫(yī)用修復(fù)材料，患者的切口或裂傷區(qū)域僅需要用醫(yī)用修復(fù)材料進(jìn)行縫合。因?yàn)橛糜诳p合切口或裂傷區(qū)域的醫(yī)用修復(fù)材料隨著縫合區(qū)域的愈合而在體內(nèi)被吸收，不需要在術(shù)后將縫線移除，從而可以減輕患者的負(fù)擔(dān)。實(shí)施例以下通過實(shí)施例來詳細(xì)描述本發(fā)明，但本發(fā)明并不限制于此。實(shí)施例11.幾丁質(zhì)酶的制備使用LB培養(yǎng)基(含10g/L多聚蛋白胨、5g/L酵母提取物、和10g/L氯化鈉)于37°C 對(duì)攜帶有質(zhì)粒的大腸桿菌進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，該質(zhì)粒中已導(dǎo)入編碼源于強(qiáng)烈火球菌的幾丁質(zhì)酶的DNA(日本專利申請?zhí)亻_平第2004-344160號(hào)中由SEQ ID NO 2表示的氨基酸序列)， 并在對(duì)數(shù)生長期(600nm處的光密度為0.2至0.4)時(shí)加入異丙基β-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)以使得最終濃度為0. 2mM。繼續(xù)不變地培養(yǎng)過夜，然后通過離心分離(6，000Xg， 7min)來收集大腸桿菌細(xì)胞。將從1升培養(yǎng)液中回收的大腸桿菌細(xì)胞懸浮于20mL的緩沖液A(25mM Tris-HCl[pH 7. 5] UmM EDTA、25mM NaCl)中，并通過超聲處理來裂解。在裂解之后，通過高速離心(13，000Xg，15min)來獲得提取液。將提取液于85°C加熱30min，再次進(jìn)行高速離心(13，000Xg，15min)，并收集上清液。將收集的上清液加到Hi1TrapQ陰離子交換柱(Amersham，5mL)中。使用 AKTAprime (Amersham)將上清液加到柱中并進(jìn)行洗脫。使用濃度梯度(25mM 1M)的包含于緩沖液A中的鹽(NaCl)來進(jìn)行洗脫。收集洗脫出目標(biāo)幾丁質(zhì)酶的級(jí)分，并且使幾丁質(zhì)酶于4°C在80%的飽和硫酸銨中沉淀過夜。通過高速離心(13，000Xg，15min)來回收沉淀物并將其再溶解于緩沖液A中。將溶解的樣品加到已用緩沖液A平衡的HiLoad ^/60Superdex-200pg凝膠過濾柱(Amersham)中，以除去低分子量的蛋白質(zhì)和殘留的硫酸銨。收集幾丁質(zhì)酶洗脫級(jí)分并用Centrift^p YM-IO(Amicon)濃縮。以這種方式得到的幾丁質(zhì)酶在37°C具有18，000U/g(干重當(dāng)量)的幾丁質(zhì)酶活性。2. /1,丁質(zhì)酶對(duì)包含幾丁質(zhì)的薄片的降解能力的評(píng)測將包含幾丁質(zhì)的薄片(Beschitin W, Unitika)切成20mmX20mm的方塊(約 0. 0125g)，并將方塊浸入20mL的50mM醋酸緩沖液(pH4. 5)或50mM Tris緩沖液(pH 7. 4) 中。之后向兩種溶液中加入0.0006g通過上述方式得到的幾丁質(zhì)酶，靜置溶液同時(shí)將溫度保持在37°C或60°C。在一段固定的時(shí)間后，將薄片移除并檢查崩解量。出于比較的目的， 進(jìn)行相同的測試而不添加幾丁質(zhì)酶。圖1示出在60°C的溫度于醋酸緩沖液中對(duì)薄片崩解的評(píng)測結(jié)果。如圖1所示，可以清楚看出包括幾丁質(zhì)的薄片因與幾丁質(zhì)酶共存而降解。在37°C的醋酸緩沖液、37°C的Tris 緩沖液、和60°C的Tris緩沖液中也得到相似的結(jié)果。包含幾丁質(zhì)的薄片在幾丁質(zhì)酶的存在下于37°C降解，因而以上結(jié)果證實(shí)，其上承載有幾丁質(zhì)酶的幾丁質(zhì)薄片將在體內(nèi)自降解并且可用于醫(yī)療應(yīng)用。3.可降解復(fù)合材料的制備于4°C將包含幾丁質(zhì)的薄片(Beschitin W, Unitika, IOOmmX 120mm,0. 4g)浸入 IOmL的50mM Tris緩沖液(pH 7. 5)中30min，該Tris緩沖液含有通過上述方式得到的濃度為0. 011g/mL的幾丁質(zhì)酶。之后，通過移除薄片并在50°C將其干燥而得到其上承載有幾丁質(zhì)酶的幾丁質(zhì)薄片(可降解復(fù)合材料)。
權(quán)利要求
1.一種可降解復(fù)合材料，包括能夠水解至少一種選自幾丁質(zhì)和殼聚糖的多糖并承載在含有所述多糖的成型品上的降解酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可降解復(fù)合材料，其中所述含有多糖的成型品為片狀。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可降解復(fù)合材料，其中所述含有多糖的成型品為纖維狀。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可降解復(fù)合材料，其中所述降解酶是在4°C或更高時(shí)表現(xiàn)出活性并且具有95°C或更高的最適溫度的熱穩(wěn)定性幾丁質(zhì)酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可降解復(fù)合材料，其中所述降解酶是源于強(qiáng)烈火球菌 (Pyrococcus furiosus)的熱穩(wěn)定性幾丁質(zhì)酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可降解復(fù)合材料，其為醫(yī)用材料。
7.根據(jù)權(quán)利要求1 5中任一項(xiàng)所述的可降解復(fù)合材料用于制備醫(yī)用材料的用途。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其中所述醫(yī)用材料是創(chuàng)傷敷料或醫(yī)用修復(fù)材料。
9.一種治療創(chuàng)傷的方法，其中患者的受傷部位涂覆有根據(jù)權(quán)利要求2所述的可降解復(fù)合材料。
10.一種縫合切口部位或裂傷部位的方法，其中患者的切口部位或裂傷部位用根據(jù)權(quán)利要求3所述的可降解復(fù)合材料進(jìn)行縫合。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供一種可降解復(fù)合材料，其包含至少一種選自幾丁質(zhì)和殼聚糖的多糖，并且具有自降解能力。通過將能夠水解幾丁質(zhì)和殼聚糖的酶承載在含有至少一種從中選擇的多糖的成型品上，該多糖可以在水分存在的環(huán)境例如生命體中緩慢降解。
文檔編號(hào)A61L15/64GK102573937SQ20098016182
公開日2012年7月11日 申請日期2009年10月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月7日
發(fā)明者奧崇, 野口武 申請人:東袋株式會(huì)社, 株式會(huì)社耐熱性酵素研究所