專利名稱：一種白桂木提取物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥和食品技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種白桂木提取物及其制備方法和用途。
具體地，涉及一種白桂木的乙酸乙酯提取物及其制備方法和它作為黑色素生成抑制劑或天 然抗氧化劑的用途。
背景技術(shù)：
隨著審美標(biāo)準(zhǔn)的提高，人們對(duì)擁有美白細(xì)致的肌膚的要求日益增加。近些年，皮膚 美白及抗衰老類(lèi)化妝品市場(chǎng)的開(kāi)發(fā)日趨受到重視，美白同時(shí)抗衰老化妝品已成為護(hù)膚類(lèi)化 妝品的主流品種之一，其消費(fèi)市場(chǎng)在不斷擴(kuò)大。 人類(lèi)皮膚的顏色取決于黑色素的含量和分布。皮膚色素沉著是由于黑色素細(xì)胞內(nèi) 黑色素產(chǎn)生過(guò)多導(dǎo)致的，而酪氨酸酶是黑色素生物合成過(guò)程中必不可少的關(guān)鍵酶。酪氨酸 酶催化酪氨酸氧化成多巴并且多巴再進(jìn)一步氧化成黑色素的前體物多巴醌。因此酪氨酸 酶抑制劑可以治療目前常見(jiàn)的色素沉著皮膚病如雀斑、黃褐斑和老年斑等。雖然目前已有 多種酪氨酸酶抑制劑用于美白，但依然存在問(wèn)題，不能滿足消費(fèi)市場(chǎng)的需要。曲酸由于不穩(wěn) 定，美白效果較弱；氫醌化合物具有強(qiáng)烈的酪氨酸酶抑制作用，但由于其可以誘導(dǎo)皮膚病以 及細(xì)胞毒性，許多國(guó)家已經(jīng)禁止使用；熊果苷較安全，但作用微弱。因此，從天然植物中尋找 安全、有效的美白成分已成為化妝品行業(yè)研究的趨向。 紫外線照射、電腦輻射、空氣污染等均會(huì)使皮膚產(chǎn)生大量的自由基，自由基極不穩(wěn) 定，它使皮膚細(xì)胞的細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，破壞皮膚的膠原蛋白及彈性纖維，并剌激 黑色素細(xì)胞，增加黑色素的分泌，從而導(dǎo)致皮膚干燥松弛，失去彈性，產(chǎn)生皺紋，皮膚變黃變 黑，產(chǎn)生色素沉積和雀斑，從而加速皮膚衰老，并可以誘發(fā)皮膚癌變等。因此，美白并能抗自 由基的"全美白概念型美白齊U"具有良好的應(yīng)用前景。目前市場(chǎng)上這樣的產(chǎn)品如Vc曲酸酯 和曲酸亞麻酸酯均擁有了良好的消費(fèi)市場(chǎng)。具有這樣多重功效的天然產(chǎn)物更是具有潛在的 應(yīng)用價(jià)值。 另外，隨著生活水平的不斷提高，人們對(duì)健康綠色食品也有了更新更高的要求。高 效、安全、無(wú)毒、純天然的食品添加劑越來(lái)越受到人們的青睞，因此開(kāi)發(fā)高效天然的抗氧化 劑以取代現(xiàn)有化學(xué)合成的抗氧化劑已成為今天國(guó)際食品界的主旋律。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種白桂木提取物。 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述白桂木提取物的制備方法。 本發(fā)明的又一 目的是提供上述白桂木提取物的用途。 本發(fā)明的還一目的是提供一種組合物，其含有上述的白桂木提取物。 根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)目的，本發(fā)明提供了一種白桂木提取物，該提取物中，異戊烯
基取代的黃酮類(lèi)化合物的含量為20 40重量％，優(yōu)選為28 40重量％ ;其中，所述異戊
烯基取代的黃酮類(lèi)化合物為artopetelin B、artonin A、 artocarpin禾口 brosimone I。
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采用高效液相色譜法(HPLC-UV)測(cè)定本發(fā)明白桂木提取物中異戊烯基取代的黃 酮類(lèi)化合物的含量。色譜條件為色譜柱為C18分析柱，流動(dòng)相為40-90% (v/v)甲醇-磷 酸水溶液或40-90% (v/v)乙腈-磷酸水溶液，檢測(cè)波長(zhǎng)為300nm，檢測(cè)時(shí)間為60分鐘，用 外標(biāo)法測(cè)定保留時(shí)間為10.0 50. Omin范圍內(nèi)的異戊烯基取代的黃酮類(lèi)化合物的含量，計(jì) 算含量為20 40重量％，優(yōu)選為28 40重量％。其中，所述的異戊烯基取代的黃酮類(lèi)化 合物為artopetelin B、 artonin A、 artocarpin禾口 brosimone I。所述異戊烯基取代的黃酮類(lèi)化合物artopetelin B、 artonin A、 artocarpin禾口
brosimone I的結(jié)構(gòu)式如下
Artocarpin Brosimone I 根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)目的，本發(fā)明提供了上述白桂木提取物的制備方法。該制備 方法為 將白桂木(Artocarpus hypargyreus Hance)的莖枝粉碎后，用溶劑提取制備得到
總提取物；將總提取物溶于水后，依次以卣代烴類(lèi)溶劑和酯類(lèi)溶劑萃取；取酯類(lèi)溶劑萃取
相，回收溶劑后干燥，即得到本發(fā)明的白桂木提取物。 所述溶劑為醇、水或其混合物。 所述醇為乙醇或甲醇等。 優(yōu)選地，所述溶劑為95% (v/v)含水乙醇。 所述鹵代烴類(lèi)溶劑可以為氯仿或二氯甲烷；優(yōu)選為氯仿。 所述酯類(lèi)溶劑優(yōu)選為乙酸乙酯。 所述提取使用的提取方法優(yōu)選為浸泡或滲漉。 根據(jù)本發(fā)明的第三個(gè)目的，本發(fā)明提供上述白桂木提取物的用途，即本發(fā)明的白 桂木提取物在制備酪氨酸酶抑制劑中的用途和在制備自由基清除劑中的用途。
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由此，本發(fā)明的白桂木提取物可以用于化妝品、藥品、食品和保健品領(lǐng)域。 具體地，本發(fā)明的白桂木提取物在制備黑色素生成抑制劑中的用途和在制備抗氧
化劑中的用途。從而可以預(yù)防皮膚衰老、保護(hù)皮膚或美白皮膚，治療包括變色、雀斑、斑點(diǎn)等
的皮膚色素沉著?？梢宰鳛轭A(yù)防食物因被氧化而變色或防止產(chǎn)品氧化的天然抗氧化劑，用
于食品和保健品的保鮮；具體可以作為動(dòng)植物油脂、焙烤食品、水產(chǎn)品、肉制品、調(diào)味劑及飲
料、醫(yī)藥、化妝品和保健食品的抗氧化劑，以及預(yù)防食物包括水果、蔬菜和魚(yú)變色。 根據(jù)本發(fā)明的第四個(gè)目的，本發(fā)明提供了一種組合物，其含有上述的白桂木提取物。 在上述組合物中，本發(fā)明的白桂木提取物作為酪氨酸酶抑制劑和自由基清除劑可 以單獨(dú)使用，也可以與其它化合物混合使用，并可以進(jìn)一步含有化妝品/藥學(xué)上所允許的 輔料或常規(guī)的載體，以制備成用作抑制黑色素生成或清除自由基的延緩衰老的化妝品或藥 物。 所述的組合物可以制成片劑、丸劑、膠囊劑、懸浮劑或乳劑。


圖1為本發(fā)明白桂木提取物隨時(shí)間對(duì)B16細(xì)胞來(lái)源酪氨酸酶的抑制率的曲線。
圖2為本發(fā)明白桂木提取物隨時(shí)間對(duì)B16細(xì)胞來(lái)源酪氨酸酶的抑制率的柱狀圖。
圖3為本發(fā)明白桂木提取物對(duì)B16細(xì)胞黑色素生成量的影響的柱狀圖。
圖4為本發(fā)明白桂木提取物的濃度對(duì)B16細(xì)胞活力的影響的曲線圖。
圖5為本發(fā)明白桂木提取物的濃度對(duì)自由基清除率的影響的柱狀圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但不限制本發(fā)明。
制備實(shí)施例
實(shí)施例1 白桂木干燥莖枝20公斤粉粹后，用95% (v/v)含水乙醇100升浸泡12小時(shí)后 滲漉，收集滲漉液400升，濃縮干燥，得到浸膏1. 8公斤。將此浸膏溶于蒸餾水后分別依 次用氯仿、乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯溶劑萃取相，回收乙酸乙酯溶劑濃縮至干，即得本發(fā) 明白桂木提取物500克。經(jīng)高效液相色譜測(cè)定，色譜條件為色譜柱為HyperClone BDS C18(4. 6mmX250mm，5iim)柱，流動(dòng)相為70% (v/v)甲醇-0. 2%磷酸水溶液，檢測(cè)波長(zhǎng)為 300nm，該提取物中異戊烯基取代的黃酮類(lèi)化合物artopetelin B、 artonin A、 artocarpin 和brosimone I含量之和為40重量％ 。
實(shí)施例2 白桂木干燥莖枝20公斤粉粹后，用70% (v/v)含水乙醇100升浸泡12小時(shí)后 滲漉，收集滲漉液400升，濃縮干燥，得到浸膏1. 5公斤。將此浸膏溶于蒸餾水后分別依 次用氯仿、乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯溶劑萃取相，回收乙酸乙酯溶劑濃縮至干，即得本發(fā) 明白桂木提取物450克。經(jīng)高效液相色譜測(cè)定，色譜條件為色譜柱為HyperClone BDS C18(4.6mmX250mm，5iim)柱，流動(dòng)相為70% (v/v)甲醇-0. 2 %磷酸水溶液，檢測(cè)波長(zhǎng)為 300nm，該提取物中異戊烯基取代的黃酮類(lèi)化合物artopetelin B、 artonin A、 artocarpin
5和brosimone I的含量之和為34重量％。
實(shí)施例3 白桂木干燥莖枝20公斤粉粹后，依次用100升、80升、60升的80% (v/v)含水甲 醇室溫浸泡三次，第一次24小時(shí)，第二次和第三次分別12小時(shí)，合并提取液，濃縮干燥，得 到浸膏1. 2公斤。將此浸膏溶于蒸餾水后分別依次用氯仿、乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯溶劑 萃取相，回收乙酸乙酯溶劑濃縮至干，即得本發(fā)明白桂木提取物420克。經(jīng)高效液相色譜測(cè) 定，色譜條件為色譜柱為HyperClone BDS C18(4. 6mmX250mm， 5 y m)柱，流動(dòng)相為65% (v/ v)乙腈_0.2%磷酸水溶液，檢測(cè)波長(zhǎng)為300nm，該提取物中異戊烯基取代的黃酮類(lèi)化合物 artopetelin B、artonin A、 artocarpin禾口 brosimone I的含量之禾口為28重量% 。
測(cè)試實(shí)施例(即藥理實(shí)施例) 為了證實(shí)本發(fā)明白桂木提取物的用途，對(duì)本發(fā)明白桂木提取物進(jìn)行了蘑菇及B16 細(xì)胞來(lái)源的酪氨酸酶的抑制作用、B16黑色素瘤細(xì)胞的測(cè)試、抗自由基氧化活性測(cè)試。結(jié)果 顯示，本發(fā)明白桂木提取物具有強(qiáng)的抑制黑色素生成及清除自由基能力。
實(shí)施例4蘑菇來(lái)源的酪氨酸酶活性測(cè)試 蘑菇來(lái)源的酪氨酸酶購(gòu)自sigma(T3824)。以曲酸作為對(duì)照品，首先將底物多巴溶 解在磷酸鹽緩沖液(PBS， pH7. 4)中達(dá)到4mM。在96孔板中，加入120 y L的PBS、20 y L的 PBS稀釋的不同濃度的樣品(上述的制備實(shí)施例l中制備的白桂木提取物)以及l(fā)OyL的 20 ii g/mL的酪氨酸酶的稀釋液，最后加入50 ii L的上述4mM底物溶液開(kāi)始反應(yīng)，27。C下反應(yīng) 20分鐘，每隔2分鐘在492nm下測(cè)定每孔的吸光度。 根據(jù)在492nm下的吸光度計(jì)算化合物對(duì)酪氨酸酶的抑制率(％)，并將酶活性抑制 率(％ )達(dá)到50%時(shí)抑制劑的濃度測(cè)定為ICs。值。抑制率(％ )可以根據(jù)下式進(jìn)行
抑制率(％ ) = [ (A-B) - (C-D) ] / (A-B) X 100 上式中，A表示反應(yīng)20分鐘后空白孔在492nm下的吸光度；B表示反應(yīng)前空白孔在 492nm下的吸光度；C表示反應(yīng)20分鐘后樣品孔在492nm下的吸光度；D表示反應(yīng)前樣品孔 在492nm下的吸光度。
結(jié)果見(jiàn)表l。 表1對(duì)蘑菇來(lái)源酪氨酸酶的抑制活性 _ 樣品 IC5。(ng/mL) _ 曲酸3400 ±192
本發(fā)明實(shí)施例1的白桂木提取物 34. 58 ± 4. 31
_ 結(jié)論從表1可以看出，本發(fā)明的白桂木提取物具有很強(qiáng)的抑制蘑菇來(lái)源的酪氨
酸酶的活性，IC50比曲酸強(qiáng)約100倍。 實(shí)施例5B16細(xì)胞來(lái)源的酪氨酸酶活性測(cè)試 B 16黑色素瘤細(xì)胞(簡(jiǎn)稱B 16細(xì)胞)是來(lái)源于C57BL6小鼠皮膚的自發(fā)性腫瘤。 B16細(xì)胞來(lái)源的酪氨酸酶提取方法為將B16細(xì)胞培養(yǎng)基吸掉，用冰冷的PBS洗2次，加入 適量含1% Triton X-100的PBS，4。C裂解30分鐘。將裂解物4°C 12000轉(zhuǎn)離心，取上清即為B16細(xì)胞的酶提取液。在96孔板150 L的反應(yīng)體系中，使用上述的制備實(shí)施例1中制 備的白桂木提取物，底物多巴終濃度lmM，酶提取液3倍稀釋，反應(yīng)溫度為37°C 。每隔5分 鐘測(cè)492nm吸光度，共80分鐘，計(jì)算反應(yīng)5分鐘、20分鐘、40分鐘、80分鐘時(shí)的酶的抑制率。 另外12小時(shí)過(guò)夜后再檢測(cè)一次，計(jì)算反應(yīng)30分鐘和12小時(shí)時(shí)酶的抑制率，計(jì)算方法同"實(shí) 施例4"。 結(jié)果見(jiàn)表2、圖1和圖2。圖1和圖2分別為樣品隨時(shí)間對(duì)B16細(xì)胞來(lái)源酪氨酸 酶的抑制率的曲線和柱狀圖。 表2對(duì)B16細(xì)胞來(lái)源酪氨酸酶的抑制活性 _ 樣品 IC5。(iig/mL) _ 曲酸 6. 48±0.389
本發(fā)明實(shí)施例1的白桂木提取物11. 46 ±1. 127
_ 結(jié)論從表2、圖1和圖2可以看出，本發(fā)明白桂木提取物具有抑制B16細(xì)胞來(lái)源的 酪氨酸酶的活性，且隨時(shí)間抑制作用逐漸增強(qiáng)，而曲酸隨時(shí)間抑制作用逐漸減弱(見(jiàn)圖1)。 12小時(shí)后，本發(fā)明白桂木提取物仍具有強(qiáng)的抑制作用，而曲酸的抑制作用消失(見(jiàn)圖2)。
實(shí)施例6對(duì)B16細(xì)胞黑色素生成的影響測(cè)試 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)可促進(jìn)B16細(xì)胞的黑色素的生成。將B16細(xì)胞 接種于48孔板，2X 104個(gè)/孑L用含10%胎牛血清(FBS)的H-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。24小時(shí) 后換上含100 ii M IBMX的培養(yǎng)基，同時(shí)加入不同濃度的樣品(上述的制備實(shí)施例1中制備 的白桂木提取物)。72小時(shí)后，吸取150 ii L培養(yǎng)液檢測(cè)后，棄培養(yǎng)基，PBS洗兩次，每孔加 入150 ii L的1. 5M的NaOH溶液，60。C水浴放置30分鐘后，于492nm處檢測(cè)培養(yǎng)液和細(xì)胞內(nèi) 的黑色素總的含量。結(jié)果見(jiàn)圖3(*表示與對(duì)照組(IBMX組)相比，p<0.001)。圖3為本 發(fā)明白桂木提取物對(duì)B16細(xì)胞黑色素生成量的影響的柱狀圖。 B16細(xì)胞接種于96孔板，2Xl(f個(gè)/孔，用DMEM培養(yǎng)基(10XFBS，高糖)培養(yǎng)。 24小時(shí)后換上含或不含100 ii M的IBMX的培養(yǎng)基，并加入不同濃度的樣品(上述的制備實(shí) 施例1中制備的白桂木提取物)。48小時(shí)后棄培養(yǎng)基，加入100 ii L的5g/L的3-(4， 5- 二 甲基噻唑-2) -2， 5- 二苯基四氮唑溴鹽(MTT) ， 4小時(shí)后棄去上清液，加入150 y L的DMSO，酶 標(biāo)儀上檢測(cè)吸光度值，測(cè)定波長(zhǎng)為570nm，參考波長(zhǎng)為630nm。結(jié)果見(jiàn)圖4。圖4為本發(fā)明白 桂木提取物的濃度對(duì)B16細(xì)胞活力的影響的曲線。 結(jié)論從圖3中可以看出，與對(duì)照組相比，本發(fā)明白桂木提取物可有效地減少B16 黑色素瘤細(xì)胞產(chǎn)生黑色素的量，且從圖4可以看出，在小于10iig/mL的濃度范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞 活力沒(méi)有明顯損傷。 實(shí)施例7DPPH法抗氧化能力測(cè)試 1， 1- 二苯基苦基苯肼(DPPH)用無(wú)水乙醇配成300 y M，將上述的制備實(shí)施例1中 制備的白桂木提取物用匿SO配成不同濃度溶液，在96孔板中分別加入95 ii L的DPra溶液 禾口 5 ii L的匿SO (空白孔)、95 ii L的無(wú)水乙醇和5 ii L的匿SO (空白對(duì)照孔)、95 y L的DPK1 溶液和5 ii L的不同濃度樣品溶液(樣品孔)、95 ii L的無(wú)水乙醇和5 ii L不同濃度樣品溶液
7(樣品對(duì)照孔)，避光25。C室溫反應(yīng)20min， 517nm檢測(cè)吸收。 測(cè)定DPra自由基清除率達(dá)到50%時(shí)的樣品濃度，其為IC5。值。抑制率(％ )可以 根據(jù)下式進(jìn)行 抑制率(％ ) = [ (A-B) - (C-D) ] / (A-B) X 100 上式中，A表示空白孔反應(yīng)20分鐘時(shí)在517nm下的吸光度；B表示空白對(duì)照孔反應(yīng) 20分鐘時(shí)在517nm下的吸光度；C表示樣品孔反應(yīng)20分鐘時(shí)在517nm下的吸光度；D表示 樣品對(duì)照孔反應(yīng)20分鐘時(shí)在517nm下的吸光度。 結(jié)果見(jiàn)圖5。圖5為本發(fā)明白桂木提取物的濃度對(duì)自由基清除率的影響的柱狀圖。
結(jié)論從圖5可以看出，本發(fā)明白桂木提取物可長(zhǎng)時(shí)間且有效地清除DPra自由基。
正如本文前面所述，本發(fā)明的白桂木提取物對(duì)蘑菇和小鼠B16細(xì)胞來(lái)源的酪氨酸 酶有非常強(qiáng)的抑制作用，在對(duì)B16細(xì)胞基本沒(méi)有明顯毒性的前提下，可以顯著的抑制黑色
素的含量。而且，本發(fā)明的白桂木提取物可長(zhǎng)時(shí)間且有效地清除DPra自由基。因此，本發(fā)明
的白桂木提取物可用于制備化妝品，具有預(yù)防皮膚衰老、保護(hù)皮膚或美白皮膚的功能；可用 于制備藥物，用于治療包括變色、雀斑、斑點(diǎn)等的皮膚色素沉著；可用于制備天然抗氧化劑， 用于食品和保健品的保鮮。
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權(quán)利要求
一種白桂木提取物，其特征在于，該提取物中，異戊烯基取代的黃酮類(lèi)化合物的含量為20～40重量％；其中，所述異戊烯基取代的黃酮類(lèi)化合物為artopetelin B、artonin A、artocarpin和brosimone I。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的白桂木提取物，其特征在于，該提取物中，異戊烯基取代的黃 酮類(lèi)化合物的含量為28 40重量％ 。
3. —種權(quán)利要求1或2所述的白桂木提取物的制備方法，其特征在于，將白桂木的莖枝 粉碎后，用溶劑提取制備得到總提取物；將總提取物溶于水后，依次以鹵代烴類(lèi)溶劑和酯類(lèi) 溶劑萃取；取酯類(lèi)溶劑萃取相，回收溶劑后干燥，即得到白桂木提取物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的白桂木提取物的制備方法，其特征在于，所述溶劑為醇、水或 其混合物；所述鹵代烴類(lèi)溶劑為氯仿或二氯甲烷；所述酯類(lèi)溶劑為乙酸乙酯；所述提取使 用的提取方法為浸泡或滲漉。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的白桂木提取物的制備方法，其特征在于，所述醇為乙醇或甲 醇；所述鹵代烴類(lèi)溶劑為氯仿。
6. 權(quán)利要求1或2所述的白桂木提取物的在制備酪氨酸酶抑制劑中的用途。
7. 權(quán)利要求1或2所述的白桂木提取物的在制備自由基清除劑中的用途。
8. 權(quán)利要求1或2所述的白桂木提取物的在制備黑色素生成抑制劑中的用途。
9. 權(quán)利要求1或2所述的白桂木提取物的在制備抗氧化劑中的用途。
10. —種組合物，其特征在于，該組合物含有權(quán)利要求1或2所述的白桂木提取物。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥和食品技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種白桂木提取物及其制備方法和用途。本發(fā)明的白桂木提取物中，異戊烯基取代的黃酮類(lèi)化合物的含量為20～40重量％。以白桂木的莖枝為原料，用溶劑提取制備得到總提取物；將總提取物溶于水后，依次以鹵代烴類(lèi)溶劑和酯類(lèi)溶劑萃??；取酯類(lèi)溶劑萃取相，回收溶劑后干燥，即得到本發(fā)明的白桂木提取物。經(jīng)體外酪氨酸酶、B16黑色素瘤細(xì)胞、清除DPPH等活性測(cè)試，結(jié)果顯示，本發(fā)明白桂木提取物具有強(qiáng)的抑制酪氨酸酶、黑色素生成和清除自由基作用，可作為黑色素生成抑制劑或美白劑或天然抗氧化劑應(yīng)用于醫(yī)藥、日用化工和食品領(lǐng)域。
文檔編號(hào)A61K8/97GK101766691SQ20101002263
公開(kāi)日2010年7月7日 申請(qǐng)日期2010年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月11日
發(fā)明者喬欣, 侯?lèi)?ài)君, 王賀瑤, 趙婷, 閆桂蕊 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所;復(fù)旦大學(xué)