專利名稱：類固醇激素修飾的陽離子聚合物及其基因復(fù)合物的制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及陽離子聚合物基因載體和基因治療領(lǐng)域，具體涉及類固醇激素修飾的陽離子聚合物的制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明還涉及聚合物與質(zhì)粒DNA形成復(fù)合物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
基因治療是將目的基因作為“藥物”輸送到患者體內(nèi)，以治療疾病的一種追根溯源 的分子治療技術(shù)。基因治療對于許多先天性疾病和獲得性疾病(如癌癥、自身免疫疾病、糖 尿病、心臟病、高血壓等)是一種有效的治療方法，它能在體內(nèi)產(chǎn)生生物活性因子或阻止細(xì) 胞內(nèi)非正常機(jī)制，使相應(yīng)疾病得以防止、減輕、代償或糾正，直至最終治愈各種疾病。因此基 因治療將是解決因基因變異所引發(fā)疾病的首選策略。在基因治療的具體實施中，基因傳輸載體的選擇至關(guān)重要。目前常見的基因傳輸 載體包括病毒載體和非病毒載體兩大類，用于基因治療臨床實驗中約有70%以上是使用病 毒載體，但其存在潛在的安全隱患、免疫原性、基因有效荷載量低等缺點，這極大的限制了 其臨床應(yīng)用。相比而言，非病毒載體的安全性優(yōu)良、基因荷載量大、制備過程簡單等方面具 有突出優(yōu)勢。但由于體內(nèi)存在多種生理障礙，使非病毒載體轉(zhuǎn)基因效率相對較低。理想的基因傳輸載體應(yīng)當(dāng)能夠安全、有效、可控地將外源性治療基因遞送至靶細(xì) 胞，克服各種生理屏障是確保載體發(fā)揮基因治療作用的前提。人體內(nèi)的生理屏障包括(1) 血液屏障DNA及其轉(zhuǎn)運(yùn)載體在血液中必須保持物理化學(xué)穩(wěn)定性；(2)細(xì)胞膜屏障DNA/載 體復(fù)合物需要選擇靶細(xì)胞，并穿過細(xì)胞膜；(3)內(nèi)涵體和溶酶體基因/載體復(fù)合物在胞內(nèi) 必須從內(nèi)涵體中逃逸，并不被溶酶體酶降解；(4)胞漿屏障基因/載體復(fù)合物在胞漿中的 擴(kuò)散受到嚴(yán)重阻礙，其必須穿過胞漿而后進(jìn)入核內(nèi)才可進(jìn)行基因表達(dá)；(5)核膜屏障除 有絲分裂時外，外來物質(zhì)進(jìn)入核內(nèi)的唯一途徑就是核孔復(fù)合物(nuclear pore complex, NPC)。在克服各種生理屏障時，陽離子聚合物非病毒載體有較大的優(yōu)勢，因為研究者能 夠在聚合物的骨架上進(jìn)行多樣性的物理化學(xué)修飾，使聚合物具有特定功能化的基團(tuán)以滿足 克服生理屏障的基因傳輸需要。目前常見的陽離子多聚物有聚乙烯亞胺(polyethylenimine，PEI)、多聚賴氨 酸(poly-L-lysine，PLL)、魚精蛋白、多聚精氨酸、殼聚糖(chitosan)、多胺樹突狀物 (polyamidoamine dendrimer)、聚丙烯亞胺樹突狀物(polypropylenimine dendrimers)、 多聚組氨酸、組氨酸賴氨酸分枝狀聚合物等。自1995年Boussif等報道了 PEI可作為非病 毒基因載體后，由于其制備方法簡單、價格便宜、轉(zhuǎn)染效率高和“質(zhì)子海綿效應(yīng)”等優(yōu)點，PEI 成為陽離子聚合物基因載體研究的熱點。但與病毒載體相比，陽離子聚合物的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效 率要低很多，其中最主要限制步驟是來自胞內(nèi)的核膜屏障。細(xì)胞核表面的核孔復(fù)合物對進(jìn) 出細(xì)胞核的粒子有著極其嚴(yán)格的控制，大部分基因傳輸載體均不能有效通過核孔復(fù)合物。非常遺憾，聚合物基因載體在細(xì)胞核靶向轉(zhuǎn)運(yùn)方面的研究仍進(jìn)展緩慢。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之一是提供一種具有細(xì)胞核靶向功能的陽離子聚合物。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之二是提供一種具有靶向性、輔助腫瘤治療、輔助抗 炎治療多重作用的陽離子聚合物，充分提高基因靶向傳輸和基因表達(dá)效率。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之三是提供一種工藝簡單，適用可靠，成本低廉的上 述陽離子聚合物的制備方法。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之四是提供上述陽離子聚合物作為基因載體的應(yīng)用。本發(fā)明應(yīng)用類固醇激素修飾陽離子聚合物，得到具有細(xì)胞核靶向功能的基因載 體。類固醇激素包括糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoid，GC)和雌激素等。類固醇激素能夠通過 非基因組效應(yīng)與細(xì)胞膜上的激素受體結(jié)合位點發(fā)生特異性，攜帶外源物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞；同時 存在于細(xì)胞漿(核)內(nèi)非活性形式的激素受體與GC結(jié)合后，受體構(gòu)象發(fā)生改變，使受體上 的核定位序列暴露，協(xié)助激素_受體復(fù)合物通過細(xì)胞核孔復(fù)合物進(jìn)行核轉(zhuǎn)運(yùn)；隨后激素_受 體復(fù)合物在細(xì)胞核內(nèi)二聚體化，并與靶基因啟動子附近的特異序列激素反應(yīng)元件(HRE)結(jié) 合，發(fā)揮基因組調(diào)節(jié)效應(yīng)調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄過程，抑制或增強(qiáng)相關(guān)基因的表達(dá)，從而發(fā)揮重要 的生理作用。此外，近年來還有許多實驗證實經(jīng)類固醇激素處理過的細(xì)胞核，其核膜表面的 核孔復(fù)合物的孔徑會顯著增大，并能夠迅速有效地幫助大分子物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核。因此，使用 類固醇激素修飾陽離子聚合物可實現(xiàn)細(xì)胞核靶向。本發(fā)明提供的陽離子聚合物還具有輔助腫瘤治療、輔助抗炎治療的多重作用，為 基因治療提供了一種嶄新的思路。類固醇激素及受體與多種腫瘤的發(fā)生和治療關(guān)系密切， 如在多數(shù)的婦科腫瘤中雌激素受體高表達(dá)，成為多種癌癥發(fā)生的明顯標(biāo)志之一和潛在的靶 向治療靶點，服用類固醇激素藥物可以有效地降低卵巢癌等的發(fā)生幾率。此外，類固醇激素 還可以用于抗炎，抗免疫等方面的治療。許多腫瘤的發(fā)生同時伴隨著炎癥以及免疫功能的 異常(比如致炎因子NF-κ B)，并且非病毒載體在遞送DNA的過程中往往會引起一定的免疫 原性和炎癥反應(yīng)，從而致降低了基因治療的效果。糖皮質(zhì)激素能通過依賴性調(diào)節(jié)和蛋白干 擾機(jī)制阻遏致炎蛋白的表達(dá)，引起腫瘤細(xì)胞的凋亡。本發(fā)明提供的類固醇激素修飾的陽離子聚合物的制備方法如下a.類固醇激素溶于有機(jī)溶劑中，加入氧化劑，在N2保護(hù)下反應(yīng)，將類固醇激素21 位α -羥基酮氧化為羧基，停止反應(yīng)，除去溶劑，溶解沉淀，調(diào)節(jié)溶液PH值，使產(chǎn)物析出，沉 淀經(jīng)洗滌、過濾、干燥即得氧化類固醇激素；b.將陽離子聚合物與氧化類固醇激素溶于有機(jī)溶劑中，加入催化脫水劑，在N2保 護(hù)下反應(yīng)，停止反應(yīng)，過濾除去反應(yīng)溶液中不溶物，透析，0. 8 μ m濾膜過濾，干燥即得類固醇 激素修飾的陽離子聚合物。所述陽離子聚合物是可與質(zhì)粒DNA靜電自組裝形成復(fù)合物的聚合物，包括聚乙烯 亞胺、多聚賴氨酸、多聚精氨酸、多聚組氨酸、組氨酸賴氨酸分枝狀聚合物、殼聚糖氨基衍生 物、多胺樹突狀物、聚丙烯亞胺樹突狀物。所述類固醇激素是21位具有α-羥基酮結(jié)構(gòu)的激素，包括地塞米松、皮質(zhì)酮、倍他 米松、甲基氫化潑尼松、潑尼松龍、氫化潑尼松龍、去炎松、可的松、氫化可的松、曲安縮松、倍氯米松、氟輕松、氟甲松龍、氯潑尼醇、鹵米松、去羥米松、丙酮縮氟氫羥龍。上述聚合物作為基因載體應(yīng)用的轉(zhuǎn)染效率受到陽離子聚合物相對分子量和類固 醇激素修飾量的影響，為使該載體的效率最優(yōu)，選用不同相對分子量的陽離子聚合物和類 固醇激素修飾量比較篩選。優(yōu)選的聚乙烯亞胺的分子量范圍為600 70，000道爾頓，殼聚糖氨基衍生物的分子量范 圍為10000 100000道爾頓，多胺樹突狀物的代數(shù)范圍為1 10 ；類固醇激素的修飾量為 3% 30%。更優(yōu)選的陽離子聚合物為聚乙烯亞胺(分子量范圍為1800 25，000道爾頓)；類固醇激 素為地塞米松。在制備方法a步驟中，氧化劑用量增加，氧化類固醇激素產(chǎn)率增加，有利于反應(yīng)； 在制備方法b步驟中，不同的聚乙烯亞胺與氧化類固醇激素投料質(zhì)量比例可控制反應(yīng)程 度，得到不同類固醇激素修飾量的陽離子聚合物。優(yōu)選的步驟a中所使用的氧化劑為高碘酸或高碘酸鹽；類固醇激素與氧化劑的摩爾比例 范圍為1 0. 1 1 5;反應(yīng)時間范圍為3 72h;反應(yīng)溫度范圍為-4°c 37°C。步驟b中陽離子聚合物與類固醇激素的投料質(zhì)量比例為20 1 1 20;聚乙 烯亞胺與氧化類固醇激素反應(yīng)時間為4 48h ；催化脫水劑為1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙 基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)或1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥 基琥珀酰亞胺(NHS)合用；反應(yīng)溫度范圍為0°C 37°C。更優(yōu)選的步驟a中所使用的氧化劑為高碘酸鉀；類固醇激素與氧化劑的摩爾比例范圍為 1 0. 5 1 1.5;反應(yīng)時間為24h;反應(yīng)溫度為室溫(15-30°c)。步驟b中陽離子聚合物與類固醇激素的質(zhì)量比例為10 1 1 1;所使用的催 化脫水劑為EDC ；反應(yīng)時間為24h ；反應(yīng)溫度為0°C。所述制備方法路線圖如下<formula>formula see original document page 6</formula>本發(fā)明還提供所述聚合物作為基因載體的應(yīng)用，其特征在于包括下列步驟將聚合物和質(zhì)粒DNA分別溶于緩沖溶液，取兩種溶液混合，室溫靜置IOmin 2h， 聚合物和質(zhì)粒DNA通過靜電自組裝形成聚合物/質(zhì)粒DNA復(fù)合物。所述的質(zhì)粒DNA，其特征在于質(zhì)粒DNA是包含報告基因、抗癌基因、細(xì)胞因子基因 的可在真核細(xì)胞中重組表達(dá)的質(zhì)粒DNA。聚合物載體與質(zhì)粒DNA的制備方法及質(zhì)量比例會影響所制得的復(fù)合物粒徑、細(xì)胞 毒性及轉(zhuǎn)染效果。優(yōu)選的聚合物溶液的溶媒為磷酸鹽緩沖液、或4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液(HEBS緩沖 液)、或氯化鈉溶液、或葡萄糖溶液；質(zhì)粒DNA溶液的溶媒為三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四 乙酸緩沖液(TE緩沖液)；聚合物溶液的濃度范圍為0. 01 10mg/ml ；質(zhì)粒DNA溶液的濃度 范圍為0. Ol 10mg/ml ；載體與質(zhì)粒DNA的質(zhì)量比例范圍為0. OOl 60 ；載體和質(zhì)粒DNA 混合后靜置時間為IOmin 2h。更優(yōu)選的聚合物溶液的溶媒為磷酸鹽緩沖液；聚合物溶液的濃度范圍為0. 1 lmg/ml ；質(zhì) 粒DNA溶液的濃度范圍為0. 1 lmg/ml ；載體與質(zhì)粒DNA的質(zhì)量比例范圍為0. 1 20 ；載 體和質(zhì)粒DNA混合后靜置時間為0. 5 Ih。本發(fā)明通過凝膠阻滯實驗驗證聚合物對質(zhì)粒DNA的包裹能力，并通過核酸酶降解 實驗考察聚合物/質(zhì)粒DNA復(fù)合物抵抗核酸酶降解的能力，進(jìn)而驗證復(fù)合物在轉(zhuǎn)染條件下 的穩(wěn)定性，詳見實施例6。
本發(fā)明通過MTT法測試了類固醇激素修飾的陽離子聚合物的細(xì)胞毒性，具體步驟 見實施例9。本發(fā)明提供了聚合物/質(zhì)粒DNA復(fù)合物在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的應(yīng)用，其特征在于聚合 物基因載體的人體腫瘤細(xì)胞、或內(nèi)皮細(xì)胞、或上皮細(xì)胞等的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)，把載有質(zhì)粒DNA的復(fù) 合物與人體腫瘤細(xì)胞、或內(nèi)皮細(xì)胞、或上皮細(xì)胞等共培養(yǎng)，復(fù)合物可攜帶質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì) 胞。本發(fā)明使用類固醇激素修飾的陽離子聚合物進(jìn)行體外轉(zhuǎn)染實驗，以驗證聚合物/ 質(zhì)粒DNA復(fù)合物的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效果，具體步驟見實施例8。
本發(fā)明提供的聚合物/質(zhì)粒DNA復(fù)合物作為基因載體的應(yīng)用，其特征在于可以用 于注射給藥、或粘膜給藥、或口服給藥。本發(fā)明的優(yōu)點(1)本發(fā)明所制備的聚合物具有細(xì)胞核靶向性；(2)本發(fā)明所制備的聚合物具有靶向性、輔助腫瘤治療、輔助抗炎治療多重作用；(3)本發(fā)明所提供的制備方法工藝簡單，適用可靠，成本低廉；(4)本發(fā)明提供的聚合物可荷載的質(zhì)粒DNA范圍廣泛，外源質(zhì)粒DNA大小范圍可以 從幾十bp到幾千kb，克服了病毒載體外源基因荷載量小的缺點；(5)本發(fā)明提供的聚合物/質(zhì)粒DNA復(fù)合物可用于多個基因聯(lián)合轉(zhuǎn)導(dǎo)，同時也可作 為平臺技術(shù)用于制備可治療多種疾病的基因傳輸系統(tǒng)。


圖1為氧化地塞米松(a)和地塞米松-聚乙烯亞胺接枝聚合物(b)的1H-NMR圖 譜；圖2為凝膠阻滯實驗電泳圖片；圖3為核酸酶降解實驗電泳圖片；圖4為復(fù)合物的粒徑結(jié)果示意圖；圖5為樣品體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗的熒光照片。
具體實施例方式應(yīng)充分說明的是，以下實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。例 如本發(fā)明所描述的聚乙烯亞胺也可以是聚乙烯亞胺的衍生物，其分子量也不應(yīng)局限于所采 用的分子量。而作為靶向分子的類固醇激素種類不局限于實施例中所采用的范圍，應(yīng)具備 更廣闊的選擇尺度范圍，所有這些都不應(yīng)成為對權(quán)利要求的限制。實施例1地塞米松修飾 的聚乙烯亞胺聚合物的合成取0. Ig地塞米松，溶解于20ml無水乙醇，加入一定量H2SO4溶液，調(diào)解pH至3左 右，在N2保護(hù)下加入高碘酸鉀溶液使之完全混合，在室溫下反應(yīng)24h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑得 到白色沉淀，加入0. 05mol/LNa0H溶液溶解沉淀，用HCl調(diào)節(jié)體系pH至2，室溫放置2h，4°C 過夜，抽濾，以水洗滌沉淀，P2O5真空干燥即得到氧化地塞米松(O-Dex)。將PEI (Sigma, MW =25000)與中間體氧化地塞米松分別溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，將兩溶液混合后 置冰浴中，取適量的EDC溶解于DMF中，緩慢滴加至PEI和O-Dex的混合溶液中，反應(yīng)24h。反應(yīng)結(jié)束后，加入相當(dāng)于DMF總量5-10倍的0°C預(yù)冷的雙蒸水，抽濾除去不溶物。濾液在雙蒸水中透析(MWCO = 3500) 2天，透析液0. Sum濾膜過濾，低壓凍干，即為地塞米松修飾的聚 乙烯亞胺聚合物(Dex-g-PEI)。通過核磁共振對聚合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證。氧化地塞米松的1H-NMR圖譜(附圖1中a 所示)中，S 12. 4歸屬為α -羥基酮氧化產(chǎn)生的羧基中的羥基。Dex-g-PEI的H1-NMR圖譜 (附圖1中b所示)中，δ 0.9和1. 2歸屬為地塞米松五元環(huán)13、16位的甲基峰，且PEI的 亞甲基特征峰從2. 7位移至3. 2，證明PEI中化學(xué)接入了地塞米松，根據(jù)PEI亞甲基的積分 面積與地塞米松甲基積分面積的比值可計算出地塞米松修飾量為12.3%。結(jié)果表明，聚乙 烯亞胺化學(xué)連接在氧化地塞米松的的20位羧基上，生成了 Dex-g-PEI聚合物。實施例2潑尼松龍修飾的聚乙烯亞胺聚合物的合成取0. Ig潑尼松龍，溶解于20ml無水乙醇，加入一定量!^04溶液，調(diào)解pH至3左 右，在N2保護(hù)下加入高碘酸鉀溶液使之完全混合，在室溫下反應(yīng)24h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑得 到白色沉淀，加入0. 05mol/L NaOH溶液溶解沉淀，用HCl調(diào)節(jié)體系pH至2，室溫放置2h，4°C 過夜，抽濾，以水洗滌沉淀，P2O5真空干燥即得到氧化潑尼松龍(O-Pon)。將PEI (Sigma, MW =25000)與中間體氧化潑尼松龍分別溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，將兩溶液混合后 置冰浴中，取適量的EDC溶解于DMF中，緩慢滴加至PEI和O-Pon的混合溶液中，反應(yīng)24h。 反應(yīng)結(jié)束后，加入相當(dāng)于DMF總量5-10倍的0°C預(yù)冷的雙蒸水，抽濾除去不溶物。濾液在雙 蒸水中透析(MWC0 = 3500) 2天，透析液0. Sum濾膜過濾，低壓凍干，即為潑尼松龍修飾的聚 乙烯亞胺聚合物(Pon-g-PEI)。實施例3地塞米松修飾的殼聚糖氨基衍生物聚合物的合成取0. Ig地塞米松，溶解于20ml無水乙醇，加入一定量H2S04溶液，調(diào)解pH至3左 右，在N2保護(hù)下加入高碘酸鉀溶液使之完全混合，在室溫下反應(yīng)24h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑得 到白色沉淀，加入0. 05mol/LNa0H溶液溶解沉淀，用HCl調(diào)節(jié)體系pH至2，室溫放置2h，4°C 過夜，抽濾，以水洗滌沉淀，P2O5真空干燥即得到氧化地塞米松(O-Dex)。將殼聚糖氨基衍 生物(殼聚糖來自玉環(huán)縣海洋生物化學(xué)有限公司，MW= 10000，殼聚糖氨基衍生物為自制產(chǎn) 品)與中間體氧化地塞米松分別溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，將兩溶液混合后置冰浴 中，取適量的EDC溶解于DMF中，緩慢滴加至PEI和O-Dex的混合溶液中，反應(yīng)24h。反應(yīng)結(jié) 束后，加入相當(dāng)于DMF總量5-10倍的0°C預(yù)冷的雙蒸水，抽濾除去不溶物。濾液在雙蒸水中 透析(MWC0 = 3500) 2天，透析液0. Sum濾膜過濾，低壓凍干，即為地塞米松修飾的殼聚糖氨 基衍生物聚合物(Dex-g-Chi)。實施例4潑尼松龍修飾的殼聚糖氨基衍生物聚合物的合成取0. Ig潑尼松龍，溶解于20ml無水乙醇，加入一定量H2S04溶液，調(diào)解pH至3左 右，在N2保護(hù)下加入高碘酸鉀溶液使之完全混合，在室溫下反應(yīng)24h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑得 到白色沉淀，加入0. 05mol/L NaOH溶液溶解沉淀，用HCl調(diào)節(jié)體系pH至2，室溫放置2h， 4°C過夜，抽濾，以水洗滌沉淀，P2O5真空干燥即得到氧化潑尼松龍(O-Pon)。將殼聚糖氨基 衍生物(殼聚糖來自玉環(huán)縣海洋生物化學(xué)有限公司，MW= 10000，殼聚糖氨基衍生物為自制 產(chǎn)品)與中間體氧化潑尼松龍分別溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，將兩溶液混合后置冰 浴中，取適量的EDC溶解于DMF中，緩慢滴加至PEI和O-Pon的混合溶液中，反應(yīng)24h。反應(yīng) 結(jié)束后，加入相當(dāng)于DMF總量5-10倍的0°C預(yù)冷的雙蒸水，抽濾除去不溶物。濾液在雙蒸水中透析(MWCO = 3500) 2天，透析液0. Sum濾膜過濾，低壓凍干，即為潑尼松龍修飾的殼聚糖氨基衍生物聚合物(Pon-g-Chi)。實施例5Dex-g_PEI/質(zhì)粒DNA的構(gòu)建及電泳阻滯實驗為考察聚合物包裹DNA的能力，以實施例1所制備的地塞米松修飾的聚乙烯亞胺 聚合物為例，說明該實驗的具體步驟。將聚合物Dex-g-PEI溶于PBS緩沖液(pH = 7. 4)中， 配制成0. lmg/ml的溶液；質(zhì)粒DNA溶于TE緩沖液(pH = 7. 4)中，配制成0. lmg/ml的溶 液。按載體與質(zhì)粒 DNA 質(zhì)量比例 0. 133,0. 266,0. 398,0. 531,0. 664,0. 797,0. 930、1. 062、 1. 195，在渦旋混合儀上混和lmin，室溫靜置0. 5h，載體和質(zhì)粒DNA通過靜電自組裝成復(fù)合 物，復(fù)合物中所含DNA均為2 μ g。分別取15 μ 1復(fù)合物溶液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳觀察DNA 阻滯情況。電泳條件0. 7%瓊脂糖(含GoIdViewer )，0. 5 XTBE緩沖液，電壓90V，電泳時 間90min，結(jié)果如附圖2所示。圖2中第一泳道為質(zhì)粒DNA對照，第二到第八泳帶分別對應(yīng)聚合物與DNA的質(zhì)量 比為 0. 133,0. 266,0. 398,0. 531,0. 664,0. 797,0. 930,1. 062,1. 195。由于聚合物中帶正電 荷的氨基通過靜電作用同DNA中帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)結(jié)合，從而將DNA包裹在復(fù)合物內(nèi)部，使 其條帶消失。根據(jù)結(jié)果，當(dāng)質(zhì)量比為0.531時條帶消失，說明載體與DNA完全結(jié)合。實施例6核酸酶降解實驗為進(jìn)一步驗證經(jīng)過包裹的DNA抗核酸酶降解的能力，以實施例1所制備的地塞米 松修飾的聚乙烯亞胺聚合物為例，說明該實驗具體步驟。制備聚合物與DNA的質(zhì)量比分別 為 0. 133,0. 398,0. 664、1. 594 的復(fù)合物(其中含 DNA3 μ g)，加入含有 3unit DNase I 的反 應(yīng)緩沖液(pH 7. 4,50mM Tris-HCl, IOmM NaCl, IOmM CaCl2,6mM MgCl2)，37°C下孵育 lh，然 后加入10μ 1的EDTA(0. 1M)，80°C下加熱IOmin滅活DNase I。樣品中加入30μ1的肝素 (10mg/ml)，渦旋15min使DNA從復(fù)合物中解聚，進(jìn)行電泳實驗，其結(jié)果如附圖3所示。附圖3中第一泳道為經(jīng)酶解后的質(zhì)粒DNA，第二泳道至第五泳道分別對應(yīng)載體/ DNA的質(zhì)量比分別為0. 133,0. 398,0. 664、1. 594，第六泳道為DNA對照。根據(jù)結(jié)果可以看出， 當(dāng)質(zhì)量比大于0. 398時，能夠保護(hù)DNA不被核酸酶降解，而沒有載體保護(hù)的質(zhì)粒DNA (第一 泳道)則被完全降解了。實驗說明所制備的聚合物載體能夠有效地保護(hù)DNA，使DNA不會在 轉(zhuǎn)染過程中被降解。實施例7動態(tài)光散射(DLS)測定Dex-g-PEI/質(zhì)粒DNA復(fù)合物粒徑大小將實例2中制備得到的質(zhì)量比為0.664的復(fù)合物，取50 μ 1用PBS稀釋到1000 μ 1， 用粒徑和電位測定儀(Brookhaven，BI-ZetaPALS)進(jìn)行測定，結(jié)果見附圖4。根據(jù)實驗結(jié)果， 質(zhì)量比為0. 664時，Dex-g-PEI/DNA復(fù)合物的粒徑在160nm左右呈均一分布。實施例8細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗轉(zhuǎn)染前一天，將對數(shù)生長期的H印G2細(xì)胞接種于24孔板，使得次日細(xì)胞融合率達(dá) 80%-90%。轉(zhuǎn)染前4h，將細(xì)胞用無血清無雙抗的培養(yǎng)基孵育。于24孔板中加入質(zhì)量比為 1. 594的Dex-g-PEI/DNA復(fù)合物，于37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)4_6h，更換有血清無雙抗的培 養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h，對細(xì)胞進(jìn)行熒光檢測，觀察GFP的表達(dá)，結(jié)果見附圖5。根據(jù)實驗結(jié)果，圖5中能觀察到一定強(qiáng)度和數(shù)量的綠色熒光蛋白的表達(dá)，說明質(zhì) 量比為1. 594的Dex-g-PEI/DNA復(fù)合物具有較理想的轉(zhuǎn)染效果。實施例9MTT法測定聚合物的細(xì)胞毒性
將處于對數(shù)生長期的!fepG2細(xì)胞用0. 02 % EDTA消化，制成細(xì)胞懸液，分別以 1 X 105/ml細(xì)胞濃度加入96孔酶標(biāo)板內(nèi)，每孔100 μ 1，設(shè)五復(fù)孔，置37°C 5% CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng) 24h左右，再分別加入終濃度為5、25、50、75和100 μ g/ml的Dex-g-PEI，以未經(jīng)修飾的PEI 為對照，分別孵育24h后，每孔加入5mg/ml MTT溶液20 μ 1，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄去全部上清，加 入DMS0100 μ 1/孔，微型振蕩器上振動5min，使結(jié)晶完全溶解，于酶聯(lián)儀570nm波長處測定 吸光度值(A)，A值越高活細(xì)胞數(shù)也越多。根據(jù)A可計算藥物對細(xì)胞的活力抑制率。 (1_加藥組細(xì)胞平均吸■) χ100% 對照組細(xì)胞平均吸光值根據(jù)實驗結(jié)果，在不同濃度下經(jīng)統(tǒng)計分析，Dex-g-PEI的細(xì)胞毒性低于PEI。實施例lODex-g-PEI/DNA復(fù)合物基因傳輸系統(tǒng)荷瘤小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)基因試驗將!fepG2細(xì)胞株接種于BALB/C裸鼠皮下，建立腫瘤模型，待瘤塊長至直 徑約0.3 0. 5cm時，將荷瘤裸鼠隨機(jī)分組，每組5只，分別為生理鹽水組、質(zhì)粒 pIRES2-EGFP-p53 組、PEI/pIRES2_EGFP_p53 組、Dex-g-PEI/pIRES2_EGFP-p53 組。小鼠尾靜 脈內(nèi)注射攜帶5ugpIRES2-EGFP-p53質(zhì)粒的復(fù)合物進(jìn)行基因治療，每天注射一次，連續(xù)注射 3天，于第4日處死裸鼠，觀察腫瘤形態(tài)變化。分離腫瘤并稱重，以PBS緩沖液(pH 7.0)漂 洗腫瘤組織2次，OCT包埋液包埋腫瘤組織，冷凍切片，風(fēng)干，隨后在熒光顯微鏡下觀察EGFP 的表達(dá)。結(jié)果顯示，PEI/pIRES2-EGFP-p53 組、Dex-g-PEI/pIRES2_EGFP-p53 組瘤體重量減 輕，Dex-g-PEI/pIRES2-EGFP-p53組綠色熒光亮度較其他組強(qiáng)。實施例llDex-g-PEI/DNA復(fù)合物基因傳輸系統(tǒng)荷瘤小鼠肺部粘膜給藥轉(zhuǎn)基因試 驗用雄性無胸腺裸鼠構(gòu)建LM-6骨肉瘤細(xì)胞模型，將SA0S-LM6人源骨肉瘤細(xì)胞株 靜脈折射6周肺轉(zhuǎn)移，8周后可見肺部明顯腫瘤形貌。將荷瘤裸鼠隨機(jī)分組，每組5只， 分別為生理鹽水組、質(zhì)粒 pIRES2-EGFP-p53 組、PEI/pIRES2_EGFP-p53 組、Dex-g-PEI/ pIRES2-EGFP-p53組。將藥液氣霧給藥至肺部粘膜，給藥量為2mg質(zhì)粒/IOml氣霧溶液。初 次給藥后第三天再次給藥，一周兩次共六周，然后處死裸鼠，分離肺部腫瘤并稱重。以PBS 緩沖液(PH 7.0)漂洗腫瘤組織2次，OCT包埋液包埋腫瘤組織，冷凍切片，風(fēng)干，隨后在熒 光顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示，PEI/pIRES2-EGFP-p53 組、Dex-g-PEI/pIRES2_EGFP-p53 組瘤 體重量減輕，Dex-g-PEI/pIRES2-EGFP-p53組綠色熒光亮度較其他組強(qiáng)。實施例12抗炎作用6-8周的雄性BALB/c小鼠隨機(jī)分組，每組5只，分別給予PBS、地塞米松、 Dex-g-PEI。地塞米松給藥劑量為2mg/kg (1 %乙醇的PBS溶液)，按等摩爾量地塞米松計給 予相當(dāng)劑量的Dex-g-PEI。30min后，小鼠腹腔注射1.5mL 3%硫膠質(zhì)(1%乙醇的PBS溶 液)。注射4h后，收集腹水，計數(shù)中性粒細(xì)胞。結(jié)果顯示，與PBS組相比，Dex-g-PEI可抑制 腹水中的中性粒細(xì)胞聚集。
權(quán)利要求
一種類固醇激素修飾的陽離子聚合物，由陽離子聚合物共價連接氧化類固醇激素而成，其特征在于包括下列步驟a.類固醇激素溶于有機(jī)溶劑中，加入氧化劑，在N2保護(hù)下反應(yīng)，將類固醇激素21位α-羥基酮氧化為羧基，停止反應(yīng)，除去溶劑，溶解沉淀，調(diào)節(jié)溶液pH值，使產(chǎn)物析出，沉淀經(jīng)洗滌、過濾、干燥即得氧化類固醇激素；b.將陽離子聚合物與氧化類固醇激素溶于有機(jī)溶劑中，加入催化脫水劑，在N2保護(hù)下反應(yīng)，停止反應(yīng)，過濾除去反應(yīng)溶液中不溶物，透析，0.8μm濾膜過濾，干燥即得類固醇激素修飾的陽離子聚合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于陽離子聚合物與類固醇激素的投料質(zhì) 量比例為20 1 1 20，類固醇激素的修飾量為3% 30%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于陽離子聚合物是可與質(zhì)粒DNA靜電自 組裝形成復(fù)合物的聚合物，包括聚乙烯亞胺、多聚賴氨酸、多聚精氨酸、多聚組氨酸、組氨酸 賴氨酸分枝狀聚合物、殼聚糖氨基衍生物、多胺樹突狀物、聚丙烯亞胺樹突狀物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于類固醇激素21位具有α-羥基酮結(jié) 構(gòu)，包括地塞米松、皮質(zhì)酮、倍他米松、甲基氫化潑尼松、潑尼松龍、氫化潑尼松龍、去炎松、 可的松、氫化可的松、曲安縮松、倍氯米松、氟輕松、氟甲松龍、氯潑尼醇、鹵米松、去羥米松、 丙酮縮氟氫羥龍。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚合物作為基因載體的應(yīng)用，其特征在于包括下列步驟將聚合物和質(zhì)粒DNA分別溶于緩沖溶液，取兩種溶液混合，室溫靜置IOmin 2h，聚合 物和質(zhì)粒DNA通過靜電自組裝形成聚合物/質(zhì)粒DNA復(fù)合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的質(zhì)粒DNA，其特征在于質(zhì)粒DNA是包含報告基因、抗癌基因、 細(xì)胞因子基因的可在真核細(xì)胞中重組表達(dá)的質(zhì)粒DNA。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的聚合物/質(zhì)粒DNA復(fù)合物作為基因載體的應(yīng)用，其特征在于 聚合物基因載體的人體腫瘤細(xì)胞、或內(nèi)皮細(xì)胞、或上皮細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)，把載有質(zhì)粒DNA的 復(fù)合物與人體腫瘤細(xì)胞、或內(nèi)皮細(xì)胞、或上皮細(xì)胞共培養(yǎng)，復(fù)合物可攜帶質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì) 胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的聚合物/質(zhì)粒DNA復(fù)合物作為基因載體的應(yīng)用，其特征在于 可以用于注射給藥、或粘膜給藥、或口服給藥。
全文摘要
本發(fā)明涉及類固醇激素修飾的陽離子聚合物及其基因復(fù)合物的制備。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種具有細(xì)胞核靶向功能，輔助腫瘤治療，輔助抗炎治療的多重作用的陽離子聚合物，并提供一種工藝簡單，適用可靠，成本低廉的上述陽離子聚合物的制備方法。該聚合物的制備方法為類固醇激素溶于有機(jī)溶劑中，經(jīng)氧化劑氧化，純化，干燥即得氧化類固醇激素；將陽離子聚合物與氧化類固醇激素溶于有機(jī)溶劑中，加入催化脫水劑反應(yīng)，純化，干燥即得類固醇激素修飾的陽離子聚合物。本發(fā)明還提供上述陽離子聚合物作為基因載體的應(yīng)用。該聚合物與質(zhì)粒DNA形成的復(fù)合物具有很好的靶向性，優(yōu)良的安全性，較高的轉(zhuǎn)染效率，具有廣泛的基因適應(yīng)性。
文檔編號A61K47/48GK101812177SQ20101001724
公開日2010年8月25日 申請日期2010年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月5日
發(fā)明者盧韻, 周建平, 姚靜, 范穎 申請人:中國藥科大學(xué)