專利名稱：酶解海洋貝類免疫增強肽的制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用酶工程技術(shù)酶解海洋扇貝、四角蛤、牡蠣等海洋貝類，制備免疫增
強肽的技術(shù)方法，屬于應(yīng)用海洋生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
免疫是機體對病原微生物侵襲的防衛(wèi)功能及維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定一清除衰老、死 亡、受傷細(xì)胞和監(jiān)視、清除突變細(xì)胞的功能，當(dāng)機體免疫功能低下或障礙時，將會發(fā)生重癥 感染、腫瘤和肌體早衰等。隨著人們對疾病治療觀念的轉(zhuǎn)變，治療的重點已經(jīng)由直接殺傷 外源性病原體轉(zhuǎn)向調(diào)整生物機體自身功能，從而免疫增強劑在醫(yī)學(xué)的應(yīng)用引起了廣泛的關(guān) 注，免疫增強劑的研究已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)最活躍的研究領(lǐng)域之一，尋找天然的免疫調(diào)節(jié)劑，增強 機體免疫是當(dāng)今腫瘤治療的重要而有效的途徑。 多數(shù)海洋貝類提取物的抗腫瘤活性與其免疫增強活性相關(guān)，即通過增強機體免疫 能力而達到抑制和消除腫瘤的功效。目前人們已經(jīng)從海洋貝類動物中發(fā)現(xiàn)了多種有抑瘤作 用的物質(zhì)。如從文蛤(Meretrix meretrixLin-naeus)中提取的蛤素(mercenene)對月中瘤禾口 白血病有預(yù)防和抑制作用；從蝦夷盤扇貝(Patinopecten yessoensis)、櫛孔扇貝(Chlamys farreri)分離的扇貝多肽，糖蛋白都有抗癌作用。從紫貽貝(Mytilus edulis)和地中海 貽貝(Mytilusgalloprovincials)中分離出的多種抗菌肽防御素(defensin)、貽貝素 (mytilin)、貽貝肽(myticin)和貽貝霉素(mytimycin)，皆為小分子肽。
活性肽的抗腫瘤作用大多是通過增強機體特異性和非特異性免疫功能、促進細(xì) 胞活性因子生成、抗自由基與輻射損傷、促進癌細(xì)胞凋亡及直接作用于腫瘤細(xì)胞等多種機 制而實現(xiàn)的。運用生物技術(shù)手段從大量的蛋白資源中酶解獲取新的免疫增強肽，這是在功 能肽的研究與開發(fā)過程中解決肽源問題、實現(xiàn)海洋水產(chǎn)品綜合利用的一個可行的現(xiàn)實途 徑。如公開號為CN1660888的中國專利，公開了利用枯草芽孢桿菌(Bacillus. Subtilis SM98011)從中國毛蝦的蛋白酶解產(chǎn)物中分離純化出新的具有六個氨基酸的降壓肽，具有較 高的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制活性。 已有報道從陸地蛋白資源的酶解物中分離到的免疫增強活性肽具有很好的免疫 促進及抑制腫瘤的效果，而來源于海洋蛋白酶解產(chǎn)物的免疫增強肽及相應(yīng)的療效還少有報 道，海洋蛋白以其特殊性和豐富性必將成為酶解制備新型免疫增強肽的更大的資源庫。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用酶工程和生化工程技術(shù)，酶解海洋貝 類制備具有免疫增強活性的酶解短肽產(chǎn)品，可用于腫瘤患者或免疫力低下的人群的康復(fù)治 療。
—種酶解海洋貝類免疫增強肽的制備方法，其特征在于，步驟如下 (1)取枯草芽孢桿菌(Bacillus. Subtilis SM98011)依次經(jīng)種子培養(yǎng)基、三角瓶
液體發(fā)酵培養(yǎng)基、罐發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)后，離心，取上清液，得粗酶液；
(2)取海洋貝類，去殼后，經(jīng)勻漿機(江蘇省金壇市宏華儀器廠，型號FSH-2)勻漿， 得貝類糜； (3)向步驟(2)制得的貝類糜中加入步驟(1)制得的粗酶液，添加量為每千克貝類
糜添加450， 000 550， 000活力單位的粗酶液，45 55。C酶解4 6h，然后升溫至90°C，
保溫15min滅酶活，然后降溫至7(TC，取酶解液，離心機(德國印pendorf ， 5804R)離心，濃
縮，干燥(無錫博達化機廠，QZ-5型移動式噴霧干燥機)，得酶解海洋貝類免疫增強肽。所述步驟(2)中的海洋貝類，選自扇貝、四角蛤或牡蠣之一或其組合。 所述步驟(1)中的種子培養(yǎng)基組份如下蛋白胨1%，酵母粉0.3%，葡萄糖1%，
瓊脂1. 6%，余量水，pH 7. 2-7. 5 ;培養(yǎng)條件28 30°C， 120rpm，搖床培養(yǎng)36小時。 所述步驟(1)中的三角瓶液體發(fā)酵培養(yǎng)基組份如下玉米粉2%，麩皮1%，豆粕
2%，Na2HP04 0. 1%，KH2P04 0 . 03%，CaCl2 0. l%，Na2C03 0. 1X，余量水，pH 7. 2-7. 5 ;接禾中
量5wt^液體種子，培養(yǎng)條件28 30°C， 180rpm，搖床培養(yǎng)36小時。 所述步驟(1)中的罐發(fā)酵培養(yǎng)基組份如下玉米粉2%，麩皮1%，豆粕2%，
Na2HP04 0.1%， KH2P04 0 . 03%， CaCl2 0.1%， Na2C03 0. 1%，余量水，pH 7. 2-7. 5 ;接種量:
5wt^液體種子，培養(yǎng)條件溶氧DO維持在20%以上，28 3(TC，培養(yǎng)36小時。 所述步驟(3)中的活力單位定義為在最適酶活溫度下，每分鐘催化酪蛋白水解生
成1微克酪氨酸的酶量為1個活力單位。 由上述制備方法制得的海洋貝類免疫增強肽。該產(chǎn)品呈金黃色略帶綠色粉末狀，
帶海洋貝類的鮮香味，易溶于水，水溶液澄清透明，略帶金黃色。 上述海洋貝類免疫增強肽在抗腫瘤活性與免疫增強活性治療中的應(yīng)用。 本發(fā)明通過利用枯草芽孢桿菌(Bacillus. Subtilis SM98011)產(chǎn)生的蛋白酶對海
洋貝類進行酶解，得到了具有抗腫瘤活性與免疫增強活性的活性肽。由于海洋蛋白具有其
特殊性和豐富性，因此為人類研究腫瘤發(fā)病機理，研制抗腫瘤藥物，提高免疫機能提供了新
的途徑。


圖1是海洋貝類小試、中試及工業(yè)化生產(chǎn)的酶解液中貝類免疫增強肽的HPLC圖
譜；其中A、工業(yè)化生產(chǎn)酶解液，B、中試酶解液，C、小試酶解液； 圖2是海洋貝類工業(yè)化生產(chǎn)的酶解液、濃縮液及噴霧干燥樣品中肽譜的HPLC圖
譜；其中A、噴霧干燥樣品，B、酶解上清液，C、濃縮酶解液；
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步闡述，但本發(fā)明所保護范圍不限于此。 實施例 1、粗酶液的發(fā)酵制備 (1)本發(fā)明使用的菌株枯草芽孢桿菌(Bacillus. Subtilis SM98011)。
(2)種子培養(yǎng)基及其制備采用LB培養(yǎng)基蛋白胨1%，酵母粉0. 3%，葡萄糖1%，
pH7. 2-7. 5。裝液量100mL/500mL三角瓶，28 30°C ， 120rpm，培養(yǎng)36小時。斜面固體培養(yǎng)
基添加瓊脂1.6%。
(3)三角瓶液體發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵產(chǎn)酶玉米粉2%，麩皮1%，豆粕2%， Na2HP04 0.1%， KH2P04 0 . 03%， CaCl2 0.1%， Na2C03 0. 1%， pH 7. 5，裝液量50mL/500mL三角瓶， 180rpm，發(fā)酵72h，離心，上清液即為粗酶液(蛋白酶SM98011)。 (4) 5L罐發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵產(chǎn)酶玉米粉2% ，麩皮1 % ，豆粕2% ， Na2HP04 0. 1 % ， KH2P040. 03%， CaCl2 0. l%，Na2C03 0.1%， pH 7.5。裝3. 5L培養(yǎng)基，滅菌后pH 7. 5，接種 5% (重量百分比)液體種子，溶氧D0維持在20X以上，控制培養(yǎng)溫度為28t:，發(fā)酵36h，離 心得上清液即為粗酶液(蛋白酶SM98011)。 (5)200L發(fā)酵罐培養(yǎng)基及發(fā)酵產(chǎn)酶玉米粉2%，麩皮1%，豆粕2%， Na2HP04 0. 1%，KH2P04 0 . 03%，CaCl2 0. l%，Na2C03 0.1%，pH 7. 5。裝150L培養(yǎng)基，滅菌后pH 7.5， 接種5% (重量百分比)液體種子，控制通氣量為5L/min，控制培養(yǎng)溫度為28t:，發(fā)酵36h， 離心得上清液即為粗酶液(蛋白酶SM98011)。
(6)蛋白酶SM98011的酶活測定 采用福林酚法，以2wt^酪蛋白為底物。用0. lmol/L的磷酸緩沖液(pH 7. 0)將酶 液稀釋合適的倍數(shù)，取lmL稀釋好的酶液，在一定的溫度下保溫2min，加入同樣溫度的底物 lmL，恒溫下反應(yīng)10min后，加入2mL 0. 4mol/L的三氯乙酸終止反應(yīng)，在40。C下保溫15min 后，10， OOOg離心10min，取lmL上清液加入5mL 0. 4mol/L的碳酸鈉，混勻后加入lmL福林 試劑，混勻后在4(TC保溫20min，然后用722分光光度計測定660nm處的OD值。標(biāo)準(zhǔn)曲線 用不同濃度的酪氨酸來制定。酶活力定義為在最適酶活溫度下，每分鐘催化酪蛋白水解生 成1微克酪氨酸的酶量為1個單位(U)。
2、免疫增強肽的制備
(1)海洋貝類酶解的小試工藝 將去殼鮮貝類(扇貝、四角蛤、牡蠣等)用勻漿機勻漿，稱重50g到250mL的三角 瓶中，每瓶中加入活力為2500U/mL的酶液10mL和40mL的蒸餾水，對照瓶中加入50mL的蒸 餾水，混勻，放入50°C的水浴搖床在150轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下酶解5h，然后迅速把酶解液加熱 到90°C ，保溫10min，使酶滅活。取酶解物8000g離心20min，將上清用分子量3000Da的膜 超濾(Amicon PM-3 membrane, Milllipore Co. Bediord， USA)，得至l扮子量小于3000Da的 濾過液，即為酶解液，凍干備用。 (2)海洋貝類酶解的中試及工業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)工藝 IOOL罐酶解鮮貝類(扇貝、四角蛤、牡蠣等)去殼后用攪拌機勻漿，稱取40kg貝 類糜到100L的酶解罐中，然后加入500， OOOU/kg的酶液，最后用水補足到總體積75L，連續(xù) 攪拌，在5(TC下酶解5h，然后迅速把酶解罐加熱到9(TC，保溫15min使酶滅活。降到70°C 后，將酶解液放出，用連續(xù)離心機離心，然后經(jīng)過二級濃縮塔(恒泰化工設(shè)備廠，WZ型系列) 濃縮，將得到的濃縮液在噴霧干燥器里噴霧干燥。 10噸罐酶解將從大魚島集團購得的牡蠣去殼后攪拌機勻漿，稱取3000kg到10 噸的酶解罐中，然后加入500， OOOU/kg的酶液，最后用水補足到總體積7500L，連續(xù)攪拌，在 5(TC下酶解5h，然后迅速把酶解罐加熱到90°C ，保溫15min使酶滅活。降到7(TC后，將酶解 液放出，用連續(xù)過濾機過濾(江蘇巨能機械有限公司，GXG系列多功能過濾機)，然后泵入三 級濃縮塔(恒泰化工設(shè)備廠，WZ型系列)濃縮，將得到濃縮液在干燥塔里噴霧干燥。
3、免疫增強肽的質(zhì)量檢測
(1)海洋貝類小試、中試酶解產(chǎn)物的氨基酸組成分析 游離氨基酸測定方法酶解液上清(lmL)加入4%的磺基水楊酸(lmL)，混勻，靜置 30min，4°C 10， 000g離心15min。上清游離氨基酸分析在HITACHI 835氨基酸自動分析儀 上進行。 全水解氨基酸取lmL的蛋白酶酶解液，加入等體積的6mol/L HC1，在11(TC水解 22h，然后通過真空干燥使HCl完全揮發(fā)，干燥的樣品重新溶于0. lmol/L的琥珀酸緩沖液中 (pH 2.2)。重溶的樣品在HITACHI 835氨基酸自動分析儀分析，所得結(jié)果為樣品的全水解
氨基酸。 肽含量T肽(％ ) = (W總-WFAA) /W總， 其中W總肽與游離氨基酸混合物重；WFAA :游離氨基酸重。 上述中試及工業(yè)化酶解過程中，上清液顏色橙黃，沉淀為深黃色，都帶有濃郁的鮮
香味。然后在5(TC左右經(jīng)真空濃縮得到濃縮液，酶解液被濃縮了8倍左右。最后噴霧干燥
得到粉狀制品，制品呈金黃色略帶綠色粉末狀，帶海洋貝類的鮮香味，易溶于水，水溶液澄
清透明，略帶金黃色。得到上清液中肽的含量為可溶性蛋白的58.6%。說明海洋貝類在經(jīng)
過蛋白酶SM98011酶解后的酶解產(chǎn)物絕大多數(shù)為肽類物質(zhì)。 (2)海洋貝類小試、中試、工業(yè)化生產(chǎn)的酶解產(chǎn)物的肽譜分析將海洋貝類的酶解產(chǎn)物用分子量3000 Da的膜超濾(Amicon PM_3 membrane
MillliporeCo. Bediord， USA)，得到分子量小于3000Da的濾過液。 再將超濾液用0. 22 ii m的微孔濾膜過濾，然后將濾過液上高壓液相色譜(HPLC)反 相柱進行肽的分析。洗脫方法為前40min內(nèi)，洗脫液從95%的流動相A (含0. 1 % TFA的 蒸餾水)變化到50%流動相B (含0. 1 % TFA的甲醇溶液)，再回到95%流動相A，整個梯 度洗脫過程為60min，流速為0. 8mL/min，紫外檢測器的檢測波長為214nm。結(jié)果見圖l，從 HPLC檢測表明，雖然試驗規(guī)模不斷放大，但酶解液的肽分布基本上沒有變化，呈現(xiàn)較穩(wěn)定的 規(guī)律性，為該產(chǎn)品實行規(guī)模化生產(chǎn)提供了可靠的依據(jù)。 進一步將海洋貝類工業(yè)化生產(chǎn)過程中得到的酶解上清液，濃縮液和干粉分別進行
稀釋離心和重溶稀釋離心處理，將配制好的合適濃度的樣品溶液，用O. 22ym的微孔濾膜
過濾，然后將濾過液上高壓液相色譜反相柱進行肽的分析，結(jié)果如圖2所示。 從HPLC檢測表明，雖然在整個海洋貝類工業(yè)化生產(chǎn)的過程中經(jīng)過了 5(TC高速攪
拌酶解，9(TC高溫滅酶活，高溫濃縮和噴霧干燥等條件劇烈的加工步驟，但是各部之間酶解
液中的肽分布還是保持了較好的重復(fù)性，說明劇烈的加工條件對分子量較小的肽的影響不
大，為進一步功能評價提供了可靠的依據(jù)。 4、免疫增強肽的性能檢測 (1)實驗動物及細(xì)胞 普通級BALB/c小鼠，6 8周齡共63只，雌性，體重18 22g ;腹水瘤小鼠2只。 YAC-1細(xì)胞系。 (2)分組及給藥劑量 63只BALB/c小鼠置于密封特殊動物房適應(yīng)性喂養(yǎng)2天后平均分成7個組，分別 為空白對照組，低劑量組(灌胃劑量250mg/kg)，中劑量組(500mg/kg)，高劑量組(1000mg/ kg)，粗品組(未經(jīng)超濾粗樣1000mg/kg)，陰性對照組(灌胃生理鹽水25mL/kg)，陽性對照組(腹腔注射環(huán)磷酰氨20mg/kg)。陽性對照組腹腔注射環(huán)磷酰氨2日 一次，每次0. 2mL ;其 它組灌胃牡蠣酶解液每日一次，一次0. 5mL，連續(xù)給藥14天。
(3)瘤種準(zhǔn)備及接種 除正常對照組，其他小鼠提前一天接種鼠肉瘤細(xì)胞株S180。腫瘤移植要求在無菌 條件下進行。將腹水瘤種鼠拉頸處死，用酒精棉球消毒其腹部皮膚，再用無菌注射器抽取腹 水，用生理鹽水稀釋5倍，混勻。用無菌注射器按0. 2mL/只接種于小鼠右前側(cè)腋下皮下，建 立實體瘤模型。整個接種時間應(yīng)盡量短，一般不超過30min以上。接完后分籠貼標(biāo)簽飼養(yǎng)。
(4)小鼠體重變化及臟器/體重比值 用電子稱稱量小鼠每日體重變化。最后拉頸處死動物，無菌條件下取胸腺、脾臟稱 重，計算臟器/體重比值。同時制備脾細(xì)胞懸液，進行淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗和NK細(xì)胞活性試 驗。胸腺指數(shù)-胸^^^(mg);脾臟指數(shù)=，:^^^(mg、)。
小鼠重量(g) 小鼠體重(g)
分組胸腺指數(shù)(mg/g)脾指數(shù)(mg/g)
空白對照組0.6480士0.1143'6.0961±0.3930"*
陽性對照CTX0.5953±0.0565**5.6334士1.010(T
陰性對照組0.8154±0.07408.8186±0.3967
低劑量(250mg/kg)0.6969±0.14109.4700±1.1800
中劑量(500mg/kg)0.8665±0.01009.4267±0.7975
高劑量(1000mg/kg)L0014士0.0898'10.7345±0.7030"
粗品組0.9397±0.1937**10.2135±0.6570* *與陰性對照組相比顯著性P < 0. 05. **與陰性對照組相比顯著性P < 0. 01. ***與
陰性對照組相比顯著性P < 0. 001.(5)瘤重及抑瘤率 拉頸處死小鼠后，取瘤稱重。
抑瘤一對照組平均g重二實，g平均瘤重x酵,。
對照組平均瘤重分組瘤重(g)抑瘤率(％)
空白對照組--
陽性對照CTX*木* 0.449±0.11882.5
陰性對照組2.567±0.077-
低劑量(250mg/kg)2.393±0.1116.8
中劑量(500mg/kg)1.781±0.226**30.6
高劑量(1000mg/kg)*承* 1,335±0.06648,0 粗品組 1.922士0.216" 25.1 *與陰性對照組相比顯著性P < 0. 05. **與陰性對照組相比顯著性P < 0. 01. ***與
陰性對照組相比顯著性P < 0. 001. (6)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗 雞紅細(xì)胞懸液制備活雞心臟取血，按30U/mL雞血加入肝素鈉，用生理鹽水洗滌 2-3次后離心(2000r/min，10min)，去上清，用生理鹽水配成20X (v/v)的雞紅細(xì)胞懸液。
吞噬功能測定實驗前2天向小鼠腹腔注射3%淀粉溶液(含0. 4%臺盼藍，起標(biāo) 記作用)進行免疫以剌激腹腔產(chǎn)生較多的巨噬細(xì)胞。實驗時向小鼠腹腔注射20%的雞紅細(xì) 胞懸液lmL，輕揉腹部使雞紅細(xì)胞分散。15 20min后，拉頸處死小鼠。將小鼠置于解剖盤 中，剪開腹腔，把內(nèi)臟推向一側(cè)，用吸管吸取腹腔液，滴在載玻片上，用瑞氏染液染色3min， 漂洗晾干后鏡檢。 油鏡計數(shù)巨噬細(xì)胞每張片計數(shù)100個，按下式計算吞噬百分率和吞噬指數(shù)。
吞隨百分率=^||||||||^畫 計數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù)
滿*匕教=被吞噬的雞紅細(xì)胞總數(shù) 計數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù)分組吞噬百分率(％)吞噬指數(shù)
空白對照組50.0 ±3.61.077 ±0.045
陽性對照CTX373 ± 1.5*0.650 ±0.036*
陰性對照組46.0 ± 1.01.130 ±0.061
低劑量(250mg/kg)45.7 ± 1.51.073 ±0.059
中劑量(500mg/kg)54.3 ±2丫0.970 ± 0.070
高劑量(lOOOmg/kg)61.0 ±3.6*1.173 ±0.061
粗品組43.0 ±2.70.953 ± 0.050 *與陰性對照組相比顯著性P < 0. 05. **與陰性對照組相比顯著性P < 0. 01. ***與 陰性對照組相比顯著性P < 0. 001. (7) ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(MTT法) 脾細(xì)胞懸液制備無菌取脾，用鑷子將脾磨碎，制成單個細(xì)胞懸液。經(jīng)200目篩網(wǎng) 過濾，或用4層紗布將脾磨碎，用無菌Hank's液洗滌2次，每次離心lOmin (1000r/min)。然 后將細(xì)胞懸浮于lmL的RPMI1640完全培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)胞濃度為5X 106個/mL。
淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)將細(xì)胞懸液分兩孔加入24孔培養(yǎng)板中，每孔lmL， 一孔加 75 ii L100 ii g/mL的ConA液，另一孔作為對照。置5% C02， 37°C C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。培 養(yǎng)結(jié)束前4h，每孔輕輕吸去上清液0. 7mL，加入0. 7mL不含小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，同 時加入MTT (5mg/mL) 50 y L/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入lmL酸性異丙醇，吹打 混勻，使紫色結(jié)晶完全溶解。然后分裝到96孔培養(yǎng)板中，每個孔分裝3 6孔作為平行樣， 用酶聯(lián)免疫檢測儀，以570nm波長測定光密度值，以加ConA孔的OD值減去不加ConA孔的 OD值代表示淋巴細(xì)胞的增殖能力。
(8)NK細(xì)胞活性測定 靶細(xì)胞的制備(YAC-1細(xì)胞)實驗前24h將靶細(xì)胞進行傳代培養(yǎng)。使用前以 Hank' s液洗3次，用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1 X 104個/mL。
NK細(xì)胞活性檢測在U型96孔培養(yǎng)板的實驗孔中分別加入效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞 各100 ii L，效靶比例為50 : 1 ;在效應(yīng)細(xì)胞對照孔，加入效應(yīng)細(xì)胞100 ii L和RPMI 1640液 100 ii L ;在耙細(xì)胞對照孔，加入耙細(xì)胞100 ii L和RPMI 1640液100 y L ;上述各項均設(shè)三個 復(fù)孔，于37°C 、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h，然后每孔加入20 ii L MTT (5mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4h， 吸去部分上清，lOOii L/孔，各孔加入100% DMSO， 100ii L/孔，振蕩、溶解，10min后，在酶聯(lián) 免疫吸附測定儀上，579nm處測定光密度值(0D)。
NK細(xì)胞活性(％) =ODt—(ODs—ODe)x100%
ODt 其中0DS為實驗孔的平均0D值，0DE是效應(yīng)細(xì)胞對照孔的平均OD值，0DT是耙細(xì)胞 對照孔的平均OD值。 運用balb/c小鼠接種S180瘤種建立荷瘤小鼠模型，灌胃牡蠣酶解產(chǎn)品檢測其對 小鼠體內(nèi)S180肉瘤生長的影響。并選用單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能、NK細(xì)胞殺傷活性及ConA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力測定等幾項實驗，研究牡蠣酶解物的免疫增強活性。結(jié)果表明，牡 蠣酶解物對S180肉瘤生長有抑制作用，同時能提高胸腺/體重比值、脾臟/體重比值、NK細(xì) 胞活性及淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力，對單核-巨噬細(xì)胞吞噬能力無影響。實驗說明牡蠣酶解物有 增強小鼠免疫能力的作用。為開發(fā)牡蠣抗腫瘤活性藥物和功能性食品奠定了一定的試驗基 礎(chǔ)。
分組NK細(xì)胞活性(y。)脾淋巴細(xì)胞增殖 光吸收570 nm
空白對照組42,22 ± 12.600.6800 ±0.0735'
陽性對照CTX20.70 ± 6.76*0.1589 ±0.0868**
陰性對照組29.37 ± 8.830.5070 ±0.0558
低劑量(250mg/kg)43.64 ±9.7(f0.7084 ±0.1807
中劑量(500mg/kg)承承 51.65 ±9.690.8219 ±0.0256***
高劑量(1000mg/kg)58.35 ± 12.5(T*0.8640 ± 0.0456***
粗品組44.30 ± 12.10*0.7536 ±0.1196' *與陰性對照組相比顯著性P < 0. 05. **與陰性對照組相比顯著性P < 0. 01. ***與 陰性對照組相比顯著性P < 0. 001。
權(quán)利要求
一種酶解海洋貝類免疫增強肽的制備方法，其特征在于，步驟如下(1)取枯草芽孢桿菌(Bacillus.Subtilis SM98011)依次經(jīng)種子培養(yǎng)基、三角瓶液體發(fā)酵培養(yǎng)基、罐發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)后，離心，取上清液，得粗酶液；(2)取海洋貝類，去殼后，經(jīng)勻漿機勻漿，得貝類糜；(3)向步驟(2)制得的貝類糜中加入步驟(1)制得的粗酶液，添加量為每千克貝類糜添加450,000～550,000活力單位的粗酶液，45～55℃酶解4～6h，然后升溫至90℃，保溫15min滅酶活，然后降溫至70℃，取酶解液，離心機離心，濃縮，干燥，得酶解海洋貝類免疫增強肽。
2. 如權(quán)利要求1所述的酶解海洋貝類免疫增強肽的制備方法，其特征在于，步驟(2)中 的海洋貝類，選自扇貝、四角蛤或牡蠣之一或其組合。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的酶解海洋貝類免疫增強肽的制備方法，其特征在于，步驟 (1)中的種子培養(yǎng)基組份如下蛋白胨1 % ，酵母粉0. 3% ，葡萄糖1 % ，瓊脂1. 6% ，余量水， pH 7. 2-7. 5 ;培養(yǎng)條件28 30°C， 120rpm，搖床培養(yǎng)36小時。
4. 如權(quán)利要求1或2所述的酶解海洋貝類免疫增強肽的制備方法，其特征在于，步驟 (1)中的三角瓶液體發(fā)酵培養(yǎng)基組份如下玉米粉2%，麩皮1%，豆粕2%，Na2HP04 0. 1%， KH2P04 0 . 03%， CaCl2 0. 1%， Na2C03 0. 1%，余量水，pH 7. 2-7. 5 ;接種量5wt^液體種子， 培養(yǎng)條件28 30°C， 180rpm，搖床培養(yǎng)36小時。
5. 如權(quán)利要求1或2所述的酶解海洋貝類免疫增強肽的制備方法，其特征在于，步驟 (1)中的罐發(fā)酵培養(yǎng)基組份如下玉米粉2 % ，麩皮1 % ，豆粕2 % ， Na2HP04 0. 1 % ， KH2P04 0. 03%，CaCl2 0. l%，Na2C03 0. 1X，余量水，pH 7. 2-7. 5 ;接種量5wt^液體種子，培養(yǎng)條 件溶氧DO維持在20%以上，28 30。C，培養(yǎng)36小時。
6. 如權(quán)利要求1或2所述的酶解海洋貝類免疫增強肽的制備方法，其特征在于，步驟 (3)中的活力單位定義為在最適酶活溫度下，每分鐘催化酪蛋白水解生成l微克酪氨酸的 酶量為l個活力單位。
7. 由上述權(quán)利要求1制備方法制得的海洋貝類免疫增強肽。
8. 權(quán)利要求7所述的海洋貝類免疫增強肽在抗腫瘤活性與免疫增強活性治療中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用酶工程技術(shù)酶解海洋扇貝、四角蛤、牡蠣等海洋貝類，制備免疫增強肽的技術(shù)方法，屬于應(yīng)用海洋生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過利用枯草芽孢桿菌(Bacillus.Subtilis SM98011)產(chǎn)生的蛋白酶對海洋貝類進行酶解，得到了具有抗腫瘤活性與免疫增強活性的活性肽。由于海洋蛋白具有其特殊性和豐富性，因此為人類研究腫瘤發(fā)病機理，研制抗腫瘤藥物，提高免疫機能提供了新的途徑。
文檔編號A61P35/00GK101736064SQ20101001189
公開日2010年6月16日 申請日期2010年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月20日
發(fā)明者何海倫, 周百成, 張玉忠, 王昱凱, 陳秀蘭 申請人:山東大學(xué)