專利名稱：：利用Co60-γ射線冷滅菌用于細胞培養(yǎng)的紫龍金藥物溶液的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種利用Co60_Y射線照射滅菌的方法，尤其涉及利用Co60_Y射線照射紫龍金藥物溶液的滅菌方法。
背景技術(shù)：
：紫龍金片是天津中新藥業(yè)集團股份有限公司下屬企業(yè)隆順榕制藥廠與北京市腫瘤防治研究所合作開發(fā)研制，國家藥品監(jiān)督管理局批準的三類抗癌新藥。主要藥效物質(zhì)和作用機理的基礎(chǔ)研究扎實，對主要藥材如黃芪、當歸、丹參等的研究已相當透徹，具有益氣養(yǎng)血，清熱解毒，理氣化瘀的功效。本品為肺癌氣血兩虛兼瘀熱證患者化療的輔助用藥，具有一定的改善臨床癥狀，體力狀況評分的作用，對免疫指標NK細胞、CD4細胞等有改善作用，可減少化療所致的外周血象降低、肝腎功能損害及惡心嘔吐、脫發(fā)等臨床反應(yīng)，其多項研究經(jīng)過專家鑒定具有國際先進水平。中藥作用特點在于作用的多效性、量效關(guān)系的復(fù)雜性、作用的相對不穩(wěn)定性、某些中藥的雙向調(diào)節(jié)作用等；同時中藥作用方式上又具有多成份、多環(huán)節(jié)、多靶點的特性。這些復(fù)雜的特點，以往的藥物研究方法，很難從整體到細胞水平，甚至是分子水平進行全面地研究?，F(xiàn)代藥理學(xué)分子水平的研究已明確藥物作用都有其"靶基因"，靶基因也是中藥作用的最本質(zhì)的指標。作為分子生物學(xué)手段之一的生物芯片技術(shù)的出現(xiàn)為我們在基因水平了解中藥的作用靶點及方式、代謝途徑提供了強有力的工具。將成千上萬種核酸探針分子有序的排列在面積不大的載體材料上并與標志的樣品核酸雜交，通過放射自顯影或熒光掃描顯示，可一次獲得大量有用的生物信息。它為從分子水平向整體水平研究生命現(xiàn)象的回歸架起了一座橋梁，它是一項足可以媲美PCR技術(shù)的分子生物學(xué)發(fā)展中的"里程碑"級的生物高科技。其實用性極強，目前已用于基因的發(fā)現(xiàn)和表達研究、雜交測序以及多態(tài)性檢測等各個領(lǐng)域，被評為21世紀最有發(fā)展前途的高新技術(shù)之一。表達譜基因芯片是基因芯片中應(yīng)用最為廣泛，也是最能體現(xiàn)基因芯片的高通量、微型化和自動化特征的。其正在功能基因組學(xué)的研究中發(fā)揮著極其重要的作用。表達譜芯片在中醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用還處于初始階段，許多技術(shù)方法還處于摸索階段，理論、方法尚欠成熟，目前主要集中在中藥藥理研究等方面?？梢灶A(yù)見，生物芯片技術(shù)將在中藥現(xiàn)代化研究與開發(fā)中大顯身手。利用表達譜芯片分析平臺進行實驗，首先要解決用于細胞培養(yǎng)的紫龍金藥物溶液滅菌問題。在藥劑生產(chǎn)過程中常采用的滅菌方法有熱壓滅菌法，流通蒸氣滅菌法，煮沸滅菌法，濾過滅菌法及氣體滅菌法等。Co60-Y射線(鈷60-Y射線)輻照滅菌是近年來發(fā)展較為迅速的一種滅菌方法。它具有穿透力強，操作簡便，速度快，可在常溫下滅菌，輻射劑量適當，不會破壞藥品的有效成分，亦不會對人產(chǎn)生傷害，且有滅菌后較長時間控制細菌的再增殖等優(yōu)點。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種操作簡便、易行的利用Co60-y射線冷滅菌用于細胞培養(yǎng)的紫龍金藥物溶液的方法，其中照射Co60-y射線1-12小時，輻射劑量為2-8kGy，滅菌后的利紫龍金藥物溶液可以用于后期細胞培養(yǎng)。本發(fā)明的較佳實施例中，照射Co60_y射線2-8小時，更佳地，照射Co60_y射線4小時。本發(fā)明的較佳實施例中，輻射劑量為4kGy。本發(fā)明所述的紫龍金藥物溶液中含有細菌、真菌或霉菌中的至少一種；所述紫龍金藥物溶于細胞培養(yǎng)液改良型a-MEM、改良型RPMI-1640或HAM'S/F-12中的至少一種；藥物濃度為4.125mg/ml-133mg/ml，優(yōu)選為66mg/ml、33mg/ml、22mg/ml、16.5mg/ml、8.25mg/ml。本發(fā)明的較佳實施例中，利用Co60-y射線照射紫龍金藥物溶液滅菌并用于后期細胞培養(yǎng)的方法主要包含步驟1)利用革蘭氏陽性和革蘭氏陰性(G+、G-)菌的2YT培養(yǎng)物作模擬實驗，摸索Co60-y射線照射的條件；2)將步驟1)的所得物以40ml分裝到50ml離心管中；3)將步驟2)的所得物照射Co60_y射線4小時，輻射劑量為4kGy;4)將步驟3)的所得物取100ul涂平板，放37度恒溫培養(yǎng)24h;5)將步驟4)的所得物全部轉(zhuǎn)入滅菌三角瓶中，放37度恒溫培養(yǎng)24h、48h、72h、96h;6)將步驟4)和5)的所得物觀察無生長跡象；7)將Co60-y射線照射4小時，輻射劑量為4kGy為最后選擇參數(shù)照射照射溶于不同細胞培養(yǎng)液和不同濃度梯度的紫龍金藥物溶液。本發(fā)明的實驗結(jié)果表明，本發(fā)明所述的方法適用于不同藥物濃度、不同細胞培養(yǎng)液在不影響藥效的前提下，快速有效的滅菌，操作簡便，通用性強，無毒且費用低，照射后的紫龍金藥物溶液完全滅菌可用于后期細胞培養(yǎng)。下列實施例旨在進一步舉例說明，而不是限制本發(fā)明。在不違背本發(fā)明的精神和原則前提下，對發(fā)明個別技術(shù)步驟進行的任何改動和改變都將落入本發(fā)明的權(quán)利要求范圍內(nèi)。圖1A-圖1B表示以大腸桿菌(DH5a)模擬摻入紫龍金溶液進行Co60_y射線照射4小時前后平板計數(shù)結(jié)果圖1A為大腸桿菌(DH5a)模擬摻入紫龍金溶液但未進行Co60-y射線照射，涂平板過夜培養(yǎng)結(jié)果；圖1B為大腸桿菌(DH5a)模擬摻入紫龍金溶液但未進行Co60-y射線照射4小時后，涂平板過夜培養(yǎng)結(jié)果。圖2A-圖2B表示以金黃色葡萄球菌模擬摻入紫龍金溶液進行Co60_y射線照射4小時前后平板計數(shù)結(jié)果圖1A為金黃色葡萄球菌模擬摻入紫龍金溶液但未進行Co60-y射線照射，涂平板過夜培養(yǎng)結(jié)果；圖1B為金黃色葡萄球菌模擬摻入紫龍金溶液但未進行4Co60-y射線照射4小時后，涂平板過夜培養(yǎng)結(jié)果。圖3A-圖3B表示紫龍金溶液進行Co60_y射線照射前后細胞(人胚肺成纖維細胞MRC-5)在改良型a-MEM中的培養(yǎng)結(jié)果圖1A為紫龍金溶液未進行Co60_y射線照射細胞培養(yǎng)結(jié)果，因細菌生長培養(yǎng)基已變?yōu)闇啙岬狞S色；圖2A為紫龍金溶液進行Co60-y射線照射后細胞培養(yǎng)結(jié)果，培養(yǎng)基為清澈透明的紫紅色。具體實施例方式下面通過最佳實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明。以下實施例僅僅是用于說明而不是限制本發(fā)明。輔你l1以大腸桿菌(DH5ci)樽擬講行Co60-y射線照射實驗平板計數(shù)完整步驟包括1)將大腸桿菌(DH5a)甘油保存菌種取20ul接20ml2YT培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)，37度，150rpm;2)將過夜培養(yǎng)的細菌按1:10稀釋，用2YT稀釋各50ml，稀釋8個梯度10—U0—2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8，分別取10-6、10-7、10-8各飾1進行涂板，放37度恒溫培養(yǎng)24h后，計數(shù)；3)將稀釋好的各菌濃梯度，分別平行取3份，送天津市物理研究所進行&)60-y射線照射實驗，照射時間為lh、2h、4h、8h;4)取100ul涂板，放37度恒溫培養(yǎng)24h后，計數(shù)。<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>實施例2以金黃色葡萄球菌模擬進行Co60-y射線照射實驗平板計數(shù)完整步驟包括1)將金黃色葡萄球菌甘油保存菌種取20ul接20ml2YT培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)，37度，150rpm;2)將過夜培養(yǎng)的細菌按1:10稀釋，用2YT稀釋各50ml，稀釋8個梯度10—U0—2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8，分別取10-6、10-7、10-8各飾1進行涂板，放37度恒溫培養(yǎng)24h后，計數(shù)；3)將稀釋好的各菌濃梯度，分別平行取3份，送天津市物理研究所進行Co60-7射線照射實驗，照射時間為lh、2h、4h、8h;4)取lOOul涂板，放37度恒溫培養(yǎng)24h后，計數(shù)。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實施例4金黃色葡萄球菌模擬進行Co60-Y射線照射實驗搖瓶計數(shù)完整步驟包括1)將金黃色葡萄球菌甘油保存菌種取20ul接20ml2YT培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)，37度，150rpm;2)將過夜培養(yǎng)的細菌按1:10稀釋，用2YT稀釋各50ml，稀釋8個梯度10—UO—2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8，分別取10-6、10-7、10-8各飾1進行涂板，放37度恒溫培養(yǎng)24h后，計數(shù)；3)將稀釋好的各菌濃梯度，分別平行取3份，送天津市物理研究所進行Co60-y射線照射實驗，照射時間為lh、2h、4h、8h;4)取100ul涂板，其余轉(zhuǎn)入無菌的三角瓶中，37度，150rpm培養(yǎng)，于24h、48h、72h、96h持續(xù)觀察結(jié)果。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實施例5以紫龍金藥物溶液進行Co60_y射線照射實驗完整步驟包括1)紫龍金片主要成分為黃芪、當歸、白英、龍葵等；2)配制溶液稱取紫龍金藥片13.3g溶解于相應(yīng)細胞培養(yǎng)基中，等完全溶解后，轉(zhuǎn)入容量瓶中進行定容100ml，然后分裝1.2ml到1.5ml離心管中，進行Co60-y射線照射實驗；其他藥物濃度66mg/ml、33mg/ml、22mg/ml、16.5mg/ml、8.25mg/ml、4.125mg/ml用133mg/ml的母液進行稀釋而成，然后進行1.2ml每管分裝；3、)將稀釋好的各濃梯梯度，分別平行取3份，送天津市物理研究所進行Co60-y射線照射實驗，照射時間為4h;4)用不同濃度的經(jīng)Co60_y射線照射后的紫龍金藥物溶液處理細胞，每個培養(yǎng)瓶加9ml培養(yǎng)基(2%血清，1%雙抗)，1ml藥物，37度5%C02靜置培養(yǎng)；5)于24h、48h、72h、96h持續(xù)觀察結(jié)果。權(quán)利要求一種利用Co60-γ射線冷滅菌用于細胞培養(yǎng)的紫龍金藥物溶液的方法，其特征在于，照射Co60-γ射線1-12小時，輻射劑量為2-8kGy。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，照射Co60-y射線2-8小時。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，照射Co60-y射線4小時。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，輻射劑量為4kGy。5.根據(jù)權(quán)利要求l-4任一項所述的方法，其特征在于，所述紫龍金藥物溶液中含有細菌、真菌或霉菌中的至少一種。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述紫龍金藥物溶于細胞培養(yǎng)液改良型a-MEM、改良型RPMI-1640或HAM'S/F-12中的至少一種。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述紫龍金藥物溶液的濃度為4.125mg/ml—133mg/ml。全文摘要本發(fā)明涉及一種利用Co60-γ射線冷滅菌用于細胞培養(yǎng)的紫龍金藥物溶液的方法，其中照射Co60-γ射線1-12小時，輻射劑量為2-8kGy。該方法適用于不同藥物濃度、不同細胞培養(yǎng)液在不影響藥效的前提下，快速有效的滅菌，操作簡便，通用性強，無毒且費用低，照射后的紫龍金藥物溶液完全滅菌可用于后期細胞培養(yǎng)。文檔編號A61L2/08GK101745128SQ20101000109公開日2010年6月23日申請日期2010年1月21日優(yōu)先權(quán)日2010年1月21日發(fā)明者張平,曹勃陽,熊誦錦,王欣,王磊,聶萬達申請人:天津中新藥業(yè)集團股份有限公司;天津中新藥業(yè)集團股份有限公司隆順榕制藥廠;天津生物芯片技術(shù)有限責任公司